CN109072239A

CN109072239A - 治疗眼病的寡核苷酸

Info

Publication number: CN109072239A
Application number: CN201780025611.3A
Authority: CN
Inventors: H·C·范迪鹏; H·L·陈; J·J·图鲁宁
Original assignee: ProQR Therapeutics II BV
Current assignee: ProQR Therapeutics II BV
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2018-12-21
Also published as: WO2017186739A1; EA201892431A1; ES2801823T3; JP7043082B2; AU2017257292A1; DK3448999T3; IL262199A; EP3448999B1; KR20180134931A; US20210401871A1; EP3448999A1; US10617707B2; JP2019515688A; MX2018013003A; IL262199B; CA3021899A1; US20190381089A1; ZA201806628B; KR102368920B1; US11123360B2

Abstract

本发明涉及医学和免疫学领域。特别地，它涉及可用于治疗、预防和/或延迟Usher综合征II型和/或USH2A相关的非综合征型视网膜变性(尤其是通过使人USH2A基因中的外显子40和41之间的假外显子(PE40)跳读)的新型反义寡核苷酸。

Description

治疗眼病的寡核苷酸

技术领域

本发明涉及医学和免疫学领域。特别地，它涉及用于治疗、预防和/或延迟Usher综合征II型和/或USH2A-相关的非综合征型视网膜变性的新型反义寡核苷酸。

背景技术

Usher综合征(USH)和非综合征型视网膜色素变性(NSRP)是视网膜的退行性疾病。USH在临床和遗传上具有异质性，是迄今为止人类中最常见的遗传性耳聋失明类型。USH患者的听力损伤大多是稳定的并且具有先天性，可通过助听器或人工耳蜗部分补偿。NSRP比USH更普遍，每4,000名个体中就有1个发生。USH和NSRP中感光细胞的变性是渐进的，并且经常导致生命的第三十年和第四十年之间的完全失明，从而留下治疗干预的时间。USH2A基因的突变是这两种疾病的最常见原因。突变的范围遍及所有72个USH2A外显子及其侧翼内含子序列，并且包含无义和错义突变、缺失、重复、大重排和剪切变体。迄今为止最频繁突变的外显子是外显子13，其包含两个发现者突变(Usher综合征II型(USH2)患者中的c.2299delG(p.E767SfsX21)和NSRP患者中的c.2276G＞T(p.C759F))。对于外显子50，已经报道了十五种致病突变，其中至少八种明显是蛋白质截短的。USH2A内含子40的第一个深内含子突变(c.7595-2144A＞G)由Vaché等人(2012.Hum Mutat 33：104-8)报道。该突变在内含子40中产生隐蔽的高质量剪切供体位点，导致在突变型USH2A mRNA中包含152bp的异常外显子，并导致翻译过早终止(参见WO 2016/005514的图1A和B)。

长期以来，将USH和其它视网膜营养不良视为无法治愈的疾病。然而，使用基因增强疗法的几个I/II期临床试验已经在具有RPE65和MYO7A基因突变的LCA/RP/USH患者的选定组中产生了有希望的结果。编码序列的大小(15,606bp)和USH2A基因和mRNA的可变剪切分别阻碍了基因增强疗法，因为目前许多可用载体(例如腺相关(AAV)和慢病毒载体)的负载大小有限。

尽管基于反义寡核苷酸(AON)的疗法具有广泛的临床潜力，但它并不常用于脊椎动物的眼中。AON是小的(16-25个核苷酸)多核苷酸分子，其能够干扰剪切，因为它们的序列与靶标前mRNA分子的序列互补。在结合AON后，前mRNA的靶区域不再可用于剪切因子，这导致AON靶向的外显子跳读跳读。在治疗上，这种方法可以以两种方式使用：a)重新引导其中突变激活隐蔽的剪切位点的基因中的正常剪切；和b)以mRNA的阅读框保持完整并且制备(部分)功能性蛋白质的方式使携带(蛋白质-截短的)突变的外显子跳读跳读。对于USH2A基因，72个外显子中的28个可能跳读跳读而不会干扰转录物的总阅读框。基于AON的两种方法都成功应用于患有严重遗传性疾病的患者。Liquori等人(2016.Hum Mutat 37：184-193)显示AON能够阻止在USH2A基因的mRNA中包含由内含子50中的c.9959.4159A＞G突变引起的155bp假外显子(pseudo exon)50(PE 50)。

本发明的一个目的是提供一种方便的治疗策略，用于预防、治疗或延迟由人USH2A基因的外显子40和41之间的内含子中存在的c.7595-2144A＞G突变引起的USH和/或NSRP。之前已经提出过(Vaché等人，2012)，并且之后证明(WO 2016/005514)，AON能够阻断USH2A前mRNA的异常剪切，这种异常剪切由导致包含假外显子40：PE40的这种突变引起。值得注意的是，需要进一步改善的替代物，其表现更好并且具有额外的有益特性。本发明的目的是提供这样的替代物。

发明内容

本发明涉及反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA中跳读假外显子40(PE40)，其中包含假外显子是由于USH2A基因中的c.7595-2144A＞G，并且其中所述AON包含选自以下任何序列组的序列：(i)SEQ ID NO：6、4、8、23、30、31、32、37；(ii)SEQ ID NO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36；和(iii)SEQ ID NO：21、27、28、29。在另一个实施方式中，本发明还涉及能够诱导从人USH2A前mRNA中跳读PE40的AON，其中所述AON包含与SEQ ID NO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。在优选的实施方式中，本发明的AON的长度为18至143个核苷酸，优选18至40个核苷酸，更优选18至30个核苷酸，甚至更优选18至24个核苷酸，并且最优选由选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、19、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36和37的序列，优选选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、26、34、35和37的序列，更优选选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、26和35的序列组成。在另一个优选的实施方式中，根据本发明的AON包含2′-O-烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰的核糖、2′-O-丙基修饰的核糖、和/或这些修饰的取代衍生物，如卤代衍生物。本发明的AON中的一个或多个核苷酸可通过2′-O-甲氧基乙基修饰进行修饰。本发明还涉及一组AON，其包含至少两种如本文要求保护的AON。在另一个实施方式中，本发明还涉及当置于有利于AON表达的条件下时表达根据本发明的AON的病毒载体。在另一个实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的AON、或根据本发明的一组AON、或根据本发明的病毒载体，和药学上可接受的赋形剂。本发明还涉及根据本发明的AON、组、载体或组合物，用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症，如Usher综合征II型。

附图说明

图1示出在HEK293细胞中使用报告构建体，七种备选反义寡核苷酸与本领域的两种已知反义寡核苷酸(分别为AON1和AON2：R1和R2)和不相关的对照寡核苷酸(ctrl)相比，比较PE40外显子跳读效率的初始筛选的逆转录酶结果，在施用USH2a-PE40-3、-5和-7后显示信号明显增加。下图示出相对于PE40序列的不同AON的大致位置。

图2示出从5’到3’的PE40序列(粗体并带下划线，并分成两部分)，以及本文测试的不同AON的结合位点。每个测试的AON的SEQ ID NO在括号之间给出，名称在表1中给出。PE40序列下游的第一个核苷酸是鸟苷(G)，其代表c.7595-2144A＞G突变。AON1(1)和AON2(2)的位置直接在PE40序列下面给出。斜体序列是PE40的上游和下游序列。如实施例中所概述的和本文所要求保护的三个感兴趣的区域分别围绕USH2a-PE40-3(SEQ ID NO：19，粗体)、USH2a-PE40-5(SEQ ID NO：21，粗体)和USH2a-PE40-7(SEQ ID NO：23，粗体)。

图3示出基于图1和2中所示的USH2a-PE40-3、-5和-7的一组寡核苷酸的PE40跳读筛选的逆转录酶结果。显然，AON USH2a-PE40-8和-11(基于USH2a-PE40-3)和USH2a-PE40-17(基于USH2a-PE40-7)显示出进一步增加的强度，表明相对于本领域已知的寡核苷酸的进一步改善。

