CN104837997A - 用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸 - Google Patents

用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本文提供靶向在编码肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)的基因的3’非翻译区中的多聚CUG重复束的肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸和用于其系统施用以治疗I型肌强直性营养不良(DM1)的方法。

Description

用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸
发明领域
本发明是关于靶向在编码肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)的基因的3’非翻译区中的多聚CUG重复束(poly CUG repeat tract)的阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸及其系统施用用于治疗I型肌强直性营养不良(DM1)。
发明背景
1型肌强直性营养不良是常染色体显性遗传性病症，主要表现为神经肌肉疾病，但也可能涉及心脏、内分泌、胃肠道和中枢神经系统功能障碍。DM1的一个标志症状是肌强直，一种收缩之后肌肉松弛方面的缺陷，并通过肌电图(EMG)由肌肉中持久运行的重复动作电位检测。DM1中的基因病变由在编码称为肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)的蛋白激酶的基因的3’非翻译区中的不稳定CUG三核苷酸重复元件组成。CUG重复的较小拷贝数目在未受到影响的个体中有发现，而在DM1患者中检测到范围在50拷贝至数千拷贝的较大数目的不稳定CUG重复。遗传学研究已经确立了CUG重复数目直接与发病年龄和疾病严重程度相关(Day&Ranum,2005,Neuromuscul Disord15:5-16)。
包含较大数目的CUG重复的RNA转录物如DMPK取得了功能获得性(gain-of-function)特性并在表达突变的DMPK转录物的细胞和组织中促进RNA介导的毒性(Wheeler&Thornton,2007,Curr Opin Neurol 20:572-576)。病理性的转录物保留于核中(Taneja et al.,1995,J Cell Biol 128:995-1002)，在其中所述病理性的转录物捕获RNA结合蛋白如MBNL1(Mankodi et al.,2001,HumMol Genet 10:2165-2170；Mankodi et al.,2003,Ann Neurol 54：760-768)。多聚(CUG)RNA还增加CUG-BP1的稳态水平(Timchenko NA et al.,2001,J BiolChem,276:7820-7826；Kuyumcu-Martinez et al.,2007,Mol Cell 28:68-78)。MBNL1的封存和CUG-BP1活性的增加都与大数目的RNA转录物的异常剪接相关。值得注意的是氯离子通道ClC-1mRNA的缺陷性RNA剪接(Mankodiet al.,2002,Mol Cell 10:35-44)，已表明其可直接导致肌强直(Wheeler et al.,2007,J Clin Invest 117:3952-3957)。除RNA剪接异常外，突变的DMPK表达的后果还包括骨骼肌转录物组的重塑(Osborne et al.,2009,Hum Mol Genet18:1471-1481)。由异常的RNA剪接导致的具有改变的一级序列(primarysequence)的蛋白产物和包含改变的转录物组的失调的mRNA水平预期会与DM1疾病的特定方面具有相关性甚至因果关系。
目前在临床上无靶向毒性RNA(该疾病的首要病理学驱动者)的用于DM1的治疗剂。对于DM1的标准照护治疗主要是支持性的且目的在于管理特定的病症如肌强直(Logigian et al.,2010,Neurology 74:1441-1448)。新型治疗方式的临床前评估已在包含在3'非翻译区含有250个CUG三核苷酸插入的人骨骼肌动蛋白转基因的HSALR转基因小鼠模型中实施。HSALR模型表明DM1的多个特征包括通过CUG RNA的MBNL封存和随之而来的RNA剪接异常、肌肉转录物组中的改变和生理畸变如肌强直(Osborne et al.,2009,Hum MolGenet 18:1471-1481；Mankodi et al.,(2000),Science 289:1769-1773)。在HSALR小鼠中测试的新型治疗模式包括经设计与CUG重复RNA相互作用并释放与病灶关联的MBNL1蛋白的小分子配体(Warf et al.,2009,Proc Natl Acad Sci US A 106:18551-18556；Parkesh et al.,2012,J Am Chem Soc 134:4731-4742；Oforiet al.,2012,Nucl.Acid.Res.出版中，首次在线公开：2012年4月6日)。此外，三种靶向所述CUG重复束的反义寡核苷酸(ASO)化学已在于DM1转基因小鼠模型中实施的研究中得以评估(Wheeler et al.,2009,Science 325:336-339；Mulders et al.,2009,Proc Natl Acad Sci U S A 106:13915-13920；Lee et al.,2012,Proc Natl Acad Sci U S A 109:4221-4226。Wheeler及其同事(2009,Science325:336-339)证实了在经过25mer CAG序列(CAG25)吗啉代寡核苷酸肌内(IM)注射的HSALR小鼠的胫骨前(TA)肌中DM1病理学的局部纠正。CAG25治疗的TA肌肉表现出核糖核灶存在的减少、MBNL1蛋白的重新分布、RNA剪接异常的纠正、氯离子通道(CLC-1)蛋白质表达和功能的恢复和肌强直的降低(Wheeler et al.,2009,Science 325:336-339)。虽然该治疗方式表明对HSALR小鼠DM1样表型的纠正，但是仍需要允许多组织(包括多组织类型)得以暴露于靶向造成DM1的毒性DMPK RNA转录物的活性吗啉代寡核苷酸的系统递送策略。
贯穿本说明，引用了多个专利、专利申请和其他类型的发表物(例如，杂志文章)。本文引用的所有专利、专利申请和发表物的公开内容由于各种目的以其全文通过提述并入。
发明概述
除其他外，本文提供的发明公开用于制造和使用可系统性递送至多组织和组织类型的阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸的组合物和方法，及其用于治疗DM1的用途。
相应地，在一个方面，本文提供在有需要的个体中用于治疗或预防1型肌强直性营养不良(DM1)的方法，包括：向个体系统施用治疗上有效量的阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与在肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)RNA转录物靶的3'非翻译区(UTR)中的至少3个多聚CUG重复序列互补的序列，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的施用至少在两种肌肉中缓解至少一种DM1症状。权利要求1的方法，其中所述阳离子肽在长度上为8-30个氨基酸残基且包含一种或多种选自下组的亚序列：RXR、RX、RB和RBR，其中R是精氨酸，B是β-丙氨酸，且每个X独立为-NH-(CHR1)n-C(O)-，其中n是4-6且每个R1独立为H或甲基且使至多两个R1是甲基。在一些实施方案中，所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXRRBR)2XB-。在另一些实施方案中，所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXR)4XB-。在上述任一方法的实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列5'-(AGC)n-3'、5'-(GCA)n-3'或5'-(CAG)n-3'，其中n为约5-25中的任意值。在另一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’和/或3’末端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列：5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3'。在另一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸进一步包含5'胺修饰。在上述任一方法的实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸是二氨基磷酸阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。在上述任一方法的其他实施方案中，所述阳离子肽通过连接在吗啉代反义寡核苷酸5'末端的间隔区部分与所述吗啉代反义寡核苷酸分开。在一个实施方案中，所述间隔区部分包含
