JP6404219B2 - 筋強直性ジストロフィーを治療するためのペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）を治療するための、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）をコードする遺伝子の３’非翻訳領域のポリＣＵＧリピートトラクトを標的とするカチオン性ペプチド結合モルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその全身投与に関する。

筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、主に神経筋疾患として現れるが、心臓、内分泌、胃腸および中枢神経系の機能不全にも関与する、常染色体優性の遺伝性障害である。ＤＭ１の特徴的症状は筋強直であり、これは収縮後の筋弛緩異常であり、筋肉における長期にわたる反復性の活動電位として筋電図検査（ＥＭＧ）で検出される。ＤＭ１における遺伝的病変は、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）として知られるプロテインキナーゼをコードする遺伝子の３’非翻訳領域における不安定なＣＵＧトリヌクレオチドリピートエレメントからなる。少数コピーのＣＵＧリピートが非罹患者で見つけられるが、５０コピーから数千コピーに及ぶ多数の不安定なＣＵＧリピートがＤＭ１患者で検出される。ＣＵＧリピートの数が発症年齢および疾患の重症度と直接的に相関することが遺伝学研究によって確証された（非特許文献１）。

多数のＣＵＧリピートを含むＤＭＰＫなどのＲＮＡ転写産物は、突然変異型ＤＭＰＫ転写産物を発現する細胞および組織において、機能獲得型の特質を獲得し、ＲＮＡ媒介毒性を促進する（非特許文献２）。病原性転写産物は核内に保持され（非特許文献３）、ここで、この転写産物はＭＢＮＬ１などのＲＮＡ結合タンパク質を捕捉する（非特許文献４；非特許文献５）。ポリ（ＣＵＧ）ＲＮＡもＣＵＧ−ＢＰ１の定常レベルを増大させる（非特許文献６；非特許文献７）。ＭＢＮＬ１の隔離とＣＵＧ−ＢＰ１活性の増大の両方は、多数のＲＮＡ転写産物の異常なスプライシングに関連する。注目すべきものはクロリドチャネルＣｌＣ−１ｍＲＮＡの不完全なＲＮＡスプライシング（非特許文献８）であり、これは、筋強直を直接的に引き起こすことが示された（非特許文献９）。異常なＲＮＡスプライシングに加えて、突然変異型ＤＭＰＫの発現の結果としては、骨格筋のトランスクリプトームのリモデリングが挙げられる（非特許文献１０）。異常なＲＮＡスプライシングおよびトランスクリプトームの変化を含む無調節なｍＲＮＡレベルに起因する、一次配列が変化したタンパク生成物は、ＤＭ１疾患の特定の態様と関連があり、因果関係さえもあることが予期される。

現在、ＤＭ１の臨床において、疾患の主要な病原性駆動体である有毒なＲＮＡを標的とする治療剤はない。ＤＭ１に関する標準治療法は、主に支持的であり、特定の症状、例えば筋強直を管理することを目的としている（非特許文献１１）。新規な治療方法の前臨床評価が、２５０のＣＵＧトリヌクレオチドの挿入を３’非翻訳領域において内部に持つヒト骨格アクチン導入遺伝子を含むＨＳＡ^ＬＲトランスジェニックマウスモデルにおいて行われた。このＨＳＡ^ＬＲモデルは、ＣＵＧ ＲＮＡによるＭＢＮＬ１の隔離およびその後に続くＲＮＡスプライシング異常、筋肉のトランスクリプトームの変化ならびに筋強直などの生理的な異常性を含めて、ＤＭ１の幾つかの特色を示す（非特許文献１０；非特許文献１２）。ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて試験した新規な治療様式は、ＣＵＧリピートＲＮＡと相互作用し、病巣結合性ＭＢＮＬ１タンパク質を遊離するように設計される小分子リガンドを含む（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。加えて、ＣＵＧリピートトラクトを標的とする３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の化学作用が、ＤＭ１のトランスジェニックマウスモデルにおいて行われた研究で評価された（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８。非特許文献１９は、２５塩基長のＣＡＧ配列モルホリノオリゴヌクレオチド（ＣＡＧ２５）の筋肉内（ＩＭ）注射を与えたＨＳＡ^ＬＲマウスの前脛骨（ＴＡ）筋において、ＤＭ１の病状の局部的な補正を示した。ＣＡＧ２５で治療したＴＡ筋は、リボ核病巣の存在の低下、ＭＢＮＬ１タンパク質の再分布、異常なＲＮＡスプライシングの補正、クロリドチャネル（ＣｌＣ−１）タンパク質の発現および機能の修復ならびに筋強直の低減を示した（非特許文献１６）。この治療方法は、ＨＳＡ^ＬＲマウスのＤＭ１様表現型の補正を示したが、複数の組織型を含めた複数の組織が、ＤＭ１の原因となる有毒なＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物を標的とする活性なモルホリノオリゴヌクレオチドへ暴露されることを可能にする、全身的送達ストラテジーの必要性が依然として存在すると思われる。

本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願および他の種類の刊行物（例えば雑誌論文）が参照される。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願および刊行物の開示を、すべての目的のために、参照によって完全に本明細書に組み入れる。

Ｄａｙ＆Ｒａｎｕｍ、２００５、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ １５：５〜１６ Ｗｈｅｅｌｅｒ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００７、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２０：５７２〜５７６ Ｔａｎｅｊａら、１９９５、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２８：９９５〜１００２ Ｍａｎｋｏｄｉら、２００１、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：２１６５〜２１７０ Ｍａｎｋｏｄｉら、２００３、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５４：７６０〜７６８ Ｔｉｍｃｈｅｎｋｏ ＮＡら、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６：７８２０〜７８２６ Ｋｕｙｕｍｃｕ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００７、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２８：６８〜７８ Ｍａｎｋｏｄｉら、２００２、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５〜４４ Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３９５２〜３９５７ Ｏｓｂｏｒｎｅら、２００９、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８：１４７１〜１４８１ Ｌｏｇｉｇｉａｎら、２０１０、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７４：１４４１〜１４４８ Ｍａｎｋｏｄｉら、（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６９〜１７７３ Ｗａｒｆら、２００９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１８５５１〜１８５５６ Ｐａｒｋｅｓｈら、２０１２、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３４：４７３１〜４７４２ Ｏｆｏｒｉら、２０１２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．印刷中、オンラインで最初に発表される：４月６日２０１２年 Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：３３６〜３３９ Ｍｕｌｄｅｒｓら、２００９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１３９１５〜１３９２０ Ｌｅｅら、２０１２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９：４２２１〜４２２６ Ｗｈｅｅｌｅｒおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：３３６〜３３９）

本明細書で提供される発明は、特に、複数の組織および組織型に全身的に送達され得るカチオン性ペプチド結合モルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造および使用するための組成物および方法ならびにＤＭ１の治療に対するその使用を開示する。

したがって、一態様では、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療または予防を必要とする個体においてそれを治療または予防するための方法であって：筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ＲＮＡ転写産物標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも３つのポリＣＵＧリピート配列に相補的な配列を含む治療有効量のカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを全身的に個体に投与することを含み、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、少なくとも２つの筋肉においてＤＭ１の少なくとも１つの症状を軽減する方法が本明細書で提供される。カチオン性ペプチドが８〜３０個のアミノ酸残基の長さであり、ＲＸＲ、ＲＸ、ＲＢおよびＲＢＲからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサブ配列を含み、ここで、Ｒはアルギニンであり、Ｂはβ−アラニンであり、各Ｘは独立に−ＮＨ−（ＣＨＲ^１）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎは４〜６であり、各Ｒ^１は独立にＨまたはメチルであり、ただし最大で２つのＲ^１がメチルである、請求項１に記載の方法。幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲＲＢＲ）_２ＸＢ−を含む。他の実施形態では、カチオン性ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲ）_４ＸＢ−を含む。上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｎが約５〜２５のいずれかである配列５’−（ＡＧＣ）_ｎ−３’、５’−（ＧＣＡ）_ｎ−３’または５’−（ＣＡＧ）_ｎ−３’を含む。別の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に１つから２つの付加的なモルホリノヌクレオチドをさらに含む。幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’を含む。別の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’アミン修飾をさらに含む。上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。上記の方法のいずれかの他の実施形態では、カチオン性ペプチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合したスペーサー部分によって、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドから分離される。一実施形態では、スペーサー部分は、
を含む。

上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、筋肉は、骨格筋、平滑筋および／または心筋である。上記の方法のいずれかの他の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前脛骨筋、四頭筋および／または腓腹筋の細胞を透過する。上記の方法のいずれかのさらに他の実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は筋強直である。上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、筋核内のリボ核病巣におけるｍｕｓｃｌｅｂｉｎｄ−ｌｉｋｅ−１（ＭＢＮＬ−１）タンパク質の凝集である。上記の方法のいずれかの他の実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、筋細胞における少なくとも１種のＲＮＡ転写産物の異常なスプライシングである。別の実施形態では、前記少なくとも１種のＲＮＡ転写産物（ヒト遺伝子のＲＮＡ転写産物など）は：Ｓｅｒｃａ−１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣＩＣからなる群から選択される。上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与は、静脈内、腹腔内または皮下に行われる。上記の方法のいずれかの他の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個体に週１回投与される。上記の方法のいずれかのさらに他の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１から６週間個体に投与される。上記の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬として許容される賦形剤と共に投与される。上記の方法のいずれかの他の実施形態では、個体はヒトである。

