CN115175684A - 视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂 - Google Patents

视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种对视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病有效的治疗剂。具体而言，提供了一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂，其包含与FGF2结合的适体或其盐。

Description

视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾 病的治疗剂
技术领域
本发明涉及一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂，其含有与FGF2结合的适体或其盐。
背景技术
老年性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是一种会损害视网膜中心黄斑的疾病，并且在恶化时会导致失明。50岁以上人群中约有1％会患上老年性黄斑变性，在欧美已成为导致失明的主要原因。另外，预计到2020年全球老年性黄斑变性患者人数将达到约2亿人。
老年性黄斑变性大致分为萎缩性(干性)和渗出性(湿性)。萎缩性老年性黄斑变性是一种由于年龄增长导致视网膜色素上皮细胞炎症的发生，位于其上部的感光细胞与视网膜色素上皮细胞一起丢失，从而产生视力障碍的疾病。到目前为止，对于萎缩性老年性黄斑变性还没有有效的治疗药物，主要的对策是通过改善生活习惯等来进行预防。另一方面，渗出性老年性黄斑变性是一种由于年龄增长导致视网膜色素上皮细胞功能降低或视网膜色素上皮细胞损伤而从脉络膜产生异常的新生血管，由于新生血管的出血或血液成分的渗漏等感光细胞的功能受损的疾病。
对渗出性老年性黄斑变性的治疗在过去15年左右取得了大幅度的进步，已有几种治疗药物上市。例如，抑制视网膜中异常血管新生的VEGF抑制药物被用作老年性黄斑变性的治疗药物。据报道，这些VEGF抑制药物对大约一半的渗出性老年性黄斑变性患者有治疗效果，但对30至50％的患者无效(非专利文献1)。另外，也有报告指出，即使是已确认治疗效果的患者，从治疗开始几年后视力也开始下降(非专利文献2)。
然而，作为渗出性老年性黄斑变性患者预后不良的原因之一，由渗出性老年性黄斑变性产生的视网膜下高反射病灶(subretinal hyperreflective material，SHRM)备受关注(非专利文献3)。当存在这种SHRM时，即使去除了异常的新生血管，治疗效果也被认为是差的。尤其是抗VEGF药物不能去除SHRM，因此抗VEGF药物对渗出性老年性黄斑变性的治疗效果被认为是有限的(非专利文献4)。
另外，据报道，这种SHRM不仅在老年性黄斑变性中发生，在其他各种视网膜疾病中也会发生。如玻璃体视网膜淋巴瘤(非专利文献5)；BEST病(非专利文献6)；玻璃体视网膜界面异常(非专利文献7)；中心性浆液性脉络膜视网膜病变(非专利文献8)；肌强直性营养不良(非专利文献9)，据报道，在上述疾病患者视网膜的OCT图像中可以确认SHRM，这与各视网膜疾病的治疗效果和预后不良有关。
即，认为使这种SHRM消失对于治疗伴有许多SHRM的视网膜疾病和改善其预后不良很重要。
另一方面，能够使SHRM消失的视网膜疾病的治疗药物尚未见报道。因此，需要对视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病有效的治疗剂。此外，没有FGF2抑制剂对视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病有效的报告。另一方面，申请人正在积极开发以针对FGF2的适体为有效成分的药物。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Brown DM等，N Engl J Med.2006年10月5日；355(14)：1432-44
非专利文献2：Bhisitkul RB等，Ophthalmology.2016年6月；123(6)：1269-77
非专利文献3：Alex S.Willoughby，BS等，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol(2018)256：2089–2096
非专利文献4：Ebenezer Daniel等，Ophthalmology.2014年3月；121(3)：656–666.
