RU2662962C2 - Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии - Google Patents
Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662962C2 RU2662962C2 RU2015115721A RU2015115721A RU2662962C2 RU 2662962 C2 RU2662962 C2 RU 2662962C2 RU 2015115721 A RU2015115721 A RU 2015115721A RU 2015115721 A RU2015115721 A RU 2015115721A RU 2662962 C2 RU2662962 C2 RU 2662962C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cationic peptide
- antisense oligonucleotide
- morpholine
- muscle
- morpholine antisense
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 108
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 title abstract description 36
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 title description 20
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 title description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 7
- 201000009340 myotonic dystrophy type 1 Diseases 0.000 claims abstract description 110
- 102100022437 Myotonin-protein kinase Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 85
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 85
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 108010052185 Myotonin-Protein Kinase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102000018658 Myotonin-Protein Kinase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 208000037140 Steinert myotonic dystrophy Diseases 0.000 claims abstract description 4
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 178
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 206010061533 Myotonia Diseases 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- 101100107064 Drosophila melanogaster Zasp52 gene Proteins 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 5
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 4
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 4
- 101150052500 cic-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 10
- 101710128223 Chloride channel protein Proteins 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 9
- 230000003274 myotonic effect Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 8
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 8
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 8
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 description 8
- -1 m-Titin Proteins 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 6
- 101001023021 Homo sapiens LIM domain-binding protein 3 Proteins 0.000 description 6
- 102100035112 LIM domain-binding protein 3 Human genes 0.000 description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 6
- 208000007590 Disorders of Excessive Somnolence Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 4
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000011128 cardiac conduction Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 206010042772 syncope Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 3
- 102100033676 CUGBP Elav-like family member 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710170322 CUGBP Elav-like family member 1 Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 3
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 3
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 3
- 101000710837 Homo sapiens CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 208000035955 Proximal myotonic myopathy Diseases 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 208000008784 apnea Diseases 0.000 description 3
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010020765 hypersomnia Diseases 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 3
- 201000008709 myotonic dystrophy type 2 Diseases 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 201000007532 polyhydramnios Diseases 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 3
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 3
- 201000002859 sleep apnea Diseases 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710189683 Alkaline protease 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710154562 Alkaline proteinase Proteins 0.000 description 2
- 101710170876 Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 2
- 208000004130 Blepharoptosis Diseases 0.000 description 2
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 2
- 102100033849 CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 2
- 102000011045 Chloride Channels Human genes 0.000 description 2
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034347 Faecal incontinence Diseases 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- 206010052105 Gastrointestinal hypomotility Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000583839 Homo sapiens Muscleblind-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 2
- 206010021118 Hypotonia Diseases 0.000 description 2
- 201000005081 Intestinal Pseudo-Obstruction Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 2
- 208000007950 Ocular Hypotension Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000018525 Postpartum Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 206010036872 Prolonged labour Diseases 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010038669 Respiratory arrest Diseases 0.000 description 2
- 206010070833 Respiratory muscle weakness Diseases 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 206010043298 Testicular atrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010046763 Uterine atony Diseases 0.000 description 2
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 206010047513 Vision blurred Diseases 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010788 atrophy of testis Diseases 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 208000024330 bloating Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000035252 development of secondary sexual characteristics Effects 0.000 description 2
- 210000000188 diaphragm Anatomy 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 201000004673 mature cataract Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 2
- 230000036640 muscle relaxation Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 231100001044 testicular atrophy Toxicity 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- MHCMWGPPLOSCJY-UHFFFAOYSA-N 4-$l^{1}-azanylmorpholine Chemical compound [N]N1CCOCC1 MHCMWGPPLOSCJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 206010001541 Akinesia Diseases 0.000 description 1
- 239000012109 Alexa Fluor 568 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 206010006242 Breast enlargement Diseases 0.000 description 1
- 102100032539 Calpain-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000018424 Chloride channel ClC-1 Human genes 0.000 description 1
- 108050007520 Chloride channel ClC-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023457 Chloride channel protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010008635 Cholestasis Diseases 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Chemical group 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100040130 FH1/FH2 domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710120374 FH1/FH2 domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100033429 Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710165608 Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 101000867715 Homo sapiens Calpain-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000906651 Homo sapiens Chloride channel protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000583841 Homo sapiens Muscleblind-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000957333 Homo sapiens Muscleblind-like protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000969334 Homo sapiens Myotubularin-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000577307 Homo sapiens Nebulin-related-anchoring protein Proteins 0.000 description 1
- 101000764260 Homo sapiens Troponin T, cardiac muscle Proteins 0.000 description 1
- 101000764274 Homo sapiens Troponin T, fast skeletal muscle Proteins 0.000 description 1
- 101000997314 Homo sapiens Voltage-gated potassium channel subunit beta-1 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150074431 Mbnl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091060294 Messenger RNP Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101000884283 Mus musculus Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 102100030965 Muscleblind-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030964 Muscleblind-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038751 Muscleblind-like protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000012905 Myotonic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021416 Myotubularin-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010054235 NMDA receptor A1 Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 description 1
- 206010036653 Presyncope Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000012287 Prolapse Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000004913 RYR1 Human genes 0.000 description 1
- 108060007240 RYR1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005539 Respiratory Aspiration Diseases 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150030482 SMD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710109122 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027697 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 description 1
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710121739 Small core protein Proteins 0.000 description 1
- 208000034713 Spontaneous Rupture Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010049418 Sudden Cardiac Death Diseases 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102100026893 Troponin T, cardiac muscle Human genes 0.000 description 1
- 102100026896 Troponin T, fast skeletal muscle Human genes 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 102100034081 Voltage-gated potassium channel subunit beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940081735 acetylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 208000025261 autosomal dominant disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021018 autosomal dominant inheritance Diseases 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 230000007870 cholestasis Effects 0.000 description 1
- 231100000359 cholestasis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Chemical group 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid Chemical group NP(N)(O)=O ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 239000012055 enteric layer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012054 flavored emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000020375 flavoured syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 230000007160 gastrointestinal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000004313 glare Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000079 gynecomastia Diseases 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000876 intercostal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000000111 lower esophageal sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 208000004840 megacolon Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000021400 peanut butter Nutrition 0.000 description 1
- 210000003903 pelvic floor Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003018 phosphorus compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 208000001095 pilomatrixoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 208000026440 premature labor Diseases 0.000 description 1
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- LZFIOSVZIQOVFW-UHFFFAOYSA-N propyl 2-hydroxybenzoate Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=CC=C1O LZFIOSVZIQOVFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000007665 sagging Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000004208 shellac Substances 0.000 description 1
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 description 1
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 description 1
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020685 sleep-wake disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007779 soft material Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000012058 sterile packaged powder Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 206010047302 ventricular tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3233—Morpholino-type ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума. Систематически вводят индивидууму терапевтически эффективное количество связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, содержащего: (a) последовательность морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, комплементарную по меньшей мере 3 последовательностям повтора поли-CUG в 3’-нетранслируемой области (UTR) протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK) целевого РНК транскрипта; и (b) спейсерную группу, связывающую морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид и катионный пептид, причем спейсерная группа содержит.Изобретение позволяет облегчать по меньшей мере один симптом DM1 в по меньшей мере двух мышцах. 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное открытие относится к связанным с катионным пептидом морфолиновым (PPMO) антисмысловым олигонуклеотидам, которые направлены на участок повтора поли-CUG в 3'-нетранслируемой области гена, кодирующего протеинкиназу миотонической дистрофии (DMPK), и систематическому введению их для лечения миотонической дистрофии типа I (DM1).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Миотоническая дистрофия типа 1 (DM1) представляет собой аутосомное доминантное наследственное нарушение, которое проявляется первоначально в виде нервно-мышечного заболевания, но может также приводить к сердечной, эндокринной, желудочно-кишечной дисфункции и дисфункции центральной нервной системы. Отличительным симптомом DM1 является миотония, нарушение миорелаксации после сокращения, и его детектируют электромиографией (EMG) в виде длинных периодов повторяющихся потенциалов действия в мышце. Генетическое повреждение DM1 состоит из неустойчивого тринуклеотидного повторного элемента CUG в 3'-нетранслируемой области гена, кодирующего протеинкиназу, называемую протеинкиназа миотонической дистрофии (DMPK). Малое количество копий повтора CUG обнаружено у непораженных индивидуумов, тогда как большие количества неустойчивых повторов CUG, варьирующиеся от 50 копий до нескольких тысяч копий, детектированы у пациентов с DM1. В генетических исследованиях было установлено, что количество повторов CUG напрямую коррелирует с возрастом в начале и тяжестью заболевания (Day & Ranum, 2005, Neuromuscul Disord 15:5-16).
РНК транскрипты, такие как DMPK, которые содержат большое количество повторов CUG, приобретают свойства получения функции и стимулируют РНК-опосредованную токсичность в клетках и тканях, экспрессирующих мутантный транскрипт DMPK (Wheeler & Thornton, 2007, Curr Opin Neurol 20:572-576). Патогенный транскрипт сохраняется в ядре (Taneja et al., 1995, J Cell Biol 128:995-1002), где он улавливает связывающие РНК белки, такие как MBNL1 (Mankodi et al., 2001, Hum Mol Genet 10:2165-2170; Mankodi et al., 2003, Ann Neurol 54:760-768). Поли-(CUG) РНК также увеличивает уровни устойчивого состояния CUG-BP1 (Timchenko NA et al., 2001, J Biol Chem, 276:7820-7826; Kuyumcu-Martinez et al., 2007, Mol Cell 28:68-78). Как секвестрация MBNL1, так и возрастание CUG-BP1 активности ассоциировано с неправильным сплайсингом большого количества РНК транскриптов. Следует отметить нарушенный сплайсинг РНК мРНК хлоридного канала ClC-1 (Mankodi et al., 2002, Mol Cell 10:35-44), который, как было продемонстрировано, непосредственно приводит к миотонии (Wheeler et al., 2007, J Clin Invest 117:3952-3957). В добавление к неправильному сплайсингу РНК последствие экспрессии мутантной DMPK включает в себя ремоделирование транскриптома скелетной мышцы (Osborne et al., 2009, Hum Mol Genet 18:1471-1481). Предполагается, что белковые продукты с измененными первичными последовательностями, полученными в результате неправильного сплайсинга РНК и дерегулированных уровней мРНК, содержащих измененный транскриптом, будут иметь ассоциации и даже причинно-следственные связи со специфическими аспектами DM1 заболевания.
В настоящее время нет терапевтических агентов в клиническом лечении для DM1, которые направлены на токсичную РНК, первичный патогенный драйвер заболевания. Стандартные лечения DM1 в основном являются поддерживающими и направлены на контроль специфических симптомов, например, миотонии (Logigian et al., 2010, Neurology 74:1441-1448). Доклиническая оценка новых терапевтических подходов была проведена на трансгенной мышиной модели HSALR, которая содержит трансген человеческого скелетного актина, несущий тринуклеотидную вставку 250 CUG в 3'-нетранслируемой области. Модель HSALR демонстрирует некоторые свойства DM1, включая MBNL1 секвестрацию посредством CUG РНК и результирующие нарушения сплайсинга РНК, изменения в мышечном транскриптоме и физиологические аберрации, такие как миотония (Osborne et al., 2009, Hum Mol Genet 18:1471-1481; Mankodi et al., (2000), Science 289:1769-1773). Новые терапевтические возможности, тестируемые на мышах HSALR, включают в себя низкомолекулярные лиганды, которые сконструированы для взаимодействия с РНК с повтором CUG и высвобождения ассоциированного с очагами белка MBNL1 (Warf et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:18551-18556; Parkesh et al., 2012, J Am Chem Soc 134:4731-4742; Ofori et al., 2012, Nucl. Acid. Res. in press, впервые опубликована онлайн: 6 апреля, 2012). В добавление три химические структуры антисмыслового олигонуклеотида (ASO), которые направляют участок повтора CUG, оценивали в исследованиях, проведенных на трансгенных мышиных моделях DM1 (Wheeler et al., 2009, Science 325:336-339; Mulders et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:13915-13920; Lee et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA 109:4221-4226). Wheeler и коллеги (2009, Science 325:336-339) продемонстрировали локальную коррекцию патологии DM1 в задней большеберцовой (tibilias anterior, TA) мышце мышей HSALR, подвергаемых внутримышечной (в/м) инъекции 25-мерного морфолинового олигонуклеотида с последовательностью CAG (CAG25). Обработанные CAG25 мышцы TA продемонстрировали снижение присутствия рибонуклеарных очагов, перераспределение белка MBNL1, коррекцию неправильного сплайсинга РНК, восстановление экспрессии и функции белка хлоридного канала (ClC-1) и уменьшение миотонии (Wheeler et al., 2009, Science 325:336-339). Хотя этот терапевтический подход продемонстрировал коррекции DM1-подобного фенотипа мышей HSALR, все еще существует потребность в стратегии систематической доставки, которая позволила бы многочисленным тканям, включая многочисленные тканевые типы, возможность подвергаться воздействию активного морфолинового олигонуклеотида, направленного на токсичные транскрипты РНК DMPK, ответственные за DM1.