图4示出更进一步且基于USH2a-PE40-8、-11和-17的一组寡核苷酸的PE40跳读筛选的逆转录酶结果。短表示比原始的短。5mC表示5-甲基-胞嘧啶(也参见表1)。DAP表示2，6-二氨基嘌呤。

图5示出在用如实施例1中概述的八种不同的寡核苷酸处理的USH2患者成纤维细胞中，经过作为标准的来自GUSB基因(管家基因)的β-葡糖醛酸糖苷酶表达的校正，并且如本领域技术人员所常用的那样，呈现与野生型产物(每个AON的右侧柱)相比表达PE40(每个AON的左侧柱)的小滴数量的柱状图。

图6示出人PBMC中所示的USH2a-PE40 AON的免疫原性和免疫毒性评估结果。A.热图，描绘了与盐水-处理的人PBMC相比，用本文公开的寡核苷酸或阳性对照LPS(100ng/ml)和R848(1μM)刺激人PBMC 24小时后培养物上清液中细胞因子浓度的倍数变化和显著水平。每格显示每种测量的细胞因子的每个处理条件的倍数变化。B.在暴露于本发明的四种不同的USH2a-PE40反义寡核苷酸或阳性对照24小时后，与盐水处理的PBMC相比，存活的PBMC的相对数目表示为试卤灵荧光的倍数变化。活细胞评估使用CellTiter-试剂盒(Promega)使用制造商的方案进行。对于所有单独的生物学重复，倍数变化通过将测量的RFU相对于相应的三次重复盐水对照的几何平均数进行归一化来计算。每个单独供体的结果显示为三次重复倍数变化的平均值±SEM，相对于其相应盐水对照的平均值(虚线)而归一化。重复测量进行单因素方差分析与Dunnett测试用于多重校正(与盐水相比)。

图7示出在用USH2a-PE40-24处理后从杂合USH2患者获得的成纤维细胞产生的视杯中的USH2A前mRNA中PE40跳读的结果。左侧四个泳道显示来自健康供体的成纤维细胞产生的视杯中的结果，并且随后的三个泳道显示来自USH2患者成纤维细胞的视杯的结果。对照寡核苷酸是不与USH2A前mRNA互补的无关寡核苷酸。右侧的阴性对照不含核酸物质。对照泳道5示出两条显性条带，上部条带代表包含PE40序列的mRNA，并且下部厚条带代表缺乏PE40序列的mRNA。用USH2a-PE40-24处理导致从前mRNA中完全跳读PE40，因为没有检测到上部条带。

具体实施方式

出于本发明的目的，术语“包含异常假外显子”、“包含异常假外显子40”或“包含异常152bp核苷酸假外显子”认为是同义词，并且认为是指包含USH2A基因的假外显子40(PE40)到mRNA中，或包含其部分或包含该序列的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列到USH2A mRNA中。

术语“外显子跳读”在本文中定义为诱导、产生或增加细胞内产生不包含特定外显子的成熟mRNA，在没有外显子跳读的情况下，该特定外显子将存在于成熟mRNA中。外显子跳读通过向表达所述成熟mRNA的前mRNA的细胞提供一种分子来实现，该分子能够干扰序列如允许剪切的酶促过程所需的(隐蔽)剪切供体或(隐蔽)剪切受体序列，或该分子能够干扰用于识别待包含在成熟mRNA中的外显子的核苷酸段所需的外显子包含信号；这种分子在本文中称为外显子跳读分子。在本发明中，外显子跳读涉及使PE40跳读。

术语前mRNA是指通过转录从细胞的DNA模板合成(例如在细胞核中)的未加工或部分加工的前体mRNA。

术语“外显子保留”涉及当该外显子没有发生外显子跳读而通过剪切反应加工前mRNA时，细胞内产生包含特定外显子的成熟mRNA。对于本发明，当人USH2A基因为野生型时，PE40通常不存在于来自人USH2A基因的成熟mRNA中，当特定突变使得PE40没有从前mRNA剪切掉时，PE40保留在来自人USH2A基因的成熟mRNA中，如在本文中详细讨论的，存在c.7595-2144A＞G突变时发生的。本发明的目的是防止、抑制或减少PE40在人USH2A mRNA中的外显子保留，从而预防、延迟和/或治疗Usher综合征II型。

术语“反义寡核苷酸”(AON)应理解为是指与前mRNA分子、异源核RNA(hnRNA)或mRNA分子中的靶核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。本文提供本发明的寡核苷酸的靶序列。反义序列的互补(或基本上互补)程度优选使得包含反义序列的分子能够在生理条件下与RNA分子中的靶核苷酸序列形成稳定的杂交体。术语“反义寡核苷酸”、其缩写“AON”和术语“寡核苷酸”在本文中可互换使用，并且应理解为是指包含反义序列的寡核苷酸。反义寡核苷酸优选是单链的，并且优选地不与自身或相同类型的另一种AON自退火。

在本发明的上下文中使用的术语“基本上互补”表示允许反义序列中的一些错配，只要功能性(即诱导PE40的跳读)仍然是可接受的。

术语“假外显子跳读”在本文中定义为诱导、刺激、引起、增强、产生或增加细胞内的产生不包含特定内含子区域或假外显子的成熟mRNA，在没有假外显子跳读的情况下，该特定内含子区域或假外显子将存在于成熟mRNA中。假外显子跳读通过向表达所述成熟mRNA的前mRNA的细胞提供一种分子来实现，该分子能够干扰序列如允许剪切的酶促过程所需的(隐蔽)剪切供体或(隐蔽)剪切受体序列，或该分子能够干扰用于识别待包含在成熟mRNA中的假外显子的核苷酸段所需的假外显子包含信号；这种分子在本文中称为假外显子跳读分子。

优选地，互补度为90％至100％。通常，这允许在20个核苷酸的寡核苷酸中存在1或2个错配，或者在40个核苷酸的寡核苷酸中存在1、2、3或4个错配，或者在60个核苷酸的寡核苷酸中存在1、2、3、4、5或6个错配。

在一个实施方式中，本文所述的外显子跳读AON可以是与指定序列结合和/或互补的化合物。例如，用于筛选结合特定核苷酸序列的AON的方法公开于WO 2002/024906、US 6,875,736和WO 2016/005514，其并入本文以供参考。与特定序列的结合(优选在异常152个核苷酸USH2A假外显子40(PE40)的背景下)可以通过技术人员已知的技术评估。优选的技术是如EP1619249中所述的凝胶迁移率变动分析。在一个优选的实施方式中，一旦所述分子与标记序列的结合可在凝胶迁移率变动分析中检测到，则称(假)外显子跳读AON结合。

在本发明的所有实施方式中，“(假)外显子跳读分子”是AON。为了本发明的目的而设计AON是特别相关的。在优选的方法中，为了设计、改善所述外显子跳读分子，必须考虑以下至少一个方面：(1)AON优选不含CpG或一段CpG基序；和(2)AON具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学性质。寡核苷酸中CpG或一段CpG基序的存在通常与所述寡核苷酸的免疫原性增加有关。免疫原性可以在动物模型中通过评估CD4+和/或CD8+细胞的存在和/或炎性单核细胞浸润来评估。它还可以在用本发明的寡核苷酸治疗的动物或人的血液中通过使用本领域技术人员已知的标准免疫测定法检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在来评估。炎性反应、I型干扰素产生、IL-12产生和/或免疫原性的增加可以通过使用标准免疫测定检测中和抗体或识别所述寡核苷酸的抗体的存在或增加量来评估。

