JP2022009734A - タイチン系ミオパチー及び他のタイチノパチーの治療のための材料及び方法 - Google Patents

タイチン系ミオパチー及び他のタイチノパチーの治療のための材料及び方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022009734000001
【課題】タイチン系ミオパチー及び他のタイチノパチーの治療のための材料及び方法の提供。
【解決手段】本出願は、タイチン系ミオパチー、特にタイチン系心筋症、及び／または他のタイチノパチーを有する患者を治療するための材料及び方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集によって細胞内のタイチン遺伝子を編集するための材料及び方法を提供する。１つの態様では、ゲノム編集によってヒト細胞内のタイチン遺伝子を編集するための方法であって、該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、該タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす該タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む方法が、本明細書に提供される。
【選択図】図１Ｂ

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／２５５，８８７号に対する優先権を主張する。
本出願は、タイチン系ミオパチー、特にタイチン系心筋症、及び／または他のタイチノパチー（ｔｉｔｉｎｏｐａｔｈｙ）を有する患者を治療するための材料及び方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集によって細胞内のタイチン遺伝子を編集するための材料及び方法を提供する。
タンパク質タイチンは、以前は「コネクチン」と呼ばれており、ヒトの体内で最大のタンパク質である。それは、骨格筋の分子ばねとして機能する。ヒトタイチン遺伝子は、染色体２ｑ３１上に位置する。タイチン遺伝子のコーディング領域は、３６４個のエクソンを含み、その３６３個は、３８，１３８個のアミノ酸残基（４，２００ｋＤ）をコードする（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７７８９２）。骨格筋タイチンタンパク質の大きさは、３，７００ｋＤであり、そのインビボの物理的長さは、２μｍである。タイチンは、横紋筋において機械的、発達的、及び調節的な役割を有する。その４つの領域（Ｚ盤、Ｉ帯、Ａ帯、及びＭ線）は、筋肉の基本構築要素、筋節の２分の１の長さに跨る。図１、パネルＡを参照されたい［Ｃｈｅｖｅａｕら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３５（９）：１０４６－１０５９（２０１４）から再作成］。タイチンの主な機能の１つは、筋節の収縮要素を定位置に維持することであり、これは筋肉の弾力性に関与している。
タイチンは、代替スプライシングのためのいくつかの部位を有し、異なる長さのアイソフォームを異なる筋肉内に出現させる［Ｂａｎｇら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８９：１０６５－１０７２（２００１）］。Ｉ帯アイソフォームは、骨格筋（３，７００ｋＤ）において心筋（２，９７０～３，３００ｋＤ）におけるよりも長いことが観察されており、一方、Ｚ盤においては、心筋タイチンは、骨格筋タイチンよりも多くの反復モチーフを含む（Ｇａｕｔｅｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０９：２７４７－２７５４ １９９６；Ｓｏｒｉｍａｃｈｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７０：６８８－６９５ １９９７）。タイチンのＣ末端短縮型７００－ｋＤアイソフォームは、心筋内に発現される（Ｂａｎｇら、上記参照）。タイチンのＭ線領域もまた、差別的に発現され、Ｍｅｘ５＋及びＭｅｘ５－の２つの異なるスプライスアイソフォームが同定されている（Ｌａｂｅｉｔ ａｎｄ Ｋｏｌｍｅｒｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９３－２９６ １９９５；Ｋｏｌｍｅｒｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５６：５５６－５６３１９９６；Ｓｏｒｉｍａｃｈｉら、上記参照）。超構造レベルでは、カルボキシ末端Ｍｅｘ６タイチンエピトープ及び触媒タイチンキナーゼドメインのどちらも、Ｍ線格子の周縁内に局在化されている（Ｏｂｅｒｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ １６：２１１－２２０ １９９７）。Ｍｅｘ５／Ｍｅｘ６タイチンエピトープ、触媒タイチンキナーゼドメイン、ならびにタイチンのこの領域に結合されるｐ９４及び筋肉特異的ｒｉｎｇフィンガー－１（ＭＵＲＦ－１）タンパク質は、シグナル複合体を形成し得る（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉら、上記参照；Ｃｅｎｔｎｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０６：７１７－７２６ ２００１）。いくつかの異なるタイチンアイソフォームの発生は、解剖学的に制限されたミオパチーにおける筋肉の選択的関与に関連し得る（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉら、上記参照）。近年、常染色体優性の拡張型心筋症は、フレームシフトを引き起こすエクソン３２６内のＡ帯タイチン変異、及びＺ盤タイチン内の変異に関連付けられることが示された［Ｓｉｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：１０２２－１０２６（１９９９）；Ｇｅｒｕｌｌら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３０：２０１－２０４（２００２）］。
タイチンは、多数の他の筋肉タンパク質のためのリガンド結合部位を提供する。図１のパネルＢを参照されたい［Ｃｈｅｖｅａｕら（上記参照）から再作成］。
異なる細胞内のタイチン遺伝子の代替スプライシングは、変更されたアイソフォーム組成物及びタンパク質の受動的剛性の変動をもたらし、転じて筋肉の機能性及び安定性に影響を及ぼす。特に心筋において、胎児の心臓タイチンは、非常に長いばねセグメントを有し、成人のＮ２Ｂアイソフォームは、より短くより剛性のばねを有し、成人のＮ２ＢＡアイソフォームは、中程度のより柔軟なばねを有し、Ｎ２Ａ骨格筋特異的アイソフォームは、長いばね長さを有する［ＬｅＷｉｎｔｅｒ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｕｌ １３ ２００４；１１０（２）：１０９－１１１］。正常な心臓では、タイチンは、生理学的筋節長さにおける受動的心筋剛性の主要な決定因子である［Ｇｒａｎｚｉｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．Ｏｃｔ ７ ２０１４；１１１（４０）：１４５８９－１４５９４］。
心臓の筋肉における減少する量のＮ２ＢＡアイソフォームは、末期心不全［ＭｃＮａｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｆｅｂ ３ ２０１５；２１（２）：１７４－１８２］及び非虚血性拡張型心筋症（ＤＣＭ）［ＬｅＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒａｎｚｉｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｍａｒ ２０１４；６３（３）：２０７－２１２．；Ｍａｋａｒｅｎｋｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｏｃｔ １ ２００４；９５（７）：７０８－７１６；Ｊａｂｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｓｅｐ ２００８；１（３）：１９２－１９９］を有するものの特徴である。筋節の受動的張力は、ＤＣＭ成人患者ではおよそ３０％低減され、この張力の損失は、タイチンの損失及び増大された線維症の結果である［Ｍａｋａｒｅｎｋｏら、上記参照］。近年、５，２００人の患者に対して、ＤＣＭをもたらす病原性変異を同定するためにタイチンの配列決定が行われ［Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊａｎ １４ ２０１５；７（２７０）：２７０ｒａ２７６］、家族性ＤＣＭ症例の３０％がタイチン系変異、特にＣ末端短縮型変異に起因することが同定された［Ｈｅｒｍａｎら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；３６６（７）：６１９－６２８；Ｇｅｒｕｌｌら、上記参照；Ｉｔｏｈ－Ｓａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２００２；２９１（２）：３８５－３９３；Ｇｅｒｕｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００６；８４（６）：４７８－４８３］。非虚血性ＤＣＭは、２５０人中１人に発生し、心不整脈、心不全、及び心臓移植の重要な原因である。
タイチン系ミオパチーまたは他のタイチノパチーのための治癒または治療はこれまでにないため、タイチン系ミオパチー及び／または他のタイチノパチーを治療するための製品及び方法を提供する必要性が当該技術分野において存在する。
Ｃｈｅｖｅａｕら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３５（９）：１０４６－１０５９（２０１４） Ｂａｎｇら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８９：１０６５－１０７２（２００１）
タイチン系心筋症及び他のタイチノパチーを治療するために使用され得る、ゲノム編集によってタイチン遺伝子内の１つ以上の変異を修正すること、及びタイチンタンパク質活性を回復させることによってゲノムにおける恒久的な変化を作成するためのエクスビボ及びインビボ方法、ならびにかかる方法を実施するための構成要素、キット、及び組成物、ならびにそれらによって生成される細胞が、本明細書に提供される。
１つの態様では、ゲノム編集によってヒト細胞内のタイチン遺伝子を編集するための方法であって、該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、該タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす該タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む方法が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、タイチン系心筋症または他のタイチノパチーを有する患者を治療するためのエクスビボ方法であって、該患者の心臓の生検を実施するステップと、内因性心臓幹細胞（ｅＣＳＣ）または初代心筋細胞が挙げられるがこれらに限定されない心臓前駆細胞を単離するステップと、該ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞のタイチン遺伝子を編集するステップと、該ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を該患者にインプラントするステップと、を含む方法である。
いくつかの実施形態では、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を単離するステップは、消化酵素を用いた新鮮な心臓組織のかん流、細胞分画遠心法、及び細胞培養を含む。
いくつかの実施形態では、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞のタイチン遺伝子を編集するステップは、該前駆細胞または初代心筋細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、該タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす該タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む。
いくつかの実施形態では、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を患者にインプラントするステップは、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を局所注射または全身注入によって患者にインプラントすることを含む。
いくつかの実施形態では、タイチン系心筋症及び／または他のタイチノパチーを有する患者を治療するためのインビボ方法であって、該患者の細胞内のタイチン遺伝子を編集するステップを含む方法が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、インビボで患者の細胞内のタイチン遺伝子を編集するステップは、該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、該タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす該タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはそれらの種ホモログ、コドン最適化された、もしくは修飾されたバージョンである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＮＨドメインにわたって少なくとも９０％、９５％、または９８％の同一性を、及びＲｕｖＣドメインに対して少なくとも９０％、９５％、または９８％の同一性を保持する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、アシダミノコッカスｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、アシダミノコッカスｓｐ．ＢＶ３Ｌ６またはラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６エンドヌクレアーゼと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＲｕｖＣドメインに対して少なくとも９０％、９５％、または９８％の同一性を保持する。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡは、修飾されたポリヌクレオチドまたはＲＮＡであり、任意に、修飾された主鎖、糖部分、ヌクレオシド間連結、及び修飾されたまたはユニバーサルな塩基を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡ、または１つ以上のｓｇＲＮＡは、修飾されたＲＮＡであり、任意に、修飾された主鎖、糖部分、ヌクレオシド間連結、及び修飾されたまたはユニバーサルな塩基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと予備複合体化される。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、野生型タイチン遺伝子またはｃＤＮＡの一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型タイチン遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、該１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、該タイチン遺伝子内のＤＳＢ遺伝子座における１つの二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、該ＤＳＢ遺伝子座における染色体ＤＮＡ内への、該ＤＳＢ遺伝子座に近位の該タイチン遺伝子の該染色体ＤＮＡの一部の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす該ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する、１つの二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成する、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、該ｇＲＮＡは、該ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、近位は、ＤＳＢ遺伝子座の上流と下流との両方のヌクレオチドを意味する。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型タイチン遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、該１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、該タイチン遺伝子内の一対の二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、第１のものが５’ＤＳＢ遺伝子座に、及び第２のものが３’ＤＳＢ遺伝子座にあり、該５’ＤＳＢ遺伝子座と該３’ＤＳＢ遺伝子座との間の染色体ＤＮＡ内への、該タイチン遺伝子内の該５’ＤＳＢ遺伝子座と該３’ＤＳＢ遺伝子座との間の該染色体ＤＮＡの恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらすポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する、一対の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成する２つ以上Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、該第１のガイドＲＮＡは、該５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、該第２のガイドＲＮＡは、該３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つまたは２つのｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくはｓｇＲＮＡは、修飾されたｇＲＮＡまたは修飾されたｓｇＲＮＡであり、任意に、修飾された主鎖、糖部分、ヌクレオシド間連結、及び修飾されたまたはユニバーサルな塩基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つまたは２つのｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと予備複合体化される。
いくつかの実施形態では、ＤＳＢは、タイチン遺伝子のタイチンエクソン２１９、タイチンエクソン２４２、もしくはタイチンエクソン内にあり、または５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢが、それぞれ、イントロン２１８及びイントロン２１９内にあるか、もしくはそれぞれイントロン３２５及びイントロン３２７内にある。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、以下の病理学的変異体のうちの１つ以上に指向される：ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃ、ｃ．３７１１２Ｇ＞Ａ、及びｃ４３６２ｉｎｓＡＴ。
いくつかの実施形態では、修正は、相同指向修復（ＨＤＲ）による。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートは、各々別々に脂質ナノ粒子に製剤化されるか、またはすべて脂質ナノ粒子に共製剤化されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、送達は、局所注射または全身注入による。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートの両方は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達される。いくつかの実施形態では、送達は、局所注射または全身注入による。
いくつかの実施形態では、タイチン遺伝子は、染色体２ｑ３１上に位置する（ゲノムリファレンスコンソーシアム－ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）。
別の態様では、タイチン系心筋症またはタイチノパチーを有する患者に由来する細胞内のタイチン遺伝子を編集するための図中のスペーサー配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、修飾されたｇＲＮＡまたは修飾されたｓｇＲＮＡであり、任意に、修飾された主鎖、糖部分、ヌクレオシド間連結、及び修飾されたまたはユニバーサルな塩基を含む。
別の態様では、前述の方法によってタイチン遺伝子内の１つ以上の変異を恒久的に修正し、タイチンタンパク質活性を回復させるように修飾されている細胞が、本明細書に提供される。さらに、そのゲノムが前述の方法によって修飾されている細胞を患者に投与することによって、タイチン系心筋症及び／またはタイチノパチーを改善するための方法が、本明細書に提供される。
種々の他の態様及び実施形態が、本明細書に説明及び例示される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ゲノム編集によってヒト細胞内のタイチン遺伝子を編集するための方法であって、前記細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす前記タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む、方法。
（項目２）
タイチン系心筋症または他のタイチノパチー（ｔｉｔｉｎｏｐａｔｈｙ）を有する患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
ｉ）前記患者の心臓の生検を実施するステップと、
ｉｉ）内因性心臓幹細胞（ｅＣＳＣ）または初代心筋細胞を単離するステップと、
ｉｉｉ）前記ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞のタイチン遺伝子を編集するステップと、
ｉｖ）前記ゲノム編集されたｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を前記患者にインプラントするステップと、を含む、方法。
（項目３）
前記単離するステップが、消化酵素を用いた新鮮な心臓生検組織のかん流、細胞分画遠心法、及び細胞培養を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記編集するステップが、前記ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす前記タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む、項目２～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記インプラントするステップが、前記ゲノム編集されたｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を、局所注射または全身注入によって前記患者にインプラントすることを含む、項目２～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
タイチン系心筋症または他のタイチノパチーを有する患者を治療するためのインビボ方法であって、前記患者の細胞内のタイチン遺伝子を編集するステップを含む、方法。
（項目７）
前記編集するステップが、前記細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記タイチン遺伝子内の１つ以上の変異の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす前記タイチン遺伝子内の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成することを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはそれらのホモログ、コドン最適化された、もしくは修飾されたバージョンである、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目９）
前記細胞に、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞に、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡが、修飾されたポリヌクレオチドまたはＲＮＡである、項目９または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞に１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記１つ以上のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、修飾されたｇＲＮＡまたは修飾されたｓｇＲＮＡである、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと予備複合体化される、項目１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞に、野生型タイチン遺伝子またはｃＤＮＡの一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記野生型タイチン遺伝子またはｃＤＮＡの前記一部が、前記タイチン遺伝子またはｃＤＮＡ全体である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記方法が、前記細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、前記野生型タイチン遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記タイチン遺伝子内のＤＳＢ遺伝子座における１つの二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＤＳＢ遺伝子座における染色体ＤＮＡ内への、前記ＤＳＢ遺伝子座に近位の前記タイチン遺伝子の前記染色体ＤＮＡの一部の恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する、１つの二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成する１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、前記ｇＲＮＡが、前記ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目１９）
