KR20180134931A

KR20180134931A - 안 질환 치료용 올리고뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR20180134931A
Application number: KR1020187031243A
Authority: KR
Inventors: 헤스터 카타리나 반 디에펜; 희 람 찬; 쟌네 주하 투루넨
Original assignee: 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이.
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2018-12-19
Also published as: CA3021899A1; IL262199A; US10617707B2; CN109072239A; PL3448999T3; US20190381089A1; JP2019515688A; DK3448999T3; US20200237802A1; WO2017186739A1; ZA201806628B; IL262199B; MX2018013003A; EP3448999B1; EP3448999A1; US11123360B2; KR102368920B1; EA201892431A1; US20210401871A1; JP7043082B2

Abstract

본 발명은 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히 어셔 증후군 Ⅱ형 및/또는 USH2A-관련 비-증후군성 망막 변성의 치료, 예방 및/또는 지연을 위해 특히 인간 USH2A 유전자 엑손 40과 41 내의 유사 엑손 (PE40)을 스킵핑에 사용되는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

Description

안 질환 치료용 올리고뉴클레오타이드

본 발명은 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히 어셔 증후군 Ⅱ 형 및/또는 USH2A 관련 비-증후군성 망막 변성의 치료, 예방 및/또는 지연을 위한 신규 한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

어셔 증후군(Usher Syndrome, USH)과 비-증후군성 망막염(NSRP)은 망막의 퇴행성 질환이다. USH는 임상적으로나 유전적으로 이질적이며 인간에게 유전되는 가장 보편적인 유형의 청력 상실증이다. USH 환자의 청력 손상은 대부분 안정적이며 선천적이며 보청기 또는 달팽이관 보형물을 통해 부분적으로 보완될 수 있다. NSRP는 4,000명 당 1명에서 발생하는 USH보다 흔한 질환이다.

USH와 NSRP에서 광 수용체 세포의 퇴행성은 진행성으로 종종 30년 내지 40년 후에 완전한 실명을 초래하지만 치료를 위한 시기를 남겨두게 된다. USH2A 유전자의 변이가 두 질환의 가장 빈번한 원인이다.

변이의 범위는 72개 USH2A 엑손 전체와 이에 인접한 인트론 서열 전체에 퍼져 있으며 넌센스 및 미스센스 변이, 결실, 복제, 큰 재배열 및 스플라이싱 변이를 포함한다. 가장 흔하게 변이되는 엑손은 엑손 13으로 두 개의 근본적 변이(어셔 증후군 Ⅱ형 환자 내의 c.2299delG (p.E767SfsX21) 및 NSRP 환자 내의 c.2276G>T (p.C759F)를 나타낸다.

엑손 50의 경우 15개의 병원성 변이가 보고되었으며 그 중 적어도 8개는 단백질 트런케이팅이 분명하다. USH2A의 인트론 40(c.7595-2144A> G)의 첫 번째 딥-인트론 변이는 Vach 등(2012. Hum Mutat 33 : 104-8)에 의해 보고되었다. 이 변이는 인트론 40에서 크립틱(cryptic) 고품질의 스플라이스 공여 부위를 생성시켜 변이 USH2A mRNA에 152bp의 비정상적인 엑손의 포함을 유발하고 번역의 조기 종료를 초래한다(WO 2016/005514의 도 1A 및 B 참조).

USH와 다른 망막 근이영양증은 오랫동안 난치병으로 간주되었다. 그러나 유전자 오그멘테이션 요법을 사용하는 여러 단계 Ⅰ/Ⅱ 임상 시험으로 RPE65 및 MYO7A 유전자에 변이를 지닌 LCA/RP/USH 환자의 그룹에서 유망한 결과가 도출되었다. USH2A 유전자와 mRNA의 코딩 서열 크기(15,606 bp)와 USH2A 유전자와 mRNA의 선택적인 스플라이싱은 대부분의 가용 벡터(예 : 아데노-관련(AAV) 및 렌티바이러스 벡터)의 운송물 크기 제한으로 인해 유전자 오그멘테이션 요법을 방해한다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON) 기반 치료의 광범위한 임상 잠재력에도 불구하고 척추동물의 안구에는 빈번하게 사용되지 않는다. AON은 작고 (16-25개 뉴클레오타이드) 폴리뉴클레오타이드 분자로서 스플라이싱을 방해할 수 있으며 그 서열은 표적 전 mRNA 분자의 서열과 상보적이다. AON의 결합시, pre-mRNA의 표적화된 영역은 AON에 의해 표적화된 엑손의 스킵을 초래하는 스플라이싱 인자에 대해 더 이상 이용되지 않는다.

치료 방법으로 2 종류의 방법이 적용될 수 있다 : a) 크립틱 스플라이스 부위를 활성화시키는 변이를 지닌 유전자의 정상적인 스플라이싱을 리디렉트(redirect)시키고; b) 이를 통하여 단백질을 트런케이팅 시키는 변이를 전달하는 엑손을 스킵핑하고; 이에 따라 mRNA의 리딩 프레임을 그대로 유지시켜 (일부) 기능적 단백질을 유지시키는 것이다. USH2A 유전자의 경우, 72개의 엑손 중 28개는 전사체의 전체 리딩 프레임을 유지하면서 잠재적으로 스킵핑할 수 있다. 두 가지 AON 기반 방법 모두는 심각한 유전적 질환을 지닌 환자에게 성공적으로 적용되고 있다.

Liquori 등(2016. Hum Mutat 37:184-193)은 AON이 USH2A 유전자의 mRNA 내에서 인트론 50의 c.9959.4159A>G 변이에 의해 유발된 155 bp 유사(pseudo) 엑손 50(PE 50)의 내포(inclusion)를 예방할 수 있음을 나타내었다.

본 발명의 목적은 인간 USH2A 유전자의 엑손 40과 41 사이의 인트론에 존재하는 c.7595-2144A>G 변이에 의해 유발된 USH 및/또는 NSRP의 예방, 치료 또는 지연에 유용한 치료 방법을 제공하는 것이다.

이미 제안된 바 있으나(Vach 등, 2012), 이후 WO 2016/005514에서 유사 엑손 40: PE40의 내포를 야기하는 변이를 지닌 USH2A 프리-mRNA의 비정상 스플라이싱을 차단할 수 있는 AON을 개시한 바 있다. 또한 추가적으로 유리한 특성을 지닌 더욱 향상된 대안에 대한 요구가 지속적으로 있었다. 본 발명의 목적은 이러한 대안을 제공하는 것이다.

본 발명은 인간 USH2A 프리-mRNA로부터 유사 엑손 40(PE40)의 스킵핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것으로 유사 엑손의 내포는 USH2A 유전자 내에서 c.7595-2144A>G 변이에 인한 것이며 상기 AON은 (ⅰ) 서열번호: 6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37; (ⅱ) 서열번호: 3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; 및 (ⅲ) 서열번호: 21, 27, 28, 29로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 인간 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 유도할 수 있는 AON에 관한 것으로 상기 AON은 서열번호: 45, 46 또는 47 내의 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함한다.

바람직한 실시형태에서 본 발명의 AON은 18개 내지 143개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 18개 내지 40개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 18개 내지 30개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 18개 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이를 지닌다. 또한 바람직하게는 서열번호: 6, 3, 4, 5, 7, 8, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36 및 37로 이루어진 군에서 선택된 서열, 보다 바람직하게는 서열번호 6, 3, 4, 5, 7, 8, 26, 34, 35 및 37에서 선택된 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 6, 3, 4, 5, 7, 8, 26 및 35에서 선택된 서열이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸 변형 리보스(RNA), 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-프로필 변형 리보스와 같은 2'-O-알킬 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형체의 치환된 유도체를 포함한다.

본 발명의 AON 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 변형에 의해 변형될 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서 내의 청구 범위와 같이 적어도 2개의 AON을 포함하는 AON 세트에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에서 본 발명은 또한 AON의 발현을 유도하는 조건 하에서 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 AON의 세트 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 USH2A 프리-mRNA의 조절 스플라이싱을 필요로 하는 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 관련 질환 또는 증상의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 세트, 벡터 또는 조성물에 관한 것이다.