На протяжении всего данного описания имеют место ссылки на различные патенты, патентные заявки и другие типы публикаций (например, журнальные статьи). Раскрытие всех патентов, патентных заявок и публикаций, приведенных в данном документе, посредством настоящего полностью включено в данный документ посредством ссылки.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленное в данном документе открытие раскрывает, в числе прочего, композиции и способы производства и применение связанных с катионным пептидом морфолиновых (PPMO) антисмысловых олигонуклеотидов, которые могут быть систематически доставлены в многочисленные ткани и тканевые типы, и применение того же самого для лечения DM1.
Соответственно, один объект, представленный в данном документе, является способом лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащим: систематическое введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединенного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность, комплементарную по меньшей мере 3 последовательностям повтора поли-CUG в 3'-нетранслируемой области (UTR) целевой РНК транскрипта протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK), в котором введение соединенного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида облегчает по меньшей мере один симптом DM1 в по меньшей мере двух мышцах. Способ по п.1, в котором катионный пептид составляет 8-30 аминокислотных остатков в длину и содержит одну или более субпоследовательностей, выбранных из группы, состоящей из RXR, RX, RB и RBR, в которой R представляет собой аргинин, Β представляет собой β-аланин, и каждый X представляет собой независимо -NH-(CHR1)n-C(O)-, в котором n составляет от 4 до 6, и каждый R1 представляет собой независимо H или метил так, чтобы самое большее два R1 представляли собой метил. В некоторых вариантах осуществления катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXRRBR)2XB-. В других вариантах осуществления катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXR)4XB-. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность 5'-(AGC)n-3', 5'-(GCA)n-3' или 5'-(CAG)n-3', в которой n составляет любое из приблизительно 5-25. В другом варианте осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид дополнительно содержит от 1 до 2 добавочных морфолиновых нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность: 5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3'. В другом варианте осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид дополнительно содержит 5'-аминомодификацию. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид представляет собой фосфородиамидатный связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, катионный пептид отделен от морфолинового антисмыслового олигонуклеотида спейсерной группой, присоединенной к 5'-концу морфолинового антисмыслового олигонуклеотида. В варианте осуществления спейсерная группа содержит
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, мышцы представляют собой скелетные мышцы, гладкие мышцы и/или сердечную мышцу. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид проникает в клетки передней большеберцовой мышцы, четырехглавой мышцы и/или икроножной мышцы. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой миотонию. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой агрегирование белка musclebind-like-1 (MBNL-1) в рибонуклеарных очагах внутри миоядер. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой неправильный сплайсинг по меньшей мере одного РНК транскрипта в мышечных клетках. В другом варианте осуществления упомянутый по меньшей мере один транскрипт РНК (такой как транскрипт РНК человеческих генов) выбран из группы, состоящей из: Serca-1, m-Titin, Zasp и CIC. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, систематическое введение связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида выполняют внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят индивидууму раз в неделю. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят индивидууму в течение от одной до шести недель. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. В других вариантах осуществления любого из способов, описанных выше, индивидуум является человеком.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 изображает химическую структуру PPMO и оценку биоактивности PPMO-B и PPMO-K в мышах HSALR. (a) Структура PPMO, содержащая проникающий в клетку пептид (пептид Β или пептид K), ковалентно присоединенный к линкеру, расположенному на 5'-конце морфолинового олигомера. Последовательности пептида Β и пептида Κ описаны в материалах и способах. (b) Тестовую и контрольную в/м инъекцию в мышцу TA выполняли, как описано в материалах и способах. Непосредственно инъекция в TA с последующим анализом сплайсинга Serca-1 служила для определения влияния ковалентного присоединения пептида Β или пептида Κ на биоактивность CAG25. Через три недели после в/м инъекции отбирали мышцы TA, очищали общую РНК и амплифицировали Serca-1 для детектирования сплайсированных изоформ с или без экзона 22 (ex22). Каждая скобка представляет одну HSALR мышь, инъецированную с указанным ASO (GAC25, CAG25, PPMO-B и PPMO-K), инъецированную в одну TA и с контралатеральной TA (кон), инъецированной с солевым раствором-носителем. РНК из TA мыши дикого типа FVB/n также анализировали в качестве контроля, и она продемонстрировала сплайсинг Serca-1, который происходит у мышей без заболевания.
Фиг. 2 изображает, что повторные инъекции IV PPMO-B или PPMO-K корректируют сплайсинг Serca-1. Мышей HSALR инъецировали с солевым раствором, CAG25, PPMO-B или PPMO-K раз в неделю в течение шести недель. Указанные группы мышц отбирали у мышей примерно через одну неделю после последней дозы. Очищали общую РНК и амплифицировали Serca-1 для детектирования дифференцированно сплайсированных изоформ. РНК из ΤA мыши дикого типа FVB/n служила в качестве контроля как на фиг. 1. Сплайсинг Serca-1 в РНК, очищенной из TA мышей HSALR, инъецированных с GAC25 или CAG25 как на фиг. 1, служил в качестве отрицательного контроля (отр. конр.) и положительного контроля (пол. конт.), соответственно.
Фиг. 3 изображает коррекцию неправильного сплайсинга ZASP, m-Titin и ClC-1 в мышах HSАLR, дозированных с повторными IV инъекциями PPMO-K. Мышей HSALR инъецировали с солевым раствором или PPMO-K раз в неделю в течение шести недель. Указанные группы мышц отбирали у мышей, общую РНК очищали и ZASP, m-Titin и ClC-1 амплифицировали для детектирования дифференцированно сплайсированных изоформ, содержащих указанные конфигурации экзона (ex) и интрона (int). РНК из TA мыши FVB/n дикого типа служила в качестве контроля без заболевания. Положительный и отрицательный контроли генерировали с РНК как на фиг. 2 с амплификацией ПЦР на ZASP, m-Titin и ClC-1.
Фиг. 4 изображает, что систематическая доставка PPMO-K снижает частоту и интенсивность РНК очагов CUG в четырехглавой мышце мышей HSALR. Анализ FISH проводили на замороженных срезах четырехглавой мышцы, как уже описано (Mankodi et al., 2001, Hum Mol Genet 10:2165-2170), с применением 2'-O-метил-модифицированного РНК зонда (5'-GCAGCAGCAGCAGCAGCAGC-3'), меченого на 5'-конце с AlexaFluor 555, и визуализировали посредством конфокальной микроскопии. (a, b) Мыши HSALR, обработанные шесть раз в неделю IV инъекциями солевого раствора, демонстрировали обильные очаги CUG РНК в ядрах мышц, меченых с DAPI. (c, d) HSALR, обработанные шесть раз в неделю IV инъекциями PPMO-K (30 мг/кг), демонстрировали уменьшение количества и интенсивности РНК очагов CUG. (e, f) Мышца FVB/n дикого типа не содержала обнаруживаемые очаги. Масштабная линейка = 50 мкм.
Фиг. 5 изображает, что иммунофлуоресцентная микроскопия демонстрирует ядерное перераспределение белка MBNL1 в обработанных PPMO-K мышах. Иммунофлуоресцентное окрашивание белков MBNL1 в срезах четырехглавой мышцы и конфокальную микроскопию проводили, как описано в материалах и способах. (a-c) Срезы мышц HSALR мышей, обработанных солевым раствором, демонстрируют точечную локализацию MBNL1 в ядре. (d-f) Срезы мышц обработанных PPMO-K мышей HSALR демонстрируют диффузное ядерное окрашивание MBNL1. (g-i) Срезы мышц мышей FVB/n дикого типа демонстрировали диффузное ядерное окрашивание MBNL1. Масштабная линейка = 10 мкм.
Фиг. 6 изображает, что миотония была скорректирована у мышей HSALR, которым вносили дозу повторной инъекции IV PPMO-K. (a) Уровни мРНК HSALR трансгена, нормализированные по 18S РНК в TA, икроножной и четырехглавой мышце гомозиготных HSALR, гемозиготных HSALR и мышей FVB/n дикого типа. Данные представлены в виде среднее + SD, n=6 мышей на группу. (b) Отслеживания регистраций EMG в икроножной мышце HSALR (миотония) или мышей FVB/n дикого типа (без миотонии). Миотония детектирована у мышей HSALR, но не у мышей дикого типа. (c) Проводили EMG анализ на необработанных гомозиготных HSALR, гемозиготных HSALR и мышах дикого типа. EMG также проводили на гомозиготных HSALR мышах, обработанных шесть раз в неделю инъекциями солевого раствора или PPMO-K. Каждую мышцу анализировали 10 раз для генерирования степени миотонии, как описано в материалах и способах. Данные представлены в виде средняя степень + SD для каждой тестируемой группы мышц, n=3-8 мышей на группу.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное открытие, в числе прочего, относится к катионным пептидсвязанным морфолиновым (PPMO) антисмысловым олигонуклеотидам, которые могут быть систематически доставлены к многочисленным тканям и/или тканевым типам у индивидуумов с миотонической дистрофией типа 1 (DM1). Авторы открытия обнаружили, что добавление проникающего в клетку пептида к последовательности CAG морфолино позволяет достаточное внедрение PPMO в мышечную ткань для нейтрализации токсичных эффектов удлиненного CUG повтора при введении систематически в животные модели DM1. Доставка этих морфолино и их проникновение в мышечные клетки индивидуумов, обладающих высокими количествами поли-CUG мРНК, было ассоциировано с почти полным разрешением нарушений сплайсинга в ряде белков, высвобождением MBNL1 из РНК очагов и элиминацией миотонии.
I. Общие технологии
При осуществлении на практике открытия применены, если не указано иное, общепринятые технологии в химии нуклеиновых кислот, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые хорошо известны специалисту в данной области. Такие технологии полностью объяснены в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989), и Molecular Cloning: A Laboratory Manual, третье издание (Sambrook and Russel, 2001) (обобщенно называемой в данном документе "Sambrook"); Current Protocols in Molecular biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, включая дополнения в 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994). Нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы in vitro хорошо известными технологиями химического синтеза, как описано, например, в Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic acids Res. 5 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; патенте США №4458066.
II. Определения
Термин "целевая РНК" относится к РНК транскрипту, с которым связывается морфолино специфичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления целевая РНК представляет собой одну или более молекул мРНК DMPK, имеющих переменное количество тринуклеотидных повторных элементов CUG в 3’-нетранслируемой области.
"Морфолино" или "морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид" относятся к олигонуклеотидному аналогу, составленному из морфолиновых субъединичных структур, где (i) структуры соединены вместе содержащими фосфор соединениями от одного до трех атомов в длину, предпочтительно два атома в длину, и предпочтительно незаряженными или катионными, соединяющими азот морфолино одной субъединицы с 5’-экзоциклическим углеродом смежной субъединицы, и (ii) каждое морфолиновое кольцо несет пуриновую или пиримидиновую группу спаривания оснований, эффективную для связывания посредством специфичного к основаниям водородного связывания с основанием в полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления морфолино связывает целевую РНК, что блокирует трансляцию целевой РНК в белок. В других вариантах осуществления морфолино предотвращает агрегирование целевой РНК с собой или с другими клеточными РНК, белками или рибопротеинами, такими как, но без ограничения ими, РНК, белки и рибопротеины, ассоциированные с клеточным аппаратом сплайсинга мРНК.
"Индивидуум" может являться млекопитающим, таким как любой распространенный лабораторный модельный организм или млекопитающее. Млекопитающие включают в себя, но не ограничены ими, людей и приматов, кроме человека, сельскохозяйственных животных, используемых в спортивных целях животных, домашних животных, мышей, крыс и других грызунов.
В используемом в данном документе значении "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить" или "лечащий") относится к клиническому вмешательству, разработанному для изменения естественного течения болезни у индивидуума или клетки, подвергаемых обработке во время клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают в себя, но не ограничены ими, снижение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление состояния заболевания и ремиссию или улучшенный прогноз.
В используемом в данном документе значении "предотвращение" включает в себя предоставление профилактики в отношении проявления или повторения заболевания или симптомов, ассоциированных с заболеванием у индивидуума. Индивидуум может являться предрасположенным, подверженным или иметь риск развития заболевания, но у него еще не было диагностировано заболевание.
