JP2019515688A - 眼疾患を処置するオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、医学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、これは、特にヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるエクソン４０および４１の間における偽エクソン（ＰＥ４０）をスキップすることによる、アッシャー症候群タイプＩＩおよび／またはＵＳＨ２Ａ関連非症候性網膜変性の処置、防止および／または遅延において使用してよい。

Description

本発明は、医学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、アッシャー症候群タイプＩＩおよび／またはＵＳＨ２Ａ関連非症候性網膜変性の処置、防止および／または遅延のための新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

アッシャー症候群（ＵＳＨ）および非症候性網膜色素変性症（ＮＳＲＰ）は、網膜の変性疾患である。ＵＳＨは、臨床的および遺伝的に不均一であり、ヒトにおける圧倒的に最も一般的なタイプの遺伝性盲聾である。ＵＳＨ患者における聴覚障害は、大部分が安定で先天的なものであり、補聴器または人工内耳によって部分的に補償することができる。ＮＳＲＰはＵＳＨよりも一般的であり、４，０００人の個体あたり１人に生じる。ＵＳＨおよびＮＳＲＰにおける光受容体細胞の変性は進行性であり、しばしば、３０代および４０代の間に完全な失明をもたらし、それによって治療的介入のための時間が残される。ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異は、両方の障害における最も頻繁な原因である。変異の範囲は、７２個すべてのＵＳＨ２Ａエクソンおよびこれらに隣接するイントロン配列全体にわたって広がり、ナンセンスおよびミスセンス変異、欠失、重複、大きな再構成、およびスプライシングバリアントを含む。圧倒的に最も頻繁な変異エクソンはエクソン１３であり、これは２つの創始者変異を含む（アッシャー症候群タイプＩＩ（ＵＳＨ２）患者におけるｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｅ７６７ＳｆｓＸ２１）およびＮＳＲＰ患者におけるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｃ７５９Ｆ））。エクソン５０については、１５個の病原性変異が報告されているが、それらのうち少なくとも８個は、明らかにタンパク質切断型である。ＵＳＨ２Ａのイントロン４０における最初の深部イントロン変異（ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ）は、Ｖａｃｈｅらによって報告された（2012. Hum Mutat 33:104-8）。この変異は、変異ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおける１５２ｂｐの異常なエクソンの包含を生じさせる隠れた高品質なスプライスドナー部位をイントロン４０内に作り出し、翻訳の未成熟な終結をもたらす（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットの図１ＡおよびＢを参照）。

ＵＳＨおよび他の網膜ジストロフィーは、長らく、不治の障害であると考えられてきた。しかし、遺伝子増強療法を使用するいくつかの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、ＲＰＥ６５およびＭＹＯ７Ａ遺伝子における変異を有するＬＣＡ／ＲＰ／ＵＳＨ患者の選択された群において、有望な結果をもたらした。コード配列のサイズ（１５，６０６ｂｐ）ならびにＵＳＨ２Ａ遺伝子およびｍＲＮＡの選択的スプライシングは、それぞれ、遺伝子増強療法の妨げとなるが、それは、多くの利用可能なベクター（例えばアデノ随伴（ＡＡＶ）およびレンチウイルスベクター）の運搬サイズが現在のところ限定的なためである。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）ベースの療法の広い臨床的可能性にもかかわらず、これは脊椎動物の眼においては頻繁には使用されていない。ＡＯＮは小さな（１６〜２５ヌクレオチド）ポリヌクレオチド分子であり、スプライシングに干渉することができるが、それはこれらの配列が、標的プレｍＲＮＡ分子の配列に相補的だからである。ＡＯＮと結合すると、プレｍＲＮＡの標的となる領域は、もはやスプライシング因子にとって利用可能ではなく、これは、ＡＯＮの標的となるエクソンのスキッピングを生じさせる。治療的には、この方法論は２通りに使用することができる：ａ）隠れたスプライス部位が変異によって活性化される遺伝子の、正常なスプライシングをリダイレクトすること、およびｂ）ｍＲＮＡのリーディングフレームが完全なままであり、（部分的に）機能的なタンパク質が作られるように、（タンパク質切断型）変異を運搬するエクソンをスキップすること。ＵＳＨ２Ａ遺伝子については、７２個のエクソンのうち２８個が、転写産物の全体的なリーディングフレームを撹乱することなく、潜在的にスキップされ得る。両方のＡＯＮベースの方法が、重度の遺伝的障害を有する患者において成功裏に適用されている。Ｌｉｑｕｏｒｉら（2016. Hum Mutat 37:184-193）は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のｍＲＮＡにおいて、イントロン５０におけるｃ．９９５９．４１５９Ａ＞Ｇ変異によって引き起こされる１５５ｂｐの偽エクソン５０（ＰＥ５０）の包含を、ＡＯＮが防ぐことができたことを示した。

ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン４０および４１の間のイントロンに存在するｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異によって引き起こされるＵＳＨおよび／またはＮＳＲＰの防止、処置または遅延のための、便利な治療的戦略を提供することが本発明の目的である。この変異によって引き起こされ、偽エクソン４０：ＰＥ４０の包含をもたらすＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡの異常なスプライシングを、ＡＯＮが阻害できることが、以前示唆され（Vache et al. 2012）、その後に実証された（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレット）。注目すべきことに、より良好に機能し、さらなる有益な特性を有するさらに改善された選択肢の必要性が存在する。本発明の目的は、そのような選択肢を提供することである。

本発明は、ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからの偽エクソン４０（ＰＥ４０）のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関し、ここで偽エクソンの包含は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇに起因し、ここで前記ＡＯＮは、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含む：（ｉ）配列番号６、４、８、２３、３０、３１、３２、３７；（ｉｉ）配列番号３、５、７、１９、２４、２５、２６、３４、３５、３６；および（ｉｉｉ）配列番号２１、２７、２８、２９。本発明はまた、別の実施形態において、ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキッピングを誘導することができるＡＯＮに関し、ここで前記ＡＯＮは、配列番号４５、４６または４７の少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。好ましい実施形態において、本発明のＡＯＮは、１８〜１４３ヌクレオチド、好ましくは１８〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの長さを有し、最も好ましくは、配列番号６、３、４、５、７、８、１９、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、および３７からなる群から選択される配列からなり、好ましくは配列番号６、３、４、５、７、８、２６、３４、３５、および３７から選択され、より好ましくは配列番号６、３、４、５、７、８、２６、および３５から選択される。別の好ましい実施形態において、本発明に従うＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体などの、２’−Ｏ−アルキルホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明のＡＯＮ内の１つまたは複数のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾によって修飾されてよい。本発明はさらに、ここで特許請求された少なくとも２種のＡＯＮを含む１セットのＡＯＮに関する。別の実施形態において、本発明はまた、ＡＯＮの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、本発明に従うＡＯＮを発現するウイルスベクターに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従う１セットのＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする、アッシャー症候群タイプＩＩなどのＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置における使用のための、本発明に従うＡＯＮ、セット、ベクターまたは組成物に関する。