도 1은 통상의 기술분야에서 2개의 공지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (각각 AON1 및 AON2: R1 및 R2) 및 비 관련성 대조 올리고뉴클레오타이드(ctrl)와 비교하여 PE40 엑손 스킵핑 효율을 비교한 7개의 초기 스크리닝된 대안적 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 역전사 효소 결과를 나타낸다. HEK293 세포 내에서 리포터 컨스트럭트를 사용하여 USH2a-PE40-3, -5 및 -7을 투여한 후 신호 증가가 분명하게 나타났다. 하부 패널은 PE40 서열과 관련하여 서로 상이한 AON의 대략적인 위치를 나타낸다.
도 2는 5'에서 3'으로 PE40 서열(굵은 글씨 및 밑줄로 표시하고 두 부분으로 나타냄) 및 본 명세서에서 시험된 상이한 AON에 대한 결합 부위를 나타낸다. 시험 된 각 AON의 서열번호는 괄호 안에 표시되며 명칭은 표 1에 나타낸다. PE40 서열의 첫 번째 다운스트림 뉴클레오타이드는 c.7595-2144A>G 변이를 나타내는 구아노신(G)이다. AON1 (1) 및 AON2 (2)의 위치는 PE40 서열 바로 아래에 나타내었다. 이탤릭체 서열은 PE40의 업스트림 및 다운스트림 서열이다. 3개의 관심 영역은 실시예에 요약된 바와 같으며 본 명세서에서 청구된 바와 같다. 각각 USH2a-PE40-3(서열번호: 19, 굵은 글씨), USH2a-PE40-5 (서열번호: 21, 굵은 글씨) 및 USH2a-PE40-7 (서열번호: 23, 굵은 글씨)이다.
도 3은 도 1 및 도 2에 나타난 USH2a-PE40-3, -5 및 -7에 기반한 올리고뉴클레오타이드 세트의 PE40 스킵을 스크리닝한 역전사 효소 결과를 나타낸 것이다. 명백하게 AON USH2a-PE40-8 및 -11 (USH2a-PE40-3에 기반함) 및 USH2a-PE40-17 (USH2a-PE40-7에 기반함)은 당 업계에 공지된 올리고뉴클레오타이드보다 더 개선된 것으로 나타났다.
도 4는 USH2a-PE40-8, -11, 및 -17 기반하에 한 단계 더 나아간 올리고뉴클레오타이드 세트의 PE40 스킵을 스크리닝한 역전사 효소 결과를 나타낸 것이다. '쇼트'(Short)는 원래 서열보다 짧아짐을 의미한다. 5mC는 5-메틸-시토신을 의미한다(표 1 참조). DAP는 2,6-디아미노퓨린을 의미한다.
도 5는 실시예 1에 요약된 바와 같이 8개의 상이한 올리고뉴클레오타이드로 처리된 USH2 환자 섬유아세포 내에서 표준품으로서 당업자에 의해 빈번히 사용되는 GUSB 유전자(실내 보관 유전자)에 의해 베타-글루쿠로니다제 발현이 보정된 야생형 생성물(각 AON에 대한 우측 막대)과 비교하여 PE40(각 AON에 대한 왼쪽 막대)을 발현하는 드랍렛의 수를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 인간 PBMC에서 나타난 USH2a-PE40 AON의 면역원성 및 면역독성 평가 결과를 나타낸다. (A) 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드를 지닌 인간 PBMC를 24시간 자극시킨 후 배양 상등액 내의 사이토카인 농도의 유의미한 수준으로 배수(fold) 변화를 생리 식염수 처리된 인간 PBMC와 비교를 통해 양성 대조군으로 LPS(100 ng/ml) 및 R848(1 μM)을 사용한 히트 맵이다. 모든 사각형은 측정된 각 사이토카인에 대한 처리 조건 당 배수 변화를 나타낸다.
(B) 본 발명의 4 가지 상이한 USH2a-PE40 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 양성 대조군을 24시간 노출시킨 후 식염수 처리된 PBMC와 비교하여 레조루핀 형광의 배율 변화에 따른 생존 가능한 PBMC의 상대 수를 나타낸다. 생존 가능한 세포 평가는 CellTiter-Blue 키트(Promega)를 사용하여 제조자 지침에 따라 수행되었다. 모든 개별 생물학적 복제물에 대해 배수 변화는 상응하는 3개 식염수 대조군의 기하 평균에 대해 측정된 RFU를 정규화함으로써 계산되었다.
결과는 개별적인 공여자 당 3개의 배수 변화의 평균±SEM으로 나타내며 상응하는 3개 식염수 대조군(점선)의 평균에 대해 정규화하였다. Dunnett 시험 및 반복 측정 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 통해 다중 보정(식염수와 비교)을 수행하였다.
도 7은 USH2a-PE40-24로 처리한 후 이형접합 USH2 환자로부터 수득된 섬유아세포로부터 생성된 옵틱 컵에서 USH2A 프리 -mRNA에서 PE40 스킵핑 결과를 나타낸다. 4개의 왼쪽 레인은 건강한 공여자의 섬유아세포에서 생성된 옵틱 컵의 결과를 나타내며 이후 3개의 레인은 USH2 환자 섬유아세포의 옵틱 컵을 사용한 결과를 나타낸다.
대조군 올리고뉴클레오타이드는 USH2A 프리-mRNA에 상보적이지 않은 비-관련성 올리고뉴클레오타이드이다. 우측의 음성 대조군에는 핵산 물질이 포함되지 않았다. 대조군 레인 5는 두 개의 우세한 밴드를 나타내며 상부층 밴드는 PE40 서열을 포함하는 mRNA를 나타내고 하부층 지방 밴드는 PE40 서열을 지니지 않는 mRNA를 나타낸다. USH2a-PE40-24로 처리하면 프리-mRNA로부터 PE40을 완전히 스킵핑할 수 있으며 상부층 밴드는 검출되지 않았다.

본 발명의 목적을 위해 '비정상 유사 엑손 (aberrant pseudo exon)의 내포(inclusion)', '비정상 유사 엑손 40의 내포' 또는 '비정상 152 bp 뉴클레오타이드 유사 엑손의 내포' 라는 용어는 동일한 의미로 사용되며 USH2A 유전자의 유사 엑손 40 (PE 40)이 mRNA로 내포됨을 의미하거나 그 서열의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 상동성을 지니는 서열 또는 그 일부가 USH2A mRNA 내포되는 것을 의미한다.

본 명세서 내에서 엑손 스킵핑(exon skipping)이란 용어는 엑손 스킵핑이 없었다면 성숙한 mRNA에 존재할 수 있는 특정 엑손이 포함되지 않는 성숙한 mRNA를 세포 내에서 유도 생성 또는 생성 증가시키는 것을 의미한다.

엑손 스킵핑 (exon skipping)은 예를 들면 스플라이싱의 효소 프로세스를 허용하기 위해 요구되는 (암호화) 스플라이스 도너 또는 (암호화) 스플라이스 억셉터 서열과 같은 서열을 간섭 할 수 있는 분자 또는 성숙한 mRNA에 포함될 엑손으로서 뉴클레오타이드의 스트레치의 인식에 필요한 엑손 내포 시그널과 간섭 할 수 있는 분자와 함께 성숙한 mRNA의 프리 -mRNA를 발현하는 세포를 제공함으로써 달성된다

이러한 분자를 본 명세서 내에서는 '엑손 스킵핑 분자'라고 언급하며 본 발명은 PE40 스킵핑에 관련된 엑손 스킵핑에 관한 것이다.

'프리 -mRNA'라는 용어는 핵 내에서 전사에 의해 세포의 DNA 주형으로부터 합성되는 처리되지 않거나 부분적으로 처리된 mRNA 전구체를 의미한다.

엑손 보존(retention)이라는 용어는 스플라이싱 반응을 통해 프리 -mRNA를 프로세싱하는 동안 엑손 내에 아무런 엑손 스킵핑이 발생하지 않을 때 특정 엑손을 포함하는 성숙한 mRNA의 세포 내 생성에 관련된 것을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 야생형 인간 USH2A 유전자로부터의 성숙한 mRNA에는 정상적으로 존재하지 않는 PE40은 본 명세서 내에서 논의된 c.7595-2144 A>G 변이의 존재 시의 경우에는 특정 변이가 PE40을 프리 -mRNA로부터 스플라이스 아웃 시키지 않게 되어 인간 USH2A 유전자 내에 성숙한 mRNA가 보존되는 것이다.

본 발명의 목적은 인간 USH2A mRNA에서의 PE40의 엑손 보유를 예방, 억제 또는 감소시킴으로써 어셔 증후군 II 형을 예방, 지연 및/또는 치료하기 위한 것이다.

용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"(AON)는 프리 -mRNA 분자, 헤테로지니어스 핵산 RNA (hnRNA) 또는 mRNA 분자 내에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 표적 서열이 본 명세서에서 제공된다. 안티센스 서열의 상보성 또는 실질적인 상보성의 정도에 따라 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리학적 조건 하에서 RNA 분자 내의 표적 뉴클레오타이드 서열과 안정한 혼성화를 형성 할 수 있게 된다.

용어 '안티센스 올리고뉴클레오타이드' 또는 그의 약어 'AON'및 '올리고뉴클레오타이드'는 본 명세서 내에서 서로 혼용되고 있으며 안티센스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 단일 가닥이고 바람직하게는 그 자체 또는 동일한 종류의 다른 AON에 대해 자가-어닐링 되지 않는다.

본 발명의 명세서 내에 사용된 '실질적으로 상보적인'이란 용어는 기능 즉 PE40의 스킵핑 (skipping)을 유도하는 것이 허용되는 한 안티센스 서열의 일부 미스 매치가 허용된다는 것을 의미한다.

용어 '유사(pseudo) 엑손 스킵핑'은 본 명세서 내에서 유사 엑손 스킵핑을 지니지 않는 성숙한 mRNA 내에 존재하는 특정 인트론 영역 또는 유사 엑손을 포함하지 않는 성숙한 mRNA를 세포 내에서 유도 자극 유발 증진 생성 또는 생성을 증가시키는 것을 의미한다.

유사 엑손 스킵핑은 예를 들면 스플라이싱의 효소 프로세스를 허용하기 위해 요구되는 (암호화) 스플라이스 도너 또는 (암호화) 스플라이스 억셉터 서열과 같은 서열을 간섭 할 수 있는 분자 또는 성숙한 mRNA에 포함될 엑손으로서 뉴클레오타이드의 스트레치의 인식에 필요한 유사 엑손 내포 시그널과 간섭 할 수 있는 분자와 함께 성숙한 mRNA의 프리 -mRNA를 발현하는 세포를 제공함으로써 달성된다. 이러한 분자를 본 명세서 내에서는 '유사 엑손 스킵핑 분자'라고 언급한다.

바람직한 상보성은 90 % 내지 100 % 이다. 일반적으로 이것은 20 개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1 또는 2 개의 불일치를 허용하는 것이다. 40 개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1, 2, 3 또는 4 개의 미스 매치를 허용하며 60 개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오타이드에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 미스 매치를 허용하는 것이다.

하나의 실시 형태에서 본 명세서 내에 정의된 AON을 스킵핑하는 엑손은 특정 서열에 결합 및/또는 상보적인 화합물 일 수 있다. 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 AON을 스크리닝하는 방법은 예를 들면 본 명세서 내에 참고 문헌으로 인용 된 WO 2002/024906, 미국 특허 6,875,736호 및 WO 2016/005514에 개시되어 있다. 바람직하게는 USH2A 유사 엑손 40 (PE40)과 관련된 비정상적인 152 뉴클레오타이드 와 관련된 특정 서열에 대한 결합은 당업자에게 공지 평가되고 있다.

한편 바람직한 기술은 유럽 특허 1619249호에 개시된 겔 이동 시프트 분석이다. 바람직한 실시 형태에서 표지된 서열에 대한 분자의 결합이 겔 이동 시프트 분석에서 검출되는 즉시 AON을 스킵핑하는 (유사) 엑손이 결합된다고 여겨진다.

본 발명의 모든 실시 형태에서, (유사) 엑손 스킵핑 분자는 AON이다. 본 발명의 목적은 AON을 설계하는 것과 특히 관련되어 있다. 바람직한 방법에서 다음 중 적어도 하나는 엑손 스킵핑 분자의 디자인 및 개선을 위해 고려되어야 한다. (1) AON은 바람직하게는 CpG 또는 CpG 모티프의 스트레치를 함유하지 않는다; (2) AON은 수용 가능한 RNA 결합 카이네틱스 및/또는 열역학 특성을 지닌다. 이때 올리고뉴클레오타이드에서 CpG 또는 CpG 모티프의 존재는 일반적으로 상기 올리고뉴클레오타이드의 증가된 면역원성과 관련이 있다.

