JP2016530887A

JP2016530887A - Ｓｍｎ関連病理を処置するためのアンチセンスオリゴマーおよび方法

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Publication number: JP2016530887A
Application number: JP2016541743A
Authority: JP
Inventors: スティーブンドナルドウィルトン，; スーフレッチャー，; ローレンルイーズプライス，; チャレルムチャイミトルパント，
Original assignee: University of Western Australia
Current assignee: University of Western Australia
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-10-06
Also published as: WO2015035460A1; EP3044317A1; US20170051277A1

Abstract

生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド。概して、本発明の一態様によれば、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部においてｍＲＮＡ前駆体スプライシングを修飾するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。好ましくは、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部においてエクソン包含を誘導するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。

Description

本発明は、特に生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子転写物におけるスプライス修飾を容易にするのに適したアンチセンスオリゴマーおよび組成物に関する。本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴマーを使用してこれらの遺伝子転写物におけるエクソン包含を誘導する方法、ならびに本発明の方法における使用に適合された治療用組成物も提供する。

背景技術についての以下の説明は、本発明の理解を容易にすることのみを意図する。この説明は、参照されている資料のいずれかが、本出願の優先日の時点で共通の一般知識の一部であるかまたは一部であったことを承認するものでも認めるものではない。

脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、ヒトにおいて２番目に多い常染色体劣性障害であり、２歳未満の子供における死亡の主な遺伝的原因である。ＳＭＡの全発生率は生児出生１０，０００人に１人程度であり、保因者頻度は１／３５である（Ｐｒｉｏｒ、２００４年）。３つの形態のＳＭＡが認識されており、ＳＭＡＩ型は最も重症であり、ＳＭＡＩＩＩ型はこのスケールのより軽症の方である。ＳＭＡＩに罹患している子供は決して座ることなく、通常、生後１年以内に死亡するのに対して、ＳＭＡＩＩＩに罹患している子供は歩く能力を獲得し、正常な平均余命を有する。中間の形態（ＳＭＡＩＩ）は、支えなしで座ることができるが、決して歩けるようにならない個体を表している。

ＳＭＡは、通常、第５染色体上の生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子のゲノム欠失により引き起こされ、それにより機能的ＳＭＮタンパク質が喪失する。ＳＭＮは遍在的に発現され、主に細胞質および核「ｇｅｍｓ」（コイル小体対）に位置する。複数の構成成分がＳＭＮと相互作用すると特定されており、転写、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング、ｍＲＮＡ輸送およびリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の構築を含む、様々な細胞プロセスへのその関与を示している（Ｇｕｂｉｔｚ、２００４年、Ｈｕａ、２００４年、Ｍｅｉｓｔｅｒ、２００１年、Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ、２００２年）。

ＳＭＮ遺伝子は２５ｋｂにわたり、１．６２ｋｂの完全長ＳＭＮ転写物（ＳＭＮ−ＦＬ）またはエクソン７を欠失するより短い転写物（ＳＭＮΔ７）にプロセシングされる。ヒトはＳＭＮ遺伝子の余分なコピーを有しているが、セントロメアＳＭＮ２遺伝子（複数可）が高コピー数で存在していない限り、ＳＭＮ１喪失を十分に補うことができない。なぜなら、ＳＭＮ２遺伝子転写物の大部分は、非生産的スプライシングに起因してエクソン７を欠失しているからである。

ヒトＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子はわずかなヌクレオチド置換が異なるだけである：エクソン内に２つの置換が含有され、そのどちらもコード配列を変えず、イントロンにおいて８つの変化が生じている（Ｍｏｎａｎｉ、１９９９年）。これらの２つの遺伝子は同一のタンパク質を潜在的にコードできるが、ＳＭＮ２エクソン７の開始付近のＣ＞Ｔ多型が、ほとんどのＳＭＮ２遺伝子転写物からのエクソンの喪失をもたらす主な要因の１つとみなされている（図１）。現在、エクソン７の定義に必要なエンハンサー（ＳＦ２／ＡＳＦ）の抑止と、サイレンサーエレメントの同時生成の組合せにより、エクソン７認識が抑制され、次いでイントロン６および７を有する成熟ｍＲＮＡからエクソン７が除去されると考えられている。

さらに、エクソン７（Ｈｕａ、２００７年）ならびにイントロン６および７（Ｓｉｎｇｈ、２００７年、Ｈｕａ、２００８年）において他のサイレンサーモチーフが特定されており、予測される弱いエクソン７アクセプターおよびドナー部位もまた、このエクソンを成熟転写物から脱落させやすくしていると考えられる（Ｌｉｍ、２００１年）。ＳＭＮΔ７ｍＲＮＡは、切断された非機能的タンパク質に翻訳され、それは不安定であり、自己会合できず、それは疾患重症度と相関する性質である。

神経細胞において、正常に発現されたＳＭＮ２転写物の９０％はエクソン７を欠失しており、エクソン７を含有しているＳＭＮ２転写物の残りの１０％はＳＭＮ１の非存在下で運動ニューロン保護を提供するのに不十分であるが、タンパク質のレベルは、他の神経集団を含む、多くの他の組織を保護するようである。ＳＭＮ２の増加したコピーにより、より高いレベルの完全長ＳＭＮ転写物およびタンパク質が導かれ、それは表現型の重症度をモジュレートする。実際に、ＳＭＮ１を欠失しているが、ＳＭＮ２の５〜６個のコピーを保有しているヒトは、正常であると報告されており（Ｓｗｏｂｏｄａ、２００５年）、さらにＳＭＮ２の８個のコピーはＳＭＮ−／−マウスにおける表現型を回復させる（Ｍｏｎａｎｉ、２０００年）。
いくつかの研究において、ＳＭＮのレベルに対していくらかの少しの効果を有していたアンチセンスオリゴマー（ＡＯ）が特定されているが、試験したＡＯの多くは、エクソンスキッピングまたは促進された非生産的エクソン７スキッピングのいずれに対する効果も有さなかった（Ｈｕａ２００７年、Ｈｕａ２００８年、Ｌｉｍ２００１年、Ｍａｄｏｃｓａｉ、２００５年）。

ＰｒｉｏｒＴＷ，ｅｔａｌ．ＨｏｍｏｚｙｇｏｕｓＳＭＮ１ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎｕｎａｆｆｅｃｔｅｄｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｂｙＳＭＮ２．ＡｍＪＭｅｄＧｅｎｅｔＡ．２００４Ｏｃｔ１５；１３０Ａ（３）：３０７−１０．

こうした背景の下で、脊髄性筋萎縮症を含む筋萎縮症を処置するための治療の開発が求められている。

概して、本発明の一態様によれば、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部においてｍＲＮＡ前駆体スプライシングを修飾するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。好ましくは、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部においてエクソン包含を誘導するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。例えば、本発明の一態様において、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載される配列を含む群から選択される。

ＳＭＮ遺伝子はＳＭＮ２であってもよい。標的部位はＳＭＮ２遺伝子転写物におけるサイレンサー部位であってもよい。

したがって、一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７の包含を誘導できるアンチセンスオリゴマーであってもよい。このように、アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８における標的配列に向けられる分子であってもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載される配列を含む群から選択される。

アンチセンスオリゴマーは、成熟ＳＭＮ２ｍＲＮＡにおけるエクソン７包含、および所望の場合、イントロン７包含を誘導できるアンチセンスオリゴマーであってもよい。このように、本発明のアンチセンスオリゴマーは、エクソン７およびイントロン７を含有するＳＭＮ２転写物を生成するために使用されてもよく、ここで、エクソン７は正常な終止コドンを含有し、イントロン７はＳＭＮ遺伝子転写物の３’ＵＴＲの一部になる。好ましくは、このようなアンチセンスオリゴマーは表２のものから選択される。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、選択されたＳＭＮ標的部位と結合できるアンチセンスオリゴマーであるように選択されてもよく、ここで、標的部位は、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはエクソンスプライシングエレメントから選択されるｍＲＮＡスプライシング部位である。

本発明のなおさらなる態様によれば、アンチセンスオリゴマーに基づいた治療に使用するための本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーが提供される。

より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号７〜１７および２９〜６４、具体的には配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、より具体的には配列番号７〜１３、最も具体的には配列番号１０のいずれか１つまたは複数、ならびにそれらの組合せまたはカクテルからなる群から選択されてもよい。これは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列とハイブリダイズできる配列、それらと相補的な配列、ＳＭＮ遺伝子転写物においてｍＲＮＡ前駆体プロセシング活性を保有またはモジュレートする、それらの修飾塩基、修飾骨格および機能的切断部または伸長部を含有する配列を含む。

本発明はまた、２つまたはそれ超のこのようなアンチセンスオリゴマーを含む構築物を含む、ＳＭＮ遺伝子転写物においてエクソン包含を誘導するために選択された標的と結合できる２つまたはそれ超のアンチセンスオリゴマーの組合せにも及ぶ。

有利には、本発明はまた、転写物におけるＳＭＮ２イントロン７およびエクソン７包含を増強またはモジュレートする方法であって、本発明の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを使用するステップを含む方法を提供する。同様に、本発明はまた、それを必要とする対象における脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはＳＭＡに関連する状態を処置する方法であって、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与するステップを含む方法も提供する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。

本発明の別の態様によれば、患者におけるＳＭＮ関連病理を処置する方法であって、
ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを含む組成物を患者に投与するステップ
を含む方法が提供される。

本発明は、患者におけるＳＭＮ関連病理を処置するための医薬、予防または治療用組成物であって、
ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマー、ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む組成物をさらに提供する。

組成物は、約１ｎＭ〜１０００ｎＭの本発明の各々の所望のアンチセンスオリゴマーを含んでもよい。好ましくは、組成物は、約１０ｎＭ〜５００ｎＭ、最も好ましくは１ｎｍから１０ｎＭの間の本発明の各々のアンチセンスオリゴマーを含んでもよい。

本発明の別の態様によれば、ＳＭＮ関連病理をモジュレートまたは制御するための医薬の製造における本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの使用が提供される。したがって、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはＳＭＡに関連する状態を処置するための医薬を製造するための、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量の使用が提供される。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。

ＳＭＮ関連病理は、機能的ＳＭＮ遺伝子産物の喪失から生じる脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの筋萎縮症であってもよい。

本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー、適切な担体およびその使用のための指示書を含むキットが提供される。

本発明は、患者への送達に適した形態で、ＳＭＮ関連病理などの遺伝的障害の予防的または治療的処置に役立つように適合された１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーをさらに提供する。

