KR20230120127A - Tardbp 관련 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 TAR DNA-결합 단백질 43(TAR DNA-binding protein 43; TDP43)을 암호화하는 분산 반응 DNA 결합 단백질 43(transactive response DNA binding protein 43; TARDBP) 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하는데 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 TARDBP에 대해 표적화된 AON 및 STMN2에 대해 표적화된 AON을 포함하는 치료학적 조성물의 투여에 의해 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

TARDBP 관련 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 단백질 TAR DNA-결합 단백질 43(TAR DNA-binding protein 43; TDP43)을 암호화(encoding)하는 분산 반응 DNA 결합 단백질 43(transactive response DNA binding protein 43; TARDBP) 유전자의 발현을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide; AON)에 관한 것이다. 본 발명은 AON, 및 TARDBP에 대해 표적화된(targeted) AON을 포함하는 치료학적 조성물의 투여에 의해 TDP43 단백질병증(proteinopathy)과 관련된 질환의 영향(effect)을 치료, 방지 또는 개선(ameliorating)시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 STMN2를 암호화하는 핵산에 대해 표적화되고 STMN2 프레-mRNA(STMN2 pre-mRNA)에 결합할 수 있는 AON에 관한 것이다.
배경 기술의 다음의 논의는 본 발명만의 이해를 촉진시키기 위해 의도된다. 논의는 언급된 물질 중 어느 것도 본 출원의 우선일 당시 일반적인 상식의 일부이거나 일부이었음을 인식하거나 인정하는 것이 아니다.
TDP43 단백질병증은 뉴우런(neuron) 및 아교 세포(glial cell)에서 TDP43의 비정상적인 편재화(aberrant mislocalisation), 포스포릴화, 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 절단을 포함한다. TDP43 단백질병증은 수개의 신경변성 질환(neurodegenerative disease)에 걸쳐 발생한다. 조직학적 연구는 TDP43이 대부분의 극위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 환자, 예를 들면, TARDBP 유전자 내 뿐만 아니라 산발적인 경우(sporadic case)에서 병원성 변이를 지닌 환자, 및 C90RF72 헥사뉴클레오타이드 반복 확장(C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion)을 지닌 환자의 뉴우런내 세포질 응집체(cytoplasmic aggregate) 속에 존재함을 확인하였다(Giordana et. al. Brain Pathology, 2010; Takeuchi et al. Acta Neuropathologica Communications 2016; Schipper et al. Neuropathology 및 Applied Neurobiology, 2016). 뇌 및 척수에서 유비퀴틴-양성 세포질성 신경 포함(ubiquitin-positive cytoplasmic neuronal inclusion)에서 TDP43의 편재화 및 응집은 현재 ALS의 병리학적 특징으로 고려되고 있다. TDP43 단백질병증은 또한 전두측두 변성(frontotemporal degeneration) 또는 전두측두 치매(frontotemporal dementia; FTD)로서 또한 공지되어 있고, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease; AD) 경우의 30 내지 70%를 차지하는(Josephs et al. Acta Neuropathologica, 2016), 전두측두엽 변성(frontotemporal lobar degeneration; FTLD)의 가장 일반적인 아형에서 관찰된다(Gao et al. Journal of neurochemistry, 2018). TDP43 병리학은 또한 수개의 다른 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 또는 신경근 질환(neuromuscular disease), 예를 들면, 페리 증후군(Perry syndrome; PS)(Mishima, T., et al., Journal of neuropathology and experimental neurology, 2017. 76(8): p. 676-682), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy; CTE)(McKee, A.C., et al., Acta neuropathologica, 2015. 131(1): p. 75-86), 뇌 철 축적 제1형을 지닌 신경변성(neurodegeneration with brain iron accumulation type 1; NBIAT1)(Haraguchi, T., et al., Neuropathology, 2011. 31(5): p. 531-539), 항-IgLON5 증후군(anti-IgLON5 syndrome; AIS)(Cagnin, A., et al., Journal of Alzheimer's disease, 2017. 59(1): p. 13-20), 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis; NCL)(Gtzl, J.K., et al., Acta neuropathologica, 2014. 127(6): p. 845-860), 레비 소체 치매(lewy body dementia; LBD)(Arai, T., et al., Acta neuropathologica, 2009. 117(2): p. 125-136.), 포함체 근병증(inclusion body myopathy; IBMY)(Weihl, C.C., et al., Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 2008. 79(10): p. 1186-1189), 포함체 근육염(inclusion body myositis; IBM) (Huntley, M.L., et al., Laboratory Investigation, 2019. 99(7): p. 1041-1048) 및 수개의 다른 희귀 질환(very rare disease)에서의 특징이다.
TARDBP 유전자는 ALS에 연루되었다. ALS는 운동 뉴우런에 영향을 미치는 치명적인 변성 질환(fatal degenerative disease)이다. ALS는 전형적으로 중년에서 발생하며 끈질기게 진행성인 근 위축증(relentlessly progressive muscle atrophy) 및 약화(weakness)로서 나타나며, 호흡근에서의 효과는 대부분의 경우에 질환 발병 후 2 내지 4년까지로 생존을 제한한다(Chio et al. World Federation of Neurology Research Group on Motor Neuron Diseases, 2009). ALS는 100,000명의 개체(individual) 당 2명의 발생율 및 100,000명의 개체 당 5.4명의 유병률을 지닌 가장 일반적인 성인 운동 뉴우런 질환(adult motor neuron disease)이다(Chio et al. Neuroepidemiology, 2013). 현재의 치료 선택사항은 생존을 단지 수개월 연장시키거나(Cetin H. et al, Neuroepidemiology, 2015. 44: p. 6-1), 또는 일부 환자에서 단지 적당한 이점을 제공하는(Sawada, Expert Opinion on Pharmacotherapy, 2017. 18(7): p. 735-738) 승인된 의약을 사용한 증상 관리 및 호흡 지지를 기반으로 한다. 질환 진행을 늦추거나 중지시키는 효과적인 치료는 결여되어 있다.
일반적으로 핵에 집중되었지만, TDP43은 핵 국재화 신호(nuclear localization signal) 및 핵 외수송 신호(nuclear export signal) 둘 다를 함유하고 핵과 세포질 사이를 전 후로 왕복한다(Ayala et al. Journal of Cell Science, 2008. 121(22): p. 3778-3785). TDP43의 발현은 피드백 메카니즘(feedback mechanism)에 의해 자동조절되며, 여기서 단백질은 핵 과잉 상태(nuclear excess)일 때 이의 자체 프레-mRNA(pre-mRNA)의 3'UTR 내 영역에 결합한다. 이는 해독되기 보다는 분해되는 mRNA 전사체를 생성하는 대안적인 폴리아데닐화 신호 및 스플라이싱 현상(splicing event)의 사용을 개시한다(Koyama et al., Nucleic acids research, 2016. 44(12): p. 5820-5836; Avenda
Figure pct00002
o-Vzquez, S.E., et al., Genes & Development, 2012. 26(15): p. 1679-1684; D'Alton et al., RNA, 2015. 21(8): p. 1419-1432).
ALS에서 TDP43의 세포질성 편재화는 이의 폭주 상향조절(runaway upregulation)을 초래한다. 이는 세포질에서 TDP43의 잠재적으로 독성인 응집의 증가된 수준 및 형성을 야기하는 반면, 핵 속의 TDP43 수준을 고갈된 채로 남는다(Koyama et al., Nucleic Acid Res. 2016. Jul; 44(12): p 5820-36). TDP43 과발현 설치류 모델은 야생형 및 돌연변이체 TDP43 둘 다의 과발현이 신경변성 표현형을 유발할 수 있음을 일관되게 밝혀내었다(Ash et al., Human Molecular Genetics, 2010. 19(16): p. 3206-3218; Wils et al., PNAS USA, 2010. 107(8): p. 3858-3863; Kabashi, et al., Human Molecular Genetics, 2010. 19(4): p. 671-683; Stallings et al., Neurobiology of Disease, 2010. 40(2): p. 404-414; Xu et al., Molecular Neurodegeneration, 2011. 6(1): p. 73; Liachko, et al., The Journal of Neuroscience, 2010. 30(48): p. 16208-16219).
TDP43은 유전자 발현의 조절인자로서 기능하며 프레-mRNA 스플라이싱, mRNA 안정성의 조절, mRNA 수송, 해독 및 비-암호화 RNA의 조절에서의 역할과 함께 수개의 RNA 프로세싱 단계(RNA processing step)에 포함된다(Ratti, A. and E. Buratti, Journal of Neurochemistry, 2016. 138(S1): p. 95-111; Buratti, E. and F.E. Baralle, RNA Biology, 2010. 7(4): p. 420-429; Tollervey et al., Nature Neuroscience, 2011. 14(4): p. 452-458). 이는 또한 스트레스 과립 역학(stress granule dynamic)에서 역할을 담당한다. 스트레스 과립(stress granule)은 스트레스 하에서 비-필수 전사체(non-essential transcript) 및 프로-세포자멸사 단백질(pro-apoptotic protein)의 해독적 억류(translational arrest)에 의한 세포 생존을 촉진한다(Protter, D.S.W. 및 R. Parker, Trends in Cell Biology, 2016. 26(9): p. 668-679).
TDP43는 핵 및 세포질 둘 다에서 기능하지만 주로 핵 내에서 잔류한다. 스플라이싱 및 전사에서 이의 역할을 통해, TDP43은 많은 다른 유전자의 조절에 포함되며 이의 핵 고갈은 세포에서 다양한 하부 효과를 초래하는 경향이 있다.
증가된 세포질성 TDP43은 전반적인 mRNA 해독, 스프레스 과립 역학, 미토콘드리아 기능(mitochondrial functioning) 및 다른 세포 경로에 영향을 미친다. TDP43은 단백질 합성에서 전반적인 감소를 초래하는 것으로 밝혀진 이의 세포질성 증가와 함께 해독을 조절하는데 포함된다(Russo et al., Human Molecular Genetics, 2017. 26(8): p. 1407-1418). TDP43은 도한 스트레스 과립 형성 및 유지에 포함된다(Khalfallah, Y., et al., Scientific Reports, 2018. 8(1): p. 1-13). 프리온-유사 도메인(prion-like domain), 예를 들면, TDP43을 지닌 단백질은 다수의 일시적인 약한 상호작용을 형성하는 이의 능력으로 인하여 스트레스 과립의 가역적인 조립에 중요한 것으로 고려되고 있다(Harrison, A.F. and J. Shorter, The Biochemical Journal, 2017. 474(8): p. 1417-1438). 증가된 세포질성 TDP43은 스트레스 과립 역학을 방해하여 이의 기능장애를 초래할 수 있다. TDP43 과발현은 또한 미토콘드리아 기능에 수개의 방식으로 영향을 미친다(Wang, W., et al., Nature Medicine, 2016. 22(8): p. 869-87827; Prasad, A., et al., Frontiers in Molecular Neuroscience, 2019. 12(25)). 세포질성 TDP43의 축적은 또한 프리온-유사 증식 메카니즘(prion-like propagation mechanism)을 통한 질환 진행에 기여할 수 있다(Nonaka, T., et al., Cell Reports, 2013. 4(1): p. 124-134).
핵 TDP43의 고갈이 쟁점화되어 있으며, TDP43 핵 고갈의 최악의 효과가 탐구되고 있다. 그러나, 증가된 세포질성 TDP43은 유의적인 부작용 결과와 관련되어 있다. 따라서, 세포질성 TDP43을 감소시키는 전략이 TDP43 단백질병증과 관련된 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다.
AON 매개된 TDP43 하향조절은 이러한 과정에서 세포질성 TDP43 과발현의 영향을 감소시킬 수 있다. 제WO2019/013141호는 TARDBP에 대해 지시된 다수의 AON을 기술하고 있다. 그러나 이러한 AON 중 어느 것도 아직까지 TDP43 단백질병증과 관련된 질환에 대해 효과적이고 상업적으로 이용가능한 치료를 이끌지 못하고 있다.
스플라이싱(splicing) 및 전사에서의 이의 역할을 통해, TDP43은 많은 다른 유전자의 조절에 포함되며 이의 핵 고갈은 세포에서 다양한 하부 효과(downstream effect)를 초래하는 경향이 있다. 핵 TDP43 고갈은 수백개의 RNA의 차등적인 발현 또는 스플라이싱을 초래한다(Klim et al., Nature Neuroscience, 2019. 22(2): p. 167-179)[1][1]. 최근의 연구는 ALS에서 TDP43 단백질병증이 뉴우런 단백질 스타티민-2의 발현을 변경시키고 이것이 향상된 뉴우런 취약성(neuronal vulnerability)과 직접적인 기능적인 관련성을 가질 수 있음을 밝혀내었다.
스타티민-2는 STMN2 유전자에 의해 암호화된 뉴우런 포스포단백질이다. 이는 골지체(Golgi)에 국재화(localising)될 뿐만 아니라 소낭으로 핵둘레 세포질, 액손, 및 뉴우런의 성장 원추(growth cones of neuron)에 분포하는 막-관련 단백질이다(Chauvin, S. and A. Sobel, Neuronal stathmins: A family of phosphoproteins cooperating for neuronal development, plasticity and regeneration. Progress in Neurobiology, 2015. 126: p. 1-18). 스타트민-2(stathmin-2)는 신경계에서 고도로 발현되며 뉴우런 분화, 가소성(plasticity) 및 재생 동안 상향조절된다(Chauvin 및 Sobel 2015).