"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического соединения, такого как антисмысловой олигомер, вводимого млекопитающему объекту или в виде единичной дозы, или в виде части ряда доз, которая является эффективной для выработки требуемого терапевтического эффекта. Для антисмыслового олигомера этот эффект, как правило, привносится ингибированием трансляции или естественного сплайсингового процессинга выбранной целевой последовательности.
В используемом в данном документе значении формы единственного числа включают в себя ссылку на формы множественного числа, если не указано иное.
Необходимо понимать, что аспекты и варианты осуществления открытия, описанные в данном документе, включают в себя "содержащие", "состоящие из" и "по существу состоящие из" объекты и варианты осуществления.
Подразумевается, что каждое максимальное численное ограничение, приведенное по всему объему данного описания, включает в себя каждое более низкое численное ограничение, как если бы такие численные ограничения были точно описаны в данном документе. Каждое минимальное численное ограничение, приведенное по всему объему данного описания, будет включать в себя каждое более высокое численное ограничение, как если бы такие более высокие ограничения были бы точно описаны в данном документе. Каждый численный диапазон, приведенный по всему объему данного описания, будет включать в себя каждый более узкий численный диапазон, который попадает в такой более широкий численный диапазон, как если бы такие более узкие численные диапазоны были бы точно описаны в данном документе.
III. Композиции
A. Морфолино
Морфолино являются синтетическими молекулами, имеющими структуру, которая имеет большое сходство с встречающейся в природе нуклеиновой кислотой. Эти нуклеиновые кислоты связывают комплементарные последовательности РНК стандартным спариванием оснований нуклеиновых кислот. Структурно морфолино отличаются от ДНК или РНК тем, что эти молекулы имеют основания нуклеиновой кислоты, связанные с морфолиновыми кольцами вместо дезоксирибозного или рибозного колец. Дополнительно, остов морфолино состоит из неионных или катионных соединяющих групп вместо фосфатов. К примеру, замещение анионных фосфатов незаряженными фосфородиамидатными группами элиминирует ионизацию в диапазоне обычного физиологического pH, что делает морфолино незаряженными молекулами в организмах или клетках. Морфолино наиболее часто используют в виде одноцепочечных олигов, хотя гетеродуплексы морфолиновой цепи и комплементарной цепи ДНК могут быть применены в комбинации с реагентами для катионной цитозольной доставки.
В отличие от многих антисмысловых структурных типов (например, фосфотиоатов) морфолино не разрушают их целевые молекулы РНК. Вместо этого морфолино действуют посредством "стерического блокирования", т.е. связывания с целевой последовательностью внутри РНК и стерического препятствования молекулам, которые могут в противном случае взаимодействовать с РНК. Связанные с 5'-нетранслируемой областью матричной РНК (мРНК) морфолино могут препятствовать прогрессированию рибосомального инициирующего комплекса с 5'-кэп до стартового кодона. Это предотвращает трансляцию кодирующей области целевого транскрипта (так называемое "нокаутирование" генной экспрессии). Некоторые морфолино нокаутируют экспрессию настолько эффективно, что после разрушения предсуществующих белков целевые белки становятся не обнаруживаемыми посредством вестерн-блоттинга.
Морфолино могут также препятствовать этапам процессинга пре-мРНК обычно предотвращением направляющих сплайсинг комплексов мяРНП от связывания с их мишенями на границах интронов на цепи пре-РНК. Предотвращение U1 (в донорном сайте) или U2/U5 (в полипиримидиновой группе и акцепторном сайте) от связывания может в результате привести к модифицированному сплайсингу, обычно приводя к исключению экзонов из зрелого транскрипта мРНК. Сплайсированная модификация может быть удобным образом проанализирована полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) и видна в виде сдвига полосы после гель-электрофореза продуктов ОТ-ПЦР.
Морфолино также были применены для блокирования интронных сплайсированных сайленсеров и сплайсированных энхансеров. Функции мяРНП U2 и U12 были ингибированы посредством морфолино. Морфолино, направленные к "скользким" последовательностям мРНК в кодирующих областях белков, могут индуцировать трансляционные сдвиги рамки. Активности морфолино против этого множества мишеней предполагают, что морфолино могут быть применены в качестве универсального инструмента для блокирования взаимодействий белков или нуклеиновых кислот с мРНК.
Композиции по данному открытию составлены из морфолиновых субъединиц, соединенных вместе незаряженными содержащими фосфор связями от одного до трех атомов в длину, соединяющими азот морфолино одной субъединицы с 5’-экзоциклическим углеродом смежной субъединицы, в котором основание, присоединенное к морфолиновой группе, является пуриновой или пиримидиновой группой спаривающегося основания, эффективной для связывания специфичным к основанию водородным связыванием с основанием в полинуклеотиде. Пуриновая или пиримидиновая группа спаривающегося основания является, как правило, аденином, цитозином, гуанином, урацилом или тимином. Приготовление таких олигомеров описано подробно в патенте США № 5185444, который настоящим полностью включен в данный документ посредством ссылки. Могут быть внесены изменения в эту связь при условии, что они не препятствуют связыванию или активности. К примеру, кислород, присоединенный к фосфору, может быть замещен серой (тиофосфородиамидат). 5'-кислород может быть замещен амино или амино с замещением низшим алкилом. Азот боковой цепи, присоединенный к фосфору, может являться незамещенным, монозамещенным или дизамещенным с (необязательно замещенным) низшим алкилом. Группа спаривания пуринового или пиримидинового основания представляет собой, как правило, аденин, цитозин, гуанин, урацил, тимин или инозин. Синтез, структуры и характеристики связывания морфолино подробно раскрыты в патентах США №№5698685, 5217866, 5142047, 5034506, 5166315, 5521063, 5506337 и опубликованной международной заявке на патент WO 2008/036127, все из которых полностью включены в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды по данному открытию могут быть комплементарными последовательности повтора поли-CUG в 3'-нетранслируемой области (UTR) целевой РНК протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK). В некоторых вариантах осуществления морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид является идентичным на по меньшей мере любую величину из приблизительно 90%, 95% или 100% включительно, включая любые проценты между этими величинами, 3’-нетранслируемой области целевой РНК протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK). В некоторых вариантах осуществления морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды являются комплементарными по меньшей мере любой из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более последовательностей повтора поли-CUG в 3’-нетранслируемой области (UTR) целевой РНК DMPK. В некоторых вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность 5'-(AGC)n-3', 5'-(GCA)n-3' или 5'-(CAG)n-3', в которых n составляет любое из приблизительно 5-25. В другом варианте осуществления связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды могут дополнительно содержать от 1 до 2 добавочных морфолиновых нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность 5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3. В другом варианте осуществления морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид связывает транскрипт РНК DMPK специфичным к последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит 5'-аминомодификацию. В другом варианте осуществления морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может представлять собой фосфородиамидатный связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид.
B. Катионные проникающие в клетку пептиды и связанные с катионным пептидом морфолино
Морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, присоединены к катионному пептиду, который облегчает систематическую доставку морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов в мышечные клетки. В целом катионный пептид, как описано в данном документе, может иметь от 8 до 30 аминокислотных остатков в длину и состоять из субпоследовательностей, выбранных из группы, состоящей из RXR, RX, RB и RBR; где R представляет собой аргинин (который может включать в себя D-аргинин), Β представляет собой β-аланин, и каждый X представляет собой независимо -NH-(CHR1)n-C(O)-, где n составляет 4-6, и каждый R1 представляет собой независимо H или метил, так что самое большее два R1 являются метилом. В некоторых вариантах осуществления каждый R1 является водородом. В других вариантах осуществления катионный пептид может быть любым из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислотных остатков в длину. В другом варианте осуществления переменная составляет 5, как, например, в 6-аминогексановой кислоте. В варианте осуществления катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXRRBR)2XB-, где Ac представляет собой ацетильную группу. В другом варианте осуществления катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXR)4XB-, где Ac представляет собой ацетильную группу. Дополнительную информацию относительно синтеза и структуры катионных проникающих в клетку пептидов можно найти в публикации патентной заявки США №2009/0099066, раскрытие которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте катионный пептид присоединен непосредственно к морфолиновому антисмысловому олигонуклеотиду. В других вариантах осуществления катионный пептид присоединен к морфолиновому антисмысловому олигонуклеотиду через спейсерную группу, присоединенную к 5'-концу морфолинового антисмыслового олигонуклеотида. Спейсерная группа может быть введена в пептид во время синтеза катионного пептида. К примеру, когда спейсер содержит свободную аминогруппу и вторую функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая позволяет связывание с другой молекулярной группой, спейсер может быть конъюгирован с твердой подложкой, применяемой для синтеза пептида. Впоследствии катионный пептид может быть синтезирован непосредственно на свободной аминогруппе спейсера посредством стандартной твердофазной технологии. В другом варианте осуществления спейсерная группа может быть конъюгирована с катионным пептидом после синтеза пептида. Такое конъюгирование может быть достигнуто хорошо разработанными в данной области способами. В варианте осуществления линкер содержит по меньшей мере одну функциональную группу, пригодную для присоединения к целевой функциональной группе синтезированного катионного пептида. К примеру, спейсер со свободной аминогруппой может быть подвергнут реакции с катионными пептидами C-концевой карбоксильной группы. В некоторых вариантах осуществления спейсерная группа содержит:
В варианте осуществления связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
в которой R2 представляет собой катионный пептид (такой как любой из катионных пептидов, раскрытых в данном документе), R3 представляет собой H, CH3 или CH2CONH2, и R4 представляет собой морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность 5'-(AGC)n-3', 5'-(GCA)n-3' или 5'-(CAG)n-3', в которой n составляет любое значение из приблизительно 5-25. В другом варианте осуществления связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды могут дополнительно содержать от 1 до 2 добавочных морфолиновых нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце олигонуклеотидов.
В другом варианте присоединенный к катионному пептиду морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит
в которой Ac представляет собой ацетил, R представляет собой аргинин (который может включать в себя D-аргинин), Β представляет собой β-аланин, каждый X представляет независимо -NH-(CHR1)n-C(O)-, где n составляет 4-6, и каждый R1 представляет собой H, и R4 представляет собой морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность 5'-AG(CAG)7CA-3'.
В другом варианте присоединенный к катионному пептиду морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит
в которой Ac представляет собой ацетил, R представляет собой аргинин (который может включать в себя D-аргинин), Β представляет собой β-аланин, каждый X независимо представляет собой -NH-(CHR1)n-C(O)-, где n составляет 4-6, и каждый R1 представляет собой H, и R4 представляет собой морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность 5'-AG(CAG)7CA-3'.
C. Фармацевтические составы
При применении в качестве фармацевтических средств связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть составлены с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или носителями в фармацевтическую композицию.
При применении в качестве фармацевтических средств связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды могут быть введены в форме фармацевтических композиций. Эти соединения могут быть введены разнообразными путями, включая оральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный и внутриносовой. Эти соединения эффективны как в инъецируемой, так и в оральной композиции. Такие композиции приготовлены хорошо известным в фармацевтической области образом и содержат по меньшей мере одно активное соединение.
Данное открытие также включает в себя фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента один или более из связанных с катионным пептидом морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов, ассоциированных с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями. При создании композиций этого изобретения активный ингредиент обычно смешивают с вспомогательным веществом или носителем, разбавляют вспомогательным веществом или носителем или заключают в такое вспомогательное вещество или носитель, который может быть в форме капсулы, саше, бумажного или другого контейнера. Когда вспомогательное вещество или носитель служит в качестве разбавителя, он может являться твердым, мягким или жидким материалом, который действует в качестве основы, носителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, леденцов, саше, капсул, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердой или жидкой среды), мазей, содержащих, к примеру, вплоть до 10% по массе активного соединения, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных инъецируемых растворов и стерильных упакованных порошков.
При изготовлении состава может быть необходимо размолоть активное соединение для обеспечения подходящего размера частиц перед комбинированием с другими ингредиентами. Если активное соединение является по существу нерастворимым, то обычно его размалывают до размера частиц менее чем 200 меш. Если активное соединение является по существу водорастворимым, то размер частиц обычно регулируют размалыванием для обеспечения по существу однородного распределения состава, например, приблизительно 40 меш.