別の態様によれば、本発明は、ＳＭＮ遺伝子において有害突然変異が存在し、スプライス操作によって変異の作用が抑制され得る、遺伝的疾患または病理を患っている患者を処置する方法であって、
ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを選択するステップ、および
ｂ）アンチセンスオリゴマーを患者に投与するステップ
を含む方法を提供する。

本発明はまた、ＳＭＮ関連遺伝的疾患を処置するための医薬を製造するための、本明細書に記載される精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用を提供する。

本発明は、なおさらなるその態様によれば、本発明のアンチセンスオリゴマー配列のｃＤＮＡまたはクローニングされたコピー、および本発明のアンチセンスオリゴマー配列を含有するベクターに及ぶ。本発明はさらにまた、このような配列および／またはベクターを含有する細胞にも及ぶ。

患者は、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。

本発明は、患者における不正確なＳＭＮ発現によって特徴付けられる状態、特にＳＭＡに関連する状態を処置する方法であって、
ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの有効量を患者に投与するステップ
を含む方法をさらに提供する。

好ましくは、投与されるアンチセンスオリゴマーは、患者がその患者において不正確なＳＭＮ発現を生じるという点で特定の遺伝的病変に関係がある。

さらに、本発明は、ＳＭＡを防止または少なくとも最小化するために患者を予防的に処置する方法であって、
ａ）１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物の有効量を患者に投与するステップ
を含む方法を提供する。

本発明は、ＳＭＮ遺伝子転写物におけるスプライシングを操作する方法であって、
ａ）本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーの１つまたは複数を準備し、オリゴマーを標的核酸部位と結合させるステップ
を含む方法をさらに提供する。

本発明のなおさらなる態様によれば、不正確、不完全または欠陥があるＳＭＮ−スプライシングによって引き起こされる病理を有する患者を処置する方法であって、
ａ）本明細書に記載される１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーまたは本明細書に記載される組成物の有効量を患者に投与するステップ
を含む方法が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載される核酸配列のＤＮＡ等価物を含むＳＭＮについてのスプライス操作標的核酸配列が提供される。配列は、好ましくは、配列番号７〜１７および２９〜６４、好ましくは配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、最も好ましくは配列番号１０、ならびにそれらと相補的な配列からなる群から選択される。

本発明のさらなる態様は、ここで、付随の非限定的な実施例および図面を参照して記載される。

図１は、エクソン７におけるＣ（ＳＭＮ１）またはＴ（ＳＭＮ２）多型に応答するＳＭＮ遺伝子の主要な代替スプライシングを示すＳＭＮ１およびＳＭＮ２スプライシングパターンの図表示を示す。ＳＭＮ１遺伝子発現は、典型的に、エクソン７（ＳＭＮ−ＦＬ）を含有する転写物の９０％およびエクソン７ＳＭＮΔ７をスキップしている転写物の１０％のみにおいて生じる。ＳＭＮ１遺伝子の非存在下では、ＳＭＮ２発現はエクソン７認識に支障を来している。ほぼ等しい量のこれらの転写物はＳＭＡ患者の線維芽細胞において生成されるが、約１０％のみのＳＭＮ−ＦＬ：９０％のＳＭＮΔ７ｍＲＮＡはＳＭＡ患者由来の神経細胞において観察される。

図２は、５０、２５、１０および５ｎＭにおいてイントロン６（ＡＯ配列番号３〜６）およびイントロン７（ＡＯ配列番号７〜１３）に向けられたオリゴマーによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７ＲＮＡ（矢印で示した）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。明確な用量依存応答がＡＯ配列番号６、１０および１３で見られる。Ｓｉｎｇｈら２００６年（Ｓｉｎｇｈ、２００６年＃７４）により記載されているオリゴマー（配列番号１）が、陽性対照として示され（対照ＡＯ）、使用されている。

図３は、ＳＭＡ細胞および最終的にＳＭＡの一過性マウスモデルを発生させるために、正常なヒト細胞においてエクソンスキッピングを誘導するように設計されたＡＯのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。ＡＯ配列番号１８、１９および２０は、組み合わせた場合、１００、５０、２５および１２．５ｎＭにて示されるスキッピングの良好なレベルを示す。エクソン７をターゲティングする単一のＡＯ配列番号２２は５０ｎＭ用量において１００％のエクソンスキッピングを示す。

図４は、エクソン７に近接した付近をターゲティングするエクソンスキッピングＡＯによる処置後の正常な細胞におけるＳＭＮタンパク質の７５％ノックダウンを示しているウェスタンブロッティングデータを示す。ＡＯを６００および３００ｎＭにて試験した。ＳＭＮ発現のレベルを、関連していない対照ＡＯによって示される発現と比較してβ−チューブリンおよび処置群に対して正規化する。さらなる健常対照およびＳＭＡ患者試料を比較のために使用した。

図５は、エクソン７スキッピングを誘導すると予測されるマウス特異的オリゴマーにより処理したマウス線維芽細胞におけるＳＭＮ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。この図は、エクソン７ドナー部位を、マウスドナースプライス部位に特異的なＡＯ配列番号２３〜２６でターゲティングした後のマウスＳＭＮエクソン７スキッピングを示す。ヒトおよびマウス遺伝子はこの領域において相違するので、これらのＡＯはヒト特異的ＡＯ配列番号１８〜２２とは異なるが、同じ領域周囲でアニールされる。マウスＡＯ配列番号２３および２４（ヒトＡＯ配列番号１９および２０と同じ座標を標的とする）は６００および３００ｎＭにおいて限定されたスキッピングを示し、高レベルの細胞死を誘導する。しかしながら、ヒトＡＯ配列番号２２よりエクソンに近い６塩基をシフトしているＡＯ配列番号２６は、５０ｎＭの低用量にて５０％超のエクソンスキッピングを示し、ＳＭＡ患者の線維芽細胞において見られるものと同様のＦＬ／Δ７比を誘導する。

図６は、２５、５０および１００ｎＭにてイントロン６（ＡＯ配列番号２９〜４１）に向けられたオリゴマーによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７ＲＮＡ（矢印で示す）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。ＡＯは、エクソン７の上流の明確な用量応答ターゲティング領域１２０〜２５０塩基を示す。エクソン７の上流の２５０塩基をターゲティングするＡＯ配列番号２９は１００ｎＭにてほぼ９０％のエクソン包含を誘導する。

図７は、２５、５０および１００ｎＭにてイントロン７（ＡＯ配列番号７〜１３、４２、４３、４６〜５５）に向けられたオリゴマーによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７ＲＮＡ（矢印で示した）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。ＡＯ配列番号５３および５４はエクソン７の下流の２５０塩基を標的とし、１００ｎＭにてほぼ９０％のエクソン保持を促進する。

図８は、２５、５０および１００ｎＭにてイントロン７（ＡＯ配列番号１０、４４および４５）に向けられたオリゴマーによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７ＲＮＡ（矢印で示した）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。配列番号４４および４５は２８および３０塩基であり、ＡＯ配列番号１０より高いＧＣ含量を有し、エクソン７保持を改善する。

図９は、５０、１００および２００ｎＭにてイントロン７（ＡＯ配列番号１０および５６）に向けられたオリゴマーによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７ＲＮＡ（矢印で示した）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。ＡＯ配列番号５６はステープリングＡＯを生み出すために配列番号１０のいずれかの側の２点においてイントロン７と結合し、エクソン７保持を改善する。

図１０は、２５０および５００ｎＭにてエクソン８（ＡＯ配列番号１４〜１７）に向けられたオリゴマーでのエレクトロポレーションによるトランスフェクション後のＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるＳＭＮ−ＦＬ、ＳＭＮΔ７ＲＮＡおよびＳＭＮ−ｉｎｔ／ｅｘ７を含んだ転写物（矢印で示される）の量の変化を示しているＲＴ−ＰＣＲ研究を示す。全てのＡＯはエクソンおよびイントロン７のほぼ１００％の包含を示す。

図１１は、ＳＭＮ遺伝子における本発明のＡＯの結合位置の概略である。エクソン７包含を誘導する際のＡＯの効率はスケールに従って「＋」で表される。

アンチセンスオリゴマー
本発明の第１の態様によれば、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部におけるｍＲＮＡ前駆体スプライシングを修飾するためにＳＭＮ遺伝子転写物上の選択された標的と結合できるアンチセンスオリゴマーが提供される。概して、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部におけるエクソン包含を誘導するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。

「単離された」とは、通常、その天然状態において付随している構成成分を実質的または本質的に含まない物質を意味する。例えば、本明細書に使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する状態においてそれと隣接する配列から精製または除去されているポリヌクレオチド、例えば、ゲノム内の断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指してもよい。細胞に関して、「単離している」という用語は、対象起源（例えば、ポリヌクレオチドリピート疾患を有する対象）由来の細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の精製を指す。ｍＲＮＡまたはタンパク質の文脈において、「単離している」とは、起源、例えば細胞からのｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を指す。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断もしくは阻害もしくはモジュレートするように、またはｍＲＮＡ前駆体スプライスプロセシングを阻害もしくはモジュレートするように、または標的ｍＲＮＡの分解を誘導するように設計されてもよく、それがハイブリダイズする標的配列「に向けられた」または「に対してターゲティングされる」と言われてもよい。ある特定の実施形態では、標的配列は、前処理されたｍＲＮＡの３’または５’スプライス部位、分岐点、またはスプライシングの調節に関与する他の配列を含む領域を含む。標的配列はエクソン内もしくはイントロン内であってもよいか、またはイントロン／エクソン連結に及んでいてもよい。

ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効果的に標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ前駆体）の領域を遮断するために標的ＲＮＡ（すなわち、スプライス部位選択がモジュレートされるＲＮＡ）と十分な配列相補性を有する。例示的な実施形態では、ＳＭＮｍＲＮＡ前駆体のこのような遮断は、別様でスプライシングをモジュレートする天然タンパク質についての結合部位をマスクすること、および／またはターゲティングされるＲＮＡの構造を変化させることのいずれかによってスプライシングをモジュレートするのに役立つ。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは標的ｍＲＮＡ前駆体（例えば、ＳＭＮ遺伝子ｍＲＮＡ前駆体）である。

