ES2532634T3 - Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne - Google Patents

Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne Download PDF

Info

Publication number
ES2532634T3
ES2532634T3 ES09788160.1T ES09788160T ES2532634T3 ES 2532634 T3 ES2532634 T3 ES 2532634T3 ES 09788160 T ES09788160 T ES 09788160T ES 2532634 T3 ES2532634 T3 ES 2532634T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oligonucleotide
rna
artificial
antisense oligonucleotide
framework
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09788160.1T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2532634T5 (es
Inventor
Josephus Johannes De Kimpe
Gerardus Johannes Platenburg
Judith Christina Theodora Van Deutekom
Annemieke Aartsma-Rus
Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PROSENSA TECHNOLOGIES BV
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Original Assignee
PROSENSA TECHNOLOGIES BV
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40873329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2532634(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/NL2008/050673 external-priority patent/WO2009054725A2/en
Application filed by PROSENSA TECHNOLOGIES BV, Leids Universitair Medisch Centrum LUMC filed Critical PROSENSA TECHNOLOGIES BV
Application granted granted Critical
Publication of ES2532634T3 publication Critical patent/ES2532634T3/es
Publication of ES2532634T5 publication Critical patent/ES2532634T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido antisentido que comprende la secuencia nucleotídica SEC ID N.º: 3.

Description

Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
Campo
La invención se refiere al campo de la genética, más específicamente de la genética humana. La invención en particular se refiere a la modulación de ayustamiento en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne humana.
Antecedentes de la invención
Las miopatías son trastornos que dan como resultado dificultad funcional de músculos. Distrofia muscular (MD) hace referencia a enfermedades genéticas que se caracterizan por debilidad y degeneración progresiva de los músculos esqueléticos. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD) son las formas infantiles más comunes de distrofia muscular. Son trastornos recesivos y debido a que el gen responsable de DMD y BMD reside en el cromosoma X, las mutaciones afectan principalmente a varones con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 3500 niños.
DMD y BMD están causadas por defectos genéticos en el gen DMD que codifica distrofina, una proteína muscular que se requiere para interacciones entre el citoesqueleto y la matriz extracelular para mantener estabilidad de las fibras musculares durante la contracción. DMD es un trastorno grave, neuromuscular letal que da como resultado una dependencia del apoyo de una silla de ruedas antes de la edad de 12 años y los pacientes de DMD mueren frecuentemente antes de la edad de treinta debido a fallo respiratorio o a fallo cardiaco. En contraste, los pacientes de BMD frecuentemente mantienen su capacidad de andar hasta más adelante en su vida, y tienen expectativas de vida cercanas a las normales. Las mutaciones de DMD en el gen DMD se caracterizan principalmente por inserciones de cambio de marco o por deleciones o por mutaciones puntuales sin sentido, que dan como resultado la ausencia de distrofina funcional. Las mutaciones de BMD en general mantienen el marco de lectura intacto, permitiendo síntesis de una distrofina parcialmente funcional.
Durante la última década, la modificación específica de ayustamiento con el fin de restaurar la fase de lectura alterada del tránscrito de DMD ha surgido como una terapia prometedora para distrofia muscular de Duchenne (DMD) (van Ommen, van Deutekom, Aartsma-Rus, Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(2): 140-9, Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myol. 2007; 26(3): 179-84, van Deutekom et al., N Engl J Med. 2007; 357(26): 2677-86).
Usando oligonucleótidos antisentido (AON) que interfieren con señales de ayustamiento se puede inducir el salto de exones específicos en el pre-ARNm de DMD, restaurando así la fase de lectura abierta y convirtiendo la DMD grave en un fenotipo de BMD más leve (van Deutekom et al. Hum Mol Genet. 2001; 10: 1547-54; Aartsma-Rus et al., Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14.). In vivo la prueba de concepto se obtuvo primero en el modelo de ratón de mdx, que es deficiente en distrofina debido a una mutación sin sentido en el exón 23. Las inyecciones intramuscular e intravenosa de AON que tienen como objetivo el exón mutado 23 restauran la expresión de distrofina durante al menos tres meses (Lu et al. Nat Med. 2003; 8: 1009-14; Lu et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2005;102(1): 198-203). Esto se acompañó de restauración de proteínas asociadas a distrofina en la membrana de fibras así como de mejora funcional del músculo tratado. El salto in vivo de exones humanos se ha logrado en el modelo de ratón de hDMD, que contiene una copia completa del gen DMD humano integrado en el cromosoma 5 del ratón (Bremmer-Bout et al. Molecular Therapy. 2004;
10: 232-40; 't Hoen et al. J Biol Chem. 2008; 283: 5899-907).
Como la mayoría de los pacientes de DMD tienen deleciones que se agrupan en zonas críticas, el salto de un número pequeño de exones es aplicable a números de pacientes relativamente grandes. La aplicabilidad real de el salto de exones puede determinarse por deleciones, duplicaciones y mutaciones puntuales comunicadas en bases de datos de mutaciones de DMD tales como la base de datos de mutación de DMD de Leiden disponible en www.dmd.nl. El salto terapéutico del exón 45 del pre-ARNm de DMD restauraría la fase de lectura abierta de pacientes de DMD que tienen deleciones incluyendo pero no limitadas a exones 12-44, 18-44, 44, 46, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, 46-55, 46-59, 46-60 del pre-ARNm de DMD, que tienen lugar en un total del 16 % de todos los pacientes de DMD con una deleción (Aartsma-Rus y van Deutekom, 2007, Antisense Elements (Genetics) Research Focus, 2007 Nova Science Publishers, Inc.). Además, para algunos pacientes de DMD se requiere el salto simultáneo de uno o más exones además del exón 45, tales como los exones 51 o 53 para restaurar la fase de lectura correcta. Ejemplos no limitantes incluyen pacientes con una deleción de exones 46-50 que requieren el co-salto de los exones 45 y 51, o con una deleción de exones 46-52 que requieren el co-salto de los exones 45 y 53.
Recientemente, se completó exitosamente un primer estudio en seres humanos donde un AON que induce el salto del exón 51 se inyectó en un área pequeña del músculo tibialis anterior de cuatro pacientes de DMD. Se observó expresión de distrofina novedosa en la mayoría de las fibras musculares en todos los cuatro pacientes tratados y el AON fue seguro y bien tolerado (van Deutekom et al. N Engl J Med. 2007; 357: 2677-86).
La mayoría de los AON estudiados contienen hasta 20 nucleótidos y se ha argüído que este tamaño relativamente pequeño mejora la distribución tisular y/o la penetración celular de un AON. Sin embargo, tales AON cortos darán como resultado una especificidad limitada debida a un riesgo incrementado de la presencia de secuencias idénticas en otra parte en el genoma y una unión al objetivo limitada o una afinidad al objetivo limitada debida a una energía libre
baja del complejo objetivo de AON. Por lo tanto los autores de la invención decidieron diseñar oligonucleótidos antisentido nuevos y opcionalmente mejorados que no deberían presentar todos estos inconvenientes.
El documento WO2007/135105 divulga dos oligonucleótidos antisentido de menos de 21 nucleótidos que tienen como objetivo una subregión de SEC ID N.º: 2 del exón 45 del pre-ARNm de distrofina.
Descripción de la invención
Procedimiento
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inducir y/o promover el salto del exón 45 del pre-ARNm en un paciente, preferentemente en una célula aislada de dicho paciente, comprendiendo el procedimiento proporcionar a dicha célula y/o a dicho paciente un oligonucleótido antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 3.
De acuerdo con ello, se suministra en este acto un procedimiento para inducir y/o promover salto del exón 45 de pre-ARNm de DMD, preferentemente en una célula aislada de un paciente, comprendiendo el procedimiento proveer a dicha célula y/o a dicho paciente con dichos oligonucleótidos antisentido.
Se entenderá que dicho procedimiento abarca un procedimiento in vitro, in vivo o ex vivo.
Según se define en el presente documento un pre-ARNm de DMD preferentemente quiere decir el pre-ARNm de un gen DMD o de un paciente de DMD o de BMD. El gen o la proteína de DMD corresponde al gen o la proteína de la distrofina.
Un paciente se desea preferentemente para querer decir un paciente que tiene DMD o BMD según se define más adelante en el presente documento o un paciente susceptible de desarrollar DMD o BMD debido a su origen genético.
En la divulgación, salto del exón se refiere a la inducción en una célula de un ARNm maduro que no contiene un exón particular que normalmente está presente en él. El salto del exón se logra proporcionando una célula que expresa el pre-ARNm de dicho ARNm con una molécula capaz de interferir con secuencias tales como, por ejemplo, la secuencia donante de ayustamiento o la secuencia aceptora de ayustamiento que se requieren ambas para mejorar el procedimiento enzimático de ayustamiento, o una molécula que es capaz de interferir con una señal de inclusión de exón requerida para el reconocimiento de un tramo de nucleótidos como un exón a incluirse en el ARNm. El término pre-ARNm se refiere a un ARNm precursor no procesado o procesado parcialmente que se sintetiza a partir de una plantilla de ADN en el núcleo celular por transcripción.
Dentro del contexto de la invención inducir y/o promover salto de un exón como se indica en el presente documento quiere decir que al menos el el 1 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %,50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del ARNm de DMD en una o más células (musculares) de un paciente tratado no contendrá dicho exón. Esto se valora preferentemente por PCR según se define en los ejemplos.
Preferentemente, un procedimiento de la invención induciendo o promoviendo salto del exón 45 del pre-ARNm de la DMD en una o más células de un paciente proporciona a dicho paciente una proteína distrofina funcional y/o disminuye la producción de una proteína de distrofina aberrante en dicho paciente. Por lo tanto un procedimiento preferido es un procedimiento, en el que un paciente o una célula de dicho paciente se provee con una proteína distrofina muscular funcional y/o en el que la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho paciente o en una célula de dicho paciente se disminuye. La disminución de la producción de la distrofina aberrante se puede valorar en el nivel de ARNm y quiere decir preferentemente que el 99 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos de la cantidad inicial de ARNm de distrofina aberrante, es aún detectable por RT-PCR. Un ARNm de distrofina aberrante o una proteína distrofina aberrante se refiere también en el presente documento como un ARNm de distrofina o una proteína distrofina no funcional. Una proteína distrofina no funcional es preferentemente una proteína distrofina que no es capaz de unir actina y/o miembros del complejo proteico DGC. Una proteína distrofina no funcional
o un ARNm de distrofina no funcional típicamente no tiene, o no codifica una proteína de distrofina con un extremo C-terminal intacto de la proteína.