近位が、前記ＤＳＢ遺伝子座の上流と下流との両方のヌクレオチドを意味する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、前記野生型タイチン遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記タイチン遺伝子内の１対の二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、第１のものが５’ＤＳＢ遺伝子座に、及び第２のものが３’ＤＳＢ遺伝子座にあり、前記５’ＤＳＢ遺伝子座と前記３’ＤＳＢ遺伝子座との間の染色体ＤＮＡ内への、前記タイチン遺伝子内の前記５’ＤＳＢ遺伝子座と前記３’ＤＳＢ遺伝子座との間の前記染色体ＤＮＡの恒久的な修正とタイチンタンパク質活性の回復とをもたらす前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する、１対の二本鎖切断（ＤＳＢ）を達成する２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、前記第１のガイドＲＮＡが、前記５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー並列を含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは２つのｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡが、修飾されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡである、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは２つのｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと予備複合体化される、項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記野生型タイチン遺伝子またはｃＤＮＡの前記一部が、前記タイチン遺伝子またはｃＤＮＡ全体である、項目１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ＤＳＢ、または５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢが、前記タイチン遺伝子のエクソン２１９、イントロン２４２、またはエクソン２１９及びイントロン２４２の両方にある、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、以下の病理学的変異体：ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃ、ｃ．３７１１２Ｇ＞Ａ、ｃ．４３６２８ｉｎｓＡＴ、ｐ．ＥＥ３３５９ Ｗ３３３６２ｄｅｌｉｎｓＶＫＥＫ、ｃ．６２８９０ｄｅｌＧ、タイチンのＰＥＶＫ領域内に位置するエクソン１１２～２２５内に位置する変異、エクソン４８（Ｎｏｖｅｋ ３アイソフォーム）内の変異、及び心臓Ｎ２Ｂアイソフォーム内の変異、のうちの１つ以上に指向される、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目２７）
前記修正が、相同指向修復（ＨＤＲ）による、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートが、各々別々に脂質ナノ粒子に製剤化されるか、またはすべて脂質ナノ粒子に共製剤化されるかのいずれかである、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓ９ ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子に製剤化され、前記ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートの両方が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達される、項目１、２、または６に記載の方法。
（項目３０）
前記タイチン遺伝子が、染色体２ｑ３１（ゲノムリファレンスコンソーシアム－ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）上に位置する、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
心筋ミオパチーまたは他のタイチノパチーを有する患者に由来する細胞内のタイチン遺伝子を編集するための図中の配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
（項目３２）
前記１つ以上のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目３２に記載の１つ以上のｇＲＮＡ。
（項目３３）
前記１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、修飾されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡである、項目３１または３２に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
（記載なし） （記載なし） 図２は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたタイチンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。 図３は、ｇＲＮＡ構造及び配列を示す。 図４は、ドナーテンプレートを示す。 図５は、ＰＣＲ生成物を、０．７％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で走らせた結果を示す。 図６は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたそれぞれのイントロンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。 図７は、エクソン２１９を欠失させるために、一対のｓｇＲＮＡの一方または両方の構成部員において代替的に使用され得た２１ｂｐスペーサー配列を示す。 図８は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたタイチンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。 図９は、選択される２つのＰＡＭのセット（各イントロンに対して１セット）、及び選択されるそれぞれのイントロンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡ）の２１ｂｐスペーサー配列を示す。
タイチノパチー
タイチノパチーは、タイチン遺伝子の両コピーを不活性化するホモ接合または複合ヘテロ接合変異に関与する状態である。
タイチノパチーに関連付けられる種々の変異が存在し、それらは、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、及び他の変異の組み合わせである。種々の変異は、遺伝子のエクソン全体にわたって分布される。一般的な変異としては、限定されるものではないが、ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃ、ｃ．３７１１２Ｇ＞Ａ、ｃ４３６２ｉｎｓＡＴ、ｃ．４３６２８ｉｎｓＡＴ、ｐ．ＥＥ３３５９ Ｗ３３３６２ｄｅｌｉｎｓＶＫＥＫ（米国特許公開第２０１３／０１７１１７２ Ａ１号）、ｃ．６２８９０ｄｅｌＧ、タイチンのＰＥＶＫ領域内に位置するエクソン１１２～２２５内に位置する変異、エクソン４８（Ｎｏｖｅｋ ３アイソフォーム）内の変異、及び心臓Ｎ２Ｂアイソフォーム内の変異が挙げられる。
タイチン系ミオパチーは、タイチン遺伝子内の変異（複数可）が筋障害をもたらすタイチノパチーである。筋障害としては、限定されるものではないが、異常な筋疲労、筋力低下、筋肉の衰え、及び／または筋肉線維症のうちの少なくとも１つが挙げられる。いくつかの実施形態では、タイチン系ミオパチーは、タイチン系心筋症である。
タイチン系ミオパチーとしては、限定されるものではないが、中心核ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｊ、拡張型心筋症、早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー、致死性心筋症を伴う早期発症型ミオパチー、肥大型心筋症、及び脛骨筋ジストロフィーが挙げられる。
治療的アプローチ
タイチン遺伝子内の１つ以上の変異を修正すること、及びタイチンタンパク質活性を回復させることによって、ゲノム改変ツールを使用してゲノムに対する恒久的な変化を作成するためのエクスビボ及びインビボ方法が、本明細書に提供される。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、タイチン遺伝子のゲノム遺伝子座内の天然スプライシングまたは天然コーディング領域を恒久的に回復させる。
タイチン系心筋症またはタイチノパチーを有する患者を治療するための方法が、本明細書に提供される。かかる方法の実施形態は、エクスビボの細胞系療法である。
エクスビボの細胞系療法のいくつかの実施形態では、患者の心臓の生検が実施される。次に、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞が、生検された材料から単離される。次に、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に説明される材料及び方法を使用して修正される。最後に、ゲノム編集されたｅＣＳＣまたは初代心筋細胞が、患者にインプラントされる。
かかる方法の別の実施形態は、インビボ系療法である。この方法では、患者内の細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に説明される材料及び方法を使用して修正される。
インビボ遺伝子療法の利点は、治療薬の生成及び投与の容易さである。同一の治療的アプローチ及び療法は、例えば、同一または類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する多数の患者等の複数の患者を治療するために使用される可能性を有する。対照的に、エクスビボ細胞療法は、典型的には患者自身の細胞の使用を必要とし、その細胞は、単離され、操作され、同一の患者に戻される。
本発明の方法は、エクスビボ方法かインビボ方法かにかかわらず、遺伝子内の１つ以上の特定の変異を修正することか、または外因性タイチンｃＤＮＡ配列もしくはその断片を遺伝子の遺伝子座内に、もしくはゲノム内の非相同の場所（ＡＡＶＳ１等のセーフハーバー部位等）に導入することかのいずれかを含む。修正及びノックイン戦略のどちらも、相同指向修復（ＨＤＲ）においてドナーＤＮＡテンプレートを利用する。いずれかの戦略におけるＨＤＲは、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによってゲノム内の特定の部位において１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作成することによって、達成され得る。
例えば、修正戦略は、外から導入されるドナーＤＮＡテンプレートの存在下で、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを用いて関心の遺伝子内に１つの二本鎖切断を誘導するか、または２つ以上の適切なｓｇＲＮＡを使用して関心の遺伝子内に２つ以上の二本鎖切断を誘導して、細胞ＤＳＢ応答を相同指向修復に指向することによって、遺伝子内の特定の変異を修正することを含む（ドナーＤＮＡテンプレートは、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり得る）。このアプローチは、タイチン遺伝子のすべての主要な変異体に関するｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡ分子の開発及び最適化を必要とする。
例えば、ノックイン戦略は、タイチン遺伝子の上流、またはそのエクソン及び／もしくはイントロン内、あるいはセーフハーバー部位（ＡＡＶＳ１等）内を標的化するｓｇＲＮＡまたは一対のｓｇＲＮＡを使用して、野生型タイチンｃＤＮＡを遺伝子の遺伝子座内にノックインすることを含む。ドナーＤＮＡは、挿入領域に対する相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡであろう。
両戦略（修正及びノックイン）の利点は類似しており、原則として、短期及び長期の両方の有益な臨床及び実験室効果が挙げられる。それに加えて、治療的利益を提供するために低割合のタイチン活性しか必要とされないことがあり得る。両戦略の別の利点は、大部分の患者が低レベルの遺伝子及びタンパク質活性を有し、したがって、例えば、遺伝子修正の後の追加的なタンパク質発現が、標的遺伝子生成物に対する免疫応答を必ずしも導くわけではないことを示唆しているということである。ノックインアプローチは、一部の患者のみと比較してすべての患者を治療する能力という、修正アプローチを上回る１つの利点を提供する。この遺伝子内に共通の変異はあるが、多数の他の可能な変異も存在しており、ノックイン方法の使用はこれらすべてを治療し得る。
別法として、ノックアウト戦略は、変異を有するタイチン遺伝子のエクソン（複数可）をノックアウトして、フレームシフトにリーディングフレームを修正させ、タイチンタンパク質を救済させることを含む。この戦略は、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対を利用して、変異を伴うエクソンを切除する（またはエクソンを「スキップ」する）。この戦略では、ドナーＤＮＡテンプレートは利用されない。
ヒト細胞
本明細書に説明及び例証されるようなタイチン系心筋症及び／またはタイチノパチーを改善するために、ゲノム編集の主な標的は、ヒト細胞である。
ゲノム編集を必要とする患者に由来し、したがって該患者と既に完全に適合されている自己細胞内でゲノム編集を実施することによって、患者に安全に再導入され得る細胞を発生させ、患者の疾患に関連付けられる１つ以上の臨床状態の改善に効果的であろう細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたヒト細胞は、骨格筋前駆細胞である。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたヒト細胞は、骨格筋細胞である。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたヒト細胞は、内因性心臓幹細胞（ｅＣＳＣｓ）である［同定：Ｔｏｒｅｌｌａら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７，６４：６６１－６７３及びＢｅａｒｚｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７；１０４：１４０６８－１４０７３；ｅＣＳＣを含む前駆細胞の種類：Ｓａｎｇａｎａｌｍａｔｈ ａｎｄ Ｂｏｌｌｉ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；１１３：８１０－８３４；心臓生検からのｅＣＳＣの単離：Ｄ’Ａｍａｒｉｏら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１１；１０８：８５７－８６１］。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたヒト細胞は、初代心筋細胞である。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたヒト細胞は、心筋細胞である。
生検の実施
生検は、身体から採取される組織の標本である。生検は、当該技術分野における既知の方法のいずれかに従って実施され得る。例えば、心臓の細胞を捕捉するために針が心臓に挿入される。
ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞の単離
ｅＣＳＣ及び初代心筋細胞は、当該技術分野における任意の既知の方法に従って単離され得る。
ゲノム編集
ゲノム編集は概して、好ましくは正確なまたは所定の様式で、ゲノムのヌクレオチド配列を修飾するプロセスを指す。本明細書に説明されるゲノム編集の方法の例は、部位指向性ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の正確な標的場所においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断し、それによってゲノム内の特定の場所において二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断を作成する方法を含む。かかる切断は、Ｃｏｘら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２），１２１－３１（２０１５）において近年考察されている通り、相同指向修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の天然の内因性細胞プロセスによって修復され得、また通常それらによって修復される。ＮＨＥＪは、ヌクレオチド配列の損失または追加を有することもある二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端に直接結合し、それは、遺伝子発現を破壊または強化し得る。ＨＤＲは、切断点において定義されたＤＮＡ配列をを挿入するためのテンプレートとして、相同配列、またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体等の内因性ゲノム内にあってもよい。別法として、ドナーは、ヌクレアーゼ開裂遺伝子座と高相同性の領域を有するが、開裂された標的遺伝子座内に組み込まれ得る追加的な配列または欠失を含む配列変化も含有し得る外因性核酸、例えば、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルスであってもよい。第３の修復機構は、「代替ＮＨＥＪ」とも称されるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、その遺伝的結果は、小さい欠失及び挿入が開裂部位において生じ得るという点でＮＨＥＪに類似している。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用してより好ましいＤＮＡ末端結合修復結果を導き、近年の報告は、このプロセスの分子機構をさらに解明している；例えば、Ｃｈｏ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，１７４－７６（２０１５）；Ｋｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）；Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ ５１８，２５４－５７（２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ ５２８，２５８－６２（２０１５）を参照されたい。場合により、ＤＮＡ切断の部位における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。
これらのゲノム編集機構の各々は、所望のゲノム変化を作成するために使用され得る。ゲノム編集プロセスにおけるステップは、意図される変異の部位の可能な限り近くの標的遺伝子座内に１つまたは２つのＤＮＡ切断を作成することであり、後者は二本鎖切断または２つの一本鎖切断として作成される。これは、本明細書に説明及び例証される通り、部位指向性ポリペプチドの使用を介して達成され得る。
部位指向性ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ等は、例えば、ゲノムＤＮＡ等の核酸内に二本鎖切断または一本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存性修復または非相同末端結合または代替非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とすることなく開裂した標的核酸を修復し得る。これは、開裂部位における標的核酸内に小さな欠失または挿入（インデル）をもたらし得る場合があり、遺伝子発現の破壊または変化を導き得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸開裂部位に隣接する配列に相同である配列を含む。姉妹染色分体は、概して、修復テンプレートとして細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復テンプレートは、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸等の外因性核酸として供給されることが多い。外因性ドナーテンプレートを用いて、隣接する相同領域間に追加的な核酸配列（トランス遺伝子等）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失等）を導入して、その追加的なまたは変化された核酸配列も標的遺伝子座内に組み込まれるようにすることが一般的である。ＭＭＥＪは、小さな欠失及び挿入が開裂部位に生じ得るという点でＮＨＥＪに類似した遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、開裂部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を導く。場合により、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。
したがって、場合により、相同の組み換えは、標的核酸開裂部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列またはポリヌクレオチドドナーテンプレート）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が、標的核酸開裂部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸開裂部位において天然には発生しない配列である。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、変化、統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、及び／または遺伝子変異を導き得る。ゲノムＤＮＡの欠失及び非天然核酸のゲノムＤＮＡへの統合のプロセスは、ゲノム編集の例である。