在上述任一方法的一些实施方案中，所述肌肉是骨骼肌、平滑肌和/或心肌。在上述任一方法的其他实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸穿透入胫骨前肌、四头肌和/或腓肠肌的细胞。在上述任一方法的其他实施方案中，所述DM1的至少一种症状是肌强直。在上述任一方法的一些实施方案中，所述DM1的至少一种症状是在肌细胞核内的核糖核灶中的肌盲样蛋白1(muscleblind-like-1；MBNL-1)的聚集。在上述任一方法的其他实施方案中，所述DM1的至少一种症状是肌肉细胞中至少一种RNA转录物的异常剪接。在另一实施方案中，所述至少一种RNA转录物(如人基因的RNA转录物)选自下组：Serca-1、m-肌联蛋白、Zasp和CIC-1。在上述任一方法的一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的系统施用通过静脉内、腹膜内或皮下实施。在上述任一方法的其他实施方案中，将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸每周施用至个体。在上述任一方法的其他实施方案中，将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸向个体施用一至六周。在上述任一方法的其他实施方案中，将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸与可药用赋形剂一起施用。在上述任一方法的其他实施方案中，所述个体是人。
附图简述
图1描述PPMO的化学结构和在HSALR小鼠中对PPMO-B和PPMO-K生物活性的评估。(a)包含共价附着至位于吗啉代寡聚体5'末端的接头的细胞穿透肽(肽B或肽K)的PPMO结构。肽B和肽K的序列描述于材料和方法中。(b)测试物和对照ASO在TA肌肉中的IM注射如材料和方法中所述进行实施。提供向TA中的直接注射伴随对Serca-1剪接的后续分析以测定肽B或肽K的共价附着对CAG25生物活性的影响。IM注射后三周，收获TA肌肉，纯化总RNA，并扩增Serca-1以检测具有或不具有外显子22(ex22)的剪接同种型(isoform)。每个括号代表一只用所示的ASO(GAC25、CAG25、PPMO-B和PPMO-K)注射入一侧TA的HSALR小鼠且对侧TA(con)用盐水媒介物进行注射。来自FVB/n野生型小鼠的TA的RNA作为对照也进行了分析并证实在非疾病小鼠中发生Serca-1剪接。
图2描述PPMO-B或PPMO-K的重复IV注射纠正Serca-1剪接。HSALR小鼠用盐水、CAG25、PPMO-B或PPMO-K每周注射持续六周。所示的肌肉组收集自最终给药后约一周的小鼠。纯化总RNA，并扩增Serca-1以检测差异剪接的同种型。来自FVB/n野生型小鼠的TA的RNA如图1作为对照。如图1中在纯化自用GAC25或CAG25注射的HSALR小鼠的TA的RNA中Serca-1的剪接分别作为阴性对照(阴性对照)和阳性对照(阳性对照)。
图3描述ZASP、m-肌联蛋白和ClC-1在用PPMO-K的重复IV注射给药的HSALR小鼠中对异常剪接的纠正。HSALR小鼠用盐水或PPMO-K每周注射持续六周。所示肌肉组收集自小鼠，纯化总RNA，扩增ZASP、m-肌联蛋白和ClC-1以检测包含所示外显子(ex)和内含子(int)构造的差异剪接同种型。来自FVB/n野生型小鼠TA的RNA作为非疾病对照。ZASP、m-肌联蛋白和ClC-1的阳性和阴性对照用RNA如图2所示用PCR扩增生成。
图4描述PPMO-K的系统递送降低CUG RNA灶在HSALR小鼠四头肌中的频率和强度。如(Mankodi et al.,2001,Hum Mol Genet 10:2165-2170)所述在冷冻四头肌切片上使用在5'末端用AlexaFluor 555标记的2'-O-甲基修饰的RNA探针(5’-GCAGCAGCAGCAGCAGCAGC-3’)实施FISH分析并经由共聚焦显微镜进行成像。(a,b)用六次每周盐水IV注射治疗的HSALR小鼠在用DAPI标记的肌肉核中展示大量的CUG RNA灶。(c,d)用六次每周PPMO-K(30mg/kg)IV注射治疗的HSALR展示CUG RNA灶在数量上和强度上的降低。(e,f)野生型FVB/n肌肉不包含可检测的灶。比例尺＝50μm。
图5描述免疫荧光显微术证实在PPMO-K治疗的小鼠中MBNL1蛋白的重新的核分布。MBNL1蛋白在四头肌的切片中的免疫荧光染色和共聚焦显微术如在材料和方法中所述进行实施。(a-c)来自盐水治疗的HSALR小鼠的肌肉切片表明MBNL1在核中的点状定位。(d-f)来自PPMO-K治疗的HSALR小鼠的肌肉切片表明MBNL1的弥散核染色。(g-i)来自野生型FVB/n小鼠的肌肉切片表明MBNL1的弥散核染色。比例尺＝10μm。
图6描述在用PPMO-K的重复IV注射给药的HSALR小鼠中肌强直的纠正，(a)标准化至纯合子HSALR、半合子HSALR和野生型FVB/n小鼠的TA、腓肠肌和四头肌中的18S RNA的HSALR转基因mRNA水平。数据以平均值+SD表示，n＝6小鼠每组。(b)HSALR(肌强直)或野生型FVB/n小鼠(无肌强直)腓肠肌中EMG记录的轨迹追踪。肌强直在HSALR小鼠而非野生型小鼠中得以检测。(c)EMG分析在未处理的纯合子HSALR、半合子HSALR和野生型小鼠上实施。EMG还在用六次每周盐水或PPMO-K注射治疗的纯合子HSALR小鼠上实施。对每种肌肉进行10次分析以生成如材料和方法中所述的肌强直度。对于检测的每个肌肉组数据以平均度+SD表示，n＝3-8小鼠每组。
发明详述
除其他外，本发明提供可在具有1型肌强直性营养不良(DM1)的个体中系统递送至多组织和/或组织类型的阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸。发明人已发现当在DM1动物模型中系统施用时，将细胞穿透肽添加至CAG序列吗啉使得足够的PPMO吸收入肌肉组织以中和延长的CUG重复的毒性效果。这些吗啉的递送和其向具有高数目多聚CUG mRNA的个体的肌肉细胞中的穿透与近乎彻底解决多种蛋白中的剪接缺陷、MBNL1自RNA灶的释放和肌强直的消除相关。
I.通用技术
除非另外表明，本发明的实践将采用核酸化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中本领域的技术人员熟知的常规技术。这些技术在下列文献中完整阐述，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook et al.,1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook and Russel,2001),(本文中共同称为“Sambrook”)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,includingsupplements through 2001)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)。核酸可通过熟知的化学合成技术在体外进行合成，如例如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.5 25:3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；美国专利号4,458,066中所述。
II.定义
术语“RNA靶”指吗啉以序列特异的方式结合的RNA转录物。在一些实施方案中，所述RNA靶是在3'非翻译区中具有可变数目的CUG三核苷酸重复元件的一种或多种DMPK mRNA分子。
“吗啉”或“吗啉代反义寡核苷酸”指由吗啉亚单元结构组成的寡核苷酸类似物，其中(i)所述结构由含磷连接基连接在一起，所述连接基为一至三原子长优选为两原子长，且优选不带电或为阳离子，将一个亚基的吗啉氮接合至相邻亚基的5'环外碳，且(ii)每个吗啉环带有嘌呤或嘧啶碱基配对部分，该部分有效通过碱基特异性氢键键合与多核苷酸中的碱基结合。在一些实施方案中，所述吗啉与RNA靶结合，阻断RNA靶翻译成蛋白。在其他实施方案中，所述吗啉防止RNA靶与其本身或与其他细胞RNA、蛋白或核糖蛋白(如但不限于与细胞mRNA剪接器相关的RNA、蛋白质和核糖蛋白)聚集。
“个体”可以是哺乳动物，如任何常规的实验室模式生物或哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人和非人的灵长类、农场动物、运动动物、宠物、小鼠、大鼠和其它啮齿类动物。
如本文所用“治疗”(及其语法上的变体如“进行治疗”或“正在治疗”)指设计来在临床病理学过程中改变正在受到治疗的个体或细胞的自然病程的临床干预。理想的治疗效果包括但不限于降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。
如本文所用“预防”包括提供对疾病的发生或复发或与个体中疾病相关的症状的预防。个体可为倾向于、易感或有风险形成疾病但还未诊断具有疾病的个体。
“有效量”或“治疗上有效量”指治疗化合物如反义寡聚物以单独给药或作为系列给药的一部分施用至哺乳动物受试者的量，其有效产生预期的治疗效果。对于反义寡聚物，该效果通常由抑制选择的靶序列的翻译或自然剪接加工带来。