Incrementar la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho paciente puede valorarse en el nivel de ARNm (por análisis de RT-PCR) y preferentemente quiere decir que una cantidad detectable de un ARNm de distrofina funcional es detectable por RT-PCR. En otra realización, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del ARNm de distrofina detectable es un ARNm de distrofina funcional Incrementar la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho paciente puede valorarse en el nivel de proteína (por análisis de inmunofluorescencia y por análisis de bandas de western) y preferentemente quiere decir que una cantidad detectable de una proteína distrofina funcional es detectable por análisis de inmunofluorescencia o por análisis de bandas de western. En otra realización, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la proteína distrofina detectable es una proteína distrofina funcional
Según se define en el presente documento, una distrofina funcional es preferentemente una distrofina de tipo silvestre que corresponde a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se identifica en la SEC ID N.º: 1. Una
distrofina funcional es preferentemente una distrofina, que tiene un dominio de unión a actina en su parte N-terminal (primeros 240 aminoácidos en el extremo N-terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 hasta 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos en el extremo C-terminal) estando presente cada uno de estos dominios en una distrofina de tipo silvestre como se conoce por la persona experta. Los aminoácidos indicados en el presente documento corresponden a aminoácidos de la distrofina de tipo silvestre que están representados por SEC ID N.º: 1. En otras palabras, una distrofina funcional es una distrofina que presenta al menos en algún grado una actividad de una distrofina de tipo silvestre. "Al menos en algún grado" preferentemente quiere decir al menos al 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de una actividad correspondiente de una distrofina funcional de tipo silvestre. En este contexto, una actividad de una distrofina funcional es preferentemente unirse a actina y al complejo glucoproteico asociado a distrofina (DGC) (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). La unión de distrofina a actina y al complejo DGC puede visualizarse bien por co-inmunoprecipitación usando extractos de proteína totales o bien por análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales, a partir de una biopsia muscular, como se conoce por la persona experta.
Individuos o pacientes que sufren de distrofia muscular de Duchenne tienen típicamente una mutación en el gen DMD que impide síntesis de la proteína de distrofina completa, es decir una parada prematura impide la síntesis del extremo C-terminal. En la distrofia muscular de Becker el gen DMD también comprende una mutación comparado con el gen de tipo silvestre pero la mutación típicamente no induce una parada prematura y el extremo C-terminal típicamente se sintetiza. Como un resultado se sintetiza una proteína distrofina funcional que tiene al menos la misma actividad en clase que la proteína de tipo silvestre, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad. El genoma de un individuo con BMD codifica típicamente una proteína de distrofina que comprende la parte N-terminal (primeros 240 aminoácidos en el extremo N-terminal), un dominio rico en cisteínas (aminoácidos 3361 hasta 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos en el extremo C-terminal) pero su dominio en forma de barra central puede ser más corto que el de una distrofina de tipo silvestre (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). El salto del exón para el tratamiento de DMD está orientada típicamente a superar una parada prematura en el pre-ARNm omitiendo un exón en el dominio con forma de barra para corregir el marco de lectura y para permitir la síntesis del resto de la proteína distrofina incluyendo el extremo C-terminal, aunque la proteína es algo menor como resultado de un dominio de barra menor. En una realización preferida, un individuo que tiene DMD y que se está tratando por un procedimiento según se define en el presente documento estará provisto de una distrofina que presente al menos en algún grado una actividad de una distrofina de tipo silvestre. Más preferentemente, si dicho individuo es un paciente de Duchenne o se sospecha que puede ser un paciente de Duchenne, una distrofina funcional es una distrofina de un individuo que tiene BMD: típicamente dicha distrofina es capaz de interaccionar tanto con actina como con el DGC, pero su dominio central en forma de barra puede ser más corto que el de una distrofina de tipo silvestre (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). El dominio con forma de barra central de distrofina de tipo silvestre comprende 24 repeticiones similares a espectrina (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). Por ejemplo, un dominio con forma de barra central de una distrofina como se proporciona en el presente documento puede comprender 5 a 23, 10 a 22 o 12 a 18 repeticiones similares a espectrina así como puede unirse a actina y a DGC.
Un procedimiento de la invención puede aliviar una o más características de una célula muscular de un paciente de DMD que comprende deleciones que incluyen pero no se limitan a exones 12-44, 18-44, 44, 46, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, 46-55, 46-59, 46-60 del pre-ARNm de DMD de dicho paciente (Aartsma-Rus y van Deutekom, 2007, Antisense Elements (Genetics) Research Focus, 2007 Nova Science Publishers, Inc) así como de pacientes de DMD que requieren el salto simultáneo de uno o más exones además del exón 45 que incluyen pero no se limitan a pacientes con una deleción de exones 46-50 que requieren el co-salto de los exones 45 y 51, o con una deleción de exones 46-52 que requieren el co-salto de los exones 45 y 53.
En una realización preferida, uno o más síntoma(s) o característica(s) de una célula miogénica o de una célula muscular de un paciente de DMD se alivia(n). Tales síntomas o características pueden evaluarse al nivel celular, al nivel tisular o en el propio paciente.
Un alivio de uno o más síntomas o características puede valorarse por cualquiera de los siguientes ensayos en una célula miógena o célula muscular de un paciente: captación de calcio reducida por células musculares, síntesis de colágeno disminuida, morfología alterada, biosíntesis de lípidos alterada, estrés oxidativo disminuido, y/o función de fibras musculares, integridad, y/o supervivencia mejoradas. Estos parámetros se valoran usualmente usando análisis de inmunofluorescencia y/o análisis de histoquímica de secciones transversales de biopsias musculares. La mejora de la función, de la integridad y/o de la supervivencia de fibras musculares se puede valorar usando al menos uno de los siguientes ensayos: una disminución detectable de creatina cinasa en la sangre, un decrecimiento detectable de necrosis de fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo sospechoso de ser distrófico, y/o un incremento detectable de la homogeneidad del diámetro de fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo sospechoso de ser distrófico. Cada uno de estos ensayos se conoce por la persona experta.
Se puede detectar en sangre creatina cinasa según se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602, 2006). Un decrecimiento detectable en creatina cinasa puede querer decir un decrecimiento del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más comparado con la concentración de creatina cinasa en un mismo paciente de DMD antes del tratamiento.
Un decrecimiento detectable de necrosis de fibras musculares se valora preferentemente en una biopsia muscular, más preferentemente como se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602, 2006) usando secciones transversales de biopsia. Un decrecimiento detectable de necrosis puede ser un decrecimiento del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del área en la que se ha identificado necrosis usando secciones transversales de biopsias. El decrecimiento se mide por comparación con la necrosis como se valora en un mismo paciente de DMD antes de tratamiento.
Un incremento detectable de la homogeneidad del diámetro de fibras musculares se valora preferentemente en una sección transversal de biopsia muscular, más preferentemente según se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602, 2006). El incremento se mide por comparación con la homogeneidad del diámetro de fibras musculares en una sección transversal de biopsia muscular de un mismo paciente de DMD antes del tratamiento.
Un alivio de uno o más síntomas o características puede valorarse por cualquiera de los siguientes ensayos en el propio paciente: prolongación del tiempo hasta la pérdida de la marcha, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo tomado para levantarse del suelo, mejora en el tiempo para caminar nueve metros, mejora en el tiempo tomado para subir cuatro escalones, mejora del grado de función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardiaca, mejora de la calidad de vida. Cada uno de estos ensayos se conoce por la persona experta. Como un ejemplo,la publicación de Manzur et al (Manzur AY et al, (2008), Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy (revisión), Wiley publishers, The Cochrane collaboration.) da una explicación extensa de cada uno de estos ensayos. Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como se ha encontrado una mejora o prolongación detectable de un parámetro medido en un ensayo, ello querrá decir preferentemente que uno o más síntomas de la Distrofia Muscular de Duchenne se han aliviado en un individuo usando un procedimiento de la invención. La mejora o prolongación detectable es preferentemente una mejora estadísticamente significativa o una prolongación según se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602, 2006). Alternativamente, el alivio de uno o más síntoma(s) de la Distrofia Muscular de Duchenne puede valorarse midiendo una mejora de una función, de la integridad y/o de la supervivencia de fibras musculares según se define más tarde en el presente documento.
Un tratamiento en un procedimiento de acuerdo con la invención puede tener una duración de al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o más. La frecuencia de administración de un oligonucleótido antisentido, una composición, un compuesto de la invención puede depender de varios parámetros tales como la edad del paciente, el tipo de mutación, el número de moléculas (dosis), la formulación de dicha molécula. La frecuencia puede variarse entre al menos una vez en un periodo de tiempo de dos semanas, o de tres semanas o de cuatro semanas o de cinco semanas o en un periodo de tiempo más largo. Cada oligonucleótido antisentido o equivalente del mismo según se define en el presente documento para uso de acuerdo con la invención puede ser adecuado para administración directa a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos afectados por
o en riesgo de desarrollar DMD y puede administrarse directamente in vivo, ex vivo o in vitro. Un oligonucleótido antisentido como se usa en el presente documento puede ser adecuado para administración a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos afectados por o en riesgo de desarrollar DMD y puede administrarse in vivo, ex vivo o in vitro. Dicho oligonucleótido antisentido puede administrarse directamente o indirectamente a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de un individuo afectado por o en riesgo de desarrollar DMD y puede administrarse directa o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro. Como la distrofia muscular de Duchenne tiene un fenotipo pronunciado en células musculares, se prefiere que dichas células sean células musculares, se prefiere adicionalmente que dicho tejido sea un tejido muscular y/o se prefiere adicionalmente que dicho órgano comprenda o consista en un tejido muscular. Un órgano preferido es el corazón. Preferentemente dichas células comprenden un gen que codifica una proteína distrofina mutante. Preferentemente dichas células son células de un individuo que sufre de DMD.
Un oligonucleótido antisentido o equivalente del mismo puede administrarse como está a una célula. Cuando se administra dicho oligonucleótido antisentido o equivalente del mismo a un individuo, se prefiere que esté disuelto en una solución que es compatible con el procedimiento de administración. Para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. Se prefiere particularmente para un procedimiento de la invención el uso de un excipiente que potenciará adicionalmente la administración de dicho oligonucleótido antisentido o equivalente funcional del mismo según se define en el presente documento, a una célula y dentro de una célula, preferentemente una célula muscular. El excipiente preferido se define en la sección titulada "composición farmacéutica". In vitro, los autores de la presente invención han obtenido resultados muy buenos usando polietilenimina (PEI, ExGen500, MBI Fermentas), como se muestra en el ejemplo.
En un procedimiento preferido de la invención, se usa un oligonucleótido antisentido adicional que es capaz de inducir y/o promover el salto de un exón distinto del pre-ARNm de DMD de un paciente. Preferentemente, el segundo exón se selecciona a partir de: exón 7, 44, 46, 51, 53, 59, 67 del pre-ARNm de la distrofina de un paciente. Oligonucleótidos antisentido que se pueden usar se representan en la tabla 2. Los oligonucleótidos antisentido preferidos comprenden o
consisten en cualquiera de los oligonucleótidos antisentido como se divulgan en la tabla 2. Varios oligonucleótidos antisentido se pueden usar también en combinación. De esta forma, se impide la inclusión de dos o más exones de un pre-ARNm de DMD en ARNm producido a partir de este pre-ARNm. Esta realización se refiere adicionalmente como salto del exón doble o de multi-exón (Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004; 74(1): 83-92, Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther 2006; 14(3): 401-7). En la mayoría de los casos el salto del exón doble da como resultado la exclusión de solo los dos exones objetivo del pre-ARNm de la distrofina. Sin embargo, en otros casos se encontró que los exones objetivo y la región entera entre dichos exones en dicho pre-ARNm no están presentes en el ARNm producido incluso cuando otros exones (exones que intervienen) estaban presentes en tal región. Este multi-salto era principalmente así para la combinación de oligonucleótidos antisentido derivados del gen DMD, en la que un oligonucleótido antisentido para exón 45 y un oligonucleótido antisentido para exón 51 se añadieron a una célula que transcribe el gen DMD. Un diseño tal dio como resultado ARNm que se produce que no contiene exones 45 a 51. Aparentemente, la estructura del pre-ARNm en presencia de los oligonucleótidos antisentido mencionados fue tal que la maquinaria de ayustamiento se estimuló para conectar los exones 44 y 52 entre sí.