本发明涉及具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学特性的AON。RNA结合动力学和/或热力学特性至少部分地由寡核苷酸解链温度(Tm；使用基本Tm和最近相邻模型，对于单链RNA用寡核苷酸特性计算器计算(www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index.html))和/或AON-靶外显子复合物的自由能(使用RNA结构型式4.5)确定。如果Tm太高，则预期寡核苷酸的特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出这些参数中的每一个的优选范围。可接受的Tm可以在35℃和70℃之间，并且可接受的自由能可以在15kcal/mol和45kcal/mol之间。

在一个优选的实施方式中，当通过实时定量RT-PCR测量的异常152个核苷酸USH2A假外显子40跳读百分比为至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或在至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％时，称AON诱导异常152个核苷酸USH2A假外显子40(WO2016/005514中的SEQ ID NO：5)的跳读。用于测定外显子跳读和/或外显子保留的优选测定法在本文的实施例中描述。

优选地，根据本发明的AON包含与PE40的核苷酸序列(本文的SEQ ID NO：9)或其部分互补或基本上互补的序列，使得(基本上)互补的部分是根据本发明的寡核苷酸长度的至少50％、更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、或甚至更优选至少95％、或甚至更优选98％、或甚至更优选至少99％、或甚至更优选100％。优选地，根据本发明的AON包含与以下所示的SEQ ID NO：9的一部分互补的序列或由其组成：

假外显子40；PE40

例如，AON可包含与SEQ ID NO：9的部分互补的序列和另外的侧翼序列，尤其是PE40的3’末端的剪切位点。在一个更优选的实施方式中，所述AON的所述互补部分的长度为至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸。另外的侧翼序列可用于修饰结合，或用于修饰AON的热力学性质，更优选地用于修饰靶RNA结合亲和力。技术人员知晓，因此并非绝对需要互补区域中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计AON时，人们可能想要包含例如与互补链上的碱基并不是碱基配对的残基。如果在细胞的环境下，一段核苷酸能够充分地与互补部分杂交，则在某种程度上可以允许错配。在该上下文中，“充分地”优选是指使用如EP1619249的实施例1中所述的凝胶迁移率变动分析，可检测到AON的结合。

任选地，所述AON可通过转染到患者的成纤维细胞或视网膜细胞中来进一步测试。所靶向的外显子的跳读可通过RT-PCR(例如在EP1619249中所描述)评估。互补区域优选地设计成使得当它们组合时，它们对前mRNA中的外显子是特异性的。这种特异性可以由各种长度的互补区域产生，因为这取决于系统中其它(前)mRNA分子中的实际序列。AON还将能够与一个或多个其它前mRNA分子杂交的风险随着AON大小的增加而减小。显然在互补区域中包含错配但是保留与前体mRNA中靶向区域杂交和/或结合的能力的AON可用于本发明。然而，优选至少互补部分不包含这些错配，因为互补部分中缺乏错配的AON通常比在一个或多个互补区域中具有这些错配的AON具有更高的效率和更高的特异性。据认为，较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用数目)对提高干扰系统的剪切机制的过程的效率是有利的。优选地，互补度为90％至100％。

本发明的假外显子跳读AON优选为分离形式。根据本发明优选的假外显子跳读AON的长度为18至143个核苷酸、更优选18至60个、更优选18至40个核苷酸、更优选18至30个核苷酸、更优选18至24个核苷酸、最优选18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸或24个核苷酸。在另一个优选的实施方式中，本发明的AON由18至143个核苷酸组成、更优选18至40个核苷酸、更优选18至30个核苷酸、更优选18至20个核苷酸、或优选由18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸组成。

优选的是，本发明的外显子跳读AON包含经修饰以提高核酸酶抗性、和/或以增加AON对靶序列的亲和力的一个或多个残基。因此，在优选的实施方式中，AON序列包含至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基、和/或修饰的主链、和/或非天然的核苷间键、或这些修饰的组合的残基。

在优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包含修饰的主链。这些主链的实例由吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化物、亚砜和砜主链、甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链、亚甲基甲酰乙酰基主链、核糖乙酰主链、含烯烃主链、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链和酰胺主链提供。磷酰二胺吗啉代寡聚物是以前作为反义试剂研究的经修饰的主链寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的主链，其中DNA的脱氧核糖由六元环代替，并且磷酸二酯键由磷酰二胺键代替。吗啉代寡核苷酸对酶降解具有抗性，并且似乎通过阻止翻译或干扰前体mRNA剪切而不是通过激活核糖核酸酶H(RNase H)起反义试剂作用。通过物理破坏细胞膜的方法已经将吗啉代寡核苷酸成功地递送至组织培养细胞，并且比较这些方法中的若干方法的一项研究发现，刮擦负载(scrapeloading)是最有效的递送方法；然而，因为吗啉代主链不带电，所以阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介质。最近的一份报告证明了吗啉代寡核苷酸形成三链体(triplex)，并且由于非离子主链，这些研究表明吗啉代寡核苷酸在不存在镁的情况下能够形成三链体。进一步优选的是，主链中的残基之间的键不包括磷原子，例如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。优选的核苷酸类似物或等同物包含具有修饰的聚酰胺主链的肽核酸(PNA)。基于PNA的分子在碱基对识别方面是DNA分子的真实模拟物。PNA的主链由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接到主链。替代主链包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体。由于PNA分子的主链不含有带电的磷酸酯基团，所以通常PNA-RNA杂交体分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂交体更稳定。进一步优选的主链包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替。最优选的核苷酸类似物或等同物包含磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替，并且相邻吗啉环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子磷酰二胺键代替。在又一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中的非桥接氧中的一个的取代。该修饰略微使碱基配对不稳定，但增加了对核酸酶降解的明显抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯。本发明的另一个优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，该一个或多个糖部分在2’、3’和/或5’位置单取代或二取代，例如-OH；-F；可以由一个或多个杂原子中断的取代或未取代的直链或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨氧基乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可为六环糖或其衍生物、或脱氧六环糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物、或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2’-碳原子连接到糖环的3’或4’碳原子上，从而形成双环糖部分。优选的LNA包括2’-O，4’-C-亚乙基桥接的核酸。这些取代使得核苷酸类似物或等同物具有核糖核酸酶H和核酸酶抗性并增加对靶RNA的亲和力。在另一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成和天然的碱基，例如在本领域中已知或将知的肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤以及嘧啶和嘌呤碱基的其他-氮杂、脱氮、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。本领域技术人员应当理解，不必要对AON中的所有位置都均匀地修饰。另外，上述类似物或等同物中的多于一种可以包含在单个AON中或甚至在AON内的单个位置处。在某些实施方式中，本发明的AON具有至少两种不同类型的类似物或等同物。

根据本发明优选的假外显子跳读AON是2′-O烷基硫代磷酸酯AON，比如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰的核糖、2′-O-丙基修饰的核糖和/或这些修饰的取代衍生物，比如卤代衍生物。根据本发明的有效AON包含具有硫代磷酸酯主链的2′-O-甲基核糖。

本领域技术人员还将理解，不同的AON可以组合用于有效地USH2A的异常152个核苷酸假外显子跳读。在优选的实施方式中，至少2、3、4、5或6个AON的组合(或组)用于本发明的方法中。

AON可以与增强细胞(优选视网膜细胞)中AON摄取的部分连接。这些部分的实例是胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包括但不限于触角足、TAT、转运子(transportan))和带正电荷的氨基酸(比如寡聚精氨酸、聚精氨酸、寡聚赖氨酸或聚赖氨酸)、比如由抗体、抗体的Fab片段提供的抗原结合结构域或单链抗原结合结构域(比如骆驼状单结构域抗原结合结构域)。