本文所用单数形式“一种”、“一个”和“所述”除非另外表明也包括复数的提及对象。
应该理解的是本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“其组成为”和“其组成基本上为”所述方面和实施方案的情况。
贯穿本说明书给出的每个最大数字界限意图包括每个较低数字界限，就如该较低数字界限也在本文明确记载一般。贯穿本说明书给出的每个最低数字界限包括每个较高数字界限，就如该较高数字界限也在本文明确记载一般。贯穿全文给出的每个数字范围会包括每个落入该较宽数字范围内的较窄的数字范围，就如该较窄的数字范围也在本文明确记载一般。
III.组合物
A.吗啉
吗啉是具有非常类似于天然存在的核酸的结构的合成分子。这些核酸与互补RNA序列通过标准核酸碱基配对结合。结构上，吗啉与DNA或RNA的不同在于这些分子具有与吗啉环而非脱氧核糖或核糖环结合的核酸碱基。此外，吗啉的骨架结构由非离子或阳离子连接基基团而非磷酸(phosphate)组成。举例来说，用不带电的二氨基磷酸基团取代阴离子磷酸消除了在通常的生理pH范围的电离，使得吗啉在生物体或细胞中为不带电的分子。虽然吗啉链和互补DNA链的异源二聚可用于与阳离子胞浆递送剂的组合，但吗啉最常用作单链寡聚体。
与许多反义结构类型(例如，硫代磷酸酯)不同的是，吗啉不降解其靶RNA分子。取而代之，吗啉通过“空间阻断”作用，即与在RNA内的靶序列和可能以其他方式与RNA相互作用的空间位阻分子结合。结合至信使RNA(mRNA)的5'非翻译区的吗啉可干扰核糖体起始复合物从5’帽至起始密码子的进程。这阻止了靶向的转录物的编码区的翻译(称为“敲低”基因表达)。一些吗啉敲低表达非常有效，使得在预先存在的蛋白降解后靶向的蛋白通过免疫印迹分析无法检测。
吗啉还可干扰pre-mRNA处理步骤，通常是通过阻止剪接导向的snRNP复合物与其靶在pre-RNA链上的内含子边界处结合。阻止U1(在供体位点)或U2/U5(在多聚嘧啶部分和受体位点)的结合可导致修饰的剪接，通常使得外显子从成熟的mRNA转录物上排除。剪接修饰可以通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方便检测且在RT-PCR产物的凝胶电泳后可观察到带的移位。
吗啉已被用于阻断内含子剪接沉默子和剪接增强子。U2和U12snRNP功能通过吗啉抑制。靶向蛋白编码区内的“滑(slippery)”mRNA序列的吗啉可引发翻译框位移。吗啉针对这类靶的活性表明吗啉可用作通用工具用于阻断蛋白或核酸与mRNA的相互作用。
本发明的组合物由通过不带电的含磷连接基连接在一起的吗啉亚基组成，所述连接基为一至三原子长，将一个亚基的吗啉氮结合至相邻亚基的5'环外碳，其中附着至吗啉基的碱基是嘌呤或嘧啶碱基配对部分，其有效与多核苷酸中的碱基通过碱基特异性氢键键合结合。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。这些寡聚物的制备具体描述于美国专利号5,185,444中，其在本文以其全文通过提述并入。只要不干扰结合和活性，可对该连接基做出改变。举例来说，与磷附接的氧可用硫取代(二氨基硫代磷酸(thiophosphorodiamidate))。5'氧可用氨基或低级烷基取代的氨基取代。与磷附接的侧基氮可不取代、用低级烷基单取代或二取代(任选取代)。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。吗啉的合成、结构和结合特性详述于美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063、5,506,337和国际专利申请公开号WO 2008/036127中，上述全部通过提述并入本文。
在一些方面，本发明的吗啉代反义寡核苷酸可与在肌强直性营养不良激酶(DMPK)RNA靶的3'非翻译区(UTR)的多聚CUG重复序列互补。在一些实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸与肌强直性营养不良激酶(DMPK)RNA靶的3'非翻译区(UTR)至少约90％、95％或100％(包括其中任一，包括在这些值之间的任何百分数)相同。在一些实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸与DMPK RNA靶的3'非翻译区(UTR)中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多个多聚CUG重复序列中至少任一种情况互补。在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列5'-(AGC)n-3',5'-(GCA)n-3'或5'-(CAG)n-3'，其中n是约5-25中的任意值。在另一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在所述寡核苷酸的5'和/或3'末端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。在一些实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸包含序列5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3。在另一实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸与DMPK RNA转录物以序列特异的方式结合。在一些实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸包含5'胺修饰。在另一实施方案中，所述吗啉代反义寡核苷酸可以是二氨基磷酸阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。
B.阳离子细胞穿透肽和阳离子肽连接吗啉
本文所述的吗啉代反义寡核苷酸与促进所述吗啉代反义寡核苷酸递系统送至肌肉细胞中的阳离子肽连接。通常，如本文所述的阳离子肽长度上可以是8至30个氨基酸残基且由选自下组的亚序列组成：RXR、RX、RB和RBR；其中R是精氨酸(可包括D-精氨酸)，B是β-丙氨酸，且每个X是独立的-NH-(CHR1)n-C(O)-，其中n是4-6且每个R1独立地是H或甲基，使得至多两个R1是甲基。在一些实施方案中，每个R1都是氢。在其他实施方案中，阳离子肽在长度上可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的任一种情况。在另一实施方案中，可变的n是5，例如如在6-氨基己酸中。在一个实施方案中，所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXRRBR)2XB-，其中Ac是乙酰基基团。在另一实施方案中，所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXR)4XB-，其中Ac是乙酰基基团。关于阳离子细胞穿透肽的合成和结构的进一步信息可在美国专利申请公开号2009/0099066中获得，其公开在本文以其全文通过提述并。
一方面，所述阳离子肽直接与吗啉代反义寡核苷酸连接。在其他实施方案中，所述阳离子肽经由与吗啉代反义寡核苷酸的5'末端连接的间隔区部分与吗啉代反义寡核苷酸连接。间隔区部分可以在阳离子肽合成的过程中并入所述肽。举例来说，在间隔区包含游离氨基和允许与另一分子部分结合的第二功能基团(例如羧基或氨基)的情况中，所述间隔区可与用于肽合成的固相支持物偶联(conjugate)。此后，所述阳离子肽可通过标准固相技术直接合成在间隔区的游离氨基基团上。在另一实施方案中，所述间隔区部分可以在肽合成后与阳离子肽偶联。这种偶联可通过在本领域充分确立的方法获得。在一个实施方案中，所述接头包含至少一个适于与合成的阳离子肽的靶功能基团附接的功能基团。举例来说，具有游离胺基团的间隔区可与阳离子肽的C末端羧基基团反应。在一些实施方案中，所述间隔区部分包含
在一个实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸具有下列结构：
其中R2是阳离子肽(如本文公开的阳离子肽中的任一种)，R3是H、CH3或CH2CONH2且R4是包含序列5'-(AGC)n-3’、5'-(GCA)n-3'或5'-(CAG)n-3'的吗啉代反义寡核苷酸，其中n为约5-25中的任意值。在另一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可在寡核苷酸的5'和/或3'末端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。
另一方面，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含
其中Ac是乙酰基，R是精氨酸(可包括D-精氨酸)中，B是β-丙氨酸，每个X独立为-NH-(CHR1)n-C(O)-，其中n是4-6且每个R1都是H，且R4为包含序列5'-AG(CAG)7CA-3'的吗啉代反义寡核苷酸。
另一方面，阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含