標的ＲＮＡのスプライシングをモジュレートするために標的ＲＮＡ配列と十分な配列相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス剤が、別様でスプライシングをモジュレートし、および／または標的ＲＮＡの三次元構造を変化させる天然タンパク質についての結合部位のマスキングを誘発するのに十分な配列を有することを意味する。同様に、標的ＲＮＡのスプライシングをモジュレートするためにターゲティングされるＲＮＡ配列と十分な配列相補性を有するオリゴヌクレオチド試薬は、オリゴヌクレオチド試薬が、別様でスプライシングをモジュレートし、および／またはターゲティングされるＲＮＡの三次元構造を変化させる天然タンパク質についての結合部位のマスキングを誘発するのに十分な配列を有することを意味する。

選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、より短く、例えば約１２塩基、またはより長く、例えば約４０塩基で作製されてもよく、標的配列とのハイブリダイゼーション時に配列がスプライスモジュレーションをもたらすのに十分に相補性がある限り、少数のミスマッチを含んでもよく、任意選択で４５℃またはそれ超のＴｍを有するＲＮＡヘテロ二本鎖と共に形成してもよい。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜６を除いて、表１、２、５および６に記載される配列を含む群から選択される。

ある特定の実施形態では、標的配列とアンチセンスターゲティング配列との間の相補性の程度は安定な二本鎖を形成するのに十分である。標的ＲＮＡ配列とのアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性領域は８〜１１塩基ほどの短さであってもよいが、１２〜１５塩基またはそれ超、例えば１０〜４０塩基、１２〜３０塩基、１２〜２５塩基、１５〜２５塩基、１２〜２０塩基または１５〜２０塩基（これらの範囲の間の全ての整数を含む）であってもよい。約１４〜１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、概して、特有の相補配列を有するのに十分な長さである。ある特定の実施形態では、相補塩基の最小長さが、本明細書に説明されるように、必要な結合Ｔｍを達成するために必要とされてもよい。

ある特定の実施形態では、塩基、例えば１０〜１２塩基の少なくとも最小数が標的配列と相補的である場合、４０塩基ほどの長さのオリゴヌクレオチドが適切であってもよい。しかしながら、一般に、細胞内での容易なまたは能動的な取り込みは約３０塩基未満のオリゴヌクレオチド長で最適化される。本明細書にさらに記載されるＰＭＯオリゴヌクレオチドについて、結合安定性および取り込みの最適バランスは、概して、１８〜２５塩基の長さで生じる。約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’−ＯＭｅ）が含まれる。

ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的配列と１００％相補的であってもよいか、またはオリゴヌクレオチドと標的配列との間に形成されるヘテロ二本鎖が細胞ヌクレアーゼの作用およびｉｎｖｉｖｏで生じ得る分解の他の様式に耐えるのに十分に安定である限り、例えばバリアントを適応させるためにミスマッチを含んでもよい。それ故、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で、約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有してもよい。ヌクレアーゼによる切断の影響を受けにくいオリゴヌクレオチド骨格が本明細書で説明される。存在する場合、ミスマッチは、典型的に、中央におけるよりもハイブリッド二本鎖の末端領域に向かって不安定になりにくい。許容されるミスマッチの数は、二本鎖安定性の十分に理解されている原理に応じて、オリゴヌクレオチドの長さ、二本鎖におけるＧ：Ｃ塩基対の百分率、および二本鎖におけるミスマッチの位置に依存する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的配列と必ずしも１００％相補的ではないが、標的ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングがモジュレートされるように、標的配列と安定的および特異的に結合するのに効果的である。

オリゴヌクレオチドと標的配列との間に形成される二本鎖の安定性は結合Ｔｍおよび細胞の酵素切断に対する二本鎖の感受性による。相補配列ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドのＴｍは、Ｈａｍｅｓら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、１９８５年、１０７〜１０８頁により記載されているものまたはＭｉｙａｄａＣ．Ｇ．およびＷａｌｌａｃｅＲ．Ｂ．、１９８７年、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５４巻９４〜１０７頁に記載されているようなものなどの従来の方法によって測定され得る。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補配列ＲＮＡに対して、体温より高い、好ましくは約４５℃または５０℃より高い結合Ｔｍを有してもよい。６０〜８０℃またはそれ超の範囲のＴｍも含まれる。

バリアントのさらなる例には、配列番号７〜１７および２９〜６４のいずれかの全長に対して、約または少なくとも約７０％の配列同一性または相同性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または相同性を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。

より具体的には、ＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部におけるｍＲＮＡ前駆体スプライシングを修飾するために選択された標的部位と結合できるアンチセンスオリゴマーが提供される。好ましくは、アンチセンスオリゴマーはＳＭＮ遺伝子転写物におけるエクソン７包含を誘導するために選択された標的部位と結合できる。アンチセンスオリゴマーは、好ましくは、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に提供されるものから選択される。

ＳＭＮ遺伝子はＳＭＮ２であってもよい。このように、アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８における標的配列に向けられた分子であってもよい。標的部位はＳＭＮ２遺伝子転写物におけるサイレンサー部位であってもよい。

アンチセンスオリゴマーは、成熟ＳＭＮ２ｍＲＮＡにおけるエクソン７包含、および所望の場合、イントロン７包含を誘導できるアンチセンスオリゴマーであってもよい。このように、本発明のアンチセンスオリゴマーはエクソン７およびイントロン７を含有するＳＭＮ２転写物を生成するために使用されてもよく、ここで、エクソン７は正常な終止コドンを含有し、イントロン７はＳＭＮ遺伝子転写物の３’ＵＴＲの一部になる。好ましくは、このようなアンチセンスオリゴマーは表２のものから選択される。

有利には、本発明はまた、転写物におけるＳＭＮ２イントロン７およびエクソン７包含を増強またはモジュレートする方法であって、本発明の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを使用するステップを含む、方法を提供する。

エクソン包含を誘導するために選択された標的と結合できる２つまたはそれ超のアンチセンスオリゴマーの組合せまたは「カクテル」も提供される。あるいは、エクソン包含は、結合した２つもしくはそれ超のアンチセンスオリゴマーまたは２つもしくはそれ超のオリゴマーを含む構築物により誘導されてもよい。

本発明は、ＳＭＮ遺伝子転写物においてスプライシングを操作する方法であって、
ａ）本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーの１つまたは複数を準備し、オリゴマーを標的核酸部位と結合させるステップ
を含む、方法をさらに提供する。

本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載される核酸配列のＤＮＡまたはｃＤＮＡ等価物を含むＳＭＮについてのスプライス操作標的核酸配列が提供される。配列は、好ましくは、配列番号７〜１７および２９〜６４、具体的には配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、より具体的には配列番号７〜１３、最も具体的には配列番号１０、ならびにそれらと相補的な配列のいずれか１つまたは複数からなる群から選択される。

コンセンサススプライス部位を完全にマスクするためのアンチセンスオリゴマーの設計は、ターゲティングされるエクソンのスプライシングにおいて変化を生じさせることを必ずしも必要としなくてもよい。さらに、本発明者らは、アンチセンスオリゴマー自体のサイズまたは長さが、アンチセンスオリゴマーを設計する際の必ずしも主な要因になるとは限らないことを発見している。ＳＭＮ２エクソン７などのいくつかの標的に関して、１５塩基ほどの短さのアンチセンスオリゴマーがいくつかのエクソン包含を誘導でき、ある特定の場合、同じエクソンに向けられた他のより長い（２０〜３０塩基）オリゴマーより効果的である。

本発明者らはまた、それらが、スプライシングに向け直されたアンチセンスオリゴマーによって遮断またはマスクされ得る任意の標準的なモチーフであるようには見えないことを発見した。好ましくは、本開示は、エクソン７および一実施形態ではイントロン７の効果的で一貫性のある包含を誘導するためにＳＭＮ、好ましくはＳＭＮ２、ｍＲＮＡ前駆体における選択された標的と結合できるアンチセンスオリゴマーを提供することを目的とする。ＳＭＡおよび他のＳＭＮ関連病理は機能的ＳＭＮ遺伝子転写物の合成を不可能にする変異から生じるので、スプライシング分岐点およびエクソン認識配列またはスプライスエンハンサーがｍＲＮＡスプライシングをモジュレートするための標的部位である。

より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載されるものから選択されてもよい。配列は、好ましくは、配列番号７〜１７および２９〜６４、具体的には配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、より具体的には配列番号７〜１３、最も具体的には配列番号１０ならびにそれらの組合せまたはカクテルのいずれか１つまたは複数のいずれか１つまたは複数からなる群から選択される。これは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列とハイブリダイズできる配列、それと相補的な配列、修飾された塩基を含有する配列、修飾された骨格およびＳＭＮ遺伝子転写物においてｍＲＮＡ前駆体プロセシング活性を保有またはモジュレートするその機能的切断または伸長を含む。

オリゴマーおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的」は、安定および特異的な結合がオリゴマーと、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で生じるように、十分な程度の相補性または対合を示すために使用される用語である。アンチセンスオリゴマーの配列は、特異的にハイブリダイズできるその標的配列のものと１００％相補的である必要はないことは当該分野において理解される。アンチセンスオリゴマーは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡ産物の正常な機能を妨げる場合、特異的にハイブリダイズでき、特異的結合が所望される条件下、すなわちｉｎｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合、およびｉｎｖｉｔｒｏアッセイの場合の生理的条件下、アッセイが実施される条件下で非標的配列とのアンチセンスオリゴマーの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。

選択的ハイブリダイゼーションは、低、中または高ストリンジェンシー条件下であってもよいが、好ましくは高ストリンジェンシー下である。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、塩基組成、相補鎖の長さおよびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒のような条件の影響を受けることを認識するであろう。ストリンジェントな温度条件には、一般に、３０℃超、典型的には３７℃超、好ましくは４５℃超、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃〜８０℃またはそれ超の温度が含まれる。ストリンジェントな塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満である。しかしながら、パラメーターの組合せは任意の単一のパラメーターの尺度よりもかなり重要である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ７．０）である。構造的タンパク質におけるエクソンの末端でのコドン配列は、コドンの末端において必ずしも分解し得るとは限らず、したがってｍＲＮＡのインフレームリーディングを確実にするためにｍＲＮＡ前駆体から１つより多いエクソンを欠失する必要があり得ることは理解されるであろう。このような状況では、複数のアンチセンスオリゴマーが本発明の方法によって選択されることを必要とし得、ここで、各々は、所望のエクソンおよび／またはイントロンの包含の誘導に関与している異なる領域に向けられる。所与のイオン強度およびｐＨにて、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする温度である。このようなハイブリダイゼーションは、標的配列とのアンチセンスオリゴヌクレオチドの「近い」または「十分な」相補性、および正確な相補性で生じ得る。