根据本发明的AON可以使用本领域已知的合适方法间接地施用。例如可以将其以表达载体的形式提供给个体或所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体编码包含所述AON的转录物。表达载体优选地经由基因递送工具引入细胞、组织、器官或个体。在优选的实施方式中，提供基于病毒的表达载体，其包含驱动如本文所鉴定的外显子跳读分子的表达或转录的表达盒或转录盒。因此，本发明提供病毒载体，当置于有助于AON表达的条件下时，该病毒载体表达根据本发明的AON。可以通过质粒衍生的AON表达或由基于腺病毒或腺相关病毒载体提供的病毒表达向细胞提供能够干扰必需序列的AON，导致异常152个核苷酸USH2A假外显子的高效跳读。表达可以由聚合酶II-启动子(Pol II)、比如U7启动子或聚合酶III(Pol III)启动子、比如U6RNA启动子驱动。优选的递送载体是病毒载体、比如腺相关病毒载体(AAV)，或逆转录病毒载体、比如慢病毒载体等，所有这些均如WO 2016/005514中所详细描述。此外，质粒、人工染色体、可用于细胞的人基因组中靶向的同源重组和整合的质粒可适用于递送本文所述的寡核苷酸。本发明优选的是那些其中转录由Pol-III启动子驱动、和/或其中转录物为与U1或U7转录物融合形式的载体，它们对于递送小的转录物产生良好的结果。设计合适的转录物在本领域技术人员的技术范围内。优选的是Pol-III驱动的转录物，优选地，以与U1或U7转录物的融合转录物的形式。

根据本发明的AON可以如此递送。然而，AON也可以由病毒载体编码。通常，这是RNA转录物的形式，其在转录物的一部分中包含根据本发明的AON的序列。

考虑到迄今为止已经取得的进展，预期用于向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供根据本发明的AON的手段的改善。当然可以并入这些未来的改善以使用本发明的方法来实现提及的对mRNA重构的效果。根据本发明的AON可按原样递送给个体、所述个体的细胞、组织或器官。当施用根据本发明的AON时，优选将分子溶解在与递送方法相容的溶液中。通过提供水溶液中的质粒或通过病毒载体或纳米颗粒(所有这些均如WO 2016/005514中所详细描述)，可以向视网膜或内耳细胞提供用于AON表达的质粒。优选地，将病毒载体或纳米颗粒递送至视网膜或内耳细胞。技术人员可以选择和调整任何已知的和/或其它市售的替代赋形剂和递送系统以包装和递送用于本发明的AON，用于预防、治疗或延迟USH2A相关疾病或病症。“预防，治疗或延迟USH2A相关疾病或病症”在本文中优选地定义为阻止、停止、终止部分或完全视力损害或失明的进展，或使其逆转，以及阻止、停止、终止由USH2A基因中遗传缺陷引起的部分或完全听觉损伤或耳聋的进展或使其逆转。

在一个优选的实施方式中，将根据本发明的AON配制成组合物或药物或组合物，该组合物或药物提供有至少一种赋形剂、和/或一种用于递送的靶向配体、和/或一种将其递送至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。

应理解，如果组合物包含附加的成分比如辅料化合物，则组合物的每种成分可以不配制成单一组合或组合物或制剂。根据其特性，技术人员将知晓哪种类型的剂型对于如本文所述的每种成分最适当。如果需要，可通过添加药学上可接受的载体，将根据本发明的AON或表达根据本发明的AON的载体(优选病毒载体)并入药物活性混合物中。

因此，本发明还提供包含根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体和药学上可接受的赋形剂的组合物、优选药物组合物。这种组合物可以包含根据本发明的单一AON或病毒载体，但也可以包含根据本发明的多种不同的AON或病毒载体。这种药物组合物可以包含任何药学上可接受的赋形剂，包括载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂。

优选的给药途径是通过玻璃体内注射水溶液或特别适合的眼内给药配方。EP2425814公开了一种水包油乳液，特别适用于肽或核酸药物的眼内(玻璃体内)给药。该乳液的密度低于玻璃体液，使得乳液漂浮在玻璃体上部，避免注射的药物损害视力。

如果使用根据本发明的多个不同的AON，则本文所定义的浓度或剂量可以是指使用的所有寡核苷酸的总浓度或剂量，或者使用或添加的每种外显子跳读分子的浓度或剂量。因此，在一个实施方式中，提供一种组合物，其中使用的根据本发明的AON的单量或总量以在0.01至20mg/kg、优选0.05至20mg/kg之间的范围的量给药。合适的玻璃体内剂量为每只眼约0.05至约5mg、优选约0.1至约1mg，比如每只眼约：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。

根据本发明的优选AON用于治疗个体的USH2A相关疾病或病症。在本发明的所有实施方式中，术语“治疗”应理解为包括预防和/或延迟USH2A相关疾病或病症。可以使用根据本发明的AON治疗的个体可能已经诊断为患有USH2A相关疾病或病症。或者，可以使用根据本发明的AON治疗的个体可能尚未诊断为患有USH2A相关疾病或病症，但鉴于他或她的遗传背景，在未来可能是患USH2A相关疾病或病症的风险增加的个体。优选的个体是人。在优选的实施方式中，USH2A相关疾病或病症是Usher综合征II型。因此，本发明还提供根据本发明的AON、或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物，用作用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关的疾病或病症的药物，和用作用于预防、治疗或延迟USH2A相关疾病或病症的药物。

本发明还提供根据本发明的AON、或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物用于制备药物的用途，以制备用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症的药物，和制备用于预防、治疗或延迟USH2A相关疾病或病症的药物。因此，在另一方面，提供了本文所述的AON、病毒载体或组合物用于制备药物的用途，以制备用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的病症的药物和制备用于预防、治疗或延迟USH2A相关疾病或病症的药物。在根据本发明的用途或方法中的治疗至少一次，持续一周、一个月、几个月、一年、2、3、4、5、6年或更长，例如终生。本文所述的根据本发明使用的每个AON可以适合于直接施用于已经受影响或处于患USH2A相关疾病或病症风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，并且可以体内、离体或体外直接施用。本发明的AON、组合物、化合物或辅助化合物的给药频率可取决于若干参数，比如疾病的严重程度、患者的年龄、患者的突变、AON的数量(即剂量)、所述分子的配方、给药途径等。频率可以在每天一次、每周一次、至少两周一次、或三周一次、或四周一次或五周一次或更长的时间段之间变化。

根据本发明的AON的剂量范围优选基于临床试验(体内使用)中的上升剂量研究来设计，其中存在严格的方案要求。本文所述的AON可以以0.01至20mg/kg，优选0.05至20mg/kg的剂量使用。合适的玻璃体内剂量为每只眼0.05mg至5mg，优选0.1mg至1mg，比如每只眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。在一个优选的实施方式中，使用浓度范围为0.1nM至1μM的本文所述的AON。优选地，该范围用于体外用于细胞模型，比如视网膜细胞或视网膜组织。更优选地，使用的浓度范围为1-400nM，甚至更优选10-200nM，甚至更优选50-100nM。如果使用几种AON，则该浓度或剂量可以指AON的总浓度或剂量或所添加每种AON的浓度或剂量。在一个优选的实施方式中，作为本发明分子的递送载体的病毒载体，优选如本文前面所述的AAV载体，以每次注射1x10⁹至1x10¹⁷个病毒颗粒、更优选每次注射1x10¹⁰至1x10¹²个病毒颗粒的剂量施用。如上给出的AON浓度或剂量范围是体内、体外或离体用途的优选浓度或剂量。技术人员将理解，取决于所使用的AON、待治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所用培养基以及转染和孵育条件，所用AON的浓度或剂量可进一步变化并且可能需要进一步优化。

本发明还提供一种用于调节细胞中USH2A前mRNA剪切的方法，包括使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选是本文前面定义的那些。使细胞与根据本发明的AON、或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物接触可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。用于递送本文所述的AON、病毒载体和组合物的方法的使用涵盖在内。接触可以是直接或间接的，并且可以是体内、离体或体外。

