CN108350446A - 基于crispr/cas9的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于治疗影响眼睛和非‑眼睛组织的病症，例如角膜营养不良和微卫星扩增疾病的方法。所述方法利用核酸酶系统，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9(CRISPR‑Cas9)，以切割和/或修复基因组DNA。这样的方法可进一步包括DNA双链断裂(DSB)修复系统，其包含与非同源末端连接(NHEJ)或靶向一个或多个CRISPR‑Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)组合的修复模板。

Description

基于CRISPR/CAS9的治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月2日提交的美国临时申请号62/188,013的优先权，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
背景
角膜营养不良是一组通常为遗传的、两侧的、对称的、缓慢进展和大部分不与环境或系统因素有关的病症(1,2)。角膜营养不良可影响角膜的任何解剖层、细胞类型或组织，和导致角膜透明度损失和视力下降(1,3)。角膜营养不良总的来说影响>4%的美国人群，和角膜移植是具有足以导致明显视力损失的严重性的角膜营养不良的最终治疗。富克斯内皮角膜营养不良(FECD)是最常见的角膜营养不良，其影响大约4%的美国人群。大约70%的FECD病例由转录因子4 (TCF4)基因中的微卫星三核苷酸重复扩增引起(4)。已经描述了其它微卫星扩增疾病(5)。
因此，对于用于治疗影响眼睛和非-眼睛组织的病症，例如影响眼睛和全身的其它组织和器官的角膜营养不良和微卫星扩增疾病的新型和改进疗法，存在极大需求。
发明概述
本文描述了用于治疗影响眼睛和非-眼睛组织的病症，例如角膜营养不良和微卫星扩增疾病的方法。所述方法使用核酸酶系统，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas) 9 (CRISPR-Cas9)，以切割和/或修复基因组DNA。基于CRISPR-Cas9的基因编辑可用于失活或纠正导致角膜营养不良和微卫星扩增疾病的基因突变，从而提供用于这些疾病组的基因疗法。
本发明的一个方面涉及用于治疗影响受试者的眼睛组织的病症的方法，所述方法包括给予受试者的眼睛区域治疗有效量的核酸酶系统，其包含基因组靶向核酸酶和包含至少一个靶向基因组序列的指导DNA。
在某些实施方案中，核酸酶可作为蛋白质、RNA、DNA或包含编码核酸酶的核酸的表达载体提供。
在某些实施方案中，指导DNA可作为RNA分子(gRNA)、DNA分子或包含编码gRNA的核酸的表达载体提供。
在某些实施方案中，指导DNA可作为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个RNA分子(gRNA)、DNA分子或包含编码gRNA的核酸的表达载体，或其任何组合提供。
在某些实施方案中，核酸酶系统可以是CRISPR-Cas9。
在某些实施方案中，核酸酶系统使基因突变失活或切除基因突变。
在某些实施方案中，该系统进一步包含DNA双链断裂(DSB)修复系统。
在某些实施方案中，DSB修复系统包含与或不与非同源末端连接(NHEJ)或靶向一个或多个CRISPR-Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)组合的修复模板，所述位点纠正或编辑基因组突变。
在某些实施方案中，DSB修复系统通过宿主细胞机器提供。
在某些实施方案中，基因组靶向核酸酶可以是Cas9。
在某些实施方案中，所述病症可以是角膜营养不良或微卫星扩增疾病。
在某些实施方案中，眼睛区域可以是角膜。
在某些实施方案中，指导DNA包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向基因组序列。
在某些实施方案中，靶向基因组序列选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342所示的任何一个核苷酸序列，或其任何组合。
在某些实施方案中，核酸酶系统可局部给予至眼睛的表面。
在某些实施方案中，核酸酶系统可在角膜、巩膜上或外面给予，给予至眼睛内、结膜下、筋膜下(sub-tenon)或眼球后间隙，或在眼睑内或周围给予。
在某些实施方案中，核酸酶系统可通过植入、注射或病毒给予。
本发明的另一方面涉及用于治疗影响受试者的非-眼睛组织的病症的方法，所述方法包括给予受试者的非-眼睛组织治疗有效量的核酸酶系统，其包含基因组靶向核酸酶和包含至少一个靶向基因组序列的指导DNA。
在某些实施方案中，核酸酶可作为蛋白质、RNA、DNA或包含编码核酸酶的核酸的表达载体提供。
在某些实施方案中，指导DNA可作为RNA分子(gRNA)、DNA分子或包含编码gRNA的核酸的表达载体提供。
在某些实施方案中，核酸酶系统可以是CRISPR-Cas9。
在某些实施方案中，核酸酶系统使基因突变失活或切除基因突变。
在某些实施方案中，该方法进一步包含DNA双链断裂(DSB)修复系统。
在某些实施方案中，DSB修复系统包含与非同源末端连接(NHEJ)或靶向一个或多个CRISPR-Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)组合的修复模板，所述位点纠正或编辑基因组突变。
在某些实施方案中，基因组靶向核酸酶可以是Cas9。
在某些实施方案中，所述病症可以是微卫星扩增疾病。
在某些实施方案中，指导DNA包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向基因组序列。
在某些实施方案中，靶向基因组序列选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342所示的任何一个核苷酸序列，或其任何组合。
在某些实施方案中，核酸酶系统经局部、血管内、皮内、经皮、胃肠外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、区域性、由皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗、直接通过注射或通过给药和制剂经口给予。