非专利文献5：Cicinelli，Maria Vittoria等，Retin Cases Brief Rep.2019doi：10.1097/ICB.0000000000000952.[Epub ahead of print]
非专利文献6：Daniela C.Ferrara等，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2010年10月；248(10)：1377-1386
非专利文献7：SarraGattoussi等，Acta Ophthalmol.2019：97；364-3712019.97；364-371
非专利文献8：Niroj K Sahoo等，Indian Journal of Ophtalmology vo l.68，Issue1，126-129
非专利文献9：A Ozkaya等，J Fr Ophtalmol.2018，41：21-292018，2018：21-29
发明内容
发明要解决的技术问题
因此，本发明的目的在于提供一种针对与视网膜疾病患者的预后不良相关的视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病老年性黄斑变性有效的治疗剂。
解决问题的技术手段
发明人为实现上述目的而进行了反复深入研究，结果发现，在以FGF2适体为有效成分的治疗剂的研发中，FGF2适体对视网膜下高反射病灶(SHRM)的消失有效。通过抑制FGF2的功能使SHRM消失，从而治疗视网膜疾病的机制的药物至今尚未见报道。
发明人经过反复深入研究，最终完成了本发明。
即，本发明提供了以下内容。
[1]一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂，其中，包含与FGF2结合的适体或其盐。
[2]根据[1]所述的治疗剂，其中，所述适体包含以下式(1)表示的核苷酸序列(然而，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)：
N1GGAN2ACUAGGGCN3UUAAN4GUN5ACCAGUGUN6 (1)
式中，N1和N6分别独立地表示任意0至多个碱基，N2、N3、N4和N5独立地表示任意一个碱基，
并且所述适体为以下(a)或(b)中的任意一个：
(a)在所述适体包含的核苷酸中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位是氟原子，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位是羟基；
(b)在所述(a)的适体中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位的氟原子各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组中的原子或基团取代，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位的羟基各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组中的原子或基团取代。
[3]根据[2]所述的治疗剂，其中，以所述式(1)表示的核苷酸序列是以下式(3)表示的核苷酸序列：
N1GGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCN62 (3)
式中，N1和N62分别独立地表示任意0至多个碱基。
[4]根据[3]所述的治疗剂，其中，以所述式(3)表示的核苷酸序列是以序列号1、3、4、5、6或8表示的任意一个核苷酸序列。
[5]根据[3]所述的治疗剂，其中，以所述式(3)表示的核苷酸序列是以序列号3表示的核苷酸序列。
[6]根据[2]至[5]中任一项所述的治疗剂，其中，所述适体为如下所示的适体：
GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT
其中，(M)表示每个核苷酸中核糖2号位的甲氧基，(F)表示每个核苷酸中核糖2号位的氟原子，GL2-400TS表示分子量为40000的2分支TS型聚乙二醇，C6表示-(CH2)6-连接子，IdT表示反向dT。
[7]根据权利要求[1]至[6]中任一项所述的治疗剂，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性。
[8]根据权利要求[1]至[7]中任一项所述的治疗剂，其中，与抗VEGF药物组合给药。
[9]一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗方法，其中，包括向患者给药有效剂量的与FGF2结合的适体或其盐。
[10]一种用于治疗视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的与FGF2结合的适体或其盐。
[11]一种与FGF2结合的适体或其盐在制备视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂中的应用。
发明效果
根据本发明，可以提供对迄今为止不存在治疗药物的SHRM有效的治疗剂。SHRM放置不理会纤维化，并在视网膜周围引起纤维化视网膜疾病。即，根据本发明的治疗剂，可以治疗视网膜下高反射病灶、伴有视网膜下高反射病灶的各种视网膜疾病，还可以有助于改善伴有视网膜下高反射病灶的各种视网膜疾病的预后。
附图说明
图1是对伴有视网膜下高反射病灶的老年性黄斑变性患者实施使用本发明的治疗剂的治疗前后通过光学相干断层扫描(OCT)进行组织评估的比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂(以下也称为本发明的治疗剂)，其包含与FGF2结合的适体(以下也称为本发明的适体)或其盐。
适体是指对规定的靶分子具有结合活性的核酸分子。适体能够通过与规定的靶分子结合来抑制该靶分子的活性。本发明的适体是与FGF2结合的适体，优选与FGF2结合并抑制FGF2与FGF受体结合的适体。FGF2与FGF受体结合的抑制可以通过利用例如表面等离子体共振法的试验进行评价。
