JP7043082B2 - 眼疾患を処置するオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
偽エクソン40;PE40
5’-CTTCCTCTCCAGAATCACACAAGTTAAAGGACCCTTCTGCAACAAGAGCAGCG
AATCTACTCAGCCAGAGCAGGAAGCTAATAAAATGTATGCTGGCTTTTAAGGGGGA
AACAAATCATGAAATTGAAATTGAACACCTCTCCTTTCCCAAG-3’(配列番号9)
- USH2a-PE40-3(配列番号19)に基づくAONは、配列番号3、5、7、24、25、26、34、35、および36のAONであり、USH2a-PE40-8(配列番号3)、USH2a-PE40-11(配列番号26)、USH2a-PE40-20(配列番号5)、USH2a-PE40-22(配列番号35)およびUSH2a-PE40-28(配列番号7)が最良に機能する(図4および5を参照)。
- USH2a-PE40-5(配列番号21)に基づくAONは、配列番号27、28、および29のAONである。
- USH2a-PE40-7(配列番号23)に基づくAONは、配列番号4、6、8、30、31、32、および37のAONであり、USH2a-PE40-17(配列番号4)、USH2a-PE40-24(配列番号6)およびUSH2a-PE40-29(配列番号8)が最良に機能し(図4および5を参照)、ここでUSH2a-PE40-17および-24は、すべての他のAONの機能を凌駕しさえする。
改善されたエクソンスキッピング特性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択
イントロンUSH2A変異(c.7595-2144A>G)は、隠れたスプライスドナー部位を作り出し、これはUSH2A mRNA内への異常なエクソン(PE40)の包含を生じさせる(国際公開第2016/005514号パンフレットの図1ABを参照)。異常なエクソンに対するAONを添加することは、U1-およびU2 snRNP複合体、ならびにセリン-アルギニンリッチタンパク質などのスプライシングに必須な因子の結合を防止することによってこのエクソンの挿入を防止し、それによって正常なUSH2Aスプライシングおよびタンパク質合成を回復するであろう(国際公開第2016/005514号パンフレットの図1C)。AONは、スプライス部位に加えて、エクソン配列を標的とすることができる。AONがエクソンスキッピングを誘導する能力と、標的配列における予測されたSC35スプライス因子結合部位の存在との間には、正の相関が存在することが示唆されていた。高いエクソンスキッピング潜在能力を備えたAONを設計するために、異常なUSH2Aエクソン(152ヌクレオチドのエクソン配列に、15ヌクレオチドのイントロン配列を両側に加えたもの)を、ESE finder 3.0プログラムを使用して、エクソンスプライスエンハンサー結合モチーフについて精査した。異常なエクソン内に、それぞれ3つおよび2つのSC35結合モチーフを備えた2つの領域が予測された(データは示さず)。よって、SC35モチーフを備えたこれらの領域を包含するように2つのAONを設計し、AON1(配列番号1)およびAON2(配列番号2)と命名したが、これらはUSH2A mRNAに相補的である。AON1およびAON2エクソンスキッピング潜在能力は、国際公開第2016/005514号パンフレットにおいて研究された(そこにおける図2を参照)。
新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ(in vitro)の毒性。
オリゴヌクレオチドは、脊椎動物の自然免疫系のいわゆるパターン認識受容体(PRR)の活性化を引き起こす潜在能力を有する(Bauer et al. 2008. Immunobiology 213:315-328)。PRR受容体の最もよく研究されたファミリーは、toll様受容体(TLR)である。TLRは、自然免疫系における主要な役割を果たすタンパク質のクラスである。これらは単独の、膜貫通型の、非触媒性受容体であり、微生物由来の構造的に保存された分子を認識するマクロファージおよび樹状細胞において通常発現する。異なるタイプの核酸によって活性化されるTLRは、エンドソーム上に位置するものである:TLR3は二本鎖RNAを認識し;TLR7/8は二本鎖および一本鎖RNAを認識する。
USH2患者から生成された眼杯におけるUSH2AプレmRNA中のPE40スキッピング
自明な理由のために、網膜は、USH2患者から得ることも、インビトロ(in vitro)での研究のために使用することもできない。そのような前臨床研究のための代替案として、そのような患者網膜材料を模したオルガノイドを生成することができ、これは本明細書において眼杯(optic cup)と呼ばれ、時には眼杯(eye cup)とも呼ばれる。複合ヘテロ接合性のUSH2A c.7595-2144A>G(p.Lys2532Thrfs*56)およびc.2299delG(p.Glu767Serfs*21)変異を有する、アッシャー症候群タイプII患者からの線維芽細胞を、眼杯生成のために使用した。Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycを発現する、ラドバウドUMC幹細胞技術センター(Radboud UMC Stem Cell Technology Center)によって寛大にも提供された4種のレンチウイルスを使用して、線維芽細胞を再プログラミングした。クローンはおよそ第6継代で凍結保存し、免疫細胞化学によって、多能性幹細胞マーカーであるSSEA-4、NANOG、TRA1-81およびOCT3/4の発現についてさらに分析した。全部で3つの個別のクローンを生成し、保存した。これらのクローンは、規定のすべての品質管理(幹細胞マーカーの活性化(RT-qPCR)ならびに幹細胞および多能性マーカー(IHC)の発現)に合格した(データは示さず)。iPSC系統は、以前記載されたように(Zhong et al 2014. Nature Comm 5:4047;1-12)眼杯へと培養した。iPSCは小塊へと分化させ、mTeSR1培地および10μMのブレビスタチン(Sigma)を含む懸濁液中で培養して、凝集塊形成を誘導した。凝集塊は、DMEM/F12、1%のN2サプリメント、1×最小必須培地-非必須アミノ酸、2μg/mlのヘパリン(Sigma)を含有する神経誘導培地に移した。