Некоторые примеры пригодных вспомогательных веществ или носителей включают в себя лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, стерильную воду, сироп и метилцеллюлозу. Составы могут дополнительно включать в себя: смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгирующие и суспендирующие агенты; консервирующие агенты, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты; подслащивающие агенты и ароматизирующие агенты. Композиции открытия могут быть составлены так, чтобы обеспечивать быстрое, устойчивое или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения пациенту посредством процедур, известных в данной области.
Композиции предпочтительно составляют в единичную форму дозирования, при этом каждое дозирование содержит от приблизительно 5 мг до приблизительно 100 мг или более, такое как любое из от приблизительно 5 мг до приблизительно 10 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 20 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 30 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 40 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 60 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 70 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 80 мг или от приблизительно 5 мг до приблизительно 90 мг включительно активного ингредиента, включая любой диапазон между этими величинами. Термин "единичные формы дозирования" относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных дозирований для индивидуумов, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного материала, рассчитанное для выработки требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с пригодным фармацевтическим вспомогательным веществом или носителем.
Связанные с катионным пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды эффективны в широком диапазоне дозирований, и их обычно вводят в терапевтически эффективном количестве. Однако будет принято во внимание то, что фактически вводимое количество связанных с катионным пептидом морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов будет определено врачом, исходя из соответствующих обстоятельств, включая подвергаемое лечению состояние, выбранный путь введения, вводимое действующее соединение, возраст, вес и ответ индивидуального пациента, тяжесть симптомов пациента и тому подобное.
Для изготовления твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент/связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид смешан с фармацевтическим вспомогательным веществом или носителем для формирования твердой предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения данного открытия. При ссылке на эти предварительные композиции как гомогенные, подразумевается, что активный ингредиент диспергирован равномерно по всему объему композиции так, что композиция может быть легко подразделена на одинаково эффективные единичные формы дозирования, такие как таблетки, пилюли и капсулы.
Таблетки или пилюли по данному открытию могут быть покрыты или иным образом введены в состав для обеспечения формы дозирования, предоставляющей преимущество пролонгированного действия. К примеру, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент дозирования и внешний компонент дозирования, при этом последний имеет форму оболочки над первым. Два компонента могут быть разделены энтеральным слоем, который служит для противодействия разрушению в желудке и позволяет внутреннему компоненту проходить неповрежденным в двенадцатиперстную кишку или подвергаться замедленному высвобождению. Разнообразные материалы могут быть применены для таких энтеральных слоев или покрытий, при этом такие материалы включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
Жидкие формы, в которые новые композиции по данному открытию могут быть инкорпорированы для введения орально или инъекцией, включают в себя водные растворы, соответствующим образом ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с пищевыми маслами, такими как кукурузное масло, хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, также как и эликсиры и подобные фармацевтические носители.
Композиции для ингаляции или инсуффляции включают в себя растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать пригодные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, как описано выше. Композиции могут быть введены оральным или назальным респираторным путем для местного или систематического эффекта. Композиции в фармацевтически приемлемых растворителях могут быть распылены посредством применения инертных газов. Распыленные растворы могут быть ингалированы непосредственно из распыляющего устройства, или распыляющее устройство может быть присоединено к маске для лица или к дыхательному аппарату с интермиттирующим положительным давлением. Раствор, суспензия или порошковые композиции могут также быть введены орально или назально из устройств, которые доставляют состав подходящим образом.
IV. Способы по изобретению
Связанные с катионным пептидом морфолиновые (PPMO) антисмысловые олигонуклеотиды (такие как в композиции), раскрытые в данном документе, могут быть применены для лечения и/или предотвращения симптомов миотонической дистрофии типа I (DM1) у индивидуума. В некоторых вариантах индивидуум имеет риск развития DM1. В некоторых вариантах способ может содержать лечение и/или предотвращение симптомов, ассоциированных с DM1 (таких как любой из симптомов, описанных в данном документе), у индивидуума посредством систематического введения индивидууму эффективного количества присоединенных к катионному пептиду морфолиновых (PPMO) антисмысловых олигонуклеотидов или композиций, содержащих то же самое, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума диагностируют или подозревают наличие DM1.
Данное открытие направлено на способы ингибирования симптомов или состояний (нетрудоспособность, ограничение возможностей), ассоциированных с DM1, как подробно описано ниже. По сути, не требуется, чтобы все эти эффекты состояния были полностью предотвращены или инвертированы, хотя эффекты способов, раскрытых в данном изобретении, по-видимому, могут распространяться до значительных терапевтических преимуществ для пациента. По сути, терапевтическое преимущество необязательно полностью предотвращает или лечит конкретное состояние, полученное результате DM1, но, скорее, может охватывать результат, который включает в себя снижение или предотвращение симптомов, которые происходят в результате DM1, снижая или предотвращая проявление таких симптомов (или количественно, или качественно), снижая тяжесть таких симптомов или их физиологические эффекты и/или усиливая восстановление индивидуума после испытания им симптомов DM1.
В другом варианте предоставлены способы снижения агрегирования одного или более транскриптов мРНК DMPK внутри клетки. В некоторых вариантах осуществления способ предотвращает агрегирование одного или более транскриптов мРНК DMPK в ядре клетки.
В другом варианте в данном документе представлены способы снижения агрегирования одного или более транскриптов мРНК DMPK и одного или более ядерных белков или РНК внутри клетки. В некоторых вариантах осуществления один или более ядерных белков представляют собой белки, задействованные в сплайсинге пре-мРНК (иначе называемые гетероядерные РНК (гяРНК)) в зрелые сплайсированные мРНК. В варианте осуществления ядерные белки являются малыми сердцевинными белками (иначе называемыми белки Sm) и могут быть одним или более из SmB, SmB', SmD1, SmD2, SmD3, SmE, SmF, SmG или SmN. В некоторых вариантах осуществления одна или более ядерных РНК является РНК, задействованной в сплайсинге гяРНК в зрелые сплайсированные мРНК. В другом варианте осуществления ядерные РНК являются малыми ядерными РНК (мяРНК) и могут быть одной или более из U1, U2, U3, U4, U5, U6, U11, U12, U4atac или U6atac. В некоторых вариантах осуществления один или более ядерных белков или РНК содержат ядерный рибопротеиновый комплекс. В другом варианте осуществления РНК могут являться РНК, которая не является частью аппарата клеточного сплайсинга, такими как Serca-1, m-Titin, Zasp и CIC-1. В варианте осуществления клетка является мышечной клеткой, такой как скелетная мышечная клетка, клетка гладкой мышцы или сердечная мышечная клетка.
В частности, композиция данного открытия при введении индивидууму может лечить или предотвращать одно или более из симптомов или состояний, ассоциированных с DM1, и/или снижать или облегчать симптомы или состояния, ассоциированные с этим нарушением. По сути, защита индивидуума от эффектов или симптомов, полученных в результате DM1, включает в себя как предотвращение или снижение проявления и/или тяжести эффектов нарушения, так и лечение пациента, у которого эффекты нарушения уже произошли или начинают происходить. Благоприятный эффект может легко быть оценен рядовым специалистом в данной области и/или подготовленным клиницистом, который лечит пациента. Предпочтительно, существует положительное или благоприятное различие в тяжести или проявлении по меньшей мере одной клинической или биологической оценки, значения или величины, применяемой для оценки таких пациентов среди тех, кто был обработан со способами по данному открытию, по сравнению с теми, кто не был обработан.
A. Миотоническая дистрофия
Миотоническая дистрофия (иначе называемая миотоническая дистрофия или атрофическая миотония) является хроническим, медленно прогрессирующим, очень изменчивым, наследственным мультиситемным заболеванием с предоминантными симптомами, которые включают в себя мышечное истощение (мышечная дистрофия), катаракты, нарушения сердечной проводимости, эндокринные изменения и миотонию. Миотоническая дистрофия типа 1 (DM1), иным образом именуемая "заболевание Штейнерта", имеет как острую врожденную форму, так и форму с началом в средний период детства и является результатом мутации гена, расположенного в длинном плече хромосомы 19, называемого протеинкиназа миотонической дистрофии (DMPK), кодирующего белок, экспрессируемый преимущественно в скелетной мышце. Миотоническая дистрофия типа 2 (DM2), также называемая проксимальной миотонической миопатией (PROMM), является более редкой, чем DM1, и обычно проявляется с более мягкими признаками и симптомами. DM2 непосредственно вызвана нарушением гена ZNF9 на хромосоме 3. Миотоническая дистрофия может возникнуть у пациентов любого возраста, и формы заболевания отражают аутосомную доминантную модель наследования. DM1 является наиболее распространенной формой мышечной дистрофии, диагностируемой у взрослых с распространенностью, варьирующейся от 1 на 100000 в Японии до 3-15 на 100000 в Европе (Turner & Hilton-Jones, 2010, J Neurol Neurosurg Psychiatry 81:358-367).
Возраст в начале, а также тяжесть симптомов у индивидуумов, пораженных DM1, может значительно варьироваться даже между генетически родственными индивидуумами. У некоторых индивидуумов симптомы могут выражаться при рождении или не становиться различимыми до старости. DM1 является прогрессирующим нарушением с симптомами, обычно медленно становящимися хуже с течением времени. Следовательно, индивидуумы, у которых симптомы проявляются в ранний период жизни, как правило, испытывают большее количество осложнений и более тяжелые симптомы по сравнению с теми индивидуумами, у которых не присутствуют симптомы типичных нарушений до более позднего возраста. Тем не менее, индивидуальный прогноз варьируется и не может быть точно предсказан относительно того, как заболевание будет воздействовать на любого из индивидуумов.
1. Сердечно-сосудистые симптомы
Некоторые индивидуумы с DM1 могут испытывать от умеренных до тяжелых сердечно-легочных нарушений. К примеру, внезапная смерть из-за полной блокировки сердечной проводимости и желудочковая фибрилляция/тахикардия, вызванная кардиомиопатией, в некоторых случаях была обоснована DM1. Другие сердечно-сосудистые симптомы, которые были ассоциированы с DM1, включают в себя, но не ограничены ими, кардиогенный обморок и предобморочное состояние, нарушения сердечной проводимости, сердечные аритмии, гипотонию и застойную сердечную недостаточность. Часто у индивидуумов, у которых диагностировали DM1, развиваются сердечно-сосудистые симптомы после начала других нервно-мышечных симптомов. Однако некоторые данные указывают на то, что бессимптомные дети имеют заметный риск внезапной сердечной смерти.
2. Симптомы центральной нервной системы
Избыточная дневная сонливость (гиперсомния) часто наблюдается у индивидуумов с DM1 независимо от возраста начала. Хотя общее утомление также часто наблюдается при DM1, гиперсомния характеризуется потребностью в частом сне, зачастую непредсказуемо в течение дня, несмотря на нормальную или большую, чем нормальная, продолжительность ночного сна.
Хотя значительные нарушения периферического нерва не были подтверждены у индивидуумов с диагностированной DM1, некоторые небольшие нарушения функции периферического нерва были подтверждены в исследованиях нервной проводимости. Непосредственная причина индуцированной DM1 дисфункции периферического нерва в настоящее время неизвестна.
3. Симптомы желудочно-кишечного тракта
Желудочно-кишечные симптомы часто наблюдаются при DM1, и они происходят в результате дисфункции скелетных и/или гладких мышц пищеварительного тракта. Эти симптомы включают затруднение глотания из-за слабости/миотонии рта, языка или горла, гастроэзофагеальный рефлюкс из-за расслабления нижнего пищеводного сфинктера, боли в области живота, тошноту, рвоту, вздутие или кишечную псевдонепроходимость из-за неэффективного сокращения перистальтической гладкой мышцы в кишечнике и желудке, желчные камни, образовавшиеся в результате слабой/миотонической мускулатуры желчного протока/желчного пузыря, запор, диарею или малабсорбцию, вызванные нарушением кишечной моторикики, и недержание кала из-за мышечной слабости анального сфинктера и диафрагмы таза.
4. Симптомы репродуктивной и эндокринной системы
DM1 ассоциирована со значительными нарушениями репродуктивной и эндокринной системы. У мужчины эти симптомы могут быть не очевидны вплоть до взрослого состояния, когда гормональные и эндокринные изменения, ассоциированные с половой зрелостью, не могут произойти или являются замедленными. У самцов DM1 ассоциирована с тестикулярной атрофией, которая может привести в результате к сниженной или отсутствующей выработке спермы и мужской бесплодности, слабому развитию вторичных половых признаков, включая сниженное количество энергии, либидо, половых волос, мышечной массы и минеральной плотности костей. Кроме того, самцы с DM1 часто испытывают низкие уровни тестостерона в сыворотке, сопровождаемые повышенными уровнями лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона в сыворотке. Повышенные уровни ФСГ ассоциированы с аномально высокими соотношениями эстрадиол:тестостерон, что может привести к увеличению груди у самцов. В заключение, самцы с DM1 часто испытывают высокие показатели облысения по мужской модели и потерю волос.