典型的に、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチに対して少なくとも約５５％の同一性、好ましくはアンチセンスオリゴマーのヌクレオチドと少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％または９９％の同一性が存在する場合に生じる。記載されるように、相同性比較の長さは、より長いストレッチに対してであってもよく、ある特定の実施形態では、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常、少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常、少なくとも約２０、しばしば少なくとも約２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７または２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１または３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれ超のヌクレオチドのストレッチに対してである。

したがって、本発明のポリヌクレオチド配列は、好ましくは、本明細書の配列表に示される配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９または９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９１、９２、９３、９４または９５％、より好ましくは少なくとも９６、９７、９８％または９９％の相同性が存在する。一般に、アンチセンスオリゴマーの長さを短くすると、選択的ハイブリダイゼーションを得るのに必要とされる相同性はより高くなる。したがって、本発明のアンチセンスオリゴマーが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一性の百分率は、本明細書の配列表に示されるアンチセンスオリゴマーと比較して、７５％超、好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、９６、９７、９８％または９９％超であることが好ましい。ヌクレオチドの相同性比較は、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔプログラムまたはＧＡＰなどの配列比較プログラムによって行われてもよい（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４年、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２巻、３８７〜３９５頁）。このように、本明細書に挙げられるものと同様または大幅に異なる長さの配列がアラインメント内へのギャップの挿入によって比較されてもよく、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムによって決定される。

本発明のオリゴマーは、標的配列に対して低減された相同性の領域および正確な相同性の領域を有してもよい。オリゴマーが、その全長に対して正確な相同性を有することは必ずしも必要ではない。例えば、オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも４または５塩基の連続したストレッチ、好ましくは標的配列と同一である少なくとも６または７塩基の連続したストレッチ、より好ましくは標的配列と同一である少なくとも８または９塩基の連続したストレッチを有してもよい。オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６塩基のストレッチを有してもよい。オリゴマー配列の残りのストレッチは標的配列と断続的に同一であってもよく、例えば、残りの配列は、同一の塩基、続いて同一でない塩基、続いて同一の塩基を有してもよい。あるいは（または同様に）、オリゴマー配列は、完全な相同性未満のストレッチが散在している同一の配列のいくつかのストレッチ（例えば３、４、５または６塩基）を有してもよい。このような配列ミスマッチは、好ましくは、スプライススイッチング活性を全く喪失しないか、またはほとんど喪失しない。

また、エクソン包含のレベルをモジュレートすることを必要とされる条件または個体が存在してもよく、これは、エクソン７またはエクソン７＋イントロン７包含の所望のレベルを誘導する特定のオリゴマーまたはその組合せを選択することによって達成可能であり得ることは理解されるであろう。

「モジュレートする」という用語は、任意選択で定義されたおよび／または統計的に有意な量だけ、１つまたは複数の定量可能なパラメーターを「増加させる」または「減少させる」ことを含む。「増加させる」もしくは「増加している」、「増強させる」もしくは「増強している」、または「刺激する」もしくは「刺激している」とは、一般に、細胞または対象において、アンチセンスでない化合物または対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より多い生理学的応答（すなわち、下流効果）を生ずるかまたは引き起こす、あるまたはアンチセンス化合物または組成物の能力を指す。関連する生理学的または細胞応答（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ）は当業者に明白であり、ＳＭＮコーディングｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン７の包含の増加、またはそれを必要とする細胞、組織もしくは対象における機能的ＳＭＮ酵素の発現の増加を含んでもよい。「増加した」または「増強した」量は、典型的に、統計的に有意な量であり、アンチセンスでない化合物（薬剤の非存在下）または対照化合物によって生じる量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれ超の倍数（例えば、５００、１０００倍）（全ての整数および間の小数点および１超、例えば１．５、１．６、１．７、１．８を含む）の増加を含んでもよい。「低減させる」または「阻害する」という用語は、一般に、診断分野における慣用の技術に従って測定して、本明細書に記載される疾患または状態の症状などの関連する生理学的または細胞応答を「減少させる」１つまたは複数のアンチセンス化合物または組成物の能力に関連し得る。関連する生理学的または細胞応答（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ）は当業者に明白であり、ポンペ病などのグリコーゲン貯蔵疾患の症状または病理の低減、例えば１つまたは複数の組織内のグリコーゲンの蓄積の減少を含んでもよい。応答の「減少」は、アンチセンスでない化合物または対照組成物により生じる応答と比較して統計的に有意であり得、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の減少（間の全ての整数を含む）を含んでもよい。

アンチセンスオリゴマーの長さは、ｍＲＮＡ前駆体分子内の意図する位置と選択的に結合できる限り、変化してもよい。このような配列の長さは、本明細書に記載される選択手順に従って決定され得る。一般に、アンチセンスオリゴマーは、約１０ヌクレオチド長、最大約５０ヌクレオチド長由来である。しかしながら、この範囲内のヌクレオチドの任意の長さが方法に使用されてもよいことは理解されるであろう。好ましくは、アンチセンスオリゴマーの長さは、１０から４０、１０から３５、１５〜３０の間のヌクレオチド長、または２０〜３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２５〜３０ヌクレオチド長である。例えば、オリゴマーは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であってもよい。

本明細書に使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、標的配列内のオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成するために、ワトソン−クリック塩基対合によって核酸塩基がＲＮＡにおける標的配列とハイブリダイズできる、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の直線状配列を指す。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴマー」、「オリゴマー」および「化合物」という用語は、オリゴヌクレオチドを指すために交換可能に使用されてもよい。環状サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖、または特定の実施形態では、モルホリノ基（以下のモルホリノオリゴヌクレオチドの説明を参照のこと）に基づいてもよい。当該分野において公知の他のアンチセンス剤の中で、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドも意図される。

天然に存在しないオリゴヌクレオチド、または（ｉ）修飾された骨格構造、例えば天然に存在するオリゴ−およびポリヌクレオチド中に見出される標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、ならびに／または（ｉｉ）修飾された糖部分、例えば、リボースまたはデオキシリボース部分以外のモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、「オリゴヌクレオチド類似体」が含まれる。類似の骨格が、標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）内のオリゴヌクレオチド類似体分子と塩基との間の配列特異的様式においてこのような水素結合を可能にするように塩基を提示する場合、オリゴヌクレオチド類似体は、ワトソン−クリック塩基対合によって、標準的なポリヌクレオチド塩基と水素結合できる塩基を支持する。好ましい類似体は、実質的に変化していないリン含有骨格を有するものである。

アンチセンスオリゴマーを産生する一つの方法は２’ヒドロキシリボースタンパク質のメチル化であり、ホスホロチオエート骨格の組み込みは、ＲＮＡに一見似ているが、ヌクレアーゼ分解に対して非常に高い耐性がある分子を産生するが、本発明の当業者は本発明の目的に使用可能であり得る適切な骨格の他の形態を知っている。

アンチセンスオリゴマーとの二本鎖形成の間のｍＲＮＡ前駆体の分解を回避するために、方法に使用されるアンチセンスオリゴマーは内因性ＲＮａｓｅＨによる切断を最小化または阻止するように適合され得る。この特性は、ＲＮａｓｅＨを含有する細胞内または粗抽出物内のいずれかでの非メチル化オリゴマーによるＲＮＡの処理がｍＲＮＡ前駆体：アンチセンスオリゴマー二本鎖の分解を導くので、非常に好ましい。このような分解を迂回できるか、または誘導できない修飾されたアンチセンスオリゴマーの任意の形態が本発明の方法に使用されてもよい。ヌクレアーゼ耐性は、本発明のアンチセンスオリゴマーが、部分的に不飽和の脂肪族炭化水素鎖ならびにカルボン酸基、エステル基およびアルコール基を含む１つまたは複数の極性または荷電基を含むように、本発明のアンチセンスオリゴマーを修飾することによって達成され得る。

ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、細胞ＲＮａｓｅＨにより切断されないアンチセンスオリゴマーの例は２’−Ｏ−メチル誘導体である。このような２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドは細胞環境内および動物組織内で安定であり、ＲＮＡとのそれらの二本鎖は、それらのリボまたはデオキシリボ対応物より高いＴｍ値を有する。あるいは、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、フッ素化された最後の３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つを有してもよい。さらにあるいは、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、最後の３末端ヌクレオチド塩基の少なくとも２つの間を連結するホスホロチオエート結合を有し、好ましくは最後の４つの３’末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する。

増加したスプライス−スイッチングはまた、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）化学により達成され得る。ヒトまたはマウスＳＭＮ遺伝子転写物のＡＯ誘導性スプライス修飾は一般に、ホスホロチオエート骨格上のオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ、２ＯＭｅまたはＭＯＥ修飾塩基のいずれかを使用している。２ＯＭｅＡＯは、カチオン性リポプレックスとして送達される場合、ｉｎｖｉｔｒｏでのそれらの効率的な取り込みに起因してオリゴ設計のために使用されるが、これらの化合物はヌクレアーゼ分解の影響を受けやすく、ｉｎｖｉｖｏまたは臨床応用に対して理想的とみなされない。

ＲＮａｓｅＨを活性化しないアンチセンスオリゴマーは公知の技術に従って作製され得る（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照のこと）。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列であり得る、このようなアンチセンスオリゴマーは、その１つのメンバーとしてオリゴマーを含有する二本鎖分子とのＲＮａｓｅＨの結合を立体的に妨げるか、または阻止する任意の構造的修飾を単に含有しているだけであり、この構造的修飾は、二本鎖形成を実質的に妨げないか、または妨害しない。二本鎖形成に関与するオリゴマーの部分は、それらと結合するＲＮａｓｅＨに関与するこれらの部分と実質的に異なるので、ＲＮａｓｅＨを活性化しない多数のアンチセンスオリゴマーが利用可能である。例えば、このようなアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチド間の架橋ホスフェート残基の少なくとも１つまたは全てが、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートなどの修飾されたホスフェートである、オリゴマーであってもよい。例えば、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基の１つおきが記載されるように修飾されてもよい。別の非限定的な例では、このようなアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチドの少なくとも１つまたは全てが、２’低級アルキル部分（例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニルおよびイソプロピルなどの、Ｃ_１〜Ｃ_４、直鎖または分枝、飽和または不飽和アルキルなど）を含有する分子である。例えば、ヌクレオチドの１つおきが記載されるように修飾されてもよい。

アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴマーの好ましい形態であるが、本発明は、限定されないが、以下に記載されるようなオリゴマー模倣物を含む、他のオリゴマーのアンチセンスオリゴマーを含む。