図１は、７種の代替的アンチセンスオリゴヌクレオチドの初期スクリーニングの逆転写酵素結果を示し、これは、ＰＥ４０エクソンスキッピング効率について、本技術分野からの２種の既知のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ１およびＡＯＮ２：それぞれＲ１およびＲ２）および無関係な対照オリゴヌクレオチド（ｃｔｒｌ）との比較において、ＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター構築物を使用して代替的アンチセンスオリゴヌクレオチドを比較したものであり、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３、−５および−７の投与後に、シグナルの明瞭な増加を示している。下のパネルは、異なるＡＯＮの、ＰＥ４０配列に関する概略位置を示す。 図２は、５’から３’までのＰＥ４０配列（太字および下線、２つの部分に分かれる）および本明細書で試験された異なるＡＯＮのための結合部位を示す。試験された各ＡＯＮの配列番号はカッコ内に示し、名称は表１に示す。ＰＥ４０配列の下流の最初のヌクレオチドはグアノシン（Ｇ）であり、これはｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異を表す。ＡＯＮ１（１）およびＡＯＮ２（２）についての位置は、ＰＥ４０配列の直下に示す。斜体の配列は、ＰＥ４０の上流および下流配列である。実施例において概説され、ここで特許請求された目的の３つの領域は、それぞれ、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３（配列番号１９、太字）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−５（配列番号２１、太字）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７（配列番号２３、太字）を取り囲む。 図３は、図１および２に示されたＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３、−５および−７に基づいた１セットのオリゴヌクレオチドのＰＥ４０スキップスクリーニングの逆転写酵素結果を示す。明らかに、ＡＯＮであるＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８および−１１（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３に基づく）ならびにＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７に基づく）は、さらに増加した強度を示したが、このことは、本技術分野からの既知のオリゴヌクレオチドに対するさらなる改善を示唆している。 図４は、さらに１段階進め、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８、−１１、および−１７に基づいた１セットのオリゴヌクレオチドのＰＥ４０スキップスクリーニングの逆転写酵素結果を示す。ショートは、本来のものより短いものを意味する。５ｍＣは、５−メチル−シトシンを意味する（表１も参照）。ＤＡＰは、２，６−ジアミノプリンを意味する。 図５は、実施例１において概説されているとおり、８種の異なるオリゴヌクレオチドによって処置されたＵＳＨ２患者の線維芽細胞における、野生型産物（各ＡＯＮについて右側のバー）と比較したＰＥ４０を発現する液滴の数（各ＡＯＮについて左側のバー）を表す棒グラフを示し、この数は、標準としての、かつ当業者によって頻繁に使用されるようなものとしてのＧＵＳＢ遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）からのベータ−グルクロニダーゼ発現について補正されている。 図６は、ヒトＰＢＭＣにおける示されたＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０ ＡＯＮの免疫原性および免疫毒性評価の結果を示す。Ａ．本明細書に開示されたオリゴヌクレオチド、または陽性対照であるＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＲ８４８（１μＭ）によるヒトＰＢＭＣの２４時間刺激後における培養上清中のサイトカイン濃度の変化倍率および有意水準を、生理食塩水処置されたヒトＰＢＭＣと比較して描写するヒートマップ。各マスは、測定された各サイトカインについての処置条件あたりの変化倍率を示す。Ｂ．本発明の４種の異なるＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０アンチセンスオリゴヌクレオチド、または陽性対照に対する２４時間の曝露後、生理食塩水処置されたＰＢＭＣと比較した、レゾルフィン蛍光の変化倍率として表された、生きているＰＢＭＣの相対数。生細胞評価は、製造者のプロトコールを使用して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。個別の生物学的反復すべてについて、変化倍率は、対応する三連の生理食塩水対照の幾何平均に対して、測定されたＲＦＵを正規化することによって算出した。結果は、三連の変化倍率の平均±ＳＥＭとして、個別のドナーあたりで示され、その対応する生理食塩水対照の平均（点線）に対して正規化されている。多重補正（生理食塩水と比較した）についてのダネットの検定による反復測定一元配置分散分析を実施した。 図７は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４による処置後のヘテロ接合性ＵＳＨ２患者から得た線維芽細胞から生成した眼杯中のＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡにおけるＰＥ４０スキッピングの結果を示す。左の４つのレーンは、健康なドナー由来の線維芽細胞から生成された眼杯における結果を示し、それに続く３つのレーンは、ＵＳＨ２患者の線維芽細胞からの眼杯による結果を示す。対照オリゴヌクレオチドは、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡに相補的でない無関係なオリゴヌクレオチドである。右側の陰性対照は、核酸物質を含まない。対照レーン５は２つの優勢なバンドを示し、上側のバンドはＰＥ４０配列を含むｍＲＮＡを表し、下側の太いバンドはＰＥ４０配列を欠くｍＲＮＡを表す。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４による処置は、上側のバンドが検出できなかったので、プレｍＲＮＡからのＰＥ４０の完全なスキッピングを生じさせる。

本発明の目的のために、用語「異常な偽エクソンの包含」「異常な偽エクソン４０の包含」または「異常な１５２ｂｐヌクレオチドの偽エクソンの包含」は同義であると考えられ、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の偽エクソン４０（ＰＥ４０）のｍＲＮＡ内への包含、または、その一部もしくはその配列の９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％を構成する配列のＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ内への包含を意味すると考えられる。

用語「エクソンスキッピング」は、本明細書において、エクソンスキッピングが起きなかったなら成熟ｍＲＮＡにおいて存在するはずの特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡの産生を、細胞内において誘導するか、生じさせるか、または増加させることと定義される。例えば、スプライシングの酵素的プロセスを可能にするために必要な（隠れた）スプライスドナーもしくは（隠れた）スプライスアクセプター配列などの配列に干渉することができる分子によって、または成熟ｍＲＮＡに包含されるエクソンとして一続きのヌクレオチドを認識するために必要なエクソン包含シグナルに干渉することができる分子によって、前記成熟ｍＲＮＡのプレｍＲＮＡを発現する細胞を提供することによってエクソンスキッピングは達成され；そのような分子は、本明細書において、エクソンスキッピング分子と呼ばれる。本発明において、エクソンスキッピングは、ＰＥ４０をスキップすることに関する。

用語「プレｍＲＮＡ」は、プロセシングされていないかまたは部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを意味し、これは例えば核において、転写によって細胞のＤＮＡ鋳型から合成される。

用語「エクソン保持」は、スプライシング反応によるプレｍＲＮＡのプロセシングの間に、特定のエクソンのエクソンスキッピングが起こらなかった場合における、その特定のエクソンを含む成熟ｍＲＮＡの細胞内における産生に関する。本発明に関して、野生型である場合にヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子からの成熟ｍＲＮＡには通常存在しないＰＥ４０は、本明細書において詳細に議論されるｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異の存在下において生じるように、特定の変異によってＰＥ４０がプレｍＲＮＡからスプライシングされない場合、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子からの成熟ｍＲＮＡにおいて保持される。本発明の目的は、ヒトＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおけるＰＥ４０のエクソン保持を防止、抑制、または減少させ、それによってアッシャー症候群タイプＩＩを防止、遅延および／または処置することである。

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＯＮ）は、プレｍＲＮＡ分子、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子における標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明のオリゴヌクレオチドの標的配列が、本明細書に提供される。アンチセンス配列の相補性の程度（または実質的相補性）は、好ましくは、アンチセンス配列を含む分子が、生理的条件下で、ＲＮＡ分子における標的ヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成することができるというようなものである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、その略語「ＡＯＮ」および用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に使用され、アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを意味すると理解される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖であり、好ましくはそれ自身または同じ種類の別のＡＯＮのいずれとも自己アニーリングしない。

本発明の文脈において使用される用語「実質的に相補的」は、アンチセンス配列におけるいくつかのミスマッチが、機能性、すなわちＰＥ４０のスキッピングの誘導がなお許容可能である限り、許されることを示す。

用語「偽エクソンスキッピング」は、本明細書において、偽エクソンスキッピングが起きなかったなら成熟ｍＲＮＡにおいて存在するはずの特定のイントロン領域または偽エクソンを含まない成熟ｍＲＮＡの産生を、細胞内において誘導するか、刺激するか、引き起こすか、強化するか、生じさせるかまたは増加させることと定義される。例えば、スプライシングの酵素的プロセスを可能にするために必要な（隠れた）スプライスドナーもしくは（隠れた）スプライスアクセプター配列などの配列に干渉することができる分子によって、または成熟ｍＲＮＡに包含される偽エクソンとして一続きのヌクレオチドを認識するために必要な偽エクソン包含シグナルに干渉することができる分子によって、前記成熟ｍＲＮＡのプレｍＲＮＡを発現する細胞を提供することによって偽エクソンスキッピングは達成され；そのような分子は、本明細書において、偽エクソンスキッピング分子と呼ばれる。

好ましくは、相補性は９０％〜１００％である。一般的に、これは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおける１個もしくは２個のミスマッチ、または４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおける１、２、３もしくは４個のミスマッチ、または６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおける１、２、３、４、５もしくは６個のミスマッチ等を可能にする。

一実施形態において、本明細書において定義されるエクソンスキッピングＡＯＮは、特定された配列と結合する、および／またはそれに相補的な化合物であり得る。特定のヌクレオチド配列と結合するＡＯＮをスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２００２／０２４９０６号パンフレット、米国特許第６，８７５，７３６号明細書および国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットに開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは異常な１５２ヌクレオチドのＵＳＨ２Ａ偽エクソン４０（ＰＥ４０）の文脈における特定された配列への結合は、当業者に既知の技術によって評価してよい。好ましい技術は、ＥＰ１６１９２４９に記載されているようなゲル移動度シフトアッセイである。好ましい実施形態において、（偽）エクソンスキッピングＡＯＮは、標識された配列に対する前記分子の結合がゲル移動度シフトアッセイにおいて検出可能となるのと同じくらい速く結合すると言われる。