根据以下详细描述，本发明的其它目标、特征和优点将变得显而易见。然而应理解，详细描述和特定的实施例，尽管指示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰对本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
图1包含四个子图(A)-(D)，其描述使用与相应的突变重叠的gRNA序列，通过Cas9可靶向的两个鉴定的位点，和它们破坏已知是角膜营养不良的原因的基因的显性突变的能力。子图(A)描述使用CRISPR-Cas9系统在HEK293细胞中靶向TGFBI外显子124。下方指示了通过非同源末端连接的%基因修饰(% indel)。子图(B)描述凝胶的图像迹线，指示用于定量的峰。子图(C)描述使用CRISPR-Cas9系统在HEK293细胞中靶向TGFBI外显子555。下方指示了通过非同源末端连接的%基因修饰(% indel)。子图(D)描述凝胶的图像迹线，指示用于定量的峰。
图2包含三个子图(A)-(C)，其描述使用对应于TCF4基因的外显子2和外显子3之间的内含子内的靶序列的gRNA序列，通过Cas9可靶向的鉴定的位点。子图(A)描述在HEK293细胞中使用CRISPR/Cas9系统，靶向导致富克斯角膜营养不良的三核苷酸重复扩增的下游的内含子序列的6个gRNA (表4)。分子量梯显示在最左和最右泳道。对照泳道指示没有gRNA和没有Cas9转染。Cas9泳道指示有Cas9但无gRNA转染。箭头指示通过非同源末端连接产生的主要切割产物，和下方指示了通过非同源末端连接的%基因修饰。子图(B)描述凝胶的图像迹线，指示用于定量的峰。子图(C)描述各gRNA的预期消化物大小。
图3包含三个子图(A)-(C)，其描述使用对应于TCF4基因的外显子2和外显子3之间的内含子内的靶序列的gRNA序列，通过Cas9可靶向的鉴定的位点。子图(A)描述在HEK293细胞中使用CRISPR/Cas9系统，靶向导致富克斯角膜营养不良的三核苷酸重复扩增的上游的内含子序列的6个gRNA(表3)。分子量梯显示在最右泳道。对照泳道指示没有gRNA和没有Cas9转染。箭头指示通过非同源末端连接产生的主要切割产物，和下方指示了通过非同源末端连接的%基因修饰。子图(B)描述凝胶的图像迹线，指示用于定量的峰。子图(C)描述各gRNA的预期消化物大小。
详细描述
本文描述了用于治疗眼睛病症，例如角膜营养不良和微卫星扩增疾病的方法。所述方法使用核酸酶系统，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas) 9(CRISPR-Cas9)，以剪切、切割和/或修复基因组DNA。
如本文所用的，术语“眼睛疾病”可包括眼睛的病症，包括但不限于角膜营养不良和微卫星扩增疾病。
如本文所用的，术语“角膜营养不良”描述了一组通常为遗传的、两侧的、对称的、缓慢进展和大部分不与环境或系统因素有关的病症(1,2)。角膜营养不良包括(但可不限于)以下：上皮基底膜营养不良(即，地图-点状-指纹状营养不良、Cogan微囊上皮营养不良、前基底膜营养不良)；上皮复发性糜烂营养不良(即，Franceschetti角膜营养不良、Dystrophia Smolandiensis、Dystrophia Helsinglandica)；上皮下粘液性角膜营养不良；Meesmann角膜营养不良(即，青少年遗传性上皮营养不良、Stocker Holt营养不良)；Lisch上皮角膜营养不良(即，带状和螺纹状(Whorled)微囊营养不良)；凝胶滴样角膜营养不良(即，上皮下淀粉样变、(Grayson)原发家族性淀粉样变)；Reis–Bucklers角膜营养不良(即，Bowman层角膜营养不良I型(CDB I)、(Weidle)地理学角膜营养不良、非典型粒状角膜营养不良、粒状角膜营养不良3型、前界膜营养不良1型、浅表粒状角膜营养不良)；Thiel–Behnke角膜营养不良(即，Bowman层角膜营养不良II型(CDB2)、蜂房形角膜营养不良、前界膜营养不良II型、卷曲纤维角膜营养不良、Waardenburg–Jonkers角膜营养不良)；格子状角膜营养不良1型(典型) (即，Biber-Haab-Dimmer营养不良)；格子状角膜营养不良2型(即，家族性淀粉样变(Finnish型或Gelsolin型)、Meretoja综合征)；格子状角膜营养不良III型；格子状角膜营养不良IIIA型；格子状角膜营养不良I/IIIA型；格子状角膜营养不良IV型；多形性(角膜)淀粉样变；粒状角膜营养不良1型(即，Groenouw I型角膜营养不良)；粒状角膜营养不良2型(即，Avellino营养不良、组合型粒状-格子状营养不良)；斑点角膜营养不良(即，Groenouw II型角膜营养不良、Fehr Speckled营养不良)；Schnyder角膜营养不良(即，Schnyder晶状角膜营养不良(SCCD)、没有结晶的Schnyder晶状营养不良(SchnyderCrystalline Dystrophy Sine Crystals)、Schnyder遗传性晶状基质营养不良、晶状基质营养不良、中央基质晶状角膜营养不良、Schnyder角膜晶状营养不良、Schnyder角膜晶状营养不良)；先天性基质角膜营养不良(即，先天遗传性基质营养不良)；斑点状角膜营养不良(即，François-Neetens Speckled (Mouchetée)角膜营养不良)；后部无定形角膜营养不良(即，后部无定形基质营养不良)；Francois中央浑浊性营养不良；德斯密膜前角膜营养不良；富克斯内皮角膜营养不良(即，上皮内角膜营养不良)；后部多形性角膜营养不良(即，后部多形性营养不良、Schlichting营养不良)；先天遗传性内皮营养不良(即，Maumenee角膜营养不良)；X-连锁内皮角膜营养不良。
所有上述病症由已知或推定的基因突变引起。仍待描述的角膜营养不良将由已知或推定的基因突变引起。因此，所有遗传性角膜营养不良可适用于核酸酶系统，例如CRISPR-Cas9，用于涉及突变等位基因纠正或失活的基因疗法。
如本文所用的，“微卫星序列”，亦称为短串联重复序列，是通常重复5-50次的短DNA序列(通常2-5个核苷酸)。这些序列存在于整个人类基因组中，和重复次数可变化和/或增加。一些微卫星序列，如果它们扩增超过一定长度，可导致微卫星扩增疾病。所有已知或仍待描述的微卫星扩增疾病将由已知或推定的基因的扩增引起。因此，所有微卫星扩增疾病可适用于涉及突变等位基因纠正或失活的CRISPR-Cas9基因疗法。