本発明に有用な好ましいアンチセンスオリゴマーの具体例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴマーが含まれる。本明細書に定義される場合、修飾された骨格を有するオリゴマーには、骨格内にリン原子を保持しているものおよび骨格内にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、および時々、当該分野において参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾されたオリゴマーもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。

他の好ましいオリゴマー模倣物において、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の骨格は新たな基と置きかえられる。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている１つのこのようなオリゴマー化合物、オリゴマー模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴマーの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置きかえられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。

別の好ましい化学物質は、任意の公知のヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって分解されない、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）オリゴマー化合物である。これらの化合物は非荷電であり、ＲＮＡ鎖と結合した場合、ＲＮａｓｅＨ活性を活性化せず、ｉｎｖｉｖｏ投与の後に持続したスプライスモジュレーションを与えることが示されている。（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、７巻、１８７〜１９７頁）。

修飾されたオリゴマーはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有してもよい。オリゴマーはまた、核酸塩基（しばしば、当該分野において単に「塩基」と称される）修飾または置換を含んでもよい。ある特定の核酸塩基が本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。それらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、さらにより特には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、０．６〜１．２℃だけ核酸二本鎖安定性を増加させることが示されている。

本発明のオリゴマーの別の修飾は、オリゴマーを、オリゴマーの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強させる１つまたは複数の部分またはコンジュゲートに化学的に連結することを含む。このような部分には、限定されないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分が含まれる。

細胞侵入ペプチドが、細胞取り込みおよび核局在化を増強させるためにホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに加えられている。Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８年）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６巻９号、１６２４〜１６２９頁に示されるように、異なるペプチドタグが取り込みの効率および標的組織特異性に影響を与えることが示されている。

所与の化合物における全ての位置が均一に修飾されることは必ずしも必要ではなく、実際に上述の修飾の１つより多くが、単一の化合物において、またはさらにオリゴマー内の単一のヌクレオチドにて組み込まれてもよい。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンスオリゴマーを含む。本発明の文脈において、「キメラの」アンチセンスオリゴマーまたは「キメラ」は、２つまたはそれ超の化学的に異なる領域（各々は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴマー化合物の場合、ヌクレオチドから構成される）を含有する、アンチセンスオリゴマー、特にオリゴマーである。これらのオリゴマーは、典型的に、オリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーがヌクレアーゼ分解に対する耐性を増加させると、オリゴマーが増加した細胞取り込みを与えるように修飾される少なくとも１つの領域、および標的核酸に対する増加した結合親和性についてのさらなる領域を含有する。

アンチセンスヌクレオチドおよびそのバリアントの活性は当該分野における慣用の技術に従ってアッセイされ得る。例えば、調査対象のＲＮＡおよびタンパク質のスプライス形態および発現レベルは、転写核酸またはタンパク質のスプライス形態および／または発現を検出するための多種多様の周知の方法のいずれかによって評価され得る。このような方法の非限定的な例には、ＲＮＡのスプライスされた形態のＲＴ−ＰＣＲ、その後のＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸ハイブリダイゼーション法、例えば、ノーザンブロットおよび／または核酸アレイの使用、核酸増幅法、タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質精製法ならびにタンパク質機能または活性アッセイが含まれる。

ＲＮＡ発現レベルは、細胞、組織または生物からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち転写ポリヌクレオチド）を調製することによって、およびｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、アッセイされる核酸またはその断片の相補体である、参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって評価され得る。ｃＤＮＡは、任意選択に、相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション前に様々なポリメラーゼ連鎖反応またはｉｎｖｉｔｒｏでの転写方法のいずれかを使用して増幅されてもよく、好ましくは、ｃＤＮＡは増幅されない。１つまたは複数の転写物の発現はまた、転写物の発現のレベルを評価するために定量的ＰＣＲを使用して検出され得る。

アンチセンスオリゴマーを製造する方法
本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴマーは、簡便には、固相合成の周知の技術によって作製され得る。このような合成のための機器は、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含む、いくつかの供給業者によって販売されている。修飾された固体支持体上でオリゴマーを合成するための一つの方法は米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。

当該分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段が、追加としてまたは代替として利用されてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴマーを調製するために同様の技術を使用することは周知である。一つのこのような自動化実施形態では、ジエチル−ホスホロアミダイトが出発物質として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１年）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、２２巻、１８５９〜１８６２頁に記載されているように合成され得る。

本発明のアンチセンスオリゴマーはｉｎｖｉｔｒｏで合成され、生物起源、またはアンチセンスオリゴマーのｉｎｖｉｖｏ合成に向けられるように設計された遺伝子ベクター構築物のアンチセンス組成物を含まない。本発明の分子はまた、取り込み、分布および／または吸着に役立つように、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤のような、他の分子、分子構造体または化合物の混合物と混合、封入、コンジュゲートあるいは会合されてもよい。

治療剤
本発明はまた、予防または治療として使用されてもよく、遺伝的疾患の処置の目的のために利用されてもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、治療有効量で、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合される、本明細書に記載される効果的で一貫性のあるエクソン７包含を誘導するためにＳＭＮ２ｍＲＮＡ前駆体において選択された標的と結合するアンチセンスオリゴマーを提供する。

「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容性があり、典型的には、患者に投与される場合、異常亢進などのアレルギーまたは同様に有害な反応を生じない、分子的実体および組成物を指す。「担体」という用語は、化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの滅菌液であってもよい。水または食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、好ましくは、特に注射溶液のための担体として利用される。適切な医薬担体は、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（１９９０年）に記載されている。

本発明のより具体的な形態では、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に本発明の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの治療有効量を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、様々な緩衝液含有物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤ならびに洗浄剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。物質は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物内またはリポソーム内に組み込まれてもよい。ヒアルロン酸（Ｈｙｌａｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）も使用されてもよい。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎｖｉｖｏでの放出速度、およびｉｎｖｉｖｏでの除去速度に影響を与え得る。例えば、本明細書に参照により組み込まれているＭａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照のこと。組成物は液体形態で調製されてもよいか、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末形態であってもよい。

本発明に従って提供される医薬組成物は、当該分野において公知の任意の手段によって投与され得ることは理解されるであろう。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射、経口、局所により、または肺もしくは鼻経路により投与される。アンチセンスオリゴマーは、より好ましくは、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内または皮下の投与経路によって送達される。適切な経路は処置下の対象の状態に応じて当業者によって決定され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液が、アンチセンスオリゴマーが導入され得るいくつかの非限定的な部位である。直接的なＣＮＳ送達が利用されてもよく、例えば、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌｖｅｎｔｒｉｂｕｌａｒ）またはくも膜下投与が投与経路として使用されてもよい。

アンチセンスオリゴマーに基づいた治療
遺伝的疾患をモジュレートするための医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴマーの使用も本発明によって扱われる。

したがって、本発明のなおさらなる態様によれば、アンチセンスオリゴマーに基づいた治療に使用するための本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーが提供される。

本明細書に使用される場合、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変化させる試みに使用される任意の種類の介入である。処置には、限定されないが、医薬組成物の投与が含まれ、予防的に、または病理事象の開始もしくは病原因子との接触の後のいずれかで実施されてもよい。処置される疾患もしくは状態の進行速度を低減させ、その疾患もしくは状態の発症を遅延させ、またはその発症の重症度を低減させるように導かれ得る「予防的」処置も含まれる。「処置」または「予防」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な撲滅、治癒または防止を必ずしも示さない。

組成物は、約１ｎＭ〜１０００ｎＭの本発明の各々の所望のアンチセンスオリゴマーを含んでもよい。好ましくは、組成物は、約１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜７５０ｎＭ、１０ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜５０ｎＭ、１ｎＭ〜４０ｎＭ、１ｎＭ〜３０ｎＭ、１ｎＭ〜２０ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭから１０ｎＭの間の本発明の各々のアンチセンスオリゴマーを含んでもよい。

本発明の別の態様によれば、ＳＭＮ関連病理をモジュレートまたは制御するための医薬の製造における本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの使用が提供される。

本発明は、患者への送達に適した形態で、ＳＭＮ関連病理などの遺伝的障害の予防的または治療的処置に役立つように適合される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーをさらに提供する。

患者は、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。

治療的に有用な量のアンチセンスオリゴマーの送達は、以前に公開された方法によって達成され得る。例えば、アンチセンスオリゴマーの細胞内送達は、アンチセンスオリゴマーと有効量のブロックコポリマーの混合物を含む組成物を介してであってもよい。この方法の例は米国特許出願公開第２００４０２４８８３３号に記載されている。アンチセンスオリゴマーを核に送達する他の方法は、ＭａｎｎＣＪら（２００１年）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、９８巻（１号）４２〜４７頁、およびＧｅｂｓｋｉら（２００３年）ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、１２巻（１５号）：１８０１〜１８１１頁に記載されている。裸のＤＮＡまたは脂質担体との複合のいずれかとして発現ベクターによって核酸分子を細胞内に導入する方法は、米国特許第６，８０６，０８４号に記載されている。

ある特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、経皮方法によって（例えば、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが任意選択にリポソーム内に充填された状態で、例えばエマルション内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込みを介して）送達され得る。送達のこのような経皮およびエマルション／リポソーム介在方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に関して、当該分野において、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号に記載されており、その内容は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれている。

コロイド分散系においてアンチセンスオリゴマーを送達することが望まれ得る。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロカプセル、ビーズならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームまたはリポソーム製剤を含む脂質ベースの系が含まれる。

リポソームは、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。これらの製剤は、正味のカチオン、アニオンまたは中性電荷の特徴を有してもよく、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏでの送達方法についての有用な特徴を有してもよい。大きな単層小胞は、大きな巨大分子を含有するかなりの割合の水性緩衝液を封入できることが示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡは水性内部内に封入でき、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６巻：７７頁、１９８１年）。

リポソームを効果的な遺伝子導入ビヒクルにするために、以下の特徴が存在すべきである：（１）それらの生物学的活性を損なわずに、高効率での目的のアンチセンスオリゴマーの封入、（２）非標的細胞と比較して標的細胞との選択的および実質的な結合、（３）高効率での標的細胞質への小胞の水性含有物の送達、ならびに（４）遺伝情報の正確および効果的な発現（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年）。リポソームの組成物は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用されてもよい。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。

本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、埋め込み型装置を介して送達されてもよい。このような装置の設計は当該分野において認識されているプロセスであり、例えば米国特許第６，９６９，４００号（その内容は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている、例えば人工の埋め込み設計である。