ＰＰＭＯの化学構造およびＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋの生理活性の評価を示す図である。（ａ）モルホリノオリゴマーの５’末端に位置するリンカーに共有結合的に付加された細胞透過性ペプチド（ペプチドＢまたはペプチドＫ）を含むＰＰＭＯの構造。ペプチドＢおよびペプチドＫの配列は材料および方法に記載されている。（ｂ）ＴＡ筋において試験およびコントロールＡＳＯのＩＭ注射を材料および方法に記載されているように行った。ＴＡへの直接的注射とそれに続くＳｅｒｃａ−１のスプライシングの解析は、ペプチドＢまたはペプチドＫの共有結合の、ＣＡＧ２５の生理活性への影響を測定する役目を果たした。ＩＭ注射してから３週後に、ＴＡ筋を収集し、全ＲＮＡを精製し、Ｓｅｒｃａ−１を増幅して、エキソン２２（ｅｘ２２）を有するまたは有さないスプライスアイソフォームを検出した。各ブラケットは、一方のＴＡに注射される指示ＡＳＯ（ＧＡＣ２５、ＣＡＧ２５、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋ）で注射され、反対側のＴＡ（ｃｏｎ）は生理食塩水ビヒクルで注射された、１匹のＨＳＡ^ＬＲマウスを表す。ＦＶＢ／ｎ野生型マウスのＴＡ由来のＲＮＡもコントロールとして解析し、これは、非疾患マウスで生じるＳｅｒｃａ−１のスプライシングを示す。 ＰＰＭＯ−ＢまたはＰＰＭＯ−Ｋの反復ＩＶ注射がＳｅｒｃａ−１のスプライシングを補正することを示す図である。ＨＳＡ^ＬＲマウスを、生理食塩水、ＣＡＧ２５、ＰＰＭＯ−ＢまたはＰＰＭＯ−Ｋで６週にわたって週１回注射した。最終投与から約１週間後に指示された筋肉群をマウスから採取し、全ＲＮＡを精製し、Ｓｅｒｃａ−１を増幅して、差次的にスプライスされたアイソフォームを検出した。図１のように、ＦＶＢ／ｎ野生型マウスのＴＡのＲＮＡをコントロールとして扱う。図１のようにＧＡＣ２５またはＣＡＧ２５で注射されたＨＳＡ^ＬＲマウスのＴＡから精製したＲＮＡにおけるＳｅｒｃａ−１のスプライシングを、それぞれネガティブコントロール（ｎｅｇ ｃｏｎ）およびポジティブコントロール（ｐｏｓ ｃｏｎ）として扱う。 ＰＰＭＯ−Ｋの反復ＩＶ注射で投与されたＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＺＡＳＰ、ｍ−ＴｉｔｉｎおよびＣｌＣ−１の異常なスプライシングの補正を示す図である。ＨＳＡ^ＬＲマウスを、生理食塩水またはＰＰＭＯ−Ｋで６週にわたって１週１回注射した。指示された筋肉群をマウスから採取し、全ＲＮＡを精製し、ＺＡＳＰ、ｍ−ＴｉｔｉｎおよびＣｌＣ−１を増幅して、指示されたエキソン（ｅｘ）とイントロン（ｉｎｔ）の構成を含む、差次的にスプライスされたアイソフォームを検出した。ＦＶＢ／ｎ野生型マウスのＴＡのＲＮＡを非疾患コントロールとして扱う。ＺＡＳＰ、ｍ−ＴｉｔｉｎおよびＣｌＣ−１に対して、ポジティブおよびネガティブコントロールを図２と同様のＲＮＡを用いてＰＣＲ増幅によって生成した。 ＰＰＭＯ−Ｋの全身的送達が、ＨＳＡ^ＬＲマウスの四頭筋におけるＣＵＧ ＲＮＡ病巣の頻度および強度を低減することを示す図である。５’末端においてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５で標識された２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡプローブ（５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ−３’）を使用して、記載（Ｍａｎｋｏｄｉら、２００１、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：２１６５〜２１７０）のように、凍結した四頭筋の切片についてＦＩＳＨ解析を行い、共焦点顕微鏡により可視化した。（ａ、ｂ）生理食塩水のＩＶ注射によって週１回で６回処理したＨＳＡ^ＬＲマウスは、ＤＡＰＩ標識された筋核中に大量のＣＵＧ ＲＮＡ病巣を示す。（ｃ、ｄ）週１回で６回のＰＰＭＯ−Ｋ（３０ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射で処理したＨＳＡ^ＬＲは、ＣＵＧ ＲＮＡ病巣の数および強度の低減を示す。（ｅ、ｆ）野生型ＦＶＢ／ｎ筋は、検出可能な病巣を含まない。スケールバー＝５０μｍ。 免疫蛍光顕微鏡によって、ＰＰＭＯ−Ｋ処理マウスにおけるＭＢＮＬ１タンパク質の核再分布が示されることを示す図である。材料および方法に記載されているように、四頭筋切片中のＭＢＮＬ１タンパク質の免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡観察を行った。（ａ〜ｃ）生理食塩水処理したＨＳＡ^ＬＲマウス由来の筋切片は、核においてＭＢＮＬ１の点状の局在を示す。（ｄ〜ｆ）ＰＰＭＯ−Ｋ処理したＨＳＡ^ＬＲマウス由来の筋切片は、ＭＢＮＬ１の拡散した核染色を示す。（ｇ〜ｉ）野生型ＦＶＢ／ｎマウス由来の筋切片は、ＭＢＮＬ１の拡散した核染色を示す。スケールバー＝１０μｍ。 ＰＰＭＯ−Ｋの反復ＩＶ注射で投与されたＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて筋強直が補正されることを示す図である。（ａ）ホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲ、ヘミ接合性ＨＳＡ^ＬＲおよび野生型ＦＶＢ／ｎマウスのＴＡ、腓腹筋および四頭筋における、１８Ｓ ＲＮＡに対して標準化したＨＳＡ^ＬＲ導入遺伝子のｍＲＮＡレベル。データは、平均＋ＳＤ、群当たりｎ＝６マウスとして示す。（ｂ）ＨＳＡ^ＬＲ（筋強直）の腓腹筋または野生型ＦＶＢ／ｎマウス（筋強直なし）におけるＥＭＧ記録のトレーシング。筋強直はＨＳＡ^ＬＲマウスで検出されるが、野生型マウスでは検出されない。（ｃ）未処理のホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲ、ヘミ接合性ＨＳＡ^ＬＲおよび野生型マウスについてＥＭＧ解析を行った。ＥＭＧは、生理食塩水またはＰＰＭＯ−Ｋの注射によって週１回で６回処理したホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲマウスについても行った。材料および方法に記載されているように、各筋肉１０回解析して筋強直グレードを作成した。データは、試験した各筋肉群に対する平均グレード＋ＳＤ、群当たりｎ＝３〜８マウスとして示す。

本発明は、特に、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の個体において複数の組織および／または組織型に全身的に送達され得るカチオン性ペプチド結合モルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明者らは、ＤＭ１の動物モデルにおいて全身的に投与した場合、ＣＡＧ配列モルホリノへの細胞透過性ペプチドの付加が、筋組織へのＰＰＭＯの十分な取り込みを可能にして、伸長したＣＵＧリピートの有毒作用を中和することを発見した。多数のポリＣＵＧ ｍＲＮＡを持つ個体の筋細胞へのこうしたモルホリノの送達およびそれらの透過は、幾つかのタンパク質のスプライシング異常の完全に近い解決、ＲＮＡ病巣からのＭＢＮＬ１の遊離および筋強直の消失と関連があった。

Ｉ．一般的技術
本発明の実施は、別段指示がない限り、核酸化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における当業者に周知な従来技術を用いる。そうした技術は、文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１）（一緒に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として本明細書で言及する）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、２００１までの補遺を含める）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）において十分に説明されている。核酸は、例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１〜４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５ ２５：３４４０〜３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３〜３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６〜７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような周知の化学合成技術によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。

ＩＩ．定義
用語「ＲＮＡ標的」は、配列特異的様式でモルホリノが結合するＲＮＡ転写産物を指す。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ標的は、可変数のＣＵＧトリヌクレオチドリピートエレメントを３’非翻訳領域に有する、１種またはそれ以上のＤＭＰＫ ｍＲＮＡ分子である。

「モルホリノ」または「モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、モルホリノサブユニット構造で構成されるオリゴヌクレオチド類似体であって、（ｉ）構造が、１つから３つの原子長、好ましくは２つの原子長であり、好ましくは無電荷またはカチオン性であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する、リン含有結合によって結合しており、（ｉｉ）各モルホリノ環が、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分を有する、オリゴヌクレオチド類似体を指す。幾つかの実施形態では、モルホリノは、ＲＮＡ標的のタンパク質への翻訳を遮断するＲＮＡ標的に結合する。他の実施形態では、モルホリノは、ＲＮＡ標的自体との、または他の細胞性ＲＮＡ、タンパク質もしくはリボタンパク質、例えばこれらに限定されないが、細胞のｍＲＮＡスプライシング装置に関連するＲＮＡ、タンパク質およびリボタンパク質との、ＲＮＡ標的の凝集を防止する。

「個体」は、哺乳動物、例えば、任意の一般的な実験用モデル生物または哺乳動物であってもよい。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、家畜、競技動物、愛玩動物、マウス、ラットおよび他のげっ歯類が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）は、臨床病理の過程において治療を受ける個体または細胞の自然経過を変化させることを目的とする、臨床的介入を指す。治療の望ましい効果としては、これらに限定されないが、疾患進行速度の低下、病態の回復または寛解、および緩解または改善した予後が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「予防」は、個体において、疾患または疾患に関連する症状の出現または再発に対して予防法を提供することを含む。個体は、疾患を発生する素因があっても、疾患を発生しやすくても、疾患を発生する危険性があってもよいが、まだ疾患と診断されていない。

「有効量」または「治療有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部としてのいずれかで哺乳類対象に投与されるアンチセンスオリゴマーなどの治療用化合物の量であって、所望の治療効果をもたらすのに有効である量を指す。アンチセンスオリゴマーについては、この効果は、一般的には、選択された標的配列の翻訳または天然のスプライスプロセシングを阻害することによってもたらされる。

本明細書で使用する場合、別段指示がない限り、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の意味を含む。