本发明的适体只要是与FGF2结合的适体，优选与FGF2结合并抑制FGF2与FGF受体结合的适体就没有限制，例如，在国际公开号2020/004607中记载的适体，具体而言，包含以下式(1)表示的核苷酸序列(然而，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)：
N1GGAN2ACUAGGGCN3UUAAN4GUN5ACCAGUGUN6 (1)
并且所述适体为以下(a)或(b)中的任一个：
(a)在所述适体包含的核苷酸中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位是氟原子，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位是羟基；
(b)在所述(a)的适体中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位的氟原子各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组中的原子或基团取代，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位的羟基各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组中的原子或基团取代。
上述式(1)中，N1和N6各自独立地表示任意0至多个碱基，N2、N3、N4和N5独立地表示任意一个碱基。本说明书中的“碱基”是指构成核酸的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)中的任意一种。
只要是含有以式(1)表示的核苷酸序列的适体与FGF2结合，N1的碱基数就没有特别限定，例如可以是0至约10个、0至9个、0至8个、0至7个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个等，优选0至2个。
与N1相同，N6的碱基数也没有特别限定，例如可以为0至约10个、0至9个、0至8个、0至7个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个等，优选为0至10个、3至9个或5至8个。
在优选的实施方式中，上述式(1)中，
N1为G、GG、AG、C或缺口，
N2为A或U，
N3为G、C或A，
N4为G、C或U，
N5为G或U，
N6为UUCN61或AGUCN62(式中，N61和N62各自独立地为任意0至多个碱基)。这里，N1为“缺口”是指式(1)中不存在N1，即N1为0个碱基。
N61的碱基数没有特别限定，例如可以为0至约10个、0至7个、0至6个、0至5个、0至4个等，优选为0至5个、1至5个或2至4个。
N62的碱基数也没有特别限定，例如可以为0至约10个、0至7个、0至5个、0至4个、0至3个等，优选为0至5个、0至4个、或0至3个。
在另一优选的实施方式中，在上述式(1)中，
N1为G、GG、AG或缺口，
N2为A或U，
N3为G或A，
N4为C或U，
N5为G或U，
N6为UUCN61或AGUCN62(式中，N61和N62与上述含义相同)。
在优选的实施方式中，用于本发明的适体包含以下式(2)或(3)表示的核苷酸序列，更优选以式(3)表示的核苷酸序列：
GGGAAACUAGGGCGUUAACGUGACCAGUGUUUCN61 (2)
N1GGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCN62 (3)
(式中，N1、N61和N62与上述含义相同)。
在优选的实施方式中，本发明的适体包含以序列号1至12表示的核苷酸序列。以下表示以序列号1至12表示的核苷酸序列(然而，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)(以下，A、G、C和U分别表示核苷酸的碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶)。
序列号1：
GGGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCUCGA
序列号2：
GGGAAACUAGGGCGUUAACGUGACCAGUGUUUCUCGA
序列号3：
GGGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCCC
序列号4：
GGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCC
序列号5：
GGGGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCCCC
序列号6：
AGGGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCCC
序列号7：
GGGAAACUAGGGCGUUAACGUGACCAGUGUUUCCC
序列号8：
CGGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCCG
序列号9：
CCGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCGG
序列号10：
GGGAUACUAGGGCGUUAACGUUACCAGUGUAGUCCC
序列号11：
GGGAUACUAGGGCCUUAAGGUUACCAGUGUAGUCCC
序列号12：
GGGAUACUAGGGCAUUUAUGUUACCAGUGUAGUCCC
在一个优选的实施方式中，本发明的适体包含以序列号1、3、4、5、6或8表示的核苷酸序列，更优选以序列号3表示的核苷酸序列(包含在上式(3)中)。
在一个实施方式中，本发明的适体可以包含在上述任意一种核苷酸序列中的1个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列，只要仍与FGF2结合即可，并且所述适体可以为：
(a)在所述适体包含的核苷酸中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位是氟原子，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位是羟基；