Es posible promover específicamente el salto de también los exones que intervienen proporcionando un enlace entre los dos oligonucleótidos antisentido complementarios. Así, en una realización tramos de nucleótidos complementarios a al menos dos exones de distrofina están separados por un resto de enlace. Los al menos dos tramos de nucleótidos están así unidos en esta realización tal como para formar una molécula individual.
Por si acaso, se usa más de un compuesto en un procedimiento de la invención, dichos compuestos se pueden administrar a un individuo en cualquier orden. En una realización, dichos compuestos se administran simultáneamente (significando que dichos compuestos se administran en el plazo de 10 horas, preferentemente en el plazo de una hora). Esto sin embargo no es necesario. En otra realización, dichos compuestos se administran secuencialmente.
Oligonucleótido antisentido
En un segundo aspecto, se proporciona un oligonucleótido antisentido para usar en un procedimiento según se describe en la sección anterior titulada "Procedimiento". Dicho oligonucleótido antisentido es preferentemente un oligonucleótido antisentido (AON) o un oligorribonucleótido antisentido.
Se encontró por los actuales investigadores que especialmente el exón 45 está específicamente omitido en una frecuencia alta usando un oligonucleótido antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 3. Aunque este efecto puede asociarse con una afinidad de unión más alta de dicha molécula, comparada con una molécula que se une a un tramo continuo de menos de 21 nucleótidos, podría haber otros parámetros intracelulares implicados que favorecan características termodinámicas, cinéticas, o estructurales del dúplex híbrido. En la divulgación, se puede usar una molécula que se une a un tramo continuo de al menos 21, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleótidos dentro de dicho exón.
En la divulgación, una molécula o un oligonucleótido de la invención que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 45 de pre-ARNm de DMD es tal que la parte complementaria es al menos el 50 % de la longitud del oligonucleótido, más preferentemente al menos el 60 %, incluso más preferentemente al menos el 70 %, incluso más preferentemente al menos el 80 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o incluso más preferentemente al menos el 95 %, o incluso más preferentemente el 98 % y lo más preferentemente hasta el 100 %. "Una parte del exón 45" preferentemente significa un tramo de al menos 21 nucleótidos. En la divulgación, un oligonucleótido consiste en una secuencia que es complementaria con parte de pre-ARNm de distrofina del exón 45 según se define anteriormente. Alternativamente, un oligonucleótido puede comprender una secuencia que es complementaria con parte de pre-ARNm de distrofinal de exón 45 según se define en el presente documento y secuencias flanqueantes adicionales. En la divulgación, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos. Se pueden usar diversos tipos de secuencias flanqueantes. En la divulgación, preferentemente se usan secuencias flanqueantes adicionales para modificar la unión de una proteína a dicha molécula u oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferentemente para modificar afinidad de unión a ARN objetivo. En otra realización preferida, secuencias flanqueantes adicionales son complementarias a secuencias del pre-ARNm de DMD que no están presentes en el exón 45. Tales secuencias flanqueantes son preferentemente complementarias a secuencias que comprenden o que consisten en las secuencias consenso aceptoras o donantes de sitio de ayustamiento del exón 45. En una realización preferida, tales secuencias flanqueantes son complementarias a secuencias que comprenden o que consisten en secuencias de un intrón del pre-ARNm de DMD que es adyacente a exón 45; es decir intrón 44 o 45.
En la divulgación, un tramo continuo de al menos 21, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleótidos dentro del exón 45 se selecciona a partir de la secuencia:
(SEC ID N.º: 2).
Se ha encontrado que una molécula que une a una secuencia de nucleótido que comprende o que consiste en un tramo continuo de al menos 21, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleótidos de SEC ID N.º: 2 da como resultado salto altamente eficiente de exón 45 en una célula proporcionada con esta molécula. Se encontró que moléculas que unen a una secuencia de nucleótidos que comprende un tramo continuo de menos de 21 nucleótidos de SEC ID N.º: 2 inducían salto del exón en una manera menos eficiente que las moléculas de la divulgación. Por lo tanto, en la divulgación, se proporciona un procedimiento en el que una molécula se une a un tramo continuo de al menos 21, 25, 30, 35 nucleótidos en SEC ID N.º: 2. Al contrario de lo que se piensa generalmente, los autores de la invención encontraron sorprendentemente que se pueden alcanzar una especificidad y una eficiencia de salto de exones más altas usando oligonucleótidos que tengan una longitud de al menos 21 nucleótidos. Ninguna de las secuencias indicadas se deriva de partes conservadas de sitios de unión-ayustamiento. Por lo tanto, no es probable que dicha molécula medie ayustamiento diferencial de otros exones del pre-ARNm de DMD o de exones de otros genes.
En la divulgación, una molécula de la invención capaz de interferir con la inclusión de exón 45 del pre-ARNm de DMD es una molécula de compuesto que se une a la secuencia especificada, o una proteína tal como una proteína de unión a ARN o una proteína de dedos de cinc que no se da en la naturaleza que se ha modificado para ser capaz de unirse a la secuencia de nucleótidos indicada en una molécula de ARN. Procedimientos para rastrear moléculas de compuestos que unen secuencias de nucleótidos específicas se divulgan por ejemplo en el documento PCT/NL01/00697 y en la patente de los EE.UU. 6875736, que se incluyen en el presente documento por referencia. Procedimientos para diseñar proteínas de dedos de cinc de unión a ARN que se unen a secuencias de nucleótidos específicas se divulgan por Friesen y Darby, Nature Structural Biology 5: 543-546 (1998) que se incluye en el presente documento por referencia.
En la divulgación, una molécula de la invención es capaz de interferir con la inclusión de exón 45 del pre-ARNm de DMD y comprende un oligonucleótido antisentido que es complementario de y puede formar pares de bases con la secuencia codificante del pre-ARNm del gen DMD. Dicho oligonucleótido antisentido contiene preferentemente un residuo de ARN, un residuo de ADN, y/o un análogo nucleotídico o equivalente, como se detallará adicionalmente más adelante en el presente documento.
Una molécula de la divulgación comprende una secuencia basada en nucleótidos o una secuencia de nucleótidos o una secuencia oligonucleotídica antisentido de entre 21 y 50 nucleótidos o bases, más preferida entre 21 y 40 nucleótidos, más preferida entre 21 y 30 nucleótidos, tal como de 21 nucleótidos, 22 nucleótidos, 23 nucleótidos, 24 nucleótidos, 25 nucleótidos, 26 nucleótidos, 27 nucleótidos, 28 nucleótidos, 29 nucleótidos, 30 nucleótidos, 31 nucleótidos, 32 nucleótidos, 33 nucleótidos, 34 nucleótidos, 35 nucleótidos, 36 nucleótidos, 37 nucleótidos, 38 nucleótidos, 39 nucleótidos, 40 nucleótidos, 41 nucleótidos, 42 nucleótidos, 43 nucleótidos, 44 nucleótidos, 45 nucleótidos, 46 nucleótidos, 47 nucleótidos, 48 nucleótidos, 49 nucleótidos o 50 nucleótidos. Una molécula de la divulgación comprende una secuencia basada en nucleótidos de 25 nucleótidos.
En la divulgación una molécula se une a un tramo continuo de o es complementaria a o es antisentido con respecto a al menos un tramo continuo de al menos 21 nucleótidos dentro de la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 2. La divulgación proporciona una molécula que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos antisentido seleccionada a partir de las secuencias de nucleótidos antisentido como se representan en la Tabla 1, salvo SEC ID N.º: 68. Una molécula de la divulgación que es antisentido con respecto a la secuencia de SEC ID N.º: 2, que está presente en el exón 45 del gen DMD comprende preferentemente o consiste preferentemente en la secuencia de nucleótidos antisentido de SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 19, SEC ID N.º: 20, SEC ID N.º: 21, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 30, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 39, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 66 y/o SEC ID N.º: 67.
La divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 7 y/o SEC ID N.º: 8.
La divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de SEC ID N.º: 3. Se encontró que esta molécula es muy eficiente modulando ayustamiento de exón 45 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular. En una realización preferida, se proporciona un oligonucleótido antisentido que
comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 3.
Una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido antisentido de la invención puede contener un residuo de ARN, un residuo de ADN, un análogo nucleotídico o equivalente como se detallará adicionalmente más adelante en el presente documento. Además, un oligonucleótido antisentido de la invención puede abarcar un equivalente funcional de dicho oligonucleótido antisentido de la invención según se define en el presente documento.
Se prefiere que un oligonucleótido antisentido de la invención comprenda un o al menos un residuo que esté modificado para incrementar resistencia a nucleasas, y/o para incrementar la afinidad del nucleótido antisentido para la secuencia objetivo. Por lo tanto, en una realización preferida, una secuencia de nucleótidos antisentido comprende un
o al menos un análogo nucleotídico o equivalente, en el que un análogo nucleotídico o equivalente se define como un residuo que tiene una base modificada, y/o un armazón modificado, y/o un enlace internucleosídico que no se da en la naturaleza, o una combinación de estas modificaciones.
En una realización preferida, un análogo de nucleótido o equivalente comprende un armazón modificado. Ejemplos de tales armazones se proporcionan por armazones morfolínicos, armazones de carbamatos, armazones de siloxano, armazones de sulfuros, sulfóxidos y sulfonas, armazones de formacetilos y de tioformacetilos, armazones de metilenformacetilos, armazones de riboacetilos, armazones que contienen alquenos, armazones de sulfamatos, sulfonatos y de sulfonamidas, armazones de metilenimido y de metilenhidrazino y armazones de amidas. Oligómeros de fosforodiamidato de morfolino son oligonucleótidos de armazones modificados que se han investigado anteriormente como agentes antisentido. Los oligonucleótidos de morfolino tienen un armazón no cargado en el que el azúcar de desoxirribosa de ADN se reemplaza por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace de fosforodiamidato. Los oligonucleótidos de morfolino son resistentes a degradación enzimática y parecen funcionar como agentes antisentido deteniendo la traducción o interfiriendo con el ayustamiento de pre-ARNm más que activando ARNasa H. Se han administrado con éxito oligonucleótidos morfolínicos a células de cultivos tisulares por procedimientos que alteran físicamente la membrana celular y un estudio que compara varios de estos procedimientos encontró que la microinyección con Amarillo de Lucifer fue el procedimiento más eficiente de administración; sin embargo, debido a que el armazón morfolínico no está cargado, los lípidos catiónicos no son medidores efectivos de captación de oligonucleótidos morfolínicos en células. Una comunicación reciente demostró formación de tríplex por un oligonucleótido morfolínico y debido al armazón no iónico, estos estudios mostraron que el oligonucleótido morfolínico fue capaz de formación de tríplex en ausencia de magnesio.