本文使用的微卫星扩增疾病可包括影响眼睛和非-眼睛组织的疾病，包括(但可不限于)以下病症：睑裂狭小、下垂和内眦赘皮反向并指症；锁骨颅骨发育不全；先天性中枢性肺换气不足综合征、Haddad综合征、DM (强直性肌营养不良)；FRAXA (脆性X染色体综合征)；FRAXE (脆性XE智力低下)；FRDA (弗里德赖希氏共济失调)；富克斯内皮角膜营养不良；FXTAS (脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征)；手-足-生殖器综合征；HD (亨廷顿病)；前脑无裂畸形；伴有生长激素缺乏的智力低下；智力低下、癫痫、韦斯特综合征、Partington综合征；眼咽肌营养不良；SBMA (脊柱和延髓肌萎缩)；SCA1 (脊髓小脑性共济失调1型)；SCA12 (脊髓小脑性共济失调12型)；SCA17 (脊髓小脑性共济失调17型)；SCA2(脊髓小脑性共济失调2型)；SCA3 (脊髓小脑性共济失调3型或马-约病)；SCA6 (脊髓小脑性共济失调6型)；SCA7 (脊髓小脑性共济失调7型)；SCA8 (脊髓小脑性共济失调8型)；并指症。
如本文所用的，术语受试者的“眼睛”、“眼睛区域”或“眼区域”包括角膜、结膜、巩膜、小凹、黄斑、视神经、视网膜、晶状体、虹膜、瞳孔、眼睛内、结膜下、筋膜下或眼球后间隙，或眼睑内或周围，和眼睛的其它解剖学特征。
如本文使用的，成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas) 9核酸酶是一种切割和/或修复基因组DNA的极度通用和准确的方法(6)。基于CRISPR-Cas9的基因编辑可用于失活或纠正导致角膜营养不良和微卫星扩增疾病的基因突变，从而提供对于这些疾病组的基因疗法。来自酿脓链球菌(S. pyogenes)的天然存在的CRISPR系统已被改良以利用单一指导RNA (gRNA)，其由20个核苷酸(nt)的靶序列和结合Cas9双链核酸酶的另外结构RNA部分组成(6,7)。来自酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统具有在5’-NGG-3’前间隔区-邻近基序(PAM)附近的任何20 nt序列，或交替PAM序列处切割的潜力，和生物信息学提供了将靶位点作图的工具(8, 10)。被Cas9切割的DNA通过内源细胞机制，包括非同源末端连接(NHEJ)修复，其产生可使原始突变等位基因失活的插入缺失突变。因此，通过切割足够紧密接近蛋白质编码突变的DNA以通过移码将其失活，CRISPR-Cas9可纠正引起疾病的基因突变。或者，通过在突变的两侧切割DNA以将其切除，或在突变或重复侧翼的不同链上切口(如果距离小于200bp左右)，或通过使用修复模板和靶向一个或多个CRISPR-Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)，CRISPR-Cas9可纠正引起疾病的基因突变(编码或非编码)。因此，特定的突变序列可经基因编辑和修复。
施用于角膜细胞的CRISPR-Cas9可纠正引起角膜营养不良的遗传缺陷，因此用于治疗这些病症。CRISPR-Cas9治疗可经局部给予至眼睛的表面，通过植入给予或通过注射给予。植入或注射可给予至角膜、巩膜、眼睛内、结膜下、筋膜下或眼球后间隙，或在眼睑内或周围给予。CRISPR-Cas9还可施用于角膜或眼睛外面，以治疗除了富克斯内皮角膜营养不良之外的其它微卫星扩增疾病。治疗角膜营养不良和微卫星扩增疾病的CRISPR-Cas9方法可使用单一或多个指导RNA以失活或切除基因突变，或使用修复模板以纠正基因突变。在其它实施方案中，CRISPR-Cas9治疗可施用于非-眼睛组织以纠正导致微卫星扩增疾病的遗传缺陷。
在某些实施方案中，CRISPR-Cas9治疗的给予途径可随待接触的细胞或组织的位置和性质而改变，和包括例如，血管内、皮内、经皮、胃肠外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、区域性、由皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗、直接注射和经口给药和制剂，或以下给予途径的任何一种。术语“系统给予”是指以导致引入组合物至受试者的循环系统的方式给予，或以另外允许其扩散到整个身体的方式给予。“区域性”给予是指给予至特定的(和稍微较受限的)解剖学空间，例如腹膜内、鞘内、硬膜下，或特定的器官。“局部给予”是指给予组合物或药物至受限的或限定的解剖学空间，例如瘤内注射至肿瘤块，皮下注射，皮内或肌内注射。本领域技术人员将理解，局部给予或区域性给予也可导致组合物进入循环系统，即，在某种程度上使其全身性。例如，术语"血管内"应理解是指递送至患者的血管，意味着递送至患者的一个或多个血管、一个或多个血管内或一个或多个血管中，无论是全身性、区域性和/或局部给予。在某些实施方案中，给予可以是至称为静脉的血管(静脉内)，而在其它实施方案中，给予可以是至称为动脉的血管。静脉包括但不限于，颈内静脉、外周静脉、冠状静脉、肝静脉、门静脉、大隐静脉、肺静脉、上腔静脉、下腔静脉、胃静脉、脾静脉、肠系膜下静脉、肠系膜上静脉、头静脉和/或股静脉。动脉包括但不限于，冠状动脉、肺动脉、肱动脉、颈内动脉、弓动脉、股动脉、外周动脉和/或睫动脉。考虑到递送可通过或至微动脉或毛细管。
CRISPR-Cas系统可用于在真核细胞，包括哺乳动物细胞，例如人细胞中促进靶向基因组编辑。为了促进基因组编辑，待修饰的细胞用编码Cas9的表达载体或Cas9蛋白质、DNA或RNA本身，以及指导RNA分子本身或包含编码指导RNA分子的核酸分子的表达载体共转染。例如，在某些实施方案中，Cas9的引入可通过转染作为蛋白质、RNA、DNA或包含编码Cas9的核酸的表达载体的Cas9进行。在某些实施方案中，指导DNA本身可直接作为RNA分子(gRNA)、DNA分子或作为包含编码gRNA的核酸的表达载体给予。
尽管许多不同的CRISPR-Cas系统可经修饰以促进靶向基因组修饰，在靶向基因组修饰中最常用的CRISPR-Cas系统是来自酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9系统仅需要单一蛋白质Cas9以在指导RNA分子靶向的位点处催化双链DNA断裂。
多个指导RNA序列可在单一CRISPR阵列中编码以促进在细胞的基因组内的多个位点的同时编辑。例如，一对指导RNA可靶向位置接近的序列，以促进间插序列的缺失。在一些实施方案中，Cas9通过密码子优化的序列编码。编码Cas9的质粒，包括密码子优化的质粒和编码工程改造的Cas9切口酶的质粒，可公开获自Addgene (http://www.addgene.org/CRISPR/)。