(b)在所述(a)的适体中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位的氟原子各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组中的原子或基团取代，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位的羟基各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组中的原子或基团取代。
其中，上述被取代、缺失、插入或添加的核苷酸的数目只要在取代、缺失、插入或添加后仍然与FGF2结合就没有特别限定，例如可以为1至约10个，优选为1至6个，更优选为1至5个，进一步优选为1至4个，更进一步优选1至3个，最优选为1个或2个。核苷酸被取代、缺失、插入或添加的部位也只要在取代、缺失、插入或添加后仍然与FGF2结合就没有特别限定，在上述式(1)、(2)和(3)中，在一种核苷酸(即A、G、C或U)的指定部位中，在一至三处，优选在一或两处，更优选在一处进行核苷酸的取代、缺失、插入或添加。另一方面，在式(1)、(2)和(3)中，可以取多种核苷酸的部位(即，N1、N2、N3、N4、N5、N6、N61或N62)中，也可以允许更多的核苷酸(例如1至约10个，优选1至6个，更优选1至5个，进一步优选1至4个)的取代、缺失、插入或添加。例如，如果将以序列号3表示的核苷酸序列作为原始序列，则序列号1为序列号3的3'末端的CC被UCGA取代的序列，序列号4为序列号3的两末端分别缺失1个核苷酸的序列，序列号5为在序列号3的5'末端添加G、在3'末端添加C的序列，序列号6为在序列号3的5'末端添加A的序列，序列号8为序列号3的5'末端的G被C取代、3'末端的C被G取代的序列，序列号9为序列号3的5'末端的GG被CC取代、3'末端的CC被GG取代的序列，序列号10为序列号3的第14个A被G取代、第19个U被C取代的序列，序列号12为序列号3的第17个A被U取代的序列。
本发明的适体的长度没有特别限定，通常可以为约10至约200个核苷酸，例如，可以为约20个以上核苷酸(例如，25个以上核苷酸、30个以上核苷酸、31个以上核苷酸、32个以上核苷酸、33个以上核苷酸)，优选为25个以上核苷酸，更优选为30个以上核苷酸，进一步优选为33个以上核苷酸。另外，例如可以为约100个以下核苷酸，通常约80个以下核苷酸，优选为约70个以下核苷酸，更优选为约60个以下核苷酸，进一步优选为约50个以下核苷酸，更进一步优选为约45个以下核苷酸(例如，44个以下核苷酸，43个以下核苷酸，42个以下核苷酸，41个以下核苷酸，40个以下核苷酸)。核苷酸总数越少，化学合成和大量生产更容易，且成本上的优势也越大。另外，认为化学修饰也容易，体内稳定性也高，毒性也低。
因此，本发明的适体的长度通常可以为约10至约200个核苷酸，优选为20至80个核苷酸，更优选为25至60个核苷酸，进一步优选为25至50个核苷酸，最优选为30至45个核苷酸。
本发明的适体还可以是选自含有以上式(1)表示的核苷酸序列的适体(适体(A))的多个偶联物、在以上式(1)表示的核苷酸序列中含有1个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列的适体(适体(B))的多个偶联物、以及1个或多个适体(A)和1个或多个适体(B)的偶联物的偶联物。这些偶联物也可以与FGF2结合。
其中，偶联可以通过串联结合来进行。另外，在偶联时也可以利用连接子。连接子可以列举核苷酸链(例如1至约20个核苷酸)、非核苷酸链(例如-(CH2)n-连接子、-(CH2CH2O)n-连接子、六乙二醇连接子、TEG连接子、含肽的连接子、含-S-S-键的连接子、含-CONH-键的连接子和含-OPO3-键的连接子)。上述多个偶联物中的多个只要是2个以上就没有特别限定，例如可以为2个、3个或4个。
本发明的适体中包含的每个核苷酸可以分别是相同或不同的，可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)的2号位上包含羟基的核苷酸(即，天然的核糖核苷酸)或者在核糖的2号位上，羟基被任意的原子或基团取代(修饰)的核苷酸(本说明书中，有时记载为“修饰核苷酸”)。
这种任意的原子或基团可以列举例如被氢原子、氟原子或-O-烷基(例如-O-Me基)、-O-酰基(例如-O-CHO基)或氨基(例如-NH2基)取代的核苷酸。在本发明的适体中，也可以有至少一种(例如1、2、3或4种)核苷酸为修饰核苷酸，该修饰核苷酸在核糖的2号位上包含羟基或上述任意的原子或基团，例如选自由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基组成的组中的至少两种(例如，2，3或4种)基团。
在本发明的适体中，所有的嘧啶核苷酸还可以是核糖的2号位为氟原子的核苷酸，或者该氟原子相同或不同地未被取代或者被上述任意原子或基团，优选选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代的核苷酸。尤其是，当作为本发明的适体的制造方法，采用了使用DuraScribeTMT7转录试剂盒(Epicentre公司制造)的制备方法时，可以得到全部嘧啶核苷酸的核糖2号位被氟化的适体。氟原子被其他上述原子或基团取代的适体可以通过后述方法制备。
在本发明的适体中，所有的嘧啶核苷酸还可以是核糖的2号位为羟基的核苷酸，或者该羟基相同或不同地未被取代或者被上述任意原子或基团，优选选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代的核苷酸。羟基被其他上述原子或基团取代的适体可以通过后述方法制备。
在本发明的适体中，所有嘧啶核苷酸还可以是核糖的2号位上的氟原子被上述任意原子或基团，例如选自由氢原子、羟基和-O-Me基组成的组的相同原子或基团取代的核苷酸。
在本发明的适体中，所有嘌呤核苷酸还可以是核糖的2号位上的羟基被上述任意原子或基团，例如选自由氢原子、氟原子和-O-Me基组成的组的相同原子或基团取代的核苷酸。