其中Ac是乙酰基，R是精氨酸(可包括D-精氨酸)中，B是β-丙氨酸，每个X独立为-NH-(CHR1)n-C(O)-，其中n是4-6且每个R1都是H，且R4为包含序列5'-AG(CAG)7CA-3'的吗啉代反义寡核苷酸。
C.药物配制物
当作为药物采用时，本文公开的阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可以用可药用赋形剂或载剂配制以配制成药物组合物。
当作为药物采用时，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可以药物组合物的形式施用。这些化合物可通过多种途径包括口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内进行施用。这些化合物作为可注射和口服组合物都有效。这些组合物以药物领域熟知的方式制备且包含至少一种活性化合物。
本发明还包括药物组合物，其包含与一种或多种可药用的赋形剂或载剂关联的作为活性成分的一种或多种阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。在制造本发明的组合物的过程中，所述活性成分通常与赋形剂或载剂混合，由赋形剂或载剂稀释或以可能是胶囊、小袋、纸或其它容器的形式包封于这些赋形剂或载剂中。当所述赋形剂或载剂作为稀释剂时，其可以是充当用于活性成分的媒介、载剂或介质的固体、半固体或液体材料。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小袋、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软膏(举例来说含有多至10％重量的活性化合物)、软和硬的明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。
在配制物的制备中，可能必需要研磨所述活性化合物以在与其他成分混合前提供合适的颗粒大小。如果活性化合物是基本上不溶的，则通常将其研磨到小于200目的颗粒大小。如果活性化合物是基本上水溶的，所述颗粒大小通常通过研磨来调整以在配制物中提供基本上匀质的分布，例如约40目。
合适的赋形剂或载剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。所述配制物可额外包括：润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂如甲基-和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；和调味剂。本发明的组合物可通过采用本领域已知的方法配制成施用至患者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放的组合物。
所述组合物优选以单位剂量形式配制，每剂包含约5mg至约100mg或更多，如包括约5mg至约10mg、约5mg至约20mg、约5mg至约30mg、约5mg至约40mg、约5mg至约50mg、约5mg至约60mg、约5mg至约70mg、约5mg至约80mg，或约5mg至约90mg中任一项的活性成分，包括在这些值之间的任何范围。术语“单位剂量形式”指与合适的药物赋形剂或载剂关联的适于作为用于个体的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含经计算以产生预期治疗效果的预先判定量的活性材料。
阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在很宽的剂量范围有效且基本上以治疗上有效的量施用。但是应该理解的是，阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸实际施用的量由医生按照相关情况判断，所述相关情况包括将治疗的病况、选择的施用途径、施用的实际化合物、单个患者的年龄、体重和应答、患者症状的严重性等等。
对于固态组合物如片剂的制备，将主要的活性成分/阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸与药用赋形剂或载剂混合以形成包含本发明化合物的均匀混合物的固体预制剂组合物。当称这些预制剂组合物为均匀时，意思是所述活性成分在整个所述组合物中均匀分散，使得所述组合物易于细分成同等有效的单位剂量形式如片剂、丸剂和胶囊。
本发明的片剂或丸剂可被包衣或以其他方式配制以提供给予延长作用的优势的剂量形式。举例来说，所述片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者上包裹的形式。两种组分可通过肠溶衣层分离，所述肠溶衣层被提供用于抵抗在胃中分解并允许内部组分完整通入十二指肠或被延迟释放。多种材料可用于这种肠溶衣层或包衣层，这些材料包括多种聚合酸和聚合酸与如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素这样的材料的混合物。
本发明的新型组合物可纳入在其中以供口服或注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水或油悬浮液和用食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油调味的乳液以及酏剂和类似的药物载体。
用于吸入或吹入的组合物包括在可药用的水或有机溶剂中的溶液和悬浮液或其组合和粉末。所述液体或固体组合物可包含适当的如上文所述的可药用赋形剂。所述组合物可通过口服或鼻呼吸途径为了局部或系统效果施用。在可药用的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体雾化。雾化溶液可从雾化装置直接吸入或所述雾化装置可与面罩(face mask tent)或间歇正压呼吸机附接。溶液、悬浮液或粉状组合物可口服或经鼻从以合适方式递送配制物的装置施用。
IV.本发明的方法
本文公开的阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸(如在组合物中)可用于个体中I型肌强直性营养不良症状的治疗和/或预防。一些方面，所述个体处于形成DM1的风险中。一些方面，所述方法可包括在个体中通过向个体系统施用有效量的本文公开的量的阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸或包含所述阳离子肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸的组合物来治疗和/或预防与DM1相关的症状(如本文所述的任何症状)。在一些实施方案中，所述个体被诊断为或怀疑具有DM1。
本发明涉及如下文详述的用于抑制与DM1相关的症状或病况(残疾、障碍)的方法。因此，尽管本公开给出的方法的效果很可能达到对患者而言的显著治疗效益，但不要求完全预防或逆转病况的全部影响。因此，治疗效益无需是完全预防或治愈DM1导致的特定病况，而是可涵盖包括降低或预防DM1导致的症状、降低或预防这些症状的发生(定量或定性)、降低这些症状或其生理影响的严重性和/或增强经历DM1症状后个体的恢复在内的结果。
另一方面提供用于降低一种或多种DMPK mRNA转录物在细胞中聚集的方法。在一些实施方案中，所述方法在细胞核中预防一种或多种DMPKmRNA转录物的聚集。
另一方面，本文提供用于降低一种或多种DMPK mRNA转录物和一种或多种核蛋白或RNA在细胞中聚集的方法。在一些实施方案中，所述一种或多种核蛋白是参与将pre-mRNA(又称异核RNA(hnRNA))剪接成为成熟的剪接mRNA的蛋白。在一个实施方案中，所述核蛋白是小核心蛋白(又称Sm蛋白)且可以是一种或多种SmB、SmB'、SmD1、SmD2、SmD3、SmE、SmF、SmG或SmN。在一些实施方案中，所述一种或多种核RNA是参与将hnRNA剪接成为成熟的剪接mRNA的RNA。在另一实施方案中，所述核RNA是小核RNA(snRNA)且可以是一种或多种U1、U2、U3、U4、U5、U6、U11、U12、U4atac或U6atac。在一些实施方案中，所述一种或多种核蛋白或RNA包含核的核糖蛋白复合体。在另一实施方案中，所述RNA可以是不作为细胞剪接器一部分的RNA，如Serca-1、m-肌联蛋白、Zasp和CIC-1。在一个实施方案中，所述细胞是肌肉细胞如骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞。
具体地，当施用至个体时，本发明的组合物可治疗或预防一种或多种与DM1相关的症状或病况和/或降低或缓和与该病症相关的症状或病况。因此，保护个体免于DM1导致的影响或症状包括预防或降低所述病症的发生和/或影响的严重性以及对所述病症的影响已经在其中发生或开始发生的个体的治疗。有益效果可通过本领域的普通技术人员和/或通过正在治疗患者的受过培训的医生来评估。优选地，在已用本发明的方法治疗的这些患者与未经治疗的患者比较时，至少存在一种用于评估这些患者的临床或生物学评分、值或测量结果在严重性或发生方面存在积极的或有益的区别。
A.肌强直性营养不良