스타트민-2는 성장 원추 내에 미세소관 역학의 조율을 통해 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 자극시킨다(Morii, H., Y. Shiraishi-Yamaguchi, and N. Mori, SCG10, a microtubule destabilizing factor, stimulates the neurite outgrowth by modulating microtubule dynamics in rat hippocampal primary cultured neurons. Journal of Neurobiology, 2006. 66(10): p. 1101-1114). 미세소관은 세포골격의 일부를 구성하는 튜불린의 중합체이며, 세포에 구조 및 형태를 제공한다. 미세소관은 환경에서 유리 튜불린(free tubulin)의 양에 의존하는 조립 및 해중합(depolymerization)의 단계(phase)를 겪는 동적 구조이다(Chauvin 및 Sobel 2015). 스타트민, 예를 들면, 스타트민-2는 이의 봉쇄(sequestration) 및 방출을 통해 뉴불린의 양을 이용가능하게 조절한다. 스타트민-2의 포스포릴화는 튜블린 봉쇄의 음성 조절인자이며, 뉴블러 방출(tubular release) 및 중합을 촉진한다(Poulain and Sobel, Molecular and Cellular Neuroscience, 2007. 34(2): p. 137-146). 스타트민-2의 강력한 조절은 적절한 신경돌기형성(neuritogenesis)에 요구된다. 스타트민-2 고갈은 장기간의 성장 원추 정지 및 증가된 표면적을 유도한다(Poulain and Sobel, Molecular and Cellular Neuroscience, 2007. 34(2): p. 137-146). 스타트민-2의 중간 수준은 신경돌기 성장을 자극하지만 과발현은 과도한 미세소관 분해로 인하여 신경돌기 수축(neurite retraction)을 초래한다(Morii et al Neurobiology, 2006. 66(10): p. 1101-1114). 스타트민은 중추 신경계 및 말초 신경계에서 재생 공정에 중요한 역할을 담당하며(Chauvin and Sobel 2015)[2] 말초 신경 변성 동안 및 뇌 외상 후 상향조절된다(Voria et al., Experimental Neurology, 2006. 197(1): p. 258-267; Shin et al, Experimental neurology, 2014. 252: p. 1-11). 스타트민-2는 또한 다른 뉴우런 기능, 예를 들면, 세포내 트래피킹(intracellular trafficking) 및 뉴로엔도크린 분비(neuroendocrine secretion)에서 역할을 담당한다(Mahapatra et al Biochemistry, 2008. 47(27): p. 7167-7178).
뉴우런에서, 스타트민-2 수준은 TDP43에 의해 조절된다. TDP43은 STMN2 프레-mRNA의 제1 인트론 내 부위에 결합할 수 있고; 이는 성숙한 mRNA 내로 크립틱 엑손(cryptic exon)의 혼입을 억제하여 전체 STMN2 mRNA 및 단백질이 발현되도록 한다. TDP43 수준이 저하되면, STMN2 프레-mRNA에 대한 이의 결합을 감소시켜, 크립틱 엑손이 노출되도록 하고 성숙한 mRNA 전사체 내 이의 혼입을 초래한다. 크립틱 엑손은 조기 종결 코돈(premature termination codon) 뿐만 아니라, 조기 폴리아데닐화 부위(premature polyadenylation site)를 함유하며, 이의 활용은 절두된(truncated) 및 비-기능성 mRNA를 초래하여 감소된 스타트민-2 발현을 야기한다(Melamed et al., Nature neuroscience, 2019. 22(2): p. 180-190).
ALS 환자에서의 연구에서 TDP43가 고갈된 iPSC 유래된 운동 뉴우런은 이의 발현을 증가시킴에 의해 재저장될 수 있는 감소된 엑손 성장 및 재생을 초래하는 감소된 스타트민-2 발현을 보고하고 있다(Melamed et al., Nature neuroscience, 2019. 22(2): p. 180-190). 감소된 스타트민-2 발현 및 크립틱 엑손을 함유하는 STMN2 전사체의 증가된 발현은 ALS 환자로부터 취한 조직 샘플로부터 운동 뉴우런에서 생체 내(in vivo)에서 확인되었다(Klim et al., Nature Neuroscience, 2019. 22(2): p. 167-179; Melamed, Z.e., et al., Nature neuroscience, 2019. 22(2): p. 180-190). TDP43 발현을 감소시키고 스타트민-2의 후속적인 하향조절(downregulation)을 방지하도록 설계된 AON을 조합한 치료학적 전략은 스타트민-2 고갈에 의해 유발된 뉴우런 취약성에 대해 보호하면서 세포질성 TDP43의 충격을 감소시킬 수 있다.
안티센스 기술은 특정 유전자 생성물의 발현을 감소시키기 위한 효과적인 수단으로서 드러나고 있으며 따라서 TARDBP 발현의 조절을 위한 다수의 치료학적, 진단학적, 및 조사 적용에 유일하게 유용한 것으로 입증될 수 있다. 안티센스 기술은 다양한 상이한 수준(전사, 스플라이싱, 안정성, 해독)에서 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 안티센스 기술을 사용한 과제(challenge)는 이것이 생체 내에서 목적한 효과를 갖는 특정 AON을 확인하기가 어렵다는 것이 잔존한다는 것이다.
따라서, 상당한 양의 연구에도 불구하고, ALS와 같은 신경학적 상태에 효과적인 치료를 개발하고 확인하는 것에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이러한 배경의 관점에서 본 발명이 개발되었다. 특히, 본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환에서 TDP43 단백질병증을 개선시키기 위한 수단을 제공하는 것을 추구한다.
본 발명은 화합물, 특히 AON에 관한 것이며, 이는 TARDBP를 암호화하는 핵산에 대해 표적화된다. 본 발명의 구현예는 TARDBP 프레-mRNA에 결합할 수 있는 AON에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화합물, 특히 AON에 관한 것이며, 이는 STMN2를 암호화하는 핵산에 대해 표적화된다. 본 발명의 구현예는 STMN2 프레-mRNA에 결합할 수 있는 AON에 관한 것이다.
광범위하게는, 본 발명의 제1 양태에 따라서, TARDBP 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 (a) 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58 또는 이의 변이체(variant)로 이루어진 목록으로부터 선택되거나;
(b) 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58이 또한 결합하는 표적 TARDBP 프레-mRNA 내의 적어도 1개 이상의 인접한 핵염기(contiguous nucleobase) 또는 이의 변이체에 대해 상보성인 핵염기 서열(nucleobase sequence)을 가지며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 TARDBP 유전자의 발현을 억제하고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 실질적으로 단리 또는 정제된다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 TDP43의 발현을 억제한다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 TARDBP에서 엑손 3에 결합한다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 스키핑(exon skipping)을 통해 TARDBP 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다.
추가의 구현예에서, 엑손은 엑손 3이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드-포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체(conjugate)이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 12, 16, 24 및 25로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 16, 25이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
본 발명의 제2 양태에서, STMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 (a) 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66 또는 이의 변이체로 이루어진 목록으로부터 선택되거나; (b) 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66이 또한 결합하는 표적 STMN2 프레-mRNA내 적어도 1개 이상의 인접한 핵염기 또는 이의 변이체에 대해 상보성인 핵염기 서열을 가지고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 STMN2 유전자의 하향조절을 방지하고/하거나 이의 발현을 증가시키고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 실질적으로 단리 또는 정제된다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스타트민-2의 하향조절을 예방 또는 감소시키거나 이의 발현을 증가시킨다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 사람 STMN2의 인트론(intron) 2 내 크립틱 엑손에 결합한다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 크립틱 엑손이 성숙한 mRNA 전사체로부터 배제되도록 한다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드-포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체이다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 36 및 37로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로디미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
본 발명의 다른 양태에서, TARDBP 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 본 발명의 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및 (b) 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, STMN2 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법이 제공되고, 이러한 방법은: (a) 본 발명의 제2 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및 (b) 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은: (a) 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 하나 이상의 치료학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 약제학적 조성물이 제공되고, 이러한 조성물은: (a) 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 대상체(subject)에게 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD 및 FTLD, PS, IBMY, IBM, CTE, LBD, 및 NCL로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD 및 FTLD, PS, IBMY 및 IBM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD 및 FTLD로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서, 바이오마커(biomarker)에 의해 확인된 환자에서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 방법이 제공되고, 이러한 방법은 TDP43 억제에 반응하는 경향이 있는 TDP43 단백질병증 환자와 관련된 질환과 관련된 바이오마커의 존재에 대해 대상체를 시험하는 단계; 및 (b) 대상체가 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 대상체에게 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 바이오마커는 절두된 STMN2 전사체(truncated STMN2 transcript)이다.
본 발명의 다른 양태에서, 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나 대상체에서 자동 조절에 의해 유발된 TDP43의 과발현(overexpression)을 감소시키는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, STMN2 유전자의 하향조절을 방지 또는 감소시켜 스타트민-2의 정상 생리학적 수준(normal physiological level)을 유지하고/하거나 대상체내에서 스타트민-2의 발현이 감소된 경우 스타트민-2 발현을 증가시키는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 (a) 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, (1) 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나 (2) 대상체에서 자가 조절에 의해 유발된 TDP43의 과발현을 감소시키고 STMN2 유전자의 하향조절을 방지 또는 감소시킴으로써 대상체에서 스타트민-2의 정상 생리학적 수준을 유지시키거나 이의 발현을 증가시키는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, (1) 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나; (2) 대상체에서 자가 조절에 의해 유발된 TDP43의 과 발현을 감소시키고 STMN2 유전자의 하향조절을 방지 또는 감소시킴으로써 대상체에서 스타트민-2의 정상 생리학적 수준을 유지시키거나 이의 발현을 증가시키는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의: (a) 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 제2의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 2개의 약제학적 조성물은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(expression vector)가 제공된다.
바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 본 발명의 제2 양태의 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 세포가 제공된다.
바람직한 구현예에서, 세포는 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, TDP43 단백질병증과 관련된 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약(medicament)의 제조를 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도가 제공된다.
바람직한 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 용도는 본 발명의 제2 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 대상체에서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 키트(kit)가 제공되고, 여기서 키트는 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기(container) 속에 패키지된(packaged), 적어도 본 발명의 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 키트는 본 발명의 제2 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
본 발명은 이의 여전히 추가의 양태에 따라서, 본 발명의 AON 서열의 cDNA 또는 클로닝된 카피(cloned copy)로 확장될 뿐만 아니라 본 발명의 AON 서열의 하나 이상을 함유하는 벡터로도 확장된다. 본 발명은 이러한 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 추가로 확장된다.
본 발명의 추가의 특징은 수개의 이의 비-제한 구현예의 다음의 설명에서 보다 충분히 기술된다. 이러한 설명은 본 발명을 예시할 목적을 위해서만 포함된다. 이는 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 광범위한 요약, 개시내용 또는 설명에 한정되는 것으로 이해되지 않아야 한다.
다음의 설명은 다음의 첨부되는 도면을 참고로 제공된다.
도 1은 상이한 폴리아데닐하 부위를 활용하는 경우 생산되는 TARDBP의 전사체의 개략도를 나타낸다.
도 2는 TARDBP에서 엑손 2 및 3 표적화된 AON의 각각의 결합 위치의 개략도를 나타낸다.
도 3은 사람 섬유아세포에서 TARDBP 엑손 2 표적화된 AO를 사용한 형질감염 후 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 TARDBP 전사체 분석을 나타낸다.
도 4는 사람 섬유아세포에서 TARDBP 엑손 3 표적화된 AON을 사용한 형질감염 후 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 TARDBP 전사체 분석을 나타낸다.
도 5는 엑손 2 표적화된 AON 서열 번호: 3 및 12에 의해 유도된 TARDBP 전사체 녹다운(knockdown)의 메카니즘으로의 조사를 위한 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 TARDBP 전사체 분석을 나타낸다.
도 6은 TARDBP 폴리아데닐화 부위 1(PA1)을 차단하도록 설계된 AON을 사용한 사람 섬유아세포의 형질감염 후 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 TARDBP 전사체 분석을 나타낸다.
도 7은 150μM에서 TARDBP 표적화된 PMO AON ID 24 및 25를 사용한 핵감염을 통한 사람 섬유아세포의 형질감염 후 TARDBP 전사체 분석 및 TDP43 단백질 수준을 나타낸다.
도 8은 100 및 50μM 농도에서 TARDBP 표적화된 PMO(AON 25)를 사용한 형질감염을 통한 사람 섬유아세포의 3개의 형질감염에 대한 결과를 나타낸다. 오차 바아(error bar)는 평균의 표준 오차(standard error of the mean)를 나타낸다.
도 9는 사람 SH-SY5Y 세포에서 TARDBP 표적화된 PMO(AON 25)를 사용한 형질감염 후 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 STMN2 전사체 분석을 나타낸다.
도 10은 STMN2의 인트론 1 내 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 AON의 결합 위치의 개략도를 나타낸다.
도 11은 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25)를 단독으로 또는 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 2'O메틸-PS AON(서열 번호: 29, 30 또는 31) 또는 대조군 올리고(AON ID 28)과 함께 사용한 전기천공을 통한 사람 SH-SH5Y 세포의 형질감염 후 STMN2 전사체 분석을 나타낸다.
도 12는 서열 번호: 29(서열 번호: 32 및 33) 및 서열 번호: 30(서열 번호: 34 및 35)의 상부(upstream) 및 하부(downstream)의 AON 서열 5개 염기를 이동시킴(shifting)에 의한 서열 최적화 후 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 STMN2 전사체 분석을 나타낸다. 오차 바아는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 13은 TARDBP 엑손 3 스키핑(skipping) PMO(서열 번호: 25) 또는 서열 번호: 25 및 STMN2 표적화된 서열 번호: 36 또는 37의 조합을 사용한 전기천공을 통한 사람 SH-SH5Y 세포의 형질감염 후 STMN2 전사체 분석을 나타낸다.
도 14는 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25) 또는서열 번호: 25 및 STMN2 표적화된 서열 번호: 36 또는 37의 조합을 사용한 SH-SY5Y 세포의 3회 형질감염에 대한 STMN2 전사체 분석 결과를 나타낸다. 오차 바아는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15는 TARDBP 서열 번호: 25 및 STMN2 서열 번호: 36 또는 37 공-처리된(co-treated) 세포에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 영상(western blot image) 및 농도계측 분석(densitometric analysis)을 나타낸다.
도 16은 서열 번호: 37을 사용한 전기천공을 통한 사람 SH-SH5Y 세포의 형질감염 후 STMN2 전사체 분석을 나타낸다. 오차 바아는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 17은 서열 번호; 37만으로 처리된 세포에 대한 웨스턴 블롯 단백질 분석에 의해 나타낸 스타트민-2 발현의 결과를 나타낸다.
본 발명은 AON 치료요법을 사용하여 TDP43 단백질병증(예를 들면, ALS, AD, FTLD, PS, CTE, NBIAT1, AIS, NCL, LBD, IBMY 및 IBM)과 관련된 질환의 증상의 추가의 진행을 개선 또는 지연시키기 위한 예방학적 또는 치료학적 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 TARDBP 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화된 단리 또는 정제된 AON을 제공하고, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25; 서열 번호: 38 내지 58 또는 이의 변이체를 포함하는 목록으로부터 선택된 핵염기 서열(nucleobase sequence),
b. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25; 서열 번호: 38 내지 58 또는 이의 변이체가 또한 결합하는 표적 TARDBP 프레-mRNA 내의 적어도 하나 이상의 인접한 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 갖고,
c. 여기서 AON은 사람 TARDBP의 발현을 억제한다.