在优选的实施方式中，用于本发明的适体中包含的每个嘧啶核苷酸均为在核糖的2号位上包含氟原子的核苷酸，并且每个嘌呤核苷酸均为在核糖的2号位上包含羟基的核苷酸。在其他实施方式中，上述每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位的氟原子可以各自独立地被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代，并且上述每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位的羟基可以各自独立地被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代。
需要说明的是，在本说明书中，将构成适体的核苷酸假设为RNA(即，将糖基假设为核糖)，对核苷酸中的糖基的修饰方式进行说明，然而这并不意味着从构成适体的核苷酸中排除DNA，可以适当解读为对DNA的修饰。例如，如果构成适体的核苷酸为DNA，则核糖的2号位的羟基被其他原子或官能团取代就可以解读为脱氧核糖的2号位的氢原子被所述其他原子或官能团取代。
在本发明的适体中，尿嘧啶被胸腺嘧啶取代时，可以提高对FGF2的结合性、FGF2与FGF受体的结合抑制活性、适体的稳定性、药物递送性和在血液中的稳定性等。
在本发明的适体中，还有核苷酸中具有1个或多个，例如1至2个、1至3个、1至4个、1至5个磷酸二酯键的核苷酸可以被任意取代基修饰或取代。例如，磷酸二酯键可以被硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基磷酸酯键、氨基磷酸酯键等取代。其中，例如“核苷酸被硫代磷酸酯键取代”表示位于相邻核苷酸间的结合部位的磷酸基被硫化，即，磷酸二酯键被改性为硫代磷酸酯键。
本发明的适体中，为了稳定适体并提高其活性，1个或多个核苷酸，例如1至2个、1至3个、1至4个、1至5个核苷酸可以被桥接核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)或锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)取代。其中，“桥接核酸”是指具有如下所述结构的核酸：通过分子内桥接约束核酸的自由度，提高对互补序列的结合亲和性，并获得核酸酶抗性，例如，可列举2'，4'-BNA(LNA)、ENA(2'-O，4'-C-ethylene-bridged Nucleic Acid)等，但不限于这些。
为了提高对FGF2的结合、稳定性和药物递送性等，本发明的适体可以是每个核苷酸的糖残基(例如核糖)进一步被修饰的适体。糖残基中被修饰的部位，例如可以列举糖残基的3号位和/或4号位的氧原子被其他原子取代的部位等。修饰的种类可以列举例如氟化、O-烷基化(例如O-甲基化、O-乙基化)、O-烯丙基化、S-烷基化(例如S-甲基化、S-乙基化)、S-烯丙基化、氨基化(例如-NH2)。通过对本发明的适体进一步施加这样的糖残基的改性，可以制备碱基序列相同但活性提高的各种变化的适体。
为了提高对FGF2的结合性、防止多聚化、稳定性和药物递送性等，本发明的适体也可以是核酸碱基(例如嘌呤、嘧啶)发生改性(例如，化学置换)的适体。这样的改性可以列举例如，5位嘧啶改性、6和/或8位嘌呤改性、用环外胺改性、用4-硫尿苷取代、用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。此外，本发明的适体中所含的磷酸基可以被改性，以使其对核酸酶和水解具有抗性。例如，P(O)O基团可以被P(O)S(硫代)、P(S)S(二硫代)、P(O)N(R)R'(酰胺化)、P(O)R、P(O)OR、CO或CH2(甲缩醛)或3'-胺(-NH-CH2-CH2-)取代，其中每个R或R'独立地为H或被取代或未被取代的烷基(例如甲基、乙基)。
偶联基团的实例包括-O-、-N-或-S-，通过这些偶联基团可以与相邻的核苷酸结合。
改性也可以包括诸如封端的3'和5'改性。
改性还可以通过在末端添加聚乙二醇(PEG)、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、石胆酸-油烯基、二十二酰基、月桂酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、其他脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、酶、放射性物质、生物素等来进行。对于这样的改性，例如可以参考美国专利第5660985号和第5756703号。
尤其是，通过在PEG的末端添加来进行改性的情况下，对PEG的分子量没有特别限定，优选为1000至100000，更优选为30000至90000。PEG可以是直链状，也可以分支为二条以上的链(多臂PEG)。PEG的末端添加在后述的适体的多聚化的防止中有用。
作为这样的PEG没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择使用市售或公知的PEG，作为应用于本发明的适体的PEG的优选例，具体可列举分子量40000的2分支GS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS日油制造)、分子量40000的2分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS日油制造)、分子量40000的4分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS日油制造)、分子量80000的2分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS日油制造)、或分子量80000的4分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS日油制造)等。
在这种情况下，对本发明的适体而言，PEG可以直接添加到末端，更优选在其末端添加具有能够与PEG结合的基团的连接子等，通过该连接子将PEG添加在本发明的适体上。