凝集塊を、マトリゲルコートしたディッシュ上に播種した。培地は毎日交換した。4週間の分化後、神経網膜ドメインを手動で剥離し、2%のB27、1×NEAA、および1%の抗生物質-抗真菌物質を添加したDMEM/F12培地における懸濁液中で、摂氏37度の湿潤インキュベーターにおいて培養した。培地は1週間に2回交換した。インキュベーター内で、これらは次第に3次元の眼杯を形成した。iPSC由来眼杯の生成の成功後、これらは、USH2a-PE40-24によって、1カ月にわたって2μMおよび10μMで、AONを含む培地を1日おきに新しくすることによって処置した。成熟mRNA内へのPE40の包含を決定するために、隣接するエクソン39および42にそれぞれ位置するプライマー5’-GCTCTCCCAGATACCAACTCC-3’(配列番号40)および5’-GATTCACATGCCTGACCCTC-3’(配列番号41)によって、USH2A転写産物分析を実施した。提供されたプロトコールに従って、Nucleospin RNA II単離キット(MACHEREY-NAGEL、#740955.50、Duren-Germany)を使用して、iPSCおよび眼杯から総RNAを単離した。その後、SuperScript VILO逆転写酵素キット(ThermoFisher Scientific;カタログ#11755050;ロット#1718541)によるcDNA合成のために、0.5~1.0μgの総RNAを使用した。USH2A、LIN28A、OCT3/4、NANOGおよびSOX2を、その後、フォワードおよびリバースプライマーを使用して増幅した。参照としてハウスキーピング遺伝子であるGUSBを使用した。GoTaq(Promega A6001)を使用して、USH2A、LIN28A、OCT3/4、NANOG、SOX2およびGUSB cDNAを三連で、qPCR機器で増幅した。未処置眼杯は、野生型バンド(900bp)およびPE40配列を含むバンド(1052bp)を明らかにするが、これはゲルにおいて容易に識別される。
本発明によれば、以下が提供される。
[1]
ヒトUSH2AプレmRNAからの偽エクソン40(PE40)のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、配列番号45、46または47の少なくとも18、19、20、21、22、23、または24個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)。
[2]
ヒトUSH2AプレmRNAからの偽エクソン40(PE40)のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON):
(i)配列番号6、4、8、23、30、31、32、37;
(ii)配列番号3、5、7、19、24、25、26、34、35、36;および
(iii)配列番号21、27、28、29。
[3]
USH2AmRNAにおけるPE40の出現が、USH2A遺伝子におけるc.7595-2144A>G変異に起因するものである、上記[1]または[2]に記載のAON。
[4]
2´-O-メチル、2´-O-エチル、または2´-O-プロピルなどの少なくとも1つの2´-O-アルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド(RNAオリゴヌクレオチド)である、上記[1]から[3]までのいずれかに記載のAON。
[5]
前記AONにおけるすべてのヌクレオチドが2´-O-メチル修飾されている、上記[4]に記載のAON。
[6]
少なくとも1つのホスホロチオアート結合を有する、上記[1]から[5]までのいずれかに記載のAON。
[7]
すべての連続するヌクレオチドが、ホスホロチオアート結合によって相互連結している、上記[6]に記載のAON。
[8]
前記AONの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、上記[1]から[3]までのいずれかに記載のAONを発現するウイルスベクター。
[9]
上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、または上記[8]に記載のウイルスベクターおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、硝子体内投与のためのものである医薬組成物。
[10]
硝子体内投与のためのものであり、1つの眼あたり0.05mg~5mg、好ましくは0.1~1mgの総AON、例えば1つの眼あたり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0mgの総AONの範囲の量で投薬される、上記[9]に記載の医薬組成物。
[11]
医薬としての使用のための、上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、上記[8]に記載のベクター、または上記[9]もしくは[10]に記載の組成物。
[12]
アッシャー症候群タイプIIなどのUSH2A関連疾患、またはUSH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための、上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、上記[8]に記載のベクター、または上記[9]もしくは[10]に記載の組成物。
[13]
USH2A関連疾患、またはUSH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための医薬の調製における、上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、上記[8]に記載のベクター、または上記[9]もしくは[10]に記載の組成物の使用。
[14]
細胞においてヒトUSH2AプレmRNAからPE40をスキップする方法であって、前記細胞に、上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、上記[8]に記載のベクター、または上記[9]もしくは[10]に記載の組成物を投与すること;および、前記AONが前記ヒトUSH2AプレmRNAからのPE40のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む方法。