ゲノム改変システム、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、及びＭｅｇａＴＡＬ等は、ＤＮＡの特定のエリアが修飾されることを可能にする。さらにより最近では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが説明されている。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、規則的に間隔が空いた短い回文型反復）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノム内に見出され得る。原核生物において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ウイルス及びファージ等の外来侵入者から原核生物を防御するのに役立つような免疫系の種類として機能する生成物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能の３つの段階が存在する：遺伝子座内への新たな配列の統合、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の生合成、及び外来侵入者核酸のサイレンシングである。５つの種類のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が特定されている。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「反復（ｒｅｐｅａｔ）」と称される多数の短い反復する配列を含む。反復は、ヘアピン構造を形成し得る、及び／または構造化されていない一本鎖配列を含み得る。反復は通常、群で発生し、種間で異なることが多い。反復は、「スペーサー」と称される固有の介在配列によって規則的に間隔が空けられ、反復－スペーサー－反復の遺伝子座アーキテクチャをもたらす。スペーサーは、既知の外来侵入者の配列と同一であるか、またはそれと高い相同性を有する。スペーサー反復単位は、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、それは、スペーサー－反復単位の成熟した形態に処理される。ｃｒＲＮＡは、標的核酸の標的化に関わる「シード」またはスペーサー配列を含む（原核生物における天然に発生する形態で、スペーサー配列は、外来侵入者核酸を標的化する）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物における生合成及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関わるエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同の二次及び／または三次構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡ生合成は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによって修飾され、次にｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイにおいてｃｒＲＮＡ反復にハイブリダイズする。内因性ＲＮａｓｅＩＩＩは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを開裂するために動員される。開裂されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼトリミングに供され、成熟したｃｒＲＮＡ形態を生成する（例えば、５’トリミング）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされたままであり、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、部位指向性ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズし得る標的核酸へと複合体をガイドする。標的核酸へのｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的化された核酸開裂に関してＣａｓ９を活性化する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム内の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。本来、ＰＡＭは、部位指向性ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の標的核酸への結合を促進するために不可欠である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称される）は、ＩＩ－Ａ型（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ－Ｂ型（ＣＡＳＳ４ａ）にさらに下位分類される。Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能ゲノム編集にとって有用であることを示しており、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的なゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び用途を提供している。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、いくつかの重要な点でＩＩ型システムとは異なる。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加的なトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく成熟ｃｒＲＮＡＳに処理される。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２～４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡに処理され、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの直接反復から開始し、２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＩＩ型システムにおける成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列から開始し、約２２ヌクレオチドの直接反復が続く。また、Ｃｐｆ１は、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、その結果、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に開裂し、これは、ＩＩ型システムに関する標的ＤＮＡが先行するＧリッチＰＡＭとは対照的である。したがって、Ｖ型システムは、ＰＡＭから離れた点にて開裂し、一方ＩＩ型システムは、ＰＡＭに隣接する点にて開裂する。それに加えて、ＩＩ型システムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチド５’突出を有するねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを開裂する。ＩＩ型システムは、平滑な二本鎖切断を介して開裂する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含むが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠き、これは、ＩＩ型システムとは対照的である。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Ｆｏｎｆａｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７－２５９０（２０１４）の図１のＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されてから広範囲に書き換えられている。Ｆｏｎｆａｒａ（上記参照）の図５は、種々の種に由来するＣａｓ９ポリペプチドに関するＰＡＭ配列を提供している。
部位指向性ポリペプチド
部位指向性ポリペプチドは、ＤＮＡを開裂するためにゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位指向性は、１つ以上のポリペプチドか、または該ポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡかのいずれかとして細胞または患者に投与され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈において、部位指向性ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合し得、次に、該ガイドＲＮＡは、ポリペプチドが指向される標的ＤＮＡ内の部位を特定する。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、複数の核酸開裂（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含む。２つ以上の核酸開裂ドメインは、リンカーを介して一緒に連結され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーを含む。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸の長さを有してもよい。
天然に発生する野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」は、天然に発生するＣａｓ９及び組み換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様折り畳みを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行β鎖及びα－らせんを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡによって標的化される鎖の相補鎖）を開裂し得る。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ様折り畳みを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡに対する作用及びＤＮＡに対する作用の両方を含む、多様な核酸に基づいた機能のセットに関わる。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のα－らせんに囲まれる５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を開裂し得る。
部位指向性ポリペプチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ等の核酸内に二本鎖切断または一本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存性修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とすることなく開裂した標的核酸を修復し得る。これは、開裂部位における標的核酸内に小さな欠失または挿入（インデル）をもたらし得る場合があり、遺伝子発現の破壊または変化を導き得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸開裂部位に隣接する配列に相同である配列を含む。姉妹染色分体は、概して、修復テンプレートとして細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復テンプレートは、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸等の外因性核酸として供給されることが多い。外因性ドナーテンプレートを用いて、隣接する相同領域間に追加的な核酸配列（トランス遺伝子等）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失等）を導入して、その追加的なまたは変化された核酸配列も標的遺伝子座内に組み込まれるようにすることが一般的である。ＭＭＥＪは、小さな欠失及び挿入が開裂部位に生じ得るという点でＮＨＥＪに類似した遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、開裂部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を導く。場合により、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。
したがって、場合により、相同の組み換えは、標的核酸開裂部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が、標的核酸開裂部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸開裂部位において天然には発生しない配列である。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、変化、統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、及び／または遺伝子変異を導き得る。ゲノムＤＮＡの欠失及び非天然核酸のゲノムＤＮＡへの統合のプロセスは、ゲノム編集の例である。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型の例示的な部位指向性ポリペプチド［例えば、Ｒａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，５２０（７５４６）：１８６－１９１（２０１５）に説明される黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９、Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）に説明されるアシダミノコッカスｓｐ．ＢＶ３Ｌ６またはラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６エンドヌクレアーゼに由来するＣｐｆ１、及び種々の他の部位指向性ポリペプチド］に対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型の例示的な部位指向性ポリペプチドのヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して１０個の連続アミノ酸にわたり少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して１０個の連続アミノ酸にわたり最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して、該部位指向性ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続アミノ酸にわたり少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して、該部位指向性ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続アミノ酸にわたり最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して、該部位指向性ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続アミノ酸にわたり少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、野生型部位指向性ポリペプチドに対して、該部位指向性ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続アミノ酸にわたり最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、修飾された形態の野生型の例示的な部位指向性ポリペプチドを含む。修飾された形態の野生型の例示的な部位指向性ポリペプチドは、部位指向性ポリペプチドの核酸開裂活性を低減する変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾された形態の野生型の例示的な部位指向性ポリペプチドは、野生型の例示的な部位指向性ポリペプチドの核酸開裂活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。修飾された形態の部位指向性ポリペプチドは、実質的な核酸開裂活性を有さなくてもよい。部位指向性ポリペプチドが実質的な核酸開裂活性を有さない修飾された形態であるとき、本明細書において「酵素的に不活性である」と称される。
いくつかの実施形態では、修飾された形態の部位指向性ポリペプチドは、（例えば、二本鎖標的核酸の糖－ホスフェート主鎖のうちの１つのみを切断することによって）標的核酸上に一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導し得るような変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、野生型部位指向性ポリペプチドの複数の核酸開裂ドメインのうちの１つ以上における核酸開裂活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸の相補鎖を開裂する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を開裂するその能力は低減する複数の核酸開裂ドメインのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸の非相補鎖を開裂する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を開裂するその能力を低減する複数の核酸開裂ドメインのうちの１つ以上をもたらす。当業者は、アラニン置換以外の変異が好適であることを認識するであろう。
１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位指向性ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と称される。
Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を増加させるために使用され得る。野生型Ｃａｓ９は、典型的には、標的配列内の指定される約２０ヌクレオチドの配列（内因性ゲノム遺伝子座等）にハイブリダイズするように設計される単一ガイドＲＮＡによってガイドされる。しかしながら、いくつかの不適合がガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間で許容され得、標的部位内の必要とされる相同性の長さを、例えば、わずか１３ｎｔの相同性に効果的に低減し、それによって、標的外（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）開裂としても知られる、標的ゲノム内の他の場所におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸開裂の上昇した潜在性をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々１つの鎖のみを切断するため、二本鎖切断を作成するためには、一対のニッカーゼが、ごく接近して、及び標的核酸の反対側の鎖上で結合し、それによって二本鎖切断と等価である一対のニックを作成することが必要である。これは、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つ）が、ごく接近して、及び標的核酸の反対側の鎖上で結合すべきであることを必要とする。この要件は、二本鎖切断が生じるために必要な相同性の最小の長さを本質的に二倍にし、それによって、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）が互いに二本鎖切断が形成することを可能にするのに十分に接近する可能性が低いゲノム内の他の場所で、二本鎖開裂事象が生じる可能性を低減する。当該技術分野において説明される通り、ニッカーゼはまた、ＮＨＥＪと比べてＨＤＲを促進するために使用され得る。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通じて、ゲノム内の標的部位内に選択される変化を導入するために使用され得る。ゲノム編集における使用に関する種々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号；Ｒａｎら、上記参照、及びＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，３４７－３５５（２０１４）、ならびにそれらに引用される参考文献に見出され得る。
企図される変異は、置換、付加、及び欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸をアラニンに変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸をアミノ酸ミミック（例えば、ホスホミミック）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、保存的変異である。例えば、変異は、変異アミノ酸を、変異アミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体配座、及び／または回転異性体に似たアミノ酸（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）に変換し得る。いくつかの実施形態では、変異は、リーディングフレーム内のシフト及び／または未成熟終止コドンの作成を引き起こす。いくつかの実施形態では、変異は、１つ以上の遺伝子の発現に影響する遺伝子または遺伝子座の調節領域の変化を引き起こす。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチド（例えば、変異体、変異した、酵素的に不活性な、及び／または条件付きで酵素的に不活性な部位指向性ポリペプチド）は、核酸を標的化する。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチド（例えば、変異体、変異した、酵素的に不活性な、及び／または条件付きで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的化する。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を含む（例えば、部位指向性ポリペプチドは、融合タンパク質である）。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸開裂ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸開裂ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸開裂ドメインを含み、核酸開裂ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に由来するヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸開裂ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び部位指向性ポリペプチドを非天然配列に連結する非天然配列（例えば、核局在化シグナル）またはリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸開裂ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、部位指向性ポリペプチドは、該ヌクレアーゼドメインの開裂活性を少なくとも５０％低減する核酸開裂ドメインの一方または両方における変異を含む。
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）に由来するＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸開裂ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、該ヌクレアーゼドメインのうちの一方はアスパラギン酸１０の変異を含む、及び／または該ヌクレアーゼドメインのうちの一方はヒスチジン８４０の変異を含み、該変異は、ヌクレアーゼドメイン（複数可）の開裂活性を少なくとも５０％低減する。
本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の部位指向性ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の遺伝子座における１つの二本鎖切断を共に達成する２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特定の遺伝子座における２つの二本鎖切断を共に達成する４つのニッカーゼを含む。別法として、１つの部位指向性ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断を達成する。
ゲノム標的化核酸
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、部位指向性ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向させ得るゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、少なくとも関心の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とを含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡにおいて、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡにおいて、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両システムにおいて、二重鎖は、ガイドＲＮＡ及び部位指向性ポリペプチドが複合体を形成し得るように、部位指向性ポリペプチドを結合する。ゲノム標的化核酸は、複合体に、部位指向性ポリペプチドとのその関連性によって標的特異性を提供する。したがってゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチドの活性を施行させる。
例示的なガイドＲＮＡは、それらの標的配列のゲノムの場所及び関連付けられるＣａｓ９切断部位と共に示されている図示されるスペーサー配列を含み、ここでは、ゲノムの場所はＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリに基づく。当業者によって理解される通り、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、図中のスペーサー配列の各々は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ内に置かれてもよい。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二重分子ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡの鎖を含む。第１の鎖は、５’～３’方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的である）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’～３’方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡへの追加的な機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含んでもよい。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含む。
Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’～３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
例証として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さいＲＮＡは、下記に例証される、及び当該技術分野において説明されるような化学的手段によって容易に合成され得る。化学的合成手順は、絶えず拡大しており、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥ等のゲルの使用を回避する）等の手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが百ヌクレオチド超程度に著しく増加するため、より困難になる傾向がある。より長い長さのＲＮＡを発生させるために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を生成することである。はるかに長いＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするもの等は、より容易に酵素的に発生される。例えば、当該技術分野において説明される通り、安定性を強化する、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減する、及び／または他の属性を強化する修飾等、種々の種類のＲＮＡ修飾がＲＮＡの化学的合成及び／または酵素的発生の最中または後に導入され得る。
スペーサー伸長配列