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含むこと」、態様および実施形態「からなること」ならびに態様および実施形態「から本質的になること」を含むことが理解されよう。

本明細書全体を通して与えられるすべての最大数値限定は、それより小さいすべての数値限定を、そのようなより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含むものとする。本明細書全体を通して与えられるすべての最小数値限定は、それより高いすべての数値限定を、そのようなより高い数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含む。本明細書全体を通して与えられるすべての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るそれより狭いすべての数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべての本明細書に明確に記載されているかのように含む。

ＩＩＩ．組成物
Ａ．モルホリノ
モルホリノは、天然に存在する核酸と酷似している構造を有する合成分子である。こうした核酸は、標準的な核酸塩基対形成によって相補的なＲＮＡ配列に結合する。構造的に、モルホリノは、こうした分子はデオキシリボース環またはリボース環の代わりにモルホリン環に結合した核酸塩基を有するという点において、ＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる。さらに、モルホリノの骨格構造は、リン酸塩の代わりに非イオン性またはカチオン性の結合基からなる。例えば、無電荷のホスホロジアミデート基とのアニオン性のリン酸塩の置き換えによって、通常の生理的ｐＨ範囲においてイオン化が除かれ、生物または細胞においてモルホリノは無電荷の分子になる。モルホリノは一本鎖オリゴとして最も一般に使用されるが、モルホリノ鎖と相補ＤＮＡ鎖のヘテロ二本鎖をカチオン性のサイトゾル送達試薬と組み合わせて使用することもできる。

多くのアンチセンス構造型（例えばホスホロチオエート）と異なり、モルホリノは、その標的ＲＮＡ分子を分解しない。その代わりに、モルホリノは、「立体的遮断」によって、すなわちＲＮＡ内の標的配列に結合し、さもないとＲＮＡと相互作用し得る分子を立体的に妨害することによって働く。伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’非翻訳領域に結合すると、モルホリノは、５’キャップから開始コドンへのリボゾーム開始複合体の進行を妨げることができる。これは、標的転写産物のコード領域の翻訳を防止する（「ノックダウン」遺伝子発現と呼ばれる）。ある種のモルホリノは発現を非常に効率的にノックダウンするので、既存のタンパク質が分解された後に、標的タンパク質はウェスタンブロットによって検出不可能になる。

モルホリノは、通常、スプライス指向ｓｎＲＮＰ複合体がＲＮＡ前駆体鎖のイントロンの境界でその標的へ結合するのを防止することによって、ｍＲＮＡ前駆体のプロセシング工程を妨げることもできる。Ｕ１（ドナー部位で）またはＵ２／Ｕ５（ポリピリミジン部分およびアクセプター部位で）が結合するのを防止することによって、修飾されたスプライシングが引き起こされ得、これによって、一般に、成熟ｍＲＮＡ転写産物からエキソンが排除され得る。スプライス修飾は、好都合には、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってアッセイすることができ、ＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動後にバンドシフトとして観察される。

モルホリノは、イントロンスプライスサイレンサーおよびスプライスエンハンサーを遮断するのにも使用されている。モルホリノによって、Ｕ２およびＵ１２ ｓｎＲＮＰの機能が阻害された。タンパク質コード領域内の「不安定な」ｍＲＮＡ配列を標的にしたモルホリノは、翻訳フレームシフトを誘導することができる。こうした様々な標的に対するモルホリノの活性によって、モルホリノを、タンパク質または核酸とｍＲＮＡとの相互作用を遮断するための汎用ツールとして使用できることが示唆される。

本発明の組成物は、１つから３つの原子長であって、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する無電荷のリン含有結合によって結合しているモルホリノサブユニットで構成され、モルホリノ基に結合している塩基は、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジン塩基対形成部分である。プリンまたはピリミジン塩基対形成部分は、一般的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。そのようなオリゴマーの製造は、米国特許第５，１８５，４４４号に詳細に記載されており、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。結合または活性を妨げない限り、この結合に対して変更を行うことができる。例えば、リンに結合している酸素を硫黄（チオホスホロジアミデート）で置換することができる。５’酸素を、アミノ基または低級アルキル置換アミノ基で置換することができる。リンに結合しているペンダント窒素は、無置換でもよく、（場合により置換された）低級アルキルで一置換または二置換されていてもよい。プリンまたはピリミジン塩基対形成部分は、一般的にはアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。モルホリノの合成、構造および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、第５，２１７，８６６号、第５，１４２，０４７号、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５、第５，５２１，０６３号、第５，５０６，３３７号および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０３６１２７号に詳述されており、それらすべてを参照によって本明細書に組み入れる。

幾つかの態様では、本発明のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のポリＣＵＧリピート配列と相補的でもよい。幾つかの実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ＲＮＡ標的の３’非翻訳領域と、少なくとも約９０％、９５％または１００％のいずれか（これらの値の間にある任意のパーセンテージを中に入れ、含める）の同一性である。幾つかの実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭＰＫ ＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５またはそれ以上のいずれかのポリＣＵＧリピート配列と相補的である。幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｎが約５〜２５のいずれかである配列５’−（ＡＧＣ）_ｎ−３’、５’−（ＧＣＡ）_ｎ−３’または５’−（ＣＡＧ）_ｎ−３’を含む。別の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に１つから２つの付加的なモルホリノヌクレオチドをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ−３を含む。別の実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列特異的な様式でＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物に結合する。幾つかの実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’アミン修飾を含む。別の実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロジアミデートカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。

Ｂ．カチオン性細胞透過性ペプチドおよびカチオン性ペプチド結合モルホリノ
本明細書に記載のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋細胞へのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身的送達を容易にするカチオン性ペプチドに結合している。一般に、本明細書に記載のカチオン性ペプチドは８から３０個のアミノ酸残基の長さであり得、ＲＸＲ、ＲＸ、ＲＢおよびＲＢＲからなる群から選択されるサブ配列からなり；Ｒはアルギニン（Ｄ−アルギニンを含むことができる）であり、Ｂはβ−アラニンであり、各Ｘは独立に−ＮＨ−（ＣＨＲ^１）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎは４〜６であり、各Ｒ^１は独立にＨまたはメチルであり、ただし最大で２つのＲ^１’がメチルである。幾つかの実施形態では、各Ｒ^１は水素である。他の実施形態では、カチオン性ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基の長さのいずれかでもよい。別の実施形態では、例えば６−アミノヘキサン酸のように、変数ｎは５である。一実施形態では、カチオン性ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲＲＢＲ）_２ＸＢ−を含み、Ａｃはアセチル基である。別の実施形態では、カチオン性ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲ）_４ＸＢ−を含み、Ａｃはアセチル基である。カチオン性細胞透過性ペプチドの合成および構造に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００９／００９９０６６号に見出すことができ、その開示を、参照によって完全に本明細書に組み入れる。

一態様では、カチオン性ペプチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合している。他の実施形態では、カチオン性ペプチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合しているスペーサー部分を介してモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している。スペーサー部分は、カチオン性ペプチドを合成する間にペプチド中に組み入れられてもよい。例えば、スペーサーが遊離アミノ基および別の分子部分への結合を可能にする第二の官能基（例えばカルボキシル基またはアミノ基）を含む場合は、スペーサーは、ペプチド合成に使用される固体支持体にコンジュゲートしていてもよい。その後カチオン性ペプチドを、標準的な固相技術によってスペーサーの遊離アミノ基上に直接合成することができる。別の実施形態では、スペーサー部分は、ペプチド合成の後にカチオン性ペプチドにコンジュゲートすることができる。そうしたコンジュゲーションは、当技術分野で十分に確立された方法によって達成することができる。一実施形態では、リンカーは、合成されたカチオン性ペプチドの標的官能基への結合に適した少なくとも１つの官能基を含む。例えば、遊離アミン基を有するスペーサーをカチオン性ペプチドのＣ末端カルボキシル基と反応させることができる。幾つかの実施形態では、スペーサー部分は：
を含む。

一実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の構造：
を有し、
式中、Ｒ^２は、カチオン性ペプチド（本明細書に開示されるカチオン性ペプチドのいずれかなど）であり、Ｒ^３は、Ｈ、ＣＨ_３またはＣＨ_２ＣＯＮＨ_２であり、Ｒ^４は、ｎが約５〜２５のいずれかである配列５’−（ＡＧＣ）_ｎ−３’、５’−（ＧＣＡ）_ｎ−３’または５’−（ＣＡＧ）_ｎ−３’を含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に１つから２つの付加的なモルホリノヌクレオチドをさらに含むことができる。

別の態様では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
を含み、
式中、Ａｃはアセチルであり、Ｒはアルギニン（Ｄ−アルギニンを含むことができる）であり、Ｂはβ−アラニンであり、各Ｘは独立に、−ＮＨ−（ＣＨＲ^１）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎは４〜６であり、各Ｒ^１はＨであり、Ｒ^４は、配列５’−ＡＧ（ＣＡＧ）_７ＣＡ−３’を含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

別の態様では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
を含み、
式中、Ａｃはアセチルであり、Ｒはアルギニン（Ｄ−アルギニンを含むことができる）であり、Ｂはβ−アラニンであり、各Ｘは独立に−ＮＨ−（ＣＨＲ^１）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎは４〜６であり、各Ｒ^１はＨであり、Ｒ^４は、配列５’−ＡＧ（ＣＡＧ）_７ＣＡ−３’を含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

Ｃ．医薬製剤
医薬品として用いられる場合は、本明細書に開示されるカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物中に配合される医薬として許容される賦形剤または担体と共に配合することができる。

医薬品として用いられる場合は、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の形で投与することができる。これらの化合物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含めた様々な経路で投与することができる。これらの化合物は、注射用組成物および経口組成物の両方として有効である。そうした組成物は、医薬分野で周知の方法で製造され、少なくとも１種の活性化合物を含む。