5. Респираторные симптомы
Из-за мышечной слабости в диафрагме, абдоминальных и межреберных мышцах, а также миотонии респираторных мышц DM1 может быть ассоциирована с респираторной недостаточностью, и в наиболее тяжелых случаях может требоваться механическая вентиляция для содействия дыханию индивидуума. Дополнительно из-за слабости этих мышц у индивидуума с DM1 часто отсутствует сила для кашля после непреднамеренной аспирации еды или напитка, слюны, назальных выделений и жидких сред желудка в легкие, что обычно сопровождается затруднениями глотания при заболевании. Это может привести к повреждению и воспалению легких и бронхов в результате инфекции.
Другим респираторным симптомом, воздействующим на индивидуумов с DM1, является апноэ во время сна, которое является нарушением во время сна, характеризуемым неправильными приостановками дыхания или примерами аномально низкого дыхания во время сна, привнесенными при DM1 слабостью респираторной мышцы. Каждая приостановка дыхания, называемая апноэ, может продолжаться в течение от нескольких секунд до минут и может происходить от 5 до 30 раз или более в час. Недостаточный воздушный поток из-за апноэ во время сна (периоды отсутствия воздушного потока из-за узких дыхательных путей и прерывистого дыхания) может в результате привести к опасно низким уровням кислорода и высоким уровням диоксида углерода в крови. При умеренных случаях апноэ может вызывать нарушенный сон, чрезмерное утомление и утренние головные боли. В тяжелых случаях апноэ может вызывать высокое давление крови, сердечные аритмии и сердечный приступ.
6. Симптомы скелетной мышцы
Индивидуумы с DM1 обычно испытывают миотонию, что характеризуется медленной релаксацией мышц после произвольного сокращения или электрической стимуляции. Обычно, требуется повторное усилие для релаксации мышц, и состояние улучшается после того, как мышцы разогрелись. Однако длительное, тяжелое упражнение также может запустить это состояние. Индивидуумы с нарушением могут иметь проблемы с захватом объектов или могут иметь затруднение с подъемом из сидячего положения и жесткую, неуклюжую походку. Хотя любая скелетная мышца может испытывать миотонию, DM1 имеет тенденцию поражать некоторые мышцы тела более часто, чем другие. Они включают в себя мышцы предплечья и пальцев и мышцы языка и челюсти, что может привести к проблемам с речью или пережевыванием пищи. Дополнительно, быстрые движения могут иногда инициировать мышечную неподвижность, характерную для миотонии при DM1.
Мышечную слабость и атрофию также наблюдают у многих индивидуумов, страдающих от DM1. Мышечная слабость DM1 типично воздействует на некоторые мышцы, тогда как другие мышцы могут испытывать от малой до отсутствия слабости или могут поддерживать нормальную силу. Мышечная слабость является первичной причиной нетрудоспособности индивидуумов с DM1 и, как правило, воздействует на подвижность, ловкость рук и способность поднимать от умеренных до тяжелых объектов. В более тяжелых случаях индивидуумы испытывают проблемы с дыханием или глотанием, вызванные слабостью мышц горла и груди (например, мышца диафрагмы).
Кроме того, DM1 часто сопровождается мышечной болью. Боль может воздействовать на мышцу саму по себе или может иметь источник в суставах, связках или позвоночнике. Дополнительно, мышечная слабость может предрасполагать индивидуумов с DM1 к артритическому растяжению в этих областях.
У самок DM1 ассоциирована с осложнениями, от умеренных до тяжелых, ассоциированными с беременностью и родами, также как и со сниженной фертильностью. Это может включать в себя раннее начало менопаузы, более высокие степени самопроизвольных абортов и выкидышей, длительные схватки и роды, связанные с маточной дисфункцией, вызванной мышечной слабостью или миотонией, маточное растяжение, связанное с полигидрамнионом, что может вызывать преждевременные схватки, неадекватные маточные сокращения (атоническая матка) или преждевременный самопроизвольный разрыв мембраны, а также послеродовое кровотечение из-за неадекватных маточных сокращений (атоническая матка) или задержки отделения плаценты.
У новорожденных DM1 симптомы могут включать в себя симптомы, такие как полигидрамнион (чрезмерное накопление околоплодной жидкости из-за пониженного фетального глотания), что ассоциировано с повышенными рисками неблагоприятного исхода беременности, выпадение петель пуповины или отслоение плаценты, неправильное положение плода из-за большей фетальной подвижности, преждевременные роды, фетальный отек и пониженное фетальное движение.
7. Зрительные симптомы
Зрительные нарушения у пациентов с DM1 часто ассоциированы с развитием катаракты. Постериорные субкапсулярные радужные помутнения хрусталика представляют начальную фазу формирования катаракты при миотонической дистрофии и обнаруживаются только с биомикроскопией с щелевой лампой. Такие помутнения обычно обнаруживают у пациентов, у которых еще не развились никакие зрительные симптомы. Присутствие этого типа помутнений хрусталика и более зрелые катаракты могут быть единственным признаком заболевания. Блики и размытость зрения развиваются в виде прогрессирования помутнений хрусталика в звездообразные катаракты и, в конечном счете, в зрелые катаракты, которые являются неразличимыми от обычных катаракт. Катаракты при DM1 могут прогрессировать быстрее, чем обычные катаракты, и таким образом могут быть представлены пациенты с DM1 с ранним началом катаракты.
Дополнительные зрительные симптомы, ассоциированные с DM1, могут включать в себя ретинопатию, двухсторонний блефароптоз (провисание или падение верхнего или нижнего века), окулярную гипотонию и окулярную миотонию.
8. Клеточные и молекулярные симптомы
Генетическое повреждение DM1 приводит в результате к РНК транскрипту DMPK, содержащему большое количество повторов CUG в 3'-нетранслируемой области, который приобретает свойства получения функции и стимулирует РНК-опосредованную токсичность в клетках и тканях, экспрессирующих мутантный транскрипт DMPK. Настоящая модель процесса заболевания DM1 относится к взаимодействию РНК CUGexp с ядерными связывающими белками, в конечном счете приводя к неправильной регуляции альтернативного сплайсинга для выбранной группы пре-мРНК. Наиболее значительным молекулярным нарушением, идентифицированным в DM1, является мисрегуляция альтернативного сплайсинга. Хотя некоторые человеческие генетические нарушения могут быть обоснованы эффектами мутаций на сплайсинг РНК, почти все из этих эффектов являются цис-действующими эффектами, которые воздействуют на сплайсинг индивидуальной пре-мРНК, что приводит к неправильно сплайсированным транскриптам, кодирующим нефункциональный мутантный белок (Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15; 15 Spec No 2:R162-9; Faustino & Cooper, 2003, Gens Dev., 17:419-437). DM1 является первым примером человеческого генетического заболевания, являющегося результатом сплайсеопатии, т.е. транс-эффекта на альтернативный сплайсинг многих РНК, что не приводит в результате к выработке мутантного белка, но приводит к экспрессии сплайсированных продуктов, которые являются эволюционно-неподходящими для конкретной ткани (Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15; 15 Spec No 2:R162-9).
Белки muscleblind (MBNL) первоначально идентифицировали на связывание (CUG)90 вместо (CUG)11 in vitro (Miller et al., 2000, EMBO J., 19:4439-4448). Эти белки интенсивно привлекаются в ядерные очаги при DM1 (Mankodi et al., 2003, Ann. Neurol., 54:760-768). Из трех генов млекопитающих MBNL в скелетной мышце, сердце и мозге экспрессируются MBNL1 и MBNL2, и MBNL3 экспрессируется в основном в плаценте (Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15;15 Spec No 2:R162-9). Уровня CUGexp, экспрессированного при DM1, достаточно для заметного изменения клеточного распределения MBNL1. В мозге, скелетной мышце и сердце MBNL1 привлекается в рибонуклеарные очаги до такой степени, что он бывает заметно обеднен в других местах в нуклеоплазме (Jiang et al., 2004, Hum. Mol. Genet. 13:3079-3088; Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15; 15 Spec No 2:R162-9). Деструкция гена MBNL1 в мышах репродуцирует не только миотоническую миопатию, подобную DM1, но также DM1-подобные катаракты и сердечное заболевание (Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15; 15 Spec No 2:R162-9). Не ограничиваясь какой-либо теорией, эти обнаружения предполагают, что секвестрация MBNL1 белка на повторное удлинение РНК играет важную роль в фенотипе и симптомах, ассоциированных с DM1.
Другим белком, который, как предполагают, играет роль в DM1, является CUG-BP1, который также способен индуцировать DM1-подобные эффекты на альтернативный сплайсинг в мышце (Philips et al., 1998, Science, 280:737-741), и он был впервые идентифицирован при связывании с олигонуклеотидами (CUG) 8 in vitro (Timchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24:4407-4414). Также следует отметить аберрантный сплайсинг хлоридного канала мРНК ClC-1, который, как было продемонстрировано, в результате непосредственно приводит к миотонии (Mankodi et al., 2002, Mol. Cell, 10:35-44). Другие белки, которые, как было продемонстрировано, имеют альтернативный сплайсинг с нарушенной регуляцией в скелетных мышцах индивидуумов с DM1, включают в себя, но не ограничены ими, белки, кодируемые генами ALP, CAPN3, CLCN1, FHOS, GFAT1, IR, MTMR1, NRAP, RYR1, SERCA1, z-Titin, m-Titin, TNNT3 или ZASP. Белки, которые, как было продемонстрировано, имеют альтернативный сплайсинг с нарушенной регуляцией в сердечной мышце индивидуумов с DM1, включают в себя, но не ограничены ими, белки, кодируемые генами TNNT2, ZASP, m-Titin, KCNAB1 или ALP. Белки, которые, как было продемонстрировано, имеют альтернативный сплайсинг с нарушенной регуляцией в неврологической ткани индивидуумов с DM1, включают в себя, но не ограничены ими, белки, кодируемые генами TAU, APP или NMDAR1 (Osborne & Thornton, 2006, Hum Mol Genet., 15; 15 Spec No 2:R162-9).
B. Способы лечения миотонической дистрофии типа-I
В данном документе представлены способы лечения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащие: систематическое введение индивидууму терапевтически эффективного количества связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида (такого как любой из связанных с катионным пептидом морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов, раскрытых в данном документе), содержащего последовательность, комплементарную по по меньшей мере 3 последовательностям повтора поли-CUG в 3'-нетранслируемой области (UTR) РНК транскрипта протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK), в котором введение связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида облегчает по меньшей мере один симптом DM1 в по меньшей мере двух мышцах. В варианте осуществления мышцы могут представлять собой скелетные мышцы, гладкие мышцы и/или сердечную мышцу. В другом варианте осуществления мышцы являются скелетными мышцами и могут включать в себя, без ограничения, переднюю большеберцовую мышцу, четырехглавую мышцу и/или икроножную мышцу. В некоторых вариантах осуществления введение связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида может быть выполнено внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. В других вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может быть введен индивидууму любым образом из следующего: раз в день, раз в два дня, раз в три дня, раз в четыре дня, раз в 5 дней, раз в 6 дней или раз в 7 дней. В некоторых вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может быть введен индивидууму в течение периода вплоть до одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель, пяти недель, шести недель, семи недель, восьми недель, девяти недель, десяти недель, одиннадцати недель, двенадцати недель, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, одного года, двух лет, трех лет, четырех лет, пяти или более лет или времени жизни включительно, включая периоды времени между этими значениями. В других вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят индивидууму в любой концентрации из приблизительно 2 мг/кг, 4 мг/кг, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг, 12 мг/кг, 14 мг/кг, 16 мг/кг, 18 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг, 40 мг/кг, 45 мг/кг, 50 мг/кг, 55 мг/кг, 60 мг/кг, 65 мг/кг, 70 мг/кг, 75 мг/кг, 80 мг/кг, 85 мг/кг, 90 мг/кг, 95 мг/кг или 100 мг/кг или более включительно, включая концентрации между этими величинами. В варианте осуществления по меньшей мере один упомянутый симптом DM1 представляет собой миотонию. В варианте осуществления упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой агрегирование белка musclebind-like-1 (MBNL-1) в рибонуклеарных очагах внутри миоядер. В другом варианте осуществления упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой неправильный сплайсинг по меньшей мере одного РНК транскрипта в мышечных клетках. В некоторых вариантах осуществления транскрипт РНК выбран из группы, состоящей из: Serca-1, m-Titin, Zasp и CIC-1. В варианте осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или носителем, такими как любое из фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ или носителей, описанных в данном документе. В другом варианте осуществления индивидуум является человеком.