本発明のすべての実施形態において「（偽）エクソンスキッピング分子」はＡＯＮである。本発明の目的のために、ＡＯＮの設計がここで特に問題となる。好ましい方法において、以下の態様の少なくとも１つが、前記エクソンスキッピング分子を設計し、改善するために考慮されなければならない：（１）ＡＯＮは、好ましくはＣｐＧまたは一続きのＣｐＧモチーフを含まない；ならびに（２）ＡＯＮは許容可能なＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有する。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧまたは一続きのＣｐＧモチーフの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの増加した免疫原性を伴う。免疫原性は、動物モデルにおいて、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞および／または炎症性単核球浸潤の存在を評価することによって評価してよい。これは、本発明のオリゴヌクレオチドによって処置されている動物の、またはヒトの血液において、当業者に既知の標準的な免疫アッセイを使用して、中和抗体および／または前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することによって評価してもよい。炎症反応、Ｉ型様インターフェロン産生、ＩＬ−１２産生および／または免疫原性の増加は、標準的な免疫アッセイを使用して、中和抗体または前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在または増加する量を検出することによって評価してよい。

本発明は、許容可能なＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するＡＯＮに関する。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基礎Ｔｍおよびｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒモデルを使用して一本鎖ＲＮＡについてオリゴヌクレオチド特性計算機（www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index.html）によって計算される）、および／またはＡＯＮ−標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ バージョン４．５を使用する）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎる場合、オリゴヌクレオチドは、より特異性が低いと予測される。許容可能なＴｍおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメーターのそれぞれについて好ましい範囲を示すことは困難である。許容可能なＴｍは３５〜７０℃の範囲であってよく、許容可能な自由エネルギーは１５〜４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であってよい。

好ましい実施形態において、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定された異常な１５２ヌクレオチドのＵＳＨ２Ａ偽エクソン４０スキッピングの割合が、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％である場合、ＡＯＮは、異常な１５２ヌクレオチドのＵＳＨ２Ａ偽エクソン４０（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットにおける配列番号５）のスキッピングを誘導すると言われる。エクソンスキッピングおよび／またはエクソン保持を決定するための好ましいアッセイは、本明細書における実施例において記載される。

好ましくは、本発明に従うＡＯＮは、ＰＥ４０（本明細書における配列番号９）のヌクレオチド配列に相補的なもしくは実質的に相補的な配列、またはその一部であって、その（実質的な）相補性部分が、本発明に従うオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％、もしくはさらにより好ましくは９８％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９９％、もしくはさらにより好ましくは１００％であるようなものを含む。好ましくは、本発明に従うＡＯＮは、以下に示す配列番号９の一部に相補的な配列を含むかまたはそれからなる：
偽エクソン４０；ＰＥ４０
５’−ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧ
ＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＡＡＧＧＧＧＧＡ
ＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号９）

一例として、ＡＯＮは、配列番号９の一部および付加的な隣接配列、特にＰＥ４０の３’末端におけるスプライス部位に相補的な配列を含んでよい。より好ましい実施形態において、前記ＡＯＮの前記相補性部分の長さは、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２または１４３ヌクレオチドのものである。付加的な隣接配列は、結合を修飾するため、またはＡＯＮの熱力学的特性を修飾するため、より好ましくは標的ＲＮＡ結合親和性を修飾するために使用してよい。当業者は、そのため、相補性の領域におけるすべての塩基が、対向鎖における塩基と対を形成することができることが絶対に必要というわけではないことを知っている。例えば、ＡＯＮを設計する場合、例えば、相補鎖における塩基と塩基対を形成しない残基を組み込もうとしてよい。細胞内環境下において、一続きのヌクレオチドが相補性部分とハイブリダイズすることが十分に可能である場合、ミスマッチはある程度許容されてよい。この文脈において、「十分」とは、好ましくはＥＰ１６１９２４９の実施例１において記載されたようなゲル移動度シフトアッセイを使用して、ＡＯＮの結合が検出可能であることを意味する。

任意に、前記ＡＯＮは、患者の線維芽細胞または網膜細胞へのトランスフェクションによってさらに試験してよい。標的となるエクソンのスキッピングは、ＲＴ−ＰＣＲ（例えばＥＰ１６１９２４９に記載されたようなもの）によって評価してよい。相補性領域は、好ましくは、組み合わされた場合に、これらがプレｍＲＮＡにおけるエクソンに特異的であるように設計される。そのような特異性は、種々の長さの相補性領域によって作り出されてよく、それはこれが、この系における他の（プレ）ｍＲＮＡ分子における実際の配列に依存するからである。ＡＯＮが、１つまたは複数の他のプレｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズし得るリスクは、ＡＯＮのサイズを増加させることによって減少する。相補性の領域においてミスマッチを含むが、プレｍＲＮＡにおける標的となる領域にハイブリダイズおよび／または結合する能力を保持しているＡＯＮを、本発明において使用できることは明らかである。しかし、好ましくは、少なくとも相補性部分はそのようなミスマッチを含まない。これは相補性部分にミスマッチを欠いているＡＯＮは、典型的には、１つまたは複数の相補性領域においてそのようなミスマッチを有しているＡＯＮよりも高い効率および高い特異性を有するためである。この系のスプライシング機構に干渉するプロセスの効率を増加させることにおいて、より高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向鎖との相互作用の数が増加している）が好ましいと考えられる。好ましくは、相補性は９０％〜１００％である。

本発明の偽エクソンスキッピングＡＯＮは、好ましくは単離された形態である。本発明に従う好ましい偽エクソンスキッピングＡＯＮは、１８〜１４３ヌクレオチド、より好ましくは１８〜６０、より好ましくは１８〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２４ヌクレオチド、最も好ましくは１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、または２４ヌクレオチドの長さを有する。別の好ましい実施形態において、本発明のＡＯＮは、１８〜１４３ヌクレオチド、より好ましくは１８〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２０ヌクレオチドからなるか、または好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２もしくは１４３ヌクレオチドからなる。

本発明のエクソンスキッピングＡＯＮは、ヌクレアーゼ耐性を増加するように、および／または標的配列のためのＡＯＮの親和性を増加するように修飾された１つまたは複数の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい実施形態において、ＡＯＮ配列は少なくとも１個のヌクレオチドアナログまたは等価体を含み、ここでヌクレオチドアナログまたは等価体は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然ヌクレオシド間結合、またはこれらの修飾の組み合わせを有する残基と定義される。

好ましい実施形態において、ヌクレオチドアナログまたは等価体は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルホリノ骨格、カルバマート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファマート、スルホナートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、ならびにアミド骨格によってもたらされる。ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーは、アンチセンス剤として以前研究された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が６員環によって置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミダート結合によって置き換えられている、非荷電骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性であり、ＲＮａｓｅＨを活性化することによるのではなく、翻訳を停止するかまたはプレｍＲＮＡスプライシングに干渉することによって、アンチセンス剤として機能するように見える。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって組織培養細胞へと成功裏に送達されており、これらの方法のいくつかを比較する１つの研究は、スクレープローディング法が最も効率的な送達方法であることを見出した；しかし、モルホリノ骨格は非荷電であることから、陽イオン脂質は、細胞内へのモルホリノオリゴヌクレオチド取り込みの効果的なメディエーターではない。最近の報告はモルホリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、そして、非イオン骨格のために、これらの研究は、モルホリノオリゴヌクレオチドがマグネシウムの非存在下において三重鎖形成できたことを示した。例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル混合ヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される結合のように、骨格中の残基間の結合はリン原子を含まないことがさらに好ましい。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価体は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡベースの分子は、塩基対認識の点において、ＤＮＡ分子の真の模倣体である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、ここで核酸塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に結合している。代替的な骨格は、一炭素延長ピロリジンＰＮＡモノマーを含む。ＰＮＡ分子の骨格は、荷電リン酸基を含まないことから、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのそれぞれよりも安定である。さらに好ましい骨格は、リボースまたはデオキシリボース糖が６員モルホリノ環によって置き換えられている、モルホリノヌクレオチドアナログまたは等価体を含む。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価体は、リボースまたはデオキシリボース糖が６員モルホリノ環によって置き換えられ、隣接するモルホリノ環の間の陰イオンホスホジエステル結合が非イオンホスホロジアミダート結合によって置き換えられている、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。またさらなる実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価体は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素のうちの１つの置換を含む。この修飾は、塩基対形成をわずかに不安定化するが、ヌクレアーゼ分解に対する顕著な耐性を付与する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価体は、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホナート、３’−アルキレンホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、５’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスファートまたはボラノホスファートを含む。本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価体は１つまたは複数の糖部分を含み、これは−ＯＨ；−Ｆ；置換または非置換の直鎖または分岐低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキルであって、１つまたは複数のヘテロ原子によって中断され得るもの；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシなど、２’、３’および／または５’位において一置換または二置換されている。糖部分はピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシピラノースもしくはその誘導体、好ましくはリボースもしくはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であり得る。好ましい誘導体化糖部分は、２’−炭素原子が、糖環の３’または４’炭素原子と結合し、それによって二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価体を、ＲＮａｓｅＨおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を増加する。別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価体は、１つまたは複数の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンならびに本技術分野において知られているかまたは知られることになるピリミジンおよびプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの、合成および天然塩基を含む。当業者は、ＡＯＮにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はないことを理解している。さらに、上述したアナログまたは等価体の１つより多くが、単一のＡＯＮ中に、またはＡＯＮ内の単一の位置においてさえ組み込まれてよい。ある特定の実施形態において、本発明のＡＯＮは、少なくとも２つの異なるタイプのアナログまたは等価体を有する。