Se prefiere adicionalmente que el enlace entre un residuo en un armazón no incluya un átomo de fósforo, tal como un enlace que se forma por enlaces internucleosídicos de alquilos o de cicloalquilos de cadena corta, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta.
Un análogo nucleotídico o equivalente preferido comprende un Ácido Peptidonucleico (APN), que tiene un armazón poliamídico modificado (Nielsen, et al. (1991) Science 254: 1497-1500). Las moléculas basadas en APN son verdaderos imitadores de moléculas de ADN en términos de reconocimiento de pares de bases. El armazón del APN está compuesto de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos, en las que las nucleobases están unidas al armazón por enlaces metilencarbonílicos. Un armazón alternativo comprende un monómero de APN pirrolidínico prolongado en un carbono (Govindaraju y Kumar (2005) Chem. Commun., 495-497). Dado que el armazón de una molécula de APN contiene grupos fosfato no cargados, los híbridos de APN-ARN son usualmente más estables que los híbridos de ARN-ARN o de ARN-ADN, respectivamente (Egholm et al (1993) Nature 365, 566-568).
Un armazón adicionalmente preferido comprende un nucleótido morfolínico análogo o equivalente, en el que el azúcar de la ribosa o la desoxirribosa está reemplazado por un anillo morfolínico de 6 miembros. Un análogo o equivalente nucleotídico más preferido comprende un oligómero de morfolino fosforodiamidato (PMO), en el que el azúcar ribosa o desoxirribosa está reemplazado por un anillo morfolínico de 6 miembros y el enlace fosfodiéster aniónico entre anillos morfolínicos adyacentes está reemplazado por un enlace fosforodiamidato no iónico.
En aún una realización adicional, un análogo de nucleótido o equivalente de la invención comprende una sustitución de al menos uno de los oxígenos que no están formando puentes en el enlace fosfodiéster. Esta modificación desestabiliza ligeramente la formación de pares de bases pero añade resistencia significativa a la degradación por nucleasas. Un análogo o equivalente nucleotídico preferido comprende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, H-fosfonato, metilo y otros alquilfosfonatos incluyendo 3'-alquilen-fosfonato, 5'-alquilen-fosfonato y fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster, selenofosfato o boranofosfato.
Un análogo de nucleótidos preferido adicional o equivalente de la invención comprende uno o más restos de azúcar que están mono-o di-sustituidos en la posición 2', 3' y/o 5' tal como con -OH; un -F; un alquilo (C1-C10), alquenilo (C1-C10), alquinilo (C1-C10),, alcarilo (C1-C10), alilo (C1-C10), arilo (C1-C10), o aralquilo (C1-C10), inferior lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que puede estar interrumpido o no por uno o más heteroátomos; un O-, S-o N-alquilo; un O-, S-, o N-alquenilo; un O-, S-, o N-alquinilo; un O-, S-o N-alilo; un O-alquil-O-alquilo; un -metoxi; un -aminopropoxi; un aminoxi; un metoxietoxi; un -dimetolaminooxietoxi; y un dimetilaminoetoxietoxi. El resto azúcar puede ser una piranosa o un derivado de la misma, o una desoxipiranosa o un derivado de la misma, preferentemente
una ribosa o un derivado de la misma, o desoxirribosa o derivado de la misma. Tales restos de azúcar derivatizados preferidos comprenden Ácidos Nucleicos Inaccesibles (LNA) en los que el átomo de carbono 2' está unido al átomos de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando de este modo un resto de azúcar bicíclico. Un LNA preferido comprende ácido nucleico provisto de puentes de 2'-O,4'-C-etileno (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Suplemento N.º: 1: 241-242). Estas sustituciones vuelven al análogo o equivalente de nucleótidos resistente a ARNasa H y resistente a nucleasas e incrementan la afinidad por el ARN objetivo.
Se entiende por una persona experta que no es necesario para todas las posiciones en un oligonucleótido antisentido modificarse uniformemente. Además, más de uno de los análogos o equivalentes mencionados anteriormente se puede incorporar en un oligonucleótido antisentido individual o incluso en una posición individual en un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de la invención tiene al menos dos tipos diferentes de análogos o equivalentes.
Un oligonucleótido antisentido preferido de acuerdo con la invención comprende un oligonucleótido antisentido 2'-O-alquilfosforotioato, tal como ribosa 2'-O-metil modificada (ARN), ribosa 2'-O-etil modificada, ribosa 2'-O-propil modificada, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados.
Un oligonucleótido antisentido más preferido de acuerdo con la invención comprende una ribosa 2'-O-metil-fosforotioato.
Un equivalente funcional de un oligonucleótido antisentido de la invención se puede definir como un oligonucleótido según se define en el presente documento en el que una actividad de dicho equivalente funcional se mantiene al menos en algún grado. Preferentemente, una actividad de dicho equivalente funcional es inducir salto del exón 45 y proporcionar una proteína distrofina funcional. Dicha actividad de dicho equivalente funcional se evalúa preferentemente por lo tanto por detección de salto del exón 45 y cuantificando la cantidad de una proteína distrofina funcional. Una proteína de distrofina funcional se define preferentemente en el presente documento como que es una distrofina capaz de unir actina y miembros del complejo proteico DGC. La valoración de dicha actividad de un oligonucleótido se hace preferentemente por RT-PCR o por análisis de inmunofluorescencia o de prueba de bandas de Western. Dicha actividad se mantiene preferentemente al menos en algún grado cuando ella representa al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o más de la actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente funcional. A lo largo de esta memoria descriptiva, cuando la palabra oligonucleótido se usa se puede reemplazar por un equivalente funcional del mismo según se define en el presente documento.
Se entenderá también por una persona experta que oligonucleótidos antisentido distintos se pueden combinar para el salto de manera eficaz del exón 45 del pre-ARNm de DMD humano. En una realización preferida, una combinación de al menos dos oligonucleótidos antisentido se usa en un procedimiento de la invención, tal como dos oligonucleótidos antisentido distintos, tres oligonucleótidos antisentido distintos, cuatro oligonucleótidos antisentido distintos, o cinco oligonucleótidos antisentido distintos o incluso más. También está abarcado por la presente divulgación combinar varios oligonucleótidos o moléculas como se representan en la tabla 1 salvo SEC ID N.º: 68.
Un oligonucleótido antisentido puede unirse a un resto que potencia la captación del oligonucleótido antisentido en células, preferentemente células miogénicas o células musculares. Ejemplos de tales restos son colesteroles, carbohidratos, vitaminas, biotina, lípidos, fosfolípidos, péptidos de penetración celular que incluyen pero no están limitados a antennapedia, TAT, transportano y aminoácidos cargados positivamente tales como oligoarginina, poliarginina, oligolisina o polilisina, dominios de unión a antígenos tales como proporcionados por un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, o un dominio de unión a antígenos de cadena individual tal como un dominio de unión a antígenos de cadena individual de camélidos.
Un oligonucleótido antisentido preferido comprende un PMO unido a péptido.
Un oligonucleótido antisentido preferido que comprende uno o más análogos o equivalentes de nucleótidos de la invención modula ayustamiento en una o más células musculares, incluyendo células musculares cardiacas, tras administración sistémica. A este respecto, la administración sistémica de un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo o equivalente nucleotídico específico podría resultar en marcar como objetivo un subconjunto de células musculares, mientras que un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo nucleotídico distinto da como resultado el marcado como objetivo de un subgrupo diferente de células musculares. Por lo tanto, en una realización se prefiere usar una combinación de oligonucleótidos antisentido que comprende diferentes análogos o equivalentes de nucleótidos para modular el salto de exón 45 del pre-ARNm de DMD humano.
En la divulgación, una célula puede proverse con una molécula capaz de interferir con secuencias esenciales que dan como resultado el salto altamente eficiente de exón 45 del pre-ARNm de DMD humano por expresión oligonucleotídica antisentido derivada de plásmidos o por expresión vírica proporcionada por un vector basado en virus. Un vector basado en virus tal comprende un casete de expresión que dirige la expresión de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento. Vectores basados en virus preferidos incluyen vectores basados en adenovirus o vectores basados en virus adenoasociados. La expresión se dirige preferentemente por un promotor de polimerasa III, tal como un promotor de ARN U1, un promotor de ARN U6, o un promotor de ARN U7. Una célula muscular o
miogénica se puede proporcionar con un plásmido para expresión oligonucleotídica antisentido proporcionando el plásmido en una solución acuosa. Alternativamente, se puede proporcionar un plásmido por transfección usando agentes de transfección tales como, por ejemplo, LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) o polietilenimida (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), o derivados de los mismos.
Un sistema de expresión de oligonucleótidos antisentido preferido es un vector basado en virus asociados a adenovirus (AAV). Se han desarrollado vectores basados en AAV de cadena individual y de cadena doble que se pueden usar para expresión prolongada de secuencias nucleotídicas antisentido pequeñas para el salto altamente eficiente del exón 45 del pre-ARNm de DMD.
Un vector basado en AAV preferido comprende un casete de expresión que está dirigido por un promotor de la polimerasa III (Pol III). Un promotor Pol III preferido es, por ejemplo, un promotor de ARN U1, un promotor de ARN U6,
o un promotor de ARN U7.
La invención por lo tanto proporciona también un vector basado en virus, que comprende un casete de expresión dirigido por promotor Pol III para expresión de una o más secuencias antisentido de la invención para inducir el salto del exon 45 del pre-ARNm de DMD humano.
Composición farmacéutica
Si se requiere, un oligonucleótido antisentido de la invención o un vector que expresa un oligonucleótido antisentido de la invención se puede incorporar en una mezcla o composición farmacéuticamente activa añadiendo un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición, preferentemente una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención, y/o un vector basado en virus que expresa las secuencia(s) antisentido de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica preferida comprende un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento y/o un vector según se define en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, combinado opcionalmente con un oligonucleótido antisentido y/o un vector que es capaz de modular el salto del exón 7, 44, 46, 51, 53, 59, 67 del pre-ARNm de DMD.
Los excipientes preferidos incluyen excipientes capaces de formar complejos, vesículas y/o liposomas que administran un molécula según se define en el presente documento, preferentemente un oligonucleótido que forma un complejo o atrapado en una vesícula o liposoma por una membrana celular. Se conocen en la técnica muchos de estos excipientes. Los excipientes adecuados comprenden polietilenimina y derivados, o polímeros catiónicos similares, incluyendo copolímeros de polipropilenimina o polietilenimina (PEC) y derivados, anfífilos sintéticos, lipofectinaTM, DOTAP y/o proteínas de cápsides víricas que son capaces de autoensamblaje en partículas que pueden administrar tal oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento a una célula, preferentemente a una célula muscular. Se ha demostrado que tales excipientes administran de forma eficaz ácidos nucleicos (oligonucleótidos tales como antisentido) a una amplia diversidad de células cultivadas, incluyendo células musculares. Los inventores presentes han obtenido resultados muy buenos usando polietilenimina (PEI, ExGen500, MBI Fermentas) como se muestra en el ejemplo. Su potencial de transfección alto se combina con una toxicidad de baja a moderada exenta en términos de supervivencia celular general. La facilidad de modificación estructural se puede usar para permitir modificaciones adicionales y el análisis de sus características de transferencia de ácidos nucleicos (in vivo) adicionales y de su toxicidad adicional.