В некоторых вариантах любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на одну или более скелетных мышц. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из: миотонии, мышечной слабости, мышечной атрофии и мышечной боли.
В другом варианте любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на сердечно-сосудистую систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из: кардиогенного обморока и предобморочного состояния, нарушений сердечной проводимости, сердечной аритмии, гипотонии и застойной сердечной недостаточности.
В некоторых вариантах любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на респираторную систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из: слабости респираторной мышцы, аспирации и апноэ во время сна.
В другом варианте любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на желудочно-кишечную систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: затруднение жевания и глотания, желудочно-пищеводный рефлюкс, абдоминальная или грудная боль (диспепсия), тошнота, рвота, вздутие, кишечная псевдонепроходимость, холестаз, запор, диарея, кишечная малабсорбция, чрезмерное уплотнение стула, мегаколон, перфорация стенки кишечника, дисхезия и недержание кала.
В некоторых вариантах любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на нервную систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: когнитивное нарушение, чрезмерная дневная сонливость (гиперсомния), поведенческие затруднения, эмоциональные затруднения, затруднения социализации и периферическая невропатия.
В другом варианте любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на репродуктивную и/или эндокринную систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: тестикулярная атрофия, женское бесплодие, слабое развитие вторичных половых признаков, сниженная энергия, сниженное либидо, сниженное количество или отсутствие лобковых волос, сниженная мышечная масса, сниженная минеральная плотность костей, низкий сывороточный тестостерон, повышенный сывороточный лютеинизирующий гормон, повышенный сывороточный фолликулостимулирующий гормон, гинекомастия у самцов, ранняя менопауза, инсулиновая резистентность, преждевременное облысение по мужской модели и повышенные уровни соотношений эстрадиола к тестостерону у самцов.
В некоторых вариантах любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на беременность. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: самопроизвольный аборт, мертворождение, длительные схватки и роды, маточное растяжение, преждевременные схватки, миотонические спазмы после введения деполяризующих агентов, респираторное ослабление после введения барбитуратов и послеродовое кровотечение.
В другом варианте любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой неонатальные осложнения. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: полигидрамнион, выпадение петель пуповины, разрыв плаценты, неправильное положение плода, отек плода и фетальная акинезия.
В некоторых вариантах любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на иммунную систему. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из: гипогаммаглобулинемии и повышенной частоты пиломатриксомы.
В другом варианте любого из способов, раскрытых в данном документе, упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой симптом, воздействующий на глаз или зрение. В варианте осуществления симптом выбран из группы, состоящей из следующего: расплывчатое зрение, ретинопатия, двусторонний блефароптоз (птоз), глазная гипотония и глазная миотония.
C. Введение связанных с катионным пептидом морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов
В некоторых вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят в форме инъекции. Инъекция может содержать соединение в комбинации с водным инъецируемым вспомогательным веществом или носителем. Неограничивающие примеры пригодных водных инъецируемых вспомогательных веществ или носителей хорошо известны специалистам в данной области, и их способы приготовления составов можно найти в таких распространенных источниках как Alfonso AR: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton Pa., 1985. Пригодные водные инъецируемые вспомогательные вещества или носители включают в себя воду, водный солевой раствор, водный раствор декстрозы и тому подобное и необязательно содержат усилители растворения, такие как 10% маннит или другие сахара, 10% глицин или другие аминокислоты. Композиция может быть инъецирована подкожно, внутрибрюшинно или внутривенно.
В некоторых вариантах осуществления применяется внутривенное введение, и оно может являться непрерывным внутривенным вливанием в течение периода от нескольких минут до одного часа или более, такого как около пятнадцати минут. Вводимое количество может широко варьироваться в зависимости от типа присоединенного к катионному пептиду морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, размера единицы дозирования, типа вспомогательных веществ или носителей и других факторов, хорошо известных специалисту в данной области. Связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может содержать, к примеру, от приблизительно 0,001% до приблизительно 10% (масс/масс), от приблизительно 0,01% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,8% или любой диапазон внутри приведенного, при этом оставшаяся часть содержит вспомогательное(ые) вещество(а) или носитель(и).
Для орального введения связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может иметь форму, к примеру, таблеток или капсул, изготовленных посредством общепринятого средства с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями, такими как связывающие агенты; наполнители; скользящие вещества; разрыхлители или смачивающие агенты. Жидкие препараты для орального введения могут иметь форму, к примеру, растворов, сиропов или суспензий, или они также могут быть представлены в виде сухого продукта для смешивания с водой или другим пригодным носителем перед применением. Такие жидкие препараты могут быть изготовлены посредством общепринятого средства с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или аравийская камедь); неводные носители (например, масло ationd, масляные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также содержать буферные соли, ароматизирующие и окрашивающие в соответствующих случаях.
В некоторых вариантах осуществления связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид может быть введен ингаляцией посредством спрея-аэрозоля или распылителя, который может включать в себя пригодный газ-вытеснитель, такой как, к примеру, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или их комбинация. В неограничивающем примере единица дозирования для аэрозоля под давлением может быть доставлена посредством дозирующего клапана. В другом варианте осуществления капсулы и картриджи желатина, к примеру, могут быть применены в ингаляторе и могут быть составлены так, чтобы они содержали превращенную в порошок смесь соединения с пригодным порошкообразным основанием, таким как, к примеру, крахмал или лактоза.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Внутримышечная инъекция двух различных конъюгатов PPMO в переднюю большеберцовую мышцу корректирует аберрантный сплайсинг РНК
Большие удлинения тринуклеотидных последовательностей CUG обеспечивают основу для получения функции токсичной РНК, что приводит к пагубным изменениям в метаболизме РНК. Такой повторный элемент CUG обычно находится в 3’-нетранслируемой области протеинкиназы DMPK, но при удлинении он является генетическим повреждением - миотонической дистрофией типа I (DM1), наследственным нервно-мышечным заболеванием. Патогенный транскрипт DMPK, содержащий удлинение CUG, сохраняется в рибонуклеарных очагах как часть комплекса с РНК связывающими белками, такими как muscleblind-like 1 (MBNL1), приводя в результате к аберрантному сплайсингу многочисленных транскриптов РНК и физиологическим нарушениям, включая миотонию.
В этом примере проводили реакции конденсационного синтеза для генерирования PPMO конъюгатов, содержащих основанные на 25-мерных последовательностях CAG морфолино (Wheeler et al., 2009, Science 325:336-339), CAG25, и проникающий в клетку пептид ковалентно присоединяли к спейсерной группе, расположенной на 5'-конце морфолино (фиг. 1a). Дополнительно, для определения влияния спейсера и пептидных модификаций на биоактивность PPMO-B и PPMO-K выполняли ряд инъекций в/м в переднюю большеберцовую (TA) мышцу трансгенных мышей HSALR и оценивали сплайсинг РНК Serca-1.
Материалы и способы
Конъюгирование проникающих в клетку пептидов с морфолиновыми олигонуклеотидами
PPMO конъюгаты синтезировали, как описано Abes et al., с модификациями, как описано ниже (2006, J Control Release 116:304-313). Пептид Β (Ac(RXRRBR)2XB-COOH) или пептид Κ (Ac(RXR)4XB-COOH) (Anaspec, Fremont, CA) активировали в диметилформамиде, содержащем O-(6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторофосфат (HCTU)/диизопропилэтиламин (DIEA) в молярных соотношениях 1:2 на моль пептида при комнатной температуре (КТ). Морфолино CAG25 (5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3') (Gen Tools, Philomath, OR) с первичной 5'-аминомодификацией растворяли в диметилсульфоксиде и добавляли к активированному пептиду Β или пептиду Κ с молярным избытком пептида:ASO 1:2-1,5, и реакции позволяли протекать в течение 2 ч при КТ. Реакцию резко охлаждали водой; конъюгаты PPMO очищали на карбоксиметилсефарозе (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и элюировали в 2 M гуанидин-HCl, 1 M NaCl, pH 7,5, 20% ацетонитрил. Элюат диализировали несколько раз против буфера 0,1 мМ NaHCO3 в диализной кассете с размером пор отделяющей мембраны 3000 Да. Диализованный PPMO определяли количественно спектрофотометрическим поглощением в 0,1 Н HCl при 265 нм, замораживали и лиофилизировали.
Повторное выведение и генотипирование HSA
LR
Получали повторно выведенных гемозиготных мышей HSALR импрегнированием самок мышей дикого типа FVB/n спермой, собранной у самцов гомозиготной линии HSALR 20b. Самца и самку гемозиготных мышей спаривали для генерирования гомозиготного потомства. Анализ количественной мультиплексной ПЦР в режиме реального времени применяли для определения состояния зиготности мышей; этот анализ детектирует человеческий скелетный актин (ACTA1) и Gapdh в качестве внутреннего контроля в той же лунке. Для детектирования геномной ДНК ACTA1 применяли следующий набор праймеров и зонда (Life Technologies, Grand Island, NY): прямой: 5'-CCACCGCAAATGCTTCTAGAC, обратный: 5'-CCCCCCCATTGAGAAGATTC, зонд: 5'-CTCCACCTCCAGCACGCGACTTCT. Проприетарную последовательность набора праймеров и зонда (Life Technologies, Grand Island, NY) применяли для детектирования геномной ДНК Gapdh. Гомозиготных мышей впоследствии перекрещивали с FVB/n дикого типа для подтверждения гомозиготного состояния. Подвержденных гомозиготных мышей спаривали для поддержания гомозиготной колонии в фоновом штамме FVB/n.
ПЦР в реальном времени трансгенной мРНК HSA
LR
Общую РНК очищали из TA, икроножной и четырехглавой мышц с применением набора для липидных тканей RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Количественный ПЦР в реальном времени применяли для определения уровня мРНК трансгена HSALR; уровень 18S РНК применяли в качестве фактора нормализации. Уровень 18S РНК определяли с применением набора праймеров и зонда проприетарной последовательности (Life Technologies, Grand Island, NY). Тот же набор праймеров и зонда применяли для детектирования геномной ДНК ACTA1 для детектирования мРНК ACTA1.
Внутримышечные инъекции TA
Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию Genzyme одобрил все исследования на животных. TA анестезированных изофлураном мышей инъецировали и подвергали электропорации, как описано в Wheeler et al., 2007, J Clin Invest 117:3952-3957. TA инъецировали с 20 мкг (1 мкг/мкл) CAG25, GAC25 (5'-ACGACGACGACGACGACGACGACGA-3') (Gene Tools, Philomath, OR) или PPMO (в инъекциях PPMO-B и PPMO-K инъецировали 20 мкг эквивалентной массы ASO, принимая во внимание массу пептида), тогда как контралатеральную ΤA инъецировали с 20 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (солевой раствор).
Результаты
Синтезировали два PPMO конъюгата, содержащих или пептид Β, или пептид Κ, и называли их PPMO-B и PPMO-K, соответственно.
В/м инъекции CAG25 в TA корректировали сплайсинг Serca-1, тогда как контралатеральная TA, которая получала инъекцию солевого раствора, сохраняла неправильную модель сплайсинга Serca-1 (фиг. 1b). Контрольная морфолиновая GAC последовательность, GAC25, как и ожидалось, не корректировала сплайсинг Serca-1.
Что важно, эти результаты указывают на то, что в/м инъекции как PPMO-B, так и PPMO-K корректировали сплайсинг Serca-1, указывая на то, что пептидные и спейсерные ковалентные модификации на 5'-конце морфолино не нарушают способность CAG25 взаимодействовать с ее мишенью и нейтрализовать токсичные эффекты CUG РНК (фиг. 1b).
Пример 2: Повторные инъекции IV PPMO-B и PPMO-K эффективно улучшают сплайсеопатию in vivo
Подтвердив то, что модификация CAG25 с пептидом Β или Κ не аннулирует его биоактивность, этот пример оценивает то, могут ли PPMO-B и PPMO-K модулировать эффекты токсичной РНК у мышей HSALR с применением режима дозирования IV.
Материалы и способы
Исследования систематической доставки в HSA
LR
CAG25, PPMO-B и PPMO-K растворяли в солевом растворе и вводили самцу и самке гомозиготных мышей HSALR с дозой 30 мг/кг массы тела инъекцией IV в хвостовую вену раз в неделю в течение шести недель. Кровь отбирали ретроорбитальным кровопусканием через 24 ч после последней дозы. Примерно через одну неделю после конечной дозы мышей оценивали на присутствие миотонии, как описано в процедурах электромиографии. Затем мышей умерщвляли, срезы мышц замораживали в жидком N2 для анализов РНК или заливали в среду OCT, и замораживали в охлажденном изопентане для анализов иммунофлуоресценции и FISH.