本发明还提供一种用于治疗USH2A相关疾病或病症的方法，该疾病或病症需要调节有此需要的个体的USH2A前mRNA的剪切(比如Usher综合征II型)，所述方法包括使所述个体的细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON、或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选是本文前面定义的那些。使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON、或根据本发明的病毒载体、或根据本发明的组合物接触，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。用于递送本文所述的AON、病毒载体和组合物的方法的使用涵盖在内。接触可以是直接或间接的，并且可以是体内、离体或体外。优选的USH2A相关疾病或病症是Usher综合征II型。除非另有说明，否则本文所述的每个实施方式可与本文所述的另一实施方式组合。

本发明涉及一种反义寡核苷酸(AON)，其包含选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、19、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、和37的序列，优选选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、26、34、35、和37的序列，更优选选自SEQ ID NO：6、3、4、5、7、8、26、和35的序列。本发明的AON能够诱导、刺激或增强USH2A前mRNA中假外显子40(PE40)的跳读，其中包含PE40是由于或由USH2患者中常见的c.7595-2144A＞G引起。应理解，并且这在实施例以及图1-5和表1中进一步详述，AON不是随机挑选的，而是根据名为USH2a-PE40-3、-5和-7的三个新AON分别形成三个“衍生组”，如下：

-基于USH2a-PE40-3(SEQ ID NO：19)的AON是SEQ ID NO：3、5、7、24、25、26、34、35和36的AON，其中USH2a-PE40-8(SEQ ID NO：3)、USH2a-PE40-11(SEQ ID NO：26)、USH2a-PE40-20(SEQ ID NO：5)、USH2a-PE40-22(SEQ ID NO：35)和USH2a-PE40-28(SEQ ID NO：7)表现最佳(参见图4和5)。

-基于USH2a-PE40-5(SEQ ID NO：21)的AON是SEQ ID NO：27、28和29的AON。

-基于USH2a-PE40-7(SEQ ID NO：23)的AON是SEQ ID NO：4、6、8、30、31、32和37的AON，其中USH2a-PE40-17(SEQ ID NO：4)、USH2a-PE40-24(SEQ ID NO：6)和USH2a-PE40-29(SEQ ID NO：8)表现最佳(参见图4和5)，其中甚至USH2a-PE40-17和-24优于所有其它AON。

存在于SEQ ID NO：6、4、8、23、30、31、32、37的非常有效的AON中的重叠序列是5’-AGAUGAUCUCUUA-3’(SEQ ID NO：42)，其中胞嘧啶可以用5-甲基-胞嘧啶(5mC)代替。

存在于SEQ ID NO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36的非常有效的AON中的重叠序列是5’-CGCUGC-3’(SEQ ID NO：43)，其中胞嘧啶可以用5-甲基-胞嘧啶(5mC)代替。

存在于SEQ ID NO：21、27、28、29的非常有效的AON中的重叠序列是5’-AUUUCAAUUUCAUGAUUU-3’(SEQ ID NO：44)，其中胞嘧啶可以用5-甲基-胞嘧啶(5mC)代替。

因此，本发明还涉及包含选自SEQ ID NO：42、43和44的序列的AON。

SEQ ID NO：6、4、8、23、30、31、32、37的非常有效的AON的靶区域，包括PE40序列的3′末端的剪切边界，是5’-UCCCAAGGUAAGAGAUCAUCUUUAAGAAAAGG-3’(SEQ ID NO：45)。

SEQ ID NO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36的非常有效的AON的靶区域是5’-UCUGCAACAAGAGCAGCGAAUCUACUCAGC-3’(SEQ ID NO：46)。

SEQ ID NO：21、27、28、29的非常有效的AON的靶区域是5’-GGAAACAAAUCAUGAAAUUGAAAUUGAACA-3’(SEQ ID NO：47)。

靶向SEQ ID NO：45、46和47的任何序列的最短AON长18个核苷酸(USH2a-PE40-23(SEQ ID NO：36)。因此，本发明还涉及能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)的AON，其中所述AON包含与SEQ ID NO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。

在本发明的另一个实施方式中，其涉及能够诱导、引起、刺激和/或增强PE40从人USH2A前mRNA跳读的AON，其中所述AON包含选自任何以下序列组的序列或由其组成：(i)SEQID NO：6、4、8、23、30、31、32、37；(ii)SEQ ID NO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36；和(iii)SEQ ID NO：21、27、28、29。在一个优选的实施方式中，所述AON包含选自任何以下序列组的序列或由其组成：(i)SEQ ID NO：6、4、8；和(ii)SEQ ID NO：3、5、7、26、35。在一个高度优选的实施方式中，所述AON包含选自SEQ ID NO：6和4的序列或由其组成。在一个特定方面，USH2A前mRNA中PE40的保留(或剪切已完成后mRNA中存在PE40)是由于USH2A基因中的c.7595-2144A＞G突变，但不能排除USH2A基因中存在其它(鉴定或迄今未鉴定)突变，其也导致USH2A mRNA中存在PE40。优选地，本发明的AON是寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)，其包含至少一个2′-O烷基修饰，比如2′-O-甲基(2′-O-Me)、2′-O-乙基、或2′-O-丙基。另一种优选的修饰是2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)。在一个优选的方面，本发明的AON中的所有核苷酸都为2′-O-甲基修饰的。优选地，本发明的AON具有至少一个硫代磷酸酯键，并且更优选地，本发明的AON内的所有连续核苷酸通过硫代磷酸酯键相互连接。

在优选的实施方式中，本发明的AON的长度为18至143个核苷酸、优选18至40个核苷酸、更优选18至30个核苷酸、甚至更优选18至24个核苷酸。在一个优选的方面，根据本发明的AON包含2′-O-烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，比如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰的核糖、2′-O-丙基修饰的核糖，和/或这些修饰的取代衍生物，比如卤代衍生物。为了增加治疗效果，应用本发明的多种AON可能是有用的。因此，在另一个优选实施方式中，本发明涉及一组AON，所述组包含至少两个根据本发明的AON。另一方面，本发明涉及当置于有利于AON表达的条件下时表达根据本发明的AON的病毒载体。本发明还涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的AON、一组AON或病毒载体，和药学上可接受的赋形剂。优选地，所述药物组合物用于玻璃体内给药，并且给药剂量范围为每只眼0.05mg至5mg总AON。更优选地，所述药物组合物用于玻璃体内给药，并且给药剂量范围为每只眼0.1-1mg总AON，比如每只眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg总AON。在另一个方面，本发明涉及根据本发明的AON、根据本发明和如本文要求保护的一组AON、根据本发明的载体、或根据本发明的组合物，用作药物，优选用于治疗或预防需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症。在另一方面，本发明涉及根据本发明的AON、根据本发明的一组AON、根据本发明的载体或根据本发明的组合物在制备用于治疗需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症的药物中的用途。

本发明还涉及一种用于调节细胞中USH2A前mRNA剪切的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的AON、根据本发明的组、根据本发明的载体、或根据本发明的组合物接触。所述细胞可以是体外细胞、离体细胞或体内细胞。在所述方法中使用的所述细胞优选存在于患有USH2A相关病症或处于其风险中的(人)受试者的眼中或从其获得。因此，在另一个优选的方面，本发明涉及一种用于在患有需要调节USH2A前mRNA剪切的USH2A相关疾病或病症(比如Usher综合征II型)的个体中治疗该疾病或病症的方法，所述方法包括使所述个体的细胞与根据本发明的AON、根据本发明的组、根据本发明的载体、或根据本发明的组合物接触。

另一方面，本发明涉及一种根据本发明的假外显子跳读反义寡核苷酸、一种根据本发明的用途或一种根据本发明的方法，其中需要调节USH2A剪切的USH2A相关疾病或病症是Usher综合征II型。在最优选的方面，通过使用本发明的反义寡核苷酸发生跳读的假外显子是如本文公开的假外显子40(PE40；SEQ ID NO：9)。