肌强直性营养不良(又称营养不良肌强直或强直性肌萎缩)是慢性的、进展缓慢、高度可变、遗传多系统疾病，具有包括肌肉消瘦(肌营养不良)、白内障、心脏传导缺陷、内分泌变化和肌强直在内的主要症状。1型肌强直性营养不良(DM1)，也称为“Steinert病”，同时具有严重的先天性形式和较温和的儿童期发病形式，并由位于染色体19长臂上的称为肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)(一种主要在骨骼肌中表达的蛋白)的基因的突变导致。2型肌强直性营养不良(DM2)也称为近端肌强直性肌病(PROMM)，比DM1更罕见且通常表现更温和的体征和症状。DM2由在染色体3上的ZNF9基因缺陷在近端引起。肌强直性营养不良可在任何年龄的患者中发生且该疾病的形式展示常染色体显性遗传模式。DM1是在成人中诊断的最常见的肌营养不良症形式，具有范围从在日本的每100000人1人至在欧洲的每100000人2-15人的患病率(Turner&Hilton-Jones,2010,J Neurol Neurosurg Psychiatry 81:358-367)。
即使在遗传上相关的个体中，发病年龄以及在患有DM1的个体中症状的严重性也可显著变化。在一些个体中，症状可在出生时显现或并不明显直至进入老年。DM1是进行性病症，通常具有随时间缓慢恶化的症状。因此，生命早期显现出症状的个体与那些直至生命后期才呈现该病症的典型症状的个体相比通常既经历更多并发症又经历更严重的症状。尽管如此，个体预后不同且不能就疾病将如何影响任一个体来进行精确预测。
1.心血管症状
一些具有DM1的个体可经历中度至严重的心肺缺陷。举例来说，由于完整心脏传导的阻断导致的猝死和心肌病引起的心室纤维性颤动/心动过速在一些案例中已归因于DM1。已与DM1相关联的其它心血管症状包括但不限于心源性晕厥和先兆晕厥、心脏传导缺陷、心律失常、低血压和充血性心脏衰竭。经常，诊断具有DM1的个体继其他神经肌肉症状发作后发展出心血管症状。然而，一些数据表明无症状儿童具有可观察到的心脏性猝死风险。
2.中枢神经系统症状
不考虑发病年龄，在具有DM1的个体中经常观察到过度的日间睡眠(嗜睡)。尽管在DM1患者中还通常观察到全身疲劳，嗜睡的特征在于需要频繁的且不可预期的日间睡眠，即使夜间睡眠的持续时间正常或比正常更久。
尽管显著的外周神经异常在诊断具有DM1的个体中并未被确认，但外周神经功能中的一些细微异常已经通过神经传导研究得以确认。DM1引起的(DM1-indiced)外周神经功能障碍的近因目前并不知晓。
3.胃肠道症状
在DM1中通常观察到胃肠道症状且由消化道骨骼和/或平滑肌功能障碍导致。这些症状包括口、舌或喉部肌无力/肌强直导致的吞咽困难、由于食管括约肌松弛导致的胃食管反流、由于在肠道和胃中无效蠕动的平滑肌收缩导致的腹部疼痛、恶心、呕吐、腹胀或肠假性梗阻、由于胆管/胆囊肌肉无力/强直导致的胆结石、由肠管运动障碍引起的便秘、腹泻或吸收不良和由于肛门括约肌和盆底肌肉无力导致的大便失禁。
4.生殖和内分泌系统症状
DM1与显著的生殖系统和内分泌系统异常相关。在人体中，当荷尔蒙和内分泌这些与青春期相关的变化没有发生或者延迟时，所述症状可能直至成年前都不能确认。在男性中，DM1与睾丸萎缩相关，其可导致精子生成的降低或缺失和男性不育、第二性征发育不良包括精力、性欲、性毛、肌肉质量和骨密度降低。此外，具有DM1的男性经常经历低血清睾酮水平伴随升高的血清促黄体生成素和卵泡刺激素水平。升高的FSH水平与异常高的雌激素：睾丸激素比率相关，其可导致男性乳房增大。最后，具有DM1的男性经常经历高比率的正面男性秃顶和脱发。
5.呼吸道症状
由于隔膜、腹部和肋间肌肉肌无力以及呼吸肌的肌强直，DM1可与呼吸衰竭相关，且在最严重的情况下，可能需要机械通气以辅助个体呼吸。此外，由于这些肌肉的无力，具有DM1的个体往往在将食物和饮料、唾液、鼻腔分泌物和胃流意外吸入肺部之后缺乏力量咳嗽，并往往伴随作为疾病特征的吞咽困难。其可引起肺部和支气管的损伤和炎症进而导致感染。
另一影响具有DM1的个体的呼吸症状是睡眠呼吸暂停，这是一种睡眠病症，其特征在于在DM1中由呼吸肌无力引起的睡眠过程中异常的呼吸暂停或异常低的呼吸情况。呼吸中的每次暂停称为呼吸暂停(apnea)，其可持续数秒至数分钟，且每小时可发生5至30次或更多。由于睡眠呼吸暂停导致的气流不足(由于狭窄的气道和中断的呼吸导致的无气流时期)可导致血液中具有危险性的低氧水平和高二氧化碳水平。在温和的情况中，呼吸暂停可引起睡眠中断、过度劳累和晨起头痛。在严重的情况中，呼吸暂停可导致高血压、心律失常和心脏病发作(heart attack)。
6.骨骼肌症状
具有DM1的个体通常经历肌强直，其可通过自发收缩或电刺激后肌肉的缓慢松弛表征。一般情况下，需要反复努力以放松肌肉，且所述情况在肌肉热身后有所好转。然而，长期、激烈的锻炼也可能触发所述情况。具有所述病症的个体可能在松开他们抓住的物体时具有困难或从坐姿起身困难和僵直、笨拙的步伐。尽管任何骨骼肌可经历肌强直，但是相比其他，DM1倾向于更频繁地使机体的某些肌肉承受痛苦。这些肌肉包括前臂和手指肌肉和可能导致语言和咀嚼食物问题的舌头和下巴肌肉。此外，快速运动有时可触发DM1中肌强直特征性的肌肉僵硬。
在许多承受DM1的个体中也观察到肌肉无力和萎缩。DM1中的肌无力特征性地影响一些肌肉同时其他肌肉可能几乎不经历或不经历无力或可保持正常强度。肌肉无力是具有DM1的患者中引起残疾的首要原因且通常影响移动性、手的灵巧性和提起中等重物到重物的能力。在更严重的情况中，个体经历由喉咙和胸部中的肌肉(例如，隔膜肌肉)的无力导致的呼吸或吞咽困难。
此外，DM1经常伴随肌肉疼痛。所述疼痛可影响肌肉本身或其来源可为关节、韧带或脊椎。另外，肌肉无力可使具有DM1的个体在这些区域易患关节炎。
在女性中，DM1与跟怀孕和分娩相关的中度至严重的并发症以及生育能力下降有关。这些可包括早发性更年期、更高比例的自发性流产和流产、与由肌无力或肌强直引起的子宫功能异常相关的延长的生产和分娩、可引起早产的与羊水过多相关的子宫过度膨胀、子宫收缩不足(子宫弛缓)或胎膜过早破裂出血以及由于子宫收缩不足(子宫弛缓)或胎盘滞留引起的产后出血。
新生儿中，DM1症状可包括与升高的不良妊娠结果风险相关的羊水过多(由于降低的胎儿吞咽导致的羊水的过度积累)、脐带脱垂或胎盘早剥、由更强的胎儿运动引起的胎儿胎位不正、胎儿水肿和降低的胎儿运动。
7.视觉症状
在具有DM1的患者中的视觉障碍经常与白内障的发展相关。后囊下变色的晶状体混浊代表在肌强直性营养不良患者中白内障形成的初始阶段，且仅可用狭缝灯生物显微镜检测。这些混浊通常在未发展出任何视觉症状的患者中发现。该晶状体浑浊类型和更成熟的白内障的存在可以是该疾病仅有的征兆。视觉的眩光和模糊随晶状体混浊的进展而发展为星状白内障和最终成熟的白内障，其与普通的白内障难以区分。DM1中的白内障与普通白内障相比进展更迅速，且因此具有DM1的患者呈现早发性白内障。
与DM1相关的其他视觉症状可包括视网膜病、双边上睑下垂(上或下眼睑的下垂或下降)、低眼压和眼肌强直。
8.细胞和分子症状
DM1的遗传病变导致包含较大数目的3'非翻译区CUG重复的DMPKRNA转录物，其取得了功能获得性特性并在表达突变DMPK转录物的细胞和组织中促进RNA介导的毒性。DM1疾病进程中的现有模型涉及CUGexpRNA和核结合蛋白间的相互作用，最终导致对于所选的pre-mRNA组的替代性剪接的调节异常。在DM1中确定的最突出的分子缺陷是替代性剪接的错误调节。虽然一些人的遗传病症可归因于突变对RNA剪接的影响，但是几乎所有这些都是顺式作用的效果，其影响单个pre-mRNA剪接，导致编码非功能性的突变蛋白的异常剪接转录物(Osborne&Thornton,2006,Hum Mol Genet.,15；15 Spec No 2:R162-9；Faustino&Cooper,2003,Genes Dev.,17:419-437)。DM1是由剪接病(spliceopathy)导致的人类遗传疾病的首个实例，即对许多RNA替代性剪接的反式作用，其不引起突变蛋白的产生，而是导致对于特定组织而言在发育上不适的剪接产物的表达(Osborne&Thornton,2006,HumMol Genet.,15；15 Spec No 2:R162-9)。
肌盲(MBNL)蛋白最初被确定在体外相比(CUG)11优先与(CUG)90结合(Miller et al.,2000,EMBO J.,19:4439-4448)。这些蛋白被大量招募入DM1中的核灶(Mankodi et al.,2003,Ann.Neurol.,54:760-768)。在三种哺乳动物MBNL基因中，MBNL1和MBNL2在骨骼肌、心脏和脑中表达，而MBNL3主要在胎盘中表达(Osborne&Thornton,2006,Hum Mol Genet.,15；15 Spec No2:R162-9)。表达于DM1中的CUGexp水平足以显著改变MBNL1的细胞分布。在脑、骨骼肌和心脏中，MBNL1被招募入核糖核灶以至在核质中其他位置被显著耗尽的程度(Jiang et al.,2004,Hum.Mol.Genet.13:3079-3088；Osborne&Thornton,2006,Hum Mol Genet.,15；15 Spec No 2:R162-9)。在小鼠中对MBNL1基因的破坏不仅再现了与DM1相似的强直性肌病，还再现了DM1样白内障和心脏病(Osborne&Thornton,2006,Hum Mol Genet.,15；15 Spec No2:R162-9)。不受理论限制，这些发现表明MBNL1蛋白在重复扩张的RNA上的封存在与DM1相关的表型和症状中起到至关重要的作用。