作为PEG和本发明的适体的连接子没有特别限定，碳链数和官能团等可以根据结合部位和PEG的种类等适当选择。作为这样的连接子，例如可以列举具有氨基的连接子，具体而言，当添加在5'末端时，可例示ssH连接子(SAFC)或DMS(O)MT-氨基-修饰剂(GLENRESEARCH)，当添加在3'末端时，例示出TFA氨基C-6 lcaa CPG(ChemGenes)等。在选择该连接子的情况下，可以在PEG上添加例如N-羟基琥珀酰亚胺的活性基团的基础上，使其与连接子侧的氨基发生反应，由此将本发明的适体与PEG通过连接子结合。
作为PEG和连接子，优选可以使用市售商品。此外，PEG、连接子和本发明的适体结合所涉及的反应条件等，只要是本领域技术人员就能够适当设定。
作为本发明的适体的更优选的实施方式，示出以下的适体。
包含以序列号3表示的核苷酸序列的适体ID1：
GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT；
包含以序列号8表示的核苷酸序列的适体ID2：
GL2-400TS-C6-C(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)G(M)-idT；
包含以序列号9表示的核苷酸序列的适体ID3：
GL2-400TS-C6-C(M)C(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)G(M)G(M)-idT；
包含以序列号10表示的核苷酸序列的适体ID4：
GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)G(M)U(M)U(F)A(M)A(M)C(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT；
包含以序列号12表示的核苷酸序列的适体ID5：
GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)U(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-IdT；以及
含有以序列号3表示的核苷酸序列的适体ID6：
idT-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-C6-GL2-400TS；
(上述各式中，(M)表示每个核苷酸中核糖2号位的甲氧基，(F)表示每个核苷酸中核糖2号位的氟原子，GL2-400TS表示分子量为40000的2分支TS型聚乙二醇，C6表示-(CH2)6-连接子，IdT表示反向dT。
这些适体由于使用其中任意一种都能在本发明的治疗剂的构成中稳定存在，因此，作为本发明的治疗剂的有效成分是合适的。
本发明的适体可以是游离体，也可以是药学上可接受的盐。作为这样的盐，可以列举金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，可列举钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土金属盐、铝盐、锌盐等。作为铵盐，可列举铵、四甲铵等盐。作为有机胺加成盐，可列举三羟基氨基甲烷等。作为氨基酸加成盐，可列举赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、鸟氨酸等盐。
对本发明的适体的浓度没有特别限定，只要本发明的治疗剂发挥目标功能效果含有多少都是可以的。本说明书中的“适体的浓度”是指由构成适体分子的5'→3'磷酸酯键偶联的核酸部分的重量占治疗剂整体体积的比例(mg/mL)。作为该适体的浓度，可列举例如1至60mg/mL。
本发明的适体以单体形式存在的情况下与FGF2结合，抑制FGF2的功能并发挥其药效，但如果发生了多聚化，则观察不到与FGF2的结合，认为并不抑制FGF2的功能。如果本发明的治疗剂的适体浓度超过20mg/mL，则在一般的保存温度4至5℃下也会发生多聚化，结果具有与FGF2结合的活性整体降低的倾向。因此，在本发明的治疗剂中，本发明的适体浓度的上限优选为不超过20mg/mL的浓度。此外，在本发明的治疗剂的适体浓度较低的情况下，可能无法获得作为治疗剂的效果。因此，在本发明的治疗剂中，本发明的适体浓度的下限没有特别限制，只要是能够获得作为治疗剂的效果的浓度即可，例如优选为1mg/mL以上的浓度。
本发明的治疗剂的剂形没有特别限定，优选为水性液体制剂，更优选为注射剂。当本发明的治疗剂为水性液体制剂时，作为有效成分的本发明的适体以溶解在溶剂中的方式存在。
如国际公开号2020/004607所示，本发明的适体在使用PBS或生理盐水作为溶剂时，在作为强电解质的无机盐的影响下失去安定性，具有形成多聚体的倾向，其结果丧失对FGF2的结合活性。另一方面，作为溶剂，不含无机盐(电解质)的水抑制了本发明的适体的多聚化并增加了以单体形式存在的本发明的适体的比例。进一步地，如果将溶解于水中的本发明的适体向体内给药，则适体活性所需要的高级结构在体液中存在的电解质的作用下被重组，并且可以发挥活性。因此，作为本发明的治疗剂中使用的溶剂，优选不含无机盐(电解质)的水性溶剂，特别优选水。
将本发明的治疗剂作为注射剂使用时，如上所述，由于使用不含无机盐(电解质)的溶剂，因此渗透压低，不能直接作为注射剂来使用。因此，为了将渗透压与血浆渗透压的比调整为1以上、优选1至3，本发明的治疗剂优选包含作为非电解质的渗透压调节剂(渗透剂)。
作为在本发明的治疗剂中使用的渗透压调节剂没有特别限定，只要是非电解质即可，只要是除了无机离子类(钾离子、氯化物离子等)以外通常使用的渗透压调节剂就可以使用。作为这样的渗透压调节剂，可列举多元醇(甘油、甘露醇、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、肌醇等)、氨基酸类(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、GABA、牛磺酸、依克多因等)、甲基铵类(TMAO、胆碱、乙酰胆碱、甘氨酸甜菜碱、GPC、DMSP等)、脲类等，优选使用多元醇，更优选使用甘露醇。
对渗透压调节剂的量没有特别限定，本领域技术人员可以根据本发明的治疗剂中所含的本发明的适体的量、所使用的渗透压调节剂的种类(分子量)、目标渗透压而进行适当变更。例如，当作为渗透压调节剂使用甘露醇，使相对于生理盐水的渗透压比为约1时，渗透压调节剂在整个注射剂中的配比为2至7.5％(w/v)。更具体而言，使相对于生理盐水的渗透压比为1时，如果上述本发明的适体浓度为2mg/ml，则甘露醇的配比为4.9％，如果上述本发明的适体浓度为20mg/ml，则甘露醇的配比为3.6％。