关于CRISPR-Cas系统应用于靶向基因组工程改造的其它信息可见于Jinek等, Science 337:816-821 (2012); Cho等, Nature Biotechnology 31:230-232 (2013);Cong等, Science 339:819-823 (2013); Jinek等, eLife 2:e00471 (2013); Mali等, Science 339:823-826 (2013); Qi等, Cell 152:1173-1183 (2013); Fu等, Nature Biotechnology 31:822-826 (2013); Fu等, Nature Biotechnology 31:822-826(2013); Hsu等, Nature Biotechnology 31:827-832 (2013); Mali等, Nature Biotechnology 31:833-838 (2013); Pattanayak等, Nature Biotechnology 31:839-843 (2013)和WO/2013/142578，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
在本文提供的方法的一些实施方案中，靶核酸序列使用CRISPR/Cas系统修饰。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，受试者被给予编码Cas9的核酸和编码对眼睛中的靶核酸序列特异性的指导RNA的核酸。
在一些实施方案中，指导RNA包含靶标特异性的指导序列(例如，与靶标DNA序列的序列互补的序列)和指导RNA骨架序列。在一些实施方案中，靶标特异性的指导序列是选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342的任一个或其任何组合的核酸序列。靶标特异性的指导序列可包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342所示的核苷酸序列的核酸序列。
现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，本发明可在等同参数、浓度和条件的广泛范围内进行，而不背离本发明的精神和范围，并且无需过度实验。
本说明书通过以下实施例进一步举例说明，其不应以任何方式解释为限制。
实施例
鉴定了靶向引起角膜营养不良的已知突变的CRISPR-Cas9指导RNA (gRNA) (表1a-1c)。对应于表1中的gRNA ID的人类基因组序列列于表2。
已知转化生长因子β-诱导的(TGFBI)基因中的突变引起数种形式的角膜营养不良，包括Reis–Bücklers角膜营养不良、Thiel-Behnke角膜营养不良、格子状角膜营养不良、粒状角膜营养不良1型和粒状角膜营养不良2型(1)。在两个热点R124和R555处的错义突变是接近50%的TGFBI-相关角膜营养不良的原因(9)。
为了证实对于角膜营养不良的基于CRISPR的治疗的可行性，两个Cas9靶向位点被鉴定，其与编码TGFBI的R124和R555二者的基因组序列重叠：5’–TCAGCTGTACACGGACCGCACGG –3’ (SEQ ID NO: 145)和5’– AGAGAACGGAGCAGACTCTTGGG –3’(SEQ ID NO: 171)，分别位于外显子4和12中。在这些残基中特定的氨基酸置换导致临床不同的角膜营养不良：R124C - 格子状角膜营养不良I型；R124H - 粒状角膜营养不良2型；R555W - 粒状角膜营养不良1型；和R555Q - Reis–Bücklers角膜营养不良。
按所述(8)，将这两个靶位点克隆至pH1v1 (Addgene 60244)，和HEK293细胞用Cas9和指导RNA (gRNA)构建体共转染。转染后48或60小时，收获基因组DNA，和根据附录A(见下文)所列的引物扩增靶切割位点周围的序列。然后纯化PCR产物和定量，之后进行T7Endo I测定法。
简言之，将200ng的PCR产物变性，然后缓慢再退火以允许形成异型双链。将T7内切核酸酶I加入PCR产物和在37oC下孵育25/30分钟，以切割异型双链。通过将PCR产物放置在冰上终止反应，纯化和最终在6% TBE PAGE凝胶上运行以解析产物。凝胶用来自Promega的SYBR-Gold/ Diamond核酸染料染色，使用ImageJ可视化和量化。非同源末端连接(NHEJ)频率使用二项式导出公式计算：%基因修饰= X 100；其中“a”和“b”的值等于背景扣除后切割片段的积分面积，和“c”等于背景扣除后未切割PCR产物的积分面积。
结果(图1)表明，使用与相应突变重叠(TGFB1)或靶向重复区的5’或3’ (TCF4)的gRNA序列，所有鉴定的位点可被Cas9靶向。这些结果证实了破坏已知是角膜营养不良的原因的基因中的显性突变的能力。
治疗角膜营养不良和微卫星扩增疾病的CRISPR-Cas9方法可使用单一或多个指导RNA以失活或切除基因突变，或使用修复模板和同源定向修复以纠正基因突变。在导致FECD的TCF4微卫星扩增的情况下，可使用靶向微卫星扩增的一侧上的区域或微卫星扩增的两侧上的区域的一个或多个gRNA。表3显示了对于导致FECD的TCF4微卫星扩增上游的gRNA靶序列的ID和相应的人类基因组序列。表4显示了对于所述TCF4微卫星扩增下游的gRNA靶序列的ID和相应的人类基因组序列。在TCF4基因中的这些gRNA或其它可以任何组合使用，以纠正导致FECD的微卫星扩增。使用靶向微卫星扩增的一侧上的区域或微卫星扩增的两侧上的区域的一个或多个gRNA的类似方法可用于其它微卫星扩增疾病，包括但不限于表5所列的那些。
附录A
CRISPR靶标：
TGFBI (124)
hs101533615:TCAGCTGTACACGGACCGCACGG (SEQ ID NO: 145)
TGFBI (555)
hs101534962:AGAGAACGGAGCAGACTCTTGGG (SEQ ID NO: 171)
TCF4 (三核苷酸重复序列的下游)
hs056193532- AAGTGCAACAAGCAGAAAGGGGG (SEQ ID NO: 333)
hs056193533- GGCTGCAAAGCTGCCTGCCTAGG (SEQ ID NO: 334)
hs056193534- GCTGCAAAGCTGCCTGCCTAGGG (SEQ ID NO: 335)
hs056193535- CTGCCTAGGGCTACGTTTCCTGG (SEQ ID NO: 336)
hs056193536- CAGGAAACGTAGCCCTAGGCAGG (SEQ ID NO: 337)
hs056193537- TTGCCAGGAAACGTAGCCCTAGG (SEQ ID NO: 338)