另一被认为在DM1中起关键作用的蛋白是CUG-BP1，其也能诱导作用于肌肉中替代性剪接的DM1样影响(Philips et al.,1998,Science,280:737-741)，且最初确认其用于在体外与(CUG)8寡核苷酸结合(Timchenko etal.,1996,Nucleic Acids Res.,24:4407-4414)。还值得注意的是氯离子通道ClC-1mRNA的异常剪接，已表明这可直接导致肌强直(Mankodi et al.,2002,Mol.Cell,10:35-44)。其他被证明在具有DM1的个体骨骼肌中错误调节了替代性剪接的蛋白包括但不限于由ALP、CAPN3、CLCN1、FHOS、GFAT1、IR、MTMR1、NRAP、RYR1、SERCA1、z-肌联蛋白、m-肌联蛋白、TNNT3或ZASP基因编码的蛋白。被证明在具有DM1的个体的心肌中错误调节了替代性剪接的蛋白包括但不限于由TNNT2、ZASP、m-肌联蛋白、KCNAB1或ALP编码的蛋白。被证明在具有DM1的个体的神经组织中错误调节了替代性剪接的蛋白包括但不限于由TAU、APP或NMDAR1基因编码的蛋白(Osborne&Thornton,2006,Hum Mol Genet.,15；15 Spec No 2:R162-9)。
B.治疗I型肌强直性营养不良的方法
本文提供用于治疗有需要的个体中的1型肌强直性营养不良(DM1)的方法，其包括：向个体系统施用治疗上有效量的阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸(如本文公开的任何阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸)，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含与在肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)RNA转录物的3'非翻译区(UTR)中的至少3个多聚CUG重复序列互补的序列，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的施用至少在两种肌肉中缓解至少一种DM1症状。在一个实施方案中，所述肌肉是骨骼肌、平滑肌和/或心肌。在另一实施方案中，所述肌肉是骨骼肌且可包括但不限于胫骨前肌、四头肌和/或腓肠肌。在一些实施方案中，阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的施用可通过静脉内、腹膜内或皮下实施。在其他实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可按每天、每两天、每三天、每四天、每5天、每6天或每7天中任一种方式施用至个体。在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可向个体施用长达一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、两年、三年、四年、五或更多年或终生(包括在这些值中间的时段)的时期。在另一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸以约2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、14mg/kg、16mg/kg、18mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg或更高的浓度中的任一浓度(包括这些值中间的浓度)施用至个体。在一个实施方案中，所述DM1的至少一种症状是肌强直。在一个实施方案中，所述DM1的至少一种症状是在肌细胞核内的核糖核灶中的肌盲样蛋白1(MBNL-1)的聚集。在另一实施方案中，所述DM1的至少一种症状是肌肉细胞中至少一种RNA转录物的剪接异常。在一些实施方案中，所述RNA转录物选自下组：Serca-1、m-肌联蛋白、Zasp和CIC-1。在一个实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸与可药用赋形剂或载剂如任何本文描述的可药用赋形剂或载剂共同施用。在另一实施方案中，所述个体是人。
在本文公开的任何方法的一些方面中，所述DM1的至少一种症状是影响一种或多种骨骼肌的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：肌强直、肌肉无力、肌肉萎缩和肌肉疼痛。
在本文公开的任何方法的另一方面中，所述DM1的至少一种症状是影响心血管系统的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：心源性晕厥和先兆晕厥、心脏传导缺陷、心律失常、低血压和充血性心脏衰竭。
在本文公开的任何方法的一些方面中，所述DM1的至少一种症状是影响呼吸系统的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：呼吸肌无力、吸气和睡眠呼吸暂停。
在本文公开的任何方法中的另一方面中，所述DM1的至少一种症状是影响肠胃系统的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：咀嚼和吞咽困难、胃食管反流、腹部或胸部疼痛(消化不良)、恶心、呕吐、腹胀、肠假性梗阻、胆汁淤积、便秘、腹泻、肠道吸收不良、粪便嵌塞、巨结肠、肠穿孔、排便困难以及大便失禁。
在本文公开的任何方法中的一些方面中，所述DM1的至少一种症状是影响神经系统的症状。在一些实施方案中，所述症状选自下组：认知障碍、日间过度睡眠(嗜睡)、行为困难、情绪困难、社会化困难和周围神经病变。
在本文公开的任何方法中的另一方面中，所述DM1的至少一个症状是影响生殖和/或内分泌系统的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：睾丸萎缩、女性不孕不育、第二性征发育不良、精力减退、性欲下降、减少或不存在阴毛、肌肉质量减少、骨密度下降、低血清睾酮、血清促黄体激素升高、血清卵泡刺激素升高、男性乳房发育症、早发性更年期、胰岛素抗性、过早男性型秃发和在男性中雌二醇对睾酮的比例水平的升高。
在本文公开的任何方法的一些方面中，所述DM1的至少一个症状是影响怀孕的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：自然流产、死胎、延长的产程和分娩、子宫过度膨胀、早产、施用去极化剂后的强直性肌痉挛、施用巴比妥类药物后的呼吸衰竭和产后出血。
在本文公开的任何方法中的另一方面中，所述DM1的至少一个症状是新生儿并发症。在一个实施方案中，所述症状选自下组：羊水过多、脐带脱垂、胎盘早剥、胎儿胎位不正、胎儿水肿和胎儿运动不能。
在本文公开的任何方法的一些方面中，所述DM1的至少一个症状是影响免疫系统的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：低丙球蛋白血症和毛母质瘤(pilomatrixoma)频率增多。
在本文公开的任何方法的另一方面中，其中所述DM1的至少一个症状是影响眼或视力的症状。在一个实施方案中，所述症状选自下组：视力模糊、视网膜病变、双侧上睑下垂(上睑下垂)、低眼压和眼肌强直。
C.阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的施用
在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸以注射的形式施用。所述注射可包含化合物与水性可注射赋形剂或载剂的组合。合适的水性可注射赋形剂或载剂的非限制性实例为本领域的普通技术人员熟知且所述合适的水性可注射赋形剂或载剂和配制配制物的方法可在标准参考文献如Alfonso AR:Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack PublishingCompany,Easton Pa.,1985中找到。合适的水性可注射赋形剂或载剂包括水、水性盐水溶液、水性葡萄糖溶液等等，任选地包含溶解增强剂如10％甘露醇或其它糖、10％的甘氨酸或其他的氨基酸。所述组合物可经皮下，腹膜内，或静脉注射。
在一些实施方案中，使用静脉给药，且其可在数分钟至一小时或更长如约十五分钟的时程持续静脉内输注。施用的量可取决于阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的类型、单位剂量的大小、赋形剂或载剂的种类和其他本领域普通的技术人员熟知的因素可广泛变化。阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可构成例如约0.001％至约10％(w/w)、约0.01％至约1％、约0.1％至约0.8％或其中的任何范围，余下部分包含赋形剂或载剂。
对于口服施用，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可采用例如通过常规方式用可药用的赋形剂或载剂如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂制备的片剂或胶囊的形式。用于口服施用的液体制备物可采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或其可作为干燥产品呈现用于在使用前用水或其他合适的媒介复原。这种液体制备物可由常规方式用可药用添加剂如制备悬浮剂(例如，山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介(例如，ationd油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸)制备。制备物还可包含合适的缓冲盐、调味剂和着色剂。