La lipofectina representa un ejemplo de agente de transfección liposomal. Consiste en dos componentes lipídicos, un lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal metilsulfato) y un lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). El componente neutro media la liberación intracelular. Otro grupo de sistemas de administración son nanopartículas poliméricas.
Policationes tales como dietilaminoetilaminoetil (DEAE)-dextrano, que se conoce bien como reactivo de transfección de ADN puede combinarse con cianoacrilato de butilo (PBCA) y cianoacrilato de hexilo (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden administrar un oligonucleótido antisentido a través de las membranas celulares dentro de las células.
Además de estos materiales de nanopartículas comunes, el péptido catiónico protamina ofrece una aproximación alternativa para formular un oligonucleótido antisentido como coloides. Este sistema de nanopartículas coloidal puede formar los así llamados proticles,que se pueden preparar por un simple procedimiento de autoensamblaje para empaquetar un oligonucleótido antisentido y mediar liberación intracelular de un oligonucleótido antisentido. La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los excipientes anteriores u otros excipientes y sistemas de administración comercialmente disponibles alternativos para empaquetar y administrar un oligonucleótido antisentido para usar en la invención actual para administrar dicho oligonucleótido antisentido para el tratamiento de Distrofia Muscular de Duchenne en seres humanos.
Además, un oligonucleótido antisentido podría unirse covalentemente o no covalentemente a un ligando objetivo
específicamente diseñado para facilitar la captación dentro de la célula, dentro del citoplasma y/o de su núcleo. Tal ligando podría comprender (i) un compuesto (incluyendo pero no limitado a estructuras peptídicas (o estructuras similares a las peptídicas)) que reconoce elementos celulares, tisulares o de órganos que facilita la captación celular y/o (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la captación dentro de las células y/o la liberación intracelular de un oligonucleótido antisentido a partir de vesículas, por ejemplo endosomas o lisosomas.
Por lo tanto, en una realización preferida, se formula un oligonucleótido antisentido en un medicamento que se proporciona con al menos un excipiente y/o un ligando que dirige a objetivo para administración y/o con un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula y/o que potencia su administración intracelular. De acuerdo con ello, la invención también comprende una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un oligonucleótido antisentido y que comprende adicionalmente al menos un excipiente y/o un ligando que dirige a objetivo para administración y/o un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula y/o que potencia su administración intracelular. Se entiende que un oligonucleótido antisentido puede no estar formulado en una composición o preparación individual. Dependiendo de su identidad, la persona experta conocerá que tipo de formulación es la más apropiada para cada compuesto.
En una realización preferida, se usa una concentración in vitro de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento, que está oscilando entre 0,1 nM y 1 mM. Más preferentemente, la concentración usada está oscilando entre 0,3 a 400 nM, incluso más preferentemente entre 1 a 200 nM de molécula o un oligonucleótido según se define en el presente documento se puede usar a una dosis que está oscilando entre 0,1 y 20 mg/kg, preferentemente 0,5 y 10 mg/kg. Si se usan varios oligonucleótidos antisentido, estas concentraciones pueden referirse a la concentración total de oligonucleótidos antisentido o a la concentración de cada oligonucleótido antisentido añadido. Los intervalos de concentración de oligonucleótido(s) antisentido como se dan anteriormente son concentraciones preferidas para usos in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del/de los oligonucleótido(s) antisentido usado(s), de la célula objetivo a tratarse, del objetivo génico y de sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de incubación y de transfección, la concentración de oligonucleótido(s) usada puede variar adicionalmente y puede necesitar optimizarse algo adicionalmente.
Más preferentemente, un oligonucleótido antisentido y un compuesto adjunto a usarse en la invención para evitar, tratar DMD se producen de forma sintética y se administran directamente a una célula, un tejido, un órgano y/o pacientes en forma de formulación en una composición o preparación farmacéuticamente aceptable. La administración de una composición farmacéutica al sujeto se lleva a cabo preferentemente por una o más inyecciones parenterales, por ejemplo administraciones intravenosa y/o subcutánea y/o intramuscular y/o intratecal y/o intraventricular, preferentemente inyecciones, en uno o en múltiples sitios en el cuerpo humano.
Uso
En aún un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención, y/o un vector basado en virus que expresa una o más secuencias antisentido de acuerdo con la invención y/o una composición farmacéutica, para inducir y/o promover ayustamiento del pre-ARNm de DMD . El ayustamiento está modulado preferentemente en una célula miogénica humana o en una célula muscular in vitro. Es más preferido que el ayustamiento esté modulado en seres humanos en una célula miogénica o en una célula muscular in vivo.
De acuerdo con ello, la invención se refiere adicionalmente al uso de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento y/o del vector según se define en el presente documento y/o de la composición farmacéutica según se define en el presente documento induciendo y/o promoviendo el ayustamiento del pre-ARNm de DMD o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente de DMD.
En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprende" y sus conjugaciones se usan en sentido no limitativo para significar que los elementos después de la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además el verbo "consistir" se puede reemplazar por "consistir esencialmente en" significando que un oligonucleótido antisentido o un vector basado en virus o una composición según se define en el presente documento pueden comprender componente(s) adicional(es) a los identificados específicamente, no alterando dichos componente(s) adicionales la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido"un" or"una" no excluye la posibilidad de que más de un elemento esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" significa normalmente "al menos uno".
Cada una de las realizaciones como se identifican en el presente documento pueden combinarse conjuntamente a menos que se indique lo contrario. Todas las patentes y referencias bibliográficas citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan por la presente por referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solo para propósitos ilustrativos, y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.
Legendas de la figura
Figura 1. En los miotubos de control de seres humanos, una serie de AON (PS220 a PS225; SEC ID N.º: 3 a 8), todos
uniendo a un tramo continuo de al menos 21 nucleótidos dentro de una secuencia específica del exón 45 (es decir SEC ID N.º: 2), se pusieron a prueba a dos concentraciones diferentes (200 y 500 nM). Todos los seis AON fueron eficaces en inducir el salto específicoa del exón 45, como se conforma por análisis de secuencia (no mostrado). PS220 (SEC ID N.º: 3) sin embargo, indujo de forma reproducible los niveles más altos de salto del exón 45 (véase Fig. 2). (NT: células no tratadas, M: marcador de tamaño).
Figura 2. En los miotubos de control de seres humanos, se puso a prueba PS220 25-mero (SEC ID N.º: 3) a concentración creciente. Se observaron niveles de salto del exón 45 de hasta el 75 % (a 400 nM) de forma reproducible, como se valora por Análisis de Agilent LabChip.
Figura 3. En miotubos control humanos, las eficiencias de un AON45-5 17-mero "corto" (SEC ID N.º: 68) y de su homólogo PS220 25-mero "largo" solapante se compararon directamente a 200 nM y 500 nM. PS220 fue marcadamente más eficiente a ambas concentraciones: al 63 % cuando se compara con al 3 % obtenido con 45-5. (NT: células no tratadas, M: marcador de tamaño).
Ejemplos
Ejemplos 1 y 2
Materiales y procedimientos
El diseño de AON estaba basado en estructuras secundarias abiertas (parcialmente) solapantes del ARN de exón objetivo como se predijo por el programa m-fold (Zuker,M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415) y estaba basado en sitios de unión a proteína SR teóricos (parcialmente) solapantes como se predijo por numerosos programas de software tales como ESEfinder (Cartegni,L. et al.(2003) ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res, 31, 3568-71; Smith, P.
J. et al. (2006) An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers. Hum.Mol.Genet., 15, 2490-2508) que predice sitios de unión para las cuatro proteínas SR más abundantes (SF2/ASF, SC35, SRp40 y SRp55). AON se sintetizaron por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Países Bajos) y contienen 2'-O-metil ARN y armazones de fosforotioato (PS) de longitud total.
Cultivo de tejidos, transfección y análisis por RT-PCR
Los cultivos de miotubos derivados de un individuo saludable ("ser humano control") se obtuvieron como se describe anteriormente (Aartsma-Rus et al. Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14). Para el rastreo de los AON, se transfectaron los cultivos de miotubos con 0 a 500 nM de cada AON. El reactivo de transfección polietilenimina (PEI, ExGen500 MBI Fermentas) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 2 µl de PEI por µg de AON. Las eficacias de salto del exón se determinaron por análisis de RT-PCR anidada usando cebadores en los exones que flanquean el exón 45. Se aislaron fragmentos de PCR a partir de geles de agarosa para verificación de secuencia. Para cuantificación, los productos de PCR se analizaron usando el kit Agilent DNA 1000 LabChip y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EE.UU.).
Resultados
Una serie de secuencias dirigidas a objetivo de AON dentro de SEC ID N.º: 2 dentro del exón 45 se diseñaron y se pusieron a prueba en cultivos de miotubos normales, por transfección y RT-PCR subsiguiente y análisis de secuencia de ARN aislado subsiguiente. PS220 (SEC ID N.º: 3) indujo reproduciblemente niveles más altos de salto del exón 45, cuando se comparó con PS221-PS225 (Figura 1). Niveles altos de salto de 45 hasta el 75 % se obtuvieron ya a PS220 400 nM (Figura 2). En una comparación directa, PS220 (un 25-mero) fue de forma reproducible más eficiente en inducir el salto del exón 45 que su homólogo 17-mero más corto AON 45-5 (SEC ID N.º: 68; anteriormente publicado como h45AON5 (Aartsma-Rus et al. Am J Hum Genet 2004; 74: 83-92)), tanto a concentraciones de AON de 200 nM como de 500 nM y con el 63 % frente al 3% respectivamente a 500 nM (Figura 3). Este resultado se debe probablemente al hecho de que la longitud prolongada de PS220, de hecho solapando completamente AON 45-5, incrementa la energía libre del complejo AON-objetivo de tal forma que también se incrementa la eficacia de inducir el salto del exón 45.
Listado de secuencias
<110> Academisch ziekenhuis Leiden Prosensa B.V. Prosensa Holding B.v.