本発明に従う好ましい偽エクソンスキッピングＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体などの、２’−ＯアルキルホスホロチオアートＡＯＮである。本発明に従う効果的なＡＯＮは、ホスホロチオアート骨格を含む２’−Ｏ−メチルリボースを含む。

当業者はまた、ＵＳＨ２Ａの異常な１５２ヌクレオチドの偽エクソンを効率的にスキッピングするために、異なるＡＯＮを組み合わせることができることを理解するであろう。好ましい実施形態において、少なくとも２、３、４、５または６種のＡＯＮの組み合わせ（またはセット）を、本発明の方法において使用する。

ＡＯＮは、細胞、好ましくは網膜細胞におけるＡＯＮの取り込みを強化する部分と結合することができる。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであって、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータン、およびオリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリジンまたはポリリジンなどの正に荷電したアミノ酸を含むがこれらに限定されない細胞透過性ペプチド、抗原結合ドメインであって、抗体、抗体のＦａｂ断片、またはラクダ科単一ドメイン抗原結合ドメインなどの一本鎖抗原結合ドメインによってもたらされるような抗原結合ドメインである。

本発明に従うＡＯＮは、本技術分野において既知の適切な手段を使用して、間接的に投与されてよい。それは例えば、個体または前記個体の細胞、組織もしくは器官に対して、発現ベクターの形態で提供されてよく、ここで発現ベクターは、前記ＡＯＮを含む転写産物をコードしている。発現ベクターは、好ましくは、細胞、組織、器官または個体内に、遺伝子送達ビヒクルを介して導入される。好ましい実施形態において、本明細書において同定されたエクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセットを含む、ウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、ＡＯＮの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、本発明に従うＡＯＮを発現するウイルスベクターを提供する。プラスミド由来ＡＯＮ発現またはアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現によって、異常な１５２ヌクレオチドのＵＳＨ２Ａ偽エクソンの高度に効率的なスキッピングを生じさせる必須配列に干渉することができるＡＯＮを含む細胞を提供することができる。発現は、Ｕ７プロモーターなどのポリメラーゼＩＩ−プロモーター（Ｐｏｌ ＩＩ）、またはＵ６ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動されてよい。好ましい送達ビヒクルは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター等などのレトロウイルスベクターであり、いずれも国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットにおいて詳細に記載されたようなものである。また、細胞のヒトゲノムにおける標的化相同組換えおよび組込みのために使用可能なプラスミド、人工染色体、プラスミドは、本明細書に定義されるオリゴヌクレオチドの送達のために、適切に適用してよい。Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターから転写が駆動され、および／または転写産物がＵ１もしくはＵ７転写産物と融合する形態であるベクターが本発明に好ましく、これは小さな転写産物の送達のために良好な結果をもたらす。適切な転写産物を設計することは、当業者の技能の範囲内にある。好ましくは、Ｕ１またはＵ７転写産物との融合転写産物の形態のＰｏｌ−ＩＩＩ駆動転写産物が好ましい。

本発明に従うＡＯＮは、それ自体送達されてよい。しかし、ＡＯＮは、ウイルスベクターによってコードされてもよい。典型的には、これは転写産物の一部において本発明に従うＡＯＮの配列を含むＲＮＡ転写産物の形態である。

個体または前記個体の細胞、組織、器官に、本発明に従うＡＯＮを提供する手段における改善は、これまでに既に達成された進歩を考慮して予測される。そのような将来的な改善は、もちろん、本発明の方法を使用して、ｍＲＮＡの再構築に対して、言及した効果を達成するために組み込まれてよい。本発明に従うＡＯＮは、個体、前記個体の細胞、組織または器官にそのまま送達することができる。本発明に従うＡＯＮを投与する場合、分子は、送達方法に適合する溶液中に溶解することが好ましい。網膜または内耳細胞には、水性溶液において、またはウイルスベクターもしくはナノ粒子によって（thorough）プラスミドを提供することによって、ＡＯＮ発現のためのプラスミドを提供することができ、これらはすべて、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットに詳細に記載されるとおりである。好ましくは、ウイルスベクターまたはナノ粒子は、網膜または内耳細胞に送達される。当業者は、既知の、および／または他の市販の代替的な賦形剤および送達系のいずれかを選択し、適応させて、本発明における使用のためにＡＯＮをパッケージングおよび送達し、それをＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止、処置または遅延のために送達してよい。「ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止、処置または遅延」は、本明細書において、好ましくは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における遺伝的欠陥によって引き起こされる部分的または完全な視覚障害または失明を防止し、休止させ、その進行を停止し、または好転させることに加えて、部分的または完全な聴覚障害または失聴を防止し、休止させ、その進行を停止し、または好転させることと定義される。

好ましい実施形態において、本発明に従うＡＯＮは、組成物または医薬または組成物として製剤化され、これには少なくとも賦形剤、ならびに／または、送達のための標的化リガンドならびに／またはその、細胞への送達デバイスおよび／もしくはその細胞内送達を強化するための送達デバイスが含まれる。

組成物が補助化合物などの付加的な構成成分を含む場合、組成物の各構成成分は、単一の組み合わせまたは組成物または調製物として製剤化されなくてよいことが理解されるべきである。どのタイプの製剤が、本明細書に定義された各構成成分に最も適切であるかを、当業者は、それらの本質に従って知るであろう。必要であれば、本発明に従うＡＯＮまたは本発明に従うＡＯＮを発現するベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容可能な担体を添加することによって、薬学的活性混合物へと組み込むことができる。

したがって、本発明は、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクターおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物、好ましくは医薬組成物も提供する。そのような組成物は、本発明に従う単一種のＡＯＮまたはウイルスベクターを含んでよいが、本発明に従う複数種の、別個のＡＯＮまたはウイルスベクターを含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、充填剤、保存剤、アジュバント、可溶化剤および／または希釈剤を含む、あらゆる薬学的に許容可能な賦形剤を含んでよい。

好ましい投与経路は、眼内投与用の水性溶液または特に適合した製剤の硝子体内注射によるものである。ＥＰ２４２５８１４は、ペプチドまたは核酸薬剤の眼内（硝子体内）投与のために特に適合した水中油エマルジョンを開示している。このエマルジョンは、硝子体液よりも密度が低く、そのためエマルジョンは硝子体の上面に浮かび、注射された薬剤が視覚を損なうことを回避する。

本発明に従う複数種の別個のＡＯＮが使用される場合、本明細書に定義された濃度または用量は、使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの総濃度もしくは用量、または使用されるかもしくは添加される各エクソンスキッピング分子の濃度もしくは用量を意味してよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明に従うＡＯＮの各量または総量が、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投薬される、組成物が提供される。適切な硝子体内用量は、１つの眼あたり、約０．０５〜約５ｍｇ、好ましくは約０．１〜約１ｍｇであり、例えば１つの眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇであろう。

本発明に従う好ましいＡＯＮは、個体のＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のためのものである。本発明のすべての実施形態において、用語「処置」は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止および／または遅延を含むと理解される。本発明に従うＡＯＮを使用して処置されてよい個体は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を有すると既に診断されたものであってよい。あるいは、本発明に従うＡＯＮを使用して処置されてよい個体は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を有するとまだ診断されていなくてよいが、その遺伝的背景を考慮して、将来的にＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を発症する増加したリスクを有する個体であってよい。好ましい個体は人間である。好ましい実施形態において、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群タイプＩＩである。したがって、本発明はさらに、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を処置するための医薬としての使用のための、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止、処置または遅延のための医薬としての使用のための、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、または本発明に従う組成物を提供する。

本発明はさらに、医薬の調製のための、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を処置する医薬の調製のための、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止、処置または遅延のための医薬の調製のための、本発明に従うＡＯＮの、または本発明に従うウイルスベクターの、または本発明に従う組成物の使用を提供する。したがって、さらなる態様において、医薬の調製のための、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする状態を処置する医薬の調製のための、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の防止、処置または遅延のための医薬の調製のための、本明細書に定義されたＡＯＮ、ウイルスベクターまたは組成物の使用が提供される。本発明に従う使用における、または方法における処置は、少なくとも１回であるか、１週間、１カ月、数カ月、１年、２、３、４、５、６年またはそれより長く、例えば一生涯続く。本明細書に従う使用のための、本明細書に定義された各ＡＯＮは、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を既に患っているかまたはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官に生体内で直接投与するのに適していてよく、生体内、生体外または試験管内で直接投与されてもよい。本発明のＡＯＮ、組成物、化合物または補助化合物の投与頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、患者における変異、ＡＯＮの数（すなわち用量）、前記分子の製剤化、投与経路等々などのいくつかのパラメーターに依存してよい。頻度は、日毎、週毎、２週または３週または４週または５週またはより長い期間に少なくとも１回の間で変動してよい。