본 발명은 또한 STMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화하는 단리 또는 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66을 포함하는 목록으로부터 선택되거나,
b. 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66이 또한 결합하는 표적 STMN2 프레-mRNA내 적어도 하나 이상의 인접한 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 갖고,
여기서 AON은 이것이 감소되는 경우 스타트민-2의 정상적인 생리학적 수준을 유지하고/하거나 이의 발현을 증가시킨다.
편의상, 다음의 단락은 일반적으로 본원에 사용된 용어의 다양한 의미를 요약한다. 본 논의에 따라서, 본 발명의 조성물, 의약의 용도 및 방법에 관한 일반적인 양태에 논의되며, 이후 본 발명의 다양한 구현예의 특징을 입증하는 구체적인 실시예 및 이를 사용할 수 있는 방법이 따른다.
1. 정의
본원의 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어 및 어구의 의미는 하기 제공된다. 당해 분야에서의 용도의 사용과 본원에 제공된 이의 정의 사이에 명백한 불일치가 존재하는 경우, 명세서 내에 제공된 정의가 우선할 것이다.
당해 분야의 숙련가는 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것 이외에 다른 변화 및 변형을 허용할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변화 및 변형을 포함한다. 본 발명은 또한 명세서에 지칭되거나 나타낸 단계, 특징, 제형 및 화합물 모두를 개별적으로 또는 총괄적으로, 및 단계 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합 또는 단계 또는 특징의 임의의 2개 이상을 포함한다.
본 내용에 인용된 각각의 문서, 참고문헌, 특허원 또는 특허는 이의 전문이 참고에 의해 본원에 명확하게 포함되며, 이는 이것이 본 내용의 부분으로서 판독자에 의해 판독되고 고려될 수 있음을 의미한다. 본 내용에 인용된 이러한 문서, 참고문헌, 특허원 또는 특허는 단지 간결성의 이유를 위한 것이다. 그러나, 이러한 물질에 함유된 인?E된 물질 또는 정보 중 어느 것도 일반적인 상식인 것으로 이해될 수 있다.
본원에 언급된 임의의 생성물 또는 본원에 참고에 의해 포함된 임의의 문서에 대한 제조업자의 설명서, 설명, 생성물 명세, 및 생성물 쉬이트는 본원에서 참고로 본원에 포함되고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 구현예 중 어느 것에 의해 영역이 제한되지 않아야 한다. 이러한 구현예는 단지 예시의 목적으로 의도된다. 작용적으로 등가의 생성물, 제형 및 방법은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 영역 내에 명확하게 존재한다.
작업 실시예, 또는 달리 나타낸 것 이외에, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "약"은 퍼센트와 관련하여 사용된 경우 ±1%를 의미할 수 있다.
본원에 기술된 발명은 값(예컨대, 크기, 농도 등)의 하나 이상의 범위를 포함할 수 있다. 값의 범위는 범위 내 모든 값, 예를 들면, 범위를 정의하는 값, 및 범위에 대한 경계를 정의하는 이러한 값에 대해 매우 인접한 값과 동일하거나 실질적으로 동일한 결과를 초래하는 범위를 정의하는 값, 및 범위에 인접한 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 당해 분야의 숙련가는 범위의 상한치 또는 하한치에서 10% 변화가 전체적으로 적절하고 본 발명에 의해 포함되는 것으로 이해할 것이다. 보다 특히, 범위의 상한치 또는 하한치에서의 변화는 5%일 것이거나 더 큰 것에 상관없이, 당해 분야에서 일반적으로 인식되는 바와 같다.
본 명세서에서, 단수의 사용은 또한 달리 구체적으로 기술하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 기술하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including), 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들면, "포함하다(include)" 및 "포함된(included)"의 사용은 제한적이지 않다. 또한, 용어, 예를 들어, "성분(element)" 또는 "구성성분(component)"은 구체적으로 달리 기술하지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 성분 및 구성성분 및 하나 이상의 소단위(subunit)를 포함하는 성분 및 구성성분 둘 다를 포함한다. 또한, 용어 "부위(portion)"의 사용은 모이어티(moiety)의 부분 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 변화, 예를 들어, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 기술된 정수 또는 정수의 그룹의 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여하다"는 이의 목적한 작용 부위에서 조성물의 적어도 부분적인 국제화를 야기하여 목적한 효과를 생산하는 방법 또는 경로에 의한 대상체 내로의 조성물의 대체를 지칭한다. 본원에 기술된 화합물 또는 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 경구 또는 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장, 및 국소(예를 들면, 협측(buccal) 및 설하) 투여에 의해 투여될 수 있다.
본원에 사용된 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 발견될 수 있고 전체에 적용될 수 있다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 과학적 및 기술적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특징은 이제 다음의 비-제한적인 설명 및 실시예를 참고로 논의될 것이다.
2. 구현예
본 발명의 구현예는 일반적으로 증진된 안티센스 화합물, 및 이의 방법 또는 용도에 관한 것이고, 이는 TARDBP의 발현을 억제하도록 구체적으로 설계되어 있다. 세포질 내에서 TARDBP의 잘못된 국재화(mislocalisation)는 TDP43 단백질병증, 예를 들면, ALS, FTLD 및 AD와 관련된 질환에 연루되었다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환을 앓고 있는 환자에서 TDP43의 발현을 억제하는 것이 이러한 환자의 증상의 진행을 지연시키고/시키거나 생존을 증진시키는 효과를 가질 수 있다는 이해를 기반으로 한다. 이는 TDP43 단백질병증, 예를 들면, TDP43의 일방적인 상향조절(runaway upregulation)을 초래하는 TDP43의 세포질성 잘못된 국재하가 다수의 신경학적 상태, 예를 들면, ALS, FTLD 및 AD와 관련되어 있기 때문이다. 따라서, TARDBP 유전자(이는 TDP43을 암호화한다)의 억제는 TDP43 단백질병증과 관련된 질환, 예를 들면, ALS, FTLD 및 AD를 앓는 환자의 증상의 진행을 지연시키고/시키거나 이의 생존을 증진시키는 것으로 추정된다. 이러한 치료요법으로부터 유리할 수 있는 환자는 TARDBP 유전자 내에 돌연변이 또는 미스폴딩(misfolding)을 가질 수 있다. 그러나, TARDBP 돌연변이 또는 미스폴딩을 나타내지 않는 환자는 또한 TARDBP 유전자를 억제하는 치료에 대해 반응할 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 일반적으로 증진된 안티센스 화합물, 및 이의 방법 또는 용도에 관한 것이며, 이는 구체적으로 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하도록 설계되어 있다. 스타트민-2는 중추 및 말초 신경계 내 재생 공정에서 중요한 역할을 담당한다. 감소된 스타트민-2 발현은 ALS 환자로부터 취한 조직 샘플로부터 운동 뉴우런에서 생체 내(in vivo) 확인되었다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 또한 TDP43 발현을 감소하도록 설계된 AON을 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하도록 설계된 AON과 조합하는 치료학적 전략이 스타트민-2 고갈에 의해 유발된 뉴우런 취약성(neuronal vulnerability)에 대해 보호하면서 세포질성 TDP43 과발현의 영향을 감소시킬 수 있다는 이해를 기반으로 한다. 스타트민-2 단백질의 정상적인 생리학적 수준은 STMN2 전사체에 대해 AON을 표적화함으로써 유지될 수 있다.
A. 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 TARDBP 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자를 표적화하는 하나 이상의 단리 또는 정제된 AON을 제공하고, 여기서 AON은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58(하기 표 1 및 2에서 나타낸 바와 같음)을 포함하는 목록으로부터 선택된 핵염기 서열을 갖고, 여기서 AON은 사람 TDP43의 발현을 억제한다. 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
보다 일반적으로, 본 발명은 TARDBP 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화하는 단리 또는 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58을 포함하는 목록으로부터 선택되거나,
b. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58이 또한 결합하는 표적 TARDBP 프레-mRNA내 적어도 하나 이상의 인접한 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 갖고,
c. 여기서 AON은 사람 TARDBP의 발현을 억제한다.
본 발명은 또한 STMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자를 표적화하는 하나 이상의 단리 또는 정제된 AON을 제공하고, 여기서 AON은 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66(하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같음)을 포함하는 목록으로부터 선택된 핵염기 서열을 갖고, 여기서 이러한 AON은 스타트민-2의 정상적인 생리학적 수준을 유지하거나 이의 하향조절을 감소시킨다. 보다 일반적으로, 본 발명은 또한 STMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화하는 단리또는 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66을 포함하는 목록으로부터 선택되거나,
b. 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66이 또한 결합하는 표적 STMN2 프레-mRNA내 적어도 하나 이상의 인접한 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 갖고,
c. 여기서 이러한 AON은 스타트민-2의 정상적인 생리학적 수준을 유지하거나 이의 하향조절을 감소시킨다.
바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
[표 1]
본 발명의 임의의 AON에서, 본원에 제공된 서열의 우라실(U)은 티민(T)으로 대체될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 AON은 표 2에 나열된 바와 같은 서열을 갖는다.
[표 2]
본 문서의 실시예에 기술된 추가의 AON은 표 3에 나타낸 것을 포함한다.
[표 3]
본 발명의 특정의 AON은 엑손 2 및 3 내의 사람 TARDBP 프레-mRNA 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 사람 TARDBP 프레-mRNA의 엑손 3 내 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있고 엑손의 스키핑을 유도한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 AON은 서열 번호: 16 또는 서열 번호: 25의 서열이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 엑손 2 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 일 구현예에서, AON은 서열 번호: 12 또는 서열 번호: 24이다.
본 발명의 특정의 AON은 또한 인트론 1 내의 사람 STMN2 프레-mRNA 크립틱 엑손 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 사람 STMN2 프레-mRNA의 인트론 내 크립틱 엑손 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 3개의 인핸서 부위 핫스폿(hotspot)에 대해 표적화된 AON을 사용한 온라인 스플라이스 예측 도구에 의해 예측된 바와 같은 스플라이싱 인핸서의 결합을 억제할 수 있는 부위가 선택되었다. 스플라이싱 인핸서의 감소된 결합은 스플라이세오솜(spliceosome)에 의한 엑손의 인식을 감소함으로써 크립틱 엑손이 성숙한 mRNA 전사체로부터 배제되도록 한다. 이는 크립틱 엑손을 함유하지 않는 성숙한 STMN2 전사체가 해독되므로 증가된 수준의 스타트민-2가 생산되도록 할 수 있다.
바람직하게는, 사람 STMN2 프레-mRNA 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계된 AON은 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66의 목록으로부터 선택되거나, 보다 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 36 및 37로부터 선택된다.
용어 "안티센스 올리고머" 및 "안티센스 화합물" 및 "안티센스　올리고뉴클레오타이드" 또는 "AON"은 상호교환적으로 사용되며 사이클릭 소단위의 선형 서열을 지칭하고, 각각은 염기-쌍화 모이어티가 왓슨-크릭 염기 쌍화(Watson-Crick base pairing)에 의해 핵산(전형적으로 RNA)내 표적 서열에 하이브리드화함으로써, 표적 서열 내에서 핵산:올리고머 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성하도록 하는 소단위간 연결에 의해 연결된, 염기-쌍화 모이어티를 지닌다. 사이클릭 소단위는 리보스 또는 다른 펜토스 당 또는 바람직한 구현예에서, 모르폴리노 그룹을 기반으로 한다(참고: 하기 모르폴리노 올리고머의 설명). 올리고머는 표적 서열에 대해 정확하거나 근처의 서열을 가질 수 있고; 올리고머의 말단 근처의 서열내 변화는 일반적으로 내부내 변화에 바람직하다. 또한 당해 분야에 고지된 다른 안티센스 제제 중에서, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA), 록킹된 핵산(locked nucleic acid; LNA), 및 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드가 고려된다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함하고, 여기서 RNA는 DNA 주형(template)의 전사에 의해 제조 또는 수득된다. 본 발명에 따라서, 핵산은 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥으로서 및 선형 또는 공유결합적으로 환형의 폐쇄된 분자로서 존재할 수 있다.
"단리된"은 이의 천연 상태로 이를 일반적으로 동반하는 구성성분으로부터 실질적으로 또는 필후적으로 유리된 물질을 의미한다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은, "단리된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "단리된 올리고뉴클레오타이드"는 천연적으로 발생하는 상태에서 이를 플랭킹(flanking)하는 서열로부터 정제 또는 제거된 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 게놈내 단편에 대해 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭할 수 있다. 용어 "단리하는"은 이것이 세포를 지칭하므로 공급 대상체(예컨대, 폴리뉴클레오타이드 반복체 질환을 지닌 대상체)로부터의 세포(예컨대, 섬유아세포, 림프아세포)의 정제를 지칭한다. mRNA 또는 단백질의 문맥에서, "단리하는"은 공급원, 예컨대, 세포로부터 mRNA 또는 단백질의 회수를 지칭한다.
AON은 이것이 하이브리드화하는 표적 서열에 대해 "지시된" 또는 "표적화된" 것으로 일컬어질 수 있다. 특정의 구현예에서, 표적 서열은 폴리아데닐화 부위 및 주변 영역을 포함하는 영역을 포함한다. 표적 서열은 전형적으로 mRNA의 AUG 출발 코돈, 해독 억제 올리고머(Translation Suppressing Oligomer), 또는 프레-가공된 mRNA의 스플라이스 부위, 스플라이스 억제 올리고머(Splice Suppressing Oligomer; SSO)를 포함하는 영역이다. 스플라이스 부위에 대한 표적 서열은 프레-가공된 mRNA 내 정상의 스플라이스 수용체 연결(junction)의 하부의 이의 5' 말단 1 내지 약 25개 염기쌍을 갖는 mRNA를 포함할 수 있다. 바람직한 표적 서열은 스플라이스 부위를 포함하는 프레-가공된 mRNA의 임의의 영역이거나 엑손 암호화 서열 내에 전적으로 함유되거나 스플라이스 수용체 또는 공여체 부위에 걸쳐있다(span). 올리고머는, 이것이 상술된 방식으로 표적의 핵산에 대해 표적화되는 경우, 보다 일반적으로 생물학적으로 관련된 표적, 예를 들면, 단백질, 바이러스, 또는 세균"에 대해 표적화"되는 것으로 일컬러진다.