在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸可通过气雾喷雾器或喷雾器经由吸入施用，所述气雾喷雾器或喷雾器可包括合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其组合)的气溶胶。在一个非限制性实例中，用于加压气雾剂的剂量单位可通过计量阀递送。在另一实施方案中，例如明胶的胶囊和药筒可用于吸入器中且可配制成包含粉末化的具有合适粉末基质如举例来说淀粉或乳糖的化合物的混合物。
实施例
实施例1：两种不同的PPMO偶联物肌内注射入胫骨前肌纠正异常的 RNA剪接
CUG三核苷酸序列的大的扩增为导致RNA代谢中不利变化的毒性RNA功能获得性提供了基础。这样的CUG重复元件通常处于蛋白激酶DMPK的3'非翻译区，但当扩增时其成为I型肌强直性营养不良(DM1)(一种遗传性神经肌肉疾病)的遗传病变。包含CUG扩增的病原性DMPK转录物作为与RNA结合蛋白如肌盲样1(MBNL1)的复合物的一部分保留在核糖核灶中，导致众多RNA转录物的异常剪接和生理异常包括肌强直。
在该实施例中，实施冷凝合成反应以生成包含基于25mg mer CAG序列的吗啉(Wheeler et al.,2009,Science 325:336-339)CAG25和共价附着至位于吗啉5'末端的间隔区部分的细胞穿透肽的PPMP偶联物。此外，为确定间隔区和肽修饰对PPMO-B和PPMO-K的生物活性影响，对HSALR转基因小鼠的胫骨前肌(TA)实施系列IM注射且对Serca-1的RNA剪接进行了评估。
材料和方法
细胞穿透肽偶联至吗啉代寡核苷酸
PPMO偶联物如Abes et al.所述进行合成并伴随如下文所述的修饰(2006,J Control Release 116:304-313)。肽B(Ac(RXRRBR)2XB-COOH)或肽K(Ac(RXR)4XB-COOH)(Anaspec,Fremont,CA)在包含O-(6-氯苯并-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(O-(6-chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexaflurophosphate)(HCTU)/二异丙基乙胺(DIEA)的二甲基甲酰胺中以1:2每摩肽的摩尔比于室温(RT)激活。具有5'主要胺修饰的吗啉代CAG25(5’-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3’)(Gene Tools,Philomath,OR)溶于二甲基亚砜(dimethylsulofixide)并以1:2-1:5的摩尔过量的肽：ASO添加至激活的肽B或肽K并允许所述反应在室温进行2小时。所述反应用水淬灭；PPMO偶联物在羧甲基琼脂糖(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上进行纯化并在pH7.5的2M胍-HCl、1M氯化钠、20％乙腈中进行洗脱。洗脱物用数次0.1mM NaHCO3的缓冲液交换于具有3000Da的截留分子量的透析盒中进行透析。透析的PPMO在0.1N HCl中由在265nm的分光光度吸收进行量化、冷冻并冻干。
HSA LR 再衍生和基因分型
通过使FVB/n野生型雌性小鼠用收集自纯合子HSALR系20b雄性小鼠的精子受孕生成再衍生的(re-derived)半合子HSALR小鼠。雄性和雌性半合子小鼠共同交配以生成纯合后代。使用多重复合实时定量PCR测定(quantitativemultiplex real-time PCR assay)以测定小鼠的接合性(zygosity)状态；该实验检测相同细胞中的人骨骼肌动蛋白(ACTA1)和Gapdh作为内部对照。使用下列引物探针集(Life Technologies,Grand Island,NY)以检测ACTA1基因组DNA：正向：5’-CCACCGCAAATGCTTCTAGAC，反向：5’-CCCCCCCATTGAGAAGATTC，探针：5’-CTCCACCTCCAGCACGCGACTTCT。使用专有序列引物探针集(LifeTechnologies,Grand Island,NY)以检测Gapdh基因组DNA。纯合子小鼠随后与野生型FVB/n回交以确认纯合状态。确认的雄性和雌性纯合子小鼠随后共同交配以保持在FVB/n系背景下的纯合群体。
HSA LR 转基因mRNA的实时PCR
总RNA从TA、腓肠肌和四头肌中使用RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据生产说明书进行纯化。使用实时定量PCR以测定HSALR转基因的mRNA水平；使用18S RNA水平作为标准化因子。18S RNA水平使用专有序列的引物-探针集测定(Life Technologies,Grand Island,NY)。使用与用于检测ACTA1基因组DNA相同的引物-探针集以检测ACTA1mRNA。
肌内TA注射
Genzyme机构性动物护理和使用委员会批准了所有的动物研究。对异氟烷(isoflurane)麻醉的小鼠的TA进行注射并进行如Wheeler et al.,2007,J ClinInvest 117:3952-3957)所述的电穿孔。一侧TA用20μg(1μg/μL)CAG25、GAC25(5’-ACGACGACGACGACGACGACGACGA-3’)(Gene Tools,Philomath,OR)或PPMO(在PPMO-B和PPMO-K注射中，注射20μg ASO等价物，将肽的质量考虑在内)进行注射而用20μL磷酸盐缓冲盐水(盐水)注射对侧TA。
结果
对包含肽B或肽K的两种PPMO偶联物进行了合成并将其分别称作PPMO-B和PPMO-K。
CAG25向TA中的IM注射纠正了Serca-1剪接而接受盐水注射的对侧TA保留了Serca-1剪接的异常模式(图1b)。对照GAC序列的吗啉，GAC25，并未如预期般纠正Serca-1剪接。
重要的是，这些结果表明PPMO-B和PPMO-K二者的IM注射都纠正了Serca-1剪接，表明在吗啉的5'末端的肽和间隔区的共价修饰未折损CAG25与其靶相互作用且中和CUG RNA毒性作用的能力(图1b)。
实施例2：PPMO-B和PPMO-K的重复IV注射在体内有效改善剪接病
已经确认了CAG25用肽B或K的修饰并未废除其生物活性，本实施例评估了使用IV给药方案PPMO-B和PPMO-K是否能调节HSALR小鼠中的毒性RNA的作用。
材料和方法
HSA LR 中的系统递送研究
将CAG25、PPMO-B和PPMO-K溶解于盐水中并以30mg/kg体重的剂量通过尾静脉IV注射施用至雄性和雌性HSALR纯合子小鼠，每周一次持续六周。最后一次给药后24小时通过眼眶取血收集血液。最终给药后约一周，对小鼠肌强直的存在如肌电图程序中所述进行评估。随后处死小鼠，肌肉切片冷冻在液氮中用于RNA分析或包埋于OCT介质并冷冻于冷却的异戊烷中用于免疫荧光和FISH分析。
替代性剪接的RT-PCR分析
使用SuperScript III One-Step RT-PCR系统用Platinum Taq DNA聚合酶(Life Technologies,Grand Island,NY)使用用于DNA合成和PCR扩增的基因特异性引物实施RT-PCR。用于Serca-1、ZASP、m-肌联蛋白和ClC-1的引物序列在之前已进行了描述(Wheeler et al.,2007,J Clin Invest 117:3952-3957；Lin etal.,2006,Hum Mol Genet 15:2087-2097)。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，用SybrGreen I Nucleic Acid Gel Stain(Life Technologies,Grand Island,NY)进行染色并使用Fujifilm LAS-3000 Intelligent Dark Box进行成像。
结果
HSALR小鼠经历6次每周的30mg/kg剂量的CAG25、PPMO-B和PPMO-KIV注射。HSALR小鼠很好地耐受了该剂量且在CAG25和PPMO施用过程中或贯穿整个研究时期未展示明显的毒性迹象。此外，这些治疗并未影响肝脏转氨酶(ALT、AST)或肾功能标志物(肌酐、BUN)(未展示数据)。
在数个肌肉群包括TA、四头肌和腓肠肌上实施了剪接分析。如图2所示，PPMO-B和PPMO-K都显著纠正了Serca-1剪接并恢复了在野生型小鼠中观察到的剪接模式。Serca-1剪接纠正发生在所有检查的肌肉中包括TA、四头肌和腓肠肌。一只用PPMO-B治疗的小鼠展示了四头肌和腓肠肌中的部分剪接纠正。与PPMO-B和PPMO-K对比，未修饰的CAG25的静脉内注射在任何检查的肌肉组中未引起Serca-1剪接的改进(图2)。这与其他表明裸吗啉对肌肉的劣质生物分布的研究相符(Sazani,et al.,2002,Nat Biotechnol20:1228-1233)。
依赖MBNL1用于正确剪接的其他转录物包括m-肌联蛋白、Zasp和ClC-1.8,24。如图3所示，PPMO-K的系统递送导致TA、四头肌和腓肠肌中m-肌联蛋白、Zasp和ClC-1在RNA剪接上的强力纠正。用PPMO-B IV注射治疗的HSALR小鼠同样证明了对于这些转录物替代性剪接的纠正(未展示数据)。