本発明に従うＡＯＮの用量範囲は、好ましくは、厳密なプロトコール要件が存在する臨床試験（生体内使用）における用量漸増試験に基づいて設計される。本明細書に定義されたＡＯＮは、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用してよい。適切な硝子体内用量は、１つの眼あたり０．０５ｍｇ〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇであり、例えば１つの眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇであろう。好ましい実施形態において、０．１ｎＭ〜１μＭの範囲である本明細書に定義されたＡＯＮの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は網膜細胞または網膜組織などの細胞モデルにおける試験管内使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１〜４００ｎＭ、さらにより好ましくは１０〜２００ｎＭ、さらにより好ましくは５０〜１００ｎＭの範囲である。いくつかのＡＯＮが使用される場合、この濃度または用量は、ＡＯＮの総濃度もしくは用量、または添加された各ＡＯＮの濃度もしくは用量を意味してよい。好ましい実施形態において、本発明に従う分子のための送達ビヒクルとしての本明細書において先に記載されたウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射あたり１×１０⁹〜１×１０¹⁷個のウイルス粒子、より好ましくは１回の注射あたり１×１０¹⁰〜１×１０¹²個のウイルス粒子の範囲の用量で投与される。上記で示したＡＯＮの濃度または用量の範囲は、生体内、試験管内または生体外使用のために好ましい濃度または用量である。使用するＡＯＮ、処置する標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用する培地ならびにトランスフェクションおよびインキュベーション条件に依存して、使用するＡＯＮの濃度または用量はさらに変動してよく、さらに最適化される必要があり得ることを、当業者は理解するであろう。

本発明はさらに、細胞におけるＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングを調節する方法であって、細胞、好ましくは網膜細胞を、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、または本発明に従う組成物と接触させることを含む方法を提供する。この態様の特徴は、好ましくは本明細書において先に定義されたものである。細胞を、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、または本発明に従う組成物と接触させることは、当業者に既知のあらゆる方法によって実施してよい。本明細書に記載されたＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達方法の使用が含まれる。接触は直接的または間接的であってよく、生体内、生体外または試験管内であってよい。

本発明はさらに、それを必要とする個体のＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態（例えばアッシャー症候群タイプＩＩ）の処置のための方法を提供し、前記方法は、前記個体の細胞、好ましくは網膜細胞を、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、または本発明に従う組成物と接触させることを含む。この態様の特徴は、好ましくは本明細書において先に定義されたものである。細胞、好ましくは網膜細胞を、本発明に従うＡＯＮ、または本発明に従うウイルスベクター、または本発明に従う組成物と接触させることは、当業者に既知のあらゆる方法によって実施してよい。本明細書に記載されたＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達方法の使用が含まれる。接触は直接的または間接的であってよく、生体内、生体外または試験管内であってよい。好ましいＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群タイプＩＩである。特に示されない限り、本明細書に記載された各実施形態は、本明細書に記載された別の実施形態と組み合わせてよい。

本発明は、配列番号６、３、４、５、７、８、１９、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、および３７からなる群から選択される、好ましくは配列番号６、３、４、５、７、８、２６、３４、３５、および３７から選択される、より好ましくは配列番号６、３、４、５、７、８、２６、および３５から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。本発明のＡＯＮは、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡにおける偽エクソン４０（ＰＥ４０）のスキッピングを誘導し、刺激し、または強化することができ、ここでＰＥ４０の包含は、ＵＳＨ２患者において頻繁に見出されるｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇに起因するか、またはそれによって引き起こされる。ＡＯＮは無作為に選択されるものではなく、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３、−５および−７と名付けられた３種の新規なＡＯＮにそれぞれ基づいた３つの「誘導体群」を、以下のように形成することが理解されるべきであり、このことは実施例において、ならびに図１〜５および表１においてさらに詳述される：
− ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３（配列番号１９）に基づくＡＯＮは、配列番号３、５、７、２４、２５、２６、３４、３５、および３６のＡＯＮであり、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８（配列番号３）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１１（配列番号２６）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２０（配列番号５）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２２（配列番号３５）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２８（配列番号７）が最良に機能する（図４および５を参照）。
− ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−５（配列番号２１）に基づくＡＯＮは、配列番号２７、２８、および２９のＡＯＮである。
− ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７（配列番号２３）に基づくＡＯＮは、配列番号４、６、８、３０、３１、３２、および３７のＡＯＮであり、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７（配列番号４）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４（配列番号６）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２９（配列番号８）が最良に機能し（図４および５を参照）、ここでＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７および−２４は、すべての他のＡＯＮの機能を凌駕しさえする。

配列番号６、４、８、２３、３０、３１、３２、３７の非常に効果的なＡＯＮに存在する重複する配列は、５’−ＡＧＡＵＧＡＵＣＵＣＵＵＡ−３’（配列番号４２）であり、ここでシトシンは、５−メチル−シトシン（５ｍＣ）によって置き換えられてよい。

配列番号３、５、７、１９、２４、２５、２６、３４、３５、３６の非常に効果的なＡＯＮに存在する重複する配列は、５’−ＣＧＣＵＧＣ−３’（配列番号４３）であり、ここでシトシンは、５−メチル−シトシン（５ｍＣ）によって置き換えられてよい。

配列番号２１、２７、２８、２９の非常に効果的なＡＯＮに存在する重複する配列は、５’−ＡＵＵＵＣＡＡＵＵＵＣＡＵＧＡＵＵＵ−３’（配列番号４４）であり、ここでシトシンは、５−メチル−シトシン（５ｍＣ）によって置き換えられてよい。

したがって、本発明はまた、配列番号４２、４３および４４からなる群から選択される配列を含むＡＯＮに関する。

配列番号６、４、８、２３、３０、３１、３２、３７の非常に効果的なＡＯＮの標的領域であって、ＰＥ４０配列の３’末端におけるスプライシング境界を含むものは、５’−ＵＣＣＣＡＡＧＧＵＡＡＧＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＵＡＡＧＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４５）である。

配列番号３、５、７、１９、２４、２５、２６、３４、３５、３６の非常に効果的なＡＯＮの標的領域は、５’−ＵＣＵＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＡＵＣＵＡＣＵＣＡＧＣ−３’（配列番号４６）である。

配列番号２１、２７、２８、２９の非常に効果的なＡＯＮの標的領域は、５’−ＧＧＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＣＡ−３’（配列番号４７）である。

配列番号４５、４６および４７のいずれかの配列を標的とする最も短いＡＯＮは、１８ヌクレオチド長であった（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２３（配列番号３６）。したがって、本発明はまた、ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからの偽エクソン４０（ＰＥ４０）のスキッピングを誘導することができるＡＯＮに関し、ここで前記ＡＯＮは、配列番号４５、４６または４７の少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。

本発明の別の実施形態において、本発明は、ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキッピングを誘導し、引き起こし、刺激し、および／または強化することができるＡＯＮに関し、ここで前記ＡＯＮは、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれからなる：（ｉ）配列番号６、４、８、２３、３０、３１、３２、３７；（ｉｉ）配列番号３、５、７、１９、２４、２５、２６、３４、３５、３６；および（ｉｉｉ）配列番号２１、２７、２８、２９。好ましい実施形態において、前記ＡＯＮは、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれからなる：（ｉ）配列番号６、４、８；および（ｉｉ）配列番号３、５、７、２６、３５。非常に好ましい実施形態において、前記ＡＯＮは、配列番号６および４から選択される配列を含むかまたはそれからなる。特定の態様において、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡにおけるＰＥ４０の保持（またはスプライシングが完了した後のｍＲＮＡにおけるＰＥ４０の存在）は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異に起因するが、ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおけるＰＥ４０の存在も引き起こす、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における他の（同定されたか、またはこれまでのところ未同定の）変異が存在することは除外できない。好ましくは、本発明のＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−エチル、または２’−Ｏ−プロピルなどの少なくとも１つの２’−Ｏアルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。別の好ましい修飾は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）である。好ましい一態様において、本発明のＡＯＮにおけるすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾されている。好ましくは、本発明のＡＯＮは少なくとも１つのホスホロチオアート結合を有し、より好ましくは、本発明のＡＯＮ内のすべての連続するヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合によって相互連結されている。