ゲノム標的化核酸のいくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、安定性を提供し得る、及び／またはゲノム標的化核酸の修飾のための場所を提供し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列が提供される。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００ヌクレオチド超、またはそれ以上の長さを有してもよい。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００ヌクレオチド未満、またはそれ以上の長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含む。いくつかの実施形態では、該部分は、核酸標的化核酸の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、該部分は、転写終結因子セグメント（すなわち、転写終結配列）である。いくつかの実施形態では、該部分は、真核細胞内で機能する。いくつかの実施形態では、該部分は、原核細胞内で機能する。いくつかの実施形態では、該部分は、真核細胞内及び原核細胞内の両方で機能する。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、調節された安定性ならびに／またはタンパク質及びタンパク質複合体による調節されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する配列、追跡を提供する修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子に対する直接共役、蛍光検出を促進する部分に対する共役、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／またはタンパク質のための結合部位を提供する修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ等を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）が挙げられる。
スペーサー配列
スペーサー配列は、関心の標的核酸内の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異性の様式で標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、関心の標的核酸の配列に応じて変動する。
本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、システム内で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ内で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、黄色ブドウ球菌は、標的核酸内で配列５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’を含むＰＡＭを認識し、式中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、５’Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の直ぐ３’側である。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２１個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの１番目のヌクレオチドの直ぐ５’側に２１個の塩基を含む。例えば、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＲＲＴ－３’を含む配列（配列番号７８）において、標的核酸は、５’Ｎｓに対応する配列を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１９個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６個の連続した最も５’側のヌクレオチドにわたり、１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％である。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、コンピュータプログラムを使用して設計または選択される。コンピュータプログラムは、予測溶解温度、二次構造の構成、予測されるアニール温度、配列同一性、ゲノム文脈、クロマチンアクセシビリティ、ＧＣ％、ゲノム発生の頻度（例えば、同一または類似であるが、不適合、挿入、または欠失の結果として１つ以上の地点で異なる配列）、メチル化状態、ＳＮＰの存在等の変数を使用し得る。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、基準ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来するｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし得るヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖、すなわち、塩基対二本鎖構造を形成する。共に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位指向性ポリペプチドに結合する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部分は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部分は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部分は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して最大約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を有する。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔである。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来する野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含む。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、二重鎖、すなわち、塩基対二本鎖構造を形成する。共に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、部位指向性ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のうちの少なくとも一部分は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔ長であり得る。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋら（上記参照）に説明されるｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３～４８からなる。
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、黄色ブドウ球菌に由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを含む。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖は、不適合を含む（すなわち、二重鎖の２つの鎖は１００％相補的ではない）。いくつかの実施形態では、二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５、または不適合を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖は、最大約１、２、３、４、または５、または不適合を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖は、わずか２つの不適合を含む。
バルジ
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖内に「バルジ」が存在する。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの無対の領域である。いくつかの実施形態では、バルジは、部位指向性ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与する。バルジは、二重鎖の一方の側に、無対５’－ＸＸＸＹ－３’であって、式中、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対側の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドを含む、無対５’－ＸＸＸＹ－３’を含み、二重鎖の他方の側に、無対ヌクレオチド領域を含む。二重鎖の両側上の無対ヌクレオチドの数は、異なり得る。
１つの例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に無対プリン（例えば、アデニン）を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の無対５’－ＡＡＧＹ－３’を含み、式中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成し得るヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５つ以上の無対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、最大１、２、３、４、または５以上の無対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、１つの無対ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の無対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側上のバルジは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の無対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）上のバルジは、４つの無対ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対合を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、最大１つのゆらぎ対合を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも３個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも５個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１個のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１個のアデニンヌクレオチドを含む。
ヘアピン
種々の実施形態では、１つ以上のヘアピンが、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に位置する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖内の最後の対になったヌクレオチドから３’の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個以上のヌクレオチドで開始する。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖内の最後の対になったヌクレオチドの３’の最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドで開始し得る。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個以上の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５個以上の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内のヌクレオチド、一緒にハイブリダイズされる）を含む。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズされるＣＣジヌクレオチドを含む。
ヘアピンのうちの１つ以上は、部位指向性ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、２つ以上のヘアピンが存在し、いくつかの実施形態では、３つ以上のヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、黄色ブドウ球菌に由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、複数の二重鎖領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズされた領域）を含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、機能性部分を含む。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５つ以上の機能性部分を含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、最大約１、２、３、４、または５つ以上の機能性部分を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐ－ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ－ドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含む。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイドの文脈か二重分子ガイドの文脈であるかにかかわらず提供され得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチド超の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０～約５０００ヌクレオチド以上の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド超の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００ヌクレオチド未満、またはそれ以上の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含む。いくつかの実施形態では、機能性部分は、転写終結因子セグメント（すなわち、転写終結配列）を含む。いくつかの実施形態では、機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの総長を有する。いくつかの実施形態では、機能性部分は、真核細胞内で機能する。いくつかの実施形態では、機能性部分は、原核細胞内で機能する。いくつかの実施形態では、機能性部分は、真核細胞内及び原核細胞内の両方で機能する。
好適なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能性部分の非限定的な例としては、３’ポリ－アデニル化尾部、リボスイッチ配列（例えば、調節された安定性ならびに／またはタンパク質及びタンパク質複合体による調節されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する配列、追跡を提供する修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子に対する直接共役、蛍光検出を促進する部分に対する共役、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／またはタンパク質のための結合部位を提供する修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ等を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位または分子指標（例えば、バーコード配列）を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つ以上の親和性タグを含む。
単一分子ガイドリンカー配列
いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。Ｊｉｎｅｋら（上記参照）では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）。例証的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００ヌクレオチド以上である。
リンカーは、多様な配列のいずれかを含み得るが、但し好ましくは、リンカーは、ガイドの他の機能性領域に干渉し得る分子内結合を引き起こす場合があるガイドＲＮＡの他の部分と広範な相同領域を有する配列を含まない。Ｊｉｎｅｋら（上記参照）では、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されているが（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））、より長い配列を含む多数の他の配列が同様に使用され得る。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、機能性部分を含む。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５つ以上の機能性部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、最大約１、２、３、４、または５つ以上の機能性部分を含む。
遺伝子内の１つ以上の変異の置換、対応する遺伝子の遺伝子座内へのタイチンｃＤＮＡのノックイン、または遺伝子内のエクソンのノックアウトによる、細胞を修正するためのゲノム改変戦略
本発明のエクスビボ方法のステップは、例えば、前駆細胞（いくつかの実施形態では、ｅＣＳＣ、または初代心筋細胞）内の、タイチン遺伝子内の変異を編集／修正することを含む。同様に、本発明のインビボ方法のステップは、ゲノム改変を使用して患者内の細胞内のタイチン遺伝子を編集／修正することを含む。
タイチン系心筋症または他のタイチノパチーを有する患者は、タイチン遺伝子内の広範な変異を示す。したがって、異なる患者は、概して異なる修正戦略を必要とするであろう。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが、本発明の方法において使用されてもよく、各ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、それ自身の関連するＰＡＭを有し、それは、疾患に特異的であってもなくてもよい。黄色ブドウ球菌に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてタイチン遺伝子を標的化するための例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、図に示される。
ゲノム改変戦略は、相同組み換え（ＨＲ）としても知られる相同指向修復（ＨＤＲ）による、遺伝子内の１つ以上の変異の置換または対応する遺伝子の遺伝子座内へのタイチンｃＤＮＡのノックインを含む。相同指向修復は、タイチンタンパク質に対する不活性化変異を有する患者を治療するための一戦略である。これらの戦略は、タイチンタンパク質を回復させ、罹患状態を完全に逆転させるであろう。この戦略は、患者の不活性化変異（複数可）の場所に基づく、より特注されたアプローチを必要とするであろう。変異を修正するためのドナーヌクレオチドは、小さい（＜３００ｂｐ）。ＨＤＲ効率はドナー分子のサイズに反比例し得るため、これは有利である。同様に、ドナーテンプレートは、ドナーテンプレート送達の効果的な手段であることが示されているサイズが制約されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子に適合し得ることが期待される。
相同指向修復は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組み換えである。一本鎖アニール及び代替ＨＤＲを含む、ＨＤＲに関する追加的な経路が存在する。ゲノム改変ツールは、研究者が細胞の相同組み換え経路を操作して、ゲノムに対する部位特異性修飾を作成することを可能にする。細胞は、トランスで提供される合成ドナー分子を使用して二本鎖切断を修復し得ることが見出されている。したがって、二本鎖切断を特定の変異の付近に導入し、好適なドナーを提供することによって、標的化された変化がゲノム内に作成され得る。特定の開裂は、ＨＤＲの比率を、相同ドナー単独を受けた１０６個の細胞中の１の比率の１，０００倍超に増加させる特定のヌクレオチドにおける相同指向修復（ＨＤＲ）の比率は、切断部位までの距離の関数であり、したがって、重なり合うまたは最も近い標的部位を選択することが重要である。その場での修正は、ゲノムの残りを非摂動なままにするため、遺伝子編集は、遺伝子付加を上回る利点を提供する。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは著しく変動するが、概して、ゲノムＤＮＡに対するアニールを可能にするための小さいまたは大きい隣接相同性アームを有する意図される配列を含む。導入される遺伝的変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下、またはプロモーター、ｃＤＮＡ等を含み得る数キロベースのカセットと同程度の大きさであり得る。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー及び二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの両方が、使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは１００ｎｔ未満～５００ｎｔ超のサイズにわたるが、より長いｓｓＤＮＡも発生及び使用され得る。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、及びミニサークルを含む二本鎖ドナーも、しばしば使用される。概して、ＡＡＶベクターは、極めて効果的なドナーテンプレートの送達手段であることが見出されているが、個々のドナーに関するパッケージング制限は、＜５ｋｂである。ドナーの活性転写は、ＨＤＲを３倍増加させ、プロモーターの包含が変換を増加させ得ることを示唆している。反対に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。
Ｃａｓ９等の野生型エンドヌクレアーゼに加えて、ヌクレアーゼドメインの一方または他方が不活性化されており、一本のＤＮＡ鎖のみの切断をもたらすニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから、または標的エリアに隣接するニッカーゼ対を使用して指向され得る。ドナーは、一本鎖の、ニッキングされた、またはｄｓＤＮＡであり得る。
ドナーＤＮＡは、多様な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルス形質導入によって、ヌクレアーゼと共にまたは個別に供給され得る。つなぐオプションの範囲は、ＨＤＲに関するドナーの利用可能性を増大させることが提案されている。例としては、ドナーをヌクレアーゼに付着させること、近隣に結合するＤＮＡ結合タンパク質に付着すること、またはＤＮＡ末端結合または修復に関与するタンパク質に付着することが挙げられる。
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼすもの等の多数の培養条件によって、またはＤＮＡ修復及び関連付けられるタンパク質の標的化によって導かれ得る。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＳｃｒ７として知られるＤＮＡリガーゼＩＶ等の重要なＮＨＥＪ分子が抑制され得る。
ドナーが存在しない場合、ＤＮＡ切断からの末端または異なる切断からの末端は、ＤＮＡ末端がその接合点において塩基対合をほとんどまたは全く伴わずに結合されるいくつかの非相同修復経路を使用して結合され得る。標準的なＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ－ＮＨＥＪ等の類似の修復機構が存在する。２つの切断が存在する場合、介在するセグメントは、欠失または反転され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、結合部に挿入、欠失、または変異を導き得る。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する部位特異性遺伝子挿入が、行われている。組み合わせアプローチは、場合によりイントロン／エクソン境界を含む、特定の設定に適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに効果的であることが判明され得、それに対して誤りのないＨＤＲは、コーディング領域により好適であり得る。
前述の通り、タイチン遺伝子は、３６３個のタンパク質をコードするエクソンを含有する。３３１個のエクソンのうちの任意の１つ以上が、変異を修正し、タイチン活性を回復させるために修復され得る。さらなる代替物として、タイチンｃＤＮＡは、対応する遺伝子の遺伝子座へノックインされ得るか、またはＡＡＶＳ１等のセーフハーバー部位へノックインされ得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の変異を修復するようなポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の組み込みを促進するために使用され得る１つのｇＲＮＡまたは一対のｇＲＮＡを提供する。
本方法のいくつかの実施形態は、遺伝子を２回切断することによって、１つ以上の変異を置換するようなポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する欠失を作成するｇＲＮＡ対であって、一方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の３’末端で切断する、ｇＲＮＡ対を提供する。切断は、ゲノム内にＤＳＢを各々作成する一対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、またはゲノム内にＤＳＢを一緒に作成する複数のニッカーゼによって達成され得る。
別法として、本方法のいくつかの実施形態は、１つ以上の変異を置換するようなポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列の挿入を促進する１つの二本鎖切断を１つ以上の変異の周りに作成するような１つのｇＲＮＡを提供する。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、またはゲノム内でＤＳＢを一緒に作成する複数のニッカーゼによって作成され得る。