ОТ-ПЦР анализ альтернативных сплайсингов
ОТ-ПЦР проводили с применением ОТ-ПЦР системы SuperScript III One-Step с ДНК полимеразой Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY) с генспецифическими праймерами, применяемыми для синтеза кДНК и амплификации ПЦР. Последовательности праймеров для Serca-1, ZASP, m-Titin и ClC-1 были описаны ранее (Wheeler et al., 2007, J Clin Invest 117:3952-3957; Lin et al., 2006, Hum Mol Genet 15:2087-2097). Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на агарозных гелях, окрашивали красителем нуклеиновых кислот в геле SybrGreen I (Life Technologies, Grand Island, NY) и визуализировали с применением Fujifilm LAS-3000 Intelligent Dark Box.
Результаты
Мышей HSALR подвергали инъекциям IV CAG25, PPMO-B и PPMO-K с дозой 30 мг/кг шесть раз в неделю. Мыши HSALR переносили эту дозу хорошо и не проявляли никаких явных признаков токсичности во время введения CAG25 и PPMO или на протяжении всего периода исследования. Дополнительно, эти лечения не воздействовали на трансаминазы печени (ALT, AST) или маркеры функции почек (креатинин, BUN) (данные не приведены).
Анализ сплайсинга проводили на некоторых группах мышц, включая TA, четырехглавую и икроножную мышцы. Как показано на фиг. 2, как PPMO-B, так и PPMO-K значительно корректировали сплайсинг Serca-1 и восстанавливали модель сплайсинга до наблюдаемой у мышей дикого типа. Коррекция сплайсинга Serca-1 происходила во всех исследованных мышцах, включая TA, четырехглавую и икроножную мышцы. Одна из обработанных мышей с PPMO-B демонстрировала частичную коррекцию сплайсинга в четырехглавой и икроножной мышцах. В отличие от PPMO-B и PPMO-K внутривенные инъекции немодифицированного CAG25 не приводили к каким-либо улучшениям сплайсинга Serca-1 в какой-либо из исследованных групп мышц (фиг. 2). Это соотносится с другими исследованиями, демонстрирующими более низкое биораспределение к мышце непокрытых морфолино (Sazani, et al., 2002, Nat Biotechnol 20:1228-1233).
Добавочные транскрипты, находящиеся под воздействием MBNL1 для надлежащего сплайсинга, включают в себя m-Titin, Zasp и ClC-1.8,24. Как показано на фиг. 3, систематическая доставка PPMO-K привела к сильным коррекциям сплайсинга РНК m-Titin, Zasp и ClC-1 в TA, четырехглавой и икроножной мышцах. Мыши HSALR, обработанные с инъекциями IV PPMO-B, подобным образом демонстрировали коррекции альтернативного сплайсинга для этих транскриптов (данные не приведены).
Эти результаты предполагают, что систематически доставляемые PPMO-B и PPMO-K способны проникать в скелетную мышцу, поступать в миоядра мышц, гибридизироваться с поли-(CUG) РНК и высвобождать количество секвестрированного белка MBNL1, достаточное для восстановления корректного MBNL1-регулируемого сплайсинга РНК.
Пример 3: PPMO-K разрушает комплексы ядерного включения CUG в скелетной мышце и приводит в результате к перераспределению белка MBNL1
Для того чтобы определить исход обработки рибонуклеарных очагов у мышей, обработанных с PPMO-K, этот пример демонстрирует флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) для детектирования рибоядерных включений CUG в мышце.
Материалы и способы
Замороженные срезы четырехглавой мышцы толщиной 6 мкм обрабатывали для детектирования локализации белка MBNL1 посредством иммунофлуоресценции, как уже описано (Lin et al., 2006, Hum Mol Genet 15:2087-2097) со следующими модификациями: поликлональное антитело A2764 применяли в концентрации 1:5000 с последующим инкубированием с меченым Alex-568 козьим антикроличьим поликлональным вторичным антителом в концентрации 1:500. Образцы визуализировали с применением лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 ΜΕΤΑ, сконфигурированного для последовательной визуализации DAPI и Alexa Fluor-568. Исследование проводили с применением масляного иммерсионного объектива 100x/NA1.45 Plan-Fluar с 4-кратным увеличением.
Результаты
У обработанных PPMO-K мышей HSALR наблюдали уменьшение количества и интенсивности очагов CUG (фиг. 4). Однако из-за того, что олигонуклеотидная последовательность PPMO-K и зонд, применяемые в процедуре FISH, состояли из той же самой последовательности (CAG)n, не было возможно определить то, были ли эффекты на РНК очаги обусловлены деструкцией очагов PPMO-K или связывающей конкуренцией между PPMO-K и пробой FISH. В качестве более прямого, однозначного средства для выяснения эффекта PPMO-K на очаги выполняли иммунофлуоресцентное мечение MBNL1, который был секвестрирован в CUG РНК очагах и демонстрировал точечное окрашивание в ядре мышей HSALR (фиг. 5a-c). Как показано на фиг. 5d-f, PPMO-K приводил к перераспределению белка MBNL1 и приводил в результате к более диффузной локализации внутри нуклеоплазмы, как наблюдали у мышей дикого типа (фиг. 5g-i).
В совокупности иммуноокрашивание и данные FISH в этом примере предполагают, что PPMO-K взаимодействует с CUG РНК конкурентным образом, посредством этого приводя к перераспределению белка MBNL1 внутри миоядер. Высвобождение MBNL1 в очагах скелетной мышцы соотносится с коррекцией сплайсинга РНК, наблюдаемой в обработанных PPMO-K мышах.
Пример 4: Миотония скорректирована у мышей HSALR, подвергаемых инъекции IV PPMO-K
Коррекция сплайсинга РНК ClC-1 посредством PPMO-B и PPMO-K предполагает, что восстановление функции хлоридного канала может привести в результате к изменениям тяжести миотонии, что, как правило, наблюдается у мышей HSALR. Для проверки этой возможности в этом примере оценивали миотонию у обработанных солевым раствором и обработанных PPMO-K HSALR мышей посредством EMG.
Материалы и способы
EMG выполняли на анестезированных изофлураном мышах отбором образцов EMG, взятых в TA, икроножной и четырехглавой мышцах с применением двух электродов с иглой калибра 29. После вставки обеих игл мышцами аккуратно манипулировали щипцами в участке входа иглы. Оценивали степень миотонии посредством следующих критериев: 0 указывает на то, что не детектировано никаких миотонических разрядов; 1 указывает на то, что менее чем 50% мышечных манипуляций привело в результате к миотоническому разряду; 2 указывает на то, что от 50% до 80% мышечных манипуляций привело в результате к миотоническому разряду; 3 указывает на то, что от 90% до 100% мышечных манипуляций привело в результате к миотоническому разряду.
Результаты
Впервые оценивали миотонию у FVB/n дикого типа, гемозиготных и гомозиготных мышей HSALR. Гемозиготные мыши содержат примерно 50% уровня мРНК HSALR в скелетной мышце по сравнению с гомозиготными мышами (фиг. 6a). Как ожидалось, наблюдали уменьшение проявления миотонии у гемозиготных мышей относительно гомозиготных мышей и мышей дикого типа без миотонии (фиг. 6c). Отслеживания типичного миотонического разряда, которые авторы детектировали в гомозиготных мышах HSALR, показаны на фиг. 6b. Как показано на фиг. 6b, не было детектировано миотонии у мышей HSALR, обработанных с PPMO-K, что соотносится с коррекциями в альтернативном сплайсинге ClC-1, который происходил у этих мышей (фиг. 3).
Выводы
Эксперименты, приведенные в данном документе, продемонстрировали, что добавление проникающего в клетку пептида к морфолино с последовательностью CAG позволяет достаточное внедрение PPMO систематически в скелетную мышцу для нейтрализации токсичных эффектов удлиненного повтора CUG. Наблюдали почти полное прекращение нарушений сплайсинга, высвобождение MBNL1 из РНК очагов и элиминацию миотонии.
Обнаружение того, что систематическая доставка морфолинового олигонуклеотида может модулировать DM1-подобную патологию in vivo, имеет несколько значений: во-первых, 5’-ковалентная модификация морфолино на основе CAG не мешает взаимодействию с целевой CUG РНК; во-вторых, биораспределение, которое является достижимым посредством обогащенного аргинином проникающего в клетку пептида, является достаточным для предоставления коррекций биохимических и физиологических аспектов патологии DM1; и, в-третьих, тестовый агент, вводимый в исследованиях, представленных здесь в HSALR модели DM1, является тем же терапевтическим соединением-кандидатом, который мог быть оценен на безопасное применение на пациентах-людях с DM1.
Примеры, которые, как подразумевается в открытии, являются полностью иллюстративными и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие открытие каким-либо образом, также описывают и детализируют аспекты и варианты осуществления открытия, описанные выше. Вышеприведенные примеры и подробное описание предоставлены в качестве иллюстрации и не в качестве ограничения. Все публикации, патентные заявки и патенты, на которые имеются ссылки в этом описании, включены в данный документ посредством ссылки, как если бы для каждой индивидуальной публикации, патентной заявки или патента было конкретно и индивидуально указано, что он включен посредством ссылки. В частности, все публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в данный документ посредством ссылки в целях описания и раскрытия композиций и методологий, которые должны быть использованы в связи с изобретением. Хотя вышеприведенное открытие было описано в некоторых подробностях посредством иллюстраций и примеров в целях облегчения понимания, специалист в данной области без труда поймет, учитывая раскрытие данного изобретения, что некоторые изменения и модификации могут быть осуществлены без выхода за рамки объема и сущности прилагаемой формулы изобретения.
Claims (23)
1. Способ лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащий: систематическое введение индивидууму терапевтически эффективного количества связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, содержащего: (a) последовательность морфолинового антисмыслового олигонуклеотида, комплементарную по меньшей мере 3 последовательностям повтора поли-CUG в 3’-нетранслируемой области (UTR) протеинкиназы миотонической дистрофии (DMPK) целевого РНК транскрипта; и (b) спейсерную группу, связывающую морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид и катионный пептид, причем спейсерная группа содержит
где введение связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида облегчает по меньшей мере один симптом DM1 в по меньшей мере двух мышцах.
2. Способ по п.1, в котором катионный пептид имеет 8-30 аминокислотных остатков в длину и содержит одну или более субпоследовательностей, выбранных из группы, состоящей из RXR, RX, RB и RBR, где R представляет собой аргинин, Β представляет собой β-аланин, и каждый X представляет собой независимо -NH-(CHR1)n-C(O)-, где n составляет 4-6, и каждый R1 представляет собой независимо H или метил так, что самое большее два R1 являются метилом.
3. Способ по п.2, в котором катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXRRBR)2XB-.
4. Способ по п.2, в котором катионный пептид содержит аминокислотную последовательность Ac(RXR)4XB-.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность 5’-(AGC)n-3’, 5’-(GCA)n-3’ или 5’-(CAG)n-3’, где n составляет любое из приблизительно 5-25.
6. Способ по п.5, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид дополнительно содержит от 1 до 2 добавочных морфолиновых нуклеотидов на 5’- и/или 3’-конце олигонуклеотида.
7. Способ по п.5, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность: 5’-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3’.
8. Способ по п.7, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид дополнительно содержит 5’-аминомодификацию.
9. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид представляет собой фосфородиамидатный связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид.
10. Способ по любому из пп.1-4, 6-9, в котором катионный пептид отделен от морфолинового антисмыслового олигонуклеотида спейсерной группой, присоединенной к 5’-концу морфолинового антисмыслового олигонуклеотида.
11. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором мышцы представляют собой скелетные мышцы, гладкие мышцы и/или сердечную мышцу.
12. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид проникает в клетки передней большеберцовой мышцы, четырехглавой мышцы и/или икроножной мышцы.
13. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой миотонию.
14. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой агрегирование белка musclebind-like-1 (MBNL-1) в рибонуклеарных очагах внутри миоядер.
15. Способ по любому из пп.1-4, 6-8, в котором упомянутый по меньшей мере один симптом DM1 представляет собой неправильный сплайсинг по меньшей мере одного РНК транскрипта в мышечных клетках.
16. Способ по п.15, в котором упомянутый по меньшей мере один транскрипт РНК выбран из группы, состоящей из: Serca-1, m-Titin, Zasp и CIC-1.