本发明的治疗剂除了作为有效成分的本发明的适体或其盐以外，优选实质上不含电解质。其中，“实质上不含”是指在本发明的治疗剂中的FGF2适体能够长期稳定保存范围内，可以含有少量的电解质。更优选地，本发明的治疗剂除了作为有效成分的本发明的适体或其盐以外不含电解质。
在本发明的治疗剂中，根据需要可以进一步含有药学上可接受的添加剂。作为这样的添加剂，可以列举例如稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂、pH调节剂、无痛剂等。
本发明的治疗剂的pH没有特别限制，但作为注射剂使用时，优选为接近中性的pH，可以在例如pH5至9、优选6至8的范围内适当选择。
在本发明的治疗剂中，只要对本发明的适体的活性和稳定性没有不良影响，也可以混合其它活性成分。作为这样的活性成分，也可以包含作为伴有血管生成的疾病等的治疗药的麦根(マクジェン
Figure BDA0003781717330000171
)、卢森蒂斯(ルセンティス
Figure BDA0003781717330000172
)、艾莉亚(アイリーア
Figure BDA0003781717330000173
)、阿瓦斯汀(アバスチン
Figure BDA0003781717330000174
)等VGEF抑制剂、类固醇等消炎剂、吗啡等镇痛剂、镇静剂。
按照如上所述得到的本发明的治疗剂可以作为视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂来使用。
视网膜下高反射病灶(SHRM)是指，在视网膜疾病患者的黄斑部从视网膜色素上皮朝向视网膜形成的丘状结构物。视网膜下高反射病灶可通过已知的手段或设备来检测，如光学相干断层扫描(OCT)或使用该方法的设备。在本说明书中，视网膜下高反射病灶是包括新生血管组织(neovascular tissue)、纤维化(fibrosis)、视网膜下高反射渗出(subretinal hyperr eflective exudation，SHE)和出血(hemorrhage)的结构物。
作为这种伴有SHRM的视网膜疾病，只要伴有SHRM就没有特别的限定，可列举例如玻璃体视网膜淋巴瘤；BEST病；玻璃体视网膜界面异常；中心性浆液性脉络膜视网膜病变；肌强直性营养不良；老年性黄斑变性等。
本发明的治疗剂在伴有SHRM的视网膜疾病的治疗中，通过适当去除预后不良因素SHRM，可以显著提高其治疗效果。此外，能够显著改善其预后。
需要说明的是，只要伴有视网膜下高反射病灶，老年性黄斑变性就没有特别限制，但优选渗出性老年性黄斑变性。
本发明的治疗剂的给药对象可以是任意哺乳动物，然而是患有视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的哺乳动物，或有可能患有视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的哺乳动物。哺乳动物可以列举例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类以及兔子等实验动物，狗和猫等宠物，牛、猪、山羊、马和绵羊等家畜，人、猴、猩猩和黑猩猩等灵长类等，特别优选人。给药对象可以接受或不接受视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗。
本发明的治疗剂可以胃肠外给药(例如，静脉内给药、玻璃体内给药、滴眼给药等)。本发明的治疗剂的给药量根据本发明的适体的结构、视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的严重程度、给药对象的体重、年龄等而不同，但通常成人每天的有效成分(适体的寡核苷酸部分)量为约0.0001至约100mg/kg，例如约0.0001至约10mg/kg，优选约0.005至约1mg/kg。
实施例
以下，通过示出实施例进行更详细的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1：与FGF2结合的适体的SHRM消失效果
发明人在为试验RBM-007(本说明书中的适体ID1)治疗人类眼病(老年性黄斑变性，AMD)的安全性而进行的1期临床试验中，使用光学相干断层扫描(OCT)评估了给药RBM-007后的视网膜组织。
对患有伴有视网膜下高反射病灶(SHRM)的老年性黄斑变性的86岁女性患者，使用带30号针头的注射器，以100μL的给药体积，在患病眼睛的玻璃体中给药RBM-007。
然后，通过光学相干断层法(OCT)扫描对该患者的视网膜进行评估。OCT是一种利用光反射/吸收之间的关系从视网膜层的复杂组织制作高分辨率图像的技术。OCT在以下条件下进行。
设备：Spectralis诊断成像平台-海德堡工程公司(Heidelberg Engineering，Inc.)(光谱域光学相干断层扫描仪)
设置：成像模式：IR+OCT
IR强度：100％
IR视场：30°
扫描模式：体积
分辨率：高分辨率(HR)
采集模式：视网膜
EDI：开启
OCT ART平均值：16帧
扫描角度：0°(水平)
扫描模式：体积扫描(20°x20°)
#B-扫描截面：49线(密集扫描)
扫描质量(Q)：≥20
首先，给药第0天的86岁女性患者右眼的OCT图像如图1(上段)所示。在OCT对受试者的评估中，发明人识别了与新生血管组织、纤维化和视网膜下高反射渗出(SHE)相关的典型结构，并确认了出血。这种结构被称为视网膜下高反射病灶(SHRM)，是在许多视网膜疾病中观察到的组织。尤其是渗出性老年性黄斑变性产生的SHAM，被认为是预后不良的原因之一。
接下来，给药第56天的86岁女性患者右眼的OCT图像如图1(下段)所示。由该结果可知，在给药1次RBM-007后的第56天，SHRM被完全重吸收并消失。已证实老年性黄斑变性患者中SHRM的持续与纤维化、萎缩、视力下降相关联，在本实施例中观察到SHRM的消失表明本发明的RBM-007对伴有SHRM形成的老年性黄斑变性的治疗极其有效。还显示RBM-007具有使SHRM消失的效果，本发明的适体不仅可以防止AMD，而且可以防止非常多的视网膜疾病的纤维形成，可以期待良好的治疗效果。发明人在2期临床试验中期待这种效果。