タイチン遺伝子内の例証的な修飾としては、上述の変異の中またはその近位の、例えば、特定の変異の３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流または下流の領域内の置換が挙げられる。タイチン遺伝子内の変異の相対的に広範な変形を考慮すると、上述の置換の多数の変形（限定されるものではないが、より大きい及びより小さい欠失を含む）は、タイチンタンパク質活性の回復をもたらすことが期待されるであろうことが理解されるであろう。
かかる変異体は、問題となる特定の変異より５’及び／または３’方向に大きい、またはどちらかの方向に小さい置換を含む。したがって、特定の置換に関して「近位」とは、所望の置換境界（本明細書ではエンドポイントとも称される）に関連するＤＳＢ遺伝子座が、述べられている基準遺伝子座から約３ｋｂ未満である領域内にあり得ることを意図する。いくつかの実施形態では、ＤＳＢ遺伝子座は、より近位であり、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内である。小さい置換の場合、所望のエンドポイントは、基準遺伝子座におけるか、またはそれに「隣接して」おり、それによって、エンドポイントが基準遺伝子座から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ～５ｂｐ未満であることが意図される。
より大きいまたはより小さい置換を含む実施形態は、タイチン活性が回復される限り、同一の利益を提供することが期待される。したがって、本明細書に説明及び例証される置換の多くの変形は、心筋症または他のタイチノパチーを改善するために効果的であろうことが期待される。
標的配列選択
優先的に、特定の基準遺伝子座に対して５’境界及び／または３’境界の場所におけるシフトが、ゲノム編集の特定の適用を促進または強化するために使用され、それは、本明細書にさらに説明及び例証される通り、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する。
かかる標的配列選択の第１の態様では、多数のエンドヌクレアーゼシステムは、開裂のための潜在的な標的部位の食選択を導く規則または基準を有し、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型またはＶ型エンドヌクレアーゼの場合では、そのＤＮＡ開裂部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件等である。
標的配列の選択または最適化の別の態様では、標的配列及びゲノム編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせに関する「標的外」活性の頻度（すなわち、選択される標的配列以外の部位におけるＤＳＢ発生の頻度）が、標的内（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）活性の頻度に対して評価される。場合により、所望の遺伝子座における正しく編集された細胞は、他の細胞に対して選択的な利点を有し得る。選択的利点の非限定的ではあるが例証的な例としては、強化された複製率、持続性、特定の条件への耐性、患者への導入後の成功したインビボの生着または持続性の強化された比率等の属性、及びかかる細胞の維持または増加された数または生存に関連する他の属性の獲得が挙げられる。他の場合では、所望の遺伝子座における正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を特定、分類、ないしは別の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーンニング方法によって、積極的に選択され得る。選択的な利点及び指向性選択方法はどちらも、修正に関連付けられる表現型を利用し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、意図される細胞集団を選択または精製するために使用される新たな表現型を作成する第２の修飾を作成するために、２回以上編集されてもよい。かかる第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能な標識のための第２のｇＲＮＡを付加することによって作成され得る。
任意の選択的利点が適用可能であるか、または任意の指向性選択が特定の場合に適用されるべきであるかにかかわらず、標的配列選択はまた、適用の有効性を強化する、及び／または所望の標的以外の部位における望ましくない変化の潜在性を低減するために、標的外頻度を考慮してガイドされる。本明細書及び当該技術分野においてさらに説明及び例証される通り、標的外活性の発生は、標的部位と種々の標的外部位との間の類似性及び非類似性、及び使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む、多数の要因によって影響を受ける。多くの場合、標的外活性の予測を助ける生物情報学ツールが利用可能であり、かかるツールはまた、最も可能性のある標的外活性の部位を特定するために使用され得ることが多く、該部位は次に、標的内活性に対する標的外活性の相対的頻度を評価して、それによってより高い相対的標的内活性を有する配列の選択を可能にするために、実験的設定にて評価され得る。かかる技術の例証的な例は本明細書に提供されており、他のものは当該技術分野において知られている。
標的配列選択の別の態様は、相同組み換え事象に関する。相同領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同組み換え事象の中心として機能し得ることは、よく知られている。かかる組み換え事象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の複製の正常な過程の中で、また二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合等、ＤＮＡ配列が合成されている他の時にも発生し、これは、正常な周期中に定期的に発生するが、種々の事象の発生（ＵＶ光及びＤＮＡ切断の他の誘導物質等）または特定の薬剤の存在（種々の化学的誘導物質等）によっても強化され得る。多数のかかる誘導物質は、ＤＳＢをゲノム内に無差別に発生させ、ＤＳＢは、正常な細胞内で定期的に誘導及び修復されている。修復中、もとの配列は、完璧な忠実性を伴って再構築され得るが、しかしながら場合により、小さいな挿入または欠失（「インデル」と称される）が、ＤＳＢ部位に導入される。
ＤＳＢはまた、本明細書に説明されるエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の場所に特異的に誘導され得、それは、指向されるまたは優先的な遺伝子修飾事象を選択される染色体場所において引き起こすために使用され得る。ＤＮＡ修復（及び複製）の文脈において組み換えを受ける相同配列の傾向は、多数の環境で利用され得、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通して提供される関心の配列を所望の染色体場所に挿入するために相同指向修復が使用されるＣＲＩＳＰＲ等のゲノム編集システムの１つの適用の基本である。
わずか１０個以下の塩基対を含み得る「マイクロホモロジー」の小さい領域であり得る特定の配列の間の相同領域も、所望の欠失をもたらすために使用され得る。例えば、単一のＤＳＢが、近隣の配列とマイクロホモロジーを示す部位に導入される。かかるＤＳＢの修復の正常な過程において、高頻度で発生する結果は、ＤＳＢ及び付随する細胞修復プロセスによって促進されている組み換えの結果としての介在配列の欠失である。
しかしながら、いくつかの環境では、相同領域内の標的配列の選択はまた、遺伝子融合（欠失がコーディング領域内にある場合）を含む大きすぎる欠失を生じさせ得、それは、特定の環境を考慮すると望ましいまたは望ましくない場合がある。
本明細書に提供される実施例は、タイチン活性の回復をもたらす置換を誘導するように設計されるＤＳＢの作成のための種々の標的領域の選択、及び標的外事象を標的内事象に対して最小にするように設計される、かかる領域内の特定の標的配列の選択をさらに説明する。
好ましいｇＲＮＡは、選択される遺伝子座における所望のレベルのゲノム編集を達成するのに十分に高い標的内活性、及び相対的に低い、他の染色体遺伝子座における変化の可能性を低減するような標的外活性を有する。標的内活性の標的外活性に対する比率は、ｇＲＮＡの「特異性」と称されることが多い。
予測される標的外活性の初期スクリーニングに関して、既知の及び公に入手可能である最も可能性の高い標的外部位を予測するために使用され得る多数の生物情報学ツールが存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムにおける標的部位への結合は、相補的な配列の間のワトソン・クリック塩基対合によって駆動されるため、非類似性（したがって、標的外結合の低減された潜在性）の程度は、一次配列の差、不適合及びバルジ、すなわち非相補的な塩基に変化される塩基、ならびに標的部位に対する潜在的な標的外部位内への塩基の挿入または欠失に、本質的に関連するＣＯＳＭＩＤ（不適合、挿入、及び欠失を有するＣＲＩＳＰＲ標的外部位）（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕにてウェブ上で入手可能）と呼ばれる例示的な生物情報学ツールは、かかる類似性をコンパイルする。
核酸修飾
いくつかの実施形態では、細胞内に導入されるポリヌクレオチドは、本明細書においてさらに説明される及び当該技術分野において知られる通り、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を強化するため、送達を変化させるため、宿主細胞内の先天性免疫応答を低減するため、または他の強化のために使用され得る１つ以上の修飾を含む。
特定の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用され、この場合、下記に説明及び例証される通り、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイドのいずれか）、及び／または細胞内に導入されるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、修飾され得る。かかる修飾されたポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用され得る。
かかる使用の非限定的な例証の目的のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、ガイドＲＮＡの修飾は、単一分子ガイドまたは二重分子であってもよいガイドＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集複合体の形成または安定性を強化するために使用され得る。ガイドＲＮＡの修飾は、同様にまたは代替的に、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との間の相互作用の開始、安定性、または動態を強化するために使用され得、それは、例えば、標的内活性を強化するために使用され得る。ガイドＲＮＡの修飾は、同様にまたは代替的に、特異性、例えば、他の（標的外）部位における効果と比較した標的内部位におけるゲノム編集の相対比率を強化するために使用され得る。
修飾は、同様にまたは代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）による分解に対するその耐性を増加させ、それによって細胞内でのその半減期を増加させることによって、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用され得る。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期を増加させることは、ガイドＲＮＡとコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を増加させるために使用され得るため、ガイドＲＮＡの半減期を強化する修飾は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを発生させるために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態において特に有用であり得る。
修飾は、同様にまたは代替的に、細胞内に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘出する可能性または程度を減少させるために使用され得る。下記及び当該技術分野において説明される通り、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むかかる応答は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈において十分に特徴付けられており、ＲＮＡの低減された半減期及び／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連付けられる他の因子の誘出に関連付けられる傾向がある。
細胞内に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡにも１つ以上の種類の修飾が作成され得、限定されるものではないが、ＲＮＡの安定性を強化する修飾（例えば、細胞内に存在するＲＮＡｓｅｓによるその分解を増加させることによる）、結果として生じる生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を強化する修飾、及び／または細胞内に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘出する可能性もしくは程度を減少させる修飾が挙げられる。
前述のもの及び他のもの等の修飾の組み合わせは、同様に使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合では、例えば、１つ以上の種類の修飾が、ガイドＲＮＡに作成され得（上記に例示されるものを含む）、及び／または１つ以上の種類の修飾が、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに作成され得る（上記に例示されるものを含む）。
例証として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さいＲＮＡは、当該技術分野において知られる通り多数の修飾が容易に組み込まれることを可能にする化学的手段によって容易に合成され得る。化学的合成手順は、絶えず拡大しており、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥ等のゲルの使用を回避する）等の手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが百ヌクレオチド超程度に著しく増加するため、より困難になる傾向がある。化学的に修飾されたより長い長さのＲＮＡを発生させるために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を生成することである。はるかに長いＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするもの等は、より容易に酵素的に発生される。概してより少ない種類の修飾が酵素的に生成されるＲＮＡにおける使用に関して利用可能ではあるが、例えば、下記及び当該技術分野において説明される通り、安定性を強化するため、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減するため、及び／または他の属性を強化するために使用され得る修飾が依然存在し、新たな種類の修飾が定期的に開発されている。
種々の種類の修飾、特により小さい化学的に合成されたＲＮＡと共にしばしば使用されるものの例証として、修飾は、糖の２’位において修飾されえた１つ以上のヌクレオチドを含み得る。かかる修飾は、オリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。類似の修飾も、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に作成され得る。オリゴヌクレオチドはまた、糖模倣体、例えば、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルを有し得る。
多数のヌクレオチド及びヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して天然のオリゴヌクレオチドより耐性にすることが示されており、これらの修飾されたオリゴは、修飾されていないオリゴヌクレオチドより長時間無傷のまま生き残る。修飾されたオリゴヌクレオチドの具体的な例としては、修飾された主鎖を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間連結が挙げられる。
リン原子をその中に含まない修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合されたヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分を有する他のものを有するものを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結の両方、すなわち主鎖は、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのかかるオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、例えば、アミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は、保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。
ガイドＲＮＡはまた、追加的または代替的に、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書で使用されるとき、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基としては、天然核酸内にまれにまたは一時的に見いだされる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、当該技術分野では５－Ｍｅ－Ｃと称されることも多い）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルクリアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ
Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５－７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野において知られる「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも、含まれ得る。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の実施形態である。
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる非天然糖、ホスフェート、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド内のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの複数は、単一のオリゴヌクレオチド内に、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内に組み込まれてもよい。
化学的合成にはより適さず、典型的には酵素的合成によって生成されるより長いポリヌクレオチドも、種々の手段によって修飾され得る。かかる修飾としては、例えば、特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’または３’末端における特定の配列または他の部分の組み込み、及び他の修飾が挙げられ得る。例証として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、およそ４ｋｂの長さであり、インビトロ転写によって合成され得る。ｍＲＮＡに対する修飾は、例えば、例えば、その翻訳もしくは安定性を増加させるため（例えば、細胞による分解に対するその耐性を増加させることによって）、または外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするもの等のより長いＲＮＡの導入後にしばしば細胞内で観察される先天性免疫応答を誘出するＲＮＡの傾向を低減するために適用され得る。
多数のかかる修飾は、当該技術分野において説明されており、例えば、ｐｏｌｙＡ尾部、５’キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾された５’もしくは３’未翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾された塩基の使用（シュード－ＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）、もしくはＮ６－メチル－ＡＴＰ等）、または５’末端ホスフェートを除去するためのホスファターゼによる処置等である。これら及び他の修飾は、当該技術分野において知られており、ＲＮＡの新たな修飾は、定期的に開発されている。
修飾されたＲＮＡの多数の商用供給元が存在し、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、及び多数の他のものが挙げられる。ＴｒｉＬｉｎｋによって説明されている通り、例えば、５－メチル－ＣＴＰは、増加されたヌクレアーゼ安定性、増加された翻訳、または先天性面機受容体とインビトロの転写されたＲＮＡとの低減された相互作用等の望ましい特徴を付与するために使用され得る。５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、ならびにシュード－ＵＴＰ及び２－チオ－ＵＴＰもまた、下記に参照されるＫｏｒｍａｎｎら及びＷａｒｒｅｎらによる出版物に例証される通り、翻訳を強化しながら培養及びインビボにおいて先天性免疫刺激を低減することが示されている。
インビボで送達される化学的に修飾されたｍＲＮＡは、改善された治療的効果を達成するために使用され得ることが示されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４－１５７（２０１１）を参照されたい。かかる修飾は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させる、及び／またはその免疫原性を低減するために使用され得る。シュード－Ｕ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ、及び５－メチル－Ｃ等の化学的修飾を使用して、ウリジン及びシチジン残基の４分の１のみをそれぞれ２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃで置換することは、マウスにおけるｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介認識の著しい減少をもたらすことが見いだされた。先天性免疫系の活性化を低減することによって、これらの修飾は、インビボのｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増加させるために使用され得る；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら（上記参照）を参照されたい。
したがって、多様な修飾が、当該技術分野において開発され、ＲＮＡの安定性を強化する、先天性免疫応答を低減する、及び／または本明細書に説明されるようなヒト細胞内へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利益を達成するために適用されている；例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７－９６（２０１１）；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ
Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８－９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８－６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５－１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５－２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）による考察を参照されたい。
上述の通り、修飾されたＲＮＡの多数の商用供給元が存在し、その多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計される修飾に特化されている。文献内に報告されている種々の発見に基づいて、多様なアプローチが提示されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５－１４０（２０１２）によって報告される通り、非架橋酸素の硫黄による置換（ホスホロチオエート、ＰＳ）はｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広く使用されていると述べている。リボースの２’位の修飾は、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増加させると同時に、ヌクレオチド間ホスフェート結合のヌクレアーゼ耐性を改善することが報告されており、それは免疫活性化からの保護を提供することも示されている。適度なＰＳ主鎖修飾と小さい十分に許容される２’－置換（２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロ）との組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８（２００４）によって報告される通り、インビボ適用に関して高度に安定したｓｉＲＮＡと関連付けられており、２’－Ｏ－メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１－２０２（２００９）によって報告される通り、安定性の改善に効果的であることが報告されている。先天性免疫応答の誘導の減少に関して、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロを用いた特定の配列の修飾ことは、概してサイレンシング活性を保存しながら、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低減することが報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４－５０５（２００６）；及びＣｅｋａｉｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０－１０８（２００７）を参照されたい。２－チオウラシル、シュードウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びＮ６－メチルアデノシン等の追加的な修飾はまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小にすることが示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５（２００５）を参照されたい。