본원에 사용된 바와 같은, "충분한 길이" 또는 "충분한 서열 상보성"은 표적 TARDBP 프레-mRNA(또는 STMN2 프레-mRNA) 내에 적어도 1개, 보다 전형적으로 1 내지 30개의, 인접한 핵염기에 대해 상보성인 AON을 지칭한다. 일부 구현예에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 TARDBP 프레-mRNA 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 인접한 핵염기를 포함한다. 다른 구현예에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 TARDBP 프레-mRNA(또는 STMN2 프레-mRNA)내에 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접한 핵염기를 포함한다. 바람직하게는, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40개 이상의 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 10 내지 약 30개 뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 15 내지 약 25개 뉴클레오타이드이다. 여전히 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 20 내지 30개, 또는 20 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 여전히 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 22 내지 28, 25 내지 28, 24 내지 29 또는 25 내지 30개 뉴클레오타이드이다.
특정의 구현예에서, AON은 표적 RNA(예컨대, 프레-mRNA)의 영역을 효과적인 방식으로 차단하기 위한 표적 RNA에 대해 충분한 서열 상보성을 갖는다. 일부 구현예에서, TARDBP 프레-mRNA의 이러한 차단은 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 표적 프레-mRNA(예컨대, TARDBP 유전자 프레-mRNA)이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상보성(complementary 또는 complementarity)"은 염기-쌍화 규칙(base-pairing rule)에 의해 조절된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)을 참고로 사용된다. 예를 들면, 서열 5'-A-G-T-3'는 서열 "'-T-C-A-5'에 대해 상보성이다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기서 핵산 염기 중 일부 만이 염기 쌍화 구조에 따라 일치된다. 또는 핵산 사이에 "완전"하거나 "전체의" 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 하이브리드화의 효능 및 강도에서 충분한 효과를 갖는다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "상보성" 서열은 표적 RNA 또는 DNA 서열에 대해 일부 상보성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열의 보완물(complement)은 대표적인 뉴클레오타이드 서열을 지닌 이중-가닥 DNA 또는 RNA 분자를 형성할 수 있고, 뉴클레오타이드를 샤가프 법칙(Chargaff's rule)(A<>T; G<>C; A<>U)에 따라서 및 5' 내지 3' 방향으로 판독하여, 즉, 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 반대 방향으로 이의 상보성 뉴클레오타이드에 의해 대체함으로써 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 유래될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다. 이는 또한 DNA/RNA의 합성 유사체(예컨대, 2' F-ANA 올리고)를 포함한다.
용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 상보성(complementarity)의 정도를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드 서열과 표적 RNA 또는 DNA의 상보성 서열 사이에 부분적인 상동성 또는 완전한 서열 동일성이 존재할 수 있다. 부분적으로 동일한 서열은 표적 RNA 또는 DNA에 적어도 부분적으로 하이브리드화하여, 부분적인 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 의 형성 및 표적 RNA 또는 DNA의 부분적인 또는 전체적인 분해를 초래하는 올리고뉴클레오타이드이다. 완전하게 동일한 서열은 표적 RNA 또는 DNA에 완전히 하이브리드화하여 완전한 헤테로듀플렉스의 형성, 및 표적 RNA 또는 DNA의 부분적인 또는 전체적인 분해를 초래하는 올리고뉴클레오타이드이다.
특정의 구현예에서, AON은 표적 서열에 대해 100% 상보성일 수 있거나, 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 세포 뉴클레아제의 작용 및 생체 내에서 발생할 수 있는 분해의 다른 방식을 견디기에 충분히 안정한 한, 예컨대, 변이체를 수용하기 위한 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다. 따라서, 특정의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이에 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
미스매치는, 존재하는 경우, 전형적으로 중앙에서보다 하이브리드 듀플렉스(hybrid duplex)의 말단 영역을 향해 거의 탈안정화되지 않는다. 허용된 미스매치의 수는 듀플렉스 안정성의 잘 이해된 원리에 따라서, 올리고뉴클레오타이드의 길이, 듀플렉스 내 G:C 염기 쌍의 퍼센트, 및 듀플렉스 내 미스매치(들)의 위치에 의존할 것이다. 이러한 AON이 표적 서열에 대해 필수적으로 100% 상보성이지 않지만, 이는 표적 서열에 안정하게 및 특이적으로 결합함으로써, 표적 프레-RNA에 대한 절단 인자 결합이 조율되도록 하는 것이 효과적이다.
AON과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm의 기능 및 세포 효소 절단에 대한 듀플렉스의 민감성(susceptibility)이다. 상보성-서열 RNA와 관련하여 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 통상의 방법, 예를 들면, 문헌: Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, (1985), 107-108에 기술된 것에 의해 또는 문헌: Miyada C. G. and Wallace R. B., (1987), Methods Enzymol. 154, 94-107에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 특정의 구현예에서, AON은 상보성-서열 RNA와 관련하여, 체온 보다 더 크고 바람직하게는 약 45℃ 또는 50℃보다 더 큰 결합 Tm을 가질 수 있다. 60 내지 80℃ 이상의 Tm이 또한 포함된다.
변이체의 추가의 예는 서열 번호: 1 내지 66 중 어느 것의 전체 길이에 걸쳐 약 또는 적어도 약 70% 서열 동일성 또는 상동성, 예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 AON을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 사람 TARDBP 프레-mRNA의 엑손 3 내 적합한 서열을 보완하고 엑손의 스키핑을 유도하도록 설계되어 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 엑손 2 내에 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다.
바람직하게는, TARDBP 유전자 전사체 또는 이의 부분에서 엑손 스키핑을 유도하기 위한 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 AON이 제공된다. 일 양태에서, AON은 TARDBP 유전자내 엑손 2, 또는 3의 스키핑을 유도한다. 가장 바람직하게는, AON은 엑손 3의 스키핑을 유도한다.
다른 구현예에서, AON은 폴리아데닐화 신호를 차단함으로써 PA1의 용도를 입체적으로 억제함에 의한 TARDBP 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 이론에 얽매이지 않고, TARDBP 전사체는 대안적인 스플라이싱 및 수개의 폴리아데닐화 신호(PA1, PA2 및 PA4)의 사용을 통해 자가조절된다(문헌: Koyama et al., 2016에 기술된 바와 같음). TDP43이 핵에 풍부한 경우, 이는 전사체(인트론 7)의 3-UTR내 위치에 결합할 수 있다. 이는 PA1의 사용을 차단하고 PA4 또는 PA2의 사용을 개시한다. 이것이 발생하는 경우, 인트론 7 수용체 부위는 전사체 내에 남아서 인트론 7이 전사체 외부로 스플라이싱되도록 하고 인트론 6 및 8 외부로 후속적인 스플라이싱을 개시하도록 한다. 수득되는 전사체(II 또는 III)는 넌센스(nonsense) 매개된 mRNA 붕괴(decay)에 적용된다. 소량의 스플라이싱되지 않는 전사체가 또한 잔존할 수 있고 핵 내에 유지된다. TDP43이 핵으로부터 고갈되어 인트론 7에 결합할 수 없는 경우, PA1이 사용된다. Int 7 수용체 부위는 PA1의 하부에 존재하므로 전사체 내에 잔존하지 않는다. 이러한 전사체(I)는 단백질로 해독된다. 전사체의 개략도는 도 1에서 알 수 있다. 따라서, 폴리아데닐화 신호를 차단함으로써 PA1의 사용을 입체적으로 억제하는 AON은 해독된 전사체(I)의 감소 및 해독되지 않는 전사체(II, III, IV)에서의 증가를 초래할 수 있다.
AON은 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 제공된 것으로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호: 12, 16, 24 및 25를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, AON은 서열 번호: 16 또는 25를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 사람 STMN2 프레-mRNA의 인트론 1 내 크립틱 엑손 내의 적합한 서열을 보완하기 위해 설계되어 있다. 3개의 인핸서 부위 핫스폿(enhancer site hotspot)에 대해 표적화된 AON을 사용하는 온라인 스플라이스 예측 도구에 의해 예측된 바와 같이 스플라이싱 인핸서의 결합을 억제할 수 있는 부위를 선택하였다. 스플라이싱 인핸서의 감소된 결합은 스플라이세오솜(spliceosome)에 의한 엑손의 인식을 감소시켜, 크립틱 엑손이 성숙한 mRNA 전사체로부터 배제되도록 한다. 이는 크립틱 엑손을 함유하지 않는 성숙한 STMN2 전사체가 해독되므로 스타트민-2의 증가된 수준이 생산되도록 할 수 있다.
B . 사용 방법
본 발명은 TDP43의 발현을 억제하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은:
(a) 본원에 기술된 AON의 하나 이상을 제공하는 단계 및
(b) 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, AON은 표 1 또는 표 2에 제시된 것으로부터 선택될 수 있다. 서열은 바람직하게는 서열 번호: 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58, 및 이의 조합 또는 칵테일(cocktail) 중 어느 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이는 엄격한 하이브리드화 조건(stringent hybridisation condition) 하에서 이러한 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열, 이에 대해 상보성인 서열, 변형된 염기(modified base)를 함유하는 서열, 변형된 골격(modified backbone), 및 TARDBP 유전자 전사체에서 RNA 프로세싱 활성을 지니거나 조율하는 기능성 절두(truncation) 또는 이의 연장부를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호: 12, 16, 24 및 25를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, AON은 서열 번호: 16 또는 25를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용된 AON은 TARDBP 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 일 양태에서, AON은 TARDBP 프레-mRNA에서 엑손 스키핑의 유도를 통해 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 바람직하게는, AON은 엑손 2 또는 3의 스키핑을 유도한다. 가장 바람직하게는, AON은 엑손 3의 스키핑을 유도한다. 다른 구현예에서, AON은 일부 다른 메카니즘에 의해 TDP43의 발현을 감소시킬 수 있다.
바람직한 구현예로서, AON은 또한 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 이러한 AON은 인트론 내 사람 STMN2 프레-mRNA 크립틱 엑손 내에 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 특정의 AON은 사람 STMN2 프레-mRNA의 인트론 1 내 크립틱 엑손 내의 적합한 서열을 보완하도록 설계되어 있다. 3개의 인핸서 부위 핫스폿에 대해 표적화된 AON을 사용한 온라인 스플라이스 예측 도구에 의해 예측된 바와 같이 스플라이싱 인핸서의 결합을 억제할 수 있는 부위를 선택하였다. 스플라이싱 인핸서의 감소된 결합은 스플라이세오솜에 의한 엔속의 인식을 감소시켜, 크립틱 엑손이 성숙한 mRNA 전사체로부터 배제되도록 한다. 이는 크립틱 엑손을 함유하지 않는 성숙한 STMN2 전사체가 해독되므로 스타트민-2의 증가된 수준이 생산되도록 할 수 있다.
(1) TDP43 발현을 감소시키도록 설계된 AON(서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58)을; (2) 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하거나 감소시키도록 설계된 AON(서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66)과 조합시키는 치료학적 전략은 스타트민-2 고갈에 의해 유발된 뉴우런 취약성에 대해 보호하면서 세포질성 TDP43 과발현의 충격을 감소시킬 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 스타트민-2의 정상적인 생리학적 수준을 유지하면서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환을 앓는 대상체에서 TDP43 단백질병증을 개선시키기위한 수단을 제공하는 것을 추구한다.
바람직하게는, 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하도록 설계된 AON은 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66의 목록으로부터 선택되거나, 보다 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 36 및 37로부터 선택된다.
표적 서열 및 선택적인 하이브리드화
올리고머 및 DNA, cDNA 또는 RNA는 각각의 분자내 상응하는 위치의 충분한 수가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유된 경우 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화할 수 있는" 및 "상보성"은 안정하고 특이적인 결합이 올리고머와 DNA, cDNA 또는 RNA 표적 사이에 발생하도록 하기에 충분한 정도의 상보성 또는 쌍화를 나타내기 위해 사용된 용어이다. AON의 서열이 특이적으로 하이브리드화될 이의 표적 서열의 것에 대해 100% 상보성인 필요가 없음은 당해 분야에서 이해된다. 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA 생성물의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적인 결합이 요구되는 조건, 즉, 생체 내 검정 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건, 및 시험관 내 검정의 경우에, 검정이 수행되는 조건 하에서 비-표적 서열에 대한 AON의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우 AON은 특이적으로 하이브리드화될 수 있다.
선택적인 하이브리드화는 낮은, 중간의 또는 높은 엄격성(stringency) 조건 하에 있을 수 있지만, 바람직하게는 높은 엄격성 하에 있다. 당해 분야의 숙련가는 하이브리드화의 엄격성이 염기 조성, 상보성 가닥의 길이 및 하이브리드화 핵산 사이의 뉴클레오타이드 염기 미스매치의 수 외에, 염 농도, 온도, 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향받을 것이다. 엄격한(stringent) 온도 조건은 일반적으로 30℃ 초과, 전형적으로 37℃ 초과, 및 바람직하는 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃, 및 전형적으로 60℃ 내지 80℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 엄격한 염 농도는 통상적으로 1000 mM 미만, 전형적으로 500 mM 미만, 및 바람직하게는 200 mM 미만일 것이다. 그러나, 매개변수의 조합은 임의의 단일 매개변수의 척도보다 훨씬 더 중요하다. 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 65℃ 및 0.1 x SSC(1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨 pH 7.0)이다. 따라서, 본 발명의 AON은 표 1 또는 표 2에 제공된 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 올리고머를 포함할 수 있다.
주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 온도이다. 이러한 하이브리드화는 표적 서열에 대해 AON의 "근처" 또는 "실질적인" 상보성, 뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다.