면역원성은 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및/또는 염증성 단핵 세포의 침윤을 평가함으로써 동물 모델에서 평가할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 면역 측정법을 사용하여 중화 항체 및/또는 상기 올리고뉴클레오타이드를 인식하는 항체의 존재를 검출함으로써 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로 치료되는 동물 또는 사람의 혈액 내에서 측정될 수도 있다.

IL-12 생성 및/또는 면역 원성의 증가와 같은 염증 반응은 중화 항체 또는 상기 올리고뉴클레오타이드를 인식하는 항체의 존재 또는 증가 양을 표준 면역 검정법을 사용하여 검출함으로써 평가할 수 있다.

본 발명은 수용 가능한 RNA 결합 카이네틱스 및/또는 열역학 특성을 갖는 AON에 관한 것이다. RNA 결합 카이네틱스 및/또는 열역학적 특성은 올리고뉴클레오타이드 특성 계산기(www. unc. edu/-cail/biotool/oligo/index.html)에 의해 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도 (Tm)을 측정할 수 있으며 기본 Tm과 가장 인접한 모델을 이요하여 단일 가닥 RNA의 융점 및/또는 AON- 표적 엑손 복합체의 자유 에너지를 RNA 구조 버전 4.5를 이용하여 측정할 수 있다.

Tm이 너무 높으면, 올리고뉴클레오타이드는 특이성이 낮아질 것으로 예상된다. 수용 가능한 Tm 및 자유 에너지는 올리고뉴클레오타이드의 서열에 의존한다. 따라서 이들 파라미터 각각에 대해 바람직한 범위를 부여하는 것은 어렵다. 수용 가능한 Tm은 35 ~ 70 ℃ 범위이며 허용 가능한 자유 에너지는 15 ~ 45 kcal/mol 범위이다.

바람직한 실시 형태에서, AON은 USH2A 유사 엑손 40 (WO 2016/005514에서 서열번호:5)에서 비정상 152 뉴클레오타이드의 스킵핑을 유도하게 된다. 실시간 정량적 RT-PCR 분석으로 측정할 때 USH2A 유사 엑손 40에서의 비정상 152 뉴클레오타이드의 스킵핑 백분율은 적어도 30 % 또는 적어도 35 % 적어도 40 % 적어도 45 % 적어도 50 % 적어도 55 % 적어도 60 % 적어도 65 % 적어도 70 % 적어도 75 % 적어도 80 % 적어도 85 % 적어도 90 % 적어도 95 % 또는 100 %이다. 엑손 스킵핑 및/또는 엑손 보유를 결정하기 위한 바람직한 에세이는 본 명세서 내의 실시예에 기재되어 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 AON은 PE40 (서열번호:9)의 뉴클레오타이드 서열과 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 또한 그 상보적인 서열의 일부를 포함할 수 있으며 이는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 길이의 적어도 50 % 적어도 60 % 바람직하게는 적어도 70 % 보다 바람직하게는 적어도 80 % 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 % 보다 더 바람직하게는 98 % 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99 % 또는 최고로 바람직하게는 100 %이다. 또한 본 발명에 따른 AON은 하기에 나타낸 서열번호 9의 일부와 상보적인 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는 것이다 :

유사 엑손 40; PE40

5'-cttcctctccagaatcacacaagttaaaggacccttctgcaacaagagcagcg

aatctactcagccagagcaggaagctaataaaatgtatgctggcttttaaggggga

aacaaatcatgaaattgaaattgaacacctctcctttcccaag-3' (서열번호:9)

예를 들면 AON은 서열번호:9의 일부와 상보적인 서열과 추가적 인접 서열을 포함하는 것이다. 특히 PE40의 3 말단의 스플라이싱 부위에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직한 실시 형태에서 상기 AON의 상보적인 부분의 길이는 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 또는 143 뉴클레오타이드이다. 추가 인접(flanking) 서열을 사용하여 결합을 변형시키거나 AON의 열역학적 특성을 변형시키거나 보다 바람직하게는 표적 RNA 결합친화도를 변형시킬 수 있다.

당업자는 상보성 부위의 모든 염기가 반대 가닥의 염기와 쌍을 이루는 것이 절대적으로 요구되는 것은 아닌 것을 인지하고 있다. 예를 들면 AON을 설계할 때 상보적 가닥 상에 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 혼입시킬 수 있다.

세포의 상황에 따라 뉴클레오티드의 스트레치가 상보적인 부분에 충분히 혼성화 될 수 있다면 어느 정도 미스 매치가 허용 될 수 있다. 이러한 맥락에서 '충분히' 바람직하게는 유럽특허 1619249호 내의 실시예 1에 기재된 바와 같은 겔 이동 쉬프트 분석을 사용하여 AON의 결합이 검출될 수 있다.

선택적으로 상기 AON은 환자의 섬유아세포 또는 망막 세포로의 형질 감염을 통해 추가로 시험 될 수 있다. 표적화된 엑손의 스킵핑 (skipping)은 예를 들면 유럽특허 1619249호 내에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 평가 될 수 있다. 상보적 영역은 결합 될 때 프리 -mRNA 내의 엑손에 특이적 영역이 되도록 설계된다. 이러한 특이성은 시스템의 다른 (프리) mRNA 분자의 실제 서열에 의존하기 때문에 다양한 길이의 상보적인 영역으로 생성 될 수 있다.

AON이 하나 이상의 다른 pre-mRNA 분자와 혼성화 될 수 있는 위험성은 AON의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 상보성 영역에서 미스 매치를 포함하지만 프리- mRNA에서 표적 부위에 혼성화 및/또는 결합하는 능력을 보유하는 AON이 본 발명에서 사용된다.

그러나 적어도 상보적 부분은 하나 이상의 상보적 영역에서 이러한 불일치를 지닌 AON보다 상보적인 부분에서의 미스 매치가 없는 AON이 전형적으로 더 높은 효율 및 보다 높은 특이성을 지니며 따라서 미스 매치를 포함하지 않는다. 높은 혼성화 강도 즉, 대응 가닥과의 상호 작용의 수를 증가시키는 것이 시스템의 스플라이싱 메카니즘을 저해하는 공정의 효율을 증가시키는데 유리한 것으로 생각된다. 바람직하게는 상보성은 90 % 내지 100 %이다.

본 발명의 AON을 스킵핑하는 유사 엑손은 분리된 형태 인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 AON을 스킵핑하는 바람직한 유사 엑손은 18 내지 143 개 뉴클레오티드 바람직하게는 18 내지 60 바람직하게는 18 내지 40 뉴클레오티드 바람직하게는 18 내지 30 뉴클레오티드 더욱 바람직하게는 18 내지 24 뉴클레오타이드 더욱 바람직하게는 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개 뉴클레오티드이다.

또 다른 바람직한 실시 형태에서 본 발명의 AON은 18 내지 143 개 뉴클레오타이드 바람직하게는 18 내지 40 뉴클레오타이드 바람직하게는 18 내지 30 뉴클레오타이드 바람직하게는 18 내지 20 뉴클레오타이드 바람직하게는 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 또는 143 뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 AON을 스킵핑하는 엑손은 뉴클레아제 내성을 증가시키고 및/또는 표적 서열에 대한 AON의 친화성을 증가시키기 위해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 바람직한 측면에서 AON 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물을 포함하며 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 변형 된 염기 및/또는 변형 된 백본 및/또는 비천연 뉴클레오시드 연계 또는 이들의 조합을 포함 할 수 있다.

바람직한 실시 형태에서 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 변형된 백본을 포함한다. 그러한 백본의 예는 모르폴리노 백본, 카바메이트 백본, 실록산 백본, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본, 포름아세틸 및 티오폼아세틸 백본, 메틸렌포름아세틸 백본, 리보아세틸 백본, 알켄 함유 백본, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌 히드라지노 백본 및 아미드 백본. 포스포로디아미다네이트 모르폴리노 올리고머는 이전에 안티센스 제제로서 연구되어 왔던 올리고뉴클레오타이드 변형된 백본이다.

모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 DNA의 데 옥시리보스 당이 6 원 고리로 대체되고 포스포디에스테르 결합이 포스포로디아미데이트 결합으로 대체된 비전하 백본을 지닌다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 효소적 분해에 내성을 가지며 RNaseH를 활성화시키는 것보다는 pre-mRNA 스플라이싱을 방해하거나 번역을 방해함으로써 안티센스 작용제로 작용하는 것으로 여겨진다.

모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 물리적으로 파괴하는 방법으로 조직 배양 세포에 성공적으로 전달되었으며 스크랩 로딩이 가장 효율적인 전달 방법이라는 것을 몇 가지 방법과 비교하여 확인한 연구가 있다. 그러나 모르폴리노 백본은 전하가 없기 때문에 양이온성 지질은 세포에서 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 흡수를 효과적으로 매개할 수 없다.

최근 보고서는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드에 의한 삼중체 형성을 나타내었고 비이온성 백본으로 인해 연구에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 마그네슘이 없을 때 삼중체 형성이 가능하다는 것을 나타 내었다. 골격 내의 잔기 사이의 결합은 단사슬 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 결합, 혼성화 헤테로 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 결합에 의해 형성된 결합과 같은 인 원자를 포함하지 않는 것이다. 또한 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로 원자 또는 헤테로 사이클릭 뉴클레오티드 사이 결합을 포함한다.

바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 변형된 폴리아미드 백본을 지닌 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다. PNA 기반 분자는 염기쌍 인식의 관점에서 DNA 분자의 진정한 모방체이다. PNA의 주쇄는 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2- 아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며 뉴클레오 염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 골격에 연결되어 있다. 대안적인 백본은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 모노머를 포함한다.

PNA 분자의 골격은 하전된 인산염 그룹을 포함하지 않기 때문에 PNA-RNA 하이브리드는 일반적으로 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드보다 안정하다. 추가의 바람직한 주쇄는 리보오스 또는 데옥시리보스 당이 6- 원 모르폴리노 고리로 치환된 모르폴리노 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물을 포함한다.

바람직한 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리로 치환되고 인접한 모르폴리노 고리 사이의 음이온성 포스포디에스테르 결합이 비이온성 포스포로디아미데이트로 대체된 포스포로디아미다네이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하는 것이다.