当該技術分野において知られる及び市販されている通り、本明細書における使用のために、細胞によるそれらの送達及び／または摂取を強化し得る多数の共役体がＲＮＡ等のポリヌクレオチドに適用され得る；例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、ならびにアプタマーが挙げられ、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１－８０９（２０１３）による考察、及びその中に引用される参考文献を参照されたい。
コドン最適化
いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチドコードするポリヌクレオチドは、関心の標的ＤＮＡを含む細胞内の発現に関する当該技術分野において標準的である方法に従ってコドン最適化される。例えば、意図される標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリペプチドを生成するための使用に関して企図される。
ゲノム標的化核酸と部位指向性ポリペプチドとの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９等の核酸ガイドヌクレアーゼ）と相互作用し、それによって複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチドを標的核酸へとガイドする。
核酸コードシステム構成要素
別の態様では、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位指向性ポリペプチド、及び／または本開示の方法の実施形態を実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸、本開示の部位指向性ポリペプチド、及び／または本開示の方法の実施形態を実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子は、ベクター（例えば、組み換え発現ベクター）を含む。
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸に輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加的な核酸セグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、追加的な核酸セグメントがウイルスゲノム内にライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製し得る（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入時に宿主細胞のゲノム内に統合され、それによって宿主ゲノムと共に複製される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、それらが作動的に連結される核酸の発現を指向させ得る。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」、またはより単純に「発現ベクター」と称され、これらは同等の機能を果たす。
「作動可能に連結される」という用語は、関心のヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列（複数可）に連結されることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図される。かかる調節配列は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に説明されている。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を指向させるもの、及び特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を指向させるもの（例えば、組織特異性調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、所望の発現レベル等の因子に依存し得ることが、当業者によって理解されるであろう。
企図される発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ならびに、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター、及び他の組み換えベクターが挙げられる。真核性標的細胞に関して企図される他のベクターとしては、限定されるものではないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。他のベクターは、それらが宿主細胞と適合可能である限り使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の転写及び／または翻訳制御要素を含む。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結因子等を含む多数の好適な転写及び翻訳制御要素のいずれかが、発現ベクター内で使用され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ機構または他の要素のウイルス配列または構成要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターである。
好適な真核性プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期に由来するもの、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来する長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト延長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、トリベータ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセラートキナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む、小さいＲＮＡを発現させるために、例えば、Ｕ６及びＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等の種々のプロモーターが、有利であり得る。かかるプロモーターの使用の説明、及びそれを強化するためのパラメータは、当該技術分野において知られており、さらなる情報及びアプローチは、定期的に説明されている；例えば、Ｍａ，Ｈ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。
発現ベクターはまた、翻訳開始及び転写終結因子のためのリボソーム結合部位を含んでもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含んでもよい。発現ベクターはまた、部位指向性ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター等）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に制限された、及び／または一時的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異性プロモーター、細胞型特異性プロモーター等）である。
いくつかの実施形態では、本開示のゲノム標的化核酸及び／または部位指向性ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達ビヒクル内またはその表面上にパッケージ化される。企図される送達ビヒクルとしては、限定されるものではないが、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられる。当該技術分野において説明される通り、多様な標的化部分が、かかるビヒクルと所望の細胞型または場所との優先的な相互作用を強化するために使用され得る。
本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の細胞内への導入は、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、共役、原形質融合、リポフェクション、電気穿孔法、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達等によって生じ得る。
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当該技術分野において知られているウイルス性または非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。別法として、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、電気穿孔法または脂質ナノ粒子等の当該技術分野において知られている非ウイルス性送達ビヒクルによって送達されてもよい。さらなる代替的な実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で、または１つ以上のガイドＲＮＡと、もしくはｔｒａｃｒＲＮＡを伴って１つ以上のｃｒＲＮＡと予備複合体化されて送達されてもよい。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正荷電ペプチド、小分子ＲＮＡ－共役体、アプタマー－ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ－融合タンパク質複合体が挙げられるがそれらに限定されない、非ウイルス性送達ビヒクルによって送達されてもよい。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７－１１３３（２０１１）に説明されている（ここでは、他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達ビヒクルに焦点が当てられている）。
エンドヌクレアーゼをコードするガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または患者に送達されてもよい。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。別法として、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍのサイズにわたってもよい。
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性の脂質から作成されてもよい。融合性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜構成要素コレステロール等の中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を強化するための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれてもよい。カチオン性脂質の制限としては、不良な安定性及び高速クリアランスによる低い有効性、ならびに炎症応答または抗炎症応答の発生が挙げられる。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質及び親水性脂質の両方からなってもよい。
当該技術分野において知られている任意の脂質または脂質の組み合わせが、ＬＮＰを生成するために使用されてもよい。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
脂質は、ＬＮＰを生成するために任意の数のモル比で組み合わされてもよい。それに加えて、ポリヌクレオチド（複数可）は、ＬＮＰを生成するために幅広いモル比で脂質（複数可）と組み合わされてもよい。
前述の通り、部位指向性ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は各々、細胞または患者に別々に投与されてもよい。一方、部位指向性ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡと、またはｔｒａｃｒＲＮＡを伴って１つ以上のｃｒＲＮＡと予備複合体化されてもよい。予備複合体化された材料は次に、細胞または患者に投与され得る。かかる予備複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡと特異的な相互作用を形成し得る。この特性は多くの生物学的プロセスにおいて利用されるが、核酸が豊富な細胞環境では混乱した相互作用の危険性も伴う。この問題に対する１つの解決策は、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予備複合体化されるリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利益は、分解からのＲＮＡの保護である。
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。多数の修飾が、当該技術分野において知られており、使用され得る。
エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは、概して１：１のモル比で組み合わされる。別法として、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、概して１：１：１のモル比で組み合わされる。しかしながら、ＲＮＰを生成するために幅広いモル比が使用されてもよい。
組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、送達のために使用されてもよい。送達されるポリヌクレオチドを含むパッケージ化されるＡＡＶゲノム、レップ及びキャップ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を生成するための技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの生成は、以下の構成要素が単一の細胞内に存在することを必要とする（本明細書においてパッケージング細胞として示される）：ｒＡＡＶゲノム、該ｒＡＡＶゲノムと分離した（すなわち、その中にない）ＡＡＶレップ及びキャップ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶレップ及びキャップ遺伝子は、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶｒｈ．７４を含むがそれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。表１を参照されたい。
Figure 2022009734000002
パッケージング細胞を発生させるための方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要な構成要素のすべてを安定して発現する細胞株を作成することを含む。例えば、ＡＡＶレップ及びキャップ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムと、該ｒＡＡＶゲノムと分離したＡＡＶレップ及びキャップ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能な標識とを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノム内に統合される。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）等の手順によって、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）によって、細菌性プラスミドに導入されている。パッケージング細胞株は次に、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染される。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な生成に好適であることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはレップ及びキャップ遺伝子をパッケージング細胞内に導入する。
ｒＡＡＶ生成の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に考察されている。種々のアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；ならびに米国特許第６，２５８，５９５号に説明されている。
ＡＡＶベクター血清型は、標的の細胞型に適合され得る。例えば、以下の例示的な細胞型はとりわけ、示されるＡＡＶ血清型によって形質導入され得る。表２を参照されたい。
Figure 2022009734000003
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、タイチン遺伝子内の１つまたは２つの遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、各々別々に脂質ナノ粒子に製剤化されるか、またはすべて１つの脂質ナノ粒子に共製剤化される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され、一方ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクター内で送達される。
遺伝的に修飾された細胞
「遺伝的に修飾された細胞」という用語は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して）導入された少なくとも１つの遺伝的修飾を含む細胞を指す。本明細書におけるいくつかのエクスビボの実施形態では、遺伝的に修飾された細胞は、遺伝的に修飾された前駆細胞である。本明細書におけるいくつかのインビボの実施形態では、遺伝的に修飾された細胞は、遺伝的に修飾された心臓または骨格筋の細胞である。外因性ゲノム標的化核酸及び／またはゲノム標的化核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝的に修飾された細胞は、本明細書において企図される。
「対照治療集団」という用語は、ゲノム編集構成要素の付加を除き、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、密集度、フラスコサイズ、ｐＨ等を用いて治療された細胞の集団を説明する。例えば、タイチンタンパク質のウエスタンブロット分析またはタイチンｍＲＮＡの定量化等の当該技術分野において知られている任意の方法が、タイチン遺伝子の回復またはタンパク質の発現もしくは活性を測定するために使用され得る。
「単離された細胞」という用語は、それがもともと見出された有機体から除去されている細胞、またはかかる細胞の子孫を指す。任意に、細胞は、例えば、定義された条件下または他の細胞の存在下で、インビトロで培養されている。任意に、細胞は、その後で第２の有機体に導入されるか、またはそれが単離された有機体（またはそれがその子孫である細胞）に再導入される。
単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、混合されたまたは不均一な細胞の集団から除去及び分離されている細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞がそれから単離または富化された不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。いくつかの実施形態では、単離された集団は、単離されたヒト前駆細胞の集団であり、例えば、ヒト前駆細胞と該ヒト前駆細胞が由来する細胞とを含む不均一な細胞の集団と比較して、実質的に純粋なヒト前駆細胞の集団である。
特定の細胞集団に関する「実質的に強化された」という用語は、特定の種類の細胞の発生が、例えば、心筋症または他のタイチノパチーを改善するためのかかる細胞の所望のレベルに応じて、既存のまたは基準のレベルと比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍以上増加される細胞の集団指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に富化された」という用語は、細胞集団全体を構成する細胞に関して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上である細胞の集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に富化された」または「実質的に純粋な」という用語は、細胞集団全体を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋な細胞の集団を指す。すなわち、前駆細胞の集団に関する「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、本用語によって本明細書に定義される通り、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％より少ない、または１％未満の、前駆細胞ではない細胞を含有する細胞の集団を指す。
患者への細胞のインプラント
本発明のエクスビボ方法の別のステップは、肝細胞を患者にインプラントすることを含む。このインプラントするステップは、当該技術分野において知られている任意のインプラント方法を使用して達成され得る。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、患者の肝臓に直接注射されてもよく、ないしは別の方法で患者に投与されてもよい。
本発明のエクスビボ方法の別のステップは、ｅＣＳＣまたは初代心筋細胞を患者にインプラントすることを含む。このインプラントするステップは、当該技術分野において知られている任意のインプラント方法を使用して達成され得る。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、患者の心臓に直接注射されてもよく、ないしは別の方法で患者に投与されてもよい。
薬学的に許容される担体
本明細書に企図される対象に前駆細胞を投与するエクスビボ方法は、前駆細胞を含む治療用組成物の使用を含む。
治療用組成物は、細胞組成物と一緒に生理学的に忍容性のある担体を、及び任意に、活性成分としてその中に溶解または分散された本明細書に説明される少なくとも１つの追加的な生物活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、望まれない限り、治療的目的のための哺乳類またはヒト患者に投与されるときに実質的に免疫原性ではない。
概して、本明細書に説明される前駆細胞は、薬学的に許容される担体と共に懸濁液として投与される。当業者は、細胞組成物中に使用される薬学的に許容される担体は、緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤、または他の薬剤を、対象に送達される細胞の生存に実質的に干渉する量で含まないことを認識するであろう。細胞を含む製剤としては、例えば、細胞膜の完全性が維持されること、及び任意に、栄養素が細胞の生存を維持するまたは投与時の生着を強化することを許可する浸透圧緩衝液が挙げられ得る。かかる製剤及び懸濁液は、当業者に知られており、及び／または日常的な実験を使用して本明細書に説明される通り前駆細胞との使用に適合され得る。
細胞組成物はまた、乳化され得るか、または乳化手順が細胞の生存に悪影響を及ぼす場合にはリポソーム組成物として提示され得る。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分と両立可能な賦形剤と、本明細書に説明される治療的方法における使用に好適な量で混合され得る。
細胞組成物中に含まれる追加的な薬剤としては、その中の構成要素の薬学的に許容される塩が挙げられ得る。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と共に酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。
生理学的に忍容性のある担体は、当該技術分野においてよく知られている。例示的な液体担体は、活性成分及び水に加えて何も材料を含有しないか、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、またはその両方等の緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水を含有する滅菌水溶液である。またさらに、水性担体は、複数の緩衝塩、及び塩化ナトリウム及びカリウム等の塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて及び水を除外して、液相を含有し得る。かかる追加的な液相の例示的なものは、グリセリン、綿実油等の植物油、及び水－油乳剤である。特定の障害または状態の治療に有効な細胞組成物中に使用される活性化合物の量は、その障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。
投与及び有効性
「投与する」、「導入する」、及び「移植する」は、所望の効果（複数可）が生み出されるように、傷害または修復部位等の所望の部位における導入される細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、前駆細胞の対象内のへ配置の文脈において、互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、またはその分化した子孫は、インプラントされた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部分が生存可能なままである対象内の所望の場所への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間程の短さ、例えば、２４時間から数日間、数年間程の長さ、またはさらには患者の寿命、すなわち、長期の生着であり得る。例えば、本明細書に説明されるいくつかの実施形態では、有効な量の筋原前駆細胞が、腹腔内または静脈内経路等の全身投与経路を介して投与される。
「個人」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または療法が所望される任意の対象を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象は、人間である。