アンチセンスオリゴマーは、当該分野において認識されている技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイドポリマー粒子ならびにウイルスおよび非ウイルスベクターならびに当該分野において公知の他の手段）を使用して細胞内に導入され得る。選択される送達方法は、処理される細胞および細胞の位置に少なくとも依存し、当業者に明白である。例えば、局在化は、リポソームを導くために表面上に特定のマーカーを有するリポソーム、標的細胞を含有する組織内への直接注入、特異的受容体媒介取り込みまたは同様のものによって達成され得る。

当該分野において公知のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポソーム媒介取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリシン媒介取り込み、ナノ粒子媒介取り込みおよび受容体媒介エンドサイトーシス、ならびにマイクロインジェクション、透過処理（例えば、ストレプトリシン−Ｏ透過処理、アニオンペプチド透過処理）、エレクトロポレーションおよび当該分野において公知である様々な非侵襲性の非エンドサイトーシスの送達方法などの送達のさらなる非エンドサイトーシス様式を含む方法を使用して送達され得る（その全体が参照により組み込まれている、ＤｏｋｋａおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ、ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ４４巻、３５〜４９頁を参照のこと）。

アンチセンスオリゴマーはまた、医薬組成物を産生するために他の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされてもよい。適切な担体および希釈剤には、等張食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼球内、経口または経皮投与のために製剤化されてもよい。

記載される投与経路は、熟練した医師が、任意の特定の動物および条件について最適な投与経路および任意の投薬量を容易に決定できるので、単なる指針として意図される。

ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で細胞内へ新規機能的遺伝物質を導入するための複数の手法が試みられてきた（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１２７５〜１２８０頁）。これらの手法には、修飾されたレトロウイルス内で発現される遺伝子の組み込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）同上、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５１巻（１８号）、補遺：５０７４Ｓ〜５０７９Ｓ頁）、非レトロウイルスベクター内への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：４３１〜４３４頁）、またはリポソームを介した異種性プロモーター−エンハンサーエレメントに連結した導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、同上、Ｂｒｉｇｈａｍら、（１９８９年）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２９８巻：２７８〜２８１頁、Ｎａｂｅｌら、（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１２８５〜１２８８頁、Ｈａｚｉｎｓｋｉら、（１９９１年）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．ＣｅｌｌＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０６〜２０９頁；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８４巻：７８５１〜７８５５頁）、リガンド特異的なカチオンベースの輸送系のカップリング（ＷｕおよびＷｕ（１９８８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１〜１４６２４頁）、または裸のＤＮＡ発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら（１９９０年）、同上）、Ｗｏｌｆｆら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４６５〜１４６８頁）が含まれる。組織内への導入遺伝子の直接注射は局在化された発現のみを生じさせる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２年）同上）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）同上、Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９年）同上、Ｎａｂｅｌ（１９９０年）同上、およびＨａｚｉｎｓｋｉら（１９９１年）同上）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９年）２９８巻：２７８〜２８１頁およびＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）３９巻（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内投与のいずれかの後のマウスの肺のｉｎｖｉｖｏでのトランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順の総説の例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２年）２５６巻：８０８〜８１３頁、Ｂａｒｔｅａｕら（２００８年）、ＣｕｒｒＧｅｎｅＴｈｅｒ、８巻（５号）：３１３〜２３頁；Ｍｕｅｌｌｅｒら（２００８年）．ＣｌｉｎＲｅｖＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ、３５巻（３号）：１６４〜７８頁、Ｌｉら（２００６年）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１３巻（１８号）：１３１３〜９頁、Ｓｉｍｏｅｓら（２００５年）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖ、２巻（２号）：２３７〜５４頁である。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、任意の薬学的に許容される塩、エステルもしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へ投与されると、生物学的に活性な代謝産物もしくはその残留物を（直接的または間接的に）提供できる任意の他の化合物を包含する。したがって、一例として、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的等価物にも注目する。

「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに対して望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。オリゴマーに関して、薬学的に許容される塩の好ましい例には、限定されないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどと形成される塩、（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩、（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸と形成される塩、ならびに（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩が含まれる。本発明の医薬組成物は、局所または全身処置が望まれるかどうか、および処置されるエリアに応じて多数の手段で投与され得る。投与は、局所（眼および粘膜、ならびに直腸送達を含む）、例えば、粉末剤またはエアロゾルの吸入または吹送による肺（噴霧器による、気管内、鼻腔内、表皮および経皮を含む）、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入または頭蓋内、例えば、くも膜下もしくは脳室内投与が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴマーが経口投与に特に有用であると考えられる。

簡便には、単位投薬形態で存在し得る、本発明の医薬製剤は製薬業界において周知の従来の技術に従って調製され得る。そのような技術は、有効成分を医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を、液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方と均一および密接に会合させ、次いで必要な場合、製品を成形することによって調製される。

一実施形態では、アンチセンス化合物は、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの最大血中濃度を生じるのに効果的な量および様式で投与される。典型的に、アンチセンスオリゴマーの１回または複数回用量は、通常、約１〜２週間の期間、一定間隔で投与される。経口投薬についての好ましい用量は７０ｋｇ当たり約１ｍｇ〜１０００ｍｇのオリゴマーである。一部の場合、１０００ｍｇ超のオリゴマー／患者の用量が必要であってもよい。ｉ．ｖ．投与に関して、好ましい用量は７０ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇのオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーは、短期間、例えば、２週間またはそれ未満の間、毎日、一定間隔で投与されてもよい。しかしながら、一部の場合、オリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投与される。投与の後に抗生物質の投与または他の治療的処置が行われてもよいか、またはそれらと同時に投与が行われてもよい。処置計画は、処置下の対象の免疫学的検定、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示されるように（用量、頻度、経路などを）調整されてもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した効果的なｉｎｖｉｖｏでの処置計画は、投与の持続期間、用量、頻度および経路、ならびに処置下の対象の状態（すなわち、局所または全身感染に応答する投与に対する予防的投与）に応じて変化させてもよい。したがって、このようなｉｎｖｉｖｏでの治療は、しばしば、処置下の特定の種類の傷害に適した試験による監視、および最適な治療結果を達成するために用量または処置計画における対応する調整を必要とする。

処置は、例えば、当該分野において公知の疾患の一般的指標によって監視されてもよい。ｉｎｖｉｖｏで投与された本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の前、間、および後に対象から採取された生体試料（組織、血液、尿など）から決定されてもよい。このような試料のアッセイは、（１）当業者に公知の手順、例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイを使用して標的および非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の存在はまたは非存在を監視すること、（２）ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングなどの標準的な技術により決定して、参照正常ｍＲＮＡまたはタンパク質に関連する変異ｍＲＮＡの量を監視することを含む。

本発明のキット
本発明はまた、ＳＭＮ遺伝子の異常な発現レベルによって引き起こされる遺伝的疾患を有する患者を処置するためのキットであって、その使用のための指示書と一緒に適切な容器内にパッケージ化されたＳＭＮ遺伝子転写物またはその一部においてｍＲＮＡ前駆体スプライシングを修飾するための少なくとも１つの単離または精製されたアンチセンスオリゴマーを含む、キットを提供する。

好ましい実施形態では、キットは、本明細書に記載される、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に示される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー、またはアンチセンスオリゴマーのカクテルを含有する。キットはまた、緩衝液、安定化剤などの周辺試薬を含有してもよい。したがって、遺伝的疾患を有する患者を処置するためのキットであって、その使用のための指示書と一緒に適切な容器内にパッケージ化された、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７ならびにそれらの組合せまたはカクテルから選択される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーを含む、キットが提供される。

遺伝子的疾患を有する患者を処置するためのキットであって、その使用のための指示書と一緒に適切な容器内にパッケージ化された、配列番号７〜１７および２９〜６４、具体的には配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、より具体的には配列番号７〜１３、最も具体的には配列番号１０ならびにそれらの組合せまたはカクテルのいずれか１つまたは複数からなる群から選択される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーを含む、キットも提供される。

キットの含有物は凍結乾燥されてもよく、キットは、凍結乾燥した構成成分を再構成するための適切な溶媒をさらに含有してもよい。別個の容器内でパッケージ化され、このような容器と関連しているキットの個々の構成成分は、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制している政府機関によって指示される形態の通知であってもよく、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の代理人による承認を反映している。

キットの構成成分が１つまたは複数の溶液で提供される場合、溶液は、水溶液、例えば滅菌水溶液であってもよい。ｉｎｖｉｖｏでの使用に関して、発現構築物は薬学的に許容される注射可能な組成物に製剤化されてもよい。この場合、容器手段は、それ自体が、吸入器、注射器、ピペット、点眼器または他のこのような同様の装置であってもよく、それらから、製剤は、肺などの動物の患部に適用されてもよく、動物に注射されてもよく、またはさらにキットの他の構成成分に適用され、それと混合されてもよい。

キットの組成物はまた、乾燥または凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬または構成成分が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に適切な溶媒の添加による。溶媒はまた、別の容器手段で提供されてもよいことも想定される。容器の数または種類に関わらず、本発明のキットはまた、動物体内への最終的な複合組成物の注射／投与または配置を支援するための機器を含んでもよいか、またはそれとパッケージ化されてもよい。このような機器は、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、測定スプーン、点眼器または任意のこのような医学的に承認された送達ビヒクルであってもよい。

当業者は、上記の方法の用途が、多くの他の疾患の処置における使用に適したアンチセンスオリゴマーを識別するための広範な用途を有することを理解しているはずである。

ＳＭＮ遺伝子およびＳＭＡ
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、通常、第５染色体上の生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子のゲノム欠失により引き起こされ、機能的ＳＭＮタンパク質の欠失を生じる。ヒトはＳＭＮ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーを有するが、セントロメアＳＭＮ２遺伝子コピー（複数可）は、非生産的代替スプライシングに起因してＳＭＮ１の喪失を補うことができない。

上記に説明されるように、標的選択の採用はエクソン包含の効率およびそれ故、潜在的治療としてのその後の用途において重要な役割を果たす。スプライシングに関与すると推定されるｍＲＮＡ前駆体の領域をターゲティングするためにアンチセンスオリゴマーを単に設計することは、ｍＲＮＡ前駆体スプライシングを効果的に変更することを保証するものではない。しかしながら、最適な標的部位、オリゴマーの長さおよび化学的性質は効果的なスプライス−スイッチングオリゴマーに不可欠である。調査されるスプライシング介入のための標的はドナーおよびアクセプタースプライス部位を含むが、エクソンスプライシングエンハンサー、サイレンシングエレメントおよび分岐点を含む定義または保存されたモチーフはほとんど存在していない。アクセプターおよびドナースプライス部位はそれぞれ、約１６および８塩基のコンセンサス配列を有する。したがって、本発明において、サイレンサー配列は成熟ＳＭＮ２遺伝子転写物内へのエクソン７の包含を促進するためにターゲティングされる。本発明は、ＳＭＮＲＮＡのスプライス−スイッチングの大幅で一貫性のある増加を提供する多数のＡＯを識別している。