TCF4 (三核苷酸重复序列的上游)
hs056193542- AAAGAGCCCCACTTGGAAGGCGG (SEQ ID NO: 195)
hs056193543- GCCCCACTTGGAAGGCGGTTTGG (SEQ ID NO: 196)
hs056193545- TCCAAACCGCCTTCCAAGTGGGG (SEQ ID NO: 198)
hs056193546- ATCCAAACCGCCTTCCAAGTGGG (SEQ ID NO: 199)
gRNA引物:
TGFBI(124)humanF;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCAGCTGTACACGGACCGCAG(SEQ ID NO: 173)
TGFBI(124)humanR;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGG(SEQ ID NO: 343)
TGFBI(555)humanF;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCAGAGAACGGAGCAGACTCTTG(SEQ ID NO: 344)
TGFBI(555)humanR;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAAGAGTCTGCTCCGTTCTCTGG(SEQ ID NO: 345)
hs537_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTTGCCAGGAAACGTAGCCCTG (SEQ IDNO: 352)
hs537_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGGGCTACGTTTCCTGGCAAG (SEQID NO: 353)
hs536_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCCAGGAAACGTAGCCCTAGGCG (SEQ IDNO: 354)
hs536_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGCCTAGGGCTACGTTTCCTGG; (SEQID NO: 355)
hs535_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCCTGCCTAGGGCTACGTTTCCG (SEQ IDNO: 356)
hs535_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGAAACGTAGCCCTAGGCAGG (SEQID NO: 357)
hs534_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGCTGCAAAGCTGCCTGCCTAG (SEQ IDNO: 358)
hs534_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTAGGCAGGCAGCTTTGCAGCG (SEQID NO: 359)
hs533_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGGCTGCAAAGCTGCCTGCCTG (SEQ IDNO: 360)
hs533_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGGCAGGCAGCTTTGCAGCCG (SEQID NO: 361)
hs532_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCAAGTGCAACAAGCAGAAAGGG (SEQ IDNO: 362)
hs532_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCTTTCTGCTTGTTGCACTTG (SEQID NO: 363)
hs542_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCAAAGAGCCCCACTTGGAAGGG (SEQ IDNO: 364)
hs542_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCTTCCAAGTGGGGCTCTTTG (SEQID NO: 365)
hs543_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGCCCCACTTGGAAGGCGGTTG (SEQ IDNO: 366)
hs543_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAACCGCCTTCCAAGTGGGGCG (SEQID NO: 367)
hs545_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCCAAACCGCCTTCCAAGTGG (SEQ IDNO: 368)
hs545_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTTGGAAGGCGGTTTGGAG (SEQID NO: 369)
hs546_H1for;CTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCATCCAAACCGCCTTCCAAGTG (SEQ IDNO: 370)
hs546_H1rev;CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACACTTGGAAGGCGGTTTGGATG (SEQID NO: 371)
T7Endo I基因组扩增引物:
TGFBI124.1F;CCACCTGTAGATGTACCGTGCTCTC (SEQ ID NO: 346)
TGFBI124.1R;AGGGGCTGCAGACTCTGTGTTTAAG (SEQ ID NO: 347)
TGFBI555.1F;AAGGAAAATACCTCTCAGCGTGGTG (SEQ ID NO: 348)
TGFBI555.1R;AGGCCTAGGGGTAGTAAAGGCTTCC (SEQ ID NO: 349)