또 다른 실시 형태에서 본 발명의 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 포스 포디에스테르 결합에서 비-브리징 산소 중 하나의 치환을 포함한다. 이 변형은 염기쌍을 약간 불안정하게 만들지만 핵산 분해에 대한 상당한 저항성을 부여한다.

바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스 포리에스터, H-포스포네이트, 메틸 및 다른 알킬포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 또는 보레인포스페이트를 포함한다.

본 발명의 추가의 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 2 ', 3' 및/또는 5 '위치에서 일치환 또는 이치환된 하나 이상의 당 잔기, 예컨대 -OH; -F; 하나 이상의 헤테로 원자에 의해 교환될 수 있는 치환 또는 비치환된 선형 또는 분 지형 저급 (C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 알릴 또는 아랄킬; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬 -O-알킬, -메톡시, - 아미노프로폭시; 메톡시에톡시; 디메틸아미노옥시에톡시; - 디메틸아미노에톡시에톡시. 당 잔기는 피라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시피라노오스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체 또는 데옥시리보스 또는 유도체 일 수 있다.

바람직한 유도체화 당 잔기는 2'-탄소 원자가 당 고리의 3 '또는 4'탄소 원자에 연결되어 비사이클릭 당 잔기를 형성하는 잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid, LNA)을 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O, 4'-C- 에틸렌 가교 핵산을 포함한다.

이러한 치환은 뉴클레오티드 유사체 또는 동등한 RNase H 및 뉴클레아제 내성을 부여하고 표적 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다. 또 다른 실시 형태에서 본 발명의 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다.

변형된 염기는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴 및 다른 α-아자, 데자아, - 하이드록시, -할로, 티오, 티올, -알킬, -알켄일, -알키닐, 피리미딘의 티오알킬 유도체 및 퓨린 염기와 같은 합성 및 천연 염기를 포함한다. 또는 당 업계에 공지 될 것이다.

당업자라면 AON의 모든 위치가 균일하게 수정 될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 또한 앞서 언급한 아날로그 또는 균등물 중 하나 이상을 단일 AON에 통합하거나 AON 내의 단일 위치에 통합 할 수도 있다. 특정 실시 형태에서 본 발명의 AON은 2 종 이상의 상이한 유형의 유사체 또는 등가물을 갖는다.

본 발명에 따른 AON을 스킵핑하는 바람직한 유사 엑손은 2'-O- 메틸 변형된 리보오스 (RNA), 2'-O- 에틸 변형된 리보스, 2'-O- 프로필 변형된 리보스 및/또는 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형체의 치환 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 효과적인 AON은 포스포로티오에이트 골격을 갖는 2'- O- 메틸리보스를 포함한다.

당업자는 상이한 AON이 USH2A의 비정상 152 뉴클레오티드 유사 엑손 (pseudo exon)을 효율적으로 스킵핑하기 위해 조합될 수 있음을 또한 이해할 것이다. 바람직한 실시 형태에서 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 AON의 조합 또는 세트가 본 발명의 방법에 사용된다.

AON은 세포 바람직하게는 망막 세포에서 AON의 섭취를 증가시키는 모이어티에 연결될 수 있다. 이러한 모이어티의 예로는 콜레스테롤, 탄수화물, 비타민, 비오틴, 지질, 인지질, 세포 투과성 펩타이드를 포함한다. 또한 안테나 내피, TAT, 트랜스포손 및 올리고아르기닌, 폴리-아르기닌, 올리고리신 또는 폴리라이신과 같은 양전하를 띤 아미노산, 항원-의존성 펩티드 및 항원-결합 펩타이드를 포함한다. 항체, Fab 항체 단편, 또는 카펠로이드 단일 도메인 항원 결합 도메인과 같은 단쇄 항원 결합 도메인을 포함 할 수 있다.

본 발명에 따른 AON은 당업계에 공지된 적절한 수단을 사용하여 간접적으로 투여될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터의 형태로 개체 또는 개체의 세포, 조직 또는 기관에 제공 될 수 있으며 발현 벡터는 상기 AON을 포함하는 전사물을 암호화한다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 기관 또는 개체 내로 도입된다.

바람직한 실시 형태에서 본 명세서 내에서 확인된 엑손 스킵핑 분자의 발현 또는 전사를 유도하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스 발현 벡터가 제공된다. 따라서 본 발명은 AON의 발현을 유도하는 조건 하에서 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다.

세포에는 플라스미드 유도 AON 발현 또는 아데노 바이러스 또는 아데노 관련 바이러스에 근거한 벡터에 의해 제공된 바이러스 발현에 의해 전달될 수 있으며 이때 비정상 152 뉴클레오타이드 USH2A 유사 엑손의 고효율 스킵핑을 초래하는 필수 서열을 간섭 할 수 있는 AON이 제공된다. 발현은 U7 프로모터와 같은 폴리머라제 -Ⅱ 프로모터 (Pol Ⅱ) 또는 U6 RNA 프로모터와 같은 폴리머라제 Ⅲ (Pol Ⅲ) 프로모터에 의해 유도될 수 있다.

바람직한 전달 비히클은 아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV)와 같은 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터 등이며 모두 WO 2016/005514 내에 상세히 기재되어있다. 플라스미드, 인공 염색체, 표적화 호모로고스 재조합 및 세포의 인간 게놈 내에서 인티그레이션에 사용할 수 있는 플라스미드는 본 명세서 내에서 정의된 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합하게 적용될 수 있다.

본 발명에서 바람직한 것은 Pol-Ⅲ 프로모터로부터 전사가 유도되는 벡터이고 작은 전사체를 전달하기 위한 양호한 결과를 제공하는 벡터로서 전사체는 U1 또는 U7 전사체와의 융합 형태로 존재하는 것이다. 적절한 전사체를 설계하는 것은 통상의 지식을 가진 자의 기술 범위 내에 있다. 바람직하게는 U1 또는 U7 전사체를 지닌 융합 전사체의 형태로 바람직하게는 Pol-Ⅲ 유도 전사체가 바람직하다.

본 발명에 따른 AON은 상기한 바와 같이 전달될 수 있다. 그러나 AON은 또한 바이러스 벡터에 의해 암호화 될 수 있다. 전형적으로 이것은 전사체의 일부에 본 발명에 따른 AON의 서열을 포함하는 RNA 전사체의 형태이다.

본 발명에 따른 AON으로 피험자의 세포, 조직, 기관을 제공하는 수단의 개선은 이미 지금까지 성취된 기법을 고려하여 판단될 수 있다. 이러한 수단의 개선은 물론 본 발명의 방법을 사용하여 mRNA의 재구성에 대한 언급된 효과를 달성하도록 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 AON은 상기 피험자의 세포, 조직 또는 기관에 그대로 전달 될 수 있다.

본 발명에 따른 AON을 투여하는 경우 전달 방법에 적합한 용액에 분자를 용해시키는 것이 바람직하다. 망막 또는 내이 세포는 WO 2016/005514호 내에 상세히 기술된 바와 같이 수용액 또는 바이러스 벡터 또는 나노 입자를 통한 플라스미드를 사용함으로써 AON 발현을 위한 적합한 플라스미드를 제공할 수 있다.

바람직하게는 바이러스 벡터 또는 나노 입자가 망막 또는 내이 세포에 전달된다. 당업자는 USH2A 관련 질환의 예방, 치료 또는 지연을 위해 본 발명에서 사용하기 위해 AON을 전달하기 위한 공지된 및/또는 다른 상업적으로 이용 가능한 다른 부형제 및 전달 시스템 중 임의의 것을 선택 적용할 수 있다. 또한 전달패키지로 적용할 수도 있다.

'USH2A 관련 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연'은 본 명세서 내에서 바람직하게는 부분적으로 또는 전체적으로 시각 장애 또는 실명을 예방, 중지, 중단 또는 역전시키는 것으로 한편으로는 장애의 진행을 예방, 중단, 중지시키는 것으로 정의된다. USH2A 유전자의 유전적 결함으로 인해 부분적으로 또는 완전한 청각 손상 또는 청각 장애를 역전시킬 수 있다.

바람직한 실시 형태에서 본 발명에 따른 AON은 세포 또는 그의 전달 장치 및/또는 전달을 위한 적어도 부형제 및/또는 표적화 리간드가 제공된 조성물 또는 약제 또는 조성물로 제형화되고 및/또는 그것의 세포 내 전달을 증강시킨다.

조성물이 부가 화합물과 같은 추가의 성분을 포함하는 경우 조성물의 각 성분은 하나의 단일 조합, 조성물 또는 제형으로 제형화되지 못할 수 있다. 이들의 성분에 따라 당업자는 본 명세서 내에서 정의된 바와 같이 각각의 성분에 대해 어느 유형의 제제가 가장 적합한지를 판단할 수 있다.

필요한 경우 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 AON을 발현하는 벡터 바람직하게는 바이러스 벡터는 약학적으로 수용 가능한 담체를 첨가함으로써 약학적으로 활성화된 활성 혼합물에 혼입될 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물 바람직하게는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명에 따른 단일 AON 또는 바이러스 벡터를 포함 할 수 있지만 또한 본 발명에 따른 다수의 별개의 AON 또는 바이러스 벡터를 포함할 수도 있다. 이러한 약제학적 조성물은 담체, 충전제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제 등의 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

바람직한 투여 경로는 수용액의 유리체내 주사 또는 안구 투여용으로 특별히 적응된 제제를 통한 것이다. 유럽 특허 EP2425814호에는 펩타이드 또는 핵산 약물의 안구 내 (intravitreal) 투여에 특히 적합한 수중유 에멀젼을 개시한다. 이 에멀젼은 유리질 에멀젼보다 밀도가 낮기 때문에 에멀젼이 유리체 위에 떠오르면서 주사된 약물이 시력을 손상시키는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에 따라 다수의 개별적 AON이 사용되는 경우 본 명세서 내에서 정의된 농도 또는 용량은 사용된 모든 올리고뉴클레오타이드의 총 농도 또는 투여량 또는 사용되거나 첨가된 각 엑손 스킵핑 분자의 농도 또는 투여량을 지칭할 수 있다. 따라서 하나의 실시 형태에서 사용된 본 발명에 따른 AON의 각각의 함량 또는 총 함량이 0.01 내지 20 mg/kg 바람직하게는 0.05 내지 20 mg/kg 범위의 양인 조성물이 제공된다. 적합한 유리체 강내 투여량은 안구당 약 0.05 내지 약 5 mg 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 mg 예를 들면 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg 이다.