核内のオリゴマー送達もまた、大きな課題である。異なる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は異なる条件および細胞株においてＰＭＯを様々な程度に局在化し、新規ＣＰＰはＰＭＯを標的細胞に送達するそれらの能力について本発明者によって評価されている。ＣＰＰまたは「細胞取り込みを増強させるペプチド部分」という用語は交換可能に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」または「ペプチド変換ドメイン」とも呼ばれる、カチオン細胞浸透性ペプチドを指す。本明細書に示される場合、ペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の約または少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％内で細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与時にｉｎｖｉｖｏで複数の組織内の巨大分子転座を可能にする。ＣＰＰは当該分野において周知であり、例えば、その全体が参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２０１０／００１６２１５号に開示されている。

本開示は、ＳＭＮ遺伝子転写物のＡＯ誘導性スプライス−スイッチング、臨床的に関連するオリゴマーの化学的性質、送達系およびＳＭＮ２スプライス操作を治療レベルまで導くために関連する動物モデルを提供する。完全長ＳＭＮ２ｍＲＮＡ、およびそれ故、ＳＭＮ２遺伝子転写物由来のＳＭＮタンパク質の量の大幅な増加は以下によって達成される：
１）（ｉ）イントロンサイレンシング標的モチーフ、（ｉｉ）ＡＯの長さおよびオリゴマーカクテルの開発、（ｉｉｉ）化学的性質の選択、ならびに（ｉｖ）オリゴマー送達を増強させるための細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）の添加の実験的評価による、ＳＭＡ患者の線維芽細胞を使用したｉｎｖｉｔｒｏでのオリゴマー改良。
２）エクソン７および所望または必要な場合、イントロン７（エクソン７は正常な終止コドンを含有し、イントロン７はＳＭＮ２遺伝子転写物の３’ＵＴＲの一部になる）を含有するＳＭＮ２転写物を生成するための新規手法の詳細な評価。
３）ＡＯ処置した軽度、中度および重度に罹患したＳＭＡのマウスモデルを使用したｉｎｖｉｖｏでのスプライス操作治療の検証。

このように、ＳＭＮｍＲＮＡ前駆体、特にＳＭＮ２ｍＲＮＡのプロセシングが、特定のアンチセンスオリゴマーを用いて操作され得ることが本明細書で実証される。このように、機能的に有意な量のＳＭＮタンパク質がＳＭＮ２遺伝子から合成されてもよく、それにより例えば、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの筋萎縮症に関連する重度の病理を低減させる。

機能的ＳＭＮ遺伝子産物の喪失から引き起こされる脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの筋萎縮症をモジュレートまたは制御するための医薬の製造における本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの使用が提供される。

本発明は、患者における不正確なＳＭＮ発現によって特徴付けられるＳＭＡに関連する状態を処置する方法であって、
ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーの有効量を患者に投与するステップ
を含む、方法をさらに提供する。

さらに、本発明は、ＳＭＡを防止または少なくとも最小化するために患者を予防的に処置する方法であって、
ａ）１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物の有効量を患者に投与するステップ
を含む、方法を提供する。

記載される治療方法および医薬の製造に使用されるアンチセンスオリゴマーは、好ましくは、配列番号１〜６を除いて、表１、２および５〜７に記載される配列を含む群から選択される。より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号７〜１７および２９〜６４、具体的には配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４、より具体的には配列番号７〜１３、最も具体的には配列番号１０およびそれらの組合せまたはカクテルのいずれか１つまたは複数からなる群から選択されてもよい。
併用治療

本発明のＡＯはまた、薬物治療などの代替治療と併せて使用されてもよい。

ハイスループット薬物スクリーニングにより、ＳＭＡ処置に使用するための可能な化合物（Ａｎｄｒｅａｓｓｉ、２００１年＃１９、Ｂｒｉｃｈｔａ、２００３年＃２５６、Ｃｈａｎｇ、２００１年＃２５７、Ｋｅｒｎｏｃｈａｎ、２００５年＃２５５、Ｓｕｍｎｅｒ、２００３年＃１４）が識別されているが、これらの化合物の潜在的な用途についてさらに広範な実験が必要とされる。これらの化合物はＳＭＮ遺伝子転写物スプライシングの間に効果を発揮することを必要としない。ＳＭＮ発現の上方制御またはＳＭＮ転写物の安定化は潜在的に治療的であり得、異なる機構が抑制され得る可能性がある。

５５０，０００個を超える化合物のスクリーニング研究が行われており、それらの中から１７個の異なる化合物が、ＳＭＮ発現を増加させることが確認された。これらの化合物のうちの１つである、Ｃ５−置換キナゾリンは、ＡＯによって誘導されるものと異なる機構を介してＳＭＮ発現に対してその効果を発揮するように見える。本発明のＡＯと比較して識別された化合物の作用の異なる機構を考慮して、薬剤の併用による治療は有効性を増加させることができる。
総論

当業者は、本明細書に記載される発明が、具体的に記載されるもの以外の変形および修飾を受けることを理解するであろう。本発明は、全てのこのような変形および修飾を含むことを理解されたい。本発明は、また、個々または集合的に本明細書中に言及または指示されるステップ、特徴、組成物、および化合物の全て、ならびに前記ステップまたは特徴のうちの任意および全ての組合せまたは任意の２つもしくはそれ超を含む。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、その実施形態は、例証する目的のみを意図するものである。機能的に等価な生成物、組成物、および方法は、明らかに本明細書に記載される本発明の範囲内である。

本明細書に含まれるヌクレオチドおよびアミノ酸の配列情報を含む配列特定番号（「配列番号」）は、記載の最後にまとめ、プログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．０を使用して作成した。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、数字見出し＜２１０＞とその後の配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって配列表において識別される。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列についての長さ、配列の種類、および起源生物は、それぞれ、数字見出し＜２１１＞、＜２１２＞、および＜２１３＞に提供される情報によって示される。本明細書中で言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、数字見出し＜４００＞とその後の配列識別子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２など）に提供される情報によって定義される。

様々なアンチセンスオリゴマーを識別するために、アンチセンスオリゴマーの命名法が提案され、公開されている（Ｍａｎｎら、（２００２年）ＪＧｅｎＭｅｄ４巻、６４４〜６５４頁を参照のこと）。この命名は、全て同じ標的領域に向けられたいくつかのわずかに異なるアンチセンスオリゴマーを試験したときに特に関連し、以下のように示される：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
最初の文字は種を表す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）
「＃」は標的エクソン番号を表す。
「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エクソンの最初および最後におけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。
（ｘｙ）は、「−」または「＋」がそれぞれイントロンまたはエクソン配列を示すアニーリング座標を表す。一例として、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンの前のイントロンの最後の６塩基および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近接するスプライス部位は、アクセプターであるので、これらの座標の前に「Ａ」と記載する。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標は、最後の２個のエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基がアンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する場合、Ｄ（＋２−１８）と記載することができる。Ａ（＋６５＋８５）によって表される全体がエクソンであるアニーリング座標は、そのエクソンの最初から６５番目と８５番目のヌクレオチドとの間の部位を含む。

本明細書に引用される全ての刊行物（特許、特許出願、論文、研究室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。参考文献のいずれかが先行技術を構成するか、または本発明が関連する分野におけるこれらの研究の一般知識の一部であることを認めるものではない。

本明細書に使用される場合、「由来」および「由来する」という用語は、特定の完全体が、特定の起源から必ずしも直接得られないとしても、その起源から得ることが可能であることを示すものとする。

本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈が他の意味を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定の完全体または完全体の群を含むことを意味するが、任意の他の完全体または完全体の群を除くものではないと理解されるであろう。

本明細書に使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な記載において見出すことができ、明細書全体に適用される。別段の定義がなされない限り、本明細書に使用される全ての他の科学および技術用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。

アンチセンスオリゴマーが、ｍＲＮＡ前駆体配列内のエクソンの陽性認識および後のスプライシングに関与しているヌクレオチド配列をターゲティングする場合、エクソンの正常なスプライシングは阻害され得、スプライシング機構により、成熟ｍＲＮＡからターゲティングされるエクソン全体が迂回する。反対に、成熟遺伝子転写物内への特定のエクソンまたはイントロン配列の領域の組み込みを促進するために、ｍＲＮＡ前駆体内の陰性スプライスコントロールエレメント、エクソンまたはイントロンサイレンサーエレメントをターゲティングすることが可能である。多くの遺伝子において、エクソン全体の欠失は重要な機能的ドメインの喪失またはリーディングフレームの崩壊を介して非機能的タンパク質の産生を導く。しかしながら、一部のタンパク質において、タンパク質の生物活性を大きく変化させずにタンパク質内から（リーディングフレームを崩壊せずに）１つまたは複数のエクソンを欠失することによってタンパク質を短縮することが可能である。典型的に、このようなタンパク質は構造的役割を有し、および／またはそれらのそれぞれの端部において機能的ドメインを保有する。しかしながら、本発明は、エクソン７が、通常、ＳＭＮ２遺伝子転写物から取り除かれ、（所望の場合、イントロン７が）成熟ｍＲＮＡ内に含まれるように、特定のＳＭＮ２ｍＲＮＡ前駆体標的と結合でき、その遺伝子のプロセシングを再び誘導できるアンチセンスオリゴマーを記載する。

本開示は、ＳＭＮ、特にＳＭＮ２、ｍＲＮＡ内にエクソン７包含を促進するいくつかの以前に報告されていないモチーフを確認し、識別するデータを提示する。

加えて、本発明者らは、エクソン７およびイントロン７（ＳＭＮ＋ｉｎｔ７）の両方を保持しているＳＭＮ２ｍＲＮＡを誘導し、４つのＡＯを有するこの効果を実証し、そのうちの３つは図１０に示されるように重複するＡＯである。この産生物は、エクソン４〜８に及ぶゲノム産生物が１０ｋｂ超であるので、ＤＮＡ夾雑物から生じることはできない。ＳＭＮについての正常な停止コドンはエクソン７内にあるので、ＳＭＮ＋ｉｎｔ７転写物は正常なタンパク質をコードするはずであり、イントロン７は３’ＵＴＲ内に含まれる。特に終止コドンの後で、ポリアデニル化シグナルに隣接している、マウスＳＭＮ（３５５塩基）の３’ＵＴＲとヒトＳＭＮ（４４４塩基）遺伝子との間に最小の相同性が存在する。