5 Prosensa Technologies B.v.
<120> Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de DMD
<130> P6024691PCT
<150> PCT/JP2007/50673
<151> 27/10/2008 10 <160> 236
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3685
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 75
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> exón
<400> 2
10 <210> 3
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 15 <223> oligonucleótido
<400> 2 uuugccgcug cccaaugcca uccug 25
<210> 4
<211> 25 20 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 4
auucaauguu cugacaacag uugc 25 5 <210> 5
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 10 <223> oligonucleótido
<400> 5 ccaguugcau ucaauguucu gacaa 25
<210> 6
<211> 22 15 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 6 20 caguugcauu caauguucug ac 22
<210> 7
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial 25 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 7 aguugcauuc aauguucuga 20
<210> 8 30 <211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
35 <400> 8 gauugcugaa uuauuucuuc c 21
<210> 9
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 5 <223> oligonucleótido
<400> 9 gauugcugaa uuauuucuuc cccag 25
<210> 10
<211> 25 10 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 10 15 auugcugaau uauuucuucc ccagu 25
<210> 11
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 20 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 11 uugcugaauu auuucuuccc caguu 25
<210> 12 25 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
30 <400> 12 ugcugaauua uuucuucccc aguug 25
<210> 13
<211> 25
<212> ARN 35 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 13 gcugaauuau uucuucccca guugc 25
<210> 14
<211> 25 5 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 14 10 cugaauuaauu ucuuccccag uugca 25
<210> 15
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 15 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 15 ugaauuauuu cuuccccagu ugcau 25
<210> 16 20 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
25 <400> 16 gaauuauuc uuccccaguu gcauu 25
<210> 17
<211> 25
<212> ARN 30 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 17
aauuauuucu uccccaguug cauuc 25 35 <210> 18
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 18 5 auuauuucuu ccccaguugc auca 25
<210> 19
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 10 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 19 uuauuucuuc cccaguugca uucaa 25
<210> 20 15 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
20 <400> 20 uauuucuucc ccaguugcau ucaau 25
<210> 21
<211> 25
<212> ARN 25 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 21
auuucuuccc caguugcauu caaug 25 30 <210> 22
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 35 <223> oligonucleótido
<400> 22 uuucuucccc aguugcauuc aaugu 25
<210> 23
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 5 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 23 ucuuccccag uugcauucaa uguuc 25
<210> 24 10 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
15 <400> 24 ucuuccccag ugcauuca uguuc 25
<210> 25
<211> 25
<212> ARN 20 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 25
cuuccccagu ugcauucaau guucu 25 25 <210> 26
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 30 <223> oligonucleótido
<400> 26 uuccccaguu gcauucaaug uucug 25
<210> 27
<211> 25 35 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 27 uccccaguug cauucaaugu ucuga 25
<210> 28 5 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
10 <400> 28 ccccaguugc auucaauguu cugac 25
<210> 29
<211> 25
<212> ARN 15 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 29
cccaguugca uucaauguuc ugaca 25 20 <210> 30
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 25 <223> oligonucleótido
<400> 30 ccaguugcau ucaauguucu gacaa 25
<210> 31
<211> 25 30 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 31 35 caguugcauu caauguucug acaac 25
<210> 32
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
5 <400> 32 aguugcauuc aaguucuga caaca 25
<210> 33
<211> 20
<212> ARN 10 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 33
uccuguagaa uacuggcauc 20 15 <210> 34
<211> 27
<212> ARN
<213> artificial
<220> 20 <223> oligonucleótido
<400> 34 ugcagaccuc cugccaccgc agauuca 27
<210> 35
<211> 34 25 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 35 30 uugcagaccu ccugccaccg cagauucagg cuuc 34
<210> 36
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 35 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 36
guugcauuca auguucugac aacag 25
<210> 37
<211> 25
<212> ARN 5 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 37
uugcauucaa uguucugaca acagu 25 10 <210> 38
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 15 <223> oligonucleótido
<400> 38 ugcauucaau guucugacaa caguu 25
<210> 39
<211> 25 20 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 39 25 gcauucaaug uucugacaac aguuu 25
<210> 40
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 30 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 40 cauucaaugu ucugacaaca guuug 25
<210> 41 35 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 41
auucaauguu cugacaacag uuugc 25 5 <210> 42
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 10 <223> oligonucleótido
<400> 42 ucaauguucu gacaacaguu ugccg 25
<210> 43
<211> 25 15 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 43 20 caauguucug acaacaguuu gccgc 25
<210> 44
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 25 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 44 aauguucuga caacaguuug ccgcu 25
<210> 45 30 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
35 <400> 45 auguucugac aacaguuugc cgcug 25
<210> 46
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 5 <223> oligonucleótido
<400> 46 uguucugaca acaguuugcc gcugc 25
<210> 47
<211> 25 10 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 47 15 guucugacaa caguuugccg cugcc 25
<210> 48
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 20 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 48 uucugacaac aguuugccgc ugccc 25
<210> 49 25 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
30 <400> 49 ucugacaaca guuuugccgcu gccca 25
<210> 50
<211> 25
<212> ARN 35 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 50 cugacaacag uuugccgcug cccaa 25
<210> 51
<211> 25 5 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 51 10 ugacaacagu uugccgcugc ccaau 25
<210> 52
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 15 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 52 gacaacaguu ugccgcugcc caaug 25
<210> 53 20 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
25 <400> 53 acaacaguuu gccgcugccc aaugc 25
<210> 54
<211> 25
<212> ARN 30 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 54
caacaguuug ccgcugccca augcc 25 35 <210> 55
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 55 5 aacaguuugc cgcugcccaa ugcca 25
<210> 56
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 10 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 56 acaguuugcc gcugcccaau gccau 25
<210> 57 15 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
20 <400> 57 caguuugccg cugcccaaug ccauc 25
<210> 58
<211> 25
<212> ARN 25 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 58
aguuugccgc ugcccaaugc caucc 25 30 <210> 59
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 35 <223> oligonucleótido
<400> 59 guuugccgcu gcccaaugcc auccu 25
<210> 60
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 5 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 60 uuugccgcug cccaaugcca uccug 25
<210> 61 10 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
15 <400> 61 uugccgcugc ccaaugccau ccugg 25
<210> 62
<211> 25
<212> ARN 20 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 62
ugccgcugcc caaugccauc cugga 25 25 <210> 63
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 30 <223> oligonucleótido
<400> 63 gccgcugccc aaugccaucc uggag 25
<210> 64
<211> 25 35 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 64 ccgugccca augccauccu ggagu 25
<210> 65 5 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
10 <400> 65 cgcugcccaa ugccauccug gaguu 25
<210> 66
<211> 20
<212> ARN 15 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 66
uguuuuugag gauugcugaa 20 20 <210> 67
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 25 <223> oligonucleótido
<400> 67 uguucugaca acaguuugcc gcugcccaau gccauccugg gccauccugg 40
<210> 68
<211> 17 30 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 68 35 gcccaaugcc auccugg 17
<210> 69
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
5 <400> 69 agagcaggua ccuccaacau caagg 25
<210> 70
<211> 25
<212> ARN 10 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 70
gagcagguac cuccaacauc aagga 25 15 <210> 71
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 20 <223> oligonucleótido
<400> 71 agcagguacc uccaacauca aggaa 25
<210> 72
<211> 25 25 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 72 30 gcagguaccu ccaacaucaa ggaag 25
<210> 73
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 35 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 73
caggucccuc caacaucaag gaaga 25
<210> 74
<211> 25
<212> ARN 5 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 74
agguaccucc aacuacaagg aagau 25 10 <210> 75
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 15 <223> oligonucleótido
<400> 75 gguaccucca acaucaagga agaug 25
<210> 76
<211> 25 20 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 76 25 guaccuccaa caucaaggaa gaugg 25
<210> 77
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 30 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 77 uaccuccac aucaaggaag auggc 25
<210> 78 35 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 78
accuccaaca ucaaggaaga uggca 25 5 <210> 79
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 10 <223> oligonucleótido
<400> 79 ccuccaacau caaggaagau ggcau 25
<210> 80
<211> 25 15 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 80 20 cuccaacauc aaggaagaug gcauu 25
<210> 81
<211> 30
<212> ARN
<213> artificial 25 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 81 cuccaacauc aaggaagaug gcauuucuag 30
<210> 82 30 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
35 <400> 82 uccaacauca aggaagaugg cauuu 25
<210> 83
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 5 <223> oligonucleótido
<400> 83 ccaacaucaaggaagauggc auuuc 25
<210> 84
<211> 25 10 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 84 15 caacaucaag gaagauggca uuucu 25
<210> 85
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 20 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 85 aacaucaagg aagauggcau uucua 25
<210> 86 25 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
30 <400> 86 acaucaagga agauggcauu ucuag 25
<210> 87
<211> 30
<212> ARN 35 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 87 acaucaagga agauggcauu ucuaguuugg 30
<210> 88
<211> 25 5 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 88 10 acaucaagga agauggcauu ucuag 25
<210> 89
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 15 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 89 caucaaggaa gauggcauuu cuagu 25
<210> 90 20 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
25 <400> 90 aucaaggaag auggcauuuc uaguu 25
<210> 91
<211> 25
<212> ARN 30 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 91
ucaaggaaga uggcauuucu aguuu 25 35 <210> 92
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 92 5 ucaaggaaga uggcauuucu 20
<210> 93
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 10 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 93 caaggaagau ggcauuucua guuug 25
<210> 94 15 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
20 <400> 94 aaggaagaug gcauuucuag uuugg 25
<210> 95
<211> 25
<212> ARN 25 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 95
aggaagaugg cauuucuagu uugga 25 30 <210> 96
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 35 <223> oligonucleótido
<400> 96 ggaagauggc auuucuaguu uggag 25
<210> 97
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 5 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 97 gaagauggca uuucuaguuu ggaga 25
<210> 98 10 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
15 <400> 98 aagauggcau uucuaguuug gagau 25
<210> 99
<211> 25
<212> ARN 20 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 99
agauggcauu ucuaguuugg agaug 25 25 <210> 100
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 30 <223> oligonucleótido
<400> 100 gauggcauuu cuaguuugga gaugg 25
<210> 101
<211> 25 35 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 101 auggcauuuc uaguuuggag auggc 25
<210> 102 5 <211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
10 <400> 102 uggcauuucu aguuuggaga uggca 25
<210> 103
<211> 25
<212> ARN 15 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 103
ggcauuucua guuuggagau ggcag 25 20 <210> 103
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 25 <223> oligonucleótido
<400> 103 ggcauuucua guuuggagau ggcag 25
<210> 104
<211> 25 30 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 104 35 gcauuucuag uuuggagaug gcagu 25
<210> 105
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
5 <400> 105 cauuucuagu uuggagaugg caguu 25
<210> 106
<211> 25
<212> ARN 10 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 106
auuucuaguu uggagauggc aguuu 25 15 <210> 107
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> 20 <223> oligonucleótido
<400> 107 uuucuaguuu ggagauggca guuuc 25
<210> 108
<211> 25 25 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 108 30 uucuaguuug gagauggcag uuucc 25
<210> 109
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 35 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 109
ccauuguguu gaauccuuua acauu 25
<210> 110
<211> 22
<212> ARN 5 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 110
ccauuguguu gaauccuuua ac 22 10 <210> 111
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220> 15 <223> oligonucleótido
<400> 111 auuguguuga auccuuuaac 20
<210> 112
<211> 20 20 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 112 25 ccuguccuaa gaccugcuca 20
<210> 113
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 30 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 113 cuuuuggauu gcaucuacug uauag 25
<210> 114 35 <211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 114
cauucaacug uugccuccgg uucug 25 5 <210> 115
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220> 10 <223> oligonucleótido
<400> 115 cuguugccuc cgguucuga ggug 24
<210> 116