본 발명에 따른 바람직한 AON은 피험자의 USH2A 관련 질병 또는 증상의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 모든 실시 형태에서 용어 '치료'는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 지연을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 AON을 사용하여 치료할 수 있는 피험자는 이미 USH2A 관련 질환 또는 상태를 지닌 것으로 진단되었을 수 있다.

선택적으로 본 발명에 따른 AON을 사용하여 치료할 수 있는 개체는 USH2A 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 아직 진단되지 않았지만 USH2A 관련 질환 또는 상태를 발전시킬 위험성을 지닌 개체일 수 있다. 개체의 유전적 배경 선호하는 개체는 인간이다. 바람직한 실시 형태에서 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다.

따라서 본 발명은 추가로 USH2A 관련 질환 또는 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 상태의 치료를 위한 약제로서 바이러스 벡터 또는 조성물 또는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방 치료 또는 지연을 위한 약제로서의 용도에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 추가로 USH2A 관련 질환 또는 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 상태의 치료를 위한 약제로서 바이러스 벡터 또는 조성물 또는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방 치료 또는 지연을 위한 약제로서의 용도 및 약제의 제조 방법에 관한 것이다.

따라서 추가적인 실시 형태에서 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱의 조절을 필요로 하는 상태를 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서 내에서 정의된 AON 바이러스 벡터 또는 조성물의 용도를 제공하는 것이다. USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위한 약제의 용도 또는 치료 방법은 적어도 일회, 적어도 일주일, 한 달, 수개월, 1년 2, 3, 4, 5, 6 년 또는 그 이상 평생토록 지속된다.

본 발명에 사용하기 위한 본 명세서 내에서 정의된 각각의 AON은 이미 영향을 받거나 USH2A 관련 질환 또는 상태를 발병 할 위험성이 있는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 투여하기에 적합할 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 직접 투여될 수 있다. 본 발명의 AON, 조성물, 화합물 또는 관련 화합물의 투여 빈도는 질병의 중증도, 환자의 연령, 환자의 돌연변이, 용량과 같은 AON의 수, 상기 분자의 제형, 투여 경로 등을 포함한다. 빈도는 매일, 매주, 적어도 2 주에 1 회 또는 3 주 또는 4 주 또는 5 주에 1회 또는 더 긴 시간 간격으로 다양할 수 있다.

본 발명에 따른 AON의 투여량 범위는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 생체 내 사용 임상 시험에서 증가하는 투여량 연구에 기초하여 설계하는 것이 바람직하다. 본 명세서 내에서 정의된 AON은 0.01 내지 20 mg/kg 바람직하게는 0.05 내지 20 mg/kg 범위의 투여량으로 사용될 수 있다. 적절한 유리체강 내 투여량은 안구 당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0mg과 같이 안구 당 0.05mg 내지 5mg 바람직하게는 0.1 내지 1mg 일 것이다. 바람직한 실시 형태에서 0.1 nM 내지 1ㅅM 범위의 본 명세서 내에서 정의된 AON의 농도가 사용된다.

바람직하게는 이 범위는 망막 세포 또는 망막 조직과 같은 세포 모델에서 시험관 내 사용을 위한 것이다. 바람직하게는 사용된 농도는 1 내지 400 nM 바람직하게는 10 내지 200 nM 더욱 바람직하게는 50 내지 100 nM의 범위이다. 다양한 AON이 사용되는 경우 이 농도 또는 용량은 AON의 총 농도 또는 용량 또는 추가된 각 AON의 농도 또는 용량을 나타낼 수 있다.

바람직한 실시 형태에서 본 발명에 따른 분자를 위한 전달 비히클로서 본 명세서 내에서 기재한 바와 같은 바이러스 벡터 바람직하게는 AAV 벡터를 주사 당 1x10⁹ 내지 1x10¹⁷바이러스 입자 보다 바람직하게는 주사 당 1x10¹⁰ 내지 1x10¹² 바이러스 입자로 투여한다.

상기 주어진 AON의 농도 또는 용량의 범위는 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외 사용을 위한 바람직한 농도 또는 투여량이다. 당업자는 사용된 AON, 치료될 표적 세포, 유전자 표적 및 그의 발현 수준, 사용된 배지 및 형질 감염 및 항온 배양 조건에 따라 사용되는 AON의 농도 또는 투여량이 더욱 다양할 수 있으며 더 이상 최적화될 수 있다.

본 발명은 또한 세포 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 USH2A 프리 -mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 실시 형태의 특징은 바람직하게는 본 명세서에서 앞서 정의된 특징이다.

세포를 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 본 명세서 내에 기재된 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법이 포함된다. 접촉은 직접 또는 간접적 일 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험 관내 접촉일 수 있다.

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체의 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱의 조절을 필요로 하는 USH2A 관련 질환인 어셔 증후군 Ⅱ형 또는 그 상태의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 바람직하게는 망막 세포 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물로 상기 개체를 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 형태의 특징은 바람직하게는 본 명세서 내에서 앞서 정의된 특징이다.

세포 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행 될 수 있다. 본 명세서 내에 기재된 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법의 사용이 포함된다. 접촉은 직접 또는 간접적일 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 일 수 있다. 바람직한 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다. 다르게 지시되지 않는 한 본 명세서 내에 기재된 바와 같은 각각의 실시 형태는 본 명세서 내에 기술된 다른 실시 형태와 결합 될 수 있다.

본 발명은 서열번호 6, 3, 4, 5, 7, 8, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 25 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)이고 바람직하게는 서열번호 6, 3, 4, 5, 7, 8, 26, 34, 35 및 37로부터 선택되는 서열이며 더욱 바람직하게는 서열번호: 6, 3, 4, 5, 7, 8, 26 및 35에서 선택된 서열이다. 본 발명의 AON은 USH2A 프리-mRNA에서 유사 엑손 40 (PE40)의 스킵핑을 유도, 자극 또는 증강시킬 수 있다. 여기서 PE40의 내포는 USH2 환자에서 흔히 발견되는 c.7595-2144 A>G에 기인하거나 유발된다.

AON이 무작위로 선택되지는 않지만 USH2a-PE40 -3, -5 및 -7라고 명명된 3개의 새로운 AON을 기반으로 3가지 파생 그룹을 형성한다는 것이 도 1 내지 도 5 및 표 1을 통해 이해된다.

USH2a-PE40-3 (서열번호:19)에 기초한 AON은 서열번호 3, 5, 7, 24, 25, 26, 34, 35 및 36의 AON이며, USH2a-PE40-8 (서열번호:3) USH2a-PE40-11 (서열번호:26), USH2a-PE40-20 (서열번호:5) USH2a-PE40-22 (서열번호:35) 및 USH2a-PE40- 28 (서열번호:7)이 가장 잘 수행된다. (도 4 및 도 5 참조).

USH2a-PE40-5 (서열번호:21)에 기초한 AON은 서열번호 27, 28 및 29의 AON이다.

USH2a-PE40-7 (서열번호:23)에 기초한 AON은 서열번호 4, 6, 8, 30, 31, 32 및 37의 AON이고, USH2a-PE40-17 (서열번호:4) USH2a-PE40-24(서열번호:6) 및 USH2a-PE40-29 (서열번호:8)이 가장 잘 수행된다. (도 4 및 도 5 참조). 또한 USH2a-PE40-17 및 USH2a-PE40-24가 다른 모든 AON에 비해 우수한 성능을 지닌다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37 내에 존재하는 중복 서열은 5'-AGAUGAUCUCUUA-3' (서열번호:42)이고 여기서 시토신은 5-메틸-시토신 (5mC)으로 대체된다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36 내에 존재하는 중복 서열은 5'-CGCUGC-3' (서열번호:43)이고 시토신은 5-메틸-시토신 (5mC)으로 대체된다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 21, 27, 28, 29 내에 존재하는 중복 서열은 5'-AUUUCAAUUUCAUGAUUU-3' (서열번호:44)이고 여기서 시토신은 5-메틸-시토신 (5mC)으로 대체된다.

따라서 본 발명은 서열번호 42, 43 및 44로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 AON에 관한 것이다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37의 표적 부위는 PE40 서열의 3' 말단에 스플라이싱 바운더리를 포함시켜 5'-UCCCAAGGUAAGAGAUCAUCUUUAAGAAAAGG-3' (서열번호:45)이다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36의 표적 부위는 5'-UCUGCAACAAGAGCAGCGAAUCUACUCAGC-3' (서열번호:46)이다.

매우 효과적인 AON인 서열번호 21, 27, 28, 29의 표적 부위는 5'-GGAAACAAAUCAUGAAAUUGAAAUUGAACA-3' (서열번호:47)이다.

서열번호 45, 46 및 47의 임의의 서열을 표적으로 하는 가장 짧은 AON은 18개 뉴클레오티드 길이의 USH2a-PE40-23 (서열번호:36)이었다. 따라서 본 발명은 서열번호:45, 46 또는 47의 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 연속적인 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 인간 USH2A 프리-mRNA로부터의 유사 (pseudo)엑손40 (PE40)의 스킵핑을 유도할 수 있는 AON에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서 본 발명은 인간 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 유도, 유발, 자극 및/또는 증진시킬 수 있는 AON에 관한 것으로 상기 AON은 하기의 서열 군 : (ⅰ) 서열번호 6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37; (ⅱ) 서열번호 3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; 및 (ⅲ) 서열번호 21, 27, 28, 29에서 선택된 서열을 포함하거나 서열로 구성된다.

바람직한 실시 형태에서 상기 AON은 하기 서열 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 서열로 구성된다 : (ⅰ) 서열번호 6, 4, 8; (ⅱ) 서열번호 3, 5, 7, 26, 35이다. 또한 바람직한 실시 형태에서 상기 AON은 서열번호:6 및 서열번호:4에서 선택된 서열을 포함하거나 서열로 구성된다.

특정 측면에서 USH2A 프리-mRNA 내의 PE40의 보유는 또는 스플라이싱 후 mRNA 내의 PE40의 존재는 USH2A 유전자의 c.7595-2144A>G 변이에 기인한다. 비록 USH2A 유전자 내의 또다른 확인되거나 확인되지 않은 변이를 포함하더라도 USH2A mRNA 내에서 PE40의 존재는 이러한 변이에 기인하는 것이다.