本発明は、１種またはそれ以上の医薬として許容される賦形剤または担体に関連するカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの１種またはそれ以上を活性成分として含有する医薬組成物も含む。本発明の組成物の製造では、活性成分は、通常、賦形剤もしくは担体と混合され、賦形剤もしくは担体で希釈され、またはカプセル、サッシェ、紙もしくは他の容器の形であり得る賦形剤もしくは担体内に封入される。賦形剤または担体が希釈剤として働く場合は、それらは、固体材料でも半固体材料でも液体の材料でもよく、活性成分に対するビヒクル、担体または媒体として働く。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳濁液、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてのまたは液体媒質中の）、例えば１０重量％までの活性化合物を含む軟膏剤、軟質または硬質のゼラチンカプセル剤、坐剤、滅菌した注射用液剤および滅菌した包装散剤の形であってもよい。

製剤の製造では、他の成分と組み合わせるより前に、活性化合物を製粉して適切な粒径にすることが必要な場合がある。活性化合物が実質的に不溶性である場合は、活性化合物は、通常２００メッシュ未満の粒径に製粉される。活性化合物が実質的に水溶性である場合は、粒径は通常は、製粉することによって、製剤中に実質的に均一な分布をもたらすように、例えば約４０メッシュに調整される。

適切な賦形剤または担体の幾つかの例としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。製剤は、さらに以下を含むことができる：平滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイル；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えばメチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエート；甘味剤；および着香剤。本発明の組成物は、当技術分野で既知の方法によって、患者に投与した後に、活性成分の急速放出、持続性放出または遅延放出をもたらすように配合することができる。

組成物は好ましくは単位剤形で配合され、各投薬は、約５ｍｇから約１００ｍｇまたはそれ以上、例えば、約５ｍｇから約１０ｍｇ、約５ｍｇから約２０ｍｇ、約５ｍｇから約３０ｍｇ、約５ｍｇから約４０ｍｇ、約５ｍｇから約５０ｍｇ、約５ｍｇから約６０ｍｇ、約５ｍｇから約７０ｍｇ、約５ｍｇから約８０ｍｇ、または約５ｍｇから約９０ｍｇのいずれか（これらの値の間にある任意の範囲を中に入れ、含める）の活性成分を含む。用語「単位剤形」は、個体に対する単位投与量として適切な、物理的に分離した単位を指し、各単位は、適切な医薬品賦形剤または担体と共に、所望の治療効果をもたらすように計算された、あらかじめ決定された量の活性材料を含む。

カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは広い投与量範囲にわたって有効であり、一般に治療有効量で投与される。しかし、実際に投与されるカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、治療すべき状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含めた関連する状況を考慮して医師によって決定されることを理解されたい。

錠剤などの固体組成物を製造するために、主要な活性成分／カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の前製剤組成物を形成するために、医薬品賦形剤または担体と混合される。これらの前製剤組成物を均一と言及する場合は、これは、組成物を有効な単位剤形、例えば錠剤、丸剤およびカプセル剤に容易に等しく細分することができるように、活性成分が組成物全体にわたって均等に分散していることを意味する。

本発明の錠剤または丸剤は、持続性作用という利点を与える剤形を提供するために、コーティングまたは調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与成分および外部投与成分を含むことができ、後者が前者を覆う外被の形である。２つの成分は、胃での崩壊に抵抗性を示し、内部成分をインタクトな状態で十二指腸へ通過させるかまたは放出を遅延させるように働く腸溶層によって分離することができる。様々な材料をそのような腸溶層またはコーティングに使用することができ、そのような材料としては、幾つかのポリマー酸およびシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料とのポリマー酸との混合物が挙げられる。

経口的または注射による投与のために本発明の新規な組成物を組み入れることができる液体形態としては、水性液剤、適切に香気が付けられたシロップ剤、水性または油性懸濁剤、および食用油、例えばトウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油で香気が付けられた乳濁液、ならびにエリキシル剤および類似の医薬品ビヒクルが挙げられる。

吸入または吹送のための組成物としては、医薬として許容される水性溶媒もしくは有機溶媒またはそれらの混合物中の液剤および懸濁剤、ならびに散剤が挙げられる。液体または固体組成物は、上記のような適切な医薬として許容される賦形剤を含むことができる。組成物は、局部的または全身的作用のために、口または鼻呼吸経路によって投与することができる。医薬として許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスを使用して噴霧することができる。噴霧液剤は、噴霧装置から直接的に吸入してもよく、または噴霧装置は、フェイスマスクテントもしくは間欠性陽圧呼吸模擬装置に取り付けられていてもよい。液剤、懸濁剤または散剤組成物は、適切な様式で製剤を送達する装置から、経口的または経鼻的に投与することができる。

ＩＶ．本発明の方法
本明細書に開示される（組成物中などの）カチオン性ペプチド結合モルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、個体における筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）の症状の治療および／または予防に使用することができる。幾つかの態様では、個体は、ＤＭ１を発生する危険性がある。幾つかの態様では、方法は、有効量のカチオン性ペプチド結合モルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本明細書に開示される該オリゴヌクレオチドを含む組成物を全身的に個体に投与することによって、個体のＤＭ１に関連する症状（本明細書に記載の症状のいずれかなど）を治療および／または予防することを含むことができる。幾つかの実施形態では、個体は、ＤＭ１を有していると診断されるか、疑われる。

本発明は、以下に詳細に記載されているように、ＤＭ１に関連する症状または状態（身体障害、機能障害）を阻害するための方法に関する。したがって、状態のすべての影響が完全に予防されまたは回復することは必要とされないが、本明細書中に開示された方法の効果は、患者にとって著しい治療的利益にまで及ぶと思われる。したがって、治療的利益は、必ずしもＤＭ１に起因する特定の状態の完全な予防または治癒ではなく、むしろ、ＤＭ１に起因する症状を低減させるもしくは防止すること、そのような症状の出現を（量的もしくは質的のいずれかで）低減させるもしくは防止すること、そのような症状の重症度もしくはそれらの生理的影響を低減させること、および／またはＤＭ１の症状を経験した後の個体の回復を高めることを含む結果を包含し得る。

別の態様では、細胞内の１種またはそれ以上のＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物の凝集を低減させる方法が提供される。幾つかの実施形態では、方法は、細胞核中の１種またはそれ以上のＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物の凝集を防止する。

別の態様では、１種またはそれ以上のＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物の凝集および細胞内の１種またはそれ以上の核タンパク質またはＲＮＡを低減させる方法が、本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、１種またはそれ以上の核タンパク質は、スプライシングを受けた成熟ｍＲＮＡへのｍＲＮＡ前駆体（ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）としても知られている）のスプライシングに関与するタンパク質である。一実施形態では、核タンパク質は低分子コアタンパク質（Ｓｍタンパク質としても知られている）であり、ＳｍＢ、ＳｍＢ’、ＳｍＤ１、ＳｍＤ２、ＳｍＤ３、ＳｍＥ、ＳｍＦ、ＳｍＧまたはＳｍＮの１種またはそれ以上であり得る。幾つかの実施形態では、１種またはそれ以上の核ＲＮＡは、スプライシングを受けた成熟ｍＲＮＡへのｈｎＲＮＡのスプライシングに関与するＲＮＡである。別の実施形態では、核ＲＮＡは核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であり、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ１１、Ｕ１２、Ｕ４ａｔａｃまたはＵ６ａｔａｃの１種またはそれ以上であり得る。幾つかの実施形態では、１種またはそれ以上の核タンパク質またはＲＮＡは、核のリボタンパク質複合体を含む。別の実施形態では、ＲＮＡは、細胞性スプライシング装置の一部ではないＲＮＡ、例えばＳｅｒｃａ−１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣＩＣ−１であり得る。一実施形態では、細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞または心筋細胞などの筋細胞である。

特に本発明の組成物は、個体に投与される場合、ＤＭ１に関連する症状もしくは状態の１つもしくはそれ以上を治療もしくは予防する、および／またはこの障害の症状もしくはこの障害に関連する状態を低減もしくは緩和することができる。したがって、ＤＭ１に起因する影響または症状から個体を保護することは、障害の影響の出現および／または重症度を予防するまたは低減させることと、障害の影響が既に生じているまたは生じ始めている患者を治療することの両方を含む。有益効果は、当業者および／または患者を治療している熟練した臨床医によって、容易に評価することができる。好ましくは、本発明の方法を用いて治療を受けた患者を評価するのに使用される少なくとも１つの臨床的または生物学的なスコア、値または尺度の重大度または出現において、治療を受けていない患者と比較して、ポジティブなまたは有益な差が存在する。

Ａ．筋強直性ジストロフィー
筋強直性ジストロフィー（筋緊張性ジストロフィーまたは萎縮性筋緊張症としても知られている）は、筋消耗（筋ジストロフィー）、白内障、心臓の伝導異常、内分泌変化および筋強直を含む主症状を伴う、慢性の、緩徐進行性の、非常に可変性の、遺伝性の多臓器性（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ）疾患である。筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、別名「シュタイネルト病」として知られ、重度の先天型および軽度の小児期発症型の両方があり、主として骨格筋で発現するタンパク質であって、第１９染色体の長腕に位置する、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）と呼ばれる遺伝子の突然変異に起因する。筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、近位型筋緊張性ミオパシー（ＰＲＯＭＭ）とも呼ばれ、ＤＭ１よりまれであり、一般に、軽度の症候および症状を伴って現れる。ＤＭ２は、第３染色体のＺＮＦ９遺伝子の異常によって近接的に引き起こされる。筋強直性ジストロフィーはいかなる年齢の患者でも生じ得、疾患形態は常染色体優性の遺伝パターンを示す。ＤＭ１は、成人で診断される筋ジストロフィーの最も一般的な形態であり、有病率は、日本での１００，０００人に１人からヨーロッパでの１００，０００人に３〜１５人に及ぶ（Ｔｕｒｎｅｒ＆Ｈｉｌｔｏｎ−Ｊｏｎｅｓ、２０１０、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８１：３５８〜３６７）。