TCF4.3F:TGCTTTGGATTGGTAGGACCTGTTC (SEQ ID NO: 372)
TCF4.3R: GGATAATGCACACCTTCCCTGAGTC (SEQ ID NO: 373)
TGFBI外显子4扩增子:
CCACCTGTAGATGTACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGAGGCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGTGAGATGACCTCCGTCTGCCCGGGGGACTCTTATGGGGAACTGCCTTACTTCCCCGAGGGGTGGGCATGATGAATGGGAGTCTGCAGTCATTTCCTACTGTTTCAGGAAGCTTTCTCCTTAACCCCTTAGAAAAGGCTGTGGAACTTGAGCTAAAATATGTCTTACCAGGTTGCGTCTAATGCCCCCCGTTCCCTACTGGGCAGAAAGACTTGGGTGCTTCCTGAGGAGGGATCCTTGGCAGAAGAGAGGCCTGGGCTCACGAGGGCTGAGAACATGTTTCCCAGAGTTGCAAGGACCCATCTCTTAAACACAGAGTCTGCAGCCCCT (SEQ ID NO: 350)
TGFBI外显子12扩增子:
AAGGAAAATACCTCTCAGCGTGGTGAGGTATTTAAGGAAAATACCTGTTGACAGGTGACATTTTCTGTGTGTGTATCTACAGCATGCTGGTAGCTGCCATCCAGTCTGCAGGACTGACGGAGACCCTCAACCGGGAAGGAGTCTACACAGTCTTTGCTCCCACAAATGAAGCCTTCCGAGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGCAGACTCTTGGGTAAAGACCAACTTAAGTACACGTCTCCATTTTTCTAAAGTAGTGATCCCTCAGGGCCCCAGCAGCAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTTGAAGGGATTTTATGACAAGACTATTAGTGAAAGAGTGGGCGGGACTAAAGGAACTAGCAAAGGATGAGGCCAACCAGGGACTAGCAACCCTGGGAAGCCTTTACTACCCCTAGGCCT (SEQ ID NO: 351)
TCF4基因扩增子:
TGCTTTGGATTGGTAGGACCTGTTCCTTACATCTTACCTCCTAGTTACATCTTTTCCTAGGATTCTTAAAACTAGTATGGATATGCTGAGCATACATTCTTTAGAACCTTTTGGACTGTTTTGGTAAATTTCGTAGTCGTAGGATCAGCACAAAGCGGAACTTGACACACTTGTGGAGTTTTACGGCTGTACTTGGTCCTTCTCCATCCCTTTGCTTCCTTTTCCTAAACCAAGTCCCAGACATGTCAGGAGAATGAATTCATTTTTAATGCCAGATGAGTTTGGTGTAAGATGCATTTGTAAAGCAAAATAAAAAGAATCCACAAAACACACAAATAAAATCCAAACCGCCTTCCAAGTGGGGCTCTTTCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCCTCCTCTTCTAGACCTTCTTTTGGAGAAATGGCTTTCGGAAGTTTTGCCAGGAAACGTAGCCCTAGGCAGGCAGCTTTGCAGCCCCCTTTCTGCTTGTTGCACTTTCTCCATTCGTTCCTTTGCTTTTTGCAGGCTCTGACTCAGGGAAGGTGTGCATTATCC (SEQ ID NO: 374)
表1a：根据ID和基因的影响角膜和重叠gRNA靶序列的已知基因突变。
表1b. 根据ID和病况的影响角膜和重叠gRNA靶序列的已知基因突变。
表1c：根据ID和gRNA的影响角膜和重叠gRNA靶序列的已知基因突变。
表2：根据表1中的ID和相应的人类基因组序列的gRNA靶序列
表3：根据ID和引起富克斯内皮角膜营养不良的微卫星扩增上游的TCF4基因中的人类基因组序列的gRNA靶序列
表4：根据ID和引起富克斯内皮角膜营养不良的微卫星扩增下游的TCF4基因中的人类基因组序列的gRNA靶序列
表5：微卫星扩增疾病/病况，括号中为受影响的基因
睑裂狭小、下垂和内眦赘皮反向并指症[FOXL2]
锁骨颅骨发育不全[RUNX2 CBFA1)]
先天性中枢性肺换气不足综合征、Haddad综合征[PHOX2B]
DM (强直性肌营养不良) [DMPK]
DRPLA (齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩) [ATN1或DRPLA]
FRAXA (脆性X染色体综合征) [ FMR1]
FRAXE (脆性XE智力低下) [AFF2或FMR2]
FRDA (弗里德赖希氏共济失调) [FXN或X25]
富克斯内皮角膜营养不良[TCF4]
FXTAS (脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征) [FMR1]
手-足-生殖器综合征[HOXA13]
HD (亨廷顿病) [HTT (Huntingtin)]
前脑无裂畸形(HPE5) [ZIC2]
伴有生长激素缺乏的智力低下[SOX3]
智力低下、癫痫、韦斯特综合征、Partington综合征[ARX]
眼咽肌营养不良[PABPN1]
SBMA (脊柱和延髓肌萎缩) [AR]
SCA1 (脊髓小脑性共济失调1型) [ATXN1]
SCA12 (脊髓小脑性共济失调12型) [PPP2R2B或SCA12]
SCA17 (脊髓小脑性共济失调17型) [TBP]
SCA2 (脊髓小脑性共济失调2型) [ATXN2]
SCA3 (脊髓小脑性共济失调3型或马-约病) [ATXN3]
SCA6 (脊髓小脑性共济失调6型) [CACNA1A]
SCA7 (脊髓小脑性共济失调7型) [ATXN7]
SCA8 (脊髓小脑性共济失调8型) [OSCA或SCA8]
并指症[HOXD13]
参考文献
1.Weiss JS, Moller HU, Aldave AJ等. IC3D classification of cornealdystrophies –第2版. Cornea 2015;34:117-159.