<211> 31 15 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 116 20 cauucaacug uugccuccgg uucugaaggu g 31
<210> 117
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 25 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 117 cugaaggugu ucuuguacuu caucc 25
<210> 118 30 <211> 27
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
35 <400> 118 uguauaggga cccuccuucc augacuc 27
<210> 119
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220> 5 <223> oligonucleótido
<400> 119 aucccacuga uucugaauuc 20
<210> 120
<211> 22 10 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 120 15 uuggcucugg ccuguccuaa ga 22
<210> 121
<211> 35
<212> ARN
<213> artificial 20 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 121 aagaccugcu cagcuucuuc cuuagcuucc agcca 35
<210> 122 25 <211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
30 <400> 122 ugcauguucc agucguugug ugg 23
<210> 123
<211> 25
<212> ARN 35 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 122 ugcauguucc agucguugug ugg 23
<210> 123
<211> 25 5 <212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 123 10 cacuauucca gucaaauagg ucugg 25
<210> 124
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial 15 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 124 auuuaccaac cuucaggauc gagua 25
<210> 125 20 <211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
25 <400> 125 ggccuaaaac acauacacau a 21
<210> 126
<211> 20
<212> ARN 30 <213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 123
ucagcuucug uuagccacug 20 35 <210> 127
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 127 uucagcuucu guuagccacu 20
<210> 128
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 128 uucagcuucu guuagccacu g 21
<210> 129
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 129 ucagcuucug uuagccacug a 21
<210> 130
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 130 uucagcuucu guuagccacu ga 22
<210> 131
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 131 ucagcuucug uuagccacug a 21
<210> 132
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 132 uucagcuucu guuagccacu ga 22
<210> 133
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 133 ucagcuucug uuagccacug au 22
<210> 134
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 134 uucagcuucu guuagccacu gau 23
<210> 135
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 135 ucagcuucug uuagccacug auu 23
<210> 136
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220> <223> oligonucleótido
<400> 136 uucagcuucu guuagccacu gauuu 24
<210> 137
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 137 ucagcuucug uuagccacug auua 24
<210> 138
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 138 uucagcuucu guuagccacu gaua 24
<210> 139
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 139 ucagcuucug uuagccacug auuaa 25
<210> 140
<211> 26
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 140 uucagcuucu guuagccacu gauuaa 26
<210> 141
<211> 26
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 141 ucagcuucug uuagccacug auuaaa 26
<210> 142
<211> 27
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 142 uucagcuucu guuagccacu gauuaaa 27
<210> 143
<211> 19
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 143 cagcuucugu uagccacug 19
<210> 144
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 144 cagcuucugu uagccacuga u 21
<210> 145
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 145 agcuucuguu agccacuguau u 21
<210> 146
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 146 cagcuucugu uagccacuga uu 22
<210> 147
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 147 agcuucuguu agccacugau ua 22
<210> 148
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 148 cagcuucugu uagccacuga uua 23
<210> 149
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 149 agcuucuguu agccacugau uaa 23
<210> 150
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 150 cagcuucugu uagccacuga uuaa
<210> 151
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 151 agcuucuguu agccacugau uaaa 24
<210> 152
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 152 cagcuucugu uagccacuga uuaaa 25
<210> 153
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 153 agcuucuguu agccacugau uaaa 24
<210> 154
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 154 agcuucuguu agccacugau 20
<210> 155
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 155 gcuucuguua gccacugauu 20
<210> 156
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 156 agcuucuguu agccacugau u 21
<210> 157
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 157 gcuucuguua gccacugauu a 21
<210> 158
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 158 agcuucuguu agccacugau ua 22
<210> 159
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 159
gcuucuguua gccacugauu aa 22
<210> 160
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 160 agcuucuguu agccacugau uaa 23
<210> 161
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 161 gcuucuguua gccacugauu aaa 23
<210> 162
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 162 agcuucuguu agccacugau uaaa 27
<210> 163
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 163 gcuucuguua gccacugauu aaa 23
<210> 164
<211> 24
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 164 ccauuuguau uuagcauguu ccc 23
<210> 165
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 165 agauaccauu uguauuuagc 20
<210> 166
<211> 19
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 166 gccauuucuc aacagaucu 19
<210> 167
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 167 gccauuucuc aacagaucug uca 23
<210> 168
<211> 23
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 168 auucucagga auuugugucu uuc 23
<210> 169
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 169 ucucaggaau uugugucuuu c 21
<210> 170
<211> 18
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 170 guucagcuuc uguuagcc 18
<210> 171
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 171 cugauuaaau aucuuuauau 21
<210> 172
<211> 18
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 172 gccgccauuu cucaacag 18
<210> 173
<211> 18
<212> ARN
<213> artificial
<220> <223> oligonucleótido
<400> 173 guauuuagca uguucccca 18
<210> 174
<211> 18
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 174 caggaauuug ugucuuuc 18
<210> 175
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 175 gcuuuuucuuu uaguugcugc ucuuu 25
<210> 176
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 176 cuuuucuuuu aguugcugcu cuuuu 25
<210> 177
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 177 uuuucuuuua guugcugcuc uuuuc 25
<210> 178
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 178 uuucuuuuag uugcugcucu uuucc 25
<210> 179
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 179 uucuuuuagu ugcugcucuu uucca 25
<210> 180
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 180 ucuuuuaguu gcugcucuuu uccag 25
<210> 181
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 181 cuuuuaguug cugcucuuuu ccagg 25
<210> 182
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 182 uuuuaguugc ugcucuuuuc caggu 25
<210> 183
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 183 uuuaguugcu gcucuuuucc agguu 25
<210> 184
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 184 uuaguugcug cucuuuuca gguuc 25
<210> 185
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 185 uaguugcugc ucuuuuccag guuca 25
<210> 186
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 186 aguugcugcu cuuuuccagg uucaa 25
<210> 187
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 187 guugcugcuc uuuuccaggu ucaag 25
<210> 188
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 188 uugcugcucu uuuccagguu caagu 25
<210> 189
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 189 ugcugcucuu uuccagguuc aagug 25
<210> 190
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 190 gcugcucuuu uccagguuca agugg 25
<210> 191
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 191 cugcucuuuu ccagguucaa guggg 25
<210> 192
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 192 ugcucuuuuc cagguucaag uggga 25
<210> 193
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 193 gcucuuuucc agguucaagu gggac 25
<210> 194
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 194 cucuuuucca gguucaagug ggaua 25
<210> 195
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 195 ucuuuuccag guucaagugg gauac 25
<210> 196
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 196
cuuuuccagg uucaaguggg auacu 25
<210> 197
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 197 uuuuccaggu ucaaguggga uacua 25
<210> 198
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 198 uuuccagguu caagugggau acuag 25
<210> 199
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 199 uuccagguuc aagugggaua cuagc 25
<210> 200
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 200 uccagguuca agugggauac uagca 25
<210> 201
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 201 ccagguucaa gugggauacu agcaa 25
<210> 202
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 202 cagguucaag ugggauacua gcaau 25
<210> 203
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 203 agguucaagu ggauacuag caaug 25
<210> 204
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 204 gguucaagug ggauacuagc aaugu 25
<210> 205
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 205 guucaagugg gauacuagca auguu 25
<210> 206
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 206 uucaaguggg auacuagcaa uguua 25
<210> 207
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 207 ucaaguggga uacuagcaau guuau 25
<210> 208
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 208 caagugggau acuagcaaug uuauc 25
<210> 209
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 209 aagugggaua cuagcaaugu uaucu 25
<210> 210
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220> <223> oligonucleótido
<400> 210 agugggauac uagcaauguu aucug 25
<210> 211
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 211 gugggacuacu agcaauguua ucugc 25
<210> 212
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 212 ugggauacua gcaauguuau cugcu 25
<210> 213
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 213 gggauacuag caauguuauc ugcuu 25
<210> 214
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 214 ggauacuagc aauguuaucu gcuuc 25
<210> 215
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 215 gauacuagca auguuaucug cuucc 25
<210> 216
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 216 auacuagcaa uguuaucugc uuccu 25
<210> 217
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 217 uacuagcaau guuaucugcu uccuc 25
<210> 218
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 218 acuagcaaug uuaucuggcuu ccucc 25
<210> 219
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 219 cuagcaaugu uaucugcuuc cucca 25
<210> 220
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 220 uagcaauguu aucugcuucc uccaa 25
<210> 221
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 221 agcaauguua ucugcuuccu ccaac 25
<210> 222
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 222 gcaauguuau cugcuuccuc caacc 25
<210> 223
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 223 caauguuauc ugcuuccucc aacca 25
<210> 224
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 224 aauguuaucu gcuuccucca accau 25
<210> 225
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 225 auguuaucug cuuccuccaa ccaua 25
<210> 226
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 226 uguuaucugc uuccuccaac cauaa 25
<210> 227
<211> 25
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 227 guuaucugcu uccuccaacc auaaa 25
<210> 228
<211> 19
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 228 gcugccuuu uccaguuc 19
<210> 229
<211> 20
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 229 ucuuuuccag guucaagugg 20
<210> 230
<211> 19
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 230 agguucaagu gggauacua 19
<210> 231
<211> 21
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 231 caauuuuucc cacucaguau u 21
<210> 232
<211> 19
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 232 uugaaguucc uggagucuu 19
<210> 233
<211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 233
uccucaggag gcagcucuaa au 22
<210> 234
<211> 26
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 234 gcgcugguca caaaauuccug uugaac 26
<210> 235
<211> 27
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 235 cacuugcuug aaaaggucua caaagga 27
<210> 236
<211> 26
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 236 ggugaauaac uuacaaauuu ggaagc 26

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un oligonucleótido antisentido que comprende la secuencia nucleotídica SEC ID N.º: 3.
  2. 2.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la secuencia nucleotídica antisentido SEC ID N.º: 3.
  3. 3.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que al menos uno de los nucleótidos es un análogo nucleotídico.
  4. 4.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende un residuo de ARN, y/o un residuo de ADN.
  5. 5.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia del oligonucleótido antisentido comprende al menos un análogo nucleotídico, en el que un análogo nucleotídico se define como un residuo que tiene una base modificada, y/o un armazón modificado, y/o un enlace internucleosídico no natural, o una combinación de estas modificaciones.
  6. 6.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el análogo nucleotídico tiene una base modificada.
  7. 7.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el análogo nucleotídico tiene un armazón modificado.
  8. 8.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el análogo nucleotídico comprende uno o más restos de azúcar que están mono-o disustituidos en la posición 2', 3' y/o 5'.
  9. 9.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un oligonucleótido antisentido de fosforotioato 2'-O-alquil sustituido.
  10. 10.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende una ribosa 2'-O-metil-fosforotioato.
  11. 11.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende un oligonucleótido antisentido fosforotioato que comprende la secuencia de nucleótidos 5' uuugccgcug cccaaugcca uccug 3' (SEC ID N.º: 3) en la que los restos de azúcar están cada uno 2'-O-metil sustituidos.
  12. 12.
    Un oligonucleótido antisentido que es un oligonucleótido antisentido fosforotioato que tiene la secuencia de nucleótidos 5' uuugccgcug cccaaugcca uccug 3' (SEC ID N.º: 3) en la que los restos de azúcar están 2'-O-metil sustituidos.