ＤＭ１に苦しんでいる個体の発症年齢および症状の重症度は、遺伝的に関連する個体間でさえも著しく変動し得る。ある個体では、症状は出生時に現れ得るか、かなりの高齢まで明らかにならない。ＤＭ１は進行性の障害であり、症状は一般に時間と共に緩徐に悪化する。したがって、症状が若年期に現れる個体は、障害に特有な症状を高齢期まで呈さない個体のものと比べると、一般的には、多くの数の合併症および重度の症状の両方を経験する。それにもかかわらず、個体の予後は変動し、疾患がいずれか１個体にどのように影響を及ぼすかについて、正確に予測することはできない。

１．心血管系の症状
ＤＭ１を有するある個体は、中度から重度の心肺異常を経験し得る。例えば、心筋症によって引き起こされる完全な心伝導遮断および心室細動／頻脈による突然死は、場合によってはＤＭ１が原因であった。ＤＭ１に関連する他の心血管系の症状としては、これらに限定されないが、心臓性失神および失神性めまい、心伝導異常、不整脈、低血圧ならびにうっ血性心不全が挙げられる。しばしば、ＤＭ１と診断された個体は、他の神経筋の症状を発症した後心血管系の症状を発生する。しかし、無症候性の小児が突然の心臓死に対する観察可能な危険性を有することを示すデータもある。

２．中枢神経系の症状
過剰な日中の眠気（睡眠過剰）は、発症年齢に関係なくＤＭ１の個体に観察されることが多い。全身性疲労もＤＭ１で一般に観察されるが、睡眠過剰は、夜間睡眠が正常または正常より多いにもかかわらず、日中に、頻繁にかつしばしば予測不可能に睡眠する必要があることを特徴とする。

ＤＭ１と診断された個体に著しい末梢神経異常が確認されなかったものの、神経伝導検査によって、末梢神経機能におけるある種の軽微な異常が確認された。ＤＭ１誘導性末梢神経機能不全の主因は現在知られていない。

３．胃腸管の症状
胃腸症状はＤＭ１で一般に観察され、消化管の骨格筋および／または平滑筋の機能不全に起因する。これらの症状には、口、舌または咽頭の脱力／筋強直による嚥下困難、食道括約筋弛緩による胃食道逆流、腸管および胃の無効な蠕動性平滑筋収縮による腹痛、悪心、嘔吐、腹部膨満または腸偽閉塞、脱力性／筋緊張性の胆管／胆嚢筋系に起因する胆石、腸の運動不全によって引き起こされる便秘、下痢または吸収不良、ならびに肛門括約筋および骨盤底筋の脱力による大便失禁が含まれる。

４．生殖器系および内分泌系の症状
ＤＭ１は、著しい生殖器系および内分泌系の異常に関連する。男性では、これらの症状は、思春期に関連するホルモンおよび内分泌の変化が生じないか遅延する場合、成人期まで認められない可能性がある。男性では、ＤＭ１は、精子生産の低下または精子無生産および男性不妊、二次性徴の発達不良（エネルギー、性欲、性毛、筋肉量および骨塩量の低下を含める）をもたらし得る精巣萎縮に関連する。さらに、ＤＭ１の男性は、血清黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンレベルの上昇を伴う低血清テストステロンレベルを頻繁に経験する。ＦＳＨレベルの上昇は、異常に高いエストラジオール：テストステロン比に関連し、これは男性における乳房腫大につながる可能性がある。最終的に、ＤＭ１の男性は、高い発生率の前頭部男性型脱毛症および脱毛を経験することが多い。

５．呼吸症状
横隔膜、腹部および肋間筋の筋脱力ならびに呼吸筋の筋強直のため、ＤＭ１は呼吸不全に関連する可能性があり、最も重度の場合では、個体が呼吸するのを補助するために機械的呼吸を必要とする場合がある。また、筋脱力のため、ＤＭ１の個体は、飲食物、唾液、鼻汁および胃液の肺への意図されない吸引の後に咳をするための力を欠くことが多く、これは、本疾患に特有の嚥下困難をしばしば伴う。このことは、感染をもたらす、肺および気管支チューブの傷害および炎症につながり得る。

ＤＭ１の個体に影響を及ぼす別の呼吸症状は睡眠時無呼吸であり、これは、呼吸筋脱力によってＤＭ１においてもたらされる、睡眠中の呼吸の異常な休止または異常に小さな呼吸の事象を特徴とする睡眠障害である。無呼吸と呼ばれる呼吸中の各休止は、数秒から数分続く可能性があり、１時間に５から３０回またはそれ以上生じ得る。睡眠時無呼吸（狭い気道および呼吸の中断による空気の流れがない期間）による不十分な空気の流れは、危険なほど低いレベルの酸素および高いレベルの二酸化炭素を血液中にもたらし得る。軽度の場合では、無呼吸は、睡眠の乱れ、過剰な疲労および朝の頭痛を引き起こし得る。重度の場合では、無呼吸は、高血圧、不整脈および心臓発作を引き起こし得る。

６．骨格筋の症状
ＤＭ１の個体は一般に筋強直を経験し、これは、随意収縮または電気刺激後のゆっくりとした筋弛緩を特徴とする。一般に、筋肉を弛緩させるには反復した努力が必要とされ、筋肉が温まった後に状態は改善する。しかし、長引く厳しい運動はその状態を誘発する可能性もある。この障害の個体は、物を握った手を離すのに苦労する可能性があり、または坐っている場所から立ち上がるのが困難であり、硬くぎこちなく歩行する可能性がある。いかなる骨格筋も筋強直を経験する可能性があるが、ＤＭ１は、他のもの以上の頻度で体の特定の筋肉を苦しめる傾向がある。これらは、前腕および指の筋肉ならびに発声または食物の咀嚼を困難にし得る舌および顎の筋肉を含む。さらに急速な動作は、ＤＭ１の筋強直に特有の筋硬直を誘発することもあり得る。

筋肉の脱力および萎縮もＤＭ１を罹患する多くの個体で観察される。ＤＭ１の筋脱力は、ある筋肉に特徴的に影響を及ぼすが、他の筋肉はほとんどまたはまったく脱力を経験しない場合もあり、または正常な力を維持する場合もある。筋脱力は、ＤＭ１の個体における身体障害の主因であり、一般的には、移動性、手の器用さおよび適度に重いものから重いものまでを持ち上げる能力に影響を及ぼす。より重度の場合では、個体は、咽頭および胸部の筋肉（例えば横隔膜筋）の脱力によって引き起こされる呼吸困難または嚥下困難を経験する。

さらに、ＤＭ１は筋肉痛を伴うことが多い。この痛みは、筋肉それ自体に影響を及ぼす可能性があり、または関節、靱帯もしくは脊椎にその原因がある可能性がある。さらに筋脱力は、ＤＭ１の個体をこの部分において関節性挫傷に罹りやすくする。

女性では、妊娠および出産ならびに受精能の低下に関連する中度から重度の合併症に関連する。これらは、早発性閉経、高率の自然流産および流産、筋脱力または筋強直によって引き起こされる子宮機能不全に関係している遷延した分娩および出産、早期分娩を引き起こし得る羊水過多に関係している子宮の過膨張、不適切な子宮収縮（弛緩子宮）または膜の早発自然破裂、ならびに不適切な子宮収縮（弛緩子宮）または胎盤遺残による分娩後の出血を含むことができる。

新生児では、ＤＭ１の症状は、有害な妊娠結果の危険性増大、臍帯脱出または胎盤早期剥離、胎児移動性が大きいことによる胎児の位置異常、早期分娩、胎児の浮腫および胎動の低減に関連する羊水過多（胎児の嚥下の低下による羊水の過剰な蓄積）などの症状を含むことができる。

７．視覚症状
ＤＭ１患者での視力障害は、白内障の発生に関連することが多い。後嚢下の虹色のレンズの混濁は、筋強直性ジストロフィーにおける白内障形成の初期段階を表し、細隙灯顕微鏡検査によってのみ検出可能である。こうした混濁は、通常、いかなる視力症状も発生していない患者において見つかる。このタイプのレンズ混濁の存在およびより成熟した白内障が、この疾患唯一の症候であり得る。視覚の眩しさおよび不鮮明は、レンズ混濁が進行するにつれて星状白内障に発達し、最終的に成熟した白内障に発達し、これは通常の白内障と識別不能である。ＤＭ１における白内障は通常の白内障より速く進行する可能性があり、それにより、ＤＭ１患者は早発性の白内障を呈し得る。

ＤＭ１に関連する付加的な視力症状は、網膜症、両側性の眼瞼下垂（上眼瞼または下眼瞼の下垂または下降）、低眼圧および眼の筋強直を含むことができる。

８．細胞的および分子的症状
ＤＭ１の遺伝的病変は、突然変異型ＤＭＰＫ転写産物を発現する細胞および組織において機能獲得型の特質を獲得し、ＲＮＡ媒介毒性を促進する多数の３’−非翻訳領域ＣＵＧリピートを含むＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物をもたらす。ＤＭ１の疾患過程の現在のモデルは、ｍＲＮＡ前駆体の選択された群に関する選択的スプライシングの異常な制御に最終的につながる、ＣＵＧ^ｅｘｐ ＲＮＡと核結合タンパク質との相互作用に関する。ＤＭ１で同定された最も顕著な分子的異常は、選択的スプライシングの誤制御である。幾つかのヒト遺伝性障害はＲＮＡスプライシングに対する突然変異の影響に起因し得るが、これらのほとんどすべては、単一のｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに影響を及ぼし、非機能性の突然変異型タンパク質をコードする異常にスプライシングを受けた転写産物につながるシス作用性効果である（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９；Ｆａｕｓｔｉｎｏ＆Ｃｏｏｐｅｒ、２００３、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１７：４１９〜４３７）。ＤＭ１は、スプライセオパシー（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ）、すなわち突然変異型タンパク質の産生をもたらさないが、特定の組織に発生的に不適切であるスプライス産物の発現につながる、多くのＲＮＡの選択的スプライシングに対するトランス効果に起因するヒト遺伝性疾患の最初の例である（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９）。

Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ（ＭＢＮＬ）タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、（ＣＵＧ）_１１に優先して（ＣＵＧ）_９０の結合について最初に同定された（Ｍｉｌｌｅｒら、２０００、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９：４４３９〜４４４８）。こうしたタンパク質は、ＤＭ１における核の病巣に大量に動員される（Ｍａｎｋｏｄｉら、２００３、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５４：７６０〜７６８）。３つの哺乳類ＭＢＮＬ遺伝子の内、ＭＢＮＬ１およびＭＢＮＬ２は骨格筋、心臓および脳で発現しており、ＭＢＮＬ３は主に胎盤で発現している（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９）。ＤＭ１で発現するＣＵＧ^ｅｘｐのレベルは、ＭＢＮＬ１の細胞分布を著しく変化させるのに十分である。脳、骨格筋および心臓では、ＭＢＮＬ１は、核質の他の個所で著しく枯渇するほどまでに、リボ核病巣に動員される（Ｊｉａｎｇら、２００４、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３０７９〜３０８８；Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９）。マウスにおけるＭＢＮＬ１遺伝子の破壊は、ＤＭ１と類似している筋緊張性ミオパシーだけでなく、ＤＭ１様白内障および心臓疾患も再現する（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９）。理論に拘束されるものではないが、これらの発見は、リピート伸張ＲＮＡでのＭＢＮＬ１タンパク質の隔離は、ＤＭ１に関連する表現型および症状において重要な役割を果たすことを示唆する。

ＤＭ１において役割を果たすと思われる別のタンパク質はＣＵＧ−ＢＰ１であり、これも筋肉における選択的スプライシングについてＤＭ１様作用を誘導することができ（Ｐｈｉｌｉｐｓら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：７３７〜７４１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの（ＣＵＧ）_８オリゴヌクレオチドへの結合に関して最初に同定された（Ｔｉｍｃｈｅｎｋｏら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４：４４０７〜４４１４）。クロリドチャネルＣｌＣ−１ ｍＲＮＡの異常スプライシングも注目すべきであり、これは、筋強直を直接的に引き起こすことが示された（Ｍａｎｋｏｄｉら、２００２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１０：３５〜４４）。ＤＭ１の個体の骨格筋において選択的スプライシングを誤制御することが示された他のタンパク質としては、これらに限定されないが、ＡＬＰ、ＣＡＰＮ３、ＣＬＣＮ１、ＦＨＯＳ、ＧＦＡＴ１、ＩＲ、ＭＴＭＲ１、ＮＲＡＰ、ＲＹＲ１、ＳＥＲＣＡ１、ｚ−Ｔｉｔｉｎ、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＴＮＮＴ３またはＺＡＳＰ遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＭ１の個体の心筋において選択的スプライシングを誤制御することが示されたタンパク質としては、これらに限定されないが、ＴＮＮＴ２、ＺＡＳＰ、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＫＣＮＡＢ１またはＡＬＰ遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＭ１の個体の神経組織において選択的スプライシングを誤制御することが示されたタンパク質としては、これらに限定されないが、ＴＡＵ、ＡＰＰまたはＮＭＤＡＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１５；１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ２：Ｒ１６２〜９）。

Ｂ．筋強直性ジストロフィーＩ型の治療方法
本明細書中で提供されるのは、それを必要とする個体において筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療するための方法であって：筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ＲＮＡ転写産物の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも３つのポリＣＵＧリピート配列に対して相補的な配列を含むカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書に開示されるカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかなど）の治療有効量を個体に全身投与することを含み、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、少なくとも２つの筋肉においてＤＭ１の少なくとも１つの症状を軽減する、方法である。一実施形態では、筋肉は、骨格筋、平滑筋および／または心筋であり得る。別の実施形態では、筋肉は、骨格筋であり、限定はされないが、前脛骨筋、四頭筋および／または腓腹筋を含み得る。幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、静脈内、腹腔内または皮下に行うことができる。他の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごとのいずれかで個体に投与することができる。幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間もしくはそれ以上の年または生涯（これらの値の間にある期間を中に入れ、含める）まで、個体に投与することができる。さらに他の実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇもしくは１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上（これらの値の間にある濃度を中に入れ、含める）のいずれかの濃度で個体に投与される。一実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は筋強直である。一実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、筋核内のリボ核病巣におけるｍｕｓｃｌｅｂｉｎｄ−ｌｉｋｅ−１（ＭＢＮＬ−１）タンパク質の凝集である。別の実施形態では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、筋細胞における少なくとも１種のＲＮＡ転写産物の異常なスプライシングである。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は以下からなる群から選択される：Ｓｅｒｃａ−１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣＩＣ−１。一実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬として許容される賦形剤または担体、例えば本明細書に記載の医薬として許容される賦形剤または担体のいずれかと共に投与される。別の実施形態では、個体はヒトである。

本明細書に開示される方法のいずれかの幾つかの態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、１つまたはそれ以上の骨格筋に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：筋強直、筋脱力、筋萎縮および筋肉痛。

本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、心血管系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：心臓性失神および失神性めまい、心伝導異常、不整脈、低血圧ならびにうっ血性心不全。

本明細書に開示される方法のいずれかの幾つかの態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、呼吸器系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：呼吸筋脱力、誤嚥および睡眠時無呼吸。

本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、胃腸系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：咀嚼および嚥下困難、胃食道逆流、腹部または胸部の痛み（消化不良）、悪心、嘔吐、腹部膨満、腸偽閉塞、胆汁うっ滞、便秘、下痢、腸吸収不良、糞塊埋伏、巨大結腸、腸穿孔、排便障害および大便失禁。

本明細書に開示される方法のいずれかの幾つかの態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、神経系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：認知機能障害、日中の過剰な眠気（睡眠過剰）、行動的困難、情動的困難、社会化的困難および末梢神経障害。

本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、生殖器系および／または内分泌系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：精巣萎縮、女性不妊症、二次性徴の不十分な発達、エネルギー低下、性欲低下、陰毛の減少または非存在、筋肉量低下、骨塩量低下、低血清テストステロン、血清黄体形成ホルモンの上昇、血清卵胞刺激ホルモンの上昇、男性の女性化乳房、早発閉経、インスリン抵抗性、早発男性型脱毛症および男性におけるテストステロンに対するエストラジオール比レベルの上昇。

本明細書に開示される方法のいずれかの幾つかの態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、妊娠に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：自然流産、死産、遷延した分娩および出産、子宮の過膨張、早期分娩、脱分極性薬剤投与後の筋緊張性痙攣、バルビツレート投与後の呼吸抑制および分娩後の出血。

本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、新生児の合併症である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：羊水過多、臍帯脱出、胎盤早期剥離、胎児位置異常、胎児水腫および胎児の運動不能。

本明細書に開示される方法のいずれかの幾つかの態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、免疫系に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：低ガンマグロブリン血症および頻度が増大した石灰化上皮腫。

本明細書に開示される方法のいずれかの別の態様では、前記ＤＭ１の少なくとも１つの症状は、眼または視覚に影響を及ぼす症状である。一実施形態では、症状は以下からなる群から選択される：霧視、網膜症、両側性の眼瞼下垂（下垂）、低眼圧および眼の筋強直。

Ｃ．カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、注射の形で投与される。注射は、水性の注射可能な賦形剤または担体と組み合わせて、化合物を含むことができる。適切な水性の注射可能な賦形剤または担体の非限定例は、当業者に周知であり、それらおよび製剤を配合する方法は、Ａｌｆｏｎｓｏ ＡＲ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．、１９８５のような標準的な参考文献に見出すことができる。適切な水性の注射可能な賦形剤または担体としては、溶解増強剤、例えば１０％マンニトールまたは他の糖、１０％グリシンまたは他のアミノ酸を場合により含む、水、生理食塩水溶液、デキストロース水溶液などが挙げられる。組成物は、皮下、腹腔内または静脈内に注射することができる。

幾つかの実施形態では、静脈内投与が使用され、これは、数分から１時間またはそれ以上、例えば約１５分にわたる連続的静脈内注入でもよい。投与される量は、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのタイプ、単位投与量のサイズ、賦形剤または担体の種類、および当業者に周知の他の因子に応じて、広く変動し得る。カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約０．００１％から約１０％（ｗ／ｗ）、約０．０１％から約１％、約０．１％から約０．８％またはその中の任意の範囲を占めることができ、残りは賦形剤（複数可）または担体（複数可）を含む。

経口投与については、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、医薬として許容される賦形剤または担体、例えば結合剤；フィラー；潤滑剤；崩壊剤；または湿潤剤を用いて、従来の手段によって製造される、錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができ、またはこれは、使用前に水または他の適切なビヒクルと構成するための乾燥生成物として提供することができる。そのような液体製剤は、医薬として許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えばアチオンドオイル（ａｔｉｏｎｄ ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコールまたは分留した植物油）；および防腐剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて、従来の手法によって製造され得る。これらの製剤は、必要に応じて緩衝塩、着香料および着色剤を含むこともできる。

幾つかの実施形態では、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはそれらの組合せを含み得る、エアゾールスプレーまたはネブライザーを介して、吸入によって投与することができる。一非限定例では、加圧エアゾールの投与単位は、定量バルブを介して送達することができる。別の実施形態では、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを吸入器で使用することができ、例えばデンプンまたはラクトースなどの適切な粉末基剤との化合物の粉末化混合物を含むように配合することができる。