这些结果表明PPMO-B和PPMO-K的系统递送能够穿透骨骼肌，进入肌肉肌细胞核，与多聚(CUG)RNA杂交并释放足以恢复正确的MBNL1调节的RNA剪接的量的封存MBNL1蛋白。
实施例3：PPMO-K破坏骨骼肌中的CUG核包含复合物并导致MBNL1 蛋白的重新分布
为确定用PPMO-K治疗的小鼠中的核糖核灶的命运，本实施例演示了荧光原位杂交(FISH)以检测肌肉中的CUG核糖核包含物。
材料和方法
加工了6μm厚的四头肌冷冻切片以经由免疫荧光如(Lin et al.,2006,Hum Mol Genet 15:2087-2097)描述并进行如下修改来检测MBNL1蛋白的定位：使用1:5000浓度的多克隆抗体A2764，随后与1：500浓度的Alex-568标记的山羊抗兔多克隆第二抗体温育。样品使用设置用于DAPI和AlexaFluor-568顺序成像的LSM510 META激光扫描共聚焦显微镜进行成像。检验使用100x/NA1.45 Plan-Fluar油浸物镜用4x放大实施。
结果
在PPMO-K治疗的HSALR小鼠中，观察到CUG灶数目和强度的降低(图4)。然而，由于PPMO-K寡核苷酸序列和FISH步骤中应用的探针包括相同的(CAG)n序列，不可能确定对RNA灶的作用是否是由于PPMO-K对灶的破坏或是由于PPMO-K和FISH探针间的结合竞争所导致的。作为一种更直接的、明确的查明PPMO-K对灶的作用的方式，我们实施了对MBNL1的免疫荧光标记，其封存在CUG RNA灶中并在HSALR小鼠核中展示点状染色(图5a-c)。如图5d-f所示，PPMO-K导致MBNL1蛋白的重新分布并引起比在野生型小鼠中观察到的更弥散的在核质中的定位(图5g-i)。
一并考虑，在本实施例中的免疫染色和FISH数据表明PPMO-K与CUGRNA以竞争的方式相互作用进而导致在肌细胞核内MBNL1蛋白的重新分布。MBNL1在骨骼肌灶中的释放与在PPMO-K治疗小鼠中观察到的RNA剪接的纠正相符。
实施例4：肌强直在经历PPMO-K IV注射的HSA LR 小鼠中得以纠正
通过PPMO-B和PPMO-K对ClC-1RNA剪接的纠正表明氯离子通道功能的恢复可导致在HSALR小鼠中通常观察到的肌强直的严重性的改变。为检测这种可能性，在本实施例中通过EMG对盐水治疗和PPMO-K治疗的HSALR小鼠中的肌强直进行了评估。
材料和方法
对异氟烷麻醉的小鼠实施了EMG，EMG取样使用两只29号针状电极(29gauge needle electrode)取自TA、四头肌和腓肠肌。两只针都插入后，用镊子在进针位点对肌肉轻轻操作。肌强直经由下列标准进行分级：0表明未检测到强直性放电；1表明少于50％的肌肉操作导致强直性放电；2表明50％至80％的肌肉操作导致强直性放电；3表明90％至100％的肌肉操作导致强直性放电。
结果
肌强直首先在野生型FVB/n、半合子和纯合子HSALR小鼠中进行了评估。半合子小鼠相比纯合子小鼠在骨骼肌中包含约50％的HSALR mRNA水平(图6a)。如预期观察到肌强直的发生在半合子小鼠中相对纯合子小鼠中降低且在野生型小鼠中未观察到肌强直(图6c)。在纯合子HSALR小鼠中检测到的典型强直性放电的追踪示于图6b中。如图6b所示，在用PPMO-K治疗的HSALR小鼠中未观察到肌强直，与在这些小鼠中发生的ClC-1替代性剪接的纠正相符(图3)。
结论
本文实施的实验表明细胞穿透肽向CAG序列吗啉的添加允许PPMO在全身骨骼肌中的吸收足以中和延长的CUG重复的毒性作用。观察到剪接缺陷几乎完全的解决、MBNL1从RNA灶的释放和肌强直的消除。
吗啉代寡核苷酸的系统递送可在体内调节DM1样病理的发现具有多重重要含义：首先，基于CAG的吗啉的5’共价修饰并未减损与靶CUG RNA的相互作用；第二，富含精氨酸的细胞穿透肽使其得以实现的生物分布足以赋予DM1病理在生化和生理方面的纠正；且第三，此处呈现的研究中施用在DM1的HSALR模型中的测试作用剂也是能够针对在人DM1患者中的安全使用进行评估的治疗候选。
纯粹意在示例本发明因此不应认作以任何方式限定本发明的实施例还描述并详述了上文所述的本发明的方面和实施方案。前文的实施例和详尽的描述以例证而非限制的方式提供。所有的出版物、专利申请和本说明书中引用的专利在本文通过提述并入就如每一篇单独的出版物、专利申请或专利都特别地和单独地表明通过提述并入一般。具体的，本文引用的所有出版物出于描述和公开可能用于与本发明关联的化合物和方法学的目的通过提述表达性地并入本文。虽然出于清楚理解的目的，上述发明已通过例证和实施例的方式在一些细节上加以描述，显而易见的是本领域的技术人员在本发明的教导下在不脱离附加的权利要求的精髓和保护范围下可做出的改变和修饰。

Claims (22)

1.一种用于在有需要的个体中治疗或预防1型肌强直性营养不良(DM1)的方法，包括：向所述个体系统施用治疗上有效量的阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含与至少在肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)RNA转录物靶的3'非翻译区(UTR)的3个聚CUG重复序列互补的序列，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的施用在至少两种肌肉中缓解DM1的至少一种症状。
2.权利要求1的方法，其中所述阳离子肽在长度上为8-30个氨基酸残基且包含一种或多种选自下组的亚序列：RXR、RX、RB和RBR，其中R是精氨酸，B是β-丙氨酸，且每个X独立地为-NH-(CHR1)n-C(O)-，其中n是4-6且每个R1独立地为H或甲基且使至多两个R1是甲基。
3.权利要求2的方法，其中所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXRRBR)2XB-。
4.权利要求2的方法，其中所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXR)4XB-。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列5'-(AGC)n-3'、5'-(GCA)n-3'或5'-(CAG)n-3'，其中n为约5-25的任意值。
6.权利要求5的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’和/或3’末端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。
7.权利要求5的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列：5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3'。
8.权利要求7的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸进一步包含5'胺修饰。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸是二氨基磷酸阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述阳离子肽通过连接在吗啉代反义寡核苷酸5'末端的间隔区部分与所述吗啉代反义寡核苷酸分开。
11.权利要求10的方法，其中所述间隔区部分包含
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述肌肉是骨骼肌、平滑肌和/或心肌。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸穿透入胫骨前肌、四头肌和/或腓肠肌的细胞。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述DM1的至少一种症状是肌强直。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述DM1的至少一种症状是在肌细胞核内核糖核灶中的肌盲样蛋白1(MBNL-1)的聚集。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述DM1的至少一种症状是肌肉细胞中至少一种RNA转录物的异常剪接。
17.权利要求16的方法，其中所述至少一种RNA转录物选自下组：Serca-1、m-肌联蛋白、Zasp和CIC-1。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的系统施用通过静脉内、腹膜内或皮下实施。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸每周施用至个体。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸向个体施用至少一周。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸与可药用赋形剂一起施用。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述个体是人。
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