在本文及其权利要求中，动词“包括(comprise)”及其词形变化在其非限制性意义上用于意指包括该词后面的项目，但不排除未特定提及的项目。此外，除非上下文明确要求存在一个且唯一的要素，否则由不定冠词“一”(“a”或“an”)对要素的引用不排除存在多于一个要素的可能性。因此，不定冠词“一”(“a”或“an”)通常意指“至少一个”。当词“约”或“大约”与数值相关联地使用(例如约10)时，优选地意指该值可以是给定值(10)或多于或少于该值的0.1％。如本文提供的序列信息不应被如此狭义地解释为需要包含错误鉴定的碱基。本领域技术人员能够鉴定这种错误鉴定的碱基，并且知晓如何改正这种错误。本说明书中引用的所有专利和参考文献的全部内容都并入本文以供参考。

实施例

实施例1.具有改善的外显子跳读特性的反义寡核苷酸的选择。

内含子USH2A突变(c.7595-2144A＞G)产生隐蔽剪切供体位点，其导致异常外显子(PE40)包含在USH2A mRNA中(参见WO 2016/005514的图1AB)。添加针对异常外显子的AON将通过阻止剪切所必需的因子如U1-和U2 snRNP复合物和富含丝氨酸-精氨酸的蛋白质结合，来阻止该外显子的插入，从而恢复正常的USH2A剪切和蛋白质合成(WO 2016/005514的图1C)。AON可以靶向剪切位点以及外显子序列。已经表明，在AON诱导外显子跳读的能力与靶序列中预测的SC35剪切因子结合位点的存在之间存在正相关性。为了设计具有高外显子跳读潜力的AON，使用ESE finder 3.0程序仔细检查异常USH2A外显子(152个核苷酸外显子序列加上每侧内含子序列的15个核苷酸)的外显子剪切增强子结合基序。在异常外显子内，预测了分别具有三个和两个SC35结合基序的两个区域(数据未显示)。因此，设计两个AON使得它包含具有SC35基序的这些区域，命名为AON1(SEQ ID NO：1)和AON2(SEQ ID NO：2)，并且与USH2A mRNA互补。AON1和AON2外显子跳读潜力在WO 2016/005514中得到研究(参见其中的图2)。

在该实施例中，显示可以鉴定、产生和使用甚至更有效的AON，其似乎具有比先前测试的AON1和AON2甚至更强的外显子跳读潜力。所有新测试的寡核苷酸的概述在表1中提供。本文使用的所有反义寡核苷酸购自Eurogentec、MicroSynth或TriLink，并且设计具有58℃的Tm，并且在糖链和硫代磷酸酯(PS)主链中具有2′-O-甲基修饰，并且在使用前溶解在磷酸盐缓冲盐水中。

在第一筛选步骤中，AON的效果通过使用剪切报告构建体pCI-Neo-USH2a-PE40(WO2016/005514)检定。该构建体含有由500个核苷酸的内含子序列包围的PE40序列，其已插入衍生自视紫红质基因的外显子3和5之间的内含子中。首先将报告质粒转染到HEK293细胞中，然后进行单独的AON转染。报告质粒使用MaxPEI作为转染试剂进行转染，并使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies)进行随后的AON转染。孵育24小时后，收获细胞并且RNA使用ReliaPrep RNA小量制备试剂盒(Promega)提取，并且cDNA使用MaximacDNA合成试剂盒(Thermo，#EP0734)制备。PE40在成熟mRNA中的包含通过RT-PCR分析，引物位于侧翼视紫红质外显子3和5中。

图1示出USH2a-PE40-1至-7的初始筛选，其使用HEK293细胞中的报告构建体进行，与对照寡核苷酸和来自WO 2016/005514的两种已知AON(AON1和AON2)相比较。在该初始筛选中，与用AON1和AON2(分别在该图中给出为R1和R2)所测定的相比，USH2a-PE40-1、-2、-4和-6未显示出对于PE40外显子跳读的改善。然而，令人惊讶的是，发现USH2a-PE40-3、-5和-7比AON1和AON2显著更有效，其中USH2a-PE40-7最有效。

图2示出PE40的序列(作为5’至3’的RNA)和本文测试的AON的互补位置。USH2a-PE40-1(SEQ ID NO：17)、USH2a-PE40-2(SEQ ID NO：18)和USH2a-PE40-4(SEQ ID NO：20)与AON1(SEQ ID NO：1)和AON2(SEQ ID NO：2)的位置重叠。更有效的USH2a-PE40-3(SEQ IDNO：19)、USH2a-PE40-5(SEQ ID NO：21)和USH2a-PE40-7(SEQ ID NO：23)的结合位点明显位于与AON1和AON2不同的区域，并且与推定的ESE(USH2a-PE40-3和-5)重叠，并与下游剪切位点(USH2a-PE40-7；也参见图1中的下图)重叠。应注意，USH2a-PE40-6(SEQ ID NO：22)的结合位点也在由AON1或AON2结合的区域之外，但与USH2a-PE40-5(SEQ ID NO：21)的结合位点重叠，表明就该区域而言，更有效的靶向区域位于针对PE40序列的5’末端。

基于图1的初始实验，其清楚地显示PE40序列内的其它区域似乎是用于PE40跳读的更有效的“热点”，而不是本领域的AON所靶向的那些，基于所鉴定的三个区域设计了另一组AON，也为了提高合成、摄取、功效和降低免疫原性的容易性：将AON缩短或移位使得它们具有较少的内部二级结构。AON通过包含已知增强结合亲和力的碱基变化进一步修饰：5-甲基-胞嘧啶(5mC)代替胞嘧啶，并且2，6-二氨基嘌呤(DAP)代替腺嘌呤，参见表1。5mC修饰也预计改善AON的安全性，因为它涉及降低RNA和AON的免疫原性。USH2a-PE40-8、-9、-10和-11基于USH2a-PE40-3。USH2a-PE40-12、-13和-14基于USH2a-PE40-5。USH2a-PE40-15、-16、-17和-18基于USH2a-PE40-7。USH2a-PE40-20和-21基于USH2a-PE40-8。USH2a-PE40-22和-23基于USH2a-PE40-11。USH2a-PE40-24、-25、-26和-27基于USH2a-PE40-17。不同新设计的AON的位置也在图2中提供。另外AON的结果在图3和图4中提供。它表明DAP修改导致功效较低(参见USH2a-PE40-26和-27)，因此放弃了这种方法。相反，5mC-修饰的AON通常与具有正常胞嘧啶的相应AON具有相似的功效。然而，可以观察到两个方向的微小差异：5mC-修饰的USH2a-PE40-21的功效略低于相应的USH2a-PE40-8。发现USH2a-PE40-25比原始USH2a-PE40-17略微更有效。此外，已缩短两个核苷酸的两个AON(USH2a-PE40-20和-24，分别对应于-8和-17)显示出与其原始较长对应物基本相同的效果。尽管没有比原始更长的AON更有效，但认为缩短形式是优异的，因为它们更容易合成并且可能具有更好的摄取。基于此，来自这些实验的最有效的AON似乎是缩短的寡核苷酸USH2a-PE40-20和-24(分别为SEQ ID NO：5和6)，以及5mC-修饰的USH2a-PE40-22(SEQ ID NO：35)和USH2a-PE40-25(SEQ ID NO：37)。

表1.如本文测试的反义寡核苷酸的序列细节。PE40-AON1和PE40-AON2在WO 2016/005514中较早描述。X＝5-甲基-胞嘧啶(5mC)代替胞嘧啶(C)；Z＝2，6-二氨基嘌呤(DAP)代替腺嘌呤(A)。