等価遺伝子のヒトおよびマウスエクソンにおける同じ座標のターゲティングはスプライシングの効果的な再誘導を導くことができるが、本発明者らは、異なるスプライシングパターンが誘導される、より多くの例を記している。それらの相違は、ある種においてエクソンスキッピングを含み、他の種においては含まず、一例として、ある種のジストロフィン遺伝子転写物内の複数のエクソンスキッピングまたは隠れたスプライス部位活性化を含む、異なるスプライシングパターンの誘導を含み、他の種においては含まなかった。ＳＭＡ患者の線維芽細胞におけるエクソン７の完全なスキッピングを誘導したオリゴマーによるマウスＳＭＮエクソン７ドナースプライス部位の同じ領域のターゲティングは、図５に示されるように、表れているが、不完全なエクソンの切除を導いた。

ヒトと異なり、マウスは、エクソン７認識を弱める多型を１つも保有していない１つのＳＭＮ遺伝子しか有さないので、エクソンスキッピングは完全ではないことが主張され得る。ＳＭＮ２を発現するマウスモデルの欠陥は認識されている限界であるが、現在、代替手段はない。
一般的方法および技術

エクソン７にすぐ隣接しているイントロン６および７の約２７０塩基を横切るＡＯを、潜在的なサイレンシングモチーフの識別に供した。これらのＡＯをＳＭＡ患者の線維芽細胞内にトランスフェクトし、ＳＭＮ転写物内のエクソン７の包含の決定を、図２に示されるように、逆転写酵素−ＰＣＲならびにＳＭＮ−ＦＬおよびＳＭＮΔ７の割合の比較によって行った。

成熟ＳＭＮ２転写物内のイントロン７の保持は、増加または減少した安定性を含む、いくつかの起こり得る影響をもたらす。本発明者らは、正常なポリアデニル化部位が、ＳＭＮ−ＦＬ、ＳＭＮΔ７およびＳＭＮ＋ｉｎｔ７に使用されることを確認するために３’ＲＡＣＥを使用した（データは示さず）。
細胞増殖およびトランスフェクション：

十分に確立された技術を使用してＳＭＡの正常またはマウス皮膚線維芽細胞を増殖させた。ＳＭＡＩの患者の細胞を播種し、７５ｃｍ２組織培養フラスコ内で増殖させ、２４ウェルプレートに移し、様々な範囲の濃度にわたって２ＯＭｅＡＯカチオン性リポプレックス（２：１のリポフェクチン：オリゴ比）をトランスフェクトした。ヌクレオフェクションのために、ＰＭＯを、製造業者の指示書に従ってＬＯＮＺＡヌクレオフェクション機器を使用して、エレクトロポレーションショックを介して細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、典型的に、他に示さない限り、酸フェノール抽出（トリゾール）を使用して分析のためにＲＮＡを抽出する前に４８時間インキュベートした。ＲＮＡ試料をＲＮａｓｅフリーＤＮＡｓｅ１で処理したが、イントロン６は６ｋｂ超であるので、少量のＤＮＡ夾雑物は問題にならない。
オリゴマー命名：

命名法は、種、エクソン番号、アクセプターまたはドナーターゲティングおよびアニーリング座標を定義し、本明細書に記載されるように、「−」はイントロン配置を示し、「＋」はスプライス部位からのエクソン位置を指定する（Ｍａｎｎ、２００２年＃１１４）。一部の詳細なオリゴマーアニーリング座標は表１〜６に示される。
ＲＴ−ＰＣＲ分析：

ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩを使用したワンステップＲＴ−ＰＣＲ：約１００ｎｇの全ＲＮＡを鋳型として使用し、エクソン４Ｆおよび８Ｒプライマーを使用して９４℃で４０秒間、５６℃で１分間、および６８℃で１分間の２５ラウンドの前に、５５℃にて３０分間、９４℃にて２分間インキュベートした。ＰＣＲ産物を、トリス−酢酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中の２％アガロースゲル上で断片化し、Ｃｈｅｍｉｓｍａｒｔ−３０００ゲルドキュメンテーションシステム上で画像を捕捉し、Ｂｉｏ１Ｄソフトウェアにより分析してバンド重量を定量し、ＳＭＮ−ＦＬ、ＳＭＮ−ｉｎｔ７およびＳＭＮΔ７の割合を推定した。必要に応じて、バンド精製およびＤＮＡシークエンシングによって産生物同一性を確認した。
ウェスタンブロッティング：

３日後、タンパク質を処理培養物から抽出し、１５％ＳＤＳを用いたが、Ｃｏｏｐｅｒら、２００３年に従って調製した。２００Ｖにて５５分間作動するＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘ４〜１２％ＢＩＳ／トリスゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。タンパク質を、１８℃にて１時間、３０ＶにてＰａｌｌＦｌｕｏｒｏｔｒａｎｓＷＰＶＤＦ膜に移した。ＭＡＮＳＭＡ１抗体を、４℃にて一晩、１：１００希釈にて適用し、免疫検出はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキットを使用した。画像取得のためにＣｈｅｍｉ−Ｃａｐｔソフトウェアおよび画像分析のためにＢｉｏ−１Ｄソフトウェアを使用してＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔＣｈｅｍｉ−Ｓｍａｒｔ３０００システムで定量を実施した。負荷をβ−チューブリンに対して正規化して、参照負荷タンパク質としてマウスモノクローナル抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６３２１）によってβ−チューブリンを検出した。
結果
１：ＳＭＮエクソン７包含を増強させるための改善されたオリゴマー設計
ＳＭＡ線維芽細胞を使用したオリゴウォーキング（ｏｌｉｇｏｗａｌｋｉｎｇ）および改良

エクソン７内のモチーフのターゲティングはＳＭＮ−ＦＬ転写物の効果的な誘導を導かないことを見出したので（Ｈｕａ、２００８年）、イントロン６および７を応答モチーフについてスクリーニングした。イントロン６および７をターゲティングする多数の２ＯＭｅＡＯを設計し、評価し、いくつかのサイレンシングエレメントはエクソン７の上流（イントロン６）および下流（イントロン７）の両方を識別した。
オリゴマー骨格の化学的性質：

オリゴマー配列の識別がＳＭＮ−ＦＬまたはＳＭＮ＋ｉｎｔ７転写物の誘導において最も効果的であると示されると、異なる骨格の化学的性質を使用して新規化合物を調製できる。ＰＭＯは、一般に、ホスホロチオエート骨格オリゴマーより、ｉｎｖｉｖｏではるかに多くのスプライススイッチング可能性を有するので、ホスホロチオエート骨格（２’ＯＭｅｏｒホスホロジアミデートモルホリノ骨格（ＰＭＯ）上の２’修飾塩基を使用できる。
送達：

カチオン性リポプレックスとして、またはエレクトロポレーション技術によってトランスフェクション後、オリゴマーをｉｎｖｉｔｒｏで効果的に送達し、評価した。使用され得るさらなる技術には、オリゴマーを細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にカップリングすることが含まれる。
２：ＳＭＮ＋ｉｎｔ７転写物の誘導
エクソン７およびイントロン７を保持するためのエクソン８のターゲティング

本発明者らは、ＳＭＮ２エクソン８に向けられたＡＯが、エクソン７およびイントロン７を保持している大多数の転写物を生じ、それによって機能的ＳＭＮ２由来転写物を提供することを本明細書に示している。エクソン／イントロン７の包含を促進するモルホリノオリゴマー（ＡＯ配列番号１４〜１７）をトランスフェクトしたＩ型ＳＭＮ患者の線維芽細胞は増加したＳＭＮ発現を示した。成熟ｍＲＮＡにおけるイントロン７の保持は、ポリアデニル化を変化させること、または翻訳を調節し得る不安定性エレメントの導入のいずれかによってＳＭＮ転写物の安定性を損なう場合がある。
３：ＳＭＮエクソン７包含を増強するための代替のオリゴマー設計
エクソン７の保持

表６は多くの修飾されたＡＯ配列を提供する。ＡＯ配列番号５６はサイレンサー領域のいずれかの側の２つのエリアにおいて結合する「ステープリング」ＡＯを示す。ＡＯ配列番号５７〜６０はＲＮＡ配列に対する１つまたは複数のミスマッチした塩基を含有するミスマッチしたＡＯ配列を示す（データは示さず）。これらの戦略の両方は、ＲＮＡ二次構造を変化させ、包含を改善することが予測される。

参考文献

Claims

生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記ターゲティング配列が、表１、２および５〜７のいずれかから選択される、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１７および２９〜６４から選択される、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４から選択される、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３から選択される、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記ターゲティング配列が、配列番号１０から選択される、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが、２５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド、および
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１０に記載の医薬組成物。
前記ターゲティング配列が、表１、２および５〜７のいずれかから選択される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１７および２９〜６４から選択される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
前記ターゲティング配列が、配列番号１０から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
前記オリゴヌクレオチドが、２５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
それを必要とする対象における脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはＳＭＡに関連する状態を処置する方法であって、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を該対象に投与するステップを含む方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１９に記載の方法。
前記ターゲティング配列が、表１、２および５〜７のいずれかから選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１７および２９〜６４から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４から選択される、請求項２２に記載の方法。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３から選択される、請求項２２に記載の方法。
前記ターゲティング配列が、配列番号１０から選択される、請求項２２に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドが、２５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはＳＭＡに関連する状態を処置するための医薬を製造するための、生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）遺伝子ｍＲＮＡ前駆体のイントロン６、イントロン７またはエクソン８の付近または内部の領域と相補的なターゲティング配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量の使用。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項２８に記載の使用。
前記ターゲティング配列が、表１、２および５〜７のいずれかから選択される、請求項２８または２９に記載の使用。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１７および２９〜６４から選択される、請求項２８または２９に記載の使用。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３、２９、４４、５３および５４から選択される、請求項３１に記載の使用。
前記ターゲティング配列が、配列番号７〜１３から選択される、請求項３１に記載の使用。
前記ターゲティング配列が、配列番号１０から選択される、請求項３１に記載の使用。
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の使用。
前記オリゴヌクレオチドが、２５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の使用。