〔実施例１〕
２つの異なるＰＰＭＯコンジュゲートの前脛骨筋への筋肉内注射は、異常なＲＮＡスプライシングを補正する
ＣＵＧトリヌクレオチド配列の大きな伸張によって、ＲＮＡ代謝における有害な変化につながる、有毒なＲＮＡの機能獲得がもたらされる。そのようなＣＵＧリピートエレメントは、通常はプロテインキナーゼＤＭＰＫの３’非翻訳領域にあるが、伸張した場合は、そのエレメントは、遺伝性神経筋疾患である筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）の遺伝的病変である。ＣＵＧ伸張を含む病原性ＤＭＰＫ転写産物はＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ−ｌｉｋｅ１（ＭＢＮＬ１）などのＲＮＡ結合タンパク質との複合体の一部としてリボ核病巣に保持され、これによって、多数のＲＮＡ転写産物の異常スプライシングおよび筋強直を含めた生理的異常がもたらされる。

本実施例では、縮合合成反応を行って、２５塩基長ＣＡＧ配列ベースのモルホリノ（Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：３３６〜３３９）、ＣＡＧ２５およびモルホリノの５’末端に位置するスペーサー部分に共有結合的に付加された細胞透過性ペプチドを含む、ＰＰＭＯコンジュゲートを生成した（図１ａ）。さらに、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋの生理活性へのスペーサーおよびペプチド修飾の影響を判定するために、ＨＳＡ^ＬＲトランスジェニックマウスの前脛骨（ＴＡ）筋への一連のＩＭ注射を行い、Ｓｅｒｃａ−１のＲＮＡスプライシングを評価した。

材料および方法
モルホリノオリゴヌクレオチドへの細胞透過性ペプチドのコンジュゲーション
ＰＰＭＯコンジュゲートを、この後記載するように改変してＡｂｅｓらによって記載されているように合成した（２００６、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １１６：３０４〜３１３）。ペプチドＢ（Ａｃ（ＲＸＲＲＢＲ）_２ＸＢ−ＣＯＯＨ）またはペプチドＫ（Ａｃ（ＲＸＲ）_４ＸＢ−ＣＯＯＨ）（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＣＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含むジメチルホルムアミド中で、ペプチドのモルあたり１：２のモル比で室温（ＲＴ）において活性化した。５’第一級アミン修飾を有するモルホリノＣＡＧ２５（５’−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’）（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）をジメチルスルホキシドに溶解し、活性化したペプチドＢまたはペプチドＫにペプチド：ＡＳＯの１：２〜１．５モル過剰で加え、反応を２時間室温で進めた。反応を水でクエンチし；ＰＰＭＯコンジュゲートをカルボキシメチルセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって精製し、２Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２０％アセトニトリル中に溶出した。溶出物を、分子量カットオフが３，０００Ｄａである透析カセット中で、０．１ｍＭ ＮａＨＣＯ_３の何回かの緩衝液交換に対して透析した。透析したＰＰＭＯを、０．１Ｎ ＨＣｌ中において２６５ｎｍで分光光度的吸光度によって定量化し、凍結し、凍結乾燥した。

ＨＳＡ^ＬＲ再誘導およびジェノタイピング
再誘導化ヘミ接合性ＨＳＡ^ＬＲマウスを、ホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲライン２０ｂオスから採取した精子でＦＶＢ／ｎ野生型メスマウスを受精させることによって作製した。オスおよびメスのヘミ接合性マウスを交配して、ホモ接合性の子孫を生成した。定量的マルチプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、マウスの接合状態を決定し；このアッセイは、ヒト骨格アクチン（ＡＣＴＡ１）および内部コントロールとしてのＧａｐｄｈを同じウェルで検出した。以下のプライマー−プローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、ＡＣＴＡ１ゲノムＤＮＡを検出した：フォワード：５’−ＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣ、リバース：５’−ＣＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣ、プローブ：５’−ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴ。専用配列プライマー−プローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、ＧａｐｄｈゲノムＤＮＡを検出した。続いてホモ接合性マウスを、野生型ＦＶＢ／ｎと戻し交配して、ホモ接合状態を確認した。次いで、確認したオスおよびメスのホモ接合性マウスを交配して、ＦＶＢ／ｎバックグラウンド系統においてホモ接合コロニーを維持した。

ＨＳＡ^ＬＲ導入遺伝子ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して、ＴＡ、腓腹筋および四頭筋から全ＲＮＡを精製した。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、ＨＳＡ^ＬＲ導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定し；１８Ｓ ＲＮＡレベルを標準化因子として使用した。１８Ｓ ＲＮＡレベルは、専用配列のプライマー−プローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して測定した。ＡＣＴＡ１ゲノムＤＮＡを検出するのに使用したのと同じプライマー−プローブセットを用いて、ＡＣＴＡ１ ｍＲＮＡを検出した。

筋肉内ＴＡ注射
Ｇｅｎｚｙｍｅ動物実験委員会によってすべての動物研究が承認された。Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３９５２〜３９５７に記載のように、イソフルラン麻酔したマウスのＴＡを注射し、エレクトロポレーションにかけた。一方のＴＡに２０μｇ（１μｇ／μＬ）のＣＡＧ２５、ＧＡＣ２５（５’−ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡ−３’）（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋ注射中、ペプチドの質量を考慮して２０μｇＡＳＯ等価質量を注射した）を注射し、反対側のＴＡに２０μＬのリン酸緩衝食塩水（生理食塩水）を注射した。

結果
ペプチドＢまたはペプチドＫのいずれかを含む２つのＰＰＭＯコンジュゲートを合成し、それぞれＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋと称することにした。

ＴＡへのＣＡＧ２５のＩＭ注射はＳｅｒｃａ−１のスプライシングを補正したが、生理食塩水の注射を受けた反対側のＴＡは、Ｓｅｒｃａ−１のスプライシングの異常なパターンを保持した（図１ｂ）。ＧＡＣ配列のコントロールモルホリノであるＧＡＣ２５は、予測したように、Ｓｅｒｃａ−１のスプライシングを補正しなかった。

重要なことに、これらの結果はＰＰＭＯ−ＢとＰＰＭＯ−Ｋの両方のＩＭ注射がＳｅｒｃａ−１のスプライシングを補正したことを示し、これは、ペプチドおよびモルホリノの５’末端におけるスペーサー共有結合修飾は、その標的と相互作用するおよびＣＵＧ ＲＮＡの有毒作用を中和するＣＡＧ２５の能力を損なわないことを示す（図１ｂ）。

〔実施例２〕
ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋの反復ＩＶ注射はｉｎ ｖｉｖｏにおいてスプライセオパシーを効率的に改善する
ペプチドＢまたはＫを用いたＣＡＧ２５の修飾がその生理活性を妨げなかったことを確認したので、本実施例は、ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて、ＩＶ投薬レジメンを使用して、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋが有毒なＲＮＡの作用をモジュレートすることができるかどうかを評価した。

材料および方法
ＨＳＡ^ＬＲにおける全身的送達研究
ＣＡＧ２５、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋを生理食塩水に溶解し、オスおよびメスのＨＳＡ^ＬＲホモ接合性マウスに、３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈ＩＶ注射によって６週にわたって１週１回投与した。最終投与から２４時間後に、後眼窩の出血によって採血した。最終的な投与から約１週間後に、筋電図検査方法に記載されているように、筋強直の存在についてマウスを評価した。次いで、マウスを殺し；筋切片をＲＮＡ解析用に液体Ｎ_２中に凍結するか、または免疫蛍光およびＦＩＳＨ解析用にＯＣＴ媒体に包埋し、冷却イソペンタン中に凍結した。

選択的スプライシングのＲＴ−ＰＣＲ解析
ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅に使用した遺伝子特異的プライマーを使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｓｅｒｃａ−１、ＺＡＳＰ、ｍ−ＴｉｔｉｎおよびＣｌＣ−１に対するプライマー配列は、以前に記載されている（Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３９５２〜３９５７；Ｌｉｎら、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７〜２０９７）。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で染色し、ＦｕｊｉｆｉｌｍのＬＡＳ−３０００インテリジェントダークボックスを使用して画像化した。

結果
３０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＡＧ２５、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋの、週１回で６回のＩＶ注射をＨＳＡ^ＬＲマウスに与えた。ＨＳＡ^ＬＲマウスはこの用量に十分耐容性
を示し、ＣＡＧ２５およびＰＰＭＯの投与の間または研究期間全体を通して、明白な毒性症候を示さなかった。さらに、これらの処理は肝臓トランスアミナーゼ（ＡＬＴ、ＡＳＴ）または腎臓機能マーカー（クレアチニン、ＢＵＮ）に影響を及ぼさなかった（データ非表示）。

ＴＡ、四頭筋および腓腹筋を含めた幾つかの筋肉群についてスプライシング解析を行った。図２で示すように、ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋの両方は、Ｓｅｒｃａ−１のスプライシングを劇的に補正し、スプライシングパターンを野生型マウスで観察されるものに修復した。Ｓｅｒｃａ−１のスプライシング補正は、ＴＡ、四頭筋および腓腹筋を含めた検討したすべての筋肉で生じた。ＰＰＭＯ−Ｂで処理した１匹のマウスは、四頭筋および腓腹筋において部分的なスプライシング補正を示した。ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋと対照的に、未修飾のＣＡＧ２５の静脈内注射は、検討したいかなる筋肉群においても、Ｓｅｒｃａ−１のスプライシングを改善しなかった（図２）。これは、筋肉へのそのままのモルホリノの低質な体内分布を示す他の研究（Ｓａｚａｎｉら、２００２、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１２２８〜１２３３）と矛盾がない。

適切なスプライシングに関してＭＢＮＬ１に依存しているさらなる転写産物としては、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣｌＣ−１．８，２４が挙げられる。図３で示すように、ＰＰＭＯ−Ｋの全身的送達は、ＴＡ、四頭筋および腓腹筋におけるｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣｌＣ−１のＲＮＡスプライシングの確固たる補正につながった。ＰＰＭＯ−ＢのＩＶ注射で処理したＨＳＡＬＲマウスも同様に、こうした転写産物の選択的スプライシングの補正を示した（データ非表示）。