AON名称	SEQ ID NO	序列(5’至3’)
			PE40-AON1	1	GUGUGAUUCUGGAGAGGAAGCUG
PE40-AON2	2	CCCUUAAAAGCCAGCAUACA
			USH2a-PE40-1	17	GGAGAGGAAGCUGAAAGCAG
USH2a-PE40-2	18	GAAGGGUCCUUUAACUUGUG
			USH2a-PE40-3	19	AGAUUCGCUGCUCUUGUUG
USH2a-PE40-4	20	CAUUUUAUUAGCUUCCUGCU
			USH2a-PE40-5	21	UUCAAUUUCAAUUUCAUGAUUUGU
USH2a-PE40-6	22	GAGGUGUUCAAUUUCAAUUUC
			USH2a-PE40-7	23	CUUAAAGAUGAUCUCUUACCUU
USH2a-PE40-8	3	UUCGCUGCUCUUGUUGCAGA
			USH2a-PE40-9	24	GAUUCGCUGCUCUUGUUGCA
USH2a-PE40-10	25	GUAGAUUCGCUGCUCUUGUU
			USH2a-PE40-11	26	GAGUAGAUUCGCUGCUCUUG
USH2a-PE40-12	27	AUUUCAAUUUCAUGAUUUGUUUCC
			USH2a-PE40-13	28	CAAUUUCAAUUUCAUGAUUUGUUU
USH2a-PE40-14	29	UGUUCAAUUUCAAUUUCAUGAUUU
			USH2a-PE40-15	30	AAGAUGAUCUCUUACCUUGGGA
USH2a-PE40-16	31	UAAAGAUGAUCUCUUACCUUGG
			USH2a-PE40-17	4	UUCUUAAAGAUGAUCUCUUACC
USH2a-PE40-18	32	CCUUUUCUUAAAGAUGAUCUCUUA
			USH2a-PE40-19	33	CAAACCCCCACAAUACACAGC
USH2a-PE40-20	5	CGCUGCUCUUGUUGCAGA
			USH2a-PE40-21	34	UUXGXUGXUXUUGUUGXAGA
USH2a-PE40-22	35	GAGUAGAUUXGXUGXUXUUG
			USH2a-PE40-23	36	GCUGAGUAGAUUCGCUGC
USH2a-PE40-24	6	CUUAAAGAUGAUCUCUUACC
			USH2a-PE40-25	37	UUXUUAAAGAUGAUXUXUUAXX
USH2a-PE40-26	38	UCCUUZZZGZUGZUCUCUUZCC
			USH2a-PE40-27	39	UUXUUZZZGZUGZUXUXUUZXX
USH2a-PE40-28	7	XGXUGXUXUUGUUGXAGA
			USH2a-PE40-29	8	XUUAAAGAUGAUXUXUUAXX

进一步测试USH2a-PE40-8、-17、-20、-24、-28和-29(SEQ ID NO：3至8)在外显子跳读能力和体外免疫原性方面的有效性。寡核苷酸USH2a-PE40-8、-20和-28(寡核苷酸(部分)重叠)的靶核苷酸序列如下：5’-TCTGCAACAAGAGCAGCGAA-3’(SEQ ID NO：10)，位于PE40内。寡核苷酸USH2a-PE40-17、-24和-29(寡核苷酸(部分)重叠)的靶核苷酸序列如下：5’-AGG＊TAAGAGATCATCTTTAAGAA-3’(SEQ ID NO：11)，部分位于PE40(下划线AG)内，并且其侧翼区域包含c.7595-2144A＞G突变(带有星号的粗体鸟苷)。

从携带USH2A c.7595-2144A＞G和c.2391_2392del复合杂合突变的USH2患者收集成纤维细胞。在37℃下将细胞保持在含有20％FBS和1％NaPyr(Sigma Life Sciences)的DMEM AQ培养基中。将细胞以1.0x10⁶个细胞/孔的密度铺板。AON与OptiMem(批号：1697387)中的Lipofectamine 2000(Life Technologies，批号：1699509)复合30分钟，然后以100nM的浓度添加到成纤维细胞中。孵育持续另外24小时。在24小时的孵育期结尾，用环己酰胺处理细胞4小时，以抑制无义介导的mRNA衰变。孵育24小时后，收获细胞，并且使用ReliaPrepRNA小量制备试剂盒(Promega)使用制造商的方案提取RNA。随后，使用Maxima cDNA合成试剂盒(Thermo，#EP0734，货号：00335736)，使用表2的方案并遵循制造商的方案制备cDNA。应用表3的移液方案和表4的引物，使用微滴式数字PCR(ddPCR)(QX2000微滴读数器)测定PE40和野生型cDNA的水平。通过Quanta Life Software和Excel分析数据。使用本领域技术人员已知的方法将GUSB(Applied Biosystems，货号：P160210-006E01)用作管家基因。

图5示出用八种不同的AON处理的患者成纤维细胞和一种未处理(NT)的样品中对于GUSB表达水平校正的与野生型相比表达PE40的微滴数量。显然，尤其是AON1、AON2、USH2a-PE40-17(SEQ ID NO：4)和USH2a-PE40-24(SEQ ID NO：6)(在该图5中缩写为USH-PE0-17和USH-PE40-24)，似乎在增强野生型水平的表现方面最有效，并且优于两种已知的寡核苷酸AON1和AON2，而其它四种AON的效果较差。重要的是，进一步观察到USH2a-PE40-17和USH2a-PE40-24能够降低PE40水平，这是AON1和AON2未观察到的效果，表明这两种新的假外显子跳读反义寡核苷酸(USH2a-PE40-17和USH2a-PE40-24)在该设置中比两种已知的寡核苷酸表现得更好。进一步注意到，与两种已知的寡核苷酸AON1和AON2相比，其它四种寡核苷酸(USH2a-PE40-8、-20、-28和-29也能够降低PE40水平，这使得这四种寡核苷酸也优于本领域的寡核苷酸。

表2：cDNA制备

基因特异性引物用于样品，并且随机六聚体用于GUSB管家。

表3.

移液方案ddPCR

	实验	对照
			探针预混液	11μl	11μl
引物1	450nM	450nM
			引物2	450nM	450nM
探针1	250nM	250nM
			探针2	250nM	250nM
模板	至多330ng	0μl
			水	加至22μl终体积	加至22μl终体积
总计	22μl每样品	22μl每样品

表4.

多重ddPCR引物和探针

实施例2.新反义寡核苷酸的体外毒性。

寡核苷酸具有引起脊椎动物先天免疫系统的所谓模式识别受体(PRR)激活的潜力(Bauer等人2008.Immunobiology 213：315-328)。研究最充分的PRR受体家族是Toll样受体(TLR)。TLR是一类在先天免疫系统中起关键作用的蛋白质。它们是单一、跨膜的、非催化性的受体，通常在巨噬细胞和树突状细胞中表达，识别衍生自微生物的结构保守分子。由不同类型的核酸激活的TLR是位于内体上的TLR：TLR3识别双链RNA；TLR7/8识别双链和单链RNA。

在PRR识别这些组分后，触发特定的“抗微生物”免疫应答。TLR激活导致激活的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)、干扰素调节因子3(IRF-3)和激活蛋白1(AP-1)的激活(Kawasaki 2014.Front Immunol 25：461)。AP-1、IRF-3和NF-κB的激活导致炎性细胞因子、I型干扰素和先天免疫应答的其它介体的产生。这些过程不仅触发了直接的宿主防御性应答，如炎症，而且还引发和协调抗原特异性获得性免疫应答。

如前所述(Lankveld 2010.Methods Mol Biol 598：401-423)，使用原代人外周血单核细胞(PBMC)的体外暴露来评估(全身)药物特异性免疫应答和免疫毒性。使用PBMC的体外测定是使用产生(炎性)细胞因子作为全身免疫应答的替代标志物的成熟临床前测试。PBMC测定使得能够预测作为研究化合物的免疫原性和变应原性潜力因素的耐受性，并且能够估计这些化合物的安全剂量范围。

