JP5905260B2 - ヒトDuchenne型筋ジストロフィー遺伝子のエクソン43、46、50〜53のうちの少なくとも1個の効率的なスキッピングのための方法及び手段 - Google Patents
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Description
第一の態様において、本発明は、患者、好ましくは患者の単離細胞におけるDMD mRNA前駆体のエクソン43、46、50〜53のうちの少なくとも1個のスキッピングを誘導及び/又は促進するための方法であって、前記細胞及び/又は前記患者に前記エクソン内の一続きの少なくとも8ヌクレオチドと結合する分子を提供するステップを含む方法を提供する。前記方法は、in vitro、in vivo又はex vivo法を包含することを理解するべきである。
第二の態様において、前節の表題「方法」に記載されている方法における使用のための分子が提供される。本明細書に定義されている分子は、オリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であることが好ましい。
エクソン43のスキッピングのための
エクソン46のスキッピングのための
エクソン50のスキッピングのための
エクソン51のスキッピングのための
エクソン52のスキッピングのための
及びエクソン53のスキッピングのための
から選択されるヌクレオチド配列のうちの一つの配列内の一続きの少なくとも8ヌクレオチドと結合する、又は相補的である。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号8〜配列番号69のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号70〜配列番号122のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号123〜配列番号167及び/又は配列番号529〜配列番号535のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号168〜配列番号241のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号242〜配列番号310のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。更により好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号246及び/又は配列番号299のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号299のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞及び/又は患者におけるDMD mRNA前駆体のエクソン52のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。
の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号311〜配列番号358のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
−43及び51、又は
−43及び53、又は
−50及び51、又は
−51及び52、又は
−52及び53
である。
必要に応じて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する分子又はベクターは、薬学的に許容される担体を添加することにより、薬学的に活性な混合物又は組成物に取り込まれることができる。
更に別の態様において、本発明は、DMD mRNA前駆体のスプライシングを調節するための、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは分子及び/又は本発明に係る1若しくは複数種のアンチセンス配列を発現するウイルスに基づくベクター及び/又は医薬組成物の使用を提供する。スプライシングは、好ましくはヒト筋原細胞又は筋細胞においてin vitroで調節される。より好ましくは、スプライシングはヒト筋細胞においてin vivoで調節される。したがって、本発明は更に、DMD mRNA前駆体のスプライシングを調節するための、又はDMD若しくはBMD患者を治療するための薬剤を調製するための、本明細書に定義されている分子及び/又は本明細書に定義されているベクター及び/又は本明細書に定義されている医薬組成物の使用に関する。
材料及び方法
AON設計は、(部分的に)m−foldプログラムにより予見される標的エクソンRNAの重複オープン二次構造に、また(部分的に)ESE−finderソフトウエアにより予見される重複推定SR−タンパク質結合部位に基づいて行った。AONは、Prosensa Therapeutics B.V.(ライデン、オランダ)により合成し、これは2’−O−メチルRNA及び全長ホスホロチオエート(PS)骨格を含む。
健常個体(「ヒトコントロール」)(例1、3及び4;エクソン43、50、52スキッピング)又はエクソン45欠失を有するDMD患者(例2;エクソン46スキッピング)由来の筋管培養物を以前記載した通りに処理した(Aartsma−Rusら、Neuromuscul.Disord.2002;12:S71〜77及びHum Mol Genet2003;12(8):907〜14)。AONのスクリーニングのため、筋管培養物を50nM及び150nM(例2)、200nM及び500nM(例4)又は500nMのみ(例1及び3)の各AONでトランスフェクションした。トランスフェクション試薬UNIFectylin(Prosensa Therapeutics BV、オランダ)は、AON1□g当たり2□lのUNIFectylinを用いた。エクソンスキッピング効率は、標的エクソン(43、46、50、51、52又は53)側方のエクソンに存在するプライマーを用いたネステッドRT−PCR解析により決定した。配列検証のため、アガロースゲルからPCR断片を単離した。定量化のため、DNA1000LabChipsキットを用いてAgilent2100bioanalyzer(Agilent Technologies、米国)においてPCR産物を解析した。
DMDエクソン43スキッピング
エクソン43内の配列を標的とする一連のAONを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号2として定義されているエクソン43内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、エクソン43スキッピングを確実に誘導できることを示した。図1に示す通り、PS237(配列番号65)は、500nMで最高レベルのエクソン43スキッピング(最大66%)を再現可能に誘導した。比較のため、それぞれ最大13%及び36%のエクソン43スキッピングレベルを誘導する、PS238及びPS240も示す(図1)。エクソン43の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン43スキッピングは、未処置細胞(NT)には観察されなかった。
エクソン46内の配列を標的とする一連のAONを設計し、DMD遺伝子にエクソン45欠失を有するDMD患者由来の筋管培養物にトランスフェクションした。このような突然変異を有する患者のため、アンチセンスが誘導するエクソン46スキッピングは、疾病の1又複数種の症状を確実に緩和することができる、新規BMD様ジストロフィンタンパク質の合成を誘導した。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号3として定義されているエクソン46内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、50nMと比較的低濃度のAONであってもエクソン46スキッピングを確実に誘導できることを示した。図2に示す通り、PS182(配列番号117)は、最高レベルのエクソン46スキッピング(50nMで最大50%、150nMで74%)を再現可能に誘導した。比較のため、150nMでそれぞれ最大55%、58%及び42%のエクソン46スキッピングレベルを誘導する、PS177、PS179及びPS181も示す(図2)。エクソン46の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン46スキッピングは、未処置細胞(NT)には観察されなかった。