전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 안티센스 올리고머의 뉴클레오타이드와 적어도 약 14개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 약 55%의 동일성, 바람직하게는 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성이 존재하는 경우 발생할 것이다. 기술된 바와 같은 상동성 비교의 길이는 보다 긴 스트레치(stretch)에 걸쳐 존재할 수 있고 특정의 구현예에서는 흔히 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 약 12개의 뉴클레오타이드, 보다 일반적으로 적어도 약 20개, 흔히 적어도 약 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 29, 30, 31 또는 32개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 존재할 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 AON 서열은 본원의 서열 목록에 나타낸 서열에 대해 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 86, 87, 88, 89 또는 90%의 상동성을 갖는다. 보다 바람직하게는 적어도 91, 92, 93 94, 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96, 97, 98% 또는 99%의 상동성이 존재한다. 일반적으로, 안티센스 올리고머의 길이가 짧을 수록, 선택적인 하이브리드화를 수득하는데 요구된 상동성이 더 크다. 결과적으로, 본 발명의 AON이 약 30 미만의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 동일성 퍼센트가 본원의 서열 목록에 제공된 AON과 비교하여 75% 초과, 바람직하게는 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96, 97, 98% 또는 99% 초과인 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 상동성 비교는 서열 비교 프로그램, 예를 들면, GCG Wisconsin Bestfit 프로그램 또는 GAP(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방식에서 본원에 인용된 것과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 정렬 내로 갭(gap)의 삽입에 의해 비교될 수 있고, 이러한 갭은 예를 들면, GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 측정된다.
본 발명의 AON은 감소된 상동성의 영역, 및 표적 서열과 정확한 상동성의 영역을 가질 수 있다. 올리고머가 이의 천연 길이에 대해 정확한 상동성을 갖는 것이 필수적이지는 않다. 예를 들면, 올리고머는 표적 서열과 동일한 적어도 4 또는 5개의 염기의 연속된 스트레치, 바람직하게는 표적 서열과 동일한 적어도 6 또는 7개의 염기의 연속된 스트레치, 보다 바람직하게는 표적 서열과 동일한 적어도 8 또는 9개의 염기의 연속된 스프레치를 가질 수 있다. 올리고머는 표적 서열에 대해 동일한 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 염기의 스트레치를 가질 수 있다. 올리고머 서열의 남아있는 스트레치는 표적 서열과 간헐적으로 동일할 수 있는데; 예를 들면, 남아있는 서열은 동일한 서열에 이어, 동일하지 않은 서열에 이어서, 동일한 서열을 가질 수 있다. 대안적으로(또는 마찬가지로) 올리고머 서열은 완전한 상동성 미만의 스트레치로 산재된 동일한 서열(예를 들면, 3, 4, 5 또는 6개 염기)의 수개의 스트레치를 가질 수 있다. 이러한 서열은 바람직하게는 절단 변형 활성의 손실이 없거나 거의 없을 것이다.
생리학적 반응
일 양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 생리학적 반응을 유도한다. 바람직하게는, 방법은 TDP43의 발현을 감소시킨다.
용어 "조율하다(modulate 또는 modulates)"는 임의로 정의되고/되거나 통계적으로 유의적인 양에 의해 하나 이상의 정량가능한 매개변수를 "증가시킴" 또는 "감소시킴"을 포함한다. 용어 "증가하다" 또는 "증가하는", 또는 "향상하다" 또는 "향상하는", 또는 "자극하다" 또는 "자극하는"은 일반적으로 AON 또는 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 관련하여 세포 또는 대상체에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하부 효과)를 생산하거나 유발하는 하나 또는 AON 또는 조성물의 능력을 지칭한다.
"향상하다" 또는 "향상하는" 또는 "증가하다" 또는 "증가하는", 또는 "자극하다" 또는　"자극하는"은 일반적으로 안티센스 화합물 또는 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 비교하여, 세포 또는 대상체에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하부 효과)를 생산하거나 유발하는 하나 또는 안티센스 화합물 또는 조성물의 능력을 지칭한다. "증가된" 또는 "항샹된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의적인" 양이며, 안티센스 화합물이 없이(제제의 부재하에) 또는 대조군 화합물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상(예컨대, 500, 1000배)(예를 들면 1 사이 및 초과의 모든 정수 및 소수 점)(예컨대, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등)인 증가를 포함할 수 있다.
용어 "감소하는" 또는 "감소하다"는 일반적으로 AON 없이 또는 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 관련하여 세포 또는 대상체에서 생리학적 반응(즉, 하부 효과)를 생산하거나 유발하는 하나 또는 AON의 능력을 지칭한다. 용어 "감소하다" 또는 "억제하다"는 일반적으로 진단 분야에서 통상의 기술에 따라 측정된 바와 같은, 관련된 생리학적 또는 세포 반응, 예를 들면, 본원에 기술된 질환 또는 상태의 증상을 "감소시키는" 본 발명의 하나 이상의 안티센스 화합물의 능력에 관한 것일 수 있다. 관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체 내 또는 시험관 내)은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이고 TDB-43 관련된 상태의 증상 또는 병리학에서의 감소를 포함할 수 있다. 반응에서 "감소"는 안티센스 화합물 없이 또는 대조군 조성물에 의해 생산된 반응과 비교하여 통계적으로 유의적일 수 있고, 이들 사이의 모든 정수를 포함하는, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체 내 또는 시험관 내)은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이고 TDP43 발현의 양에서의 감소를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 통계적으로 유의적인 양이며, AON 없이(제제의 부재하에) 또는 대조군 화합물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상(예컨대, 500, 1000배)(1 사이 및 초과의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8을 포함함)인 증가를 포함한다. 용어 "감소하다" 또는 "억제하다"는 진단 분야에서 통상의 기술에 따라 측정된 바와 같은, 일반적으로 관련된 생리학적 또는 세포 반응, 예를 들면, 본원에 기술된 질환의 증상 또는 상태를 "감소시키는" 하나 이상의 AON 또는 조성물의 능력에 관한 것일 수 있다. 관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체 내 또는 시험관 내)은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이고 TDP43 단백질병증, 예를 들면, ALS, FTLD, AD와 관련된 질환의 증상 또는 병리학에서의 감소를 포함할 수 있다. 반응에서 "감소하다"는 AON 없이 또는 대조군 조성물에 의해 생산된 반응과 비교하여 통계적으로 유의적일 수 있고, 이들 사이의 모든 정수를 포함하여, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체 내 또는 시험관 내)은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이고 스타트민-2 발현의 양을 유지하는 것을 포함할 수 있고 스타트민-2의 하향조절을 방지함을 포함한다. 양을 "유지하는 것"은 전형적으로 통계적으로 유의적인 양이며 감소되지 않은 스타트민-2 수준을 포함할 수 있다. 바람직하게는 스타트민-2의 수준은 감소되지 않으며, 여기서 감소는 AON 없이(제제의 부재하에) 또는 대조군 화합물에 의해 생산된 스타트민-2 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이하(예컨대, 500, 1000배)(1 사이 및 초과의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8을 포함함)이다. 바람직하게는, 스타트민-2 발현은 부정적인 관련된 생리학적 또는 세포 반응을 유발하여, 진단 분야에서 통상의 기술에 따라 측정된 바와 같이, 본원에 기술된 질환 또는 상태, 예를 들면, ALS, FTLD, AD의 증상을 초래하는 수준까지 감소되지 않아야 한다. 일 구현예에서, STMN2 AON의 투여 후, 스타트민-2 발현은 증가한다. 추가의 구현예에서, STMN2 AON의 투여 후, 스타트민-2 발현은 어떠한 추가의 고갈을 방지하거나 TDP43 AON에 의해 유발된 고갈을 방지하기 전에 증가한다.
변형된 AON
일부 구현예에서, AON은 천연적으로 발생하는 핵산 분자의 화학 조성을 갖는데, 즉, AON은 변형되거나 치한된 염기, 당, 또는 소단위간 연결(inter-subunit linkage)을 포함하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 비-천연적으로 발생하는 핵산 분자, 또는 "올리고뉴클레오타이드 유사체"이다. 예를 들면, 비-천연적으로 발생하는 핵산은 하나 이상의 비-천연 염기, 당, 및/또는 소단위간 연결, 예컨대, 천연적으로 발생하는 핵산 분자에서 발견된 것과 비교하여 변형되거나 치환된 염기, 당, 및/도는 연결을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 하기에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 비-천연적으로 발생하는 핵산은 하나 이상의 변형의 유형, 예컨대, 당 및 염기 변형, 당 및 연결 변형, 염기 및 연결 변형, 또는 염기, 당, 및 연결 변형을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, AON은 비-천연(예컨대, 변형되거나 치환된) 염기를 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 비-천연(예컨대, 변형되거나 치환된) 당을 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 비-천연(예컨대, 변형되거나 치환된) 소단위간 연결을 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 하나 이상의 변형 또는 치환의 유형, 예컨대, 비-천연 염기 및/또는 비-천연 당, 및/또는 비-천연 소단위 간 연결을 함유한다.
따라서, (i) 변형된 골격 구조, 예컨대, 천연적으로 발생하는 올리고- 및 폴리뉴클레오타이드에서 발견된 표준 포스포디에스테르 연결 이외에 다른 골격, 및/또는 (ii) 변형된 당 모이어티(modified sugar moiety), 예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티 보다는 오히려 모르폴리노 모이어티를 갖는 비-천연적으로 발생하는 AON이 포함된다. 올리고뉴클레오타이드 유사체는 왓슨-크릭 염기 쌍화에 의해 표준 폴리뉴클레오타이드 염기에 수소 결합할 수 있는 염기를 뒷받침하며, 여기서 유사체 골격은 표준 뉴클레오타이드(예컨대, 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA)내 올리고뉴클레오타이드 유사체 분자와 염기 사이에 서열-특이적인 양식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 나타낸다. 바람직한 유사체는 실질적으로 하전되지 않은, 인 함유 골격을 갖는 것이다.
본 발명의 당해 분야의 숙련가가 본 발명의 목적에서 사용가능할 수 있는 적합한 골격의 다른 형태를 알고 있을 것이지만, AON을 생산하기 위한 한가지 방법은 2' 하이드록시리보스 위치의 메틸화이고 포스포로티오에이트 골격의 혼입은 RNA와 실질적으로 유사하지만 뉴클레아제 분해에 대해 훨씬 더 내성인 분자를 생산한다.
안티센스 올리고머와의 듀플렉스 형성 동안 프레-RNA의 분해를 피하기 위하여, 방법에 사용된 AON을 채택하여 내인성 Rnase H에 의한 절단을 최소화시키거나 방지할 수 있다. Rnase H를 활성화시키지 않는 안티센스 분자는 공지된 기술(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,149,797호)에 따라 제조할 수 있다. 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 서열일 수 있는, 이러한 안티센스 분자는 단순히 이의 하나의 구성원으로서 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 듀플렉스 분자에 대한 Rnase H의 결합을 입체적으로 방해 또는 방지하는 임의의 구조적 변형을 함유하며, 이러한 구조적 변형은 듀플렉스 형성을 실질적으로 방해하거나 파괴하지 않는다. 듀플렉스 형성에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 부위는 이에 결합하는 Rnase H에 포함된 이러한 부위와는 실질적으로 상이하므로, Rnase H를 활성화시키지 않는 다수의 안티센스 분자가 이용가능하다. 이러한 특성은, 세포내 또는 Rnase H를 함유하는 조 추출물로서 메틸화되지 않은 올리고머를 사용한 RNA의 처리가 프레-mRNA:AON 듀플렉스의 분해를 초래할 수 있으므로, 매우 바람직하다. 바이-패싱(by-passing)할 수 있거나 이러한 분해를 유도하지 않는 변형된 AON의 어떠한 형태도 본 발명에서 사용될 수 있다. 뉴클레아제 내성은 본 발명의 AON을 변형시켜 이것이 부분적으로 불포화된 지방족 탄화수소 쇄 및 카복실산 그룹, 에스테르 그룹, 및 알코올 그룹을 포함하는 하나 이상의 극성 또는 하전된 그룹을 포함하도록 하으로써 달성될 수 있다.
RNA와 듀플렉스된 경우 세포 Rnase H에 의해 절단되지 않는 AON의 예는 2'-O-메틸 유도체이다. 이러한 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오타이드는 세포 환경 및 동물 조직에서 안정하고, RNA와의 이의 듀플렉스는 이의 리보- 또는 데옥시리보-대응물보다 더 높은 Tm 값을 갖는다. 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 플루오르화된 마지막 3'-말단 뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 여전히 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 마지막 3-말단 뉴클레오타이드 염기 중 적어도 2개 사이에 포스포로티오에이트 결합 연결을 가지고, 바람직하게는 마지막 4개의 3'-말단 뉴클레오타이드 염기 사이의 포스포로티오에이트 결합 연결을 갖는다.
감소된 RNA 절단은 또한 대안적인 올리고뉴클레오타이드 화학을 사용하여 달성할 수 잇다(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,149,797호). 예를 들면, AON은 다음을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다: 포스포르아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer; PMO); PMO-X; PPMO; 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA); 록킹된 핵산(locked nucleic acid; LNA) 및 알파-L-LNA, 2'-아미노 LNA, 4'-메틸 LNA 및 4'-O-메틸 LNA를 포함하는 유도체; 에틸렌 브릿지된 핵산(ethylene bridged nucleic acid; ENA) 및 이의 유도체; 포스포로티오에이트 올리고머; 트리사이클로-DNA 올리고머(tcDNA); 트리사이클로포스포로티오에이트 올리고머; 2'-O-메틸-변형된 올리고머(2'-Ome); 2'-O-메톡시 에틸(2'-MOE); 2'-플루오로, 2'-플루오로아라비노(FANA); 록킹되지 않은 핵산(unlocked nucleic acid; UNA); 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid; HNA); 사이클로헥세닐 핵산(cyclohexenyl nucleic acid; CeNA); 2'-아미노(2'-NH2); 2'-O-에틸렌아민 또는 믹스머(mixmer) 또는 갭머(gapmer)로서 앞서의 임의의 조합. PMO의 주요 이점은 증가된 안전성 프로파일이다. 이의 중성 전하는 이들이 감소된 혈소판 활성화 및 면역 활성화로 단백질 상호작용에 대해 거의 민감하지 않도록 한다. 이는 또한 뉴클레아제에 의한 분해를 감소시킨다. 이는 또한 5년 이상 동안 DMD 환자에서 안전하에 사용되었다.