17. Способ по любому из пп.1-4, 6-8 или 16, в котором систематическое введение связанного с катионным пептидом морфолинового антисмыслового олигонуклеотида выполняют внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.
18. Способ по любому из пп.1-4, 6-8 или 16, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят индивидууму раз в неделю.
19. Способ по любому из пп.1-4, 6-8 или 16, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят индивидууму в течение по меньшей мере одной недели.
20. Способ по любому из пп.1-4, 6-8 или 16, в котором связанный с катионным пептидом морфолиновый антисмысловой олигонуклеотид вводят с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.
21. Способ по любому из пп.1-4, 6-8 или 16, в котором индивидуум является человеком.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261705335P | 2012-09-25 | 2012-09-25 | |
US61/705,335 | 2012-09-25 | ||
PCT/US2013/061320 WO2014052276A1 (en) | 2012-09-25 | 2013-09-24 | Peptide-linked morpholino antisense oligonucleotides for treatment of myotonic dystrophy |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018123569A Division RU2018123569A (ru) | 2012-09-25 | 2013-09-24 | Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015115721A RU2015115721A (ru) | 2016-11-20 |
RU2662962C2 true RU2662962C2 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=49301675
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018123569A RU2018123569A (ru) | 2012-09-25 | 2013-09-24 | Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии |
RU2015115721A RU2662962C2 (ru) | 2012-09-25 | 2013-09-24 | Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018123569A RU2018123569A (ru) | 2012-09-25 | 2013-09-24 | Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10111962B2 (ru) |
EP (1) | EP2900821B1 (ru) |
JP (3) | JP6404219B2 (ru) |
KR (1) | KR102240217B1 (ru) |
CN (1) | CN104837997A (ru) |
AR (1) | AR092658A1 (ru) |
AU (2) | AU2013323820B2 (ru) |
BR (1) | BR112015006049A2 (ru) |
CA (1) | CA2886017C (ru) |
IL (1) | IL237457B (ru) |
MX (1) | MX369519B (ru) |
RU (2) | RU2018123569A (ru) |
SG (2) | SG11201501544PA (ru) |
TW (1) | TWI677350B (ru) |
WO (1) | WO2014052276A1 (ru) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3044337B1 (en) * | 2013-09-13 | 2020-03-18 | Rutgers, the State University of New Jersey | Multiplex diagnostic assay for lyme disease and other tick-borne diseases |
WO2015179743A1 (en) * | 2014-05-23 | 2015-11-26 | Genzyme Corporation | Library and screening approach for improved cell penetrating peptides |
RU2739987C2 (ru) * | 2014-05-23 | 2020-12-30 | Джензим Корпорейшн | Множественные олигонуклеотидные фрагменты на пептидном носителе |
JP6954843B2 (ja) * | 2015-05-19 | 2021-10-27 | サレプタ セラピューティクス,インコーポレイテッド | ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート |
EP3377042A4 (en) * | 2015-11-16 | 2019-05-29 | The Research Institute at Nationwide Children's Hospital | SUBSTANCES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF MYOPATHIES BASED ON TITINE AND OTHER TITINOPATHIES |
MX2018007307A (es) * | 2015-12-15 | 2019-03-14 | Sarepta Therapeutics Inc | Conjugados de peptidos y oligonucleotidos. |
WO2017136435A1 (en) | 2016-02-01 | 2017-08-10 | The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer National Institute Of Health | Compounds for modulating fc-epsilon-ri-beta expression and uses thereof |
WO2018009547A1 (en) | 2016-07-05 | 2018-01-11 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Diagnosing col6-related disorders and methods for treating same |
US10450572B2 (en) * | 2016-08-12 | 2019-10-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Androgen receptor variant inhibitors and methods of using |
MA50834A (fr) * | 2017-10-17 | 2020-08-26 | Massachusetts Inst Technology | Peptides de pénétration cellulaire pour administration antisens |
EP3700537A4 (en) * | 2017-10-17 | 2021-08-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | OLIGONUCLEOTIDES-BICYCLIC PEPTIDES CONJUGATES |
JP2021518361A (ja) * | 2018-03-16 | 2021-08-02 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | アンチセンス送達用キメラペプチド |
US11987647B2 (en) | 2018-05-09 | 2024-05-21 | Ohio State Innovation Foundation | Cyclic cell-penetrating peptides with one or more hydrophobic residues |
JP2021533199A (ja) * | 2018-08-02 | 2021-12-02 | ダイン セラピューティクス, インコーポレーテッドDyne Therapeutics, Inc. | 筋強直症ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 |
MX2021014478A (es) * | 2019-05-28 | 2022-01-06 | Astellas Pharma Inc | Metodo para tratar distrofia muscular por direccionamiento del gen dmpk. |
GB201911403D0 (en) * | 2019-08-09 | 2019-09-25 | Univ Oxford Innovation Ltd | Conjugate and uses thereof |
EP4093441A1 (en) * | 2020-01-24 | 2022-11-30 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Designing antisense oligonucleotide delivery peptides by interpretable machine learning |
IL308029A (en) | 2021-04-30 | 2023-12-01 | Editforce Inc | Therapeutic drug for myotonic dystrophy type 1 |
KR20240038967A (ko) | 2021-06-23 | 2024-03-26 | 엔트라다 테라퓨틱스, 인크. | Cug 반복을 표적화하기 위한 안티센스 화합물 및 방법 |
WO2024063570A1 (ko) * | 2022-09-23 | 2024-03-28 | 주식회사 셀리버리 | 근긴장성 이영양증 단백질 키나아제를 표적화하는 세포투과성 펩티드 융합 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010037539A1 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
US20110269665A1 (en) * | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
RU2435859C2 (ru) * | 2004-07-07 | 2011-12-10 | Пки Биотек Ас | Способ введения молекулы пнк, конъюгированной с положительно заряженным пептидом, в цитозоль и/или ядро фотохимической интернализацией(pci) |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5217866A (en) | 1985-03-15 | 1993-06-08 | Anti-Gene Development Group | Polynucleotide assay reagent and method |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5521063A (en) | 1985-03-15 | 1996-05-28 | Antivirals Inc. | Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use |
EP0215942B1 (en) | 1985-03-15 | 1995-07-12 | Antivirals Inc. | Polynucleotide assay reagent and method |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
JPH0796558B2 (ja) * | 1988-03-31 | 1995-10-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 修飾ポリペプチド |
CA1340810C (en) | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
JP2745351B2 (ja) | 1991-02-14 | 1998-04-28 | 富士写真フイルム株式会社 | ペプチド誘導体及びその用途 |
US20090286693A1 (en) | 2001-12-12 | 2009-11-19 | New York University, Nyu Medical Center, Department Of Industrial Liaison | Microarrays of tagged combinatorial triazine libraries |
HUE036995T2 (hu) | 2006-05-10 | 2018-08-28 | Sarepta Therapeutics Inc | Az alegységek között kationos kötéssel rendelkezõ oligonukleotid analógok |
AU2008271050B2 (en) | 2007-06-29 | 2014-11-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
US20100016215A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-01-21 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
US10066228B2 (en) | 2011-11-30 | 2018-09-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases |
-
2013
- 2013-09-24 TW TW102134201A patent/TWI677350B/zh active
- 2013-09-24 JP JP2015533268A patent/JP6404219B2/ja active Active
- 2013-09-24 SG SG11201501544PA patent/SG11201501544PA/en unknown
- 2013-09-24 US US14/431,115 patent/US10111962B2/en active Active
- 2013-09-24 RU RU2018123569A patent/RU2018123569A/ru not_active Application Discontinuation
- 2013-09-24 EP EP13771732.8A patent/EP2900821B1/en active Active
- 2013-09-24 AU AU2013323820A patent/AU2013323820B2/en active Active
- 2013-09-24 CN CN201380061337.7A patent/CN104837997A/zh active Pending
- 2013-09-24 MX MX2015003841A patent/MX369519B/es active IP Right Grant
- 2013-09-24 KR KR1020157008107A patent/KR102240217B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-24 BR BR112015006049A patent/BR112015006049A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-09-24 WO PCT/US2013/061320 patent/WO2014052276A1/en active Application Filing
- 2013-09-24 RU RU2015115721A patent/RU2662962C2/ru active
- 2013-09-24 SG SG10201700751XA patent/SG10201700751XA/en unknown
- 2013-09-24 CA CA2886017A patent/CA2886017C/en active Active
- 2013-09-24 AR ARP130103409A patent/AR092658A1/es unknown
-
2015
- 2015-02-26 IL IL237457A patent/IL237457B/en unknown
-
2018
- 2018-09-11 JP JP2018169286A patent/JP2019006808A/ja active Pending
-
2019
- 2019-06-05 AU AU2019203929A patent/AU2019203929A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-08-28 JP JP2020143991A patent/JP2020196751A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2435859C2 (ru) * | 2004-07-07 | 2011-12-10 | Пки Биотек Ас | Способ введения молекулы пнк, конъюгированной с положительно заряженным пептидом, в цитозоль и/или ядро фотохимической интернализацией(pci) |
WO2010037539A1 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
US20110269665A1 (en) * | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112015006049A2 (pt) | 2017-08-22 |
JP2015532264A (ja) | 2015-11-09 |
TWI677350B (zh) | 2019-11-21 |
KR20150060738A (ko) | 2015-06-03 |
AU2019203929A1 (en) | 2019-07-11 |
EP2900821B1 (en) | 2020-04-01 |
TW201424752A (zh) | 2014-07-01 |
US20150238627A1 (en) | 2015-08-27 |
MX2015003841A (es) | 2015-07-17 |
AR092658A1 (es) | 2015-04-29 |
IL237457A0 (en) | 2015-04-30 |
SG10201700751XA (en) | 2017-03-30 |
RU2015115721A (ru) | 2016-11-20 |
JP2019006808A (ja) | 2019-01-17 |
CA2886017A1 (en) | 2014-04-03 |
IL237457B (en) | 2022-02-01 |
EP2900821A1 (en) | 2015-08-05 |
AU2013323820A1 (en) | 2015-04-16 |
WO2014052276A1 (en) | 2014-04-03 |
JP2020196751A (ja) | 2020-12-10 |
AU2013323820B2 (en) | 2019-06-27 |
US10111962B2 (en) | 2018-10-30 |
SG11201501544PA (en) | 2015-03-30 |
CA2886017C (en) | 2022-04-05 |
RU2018123569A3 (ru) | 2021-11-09 |
CN104837997A (zh) | 2015-08-12 |
KR102240217B1 (ko) | 2021-04-14 |
RU2018123569A (ru) | 2019-03-07 |
JP6404219B2 (ja) | 2018-10-10 |
MX369519B (es) | 2019-11-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2662962C2 (ru) | Связанные с пептидом морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды для лечения миотонической дистрофии | |
ES2867809T3 (es) | Método para el salto eficaz del exón (44) en la distrofia muscular de Duchenne y medios asociados | |
ES2532634T3 (es) | Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne | |
US10174328B2 (en) | Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis | |
JP2019500349A (ja) | 中枢神経系疾患の処置のための組成物および方法 | |
CN109415732B (zh) | 用于调节htra1表达的反义寡核苷酸 | |
US20010056077A1 (en) | Pharmaceutical composition for treatment of duchenne muscular dystrophy | |
US20160201064A1 (en) | Compositions and methods for modulating expression of frataxin | |
KR20180134931A (ko) | 안 질환 치료용 올리고뉴클레오타이드 | |
TW201018471A (en) | Multiple exon skipping compositions for DMD | |
TW202227627A (zh) | 用於抑制DUX4表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法 | |
JP2010539950A (ja) | 線維芽細胞増殖因子受容体4発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2006507809A (ja) | Vegf共調節ケモカイン−1発現のアンチセンス変調 | |
TW390884B (en) | Chirally enriched synthetic phosphonate oligomers | |
TW202229551A (zh) | 用於治療或預防SNCA相關的神經退化性疾病的SNCA iRNA組成物及其使用方法 | |
JP7360170B2 (ja) | 虚血病変部位特異的な遺伝子治療法 | |
AU2019381329A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of smooth muscle dysfunction | |
BR112020012523A2 (pt) | diagnóstico complementar para antagonistas de rna htra1 | |
CN117295525A (zh) | 细胞穿透肽缀合物及其使用方法 | |
CN116801885A (zh) | 用于抑制DUX4表达的RNAi试剂、其组合物和使用方法 | |
CN115175684A (zh) | 视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂 | |
CN115484986A (zh) | 用于预防或治疗黄斑变性的含有细胞可渗透的核酸复合物作为活性成分的组合物 | |
CN118325897A (zh) | 用于调节htra1表达的反义寡核苷酸 |