エクソン50内の配列を標的とする一連のAONを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号4として定義されているエクソン50内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、エクソン50スキッピングを確実に誘導できることを示した。図3に示す通り、PS248(配列番号127)は、最高レベルのエクソン50スキッピング(500nMで最大35%)を再現可能に誘導した。比較のため、500nMで最大14〜16%のエクソン50スキッピングレベルを誘導する、PS245、PS246及びPS247も示す(図3)。エクソン50の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン50スキッピングは、未処置細胞(NT)には観察されなかった。
エクソン51内の配列を標的とする一連のAONを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号5として定義されているエクソン51内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、エクソン51スキッピングを確実に誘導できることを示した。配列番号180を有するAONは、最高レベルのエクソン51スキッピングを再現可能に誘導した(データなし)。
エクソン52内の配列を標的とする一連のAONを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号6として定義されているエクソン52内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、エクソン52スキッピングを確実に誘導できることを示した。図4に示す通り、PS236(配列番号299)は、最高レベルのエクソン52スキッピング(200nMで最大88%、500nMで91%)を再現可能に誘導した。比較のため、500nMを投与した場合、それぞれ最大59%及び10%レベルのエクソン52スキッピングを誘導するPS232及びAON52−1(Aartsma−Rusら、Oligonucleotides2005により以前刊行された)も示す(図4)。新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって、エクソン52の正確なスキッピングを確認した。エクソン52スキッピングは、未処置細胞(NT)には観察されなかった。
エクソン53内の配列を標的とする一連のAONを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離RNAのRT−PCR及び配列解析は、本明細書では配列番号7として定義されているエクソン53内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのAONが、エクソン53スキッピングを確実に誘導できることを示した。配列番号328を有するAONは、最高レベルのエクソン53スキッピングを再現可能に誘導した(データなし)。
DMD遺伝子アミノ酸配列
Claims (20)
- 配列番号287(5’−GGUAAUGAGUUCUUCCAACUGG−3’)の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- ジストロフィンmRNA前駆体のエクソン52をスキッピングするための、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチドの少なくとも1つが、ヌクレオチドアナログとなる修飾を含む、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、1又は複数のRNA残基、及び/又は1又は複数のDNA残基を含むことになる修飾を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、
前記ヌクレオチドが、修飾塩基、及び/若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれら修飾の組合せを有することになる修飾を含む、
請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。 - 前記ヌクレオチドアナログが、修飾塩基を有することになる修飾を含む、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、修飾骨格を有することになる修飾を含む、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチドアナログが、2’、3’及び/又は5’位置において1又は2基置換された1又は複数の修飾糖部分を含むことになる修飾を含む、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、2’−O−置換ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことになる修飾を含む、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、2’−O−メチルホスホロチオエートリボースを含むことになる修飾を含む、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列5’gguaaugaguucuuccaacugg3’(配列番号287)からなるホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
糖部分が、2’−O−メチル置換されていることになる修飾を含む、
請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。 - 前記修飾骨格が、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格及びアミド骨格からなる群から選択されるものとなる修飾を含む、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、モルホリン環及び/又はホスホロジアミデートヌクレオシド間結合、及び/又はペプチド核酸、及び/又はロックド核酸を含むことになる修飾を含む、請求項1〜7及び12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)となる修飾を含む、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号287(5’−GGUAAUGAGUUCUUCCAACUGG−3’)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの発現を駆動する発現カセットを含むウイルスに基づくベクター。
- DMD若しくはBMD患者のジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングを調節するため、又はDMD若しくはBMD患者を治療するための医薬として使用される、請求項1〜14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項15に記載のウイルスに基づくベクター。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又は請求項15に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- DMD若しくはBMD患者の治療のための薬剤を調製するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項15に記載のベクター又は請求項17に記載の医薬組成物の使用。
- Duchenne型又はBecker型筋ジストロフィー患者のジストロフィンmRNA前駆体中のエクソン52のスキッピングを誘導及び/又は促進するための、請求項18に記載の使用。
- ジストロフィンmRNA前駆体中のエクソン52のスキッピングを誘導及び/又は促進することが、前記Duchenne型又はBecker型筋ジストロフィー患者の筋細胞中でのものである、請求項19に記載の使用。
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