바람직하게는 본 발명의 AON은 적어도 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-에틸 , 또는 2'-O-프로필과 같은 2'-O-알킬 변형을 지니고 있다. 더욱 바람직하게는 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE)과 같은 2'-O-알킬 변형을 지닌다.

하나의 바람직한 실시 형태에서 본 발명의 AON의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형된 것이다. 바람직하게는 본 발명의 AON은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 지니고 보다 바람직하게는 본 발명의 AON 내의 모든 순차 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합에 의해 상호 연결된다.

바람직한 실시 형태에서 본 발명의 AON은 18 내지 143개 뉴클레오타이드 바람직하게는 18 내지 40개 뉴클레오티드, 바람직하게는 18 내지 30개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 18 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이를 지닌다. 바람직한 실시 형태에서 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸 변형 리보오스 (RNA), 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-메틸 변형 리보스 프로필 변형 리보스 및/또는 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형체의 치환된 유도체를 포함한다. 치료 효과를 증가시키기 위해 본 발명의 다수의 AON을 적용하는 것이 유용할 수 있다.

따라서 다른 바람직한 실시 형태에서 본 발명은 AON 세트에 관한 것이며 상기 세트는 본 발명에 따른 적어도 2 개의 AON을 포함한다. 다른 측면에서 본 발명은 AON의 발현을 유도하는 조건 하에 놓일 때 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AON, AON 세트 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고 안구 당 총 AON 0.05mg 내지 5mg 범위의 양으로 투여된다. 더욱 바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고, 안구 당 총 AON의 함량은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0과 같이 0.1 내지 1 mg 범위의 용량으로 유리체 내에 투여된다.

또 다른 실시 형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON 본 발명에 따른 AON 세트 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 의약 조성물로서 사용하기 위한 것이며 바람직하게는 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 요구하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON 본 발명에 따른 벡터 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것으로 USH2A 관련 질환 또는 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 상태의 치료용 약제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포에서 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법에 관한 것으로 상기 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 AON 본 발명에 따른 세트 본 발명에 따른 벡터와 접촉시키는 방법을 포함하며 또한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 상기 세포는 시험관내 세포, 생체 외 세포 또는 생체 내 세포 일 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 세포는 바람직하게는 USH2A 관련 장애를 앓고 있거나 위험에 처한 인간 개체의 안구 내에 존재하거나 이로부터 수득된다.

따라서 또 다른 바람직한 측면에서 본 발명은 Usher 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절할 필요가 있는 USH2A 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서 본 발명에 따른 AON 본 발명에 따른 세트 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물을 갖는 개체의 세포에 관한 것이다.

또 다른 실시 형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 유사 엑손 스킵핑 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 용도 또는 본 발명에 따른 USH2A 관련 조절 질환 또는 USH2A의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 조건 하에서 Usher 증후군 Ⅱ형의 치료를 위한 것이다. 가장 바람직한 실시 형태에서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 스킵핑되는 유사 엑손은 본 명세서 내에 개시된 바와 같은 유사 엑손 40 (PE40;서열번호:9)이다.

본 명세서와 그 청구항에 있어서 '포함하다(comprise)'라는 동사와 그 사용법은 한정적인 의미로 사용되지 않고 관련된 항목은 포함하지만 구체적으로 언급되지 않은 항목도 제외하지 않는 것이다.

또한 부정관사인 'a' 또는 'an'의 요소에 대한 언급은 문맥상 하나의 요소만이 명백하게 요구되는 경우를 제외하고는 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사인 'a' 또는 'an' 일반적으로 '적어도 하나(at least one)'를 의미하는 것이다. 예를 들면 약 10의 경우와 같은 수치를 사용할 때 '약' 또는 '거의'라는 단어는 바람직한 수치의 0.1 %의 내외의 수치임을 의미하는 것이다.

본 명세서에서 제공된 서열 정보는 잘못 식별된 염기를 포함할 수 있는 것으로 좁게 해석해서는 안된다. 숙련된 사람은 이러한 잘못 식별된 염기를 인식할 수 있으며 이러한 오류를 수정하는 방법도 인지하고 있다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본 명세서 내에 참고 문헌으로 인용되어있다.

(실시예 1) 향상된 엑손 스킵핑 특성을 지닌 안티센스 올리고뉴클레오타이드 의 선별.

인트론 USH2A 변이 (c.7595-2144A>G)는 USH2A mRNA (WO 2016/005514호의 도 1AB 참조)에 비정상적인 엑손 (PE40)을 내포하는 크립틱 스플라이스 공여 부위를 생성한다. 비정상 엑손에 대한 AON의 첨가는 U1- 및 U2 snRNP 복합체와 같은 스플라이싱에 필수적인 인자의 결합을 방지함으로써 이러한 엑손의 삽입을 예방한다. 또한 세린-아르기닌 풍부 담백질은 정상적인 USH2A 스플라이싱 및 단백질 합성을 복원시킨다. (WO 2016/005514호의 도 1C). AON은 엑손 서열뿐만 아니라 스플라이스 부위를 표적화할 수 있다.

엑손 스킵핑을 유도하는 AON의 능력과 표적 서열에서 예측된 SC35 스플라이스 인자 결합 부위의 존재 사이에 포지티브한 상관 관계가 존재한다고 제안되었다. 매우 높은 엑손 스킵핑 포텐션을 지닌 AON을 디자인하기 위해 ESE finder 3.0 프로그램을 사용하여 비정상적인 USH2A 엑손 152개 뉴클레오타이드 엑손 서열 플러스 각각의 부위에서 15개 인트론 뉴클레오타이드 서열을 통해 엑손 스플라이스 인핸서 결합 모티프를 면밀히 조사하였다.

비정상적인 엑손 내에서 세개 및 두개의 SC35-결합 모티프를 지닌 2개의 영역이 예측되었다. 데이터는 나타내지 않았다. 따라서 SC35 모티프의 이러한 영역이 포함된 2개의 AON은 각각 AON1 (서열번호:1) 및 AON2 (서열번호:2)로 디자인하고 이들은 USH2A mRNA에 상보적인 것이었다. AON1 및 AON2 엑손-스킵핑 포텐셜은 WO 2016/005514호에서 조사되었다 (도 2 참조).

본 실시예에서 이전에 테스트한 AON1 및 AON2 보다 더 강력한 엑손 스킵핑 잠재력을 지니는 훨씬 더 강력한 AON을 식별하고 생성하여 사용될 수 있음을 보여준다. 새로이 시험된 모든 올리고뉴클레오타이드의 개요를 표 1에 나타내었다. 본 실시예에서 사용된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 Eurogentec, MicroSynth 또는 TriLink에서 구입한 후 Tm을 58℃로 당 사슬 내에 2'-O-메틸기로 변형시키고 포스포로티오에이트 (PS) 골격이 포함되도록 설계한 것으로 사용 전에 인산염 완충 생리 식염수에 용해시킨 것이다.

첫 번째 스크리닝 단계에서 스플라이싱 리포터 컨스트럭트 pCI-Neo-USH2a-PE40 (WO 2016/005514)을 사용하여 AON의 효과를 분석하였다. 이 컨스트럭트는 로돕신 유전자로부터 유래된 엑손 3과 5 사이의 인트론에 삽입된 500개 뉴클레오타이드 인트론 서열로 둘러싸인 PE40 서열을 포함한다. 먼저 리포터 플라스미드를 HEK293 세포로 트랜스펙션 한 후 별도의 AON 트랜스펙션을 수행하였다. 리포터 플라스미드는 형질 전환 시약으로서 MaxPEI를 사용하여 형질 감염시키고 후속 AON 형질 감염은 리포펙타민 2000 시약 (Life Technologies)을 사용하여 수행하였다.

24 시간 배양 후 세포를 수거하고 ReliaPrep RNA 미니프렙 키트 (Promega)를 사용하여 RNA를 추출하고 Maxima cDNA 합성 키트 (Thermo, # EP0734)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 성숙한 mRNA 내로의 PE40의 내포는 로돕신 엑손 3 및 5 인접 부위에 위치하는 프라이머를 통해 RT-PCR에 의해 분석되었다.

도 1은 대조 올리고뉴클레오타이드 및 WO 2016/005514호 (AON1 및 AON2)의 2 개의 공지된 AON과 비교하여 HEK293 세포에서 리포터 컨스트럭트를 사용하여 수행된 USH2a-PE40-1 내지 -7의 초기 스크리닝을 나타낸다. 이 초기 스크리닝 USH2a-PE40-1, -2, -4 및 -6은 AON1 및 AON2 (각각 도면에서 R1 및 R2로 나타냄)로 측정된 PE40 엑손 스킵핑에 대한 개선을 나타내지 않았다. 그러나 USH2a-PE40-3, -5 및 -7은 AON1 및 AON2보다 훨씬 효과적이었고 USH2a-PE40-7은 가장 효과적이었다.

도 2는 PE40의 서열 (5 내지 3의 RNA로서) 및 본 명세서 내에서 시험된 AON의 상보성 부위를 나타낸다. USH2a-PE40-1 (서열번호:17), USH2a-PE40-2 (서열번호:18) 및 USH2a-PE40-4 (서열번호:20)는 AON1 (서열번호:1) 및 AON2 (서열번호: 2)의 중복 부위를 포함한다. 보다 효과적인 USH2a-PE40-3 (서열번호:19), USH2a-PE40-5 (서열번호:21) 및 USH2a-PE40-7 (서열번호:23)의 결합 부위는 AON1과 AON2와 분명히 상이한 위치에 있으며 다운스트림 스플라이싱 부위 (USH2a-PE40-7; 그림 1의 하단 패널 참조)를 포함하는 ESE(USH2a-PE40-3 및 -5)의 추정 영역과 중복된다.

USH2a-PE40-6 (서열번호:22)에 대한 결합 부위는 또한 AON1 또는 AON2에 의해 결합되는 영역 외부이지만 USH2a-PE40-5 (서열번호:21)의 결합 부위와 겹쳐지며 이는 보다 강력한 표적 영역으로 PE40 서열의 5 말단 방향으로 위치한다는 것을 시사한다.