好ましい実施形態において、本発明のＡＯＮは、１８〜１４３ヌクレオチド、好ましくは１８〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する。好ましい態様において、本発明に従うＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体などの、２’−Ｏアルキルホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。治療的効果を増加させるためには、本発明の複数種のＡＯＮを適用することが有用であり得る。よって、別の好ましい実施形態において、本発明は１セットのＡＯＮに関し、前記セットは、本発明に従う少なくとも２種のＡＯＮを含む。別の態様において、本発明は、ＡＯＮの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、本発明に従うＡＯＮを発現するウイルスベクターに関する。本発明はまた、本発明に従うＡＯＮ、１セットのＡＯＮ、またはウイルスベクター、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は硝子体内投与のためのものであり、１つの眼あたり０．０５ｍｇ〜５ｍｇの総ＡＯＮの範囲の量で投薬される。より好ましくは、前記医薬組成物は硝子体内投与のためのものであり、１つの眼あたり０．１〜１ｍｇの総ＡＯＮの範囲の量、例えば１つの眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇの総ＡＯＮで投薬される。さらに別の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくは、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置または防止における使用のための、本発明に従うＡＯＮ、本発明に従い、ここで特許請求される１セットのＡＯＮ、本発明に従うベクター、または本発明に従う組成物に関する。さらに別の態様において、本発明は、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を処置するための医薬の調製における、本発明に従うＡＯＮ、本発明に従う１セットのＡＯＮ、本発明に従うベクター、または本発明に従う組成物の使用に関する。

本発明はさらに、細胞におけるＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングを調節する方法に関し、前記方法は、前記細胞を、本発明に従うＡＯＮ、本発明に従うセット、本発明に従うベクター、または本発明に従う組成物と接触させることを含む。前記細胞は、試験管内細胞、生体外細胞または生体内細胞であってよい。前記方法において使用される前記細胞は、好ましくは、ＵＳＨ２Ａ関連障害を患っているかまたはそのリスクがある（ヒト）対象の眼に存在するか、または（ヒト）対象から得られるであろう。よって、別の好ましい態様において、本発明は、アッシャー症候群タイプＩＩなどのＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の、それを患う個体における処置のための方法に関し、前記方法は、前記個体の細胞を、本発明に従うＡＯＮ、本発明に従うセット、本発明に従うベクター、または本発明に従う組成物と接触させることを含む。

さらに別の態様において、本発明は、本発明に従う偽エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に従う使用、または本発明に従う方法に関し、ここでＵＳＨ２Ａのスプライシングの調節を必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群タイプＩＩである。最も好ましい態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによってスキップされる偽エクソンは、本明細書に開示された偽エクソン４０（ＰＥ４０；配列番号９）である。

本明細書において、およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」およびその活用形は、その非限定的な意味において使用され、その単語に続く品詞が含まれることを意味するが、具体的に言及されていない品詞は除外されない。さらに、不定冠詞「１つの（a）」または「１つの（an）」による要素に対する言及は、唯一の要素が存在することを文脈が明瞭に要求していない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外するものではない。したがって、不定冠詞「１つの（a）」または「１つの（an）」は、通常は「少なくとも１つ」を意味する。単語「約」または「概ね」は、数値と共に使用される場合（例えば約１０）、好ましくは、与えられたその値（１０）よりも、その値の０．１％多いまたは少ない値であってよいことを意味する。本明細書に提供された配列情報は、誤って同定された塩基を含めることを必要とするほど狭く解釈されるべきでない。当業者は、そのように誤って同定された塩基を識別することができ、そのような誤りをどのようにして修正するかを知っている。本明細書に引用されたすべての特許文献および非特許文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

［実施例１］
改善されたエクソンスキッピング特性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択
イントロンＵＳＨ２Ａ変異（ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ）は、隠れたスプライスドナー部位を作り出し、これはＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ内への異常なエクソン（ＰＥ４０）の包含を生じさせる（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットの図１ＡＢを参照）。異常なエクソンに対するＡＯＮを添加することは、Ｕ１−およびＵ２ ｓｎＲＮＰ複合体、ならびにセリン−アルギニンリッチタンパク質などのスプライシングに必須な因子の結合を防止することによってこのエクソンの挿入を防止し、それによって正常なＵＳＨ２Ａスプライシングおよびタンパク質合成を回復するであろう（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットの図１Ｃ）。ＡＯＮは、スプライス部位に加えて、エクソン配列を標的とすることができる。ＡＯＮがエクソンスキッピングを誘導する能力と、標的配列における予測されたＳＣ３５スプライス因子結合部位の存在との間には、正の相関が存在することが示唆されていた。高いエクソンスキッピング潜在能力を備えたＡＯＮを設計するために、異常なＵＳＨ２Ａエクソン（１５２ヌクレオチドのエクソン配列に、１５ヌクレオチドのイントロン配列を両側に加えたもの）を、ＥＳＥ ｆｉｎｄｅｒ ３．０プログラムを使用して、エクソンスプライスエンハンサー結合モチーフについて精査した。異常なエクソン内に、それぞれ３つおよび２つのＳＣ３５結合モチーフを備えた２つの領域が予測された（データは示さず）。よって、ＳＣ３５モチーフを備えたこれらの領域を包含するように２つのＡＯＮを設計し、ＡＯＮ１（配列番号１）およびＡＯＮ２（配列番号２）と命名したが、これらはＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡに相補的である。ＡＯＮ１およびＡＯＮ２エクソンスキッピング潜在能力は、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットにおいて研究された（そこにおける図２を参照）。

この実施例において、さらにより強力なＡＯＮを同定し、生成し、使用することができたことが示され、これらは、以前試験されたＡＯＮ１およびＡＯＮ２よりもはるかに強力なエクソンスキッピング潜在能力を有するように見える。新規に試験されたすべてのオリゴヌクレオチドの概要を、表１に提供する。本明細書で使用したすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ＭｉｃｒｏＳｙｎｔｈまたはＴｒｉｌｉｎｋから購入し、５８℃のＴｍにより設計し、糖鎖における２’−Ｏ−メチル基およびホスホロチオアート（ＰＳ）骨格により修飾し、使用前に、リン酸緩衝生理食塩水中に溶解した。

第一のスクリーニングステップにおいて、ＡＯＮの効果を、スプライシングレポーター構築物であるｐＣＩ−Ｎｅｏ−ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレット）を使用することによってアッセイした。この構築物は、５００ヌクレオチドのイントロン配列に取り囲まれたＰＥ４０配列を含み、これはロドプシン遺伝子由来のエクソン３および５の間のイントロン中に挿入された。まず、レポータープラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、その後、別個のＡＯＮトランスフェクションを行った。レポータープラスミドはトランスフェクション試薬としてＭａｘＰＥＩを使用してトランスフェクトし、それに続くＡＯＮトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。２４時間のインキュベーション後、細胞を回収して、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡミニプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＲＮＡを抽出し、Ｍａｘｉｍａ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ、＃ＥＰ０７３４）を使用してｃＤＮＡを調製した。ＰＥ４０の、成熟ｍＲＮＡ内への包含は、隣接するロドプシンエクソン３および５に位置するプライマーによるＲＴ−ＰＣＲによって分析した。

図１は、ＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター構築物を使用して実施されたＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１〜−７の初期スクリーニングを、対照オリゴヌクレオチドおよび国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットからの２種の既知のＡＯＮ（ＡＯＮ１およびＡＯＮ２）と比較して示す。この初期スクリーニングにおいて、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１、−２、−４、および−６は、ＡＯＮ１およびＡＯＮ２によって決定されたＰＥ４０エクソンスキッピング（それぞれこの図におけるＲ１およびＲ２として示される）に対する改善を示さなかった。しかし、驚くべきことに、ＵＳＡ２ａ−ＰＥ４０−３、−５、および−７は、ＡＯＮ１およびＡＯＮ２よりも顕著に有効であることが見出され、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７が最も有効であった。

図２は、ＰＥ４０の配列（ＲＮＡとして５’から３’まで）および本明細書で試験されたＡＯＮの相補性の位置を示す。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１（配列番号１７）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２（配列番号１８）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−４（配列番号２０）は、ＡＯＮ１（配列番号１）およびＡＯＮ２（配列番号２）の位置と重複する。より効果的なＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３（配列番号１９）、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−５（配列番号２１）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７（配列番号２３）の結合部位は、明らかに、ＡＯＮ１およびＡＯＮ２とは異なる領域に位置し、推定ＥＳＥと（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３および−５）、ならびに下流のスプライス部位と（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７；図１の下側のパネルも参照）重複する。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−６（配列番号２２）のための結合部位もまた、ＡＯＮ１またはＡＯＮ２が結合する領域の外側にあるが、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−５（配列番号２１）の結合部位と重複することが注目され、このことは、この領域に関する限りは、より強力な標的化領域がＰＥ４０配列の５’末端側に位置していることを示唆する。