일 양태에서, 본 발명의 변형된 AON은 펩타이드에 접합될 수 있다. 바람직하게는, AON은 PPMO, 즉, 아미드, 말레이미드 또는 클릭 화학(click chemistry)(바람직하게는 구리가 없는 클릭 화학을 사용하여, 예를 들면, 사이클로옥틴 연결을 통해)을 통해 펩타이드 모이어티에 화학적으로 접합된 PMO 올리고뉴클레오타이드이고 적합한 링커, 예를 들면, 절단가능하거나 pH-민감성인 링커를 포함한다. 펩타이드 모이어티는 3' 또는 5' 말단을 통해 연결될 수 있다. 가장 바람직하게는, 펩타이드 모이어티는 세포를 침투하여 핵에 도달하는 AON의 능력을 증진시킬 수 있는 펩타이드이다. 예를 들면, 펩타이드 모이어티는 아르기닌이 풍부한 펩타이드, 양이온성 펩타이드 및/또는 생물다양성 미생물의 게놈으로부터 유래된 펩타이드의 라이브러리로부터 선택된 펩타이드일 수 있다(Hoffman et al., Sci Rep, 8, 1, 12538). 펩타이드는 비-천연적인 아미노산 및/또는 화학적으로 변형된 아미노산을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다.
세포 침투 펩타이드를 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머에 가하여 세포 흡수 및 핵 국재화를 향상시켰다. 상이한 세포 침투 펩타이드는 문헌: Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther., 16(9), 1624-1629에 나타낸 바와 같이, 흡수의 효능 및 표적 조직 특이성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 용어 "세포 침투 펩타이드" 및 "CPP"는 상호교환적으로 사용되며 수송 펩타이드, 담체 펩타이드, 또는 펩타이드 형질도입 도메인으로 불리는 양이온성 세포 침투 펩타이드를 지칭한다. 본원에 나타낸 바와 같은 펩타이드는 주어진 세포 배양 집단의 세포의 100% 내에서 세포 침투를 유도하는 능력을 가지고 전신계 투여 시 생체 내에서 다중 조직 내에 거대 분자 전좌(macromolecular translocation)를 허용한다. 펩타이드는 또한 조직 또는 기관으로의 국재화된 전달 후 세포 흡수를 향상시킬 수 있다.
전달 효능을 추가로 증진시키기 위하여, 상술한 변형된 뉴클레오타이드는 흔히 지방산/지질/콜레스테롤/아미노산/탄수화물/다당류/나노입자 등과 함께 당 또는 핵염기 모이어티에 접합된다. 이러한 접합된 모이어티 유도체를 또한 사용하여 AON을 작제함으로써 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 사람 TARDBP 유전자 전사체의 안티센스 올리고머-유도된 대안적인 스플라이싱은 포스포로티오에이트 골격에서 올리고리보뉴클레오타이드, PNA, 2'-Ome 또는 2'-MOE 변형된 염기를 사용할 수 있다. 2'-Ome AON이 양이온성 리포플렉스(lipoplex)로서 전달되는 경우 시험관 내에서 이의 효율적인 흡수로 인하여 올리고 설계에 사용된 경우, 이러한 화합물은 뉴클레아제 분해에 민감하고 생체 내 또는 임상 적용에 이상적인 것으로 고려되지 않는다. 대안적인 화학을 사용하여 본 발명의 AON을 생성하는 경우, 본원에 제공된 서열의 우라실(U)을 티민(T)으로 대체할 수 있다.
예를 들면, 이러한 안티센스 분자는 올리고뉴클레오타이드일 수 있고, 여기서 뉴클레오타이드간 브릿징 포스페이트 잔기의 적어도 하나, 또는 모두는 변형된 포스페이트, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 인 아미데이트이다. 예를 들면, 뉴클레오타이드간 브릿징 포스페이트 잔기의 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 다른 비-제한적인 실시예에서, 이러한 안티센스 분자는 뉴클레오타이드의 적어도 하나, 또는 모두가 2' 저급 알킬 모이어티(예컨대, C1-C4, 직쇄 또는 측쇄의, 포화되거나 불포화된 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)을 함유하는 분자이다. 예를 들면, 뉴클레오타이드의 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
본 발명에 유용한 AON의 구체적인 예는 변형된 골격 또는 비-천연 소단위간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 골격 내에 인 원자를 보유하는 것 및 골격 내에 인 원자를 가지지 않는 것을 포함한다. 이의 뉴클레오시드 골격 간에 인 원자를 가지지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다.
다른 안티센스 분자에서, 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉, 뉴클레오타이드 단위의 골격은 신규한 그룹으로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 하나의 이러한 올리고머성 단백질인, 탁월한 하이브리드화 특성을 가진 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오타이드 모사체는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵-염기는 유지되고 골격의 아미드 부위의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 핵염기(흔히 당해 분야에서 단순하게 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형되거나 치환된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 핵산 속에서 가장 일반적으로 발견된 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 염기가 거의 일반적이지 않은 또는 비-천연 염기로 대체된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
퓨린 염기는 이미다졸 환에 융합된 피리미딘 환을 포함하고; 아데닌 및 구아닌은 핵산 속에서 가장 일반적으로 발견된 2개의 퓨린 핵염기이다. 이는 다른 천연적으로 발생하는 퓨린, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이폭산틴, 및 7-메틸구아닌으로 치환될 수 있다.
피리미딘 염기는 6-원의 피리미딘 환을 포함하고; 사이토신, 우라실 및 티민은 핵산 속에서 가장 일반적으로 발견된 피리미딘 염기이다. 이는 다른 천연적으로 발생하는 피리미딘, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 슈도우라실, 및 4-티오우라실로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오타이드는 우라실 대신에 티민 염기를 함유한다.
다른 변형된 또는 치환된 염기는 2,6-디아미노퓨린, 오로트산, 아그마티딘, 라이시딘, 2-티오피리미딘(예컨대, 2-티오우라실, 2-티오티민), G-클램프(G-clamp) 및 이의 유도체, 5-치환된 피리미딘(예컨대, 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐사이토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 슈퍼 T(Super T)), 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 슈퍼 G, 슈퍼 A, 및 N4-에틸사이토신, 또는 이의 유도체; N2-사이클로펜틸구아닌(cPent-G), N2-사이클로펜틸-2-아미노퓨린(cPent-AP), 및 N2-프로필-2-아미노퓨린(Pr-AP), 슈도우라실 또는 이의 유도체; 및 2,6-디플루오로톨루엔과 같은 변성된 또는 공통의 염기 또는 무염기성 부위와 같은 부재 염기(예컨대, 1-데옥시리보스, 1,2-디데옥시리보스, 1-데옥시-2-O-메틸리보스; 또는 환 산소가 질소로 대체된 피롤리딘 유도체(아자리보스))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 슈퍼 A, 슈퍼 G 및 슈퍼 T의 유도체의 예는 미국 특허 제6,683,173호(Epoch Biosciences)에서 찾을 수 있다. cPent-G, cPent-AP 및 Pr-AP는 siRNA내에 혼입되는 경우 면역자극성효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200). 슈도우라실은 우리딘 내에서와 같이 정규의 N-글리코시드보다는 C-글리코시드를 지닌, 우라실의 천연적으로 발생하는 이성체화된 버젼이다. 슈도우리딘-함유 합성 mRNA는 우리딘-함유 mPvNA와 비교하여 증진된 안전성 프로파일을 가질 수 있다(참고: 제WO 2009127230호).
특정의 변형된 또는 치환된 핵-염기는 본 발명의 AON의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들면, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로필우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 심지어 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된 경우, 현재 바람직한 염기 치환이다.
일부 구현예에서, 변형된 또는 치환된 핵-염기는 AON의 정제를 촉진시키는데 유용하다. 예를 들면, 특정의 구현예에서, AON는 3개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6개 이상)의 연속된 구아닌 염기를 함유할 수 있다. 특정의 AON에서, 3개 이상의 연속된 구아닌 염기의 스트링(string)은 올리고뉴클레오타이드의 응집을 야기하여, 정제를 복잡하게 한다. 이러한 AON에서, 연속된 구아닌 중 하나 이상은 이노신으로 치환될 수 있다. 3개 이상의 연속된 구아닌 염기의 스트링에서 하나 이상의 구아닌에 대한 이노신의 치한은 AON의 응집을 감소시킴으로써, 정제를 촉진시킬 수 있다.
일 구현예에서, AON의 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드에 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 화학적으로 연결시킴을 포함한다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예컨대, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예컨대, 도데카디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-라이세롤-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주어진 화합물 내 모든 위치가 균일하게 변형되는 것이 필수적이지는 않으며 실제로 상술한 변형 중 하나 이상은 단일 화합물 내에 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 내 단일 뉴클레오시드 내에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 AON을 포함한다. 본 발명의 문맥에서 "키메라성" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는 안티센스 분자, 특히 올리고뉴클레오타이드이고, 이는 2개 이상의 화학적으로 명백한 영역을 함유하고, 각각은 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 올리고뉴클레오타이드 화합물의 경우에 뉴클레오타이드를 함유한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하며 여기서 올리고뉴클레오타이드는 변형됨으로써 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 위한 추가의 영역을 부여한다.
본 발명에 따라서 사용된 안티센스 분자는 잘 공지된 고체 상 합성의 기술을 통해 편리하게 및 일상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장치는 수개의 판매업자, 예를 들면, Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티(Foster City) 소재)에 의해 시판되고 있다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 한가지 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다.
다른 비-제한적인 예에서, 이러한 AON은 뉴클레오타이드 중 적어도 하나, 또는 모두가 2; 저급 알킬 모이어티(예를 들면, C1-C4, 직쇄 또는 측쇄의 포화되거나 불포화된 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)을 함유하는 분자이다. 예를 들면, 뉴클레오타이드의 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
상기 기술된 AON이 본 발명의 AON의 바람직한 형태이지만, 본 발명은 다른 올리고머성 안티센스 분자, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 하기 기술된 바와 같은 올리고머 모사체를 포함한다.
다른 바람직한 화학은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer; PMO) 올리고머성 화합물이고, 이는 임의의 공지된 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 분해되지 않는다. 이러한 화합물은 하전되지 않고, RNA 가닥에 결합된 경우 RNase H 활성을 활성화시키지 않고 생체 내 투여 후 지속적인 절단 인자 결합 조율을 발휘하는 것으로 밝혀?병?(Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Development, 1997; 7, 187-197). 바람직하게는, 본 발명의 AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
변형된 올리고머는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 올리고머는 또한 핵염기(흔히 당해 분야에서 단순히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 특정의 핵염기가 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들면, 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 심지어 특히 2'-o-메틸에틸 당 변형과 조합된 경우, 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃까지 증가시크는 것으로 밝혀졌다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 피리미딘 염기는 5-치환된 피리미딘 염기를 포함하고, 여기서 피리미딘 염기는 사이토신, 티민 및 우라실로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 5-치환된 피리미딘 염기는 5-메틸사이토신이다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 퓨린 염기는 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기를 포함한다. 일 구현예에서, N-2, N-6 치환된 퓨린은 2,6-디아미노퓨린이다.
일 구현예에서, AON은 하나 이상의 5-메틸사이토신 치환을 단독으로 또는 다른 변형, 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 함께 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, AON은 하나 이상의 2, 6-디아미노퓨린 치환을 단독으로 또는 다른 변형과 함께 포함한다.
일부 구현예에서, AON은 하나 이상의 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 또는 접합체, 예를 들면, AON의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 향상시키는 아르기닌이 풍부한 세포 침투 펩타이드에 화학적으로 연결된다. 하나의 예시적인 구현예에서, 아르기닌이 풍부한 폴리펩타이드는 이의 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 안티센스 화합물의 3' 또는 5' 말단에 공유결합적으로 커플링된다. 또한, 예시적인 구현예에서, 안티센스 화합물은 모르폴리노 소단위 및 하나의 소단위의 모르폴리노 질소를 인접한 소단위의 5' 엑소사이클릭 탄소에 결합시키는 인-함유 소단위간 연결로 구성된다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 AON, 예컨대, 서열 번호: 1 내지 66의 AON을 혼입시키는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 변형된 레트로바이러스 또는 비-레트로바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노-관련된 바이러스 벡터이다.
AON의 활성을 측정하기 위한 검정
AON 및 이의 변이체의 활성은 당해 분야에서 통상의 기술에 따라 검정할 수 있다. 예를 들면, 실측된 RNA 및 단백질의 동형 형태 및 발현 수준은 전사된 핵산 또는 단백질의 동형 및/또는 발현을 검출하기 위한 광범위한 잘-공지된 방법 중 어느 것에 의해서도 평가될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적 예는 RNA의 동형의 RT-PCR에 이은 PCR 생성물의 크기 분리, 핵산 바이브리드화 방법, 예컨대, 노던 블롯(Northern blot) 및/또는 핵산 배열의 사용; 세포 내 RNA 전사체를 검출하기 위한 형광성의 반응계내 하이브리드화(fluorescent in situ hybridization); 핵산 증폭 방법; 단백질을 검출하기 위한 면역학적 방법; 단백질 정제 방법; 및 단백질 기능 또는 활성 검정을 포함한다.
RNA 발현 수준은 세포, 조직 또는 기관으로부터 RNA/cDNA(즉, 전사된 폴리뉴클레오타이드)를 제조함에 의해서, 및 RNA/cDNA를 검정된 핵산, 또는 이의 단편의 상보체인 참고 폴리펩타이드와 하이브리드화시킴에 의해 평가될 수 있다. cDNA는 임의로 다양한 폴리머라제 쇄 반응 또는 상보성 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화 전에 시험관 내 전사 방법 중 어느 것도 사용하여 증폭시킬 수 있고; 바람직하게는 이는 증폭되지 않는다. 하나 이상의 전사체의 발현은 또한 정량적 PCR을 사용하여 전사체(들)의 발현 수준을 평가함으로써 검출할 수 있다.
AON의 제조 방법
본 발명에 따라 사용된 AON은 고체 상 합성의 잘-공지된 기술을 통해 편리하게 제조될 수 있다. 이러한 합성 장치는 수개의 판매업자, 예를 들면, Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의해 시판된다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고머를 합성하기 위한 하나의 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다.
당해 분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 방법을 추가로 또는 대안적으로 사용할 수 있다. 올리고머, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사 기술을 사용하는 것은 잘 공지되어 있다. 하나의 이러한 자동화된 구현예에서, 디에틸-포스포르아미디트는 출발 물질로서 사용되고 문헌: Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 AON은 시험관 내에서 합성되며 생물학적 기원의 안티센스 조성물, 또는 안티센스 올리고머의 생체 내 합성을 지시하도록 설계된 유전 벡터 작제물을 포함한다. 본 발명의 분자는 또한 예를 들면, 흡수, 분배 및/또는 흡수를 보조하기 위한, 리포좀, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형과 같은 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 접합되거나 달리는 관련될 수 있다.