도 1의 초기 실험을 바탕으로 PE40 서열에서 PE40 스킵핑에 더 효과적인 핫스팟이 다른 영역이 있다는 것을 명백하게 나타내었지만 AON의 추가 세트는 3가지 영역은 또한 합성, 흡수, 효능 및 면역원성의 용이성을 향상시키기 위해 확인되었다 : AON은 짧아지거나 이동되어 내부 2차 구조가 보다 줄어들 것이다. AON은 결합 친화성을 증강시키는 것으로 알려진 염기 변화를 포함시켜 추가로 변형시킨다. : 시토신 대신 5-메틸-시토신(5mC), 아데닌 대신 2,6-디아미노퓨린(DAP)을 사용한다. 표 1 참조.

5mC 변형은 RNA와 AON의 면역원성을 낮추는 것과 관련되어 있기 때문에 AON의 안전성을 향상시킬 것으로 기대된다. USH2a-PE40-8,-9,-10 및 -11은 USH2a-PE40-3에 기초하였다. USH2a-PE40-12, -13 및 -14는 USH2a-PE40-5를 기준으로 하였다. USH2a-PE40-15, -16, -17 및 -18은 USH2a-PE40-7에 기초하였다. USH2a-PE40-20 및 -21은 USH2a-PE40-8을 기반으로 하였다. USH2a-PE40-22 및 -23은 USH2a-PE40-11을 기반으로 하였다.

USH2a-PE40-24, -25, -26 및 -27은 USH2a-PE40-17을 기반으로 하였다. 신규로 설계된 서로 다른 AON의 위치도 도 2에 나타나있다. 추가 AON이 있는 결과는 도 3 및 도 4에 나타나 있다. DAP 수정으로 인해 효능이 낮아졌음을 보여준다 (USH2a-PE40-26 및 -27 참조). 따라서 이 방법은 폐기되었다.

대조적으로 5mC-변형된 AON은 일반적으로 정상 시토신을 지니는 상응하는 AON과 유사한 효능을 갖는다. 그러나 5mC로 변형된 USH2a-PE40-21은 상응 USH2a-PE40-8보다 약간 효과가 저하되었다. USH2a-PE40-25는 원래 USH2a-PE40-17보다 약간 더 효과적이었습니다. 또한 2개의 뉴클레오타이드 (USH2a-PE40-20 및 -24, 각각 -8 및 -17에 해당)에 의해 단축된 2개의 AON은 상응하는 대응물과 본질적으로 동일한 효과를 나타내었다.

오리지날 AON보다 더 효과적이지는 않지만 단축 버전은 합성이 더 쉽고 잠재적으로 향상된 업테이크를 할 수 있기 때문에 더 우수한 것으로 판단되었다. 이를 토대로 이들 실험으로부터 가장 효과적인 AON은 단축된 올리고뉴클레오타이드 USH2a-PE40-20 및 -24 (각각 서열번호:5 및 6) 및 5mC-변형 USH2a-PE40-22 (서열번호:35) 및 USH2a-PE40-25 (서열번호:37)로 나타났다.

표 1은 본 명세서에서 시험된 바와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열 세부 사항. PE40-AON1 및 PE40-AON2는 WO 2016/005514호에서 기술되었다. X는 5-메틸-시토신(5mC)이며 시토신(C) 대신 사용하였다. Z는 2,6-디아미노퓨린(DAP)이며 아데닌(A) 대신에 사용하였다.

USH2a-PE40-8, -17, -20, -24, -28 및 -29 (서열번호:3 내지 8)을 엑손 스킵핑 능력 및 시험관 내 면역원성에서의 효과에 대해 추가로 시험하였다. 올리고뉴클레오타이드 USH2a-PE40-8, -20 및 -28 올리고뉴클레오타이드가 부분적으로 중첩되는 표적 뉴클레오타이드 서열은 PE40 내에 위치하는 5'-TCTGCAACAAGAGCAGCGAA-3'(서열번호:10)이다. 올리고뉴클레오타이드 USH2a-PE40-17, -24 및 -29 올리고뉴클레오타이드가 부분적으로 중첩되는 표적 뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다 : 5'-AG G*TAAGAGATCATCTTTAAGAA-3'(서열번호:11) PE40의 밑줄친 AG와 c.7595-2144A>G 변이 굵은 구아노신이 별표로 표시되는 것이 그 인접 영역에 존재한다.

섬유아세포는 USH2A c.7595-2144A>G 및 c.2391_2392del 화합물 헤테로자이고스 변이를 지닌 USH2 환자로부터 채취되었다. 세포를 20% FBS 및 1% NaPyr (Sigma Life Sciences)을 함유하는 DMEM AQ 배지에서 37℃로 유지시킨다. 세포를 1.0×10⁶ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. AON은 30분 동안 OptiMem (lot:1697387)에서 리포펙타민 2000 (Life Technologies, lot:1699509)과 복합체를 형성시킨 다음 섬유아세포에 100nM의 농도로 첨가하였다. 배양은 24시간 더 지속되었다. 세포는 24 시간의 배양 기간이 끝날 때 4시간동안 시클로헥사미드로 처리하여 논센스-매개성 mRNA 붕괴를 저해하였다.

24시간 배양 후 세포를 수확하고 RNA 프로토콜을 사용하여 ReliaPrep RNA miniprep 키트 (Promega)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 이어서 Maxima cDNA 합성 키트 (Thermo, # EP0734, lot:00335736)를 사용하여 표 2의 방식을 사용하고 제조자의 프로토콜에 따라 cDNA를 제조하였다. 표 3의 피펫팅 및 표 4의 프라이머를 적용한 액적 디지털 PCR (ddPCR) (QX2000 액적 판독기)을 사용하여 PE40 및 야생형 cDNA의 수준을 측정하였다. 데이터는 Quanta Life Software 및 Excel로 분석하였다. GUSB (Applied Biosystems, lot : P160210-006 E01)를 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 하우스 키핑 유전자로서 사용하였다.

도 5는 1개의 비처리 (NT) 샘플과 함께 8개의 상이한 AON으로 처리된 환자 섬유아세포에서 GUSB 발현 수준에 대해 보정된 야생형 대 PE40으로 표시되는 액적의 수를 나타낸다. 명백하게 특히 도 5에서 USH-PE0-17 및 USH-PE40-24로 약칭되는 AON1, AON2, USH2a-PE40-17 (서열번호:4) 및 USH2a-PE40-24 (서열번호:6)는 야생형 수준으로 향상시키는 데 가장 효과적이었고 2개의 알려진 올리고뉴클레오타이드 AON1 및 AON2를 능가하는 반면 다른 4개의 AON은 덜 효과적이었다.

중요하게 USH2a-PE40-17 및 USH2a-PE40-24가 AON1 및 AON2에서 관찰되지 않은 효과적인 PE40 수준 저하를 가능케 하는 것으로 관찰되었다. 또한 이들 2개의 새로운 유사 엑손이 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (USH2a-PE40-17 및 USH2a-PE40-24)는 2개의 알려진 올리고뉴클레오타이드보다 훨씬 우수하였다. 다른 4개의 올리고뉴클레오타이드인 USH2a-PE40-8, -20, -28 및 -29는 또한 2개의 공지된 올리고뉴클레오타이드 AON1 및 AON2와 비교하여 PE40 수준을 저하시킬 수 있으며 이는 이들 4개의 올리고뉴클레오타이드 또한 종래의 올리고뉴클레오타이드보다 우수하였다.

표 2는 cDNA 준비 절차를 나타내며 표 3은 ddPCR 피펫팅 스킵을 나타내고 표 4는 멀티플렉스 ddPCR 프라이머와 프로브를 나타낸다.

유전자 특이 프라이머는 GUSB 보관을 위한 샘플과 랜덤 헥사머에 사용되었다.

(실시예 2) 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 시험관 내 독성.

올리고뉴클레오타이드는 척추 동물의 타고난 면역 계통의 소위 패턴 인식 수용체(PRR)의 활성화를 시킬 수 있다.(Bauer et al., 2008. Immunobiology 213 : 315-328). PRR 수용체의 가장 잘 연구된 패밀리는 톨(toll) 유사 수용체(TLRs)이다. TLR은 선천성 면역계에서 중요한 역할을 하는 단백질의 한 종류이다. 이는 미생물로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 대식세포 및 수지상 세포에서 통상적으로 발현되는 단일한 막-스팬 비촉매 수용체이다. 서로 다른 유형의 핵산에 의해 활성화되는 TLR은 엔도솜(endosomes)에 위치한다. TLR3은 이중 가닥 RNA를 인식한다. TLR7/8은 이중 및 단일 가닥 RNA를 인식한다.

PRR에 의해 이들 성분이 인식되면 특정 '항균성'면역 반응이 유발된다. TLR 활성화는 활성화된 B세포의 핵 인자 κ-경사슬-인핸서(NF-κB)의 활성화를 유도한다. 또한 인터페론 조절 인자 3 (IRF-3) 및 활성화 단백질 1(AP-1)의 활성화를 초래한다 (Kawasaki 2014. Front Immunol 25 : 461). AP-1, IRF-3 및 NF-κB의 활성화는 면역 반응의 염증성 사이토카인, 유형Ⅰ 인터페론 및 다른 중재자의 생성을 유도한다. 이러한 과정은 염증과 같은 즉각적인 숙주 방어 반응을 유발할 뿐만 아니라 항원 특이적 적응 면역 반응을 준비 조절한다.

프라이머리 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 시험관 내 노출은 전술한 것처럼 전신성 약물 특이적 면역 반응 및 면역 독성을 평가하는 데 사용되었다 (Lankveld 2010. Methods Mol Biol 598 : 401-423). PBMC를 사용한 인 비트로 분석은 전신 면역 반응의 대리 표지로서 염증성 사이토카인의 생산을 이용한 전임상 시험 방법이다. PBMC 분석은 시험 화합물의 면역원성 및 알레르기성 잠재성의 요소로서 내약성 예측을 가능하게 하고 이들 화합물에 대한 안전한 투여 범위의 추정을 가능케 한다.

USH2a PE40-20, USH2a PE40-24, USH2a PE40-28 및 USH2a PE40-29를 연구하기 위해 하우스 내 분리된 PBMC를 사용하였다. 건강한 혈액 은행 기증자의 버피 코트로부터 분리되었으며 배양 상등액에서 중요한 친 염증성 사이토카인의 생산은 1 및 4M 농도의 올리고뉴클레오타이드로 24시간 자극시킨 후에 평가하였다. 또한 올리고뉴클레오타이드로 처리한 후 PBMC의 생존 능력을 USH2a-PE40 AON의 잠재적인 세포 독성 효과를 평가하기 위해 배양 상등액을 사용하였다. 살아있는 세포는 비형광성 레자즈린을 형광성 레조루핀으로 전환시킨다 (OBrien et al., 2000. Eur J Biochem 267 : 5421-5426).