これらの結果は、全身的に送達されるＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−Ｋは、骨格筋を透過し、筋肉の筋核に入り、ポリ（ＣＵＧ）ＲＮＡとハイブリダイズし、正しいＭＢＮＬ１制御性ＲＮＡスプライシングを修復するのに十分である量の隔離されたＭＢＮＬ１タンパク質を遊離することができることを示唆する。

〔実施例３〕
ＰＰＭＯ−Ｋは、骨格筋のＣＵＧ核封入複合体を破壊し、その結果、ＭＢＮＬ１タンパク質を再分布させる
ＰＰＭＯ−Ｋで処理したマウスのリボ核病巣の最終結果を確かめるために、本実施例は、筋肉内のＣＵＧリボ核封入を検出するための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す。

材料および方法
以下の改変をして記載の（Ｌｉｎら、２００６、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７〜２０９７）ように、６μｍ厚の凍結した四頭筋の切片を処理して、免疫蛍光によってＭＢＮＬ１タンパク質の局在を検出した：ポリクローナル抗体Ａ２７６４を１：５０００の濃度で使用し、続いて、１：５００の濃度で、Ａｌｅｘ−５６８標識ヤギ−抗ウサギポリクローナル二次抗体と共にインキュベーションした。サンプルを、ＤＡＰＩおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５６８を順次イメージングするために構成されたＬＳＭ５１０ＭＥＴＡレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像化した。１００×／ＮＡ１．４５Ｐｌａｎ−Ｆｌｕａｒ油浸対物レンズを４倍ズームで使用して試験した。

結果
ＰＰＭＯ−Ｋ処理したＨＳＡ^ＬＲマウスでは、ＣＵＧ病巣の数および強度の低減が観察された（図４）。しかし、ＰＰＭＯ−ＫおよびＦＩＳＨ法に利用したプローブのオリゴヌクレオチド配列が同じ（ＣＡＧ）ｎ配列からなるので、ＲＮＡ病巣への影響がＰＰＭＯ−Ｋによる病巣の破壊によるのか、またはＰＰＭＯ−ＫとＦＩＳＨプローブの間の結合競合によるのかを判定するのは不可能であった。より直接的な、病巣へのＰＰＭＯ−Ｋの影響を突き止める明解な手段として、ＭＢＮＬ１の免疫蛍光標識を行い、ＭＢＮＬ１はＣＵＧ ＲＮＡ病巣に隔離されており、ＨＳＡ^ＬＲマウスの核中に点状の染色を示した（図５ａ〜ｃ）。図５ｄ〜ｆで示すように、ＰＰＭＯ−Ｋは、ＭＢＮＬ１タンパク質を再分布させ、野生型マウスで観察されるような、核質内におけるより拡散した局在をもたらした（図５ｇ〜ｉ）。

まとめると、本実施例の免疫染色およびＦＩＳＨのデータは、ＰＰＭＯ−Ｋは競合的様式でＣＵＧ ＲＮＡと相互作用し、それによって、筋核内のＭＢＮＬ１タンパク質の再分布がもたらされる。骨格筋病巣のＭＢＮＬ１の遊離は、ＰＰＭＯ−Ｋ処理マウスにおいて観察されたＲＮＡスプライシングの補正と矛盾がない。

〔実施例４〕
ＰＰＭＯ−ＫのＩＶ注射を与えたＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて筋強直が補正される
ＰＰＭＯ−ＢおよびＰＰＭＯ−ＫによるＣｌＣ−１ ＲＮＡのスプライシングの補正は、クロリドチャネル機能の修復が、一般的にＨＳＡ^ＬＲマウスで観察される筋強直の重症度を変化させ得ることを示唆する。この可能性を試験するために、本実施例において、生理食塩水処理したおよびＰＰＭＯ−Ｋ処理したＨＳＡ^ＬＲマウスでの筋強直を、ＥＭＧによって評価した。

材料および方法
２つの２９ゲージ針電極を使用して、ＴＡ、腓腹筋および四頭筋の中に取り入れられたＥＭＧサンプリングを用いて、イソフルラン麻酔したマウスについてＥＭＧを行った。両方の針を挿入した後、針侵入部位において鉗子を用いて優しく筋肉を操作した。筋強直を以下の判断基準によって類別した：０はミオトニックディスチャージが検出されなかったことを示す；１は筋操作の５０％未満がミオトニックディスチャージをもたらしたことを示す；２は筋操作の５０％から８０％がミオトニックディスチャージをもたらしたことを示す；３は筋操作の９０％から１００％がミオトニックディスチャージをもたらしたことを示す。

結果
筋強直を、野生型ＦＶＢ／ｎ、ヘミ接合性およびホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲマウスで最初に評価した。ヘミ接合性マウスは、ホモ接合性マウスと対比して、骨格筋において約５０％レベルのＨＳＡ^ＬＲ ｍＲＮＡを含む（図６ａ）。予想通り、ホモ接合性マウスと比較して、ヘミ接合性マウスでの筋強直の発生の低減が観察され、野生型マウスでは非筋強直が観察されなかった（図６ｃ）。ホモ接合性ＨＳＡ^ＬＲマウスで検出された典型的なミオトニックディスチャージのトレーシングを図６ｂに示す。図６ｂに示すように、ＨＳＡ^ＬＲＰＰＭＯ−Ｋで処理したマウスで筋強直は検出されず、これらのマウスで生じたＣｌＣ−１の選択的スプライシングにおける補正（図３）と矛盾がない。

結論
本明細書で行われた実験は、ＣＡＧ配列モルホリノへの細胞透過性ペプチドの付加は、骨格筋へのＰＰＭＯの十分な全身的取り込みを可能にし、伸長したＣＵＧリピートの有毒作用を中和することを示す。スプライシング異常の完全に近い解決、ＲＮＡ病巣からのＭＢＮＬ１の遊離および筋強直の消失が観察された。

モルホリノオリゴヌクレオチドの全身的送達がＤＭ１様病状をｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートするという発見は、多面的な重要性がある：第一に、ＣＡＧベースのモルホリノの５’共有結合的修飾は、標的ＣＵＧ ＲＮＡとの相互作用を損なわない；第二に、アルギニンリッチの細胞透過性ペプチドによって達成可能になる体内分布はＤＭ１の病状の生化学的および生理的な態様を補正するのに十分である；第三に、ＤＭ１のＨＳＡ^ＬＲモデルにおいて、ここに提示される研究で投与される試験薬は、ヒトＤＭ１患者での安全な使用について評価され得るのと同じ治療的候補である。

実施例は、本発明の単なる例示であることが意図され、したがって、多少なりとも本発明を限定すると考えられるべきでなく、また、上記の本発明の態様および実施形態を説明し詳述するものである。前述の実施例および詳細な説明は、例示のために与えられ、限定のために与えられるものではない。本明細書で引用するすべての刊行物、特許出願および特許は、それぞれ個々の刊行物、特許出願または特許が、参照によって組み入れられるように具体的かつ個々に示されるかのように、参照によって本明細書に組み入れる。特に、本明細書で引用されるすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物および方法論を説明および開示する目的で、参照によって本明細書に明確に組み入れる。理解を明瞭にする目的で例示および例として前述の発明をある程度詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更および改変を行い得ることが、本発明の教示に照らせば当業者に容易に分かるであろう。

Claims (21)

1. それを必要とする個体において筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療または予防するための医薬組成物であって：（ａ）筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ＲＮＡ転写産物標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも３つのポリＣＵＧリピート配列に相補的なモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド配列；（ｂ）モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとカチオン性ペプチドをつなぐスペーサー部分であって、
   を含むスペーサー部分；および（ｃ）８〜３０個のアミノ酸残基の長さであるカチオン性ペプチドを含むカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を含み、カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、少なくとも２つのタイプの筋肉においてＤＭ１の少なくとも１つの症状を軽減する、前記医薬組成物。
2. カチオン性ペプチドは、ＲＸＲ、ＲＸ、ＲＢおよびＲＢＲからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサブ配列を含み、ここで、Ｒはアルギニンであり、Ｂはβ−アラニンであり、各Ｘは独立に−ＮＨ−（ＣＨＲ¹）_n−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎは４〜６であり、各Ｒ¹は独立にＨまたはメチルであり、ただし最大で２つのＲ¹がメチルである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. カチオン性ペプチドはアミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲＲＢＲ）₂ＸＢ−を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
4. カチオン性ペプチドはアミノ酸配列Ａｃ（ＲＸＲ）₄ＸＢ−を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
5. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列５’−（ＡＧＣ）_n−３’、５’−（ＧＣＡ）_n−３’または５’−（ＣＡＧ）_n−３’を含み、ここでｎは約５〜２５のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に１つから２つの付加的なモルホリノヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
8. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは５’アミン修飾をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
9. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロジアミデートカチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. カチオン性ペプチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合したスペーサー部分によって、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドから分離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 筋肉は骨格筋、平滑筋および／または心筋である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前脛骨筋、四頭筋および／または腓腹筋の細胞を透過する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. ＤＭ１の前記少なくとも１つの症状は筋強直である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. ＤＭ１の前記少なくとも１つの症状は、筋核内のリボ核病巣におけるｍｕｓｃｌｅｂｉｎｄ−ｌｉｋｅ−１（ＭＢＮＬ−１）タンパク質の凝集である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. ＤＭ１の前記少なくとも１つの症状は、筋細胞における少なくとも１種のＲＮＡ転写産物の異常なスプライシングである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 前記少なくとも１種のＲＮＡ転写産物は：Ｓｅｒｃａ−１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、ＺａｓｐおよびＣＩＣ−１からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、静脈内、腹腔内または皮下に行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個体に週１回投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１週間にわたって個体に投与される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. カチオン性ペプチド結合モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬として許容される賦形剤と共に投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
21. 個体はヒトである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。