벡터(Vector)
또한 본 발명의 올리고머성, TARDBP-표적화 서열을 발현할 수 있는 벡터 전달 시스템, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58 중 어느 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 벡터가 포함된다.
또한 본 발명의 올리고머성, STMN2-표적화 서열을 발현할 수 있는 벡터 전달 시스템, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66 중 어느 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는 벡터가 포함된다.
"벡터" 또는 "핵산 작제물(nucleic acid construct)"은 폴리뉴클레오타이드 분자, 바람직하게는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드가 삽입되거나 클로닝(cloning)될 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 유일한 제한 부위를 함유하고, 정의된 숙주 세포, 예를 들면, 표적 세포 또는 조직 또는 이의 후대 세포 또는 조직에서 자가 복제할 수 있거나 정의된 숙주의 게놈과 통합되어 클로닝된 서열이 재생가능하도록 할 수 있다.
따라서, 벡터는 자가 복제하는 벡터, 즉, 이의 복제가 염색체 복제와는 독립적인 염색체 외 실체(extra-chromosomal entity), 예컨대, 직쇄 또는 폐쇄된 환형 플라스미드, 염색체외 성분, 미니-염색체(mini-chromosome), 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보증하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입된 경우, 게놈 내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들) 과 함께 복제되는 것일 수 있다.
C . 치료 방법
본 발명의 AON은 예방제 또는 치료제로서 사용될 수 있고, 이는 질환의 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 치료학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합된, TARDBP 프레-mRNA 내에서 선택된 표적에 결합하여 본원에 기술된 바와 같은 TARDBP의 발현을 치료학적으로 효과적인 방식으로 감소시키는 AON을 제공한다.
TDP43은 세포질 내에서 생상되어 핵 내로 도입된다. 세포질 속에서 TDP43의 응집은 핵 트래피킹(nuclear trafficking)을 위한 TDP43 이용능을 고갈시킬 수 있으며, 이는 TARDBP mRNA의 상향조절을 유발하는 자가조절을 야기하여, 증가된 TDP43을 야기할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 AON의 투여를 통해 TARDBP mRNA의 발현을 감소시키는 것은 응집체 속에서 TDP43의 감소를 야기하므로 보다 많은 TDP43으로서 TDP43 핵 트래피킹의 증진은 응집체 속에 축적되는 것보다는 트래피킹에 대해 이용가능한 것으로 예측된다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적한 치료학적 효과를 생산하기에 효과적인, 단독 용량으로서 또는 일련의 용량의 부분으로서, 포유동물 대상체에게 투여된 치료학적 화합물, 예를 들면, 안티센스 올리고머의 양을 지칭한다.
따라서, 본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물을 제공하고, 이러한 조성물은:
a) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON, 및
b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
바람직하게는, TDP43 단백질병증과 관련된 질환은 ALS, FTLD 또는 AD이다.
또한 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 방법이 제공되고, 이러한 방법은: 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 방법을 제공하며, 이러한 방법은: 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
ALS의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 방법이 또한 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 진행을 치료, 방지, 또는 지연시키기 위한 추가의 치료와 함께 투여될 수 있다. 추가의 치료는 TDP43 단백질병증과 관련된 질환 및 이의 증상의 진행을 치료, 방지, 또는 지연시키기 위한 추가의 치료와의 조합으로 투여될 수 있다. 추가의 치료는 TDP43 단백질병증과 관련된 질환과 관련된 다른 표적에 대해 지시된 AON을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가의 치료는 SOD1에 대해 지시된 AON을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 유전 또는 다른 바이오마커를 사용하여 본 발명의 AON을 통해 TDP43 억제에 대해 가장 잘 반응하는 경향이 있다. ALS 질환 위험과 관련된 유전 구조적 변화는 ALS 유전자 내 및 주변 유전자 영역에서 확인되었다. 이러한 변화는 유전 바이오마커로서 사용되어 본 발명의 방법에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인할 수 있다. 비-유전적 바이오마커를 또한 사용하여 본 발명의 방법에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인할 수 있다. 절두된 STMN2는 또한 FTD에서 TDP43 병리학의 마커인 것으로 밝혀졌다(Prudencio et. al. J Clin Invest. 2020 130(11): 6080-6092). 바람직하게는, 바이오마커는 절두된 STMN2의 형태이다.
본 발명은 바이오마커에 의해 확인된 대상체에서 ALS, FTLD 또는 AD를 치료, 방지 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은:
a) TDP43 억제에 반응하는 경향이 있는 ALS 환자와 관련된 바이오마커의 존재에 대해 대상체를 시험하는 단계; 및
b) 대상체가 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 본원에 또한 제공된다.
ALS, FTLD 또는 AD의 효과를 치료, 방지 또는 개선시키기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 본원에 또한 제공된다.
바람직하게는, 본원에 사용된 AON은 표 1 또는 2에 제공된 AON의 목록으로부터 선택되거나 보다 바람직하게는 서열 번호: 12, 16, 24, 또는 25로부터 선택된다.
본 발명은 또한 (1) TDP43 발현을 감소시키도록 설계된 AON(서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58)가; (2) 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지함으로써 스타트민-2 고갈에 의해 유발된 뉴우런 취약성에 대해 보호하면서 세포질성 TDP43 가발현의 영향을 감소시키도록 설계된 AON(서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66)의 조합을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 스타트민-2의 정상 생리학적 수준을 유지하거나 이의 하향조절을 감소하면서, TDP43 단백질병증과 관련된 질환을 앓고 있는 대상체에서 TDP43 단백질병증을 개선시키기 위한 수단을 제공하는 것을 추구한다.
바람직하게는, 스타트민-2의 후속적인 하향조절을 방지하도록 설계된 AON은 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66의 목록으로부터 선택되거나, 보다 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 36 및 37로부터 선택된다.
조성물은 약 1 nM 내지 1000 μM의 본 발명의 목적한 안티센스 올리고머(들) 각각을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물 약 1　μM 내지 500 μM, 10 μM 내지 500 μM, 50 μM 내지 750 μM, 10 μM 내지 500 μM, 1 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 50 μM, 바람직하게는 25 μM 내지 100 μM의 본 발명의 안티센스 올리고머(들)의 각각을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 바람직하게는 약 1　nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 500 nM, 50 nM 내지 750 nM, 10 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 50 nM, 가장 바람직하게는 50 nM 내지 100 nM의 본 발명의 안티센스 올리고머(들) 각각을 포함할 수 있다.
조성물은 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM, 6nM, 7nM, 8nM, 9nM, 10nM, 20nM, 50nM, 75nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 300nM, 350nM, 400nM, 450nM, 500nM, 550nM, 600nM, 650nM, 700nM, 750nM, 800nM, 850nM, 900nM, 950nM 또는 1000nM의 본 발명의 목적한 안티센스 올리고머(들) 각각을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에게 전달하기에 적합한 형태의 TDP43 단백질병증과 관련된 질환 또는 병리학의 증상의 예방학적 또는 치료학적 치료, 방지 또는 개선을 보조하도록 채택된 하나 이상의 AON을 추가로 제공한다.
어구 "약제학적으로 허용되는"은 생리학적으로 내성이고 대상체에게 투여된 경우, 전형적으로 알레르기 또는 유사하게 원치않는 반응, 예를 들면, 복통(gastric upset) 등을 생산하지 않는 분자 실체 또는 조성물을 지칭한다. 용어 "담체"는 이와 함께 화합물이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면, 물 및 오일, 예를 들면, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들면, 땅콩 오일, 대두 오일, 광 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물 또는 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 특히 주사가능한 용액을 위한 담체로서 사용된다. 적합한 약제학적 담체는 문헌: Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)에 기술되어 있다.
하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물은 치료 요법의 범위 내에서 대상체에게 투여될 수 있는데, 예를 들면, 약제학적 조성물은 매시간, 1일에 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 개월마다 1회, 및 1년에 1회 투여될 수 있다. 적절한 요법은 치료되는 상태의 특성을 기반으로 당해 분야의 숙련가에 의해 측정될 수 있다.
D. 의약의 제조
일 구현예에서, 본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 TARDBP RNA에서 선택된 표적에 결합하는 AON의 용도를 제공한다. 따라서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다. 바람직하게는 질환은 ALS, FTLD, FTD 또는 AD이다.
본 발명은 TDP43 단백질병증과 관련된 질환과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 ALS, FTLD 또는 AD의 효과를 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
TDP43 억제에 반응하는 경향이 있는 환자와 관련된 바이오마커를 발현하는 대상체에서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다.
바람직하게는, 의약의 제조를 위해 사용된 AON은 표 1 또는 2에 제공된 AON의 목록으로부터 선택되거나 보다 바람직하게는 서열 번호: 12, 16, 24, 또는 25로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 또한 스타트민-2의 정상적인 생리학적 수준을 유지하거나 이의 하향조절을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 STMN2 RNA에서 선택된 표적에 결합하는 AON의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 사용된 AON은 표 1 또는 2에 제공된 AON의 목록으로부터 선택되고 보다 바람직하게는 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, AON은 서열 번호: 33, 35, 36 및 37로부터 선택된다.
E. 약제학적 조성물
본 발명의 형태에서, 약제학적으로 허용되는 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 및/또는 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 AON의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 성분(예컨대, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 강도 및 첨가제, 예를 들면, 세제 및 가용화제(예컨대, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 메타아황산나트륨), 방부제(예컨대, 티메로살, 벤질 알코올) 및 증량 물질(bulking substance)(예컨대, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 물질은 중합체성 화합물, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리글리콜 산 등의 미립자 제제 또는 리포좀 내로 혼입될 수 있다. 하이알루론산이 또한 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 청소 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌: Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 1435 내지 1712 면)을 참고한다. 조성물은 액체 형으로 제조될 수 있거나, 건조된 분말, 예를 들면, 동결건조된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 제공된 약제학적 조성물이 당해 분야에 공지된 어떠한 수단에 의해서도 투여될 수 있음은 인식될 것이다. 바람직하게는, 투여를 위한 약제학적 조성물은 주사에 의해, 국소적으로 또는 폐 또는 비강 경로에 의해 투여된다. AON은 보다 바람직하게는 투여의 정맥내, 척추강내, 동맥 내, 복강내, 근육내 또는 피하 경로에 의해 전달된다. 적절한 경로는 치료 하에서 대상체의 상태에 적절한 것으로서, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환(extravascular circulation), 혈액 또는 림프 시스템, 및 뇌척수액은 일부 비-제한된 부위이며 여기서 AON이 도입될 수 있다. 직접적인 CNS 전달을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 대뇌-심실내(intracerebro-ventricular) 또는 척추강내 투여를 투여 경로로서 사용할 수 있다.
국소 투여용 제형은 본 개시내용의 올리고머가 국소 전달제, 예를 들면, 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이팅제(chelating agent) 및 계면활성제와 혼합된 것을 포함한다. 액체 및 리포좀은 천연(예컨대, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디에스테아롤리포스파티딜 콜린) 음성(예컨대, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예컨대, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 국소 또는 다른 투여를 위해, 본 개시내용의 올리고머는 리포좀 내로 캡슐화될 수 있거나 이에 대해, 특히 양이온성 리포좀에 대해 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고머는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합화될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호 및/또는 1999년 5월 20일자로 출원된 미국 특허원 일련번호 제09/315,298호에 추가로 기술되어 있다.
특정의 구현예에서, 본 개시내용의 AON은 경피 방법에 의해 전달될 수 있다(예컨대, AON의 유액 내로의 혼입을 통해, 이러한 AON은 리포좀 내로 임의로 패키징된다). 이러한 경피 및 유액/리포좀-매개된 전달 방법은 당해 분야, 예컨대, 미국 특허 제6,965,025호에서 AON의 전달에 대해 기술되어 있다.
본원에 기술된 AON은 또한 이식가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는 당해 분야에 인식된 공정, 예컨대, 미국 특허 제6,969,400호에 기술된 합성 임플란트 설계이다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 산제 또는 과립제, 극소미립자(microparticulate), 나노입자, 물 또는 비-수성 매질 중 현탁제 또는 액제, 캡슐제, 겔 캡슐제, 사쉐제(sachet), 정제 또는 미니정제(minitablet)를 포함한다. 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 요구될 수 있다. 경구 제형은 본 개시내용의 올리고머가 하나 이상의 침투 향상제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 것이다. 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 담즙산/염 및 지방산 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 침투 향상제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과 조합된 지방산/염을 제공한다. 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 개시내용의 올리고머는 경구적으로, 스프레이된 무수 입자를 포함하는 과립 형태로 전달될 수 있거나, 복합화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. 올리고머 복합화제(oligomer complexing agent) 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기술되어 있다. 올리고머 및 이의 제제에 대한 경구 제형은 미국 특허 제6,887,906호, 1999년 5월 20일자로 출원된 제09/315,298호 및/또는 제US20030027780호에 상세히 기술되어 있다.
비경구, 수막내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 부가제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 침투 향상제, 담체 화합물 및 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
치료학적으로 유용한 양의 AON의 전달은 이미 발표된 방법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, AON의 세포내 전달은 AON 및 유효량의 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 조성물을 통해 이룰 수 있다. 이러한 방법의 예는 미국 특허원 제US20040248833호에 기술되어 있다. 핵으로의 AON의 다른 전달 방법은 문헌: Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47, 및 in Gebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811에 기술되어 있다. 핵산 분자를 네이키드 DNA(naked DNA)로서 또는 지질 담체에 복합화시킨 발현 벡터의 방법에 의해 세포 내로 도입시키기 위한 방법은 제US 6,806,084호에 기술되어 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 AON 및 이를 포함하는 치료학적 조성물은 경피 방법에 의해(예컨대, AON을 유제 내로 혼입시킴을 통해, 이러한 AON은 리포좀 내로 임의로 패키징된다) 전달될 수 있다. 이러한 경피 및 유제/리포좀-매개된 전달 방법은 당해 분야, 예컨대, 미국 특허 제6,965,025호에서 AON의 전달을 위해 기술되어 있다.