100μg/ml의 LPS (TLR4 agonist)와 1M의 R848 (TLR7/8 agonist)의 양성 대조군을 사용한 인간 PBMC의 자극은 배양 상등액에서 모든 측정된 사이토카인, MCP-1의 농도를 유의미하게 증가시킨다. 더욱이 R848의 자극은 비슷한 정도의 사이토카인 패턴을 유도하였으나 그 정도는 낮았다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로 자극시킨 배양 상등액 내의 사이토카인 농도의 수준을 히트 맵을 통해 나타내었다. 도 6A에 나타난 바와 같이 생리 식염수 처리된 인간 PBMC와 비교하여 양성 대조군으로 측정하였다.

중요하게는 1 및 4M의 농도에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 인간 PBMC의 자극은 농도를 증가시키지 않았으며 배양 상등액 중의 임의의 측정된 사이토카인의 매우 작은 증가된 농도를 초래하였다. 마지막으로 올리고뉴클레오타이드로 처리 24시간 후에 세포 독성의 징후는 나타나지 않았다(도 6B).

(실시예 3) USH2 환자로부터 생성된 옵틱 컵 내 USH2A 프리-mRNA 내의 PE40 스킵핑

망막은 USH2 환자에게서 얻을 수 없으며 명백하게 시험관 내 연구에 사용된다. 이러한 전임상 연구의 대안으로 환자의 망막 물질과 유사한 유기체를 생성하는 것이 가능하며 본 명세서 내에서는 광섬유 컵 또는 옵틱 컵이라고도 한다. 화합물 heterozygosity에서 USH2A c.7595-2144A>G (p.Lys2532Thrfs * 56) 및 c.2299delG (p.Glu767Serfs * 21) 변이가 있는 어셔 증후군 Ⅱ형 환자의 섬유아세포를 옵틱 컵 생성에 사용하였다. 섬유아세포는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 발현하는 4개의 렌티 바이러스를 사용하여 재프로그램 되었고 Radboud UMC 줄기 세포 기술 센터에서 충분히 제공받았다. 클론은 6번 패시지 주위에 저온 보존되었고 면역 세포 화학에 의해 다관능성 줄기 세포 마커 SSEA-4, NANOG, TRA1-81 및 OCT3/4의 발현을 추가적으로 분석하였다.

총 3개의 별개의 클론이 생성되어 저장되었다. 이 클론은 모든 정의된 품질 관리에 따라 줄기 세포 마커 (RT-qPCR)의 활성화 및 줄기 세포 및 다능성 마커 (IHC)의 발현을 거쳤다. 데이터는 표시되지 않음. iPSC 계통은 앞서 설명한 바와 같이 옵틱 컵으로 배양되었다. Zhong 외 iPSCs를 작은 덩어리로 분화시키고 mTeSR1 배지 및 10 μM Blebbistatin (Sigma)으로 현탁 배양하여 응집체 형성을 유도하였다. 골편을 DMEM/F12를 함유하는 신경 유도 배지로 전이시켰다. 1 % N2 보충물, 최소 필수 배지-비필수 아미노산, 2㎍/ml 헤파린(Sigma) 응집체를 Matrigel 코팅 접시에 뿌렸다.

매체를 매일 변경하였다. 분화 4주 후에 신경 망막 도메인을 수동으로 분리하고 2% B27,1x NEAA 및 1% 항생제-항균제가 보충된 DMEM/F12 배지에서 37℃의 가습 배양기에서 현탁 배양하였다. 배지는 주 2회 교체되었다. 인큐베이터에서 그들은 점차적으로 3D 옵틱 컵을 형성하였다. iPSC 유래 광섬유 컵을 성공적으로 생성한 후 AON을 함유한 배지를 격일로 교체함으로써 USH2a-PE40-24를 2μM 및 10μM에서 1개월 동안 처리하였다.

USH2A 전사체 분석을 수행하여 성숙한 mRNA 내로의 PE40의 포함을 결정하였고 프라이머 5'-GCTCTCCCAGATACCAACTCC-3'(서열번호:40) 및 5'-GATTCACATGCCTGACCCTC-3'(서열번호:41) 39 및 42번째에 인접한 각각의 엑손 제공된 프로토콜에 따라 Nucleospin RNA Ⅱ 분리키트 (MACHEREY-NAGEL # 740955.50, D ren-Germany)를 사용하여 iPSC와 옵틱 컵에서 총 RNA를 분리하였다. 이어서 SuperScript VILO 역전사 키트 ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 11755050, 로트 # 1718541를 사용하여 0.5-1.0g의 총 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다.

USH2A, LIN28A, OCT3/4, NANOG 및 SOX2는 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 하우스 키핑 유전자 GUSB가 참조로 사용되었다. GoTaq (Promega A6001)은 qPCR 기계에서 USH2A, LIN28A, OCT3/4, NANOG, SOX2 및 GUSB cDNA를 3배로 증폭하는데 사용되었다. 처리되지 않은 옵틱 컵은 야생형 밴드(900bp)와 PE40 서열(1052bp)을 포함하는 밴드를 나타낼 것이며 이는 젤에서 쉽게 구별된다.

도 7에 제공된 결과는 USH2 환자 섬유아세포로부터 생성된 옵틱 컵 상에서 사용될 때 올리고뉴클레오타이드 USH2a-PE40-24(서열번호:6)의 농도 2μM 및 10 μM 모두가 완전히 PE40을 스킵핑 유도할 수 있기 때문에 PE40을 포함하는 어느 전사체도 검출되지 않았다. 대조군 레인 내의 상부 비특이적 희미한 밴드는 무엇을 의미하는지 분명하지 않았다.

이러한 결과로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드만이특정 경우 USH2a-PE40-24는 어셔 증후군 Ⅱ형을 앓고 있는 이형 접합체 PE40 환자의 망막과 유사한 유기체에서 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40을 효과적으로 스킵핑할 수 있다고 결론지었다

<110> ProQR Therapeutics II B.V. <120> Oligonucleotides to treat eye disease <130> P068294WO <140> Unknown <141> 2017-04-25 <150> GB1607141.7 <151> 2016-04-25 <160> 48 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 1 gugugauucu ggagaggaag cug 23 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 2 cccuuaaaag ccagcauaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 3 uucgcugcuc uuguugcaga 20 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 uucuuaaaga ugaucucuua cc 22 <210> 5 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 cgcugcucuu guugcaga 18 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 6 cuuaaagaug aucucuuacc 20 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence 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flanking sequences <400> 48 ctgctttcag cttcctctcc agaatcacac aagttaaagg acccttctgc aacaagagca 60 gcgaatctac tcagccagag caggaagcta ataaaatgta tgctggcttt taagggggaa 120 acaaatcatg aaattgaaat tgaacacctc tcctttccca aggtaagaga tcatctttaa 180 gaaaagg 187

Claims

인간 USH2A 프리-mRNA로부터 유사 엑손 40 (PE40)의 스킵핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)에 있어서, 상기 AON은 서열번호:45,46 또는 47의 뉴클레오타이드 내의 연속적인 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 상보적인 서열을 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
인간 USH2A 프리-mRNA로부터 유사 엑손 40 (PE40)의 스킵핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)에 있어서, 상기 AON은 하기 그룹의 서열 중에서 선택된 서열임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
(ⅰ) 서열번호:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37;
(ⅱ) 서열번호:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; 및
(ⅲ) 서열번호:21, 27, 28, 29.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, USH2A mRNA에서의 PE40의 출현은 USH2A 유전자 내에서 c.7595-2144A>G 변이에 근거함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 올리고리보뉴클레오티드(RNA 올리고뉴클레오타이드)이며 2'-O-메틸, 2'-O-에틸 또는 2'-O-프로필과 같은 적어도 하나의 2'-O 알킬 변형을 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제 4항에 있어서, 상기 AON 내의 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형된 것임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 하나 이상의 포스 포로티오에이트 결합을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제 6항에 있어서, 모든 뉴클레오타이드는 순차적으로 포스포로티오에이트 결합으로 상호 연결됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
AON의 발현을 유도하는 조건 하에 놓일 때, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 정의된 AON을 발현하는 바이러스 벡터.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 또는 제 8항의 바이러스 벡터와 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 있어서, 약제학적 조성물은 유리체 내 투여함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 9항에 있어서, 약제학적 조성물은 유리체 내 투여하고, 안구 당 총 AON의 함량은 0.05 mg 내지 5 mg 바람직하게는 0.1 내지 1 mg의 양으로, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0mg임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 제 8항에 따른 벡터 또는 제 9항 또는 제 10항에 따른 조성물을 의약으로 사용하기 위한 용도.
USH2A pre-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 요구하는 조건 하에서, 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 관련 질환의 치료, 예방 또는 지연을 위한 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 제 8항에 따른 벡터 또는 제 9항 또는 제 10항에 따른 조성물.
USH2A pre-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 필요로 하는 조건 하에서, USH2A 관련 질환의 치료, 예방 또는 지연용 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 제 8항에 따른 벡터 또는 제 9항 또는 제 10항에 따른 조성물의 용도.
AON이 인간 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 유도, 유발 또는 자극하도록 허용하는 조건 하에서, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 제 8항에 따른 벡터 또는 제 9항 또는 제 10항에 따른 조성물을 상기 세포에 투여하는 것을 포함하는 세포에서 인간 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40을 스킵핑하는 방법.
AON이 인간 USH2A 프리-mRNA로부터의 PE40의 스킵핑을 유도, 유발 또는 자극하도록 허용하는 조건 하에서, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 AON 제 8항에 따른 벡터 또는 제 9항 또는 제 10항에 따른 조성물을 상기 개체 내의 세포에 투여하는 것을 포함하는 USH2A- 관련 질환 또는 이로부터 고통받는 개체에서 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 필요로 하는 상태를 치료하는 방법.
제 13항에 의한 용도 또는 제 15항에 의한 방법에 있어서, USH2A- 관련 질환 또는 USH2A 프리-mRNA로부터 PE40의 스킵핑을 필요로 하는 증상이 어셔 증후군 Ⅱ형임을 특징으로 하는 방법.