本技術分野のＡＯＮによって標的とされるものよりも効果的なＰＥ４０スキッピングのための「ホットスポット」に見える他の領域が、ＰＥ４０配列内に存在することを明確に示した図１の初期実験に基づいて、さらなるセットのＡＯＮを、同定された３つの領域に基づき、また合成の容易性、取り込み、有効性および低下した免疫原性を改善するために設計した：ＡＯＮは、より少ない内部二次構造を有するように短縮化されたか、またはシフトされた。ＡＯＮは、結合親和性を強化することが知られた塩基変化：シトシンの代わりの５−メチル−シトシン（５ｍＣ）、およびアデニンの代わりの２，６−ジアミノプリン（ＤＡＰ）を含めることによってさらに修飾された。表１を参照されたい。５ｍＣ修飾はまた、ＲＮＡおよびＡＯＮの免疫原性を低下させることへの関与が示唆されているので、ＡＯＮの安全性を改善すると予測された。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８、−９、−１０、および−１１はＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−３に基づいた。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１２、−１３、および−１４は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−５に基づいた。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１５、−１６、−１７、および−１８は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−７に基づいた。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２０および−２１は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８に基づいた。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２２および−２３は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１１に基づいた。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４、−２５、−２６、および−２７は、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ−４０−１７に基づいた。新規に設計された異なるＡＯＮの位置もまた、図２に提供される。さらなるＡＯＮによる結果は、図３および４に提供される。ＤＡＰ修飾はより低い有効性をもたらしたことが示され（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２６および−２７を参照）、したがって、このアプローチは断念された。対照的に、５ｍＣ修飾されたＡＯＮは、概して、正常なシトシンを含む対応するＡＯＮと類似した有効性を有した。しかし、両方向における小さな差を観察することができる：５ｍＣ−修飾ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２１は、対応するＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８よりもわずかに有効性が低かった。ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２５は、本来のＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７よりもわずかに有効性が高いことが見出された。また、２ヌクレオチド分だけ短縮化された２種のＡＯＮ（それぞれ−８および−１７に対応するＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２０および−２４）は、それらのより長い本来の対応物と本質的に同じ効果を示した。より長い本来のＡＯＮよりも有効ではないものの、短縮化されたバージョンは、これらを合成することがより容易であり、潜在的により良好な取り込みを有し得るという事実に起因して、より優れていると考えられた。このことに基づいて、これらの実験からの最も効果的なＡＯＮは、短縮化オリゴヌクレオチドであるＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２０および−２４（それぞれ配列番号５および６）、ならびに５ｍＣ−修飾ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２２（配列番号３５）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２５（配列番号３７）であるように見える。

ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８、−１７、−２０、−２４、−２８および−２９（配列番号３〜８）を、エクソンスキッピング能力および免疫原性におけるそれらの有効性について、試験管内でさらに試験した。オリゴヌクレオチドＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８、−２０および−２８のための標的ヌクレオチド配列（これとオリゴヌクレオチドが（部分的に）重複する）は、以下のとおりであり：５’−ＴＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＡ−３’（配列番号１０）、これはＰＥ４０内に位置する。オリゴヌクレオチドＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７、−２４および−２９のための標的ヌクレオチド配列（これとオリゴヌクレオチドが（部分的に）重複する）は、以下のとおりであり：５’−ＡＧＧ^*ＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１１）、これはＰＥ４０に部分的に位置し（下線のＡＧ）、その隣接領域は、ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異を含んでいる（アスタリスクを伴う太字のグアノシン）。

線維芽細胞は、ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞ＧおよびＣ．２３９１＿２３９２ｄｅｌ複合ヘテロ接合変異を保有しているＵＳＨ２患者から採取した。細胞は、３７℃において、２０％のＦＢＳおよび１％のＮａＰｙｒ（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ ＡＱ培地中で維持した。細胞を、１．０×１０⁶個の細胞／ウェルの密度で播種した。ＡＯＮは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロット：１６９９５０９）と、ＯｐｔｉＭｅｍ（ロット：１６９７３８７）中で３０分間にわたって複合体を形成し、次いで線維芽細胞に、１００ｎＭの濃度で添加した。インキュベーションをさらに２４時間続けた。２４時間のインキュベーション期間の終わりにおいて、４時間にわたってシクロヘキサミドで細胞を処置して、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊を抑制した。２４時間のインキュベーション後、細胞を回収して、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡミニプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造者のプロトコールを使用してＲＮＡを抽出した。その後、表２のスキームを使用し、製造者のプロトコールに従って、Ｍａｘｉｍａ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ、＃ＥＰ０７３４、ロット：００３３５７３６）を使用してｃＤＮＡを調製した。ＰＥ４０および野生型ｃＤＮＡのレベルは、表３のピペット操作スキームおよび表４のプライマーを適用して、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（ＱＸ２０００液滴リーダー）を使用して決定した。データは、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅおよびエクセルによって分析した。当業者に既知の方法を使用して、ＧＵＳＢ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット：Ｐ１６０２１０−００６ Ｅ０１）をハウスキーピング遺伝子として使用した。

図５は、８種の異なるＡＯＮによって処置された患者の線維芽細胞における、ＧＵＳＢ発現レベルについて補正された、野生型に対するＰＥ４０を発現する液滴の数を、１つの未処置（ＮＴ）サンプルと共に示す。明らかに、特にＡＯＮ１、ＡＯＮ２、この図５においてＵＳＨ−ＰＥ０−１７およびＵＳＨ−ＰＥ４０−２４と略されたＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７（配列番号４）およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４（配列番号６）は、野生型レベルの出現を増強することにおいて最も有効であり、２種の既知のオリゴヌクレオチドＡＯＮ１およびＡＯＮ２の機能を凌駕するように見えたが、一方で他の４種のＡＯＮはより有効性が低かった。重要なことに、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４は、ＰＥ４０レベルを低下させることができたことがさらに観察され、その効果は、ＡＯＮ１およびＡＯＮ２によっては観察されなかったが、これは、これら２種の新規な偽エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−１７およびＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４）が、この状況において、２種の既知のオリゴヌクレオチドよりもいっそう良好に機能することを示している。他の４種のオリゴヌクレオチド（ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−８、−２０、−２８、および−２９）もまた、２種の既知のオリゴヌクレオチドであるＡＯＮ１およびＡＯＮ２と比較して、ＰＥ４０レベルを低下させることができることがさらに注目されるが、このことは、これら４種のオリゴヌクレオチドもまた、本技術分野のオリゴヌクレオチドの機能を凌駕することを意味する。

［実施例２］
新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドの試験管内毒性。
オリゴヌクレオチドは、脊椎動物の自然免疫系のいわゆるパターン認識受容体（ＰＲＲ）の活性化を引き起こす潜在能力を有する（Bauer et al. 2008. Immunobiology 213:315-328）。ＰＲＲ受容体の最もよく研究されたファミリーは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）である。ＴＬＲは、自然免疫系における主要な役割を果たすタンパク質のクラスである。これらは単独の、膜貫通型の、非触媒性受容体であり、微生物由来の構造的に保存された分子を認識するマクロファージおよび樹状細胞において通常発現する。異なるタイプの核酸によって活性化されるＴＬＲは、エンドソーム上に位置するものである：ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡを認識し；ＴＬＲ７／８は二本鎖および一本鎖ＲＮＡを認識する。

これらの成分がＰＲＲによって認識されると、特異的な「抗微生物」免疫応答が誘発される。ＴＬＲ活性化は、活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ−３）およびアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を生じさせる（Kawasaki 2014. Front Immunol 25:461）。ＡＰ−１、ＩＲＦ−３およびＮＦ−κＢの活性化は、炎症性サイトカイン、Ｉ型インターフェロンおよび自然免疫応答の他のメディエーターの産生を生じさせる。これらのプロセスは、炎症などの急速な宿主防御応答を誘発するだけでなく、抗原特異的な獲得免疫応答もプライミングし、統合する。

初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試験管内曝露を使用して、以前記載されたように（Lankveld 2010. Methods Mol Biol 598:401-423）、（全身性）薬剤特異的免疫応答および免疫毒性を評価した。ＰＢＭＣを使用する試験管内アッセイは、（炎症性）サイトカインの産生を、全身性免疫応答についてのサロゲートマーカーとして使用する確立された前臨床試験である。ＰＢＭＣアッセイは、試験化合物の免疫原性およびアレルゲン性潜在能力の因子として、忍容性の予測を可能にするものであり、これらの化合物についての安全な用量範囲の推定を可能にし得る。