工业实用性
本发明可以提供对迄今为止不存在有效治疗药物的视网膜下高反射病灶、以及伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病有效的治疗剂，可以有助于伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的预后的改善。本申请以在美国提交的US 62/970842(申请日：2020年2月6日)为基础，其全部内容包含在本说明书中。
序列表
<110> 力博美科股份有限公司
<120> 视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂
<130> 093088
<150> US 62/970,842
<151> 2020-02-06
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF2 Aptamer
<400> 1
gggauacuag ggcauuaaug uuaccagugu agucucga 38
<210> 2
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF2 Aptamer
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<220>
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gggauacuag ggcauuaaug uuaccagugu aguccc 36
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF2 Aptamer
<400> 12
gggauacuag ggcauuuaug uuaccagugu aguccc 36

Claims (11)

1.一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂，其中，包含与FGF2结合的适体或其盐。
2.根据权利要求1所述的治疗剂，其中，所述适体包含以下式(1)表示的核苷酸序列，然而，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶：
N1GGAN2ACUAGGGCN3UUAAN4GUN5ACCAGUGUN6(1)
式中，N1和N6分别独立地表示任意0至多个碱基，N2、N3、N4和N5独立地表示任意一个碱基，
并且所述适体为以下(a)或(b)中的任意一个：
(a)在所述适体包含的核苷酸中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位是氟原子，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位是羟基；
(b)在所述(a)的适体中，
(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2号位的氟原子各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组中的原子或基团取代，
(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2号位的羟基各自独立地未被取代，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组中的原子或基团取代。
3.根据权利要求2所述的治疗剂，其中，以所述式(1)表示的核苷酸序列为以下式(3)表示的核苷酸序列：
N1GGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCN62(3)
式中，N1和N62分别独立地表示任意0至多个碱基。
4.根据权利要求3所述的治疗剂，其中，以所述式(3)表示的核苷酸序列是以序列号1、3、4、5、6或8表示的任意一个核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的治疗剂，其中，以所述式(3)表示的核苷酸序列是以序列号3表示的核苷酸序列。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的治疗剂，其中，所述适体是如下所示的适体：
GL2-400TS-C6-G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)A(M)C(M)U(F)A(M)G(M)G(M)GC(M)A(M)U(M)U(F)A(M)A(M)U(M)G(M)U(F)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)GU(F)GU(F)A(M)G(M)U(M)C(M)C(M)C(M)-idT
其中，(M)表示每个核苷酸中核糖2号位的甲氧基，(F)表示每个核苷酸中核糖2号位的氟原子，GL2-400TS表示分子量为40000的2分支TS型聚乙二醇，C6表示-(CH2)6-连接子，IdT表示反向dT。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的治疗剂，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的治疗剂，其中，与抗VEGF药物组合给药。
9.一种视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗方法，其中，包括向患者给药有效剂量的与FGF2结合的适体或其盐。
10.一种用于治疗视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的与FGF2结合的适体或其盐。
11.一种与FGF2结合的适体或其盐在制备视网膜下高反射病灶或伴有视网膜下高反射病灶的视网膜疾病的治疗剂中的应用。
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