[15]
USH2A関連疾患、またはUSH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の、それを患っている個体における処置のための方法であって、前記個体の細胞に、上記[1]から[7]までのいずれかに記載のAON、上記[8]に記載のベクター、または上記[9]もしくは[10]に記載の組成物を投与すること、および、前記AONがヒトUSH2AプレmRNAからのPE40のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む方法。
[16]
前記USH2A関連疾患、またはUSH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする前記状態が、アッシャー症候群タイプIIである、上記[13]に記載の使用、または上記[15]に記載の方法。
Claims (17)
- ヒトUSH2AプレmRNAからの偽エクソン40(PE40)のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、配列番号46または47の少なくとも18、19、20、21、22、23、または24個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)。
- ヒトUSH2AプレmRNAからの偽エクソン40(PE40)のスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、以下の配列群のいずれかから選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON):
(i)配列番号3、5、7、19、24、25、26、34、35、36;および
(ii)配列番号21、27、28、29。 - USH2AmRNAにおけるPE40の出現が、USH2A遺伝子におけるc.7595-2144A>G変異に起因するものである、請求項1または2に記載のAON。
- 2´-O-メチル、2´-O-エチル、または2´-O-プロピルなどの少なくとも1つの2´-O-アルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド(RNAオリゴヌクレオチド)である、請求項1から3までのいずれか一項に記載のAON。
- 前記AONにおけるすべてのヌクレオチドが2´-O-メチル修飾されている、請求項4に記載のAON。
- 少なくとも1つのホスホロチオアート結合を有する、請求項1から5までのいずれか一項に記載のAON。
- すべての連続するヌクレオチドが、ホスホロチオアート結合によって相互連結している、請求項6に記載のAON。
- 前記AONの発現に寄与する条件下に置かれた場合に、請求項1から3までのいずれか一項に記載のAONを発現するウイルスベクター。
- 請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、または請求項8に記載のウイルスベクターおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、硝子体内投与のためのものである医薬組成物。
- 硝子体内投与のためのものであり、1つの眼あたり0.05mg~5mg、好ましくは0.1~1mgの総AON、例えば1つの眼あたり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0mgの総AONの範囲の量で投薬される、請求項9に記載の医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、請求項8に記載のベクター、または請求項9もしくは10に記載の組成物。
- アッシャー症候群タイプIIなどのUSH2A関連疾患、または前記USH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための、請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、請求項8に記載のベクター、または請求項9もしくは10に記載の組成物。
- USH2A関連疾患、または前記USH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の処置、防止または遅延のための医薬の調製における、請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、請求項8に記載のベクター、または請求項9もしくは10に記載の組成物の使用。
- 細胞においてヒトUSH2AプレmRNAからPE40をスキップする、エクスビボまたはインビトロでの方法であって、前記細胞に、請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、請求項8に記載のベクター、または請求項9もしくは10に記載の組成物を投与すること;および、前記AONが前記ヒトUSH2AプレmRNAからのPE40のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む方法。
- USH2A関連疾患、またはUSH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする状態の、それを患っている個体における処置のための方法に使用するための医薬組成物であって、
請求項1から7までのいずれか一項に記載のAON、請求項8に記載のベクター、または請求項9もしくは10に記載の組成物を含んでおり、
前記方法が、前記個体の細胞に、前記AON、前記ベクター、または前記組成物を投与すること、および、前記AONが前記ヒトUSH2AプレmRNAからのPE40のスキッピングを誘導し、引き起こし、または刺激することを可能にすることを含む、医薬組成物。 - 前記USH2A関連疾患、または前記USH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする前記状態が、アッシャー症候群タイプIIである、請求項13に記載の使用。
- 前記USH2A関連疾患、または前記USH2AプレmRNAからのPE40のスキップを必要とする前記状態が、アッシャー症候群タイプIIである、請求項15に記載の医薬組成物。
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