予防的に投与されるとき、本明細書に説明される治療方法は、心筋症または他のタイチノパチーのいずれの症状より前に対象に投与される。したがって、予防的投与は、心筋症または他のタイチノパチーを防ぐ役割を果たす。
治療的に提供されるとき、本明細書に説明される治療方法は、心筋症または他のタイチノパチーの症状の開始時（またはその後）に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、「有効な量」という用語は、心筋症または他のタイチノパチーの少なくとも１つの症状を予防または軽減するために投与することが必要とされる組成物の量を指し、例えば、心筋症または他のタイチノパチーを有する対象を治療する等の所望の効果を提供するのに十分な組成物の量に関する。したがって「治療的に有効な量」という用語は、典型的な対象、例えば、心筋症または他のタイチノパチーを有するか、またはその危険がある対象に投与されるときに、特定の効果を促進するのに十分な組成物の量を指す。有効な量としてはまた、疾患の症状の発症を予防するもしくは遅らせる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、限定されるものではないが、疾患の症状の進行を遅くする）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量が挙げられるであろう。いずれの場合においても、適切な「有効な量」は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
心筋症または他のタイチノパチーを有する患者の細胞内に発現される機能性タイチンタンパク質のレベルの控えめな及び漸進的な増加は、疾患の１つ以上の症状を改善するため、長期生存を増加させるため、及び／または他の治療に関連付けられる副作用を低減するために有益であり得る。いくつかの実施形態では、有効な対象の治療は、治療される対象内の総タイチンタンパク質に対して少なくとも約３％、５％、または７％の機能性タイチンタンパク質を生じさせる。いくつかの実施形態では、機能性タイチンタンパク質は、総タイチンタンパク質の少なくとも約１０％であろう。いくつかの実施形態では、機能性タイチンタンパク質は、総タイチンタンパク質の少なくとも約２０％～３０％であろう。同様に、正常化された細胞は罹患した細胞に対して選択的利点を有する場合があるため、著しく上昇したレベルの機能性タイチンタンパク質を有する、さらに相対的に限定された細胞の下位集団の提供は、種々の患者において有益であり得る。しかしながら、控えめなレベルの機能性タイチンタンパク質でさえ、患者における心筋症または他のタイチノパチーの１つ以上の態様の改善に有益であり得る。いくつかの実施形態では、患者内の修飾された細胞の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上が、増加されたレベルの機能性タイチンタンパク質を生成している。
「投与される」とは、所望の部位における細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による対象内への組成物の送達を指す。細胞組成物は、対象内に有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、すなわち、投与は、送達される組成物の少なくとも一部分、すなわち、少なくとも１×１０４個の細胞が所望の部位に一定期間送達される、対象内の所望の場所への送達をもたらす。投与モードとしては、注射、注入、点滴、または摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ ｓｐｉｎａｌ）、及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射及び注入が挙げられる。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与が概して好ましい。
１つの実施形態では、投与は、全身性である。「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、及び「末梢投与される」という語句は、標的部位、組織、または臓器内へ直接ではなく、その代わりに対象の循環系に入るような投与を指す。
キット
本開示は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位指向性ポリペプチド、部位指向性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本発明の方法の実施形態を実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１つ以上、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、（１）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または部位指向性ポリペプチドを含むベクターと、（３）該ベクター（複数可）及びポリペプチドの再構成及び／または希釈のための試薬とを備える。
いくつかの実施形態では、キットは、（１）（ｉ）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）該ベクターの再構成及び／または希釈のための試薬とを備える。
上述のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単一分子ガイドゲノム標的化核酸を含む。上述のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、二重分子ゲノム標的化核酸を含む。上述のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸標的化核酸をコードするベクターを含む。
上述のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、所望の遺伝的修飾を達成するために挿入されるポリヌクレオチドをさらに含み得る。
キットの構成要素は、別々の容器内にあってもよく、または単一の容器内に組み合わされてもよい。
いくつかの実施形態では、上記に説明されるキットは、１つ以上の追加的な試薬をさらに含み、この場合、かかる追加的な試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞内に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、制御試薬、制御ベクター、制御ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ生成のための試薬、配列決定のためのアダプター等から選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液等であり得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、標的内結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの開裂を促進もしくは強化するため、または標的化の特異性を改善するために使用され得る１つ以上の構成要素を含み得る。
上述の構成要素に加えて、キットは、本方法を実践するためのキットの構成要素を使用するための取扱説明書をさらに含み得る。本方法を実践するための取扱説明書は概して、好適な記録媒体上に記録される。例えば、取扱説明書は、紙またはプラスチック等の基材上に印刷されてもよい。取扱説明書は、キット内に添付文書として、キットまたはその構成要素の容器のラベル内に（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連して）等で提示されてもよい。取扱説明書は、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等の好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして提示され得る。場合により、実際の取扱説明書はキット中に提示されないが、遠隔ソースから取扱説明書を（例えば、インターネットを介して）取得するための手段が提供され得る。この実施形態の例は、取扱説明書が閲覧され得る、及び／または取扱説明書がダウンロードされ得るウェブアドレスを含むキットである。取扱説明書と同様に、取扱説明書を取得するためのこの手段は、好適な基材上に記録され得る。
ガイドＲＮＡ製剤
本発明のガイドＲＮＡは、特定の投与モード及び剤形に応じて、例えば、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される。ガイドＲＮＡ組成物は概して、生理学的に適合可能なｐＨを達成するように製剤化され、製剤及び投与経路に応じて約３のｐＨ～約１１のｐＨ、約ｐＨ３～約ｐＨ７の範囲にわたる。代替的な実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調節される。いくつかの実施形態では、組成物は、治療的に有効な量の本明細書に説明される少なくとも１つの化合物を、１つ以上の薬学的に許容される 賦形剤と一緒に含む。任意に、組成物は、本明細書に説明される化合物の組み合わせを含み、または細菌増殖の治療または予防に有用な第２の活性成分（例えば、限定されるものではないが、抗菌剤または抗微生物剤）を含んでもよく、または本発明の試薬の組み合わせを含んでもよい。
好適な賦形剤としては、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、酸化防止剤（例えば、限定されるものではないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、限定されるものではないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、限定されるものではないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、限定されるものではないが、油、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が挙げられる。
他の可能な治療的アプローチ
本明細書に説明される方法においては、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することが好ましい。しかしながら、本明細書に説明される教示、例えば、治療標的部位等は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬ等のエンドヌクレアーゼの他の形態に適用され得る。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された改変された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる、モジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮは、触媒活性ＦｏｋＩ二量体が形成することを可能にするために、反対側のＤＮＡ鎖上の同族標的「半部位」配列に、それらの間に正確な間隔を空けて結合するように改変されなければならない。それ自体は配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化する際、ゲノム編集の開始ステップとして、ＤＮＡ二本鎖切断がＺＦＮ半部位間に発生される。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２アーキテクチャの３～６個の亜鉛フィンガーからなり、各フィンガーは、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖上のヌクレオチドのトリプレットを主に認識するが、第４のヌクレオチドとの鎖をまたがる相互作用も重要であり得る。ＤＮＡと大きく接触する位置におけるフィンガーのアミノ酸の変化は、所与のフィンガーの配列特性を変化させる。したがって、４フィンガー亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識し、この場合、標的配列は各フィンガーによって寄与されるトリプレット優先性の複合物であるが、トリプレット優先性は、近隣フィンガーによって種々の程度に影響を受け得る。ＺＦＮの重要な態様は、単純に個々のフィンガーを修飾することによってほとんどの任意のゲノムアドレスに容易に再標的化され得ることであるが、これを十分に行うためには相当の熟練が必要とされる。ＺＦＮのほとんどの適用では、４～６フィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ、１２～１８ｂｐを認識する。したがって、一対のＺＦＮは典型的には、半部位間に５～７ｂｐのスペーサーを含まない２４～３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識するであろう。反復的な配列または遺伝子ホモログが設計プロセス中に除外されると仮定すると、この長さの標的配列は、ヒトゲノム内で唯一である可能性が高い。にもかかわらず、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、その特異性において絶対ではなく、したがって標的外系都合及び開裂事象が、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体としてか、またはＺＦＮの一方もしくは他方のホモ二量体としてかのいずれかで生じる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を改変して、偏性ヘテロ二量体変異体としても知られる、互いとのみ二量体化し得、それら自身とは二量体化し得ない「プラス」及び「マイナス」変異体を作成することによって、効果的に排除されている。偏性ヘテロ二量体の強制は、ホモ二量体の形成を防止する。これは、ＺＦＮ、及びこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに強化している。
多様なＺＦＮ系システムが、当該技術分野において説明されており、それらの修正は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮの設計を導くために使用される規則及びパラメータを説明している；例えば、Ｓｅｇａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（６）：２７５８－６３（１９９９）；Ｄｒｅｉｅｒ Ｂら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９－５０２（２０００）；Ｌｉｕ Ｑら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（６）：３８５０－６（２００２）；Ｄｒｅｉｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４２）：３５５８８－９７（２００５）；及びＤｒｅｉｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６－７８（２００１）を参照されたい。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、調節ヌクレアーゼの別のフォーマットを表しており、それにより、ＺＦＮと同様、改変されたＤＮＡ結合ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮは、タンデムに動作して、標的化されたＤＮＡ開裂を達成する。ＺＦＮとの主な差は、ＤＮＡ結合ドメインの性質及び関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥタンパク質に由来し、これは、もともと植物細菌性病原体キサントモナス属において説明されていた。ＴＡＬＥは、３３～３５個のアミノ酸反復のタンデムアレイからなり、各反復は、典型的には最大２０ｂｐの長さである標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を認識し、最大４０ｂｐの総標的配列長さを付与する。各反復のヌクレオチド特異性は、２つのアミノ酸だけを１２位及び１３位に含む反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンは、それぞれ、４つのＲＶＤ：Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって優位に認識される。これは、亜鉛フィンガーに関するものよりもはるかに単純な認識コードを構成し、したがってヌクレアーゼ設計に関して前者を上回る利点を示す。にもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、その特性において絶対ではなく、ＴＡＬＥＮは、標的外活性を低減するためにＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用の恩恵を受けている。
その触媒機能が非活性化されるＦｏｋＩドメインの追加的な変異体が、作成されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対のうちの半分が不活性ＦｏｋＩドメインを含む場合、標的部位において、ＤＳＢよりもむしろ一本鎖ＤＮＡ開裂（ニッキング）のみが生じるであろう。その結果は、Ｃａｓ９開裂ドメインのうちの１つが非活性化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９「ニッカーゼ」突然変異体の使用に匹敵する。ＤＮＡニックは、ＨＤＲによって、しかしながらＤＳＢよりも低い効率でゲノム編集を駆動するために使用され得る。主な利益は、標的外ニックは、ＮＨＥＪに媒介される誤修復を起こしやすいＤＳＢとは異なり、素早く正確に修復されることである。
多様なＴＡＬＥＮ系システムが、当該技術分野において説明されており、それらの修正は、定期的に報告される；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９－１２（２００９）；Ｍａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６－９（２０１２）；及びＭｏｓｃｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）。「ゴールデンゲート」プラットフォームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数の団体によって説明されている；例えば、Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）；Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５－２５（２０１１）；Ｗｅｂｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）；Ｗａｎｇら、Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１（６）：３３９－４７，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｍａｙ １７（２０１４）；及びＣｅｒｍａｋ Ｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３９：１３３－５９（２０１５）を参照されたい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、多くの場合はゲノム内の唯一の部位において、高い特異性を伴ってＤＮＡを開裂する配列特異性エンドヌクレアーゼである。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含む幅広い宿主に由来する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓ ｂｏｘ、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含むそれらの構造によって分類される通り、少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーが存在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥは、ゲノム編集における初期ステップとして標的遺伝子座においてＤＳＢを作成するために使用され得る。それに加えて、いくつかの天然の及び改変されたＨＥは、ＤＮＡの一本の鎖のみを切断し、それにより部位特異性ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列及びそれらが呈する特異性は、それらを、部位特異性ＤＳＢを作成するための有力な候補としている。
多様なＨＥ系システムが、当該技術分野において説明されており、それらの修正は、定期的に報告される：例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３－８０（２０１４）；Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１－２６（２０１４）；Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ ５５（８）：５５３－６９（２０１２）による考察；及びその中に引用される参考文献を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥの融合を使用し、調整可能なＤＮＡ結合及びＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＨＥの開裂配列特異性を利用する；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌら，ＮＡＲ ４２：２５９１－２６０１（２０１４）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｇ３ ４：１１５５－６５（２０１４）；及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１－９６（２０１５）を参照されたい。
さらなる変形では、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）のＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ Ｉ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上に約３０ｂｐ離れて位置付けられ、適合不可能な付着端を有する２つのＤＳＢを発生させる；例えば、Ｗｏｌｆｓら、ＮＡＲ ４２，８８１６－２９（２０１４）を参照されたい。既存のヌクレアーゼ系アプローチの他の組み合わせが発展し、本明細書に説明される標的化されたゲノム修飾の達成に有用であろうことが予測される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ及び他のヌクレアーゼ
上記に説明されるヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性及び機能的特性を組み合わせることは、固有の欠点のいくつかを潜在的に克服し得るゲノム編集に対するさらなるアプローチを提示する。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは典型的に、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作成する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡ（さらに、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９の場合には、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列内の追加的な２塩基）とのワトソン・クリック塩基対合を受けるガイドＲＮＡ内の２０ヌクレオチド配列によって駆動される。かかる配列は、ヒトゲノム内で唯一であるのに十分に長いが、しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対ではなく、特に標的配列の５’側半分において、著しい混乱が容認される場合があり、特異性を駆動する塩基の数を効果的に低減する。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９触媒機能を完全に非活性化し－ＲＮＡガイドＤＮＡ結合機能のみを保持し－、代わりにＦｏｋＩドメインを非活性化されたＣａｓ９と融合することであった；例えば、Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９－７６（２０１４）；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７－８２（２０１４）を参照されたい。ＦｏｋＩは触媒活性になるために二量体化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、２つのＣａｓ９－ＦｏｋＩ融合をごく接近してつないで二量体を形成し、ＤＮＡを開裂する必要がある。これは、組み合わされた標的部位における塩基の数を本質的に２倍にし、それによってＣＲＩＳＰＲ系システムによる標的化の厳しさを増加させる。
さらなる例として、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＩ－ＴｅｖＩ等の触媒活性ＨＥとの融合は、調整可能なＤＮＡ結合及びＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＩ－ＴｅｖＩの開裂配列特異性を利用し、標的外開裂がさらに低減され得ると予想される。
他の定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に不可欠であるが、不特定の要素をそれが不可欠であるか否かにかかわらず依然含み得る組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用される。
「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的及び新規のまたは機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない追加的な要素の存在を許容する。
「からなる」という用語は、実施形態のその説明に列挙されていない任意の要素を除く、本明細書に説明される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によりそうではないことが明確に記されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書に提示される特定の数値には、「約」という用語が先行する。「約」という用語は、「約」という語が先行する数値、及びおよそその数値である数値に対する忠実な（ｌｉｔｅｒａｌ）支持を提供するために使用され、すなわち、近似の列挙されていない数値が、それが提示される文脈において、具体的に列挙されている数値と実質的に同等である数であり得る。