ＵＳＨ２ａ ＰＥ４０−２０、ＵＳＨ２ａ ＰＥ４０−２４、ＵＳＨ２ａ ＰＥ４０−２８およびＵＳＨ２ａ ＰＥ４０−２９を研究するために、施設内で単離されたＰＢＭＣを使用したが、これは健康な血液バンクドナーのバフィーコートから得た。培養上清における主要な炎症促進性サイトカインの産生を、１および４μＭの濃度のオリゴヌクレオチドによる２４時間の刺激の後に評価した。さらに、オリゴヌクレオチドによる処置後のＰＢＭＣの生存能を、培養上清における蛍光レゾルフィンを測定することによって分析して、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０ ＡＯＮの潜在的な細胞毒性効果を評価した。生細胞は、非蛍光レサズリンを蛍光レゾルフィンに変換する（O'Brien et al. 2000. Eur J Biochem 267:5421-5426）。

１００ｎｇ／ｍｌの陽性対照ＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）および１μＭのＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）によるヒトＰＢＭＣの刺激は、培養上清において、測定されたすべてのサイトカインＭＣＰ−１の顕著に増加した濃度をもたらした。さらに、Ｒ８４８による刺激は、類似したパターンのサイトカインを誘導したが、その程度はより低かった。本発明のオリゴヌクレオチドまたは陽性対照による刺激後の培養上清におけるサイトカイン濃度の、生理食塩水処置されたヒトＰＢＭＣと比較した有意水準を描写するヒートマップを、図６Ａに示す。重要なことには、１および４μＭの濃度の本発明のオリゴヌクレオチドによるヒトＰＢＭＣの刺激は、培養上清中の測定されたサイトカインのいずれにおいても、増加した濃度をもたらさなかったか、またはごく少量増加した濃度をもたらす。最後に、オリゴヌクレオチドによる処置後２４時間で、細胞毒性の徴候はなかった（図６Ｂ）。

［実施例３］
ＵＳＨ２患者から生成された眼杯におけるＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡ中のＰＥ４０スキッピング
自明な理由のために、網膜は、ＵＳＨ２患者から得ることも、試験管内研究のために使用することもできない。そのような前臨床研究のための代替案として、そのような患者網膜材料を模したオルガノイドを生成することができ、これは本明細書において眼杯（optic cup）と呼ばれ、時には眼杯（eye cup）とも呼ばれる。複合ヘテロ接合性のＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｌｙｓ２５３２Ｔｈｒｆｓ^*５６）およびｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ^*２１）変異を有する、アッシャー症候群タイプＩＩ患者からの線維芽細胞を、眼杯生成のために使用した。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを発現する、ラドバウドＵＭＣ幹細胞技術センター（Radboud UMC Stem Cell Technology Center）によって寛大にも提供された４種のレンチウイルスを使用して、線維芽細胞を再プログラミングした。クローンはおよそ第６継代で凍結保存し、免疫細胞化学によって、多能性幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１−８１およびＯＣＴ３／４の発現についてさらに分析した。全部で３つの個別のクローンを生成し、保存した。これらのクローンは、規定のすべての品質管理（幹細胞マーカーの活性化（ＲＴ−ｑＰＣＲ）ならびに幹細胞および多能性マーカー（ＩＨＣ）の発現）に合格した（データは示さず）。ｉＰＳＣ系統は、以前記載されたように（Zhong et al 2014. Nature Comm 5:4047;1-12）眼杯へと培養した。ｉＰＳＣは小塊へと分化させ、ｍＴｅＳＲ１培地および１０μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ）を含む懸濁液中で培養して、凝集塊形成を誘導した。凝集塊は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＮ２サプリメント、１×最小必須培地−非必須アミノ酸、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する神経誘導培地に移した。凝集塊を、マトリゲルコートしたディッシュ上に播種した。培地は毎日交換した。４週間の分化後、神経網膜ドメインを手動で剥離し、２％のＢ２７、１×ＮＥＡＡ、および１％の抗生物質−抗真菌物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における懸濁液中で、摂氏３７度の湿潤インキュベーターにおいて培養した。培地は１週間に２回交換した。インキュベーター内で、これらは次第に３次元の眼杯を形成した。ｉＰＳＣ由来眼杯の生成の成功後、これらは、ＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４によって、１カ月にわたって２μＭおよび１０μＭで、ＡＯＮを含む培地を１日おきに新しくすることによって処置した。成熟ｍＲＮＡ内へのＰＥ４０の包含を決定するために、隣接するエクソン３９および４２にそれぞれ位置するプライマー５’−ＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号４０）および５’−ＧＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号４１）によって、ＵＳＨ２Ａ転写産物分析を実施した。提供されたプロトコールに従って、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ単離キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ、＃７４０９５５．５０、Ｄｕｒｅｎ−Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｉＰＳＣおよび眼杯から総ＲＮＡを単離した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ逆転写酵素キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ＃１１７５５０５０；ロット＃１７１８５４１）によるｃＤＮＡ合成のために、０．５〜１．０μｇの総ＲＮＡを使用した。ＵＳＨ２Ａ、ＬＩＮ２８Ａ、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２を、その後、フォワードおよびリバースプライマーを使用して増幅した。参照としてハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢを使用した。ＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａ６００１）を使用して、ＵＳＨ２Ａ、ＬＩＮ２８Ａ、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２およびＧＵＳＢ ｃＤＮＡを三連で、ｑＰＣＲ機器で増幅した。未処置眼杯は、野生型バンド（９００ｂｐ）およびＰＥ４０配列を含むバンド（１０５２ｂｐ）を明らかにするが、これはゲルにおいて容易に識別される。

図７に提供された結果は、両方の濃度（２μＭおよび１０μＭ）のオリゴヌクレオチドＵＳＨ２ａ−ＰＥ４０−２４（配列番号６）が、ＵＳＨ２患者の線維芽細胞から生成された眼杯に対して使用された場合に、ＰＥ４０の完全なスキッピングを誘導するのに十分であったことを示す。ＰＥ４０を含む転写産物を検出することができなかったからである。ｃｔｒｌレーンにおける最終的な上部の非特異的な薄いバンドが何であるかは明らかでない。

これらの結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチド、この特定のケースにおいてはＵＳＨ２ａ−ＰＥ−４０−２４が、アッシャー症候群タイプＩＩを患う（ヘテロ接合性ＰＥ４０）患者の網膜を模したオルガノイドにおいて、ＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからＰＥ４０を効率的にスキップすることができると結論される。

Claims (16)

1. ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからの偽エクソン４０（ＰＥ４０）のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、配列番号４５、４６または４７の少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）。
2. ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからの偽エクソン４０（ＰＥ４０）のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）：
   （ｉ）配列番号６、４、８、２３、３０、３１、３２、３７；
   （ｉｉ）配列番号３、５、７、１９、２４、２５、２６、３４、３５、３６；および
   （ｉｉｉ）配列番号２１、２７、２８、２９。
3. ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおけるＰＥ４０の出現が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異に起因するものである、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
4. ２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、または２’−Ｏ−プロピルなどの少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のＡＯＮ。
5. 前記ＡＯＮにおけるすべてのヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項４に記載のＡＯＮ。
6. 少なくとも１つのホスホロチオアート結合を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載のＡＯＮ。
7. すべての連続するヌクレオチドが、ホスホロチオアート結合によって相互連結している、請求項６に記載のＡＯＮ。
8. 前記ＡＯＮの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、請求項１から３までのいずれか一項に記載のＡＯＮを発現するウイルスベクター。
9. 請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、または請求項８に記載のウイルスベクターおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、硝子体内投与のためのものである医薬組成物。
10. 硝子体内投与のためのものであり、１つの眼あたり０．０５ｍｇ〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇの総ＡＯＮ、例えば１つの眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇの総ＡＯＮの範囲の量で投薬される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 医薬としての使用のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の組成物。
12. アッシャー症候群タイプＩＩなどのＵＳＨ２Ａ関連疾患、またはＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の組成物。
13. ＵＳＨ２Ａ関連疾患、またはＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための医薬の調製における、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の組成物の使用。
14. 細胞においてヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからＰＥ４０をスキップする方法であって、前記細胞に、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の組成物を投与すること；および、前記ＡＯＮが前記ヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む方法。
15. ＵＳＨ２Ａ関連疾患、またはＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキップを必要とする状態の、それを患っている個体における処置のための方法であって、前記個体の細胞に、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項８に記載のベクター、または請求項９もしくは１０に記載の組成物を投与すること、および、前記ＡＯＮがヒトＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む方法。
16. 前記ＵＳＨ２Ａ関連疾患、またはＵＳＨ２ＡプレｍＲＮＡからのＰＥ４０のスキップを必要とする前記状態が、アッシャー症候群タイプＩＩである、請求項１３に記載の使用、または請求項１５に記載の方法。