  13. 13.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el armazón modificado está seleccionado del grupo que consiste en un armazón morfolínico, un armazón de carbamato, un armazón de siloxano, un armazón de sulfuro, un armazón de sulfóxido, un armazón de sulfona, un armazón de formacetilo, un armazón de tioformacetilo, un armazón de metilenformacetilo, un armazón de riboacetilo, un armazón que contiene alquenos, un armazón de sulfamato, un armazón de sulfonato, un armazón de sulfonamida, un armazón de metilenimino, un armazón de metilenhidrazino y un armazón de amida.
  14. 14.
    Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o 13, que comprende oligómero de morfolino fosforodiamidato (PMO), ácido nucleico peptídico y/o ácido nucleico bloqueado.
  15. 15.
    Un vector basado en virus, que comprende un casete de expresión que dirige la expresión del oligonucleótido antisentido según se define en la reivindicación 1 o 2.
  16. 16.
    Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y/o el vector de la reivindicación 15, un vehículo aceptable farmacéutico y opcionalmente combinado con un oligonucleótido antisentido que es capaz de inducir o promover el salto del exón 7, 44, 46, 51, 53, 59, 67 (como se representa en la tabla 2) del pre-ARNm de distrofina de un paciente.
  17. 17.
    El oligonucleótido antisentido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, el vector de la reivindicación 15, o la composición farmacéutica de la reivindicación 16, para inducir o promover el salto del exón 45, opcionalmente en combinación con el salto de uno de los exones 7, 44, 46, 51, 53, 59, 67, en el pre-ARNm de distrofina para usar en tratar a un paciente de DMD o a un paciente de BMD.
  18. 18.
    Un procedimiento in vitro para inducir o promover el salto del exón 45 de pre-ARNm de distrofina en un paciente, preferentemente en una célula aislada de dicho paciente, comprendiendo el procedimiento proveer a dicha célula con un oligonucleótido antisentido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, con el vector de la reivindicación 15, o con la composición farmacéutica de la reivindicación 16.
  19. 19.
    Un procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el paciente es provisto con una proteína distrofina funcional y/o en el que la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho paciente está disminuida, en el que el nivel de dicha distrofina funcional es valorado por comparación con el nivel de dicha distrofina en dicho paciente en el comienzo del procedimiento.
    Fig. 2
    Rastreo de PS220 específico de Exón 45 a Concentraciones Crecientes en Miotubos Control Humanos
    Fig. 3
    Comparación del 17-mero AON45-5 frente al 25-mero PS220 en Miotubos Control Humanos
ES09788160.1T 2008-10-27 2009-01-13 Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne Active ES2532634T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
WOPCT/NL2008/050673 2008-10-27
PCT/NL2008/050673 WO2009054725A2 (en) 2007-10-26 2008-10-27 Means and methods for counteracting muscle disorders
PCT/NL2009/050006 WO2010050801A1 (en) 2008-10-27 2009-01-13 Methods and means for efficient skipping of exon 45 in duchenne muscular dystrophy pre-mrna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2532634T3 true ES2532634T3 (es) 2015-03-30
ES2532634T5 ES2532634T5 (es) 2018-04-30

Family

ID=40873329

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09788160.1T Active ES2532634T5 (es) 2008-10-27 2009-01-13 Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
ES13160338.3T Active ES2562658T3 (es) 2008-10-27 2009-01-13 Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13160338.3T Active ES2562658T3 (es) 2008-10-27 2009-01-13 Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne

Country Status (15)

Country Link
EP (4) EP2607484B1 (es)
JP (2) JP5786109B2 (es)
AU (1) AU2009310557B2 (es)
CA (3) CA2741629C (es)
CY (1) CY1116305T1 (es)
DK (2) DK2607484T3 (es)
ES (2) ES2532634T5 (es)
HK (1) HK1160169A1 (es)
HR (1) HRP20160078T1 (es)
IL (2) IL212508A (es)
NZ (1) NZ592498A (es)
PL (1) PL2607484T3 (es)
PT (2) PT2607484E (es)
SI (1) SI2607484T1 (es)
WO (2) WO2010050801A1 (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI1766010T1 (sl) 2004-06-28 2011-06-30 Univ Western Australia Protismiselni oligonukleotidi za induciranje preskakovanja eksonov in postopki za njihovo uporabo
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
CA2704049A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
CA3066050A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
WO2011036640A2 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Cellectis Meganuclease reagents of uses thereof for treating genetic diseases caused by frame shift/non sense mutations
PL2499249T3 (pl) 2009-11-12 2019-03-29 Univ Western Australia Cząsteczki antysensowne i sposoby leczenia patologii
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
US9078911B2 (en) 2011-02-08 2015-07-14 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Antisense oligonucleotides
RU2619184C2 (ru) 2011-12-28 2017-05-12 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Антисмысловые нуклеиновые кислоты
CA2862628C (en) 2012-01-27 2021-08-24 Prosensa Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
CA2877644A1 (en) * 2012-07-03 2014-01-09 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients
EA202090946A3 (ru) 2013-03-14 2021-07-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Композиции, обеспечивающие пропускание экзонов, для лечения мышечной дистрофии
EP3662912A1 (en) 2013-03-15 2020-06-10 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved dosages of eteplirsen for treating duchenne muscular dystrophy
CN111235149B (zh) * 2013-09-05 2024-04-16 萨罗塔治疗公司(美国) 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
JP6519842B2 (ja) * 2013-10-04 2019-05-29 国立大学法人神戸大学 福山型筋ジストロフィー治療用アンチセンス核酸
PL3118311T3 (pl) 2014-03-12 2019-09-30 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antysensowny kwas nukleinowy
HRP20220379T1 (hr) 2014-06-10 2022-05-27 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonukleotidi korisni u liječenju pompeove bolesti
KR102473431B1 (ko) * 2015-09-15 2022-12-01 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산
EP3359523A4 (en) 2015-10-09 2019-07-24 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
CN108778344A (zh) * 2016-03-02 2018-11-09 里兰斯坦福初级大学理事会 抗流感病毒的泛基因型药剂和其使用方法
US11339392B2 (en) 2016-03-02 2022-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
EA201892366A1 (ru) 2016-04-18 2019-03-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Антисмысловые олигомеры и способы их применения для лечения заболеваний, связанных с геном кислой альфа-глюкозидазы
MA45290A (fr) * 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
KR20190024977A (ko) 2016-06-30 2019-03-08 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이상증에 대한 엑손 스킵핑 올리고머
KR20190027373A (ko) * 2016-07-05 2019-03-14 바이오마린 테크놀로지스 비.브이. 유전적 장애 치료를 위한, 특징이 개선된, 비사이클릭 스캐폴드 모이어티를 포함하는 프리-mrna 스플라이스 스위칭 또는 조정 올리고뉴클레오티드
MX2019006882A (es) 2016-12-19 2019-08-16 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
BR112019012651A2 (pt) 2016-12-19 2020-01-28 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de oligômero de salto de éxon para distrofia muscular
HUE059905T2 (hu) 2016-12-19 2023-01-28 Sarepta Therapeutics Inc Exonátugró oligomerkonjugátumok izomdisztrófiára
SG10202107429WA (en) 2017-01-06 2021-08-30 Avidity Biosciences Inc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
EP3687577A1 (en) 2017-09-28 2020-08-05 Sarepta Therapeutics, Inc. Combination therapies for treating muscular dystrophy
CN111655268B (zh) 2017-10-04 2024-03-26 艾维迪提生物科学公司 核酸-多肽组合物及其用途
CA3083526A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Andrew John Geall Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US20220251551A1 (en) * 2018-06-13 2022-08-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
KR20210081324A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3122271A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
WO2020247782A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
AU2020287880A1 (en) 2019-06-06 2022-01-20 Avidity Biosciences, Inc. UNA amidites and uses thereof
IL293997A (en) * 2019-12-19 2022-08-01 Nippon Shinyaku Co Ltd Antistrand nucleic acids that allow exon skipping
KR20220122673A (ko) 2019-12-26 2022-09-02 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 엑손 50의 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산
US20230140736A1 (en) 2020-02-28 2023-05-04 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
CA3172111A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Barbora MALECOVA Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1218544B1 (en) 1999-10-04 2009-06-03 The University of Medicine and Dentistry of New Jersey TAR RNA binding peptides
JP4836366B2 (ja) * 2000-08-25 2011-12-14 雅文 松尾 デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
AU2003225410A1 (en) * 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
SI1766010T1 (sl) * 2004-06-28 2011-06-30 Univ Western Australia Protismiselni oligonukleotidi za induciranje preskakovanja eksonov in postopki za njihovo uporabo
JP2008538500A (ja) * 2005-04-22 2008-10-30 アカデミス ツィーケンホイス ライデン ＳＲタンパク質の結合に対する干渉とＲＮＡ二次構造に対する干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節
EP1857548A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
CA2704049A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
CA3066050A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010050802A3 (en) 2010-08-12
AU2009310557A8 (en) 2011-09-29
HRP20160078T1 (hr) 2016-04-08
EP2349287A2 (en) 2011-08-03
EP2607484B1 (en) 2016-01-06
IL212508A0 (en) 2011-06-30
AU2009310557B2 (en) 2014-09-11
PL2607484T3 (pl) 2016-06-30
IL212509A (en) 2016-04-21
CA2741629A1 (en) 2010-05-06
EP2344637A1 (en) 2011-07-20
EP2344637B2 (en) 2018-02-28
PT2607484E (pt) 2016-03-09
DK2344637T4 (en) 2018-04-23
CA2741793A1 (en) 2010-05-06
DK2607484T3 (en) 2016-03-07
CY1116305T1 (el) 2017-02-08
EP2349287B1 (en) 2018-08-15
EP3400948B1 (en) 2022-11-02
WO2010050801A1 (en) 2010-05-06
IL212509A0 (en) 2011-06-30
SI2607484T1 (sl) 2016-11-30
ES2532634T5 (es) 2018-04-30
AU2009310557A1 (en) 2010-05-06
DK2344637T3 (en) 2015-02-02
AU2009310558A1 (en) 2010-05-06
CA2741793C (en) 2018-10-30
IL212508A (en) 2013-11-28
CA3017539A1 (en) 2010-05-06
JP5905260B2 (ja) 2016-04-20
JP2012506698A (ja) 2012-03-22
CA2741629C (en) 2022-07-05
AU2009310558A8 (en) 2015-01-22
EP3400948A1 (en) 2018-11-14
EP2344637B1 (en) 2014-12-24
EP2607484A1 (en) 2013-06-26
AU2009310558B2 (en) 2014-09-04
ES2562658T3 (es) 2016-03-07
HK1160169A1 (en) 2012-08-10
JP2012506697A (ja) 2012-03-22
WO2010050802A2 (en) 2010-05-06
PT2344637E (pt) 2015-03-23
JP5786109B2 (ja) 2015-09-30
NZ592498A (en) 2012-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2532634T3 (es) Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
ES2936464T3 (es) Métodos y medios para el salto eficaz de al menos el exón 52 del gen de distrofia muscular de Duchenne humana
ES2551154T3 (es) Procedimiento para la eficiente omisión del exón (44) en distrofia muscular de Duchenne y medios asociados
AU2009310558B8 (en) Methods and means for efficient skipping of at least one of the following exons of the human Duchenne muscular dystrophy gene: 43, 46, 50- 53.