数値の範囲が本明細書に提示される場合、その範囲の下限と上限との間の各介在値、その範囲の条件及び下限である値、ならびにその範囲と共に示されるすべての値が、本開示に包含されることが企図される。その範囲の下限及び条件内のすべての可能な下位範囲もまた、本開示によって企図される。
本発明は、本発明の例証的な非限定的実施形態を提供する以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。
本実施例は、タイチン遺伝子内の変異を修復して、タイチン活性を回復させる、ゲノム遺伝子座内の変異の恒久的な修正、または異種遺伝子座における発現を導くような例証的なゲノム編集技術としてのＣＲＩＳＰＲシステムの使用を説明する。ゲノム編集による変異の修復は、本明細書に説明及び例証される通り、心筋症または他のタイチノパチーの潜在的改善のための新規の治療戦略を表す。
実施例１
タイチン短縮型変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集による修復のインビトロモデルを、中心核ミオパチー及び拡張型心筋症を伴うと特許内で特定される変異に基づいて開発した［Ｃｅｙｈａｎ－Ｂｉｒｏｓｙ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８１（１４）：１２０５－１２１４（２０１３）］。患者の線維芽細胞は、タイチンのＣ末端の短縮ならびにカルパイン３結合部位及びタイチンキナーゼドメインの損失を導く、スプライス部位に位置するタイチンエクソン２１９内のＧ＞Ｃ変異（変異ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃ）を有した。別の短縮型変異が、イントロン２４２内で同定された（変異ｃ．３７１１２Ｇ＞Ａ）。
修復戦略１
第１の例示的な修復戦略として、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及び４つの異なるｇＲＮＡのうちの１つを使用して変異を修正する野生型ドナーテンプレートを挿入する修復に関して、ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃタイチン変異を標的化した。
エクソン２１９変異の付近のタイチンヒト遺伝子の領域を、開裂部位に関して走査した。黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼがゲノム編集のために使用されているため、各領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有する黄色ブドウ球菌プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関して走査した。ＰＡＭに隣接するタイチンＤＮＡを標的化する多数の２１ｂｐスペーサー配列を、ｓｇＲＮＡ内への組み込みのために設計した。図２は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたタイチンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。図２に付与される位置番号は、タイチンゲノム配列に相補的なガイド配列の３’末端に対応する。特異性スコアは、ＤｅｓｋＧｅｎ．ｃｏｍ上で入手可能なソフトウェアを使用して決定した。特異性スコアが高くなればなるほど、ｇＲＮＡはタイチンゲノムに対してより特異的であると予測される。
各ｓｇＲＮＡ及び黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９を発現させるために、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）ｐｌａｓｍｉｄ＃６１５９１（ｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ）［Ｒａｎら、上記参照］を使用した。プラスミドは、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）に由来するＣａｓ９及びそのｓｇＲＮＡを含有する単一のベクターＡＡＶ－Ｃａｓ９システムをコードする。２１ｂｐスペーサー配列のうちの１つをコードするＤＮＡを、スペーサー配列がｓｇＲＮＡの５’末端として発現されるようにプラスミド内の適切な場所に挿入した。ｇＲＮＡ構造及び配列を示す図３を参照されたく、ここでは、特定のスペーサー配列のうちの１つが、「Ｎ」として示される５’ヌクレオチドを置換し、残りのヌクレオチドは、ｇＲＮＡの中で同じである。
患者の線維芽細胞を、ｃ．３２８５４Ｇ＞Ａ変異の修復のためにＳａＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド及び野生型ドナーテンプレートと共に電気穿孔法によってコトランスフェクトした。線維芽細胞をトリプシン処理し、１５００ｘｇで５分間ペレット化した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離した。次に、細胞を１～２ｍＬのＲＰＭＩ（血清も抗生物質も有さない）中に再懸濁し、計数した。電気穿孔法のために、細胞（２００ｕｌ～５×１０５個の細胞）を、１０ｕｇのプラスミド（１５ｕｌ以下、好ましくは水中で）及びテンプレートＤＮＡと共に０．２ｃｍキュベット内に定置し、２５０Ｖ、５００ｕＦで電気穿孔した。８００～９００ｕｌの成長培地（少なくとも２０％ｆｂｓ）を添加し、細胞を６または１２ウェルプレート内に定置した。
Figure 2022009734000004
ドナーテンプレート（図４）は、相同性アームを含み、２１ｎｔの標的配列にわたるが、ドナーテンプレートを切断するＣａｓ９の確率を減少させるような変異ＰＡＭ配列を含む１００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの一本鎖オリゴヌクレオチドであった。
患者の線維芽細胞内の遺伝子修正を実証するために、治療された細胞を、Ｔ７Ｅ１アッセイによってトランスフェクションの４８時間後に遺伝子修飾活性を有することを立証した。ＰＣＲ生成物を、０．７％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で走らせた。結果は図５に示され、ここで、インデルパーセントは全標本に関するすべてのＮＨＥＪ媒介挿入／欠失の和を表す。Ｔ７Ｅ１アッセイは、患者の線維芽細胞内で３～１０％の効率を実証した。
修復戦略２
第２の例示的な修復戦略として、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及び一対のｓｇＲＮＡを使用して、変異を含むエクソン２１９を除去（または「スキップ」）し、野生型タイチンリーディングフレームを回復させる修復に関して、ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃタイチン変異を標的化した。
エクソン２１９に隣接する２つのイントロン（イントロン２１８及びイントロン２１９）の領域を、開裂部位に関して走査した。ここでも、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼがゲノム編集のために使用されているため、各領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有する黄色ブドウ球菌ＰＡＭに関して走査した。２１ｂｐスペーサー配列を、各イントロン内のＰＡＭに隣接するＤＮＡ配列を標的化するように設計した。
次に、２１ｂｐスペーサー配列を、（例えば、戦略１に関して説明される通り）ｓｇＲＮＡ内に各々組み込む。図６は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたそれぞれのイントロンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。エクソン２１９を欠失させるために、一対のｓｇＲＮＡの一方または両方の構成部員において代替的に使用され得た２１ｂｐスペーサー配列が、図７に示される。
次に、一方がイントロン２１８を標的化し、もう一方がイントロン２１９を標的化する２つのｓｇＲＮＡを黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９と共に使用して、対象の細胞内のタイチンエクソン２１９を欠失させる。
修復戦略３
第３の例示的な修復戦略として、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及び３つの異なるｇＲＮＡのうちの１つを使用して変異を修正する野生型ドナーテンプレートを挿入する修復に関して、ｃ．３７１１２Ｇ＞Ａタイチン変異を標的化した。
イントロン２４２の領域を、開裂部位に関して走査した。ここでも、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼがゲノム編集のために使用されているため、各領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有する黄色ブドウ球菌ＰＡＭに関して走査した。ＰＡＭに隣接するタイチンＤＮＡを標的化する多数の２１ｂｐスペーサー配列を、ｓｇＲＮＡ内への組み込みのために設計した。図８は、選択されたＰＡＭ、及び選択されたタイチンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡの）２１ｂｐスペーサー配列を示す。
次に、２１ｂｐスペーサー配列を、（例えば、戦略１に関して説明される通り）ｓｇＲＮＡ内に各々組み込む。
次に、イントロン２４を標的化するｓｇＲＮＡのうちの１つを黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及び野生型ドナーテンプレートと共に使用して、対象の細胞内のイントロン２４２内の変異を修復する。
修復戦略４
第４の例示的な修復戦略として、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及び一対のｓｇＲＮＡを使用して、変異を含むエクソン３２６を除去（または「スキップ」）し、野生型タイチンリーディングフレームを回復させる修復に関して、タイチンエクソン３２６内のｃ．４３６２ｉｎｓＡＴ変異を標的化した。
エクソン３２６に隣接する２つのイントロン（イントロン３２５～３２７）の領域を、開裂部位に関して走査した。ここでも、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼがゲノム編集のために使用されているため、各領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有する黄色ブドウ球菌ＰＡＭに関して走査した。２１ｂｐスペーサー配列を、各イントロン内のＰＡＭに隣接するＤＮＡ配列を標的化するように設計した。
図９は、選択される２つのＰＡＭのセット（各イントロンに対して１セット）、及び選択されるそれぞれのイントロンＤＮＡ標的配列に相補的な（各ｇＲＮＡ）の２１ｂｐスペーサー配列を示す。次に、２１ｂｐスペーサー配列の対（１つの対につき各セットから１つ）を、（例えば、戦略１に関して説明される通り）ｓｇＲＮＡ内に各々組み込む。
次に、一方がイントロン３２５を標的化し、もう一方がイントロン３２７を標的化する２つのｓｇＲＮＡを、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９と共に使用して、対象の細胞内のタイチンエクソン３２６を欠失させる。
実施例２
実施例１に説明される実験のために発生させたプラスミドに由来するＳａＣａｓ９／ｇＲＮＡカセットを、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４内にパッケージ化する。結果として生じるｒＡＡＶは、下記の実施例４において概してｒＡＡＶ．ｒｈ７４．Ｃａｓ９ＴＴＮと称される。
これまでにＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃら、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に報告されている修飾されたクロスパッケージングアプローチを使用して、ｒＡＡＶベクターを生成する。ここで、ＨＥＫ２９３細胞内のＣａＰＯ４沈殿を用いたトリプルトランスフェクション方法は、ＡＡＶ２ ＩＴＲが、異なるＡＡＶカプシド血清型内にパッケージ化されることを可能にする［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（２）：７９１－８０１（２００２）及びＧｒｉｅｇｅｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，１（３）：１４１２－１４２８（２００６）］。生成プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．Ｃａｓ９．ＴＴＮ、（ｉｉ）キャップ血清型８様単離ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４修飾ＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、及びＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄヘルパー）である。ベクターを精製し、カプシドで包まれたベクターゲノム（ｖｇ）力価（Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用）を、先に説明される通りに決定した［Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）］。
実施例３
タイチン変異を含むマウスモデルにおいて、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４．Ｃａｓ９ＴＴＮを、冠動脈内アプローチを使用して送達し、用量漸増パラダイムを利用して、心筋細胞内の発現を達成するための適切な容量を確立する。
このモデルは、修飾されたバージョンの冠状動脈ライゲーションを通じて、マウスの心臓内に心筋虚血を誘導することを含む［Ｇａｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；１０３７：２９９－３１１；Ｇａｏら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．；１０７（１２）：１４４５－１４５３］。この新たなアプローチは、胸部に入るための従来的な方法（開胸または胸骨切開）と比較して、改善された生存率、減少された復帰時間、及びより低い心不整脈の発生を有する。本モデルにおける冠動脈内アプローチによるＡＡＶ．ｒｈ７４．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの送達は、高い形質導入効率で心臓に制限されるｅＧＦＰ発現をもたらす。
モデル１：エクソン３２６を標的化するＤＣＭモデル
２塩基対挿入（ｃ．４３６２８ｉｎｓＡＴ）を挿入して定義されるヒトＤＣＭ変異をノックアウトするために、ＣＲＩＳＰＲ ＭＩＴ プラットフォーム（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を使用して、エクソン３２６の周りのヒトゲノム配列を標的化する短縮型ｓｇＲＮＡ（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’）［Ｄｏｅｎｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４（２）：１８４－９１（２０１６）］を設計した。この変異はもともと、英国内で２つの大きな同族コホートにおいて特定されたが、しかしながら、ＴＴＮ
ＤＣＭ集団のおよそ１５％において特定されている［Ｇｒａｍｌｉｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４７（３）：３５２－３５８（２００９）；Ｚｈｏｕら、ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１５：１６３５６４（２０１５）；Ｇｒａｍｌｉｃｈら、ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７（５）：５６２－５７６（２０１５）；Ｐｅｌｅｄら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１７１（１）：２４－３０（２０１４）；Ｇｅｒｕｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３０（２）：２０１－２０４（２００２）］。それに加えて、文献は、ＴＴＮ内のエクソン２３９と２４０との接合点における潜在的な内部プロモーターを特定しており、これは、ＴＴＮを有する患者におけるより多くの病原性変異を表す［Ｚｏｕら、ｅＬｉｆｅ，４：ｅ０９４０６（２０１５）］。内部プロモーターに遠位の変異を有する患者は、より深刻なＤＣＭの症例を有する。したがって、治療的介在を研究するための利用可能なマウスモデルを設計した。
ｓｇＲＮＡの配列を、ヒトゲノムに対して整列させて、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の排除を立証した［Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（２）：１８７－１９７（２０１５）］。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡに由来するスタフィリコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を、精製し、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ注射用緩衝液（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）中に再懸濁する。ｓｇＲＮＡを、先に公開される通り、インビトロ転写によって発生させる［Ｍａｓｈｉｋｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｒｅｐｏｒｔｓ，３：３３５５２０１３）；Ｈｏｒｉｉら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４：４５１３（２０１４）］。手短に述べると、ＰＣＲ精製後、Ｔ７転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、テンプレートをインビトロ転写のために使用する。およそ６週齢の雌ＢＬ６マウスを、ＰＭＳ（妊馬血清）及びｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を用いて過剰排卵させる（Ｈｏｒｉｉら、上記参照）。その後、それらを雄ＢＬ６マウスと交尾させ、過剰排卵させたマウスの膨大部から受精卵を単離する。ｓａＣａｓ９のｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡを、極微操作装置付きの顕微鏡を使用して前核内に共注射する。注射の直後に、偽妊娠したマウス１匹当たりおよそ２０～３０個の受精卵を再インプラントする。
動物に実施するすべての手順は、ＩＡＣＵＣ（ＡＲ０８－０００１７；ＩＢＳ０００００２０２）に従う。同腹仔間のさらなる交配を利用して、ｃ．４３６２８ ＴＴＮの場所への２塩基対ＡＴのエクソン３２６挿入、及びノックイン変異の成功した生殖細胞系列伝達を決定する。
別のマウスモデルは、文献に説明されており、それは、ヒトＴＴＮ変異ｃ．４３６２８ｉｎｓＡＴを含む標的化ベクターの後にポリアデニル化シグナルを有するネオマイシン耐性カセットを使用して発生されたという点で異なる（Ｇｒａｍｌｉｃｈら、２００９，上記参照）。変異を、相同組み換えによってマウスＥＳ細胞内に導入した。Ｇｒａｍｌｉｃｈのマウスモデルでは、ホモ接合子孫は、いかなるものであれ心臓形成を伴わず、胚で致死的であった。ヘテロ接合子孫は、拡張型心筋症を発症し、ストレス誘導に際し低下した心機能を有した。
モデル２：エクソン２１９を標的化する骨格ミオパチー（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）モデル
それに加えて、ＴＴＮ骨格筋ミオパチーモデルを、骨格筋に影響を及ぼし、中心核ミオパチーとして存在する公開されている変異（ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃ）組み込むように設計した［Ｃｅｙｈａｎ－Ｂｉｒｓｏｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８１（１４）：１２０５－１４（２０１３）］。臨床集団における知見としては、増加された中心核、タンパク質の短縮、カルパイン－３に関する結合の損失、筋節の崩壊、増加された結合組織、及びミトコンドリアを欠く領域が挙げられる。この患者の臨床所見としては、全身の筋力低下、呼吸低下、及び心臓障害の可能性が挙げられる。変異は、保存されたスプライス部位に位置し、スプライシング欠陥及び短縮型タイチンタンパク質を生成する［Ｃｅｙｈａｎ－Ｂｉｒｓｏｙら、上記参照；Ｆｏｙｅ，Ｎａｒｒａｔｉｖｅ Ｉｎｑｕｉｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ，５（３）：２０６－２０８（２０１５）］。類似のマウスモデルは文献内に利用可能ではない。本明細書に説明されるＴＴＮ骨格筋ミオパチーモデルは、ＴＴＮにおける種々の種類の変異及び変異の場所に関連付けられる疾患の重篤度を記述し、治療的アプローチを提供するために有用である。モデルマウスを発生させるために、Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、塩基対変異をノックインし、ＴＴＮタンパク質を短縮し、骨格及び心臓の組織内に表現型及び機能障害を確立する。
エクソン２１９内にヒトゲノム配列を使用して短縮型ｓｇＲＮＡ（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’）を設計するために、ＣＲＩＳＰＲ ＭＩＴプラットフォームを使用した。ｓｇＲＮＡの配列を、ヒトゲノムに対して整列させて、ｓＳＮＰの排除を立証した（Ｔｓａｉら、上記参照）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡに由来するスタフィリコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を、精製し、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ注射用緩衝液（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）中に再懸濁する。先に公開される通り、ｓｇＲＮＡをインビトロ転写によって発生させる（Ｍａｃｈｉｋｏら、上記参照；Ｈｏｒｉｉら、上記参照）。手短に述べると、ＰＣＲ精製後、Ｔ７転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、テンプレートをインビトロ転写のために使用する。およそ６週齢の雌ＢＬ６マウスを、ＰＭＳ（妊馬血清）及びｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を用いて過剰排卵させる（Ｈｏｒｉｉら、上記参照）。その後、それらを雄ＢＬ６マウスと交尾させ、過剰排卵させたマウスの膨大部から受精卵を単離する。ｓａＣａｓ９のｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡを、極微操作装置付きの顕微鏡を使用して前核内に共注射する。注射の直後に、偽妊娠したマウス１匹当たりおよそ２０～３０個の受精卵を再インプラントする。
動物に実施するすべての手順は、ＩＡＣＵＣ（ＡＲ０８－０００１７；ＩＢＳ０００００２０２）に従う。同腹仔間のさらなる交配を利用して、ｃ．３２８５４Ｇ＞Ｃのエクソン２１９挿入、及びノックイン変異の成功した生殖細胞系列伝達を決定する。
ＡＡＶ．ｒｈ７４．Ｃａｓ９ＴＴＮの送達
１つ以上のタイチン遺伝子変異を有するマウス（変異は、モデル１及び２に関して説明される通りＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ゲノム編集によって導入され得る）を、２Ｌ／分の酸素中２．５％のイソフルレンを用いて麻酔をかける。左胸の皮膚を小さく切開して、胸部筋肉を露出させる。大胸筋及び小胸筋を切断して、さらなる肋間腔を露出させる。モスキート止血鉗子を、第４肋間腔を通して押し付け、肋間筋、胸膜、及び心膜を貫通する。鉗子を開いたまま、頂部を見るために心臓を外面化する。３０Ｇ針を使用して、ＡＡＶｒｈ．７４．ＳａＣａｓ９／ＴＴＮを左室の管腔内に注入する。送達後、針を除去し、心臓を胸部に戻した後、手動で排気し、一針の縫合で皮膚を閉じる。冠動脈内送達経路は、細胞分布の均一性、筋細胞の再発生、及び心筋の虚血領域内の生存組織の量の観点から、他の送達方法（例えば、静脈内、腹腔内）より優れていることが示されている［Ｌｉ，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１１；１０６（５）：８４９－８６４］。先行研究では、手順は、極めて低い死亡率を有して安全であった［Ｇａｏら、上記参照］。
研究のエンドポイントは３カ月であり、結果の測定は、生体内分布及びタイチン発現の定量化／すべての骨格及び心臓の筋肉内のｖｇコピーの定量化を含む。初期に投与されたコホートが５０％超の全長タイチンのをもたらさない場合、さらなる用量漸増を継続する。最後に、ＰＣＲ系アッセイを介して標的外分析を実施して、ＳａＣａｓ９を駆動するＮＮＧＲＲＴ特異性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を考慮し、ゲノム転座及び標的外活性を検出する。インビボ心機能を評価するために、心臓の収縮及び拡張性能を、脈波ドップラー及び組織ドップラー撮像を用いた心エコー検査を使用して定量化する。心エコー検査を使用して、駆出率、短縮率、拡張末期容量、及び収縮末期容量を含む心機能の複数の測定を決定する。それに加えて、壁厚を測定する。生活を監視し、マウスを１２週目で剖検して、心筋内のタイチン発現を評価する。タイチン（Ｚ盤及びＣ末端部分）の免疫蛍光及び心臓トロポニンＴのは、治療後の筋節の統合を実証する。筋原線維の電子顕微鏡法を使用して、治療後の適切な整列を決定する。
例証的な実施形態及び引用される文書に関する注意
本開示は特定の実施形態及び実施例を提供するが、当業者には変形及び修飾が想定されるであろうことが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。
本出願内に引用されるすべての文書は、それらが参照される開示に特に注意して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

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  1. 明細書に記載の発明。
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