为了研究USH2a PE40-20、USH2a PE40-24、USH2a PE40-28和USH2a PE40-29，使用内部分离的PBMC，从健康血库供体的血沉棕黄层获得。在用浓度为1μM和4μM的寡核苷酸刺激24小时后，评估培养上清液中关键促炎细胞因子的产生。此外，通过测量培养上清液中的荧光试卤灵来分析用寡核苷酸处理后PBMC的活力，以评估USH2a-PE40AON的潜在细胞毒性作用。活细胞将非荧光刃天青转化为荧光试卤灵(O’Brien等人2000.Eur J Biochem 267：5421-5426)。

用100ng/ml的阳性对照LPS(TLR4激动剂)和1μM的R848(TLR7/8激动剂)刺激人PBMC，导致培养上清液中所有测量的细胞因子、MCP-1的浓度显著增加。此外，用R848刺激诱导相似的细胞因子模式，尽管程度较小。图6A中示出了热图，其描绘用本发明的寡核苷酸或阳性对照刺激后与用盐水处理的人PBMC相比，培养上清液中细胞因子浓度的显著水平。重要的是，用浓度为1和4μM的本发明的寡核苷酸刺激人PBMC不会导致培养上清液中任何测量的细胞因子的浓度增加或导致浓度非常微小地增加。最后，在用寡核苷酸处理后24小时没有细胞毒性的迹象(图6B)。

实施例3.在USH2患者产生的视杯中的USH2A前mRNA中的PE40跳读

由于显而易见的原因视网膜无法从USH2患者获得并用于体外研究。作为这种临床前研究的替代方案，可以产生类似于这种患者视网膜材料的类器官，本文称为视杯，有时也称为眼杯。来自Usher综合征II型患者的成纤维细胞用于产生视杯，这些细胞具有USH2Ac.7595-2144A＞G(p.Lys2532Thrfs*56)和c.2299delG(p.Glu767Serfs*21)的复合杂合性突变。使用表达Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的四种慢病毒改编成纤维细胞，其由RadboudUMC干细胞技术中心慷慨提供。将克隆冷冻保存在大约第6代，并通过免疫细胞化学进一步分析多能干细胞标志物SSEA-4、NANOG、TRA1-81和OCT3/4的表达。总共产生3个单个克隆并储存。这些克隆通过了所有限定的质量控制(干细胞标志物的激活(RT-qPCR)和干细胞和多能性标志物的表达(IHC)(数据未显示)。将iPSC细胞系培养到视杯中，如前所述(Zhong等人2014.Nature Comm 5：4047；1-12)。将iPSC分化成小丛并用mTeSR1培养基和10μM布雷他汀(Sigma)悬浮培养以诱导聚集体形成。将聚集体转移到含有DMEM/F12、1％N2补充剂、1x最小必需培养基-非必需氨基酸、2μg ml^-1肝素(Sigma)的神经诱导培养基中。将聚集体接种到涂有基质胶的培养皿上。培养基每天更换。分化四周后，将神经视网膜区域手动分离，并在37℃下在湿润的培养箱中在含有2％B27、1xNEAA和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基中悬浮培养。培养基每周更换两次。培养箱中它们逐渐形成3D视杯。在成功生成iPSC衍生的视杯后，通过每隔一天更新含有AON的培养基，将它们用USH2a-PE40-24以2μM和10μM处理一个月。进行USH2A转录物分析以确定PE40包含在成熟mRNA中，引物为5′-GCTCTCCCAGATACCAACTCC-3’(SEQ ID NO：40)和5′-GATTCACATGCCTGACCCTC-3’(SEQ ID NO：41)，分别位于侧翼外显子39和42中。根据提供的方案，总RNA使用Nucleospin RNA II分离试剂盒(MACHEREY-NAGEL#740955.50，Düren-Germany)从iPSC和视杯中分离。随后，使用SuperScript VILO逆转录酶试剂盒(ThermoFisher Scientific；目录号#11755050；批号#1718541)将0.5-1.0μg总RNA用于cDNA合成。随后使用正向和反向引物扩增USH2A、LIN28A、OCT3/4、NANOG和SOX2。管家基因GUSB用作参考。GoTaq(Promega A6001)用于在qPCR机器中三次重复扩增USH2A、LIN28A、OCT3/4、NANOG、SOX2和GUSB cDNA。未经处理的视杯将显示野生型条带(900bp)和含有PE40序列的条带(1052bp)，其易于在凝胶中区分。

图7中提供的结果显示，当在USH2患者成纤维细胞产生的视杯上使用时，两种浓度(2μM和10μM)的寡核苷酸USH2a-PE40-24(SEQ ID NO：6)均足以诱导PE40的完全跳读，因为没有检测到包含PE40的转录物。尚不清楚对照(ctrl)泳道中最终的上部非特异性微弱条带是什么。

从这些结果可以得出结论，反义寡核苷酸，在该具体例下为USH2a-PE40-24，能够使PE40从类似于患有Usher综合征II型(杂合PE40)患者的视网膜的类器官中的USH2A前mRNA中有效地跳读。

Claims

1.反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)，其中所述AON包含与SEQ ID NO：45、46或47的至少18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的序列。

2.反义寡核苷酸(AON)，其能够诱导从人USH2A前mRNA跳读假外显子40(PE40)，其中所述AON包含选自以下序列组中任一者的序列：

(i)SEQ ID NO：6、4、8、23、30、31、32、37；

(ii)SEQ ID NO：3、5、7、19、24、25、26、34、35、36；和

(iii)SEQ ID NO：21、27、28、29。

3.根据权利要求1或2所述的AON，其中USH2A mRNA中PE40的出现是由于USH2A基因中的c.7595-2144A＞G突变。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的AON，其中所述AON是包含至少一个2′-O烷基修饰比如2′-O-甲基、2′-O-乙基、或2′-O-丙基的寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)。

5.根据权利要求4所述的AON，其中所述AON中的所有核苷酸均为2′-O-甲基修饰的。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的AON，其中所述AON具有至少一个硫代磷酸酯键。

7.根据权利要求6所述的AON，其中所有连续核苷酸均通过硫代磷酸酯键互相连接。

8.病毒载体，其在置于有助于表达如权利要求1至3中任一项所述的AON的条件下时表达所述AON。

9.药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的AON、或根据权利要求8所述的病毒载体，和药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物用于玻璃体内施用。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于玻璃体内施用，并且给药剂量范围为每只眼0.05mg至5mg、优选0.1mg至1mg的总AON，比如每只眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg的总AON。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的AON、根据权利要求8所述的载体、或根据权利要求9或10所述的组合物，用作药物。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的AON、根据权利要求8所述的载体、或根据权利要求9或10所述的组合物，用于治疗、预防或延迟USH2A-相关疾病，比如Usher综合征II型，或需要从USH2A前mRNA跳读PE40的病症。

13.根据权利要求1至7中任一项所述的AON、根据权利要求8所述的载体、或根据权利要求9或10所述的组合物，在制备用于治疗、预防或延迟USH2A-相关疾病或需要从USH2A前mRNA跳读PE40的病症的药物中的用途。

14.用于在细胞中从人USH2A前mRNA跳读PE40的方法，所述方法包括向所述细胞施用根据权利要求1至7中任一项所述的AON、根据权利要求8所述的载体、或根据权利要求9或10所述的组合物；并允许AON诱导、引起或刺激从人USH2A前mRNA跳读PE40。

15.用于治疗患有USH2A-相关疾病或需要从USH2A前mRNA跳读PE40的病症的个体的所述疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体的细胞施用根据权利要求1至7中任一项所述的AON、根据权利要求8所述的载体、或根据权利要求9或10所述的组合物，并且允许所述AON诱导、引起或刺激从人USH2A前mRNA跳读PE40。

16.根据权利要求13所述的用途、或根据权利要求15所述的方法，其中所述USH2A-相关疾病或需要从USH2A前mRNA跳读PE40的病症是Usher综合征II型。