2.Afshari NA, Bouchard CS, Colby KA等. Corneal dystrophies and ectasias.In: Weisenthal RW, ed. 2014–2015 Basic and Clinical Science Course, Section8: External Disease and Cornea. San Francisco; American Academy ofOphthalmology; 2014:253–287.
3.Weiss JS, Moller HU, Lisch W等. The IC3D classification of the cornealdystrophies. Cornea 2008;27(suppl2):S1-S83.
4.Wieben ED, Aleff RA, Eckloff BW, Atkinson EJ, Baheti S, Middha S等.Comprehensive Assessment of Genetic Variants Within TCF4 in Fuchs'Endothelial Corneal Dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science.2014;55(9):6101-7.
5.Nelson DL, Orr HT, Warren ST. The unstable repeats--three evolvingfaces of neurological disease. Neuron. 2013 Mar 6;77(5):825-43.
6.Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9for genome engineering. Cell. 2014;157(6):1262-78.
7.Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genomeengineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
8.Ranganathan V, Wahlin K, Maruotti J, Zack DJ. Expansion of the CRISPR-Cas9 genome targeting space through the use of H1 promoter-expressed guideRNAs. Nature Communications. 2014;5:4516.
9.Munier FL, Frueh BE, Othenin-Girard P, Uffer S, Cousin P, Wang MX, HeonE, Black GC M, Blasi MA, Balestrazzi E, Lorenz B, Escoto R, Barraquer R,Hoeltzenbein M, Gloor B, Fossarello M, Singh AD, Arsenijevic Y, Zografos L,Schorderet DF. BIGH3 mutation spectrum in corneal dystrophies. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 43: 949-954, 2002.
10.Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z,Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JJ, Aryee MJ, Joung JK. EngineeredCRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015 Jun 22.doi: 10.1038/nature14592.
等同方案
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确认本文所述的发明的特定实施方案的许多等同方案。尽管已经论述了本发明的特定实施方案，但以上说明书是说明性的而不是限制性的。对于本领域技术人员在参考本说明书时，本发明的许多变化可变得显而易见。本发明的完整范围应参考权利要求书，以及它们的完整范围的等同方案，和本说明书，以及这样的变化来确定。这样的等同方案意图由所附权利要求书来涵盖。

Claims (30)

1.用于治疗影响受试者的眼睛组织的病症的方法，所述方法包括给予受试者的眼睛区域治疗有效量的核酸酶系统，其包含基因组靶向核酸酶和包含至少一个靶向基因组序列的指导DNA。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸酶作为蛋白质、RNA、DNA或包含编码所述核酸酶的核酸的表达载体提供。
3.权利要求1的方法，其中所述指导DNA作为RNA分子(gRNA)、DNA分子或包含编码所述gRNA的核酸的表达载体提供。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统是CRISPR-Cas9。
5.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统使基因突变失活或切除基因突变。
6.权利要求1的方法，还包含DNA双链断裂(DSB)修复系统。
7.权利要求6的方法，其中所述DSB修复系统包含与或不与非同源末端连接(NHEJ)或靶向一个或多个CRISPR-Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)组合的修复模板，所述位点纠正或编辑基因组突变。
8.权利要求1的方法，其中所述基因组靶向核酸酶是Cas9。
9.权利要求1的方法，其中所述病症是角膜营养不良或微卫星扩增疾病。
10.权利要求1的方法，其中所述眼睛区域是角膜。
11.权利要求1的方法，其中所述指导DNA包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向基因组序列。
12. 权利要求11的方法，其中所述靶向基因组序列选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342所示的任何一个核苷酸序列，或其任何组合。
13.权利要求9的方法，其中所述角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良、上皮复发性糜烂营养不良、上皮下粘液性角膜营养不良、Meesmann角膜营养不良、Lisch上皮角膜营养不良、凝胶滴样角膜营养不良、Reis–Bucklers角膜营养不良、Thiel–Behnke角膜营养不良、格子状角膜营养不良1型(典型)、格子状角膜营养不良2型、格子状角膜营养不良III型、格子状角膜营养不良IIIA型、格子状角膜营养不良I/IIIA型、格子状角膜营养不良IV型、多形性(角膜)淀粉样变、粒状角膜营养不良1型、粒状角膜营养不良2型、斑点角膜营养不良、Schnyder角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、斑点状角膜营养不良、后部无定形角膜营养不良、Francois中央浑浊性营养不良、德斯密膜前角膜营养不良、富克斯内皮角膜营养不良、后部多形性角膜营养不良、先天遗传性内皮营养不良和X-连锁内皮角膜营养不良。
14. 权利要求9的方法，其中微卫星扩增疾病选自睑裂狭小、下垂和内眦赘皮反向并指症、锁骨颅骨发育不全、先天性中枢性肺换气不足综合征、Haddad综合征、DM (强直性肌营养不良)、FRAXA (脆性X染色体综合征)、FRAXE (脆性XE智力低下)、FRDA (弗里德赖希氏共济失调)、富克斯内皮角膜营养不良、FXTAS (脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征)、手-足-生殖器综合征、HD (亨廷顿病)、前脑无裂畸形、伴有生长激素缺乏的智力低下、智力低下、癫痫、韦斯特综合征、Partington综合征、眼咽肌营养不良、SBMA (脊柱和延髓肌萎缩)、SCA1 (脊髓小脑性共济失调1型)、SCA12 (脊髓小脑性共济失调12型)、SCA17 (脊髓小脑性共济失调17型)、SCA2 (脊髓小脑性共济失调2型)、SCA3 (脊髓小脑性共济失调3型或马-约病)、SCA6 (脊髓小脑性共济失调6型)、SCA7 (脊髓小脑性共济失调7型)、SCA8 (脊髓小脑性共济失调8型)和并指症。
15.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统经局部给予至眼睛的表面。
16.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统在角膜、巩膜上或外面给予，给予至眼睛内、结膜下、筋膜下或眼球后间隙，或在眼睑内或周围给予。
17.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统通过植入、注射或病毒给予。
18.用于治疗影响受试者的非-眼睛组织的病症的方法，所述方法包括给予受试者的非-眼睛组织治疗有效量的核酸酶系统，所述核酸酶系统包含基因组靶向核酸酶和包含至少一个靶向基因组序列的指导DNA。
19.权利要求18的方法，其中所述核酸酶作为蛋白质、RNA、DNA或包含编码核酸酶的核酸的表达载体提供。
20.权利要求18的方法，其中所述指导DNA作为RNA分子(gRNA)、DNA分子或包含编码gRNA的核酸的表达载体提供。
21.权利要求18的方法，其中所述核酸酶系统是CRISPR-Cas9。
22.权利要求18的方法，其中所述核酸酶系统使基因突变失活或切除基因突变。
23.权利要求18的方法，进一步包含DNA双链断裂(DSB)修复系统。
24.权利要求23的方法，其中所述DSB修复系统包含与非同源末端连接(NHEJ)或靶向一个或多个CRISPR-Cas9切割位点的同源定向修复(HDR)组合的修复模板，所述位点纠正或编辑基因组突变。
25.权利要求18的方法，其中所述基因组靶向核酸酶是Cas9。
26.权利要求18的方法，其中所述病症是微卫星扩增疾病。
27.权利要求18的方法，其中所述指导DNA包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向基因组序列。
28. 权利要求27的方法，其中所述靶向基因组序列选自SEQ ID NOs: 1-172和174-342所示的任何一个核苷酸序列，或其任何组合。
29. 权利要求26的方法，其中所述微卫星扩增疾病选自睑裂狭小、下垂和内眦赘皮反向并指症、锁骨颅骨发育不全、先天性中枢性肺换气不足综合征、Haddad综合征、DM (强直性肌营养不良)、FRAXA (脆性X染色体综合征)、FRAXE (脆性XE智力低下)、FRDA (弗里德赖希氏共济失调)、富克斯内皮角膜营养不良、FXTAS (脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征)、手-足-生殖器综合征、HD (亨廷顿病)、前脑无裂畸形、伴有生长激素缺乏的智力低下、智力低下、癫痫、韦斯特综合征、Partington综合征、眼咽肌营养不良、SBMA (脊柱和延髓肌萎缩)、SCA1 (脊髓小脑性共济失调1型)、SCA12 (脊髓小脑性共济失调12型)、SCA17 (脊髓小脑性共济失调17型)、SCA2 (脊髓小脑性共济失调2型)、SCA3 (脊髓小脑性共济失调3型或马-约病)、SCA6 (脊髓小脑性共济失调6型)、SCA7 (脊髓小脑性共济失调7型)、SCA8 (脊髓小脑性共济失调8型)和并指症。
30.权利要求18的方法，其中所述核酸酶系统经局部、血管内、皮内、经皮、胃肠外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、区域性、由皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗、直接通过注射或通过给药和制剂经口给予。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111757889A (zh) * 2018-10-29 2020-10-09 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统
CN111849991A (zh) * 2020-08-05 2020-10-30 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种寡核苷酸及其应用

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
EP3155101B1 (en) 2014-06-16 2020-01-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of crispr guide rnas using the h1 promoter
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
EP4036228A1 (en) * 2015-11-13 2022-08-03 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
KR20180134412A (ko) * 2016-04-22 2018-12-18 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2020046861A1 (en) * 2018-08-27 2020-03-05 Avellino Lab Usa, Inc. Crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11512312B2 (en) 2017-03-10 2022-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Treatment of Fuchs' endothelial corneal dystrophy
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US20200149041A1 (en) * 2017-06-07 2020-05-14 The University Of Tokyo Gene Therapy Drug for Granular Corneal Degeneration
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
DE102017131324A1 (de) 2017-12-27 2019-06-27 Beckhoff Automation Gmbh Statormodul und Planarantriebssystem
CN108949823B (zh) * 2017-12-29 2020-02-14 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法
KR102126573B1 (ko) 2018-10-18 2020-06-26 대한민국 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법 및 이의 용도
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
WO2021076883A2 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Brown University Muscle regeneration and growth
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2023086842A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Prime Medicine, Inc. Genome editing compositions and methods for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy
WO2023092132A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Mammoth Biosciences, Inc. Effector proteins and uses thereof
WO2024097900A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Emendobio Inc. Compositions and methods for transcription factor 4 (tcf4) repeat expansion excision

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015089354A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089462A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8993233B2 (en) * 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20160237455A1 (en) * 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
KR20180134412A (ko) * 2016-04-22 2018-12-18 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015089354A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089462A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COURTNEY DG等: "Homo sapiens transforming growth factor, beta-induced, 68kDa (TGFBI), mRNA", 《NCBI GENBANK》 *
COURTNEY, DG等: "Development of Allele-Specific Gene-Silencing siRNAs for TGFBI Arg124Cys in Lattice Corneal Dystrophy Type I", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *
JEFFRY D SANDER等: "CRISPR-Cas systems for genome editing, regulation and targeting", 《NAT BIOTECHNOL》 *
杜建勇等: "一种 gＲNA 快速合成及检测方法的建立", 《中国实验动物学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111757889A (zh) * 2018-10-29 2020-10-09 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统
CN111849991A (zh) * 2020-08-05 2020-10-30 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种寡核苷酸及其应用
CN111849991B (zh) * 2020-08-05 2022-04-08 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种寡核苷酸及其应用

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