AON을 콜로이드성 분산 시스템으로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세규, 비드, 및 지질-기반 시스템, 예를 들면, 수중 오일 유제(oil-in-water emulsion), 미셀(micelle), 혼합된 미셀, 및 리포좀 또는 리포좀 제형을 포함한다. 이러한 콜로이드성 분산 시스템은 치료학적 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
리포좀은 인공 막 소낭(artificial membrane vesicle)이며, 이는 시험관 내 및 생체 내에서 전달 비히클(delivery vehicle)로서 유용하다. 이러한 제형은 순수한(net) 양이온성, 음이온성, 또는 중성 전하 특성을 가질 수 있고 시험관 내, 생체 내 및 생체 외(ex vivo) 전달 방법을 위한 유용한 특성을 갖는다. 큰 단일라멜라 소낭(unilamellar vesicle)은 큰 거대분자를 함유하는 수성 완충제의 실질적인 퍼센트를 캡슐화시킬 수 있음이 밝혀졌다. RNA 및 DNA는 수성 내부 내에 캡슐화되어 생물학적으로 활성인 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley, et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6, 77).
리포좀이 효율적인 유전자 전달 비히클이 되도록 하기 위해서는, 다음의 특성이 존재하여야 한다: (1) 이의 생물학적 활성을 손상시키기 않고 고 효능에서 목적한 AON의 캡슐화; (2) 비-표적 세포와 비교하여 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합; (3) 소낭의 수성 성분을 표적 세포 세포질로 고 효능에서 전달; 및(4) 유전 정보의 정밀하고 효과적인 발현(Mannino, et al., 1988 Biotechniques, 6, 682). 리포좀의 조성물은 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합된, 인지질, 특히, 높은 상-전이-온도 인지질(phase-transition-temperature phospholipid)이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 의존힌다. 양이온성 리포좀은 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 것으로 여겨지는 양으로 하전된 리포좀이다. pH-민감성 또는 음으로 하전된 리포좀은 이것과의 복합체보다는 DNA를 가두는(entrap) 것으로 여겨진다. 양이온성 및 비양이온성 리포좀 둘 다를 사용하여 DNA를 세포로 전달하여 왔다.
리포좀은 또한 "입체적으로 안정한" 리포좀을 포함하고, 본원에 사용된 바와 같은, 이러한 용어는 리포좀 내로 혼입된 경우, 이러한 전문적인 지질을 결여한 리포좀과 관련하여 향상된 순환 수명(circulation lifetime)을 야기하는 하나 이상의 전문화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정한 리포좀의 예는 리포좀의 소낭-형성 지질 부위의 부분이 하나 이상의 당지질을 포함하거나 하나 이상의 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도체화된 것이다. 리포좀 및 이의 용도는 제U.S. 6,287,860호에 추가로 기술되어 있다.
AON은 당해 분야에 인식된 기술(예컨대, 형질감염, 전기천공(electroporation), 융합, 리포좀, 콜로이드성 중합체 입자 및 바이러스 및 비-바이러스 벡터 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 수단)을 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다. 선택된 전달 방법은 적어도 치료될 세포 및 세포의 위치에 의존할 것이며 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 국재화는 리포좀을 지시하고, 표적 세포를 함유하는 조직 내로의 주사, 특이적인 수용체-매개된 흡수 등을 지시하기 위해 표면에 특이적인 마커를 지닌 리포좀에 의해 달성될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, AON은 예를 들면, 리포좀-매개된 흡수, 지질 접합체, 폴리라이신-매개된 흡수, 나노입자-매개된 흡수, 및 수용체-매개된 세포내이입(receptor-mediated endocytosis), 뿐만 아니라 , 비-식균작용성 전달 방식(non-endocytic modes of delivery), 예를 들면, 미세주사, 투과(예컨대, 스트렙토라이신-O 투과, 음이온성 펩타이드 투과), 전기천공, 및 당해 분야에 공지된 다양한 비-침입성의 비-세포내이입 방법을 포함하는 방법을 사용하여 전달할 수 있다(이의 전문이 참고로 포함된 문헌: Dokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49을 참고한다).
AON을 또한 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 조성물을 생산할 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 증장성 염수 용액, 예를 들면, 포스페이트-완충된 염수를 포함한다. 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구, 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
숙련된 전문의는 최적의 투여 경로 및 임의의 특수한 동물 및 상태에 대한 임의의 투여량을 용이하게 결정할 수 있으므로, 기술된 투여 경로는 단지 안내인 것으로 의도된다.
기능성의 신규 유전 물질을 세포 내로, 시험관 내 및 생체 내에서 도입시키기 위한 다수의 접근법이 시도되어 왔다(Friedmann (1989) Science, 244, 1275-1280). 이러한 접근법은 발현될 유전자의 변형된 레트로바이러스 내로의 통합(Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); 비-레트로바이러스 벡터 내로의 통합(Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68, 143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252, 431-434); 또는 리포좀을 통해 이종 프로모터-인핸서 성분에 연결된 전이유전자의 전달(Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298, 278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249, 1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; 및 Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84, 7851-7855); 리간드-특이적인, 양이온-기반한 수송 시스템에 대한 커플링(Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263, 14621-14624) 또는 네이키드 DNA, 발현 벡터의 사용(Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247, 1465-1468)을 포함한다. 전이유전자의 조직 내로의 직접적인 주사는 단지 국재화된 발현을 생산한다(Rosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) 상기 참고; Brigham et al. (1989) 상기 참고; Nabel (1990) 상기 참고; 및 Hazinski et al. (1991) 상기 참고). 브리그햄(Brigham) 등의 그룹((1989) Am. J. Med. Sci. 298, 278-281 및 Clinical Research (1991) 39 (abstract))은 DNA 리포좀 복합체의 정맥내 또는 기관내 투여 후 단지 마우스의 폐의 생체 내 형질감염을 보고하였다. 사람 유전자 치료요법 과정의 참고 문헌의 예는: Anderson, (1992) Science 256, 808-813; Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther., 8(5), 313-23; Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol., 35(3), 164-78; Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18), 1313-9; Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv., 2(2), 237-54이다.
본 발명의 AON은 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 사람을 포함하는 동물에게 투여시, 생물학적으로 활성인 대사산물 또는 이의 잔기를 제공(직접적으로 또는 간접적으로)할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 예로서, 본 개시내용은 또한 본 발명의 화합물의 전구약물 및 약제학적으로 허용되는 염, 이러한 전구-약물의 약제학적으로 허용되는 염, 및 다른 생물등가물(bioequivalent)에 관한 것이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 약제학적으로 허용되는 염, 즉, 본 화합물의 목적한 생물학적 활성을 보유하고 이에 대해 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올리고머의 경우, 약제학적으로 허용되는 염의 바람직한 예는 (a) 양이온, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들면, 스페르민 및 스페르미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; (c) 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염; 및 (d) 원소 음이온, 예를 들면, 염소, 브롬, 및 요오드로부터 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신계 투여가 요구되는지의 여부 및 치료된 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들면, 안내 및 점막, 뿐만 아니라 직장 전달), 폐, 예컨대, 분말의 흡입 또는 취입(insufflation) 또는 에어로졸(예를 들면, 네불라이저(nebulizer), 기관내, 비강내, 상피 및 경피에 의해), 경구 또는 비경구에 의한 것일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개 내, 예컨대, 척추강내 또는 심실내를 포함한다. 적어도 2'-O-메톡시에틸 변형을 지닌 올리고머는 경구 투여에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 바람직하게는, AON은 피하 또는 정맥내 경로를 통해 전달된다.
편리하게는 단위 투여량 형태로 존재할 수 있는, 본 발명의 약제학적 제형은 약제 산업에 잘 공지된 통상의 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 연합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형함에 의해 제조된다.
다음의 실시예는 단지 예시적인 것이고 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 이러한 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적을 위해서만 포함된다. 이는 본 발명의 요약, 개시내용 또는 설명을 상기 설정된 바와 같이 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 추가의 설명없이, 당해 분야의 숙련가는 앞서의 설명을 사용하여 본 발명을 이의 최대한으로 활용할 수 있는 것으로 여겨진다. 앞서의 및 이후의 실시예에서, 모든 온도는 섭씨도(degrees Celsius)로 수정되지 않고 나타내며, 달리 나타내지 않는 한, 모든 부 및 퍼센트는 중량 기준이다.
실시예
실시예
실시예 1 - 원래의 AON의 설계
엑손 2 및 엑손 3 표적화된 스플라이스 스위칭(splice switching) AON을 온라인 스플라이스 예측 도구에 의해 예측된 바와 같이 엑손 내 엑손 스플라이스 부위(exonic splice site) 및 스플라이싱 인핸서 부위(splicing enhancer site)에 결합하도록 설계하였다. 이러한 엑손 중 어느 하나의 스키핑(skipping)은 전사체의 판독 프레임 내 이동을 초래하여 다음의 엑손에서 미성숙 종결 코돈(premature termination codon; TAA)을 초래한다. 미성숙 종결 코돈을 지닌 전사체는 모든 진핵 세포에서 작동아는 RNA 감시 메카니즘(RNA surveillance mechanism)인, 넌센스 매개 붕괴(nonsense mediated decay)를 통해 붕괴되는 것으로 알려져 있다.
AON에 대한 서열, 유전자 좌표, 및 서열 번호: 는 표 1 및 2에 나열되어 있다. AON 1 내지 66(도에서 제공된 바와 같음)은 서열 번호 1 내지 66에 상응한다.
AON은 2'-O-메틸 당 변형 및 포스포로티오에이트(PS) 골격 화학을 가졌다. AON 명명법은 문헌: Mann et al. (The Journal of Gene Medicine, 2002. 4(6): p. 644-654)에 기술된 것을 기반으로 하였으며, 이에 의해 종, 유전자, 엑손 수, 수용체 또는 공여체 표적화 및 어닐링 배위(annealing coordinate)가 기술되어 있고, 여기서 "-"는 고유의 위치를 나타내고 "+"는 본원에 기술된 바와 같이, 스플라이스 부위로부터의 엑손 위치를 명시한다. 도 2는 TARDBP에서 AON 각각의 결합 위치의 개략도를 나타낸다.
2'-O-메틸 변형을 지닌 AON 및 PS 골격은 TriLink Biotechnologies, Inc(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 또는 ChemGenes Corporation(미국 매사츄세츠주 윌밍톤 소재)으로부터 주문하였다. 포스포로디아미데이트 골격(PMO)을 지닌 AON은 Genetools LLC(미국 오리건주 필로매스 소재)로부터 주문하였다.
실시예 2 - 전사체 분석을 사용한 AON 스크리닝(Screening)
TARDBP 전사체의 RT-PCR 분석을 2'-O-메틸 AON의 형질감염에 따라 수행하였다. AON 형질감염 후 TARDBP 녹다운(knockdown) 또는 엑손 스키핑(exon skipping)의 수준을 대조군 처리된 샘플 및 비처리된 샘플의 것과 비교하였다.
대조군 서열은 관련되지 않은 유전자, SMN, ctrl AON 1(서열 번호: 26, ) 및 GeneTools로부터 구입한 음성 대조군 올리고: ctrl AON 2(서열 번호: 27; ) 및 ctrl AON 3(서열 번호: 28; )에 대해 표적화된 AON을 포함한다.
물질 및 방법
섬유아세포의 형질감염
정상의 사람 피부 섬유아세포를 확립된 기술에 따라 10% FBS DMEM 속에서 24 웰 플레이트 내로 씨딩된(seeded) 15,000개의 세포를 사용하여 증식시키고 형질가염 전에 24시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 모든 2'-O-메틸 PS-AO을 Lipofectamine 3000(형질감염 용적 ml 당 3 μl)(Life Technologies, 오스트레일리아 멜보른 소재)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시키고, AO 형질감염된 세포를 24시간 동안 항온처리하였다.
전사체 분석
RNA를 DNase 처리(Life Technologies)를 포함하는, MagMAX-96 총 RNA 단리 키트를 사용하여, 제조업자의 설명서에 따라 추출하였다. RT-PCR을 백금 Taq 폴리머라제(Life Technologies)가 들어있는 1-단계 Superscript III RT-PCR 키트를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 생성물을 TARDBP 엑손 1 내지 6(Fwd: (서열 번호: 67), Rev: (서열 번호: 68))을 따라, 온도 프로파일, 55℃에서 30분, 94℃에서 2분에 이어, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 1분 30초의 24 주기를 사용하여 증폭시켰다. 적용가능한 경우, 결과를 다음의 프라이머(Fwd: (서열 번호: 69), Rev: (서열 번호: 70))를 사용하여 엑손 2 내지 3을 따라 증폭된 관련되지 않은 하우스키핑 대조군 유전자(housekeeping control gene)(TBP)의 전사체 수준에 대해 표준화하였다.
PCR 생성물을 트리스-아세테이트-EDTA 완충제 속에서 2% 아가로스 겔 상에 분획화(fractionating)하고 영상을 겐 문서화 시스템(gel documentation system)(Vilber Lourmat, 독일 에베르하르트젤 소재)에서 포획하였다. 밀도 분석(densitometric analysis)을 Image J를 사용하여 수행하였다. 엑손 스키핑을 밴드 중량에 의해 정량화하여 전체 길이의 TARDBP 및 엑손 스키핑된 생성물의 비를 추정하였다. 생성물 확인을 필요한 경우 밴드 정제 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 엑손 스키핑의 효율은 RT-PCR에 의해 생성된 전체 생성물과 비교하여 스키핑된 엑손(들)을 지닌 전사체의 퍼센트를 계산함으로써 측정하였다. 전체 길이 전사체 녹다운(knockdown)의 퍼센트는 대조군 처리된 샘플 또는 처리되지 않은 샘플과 비교하여 하우스키핑 유전자에 대한 표준화 및 전체 길이 전사체의 비교에 의해 측정하였다.
엑손 2 표적화된 AO(AON 1 내지 6, 서열 번호: 1 내지 6)을 우선 25 및 50nM에서 시험하였다. 그러나 엑손 2 스키핑의 증거는 관찰되지 않았지만 전체 길이 전사체내 녹다운/감소는 AON 1 내지 6(서열 번호: 1 내지 6) 각각에서, 가장 큰 녹다운을 생산하는 AON 3(서열 번호: 3)과 함께 검출되었다(도 3a).
엑손 3 표적화된 AON(AON 7 내지 11, 서열 번호: 7 내지 11)을 우선 200 및 50nM에서 시험하였다. 시험한 모든 서열은 엑손 3 스키핑을 유도할 수 있었다(도 4a). AON 10(서열 번호: 10)은 50nM에서 처리한 경우 엑손 3 스키핑을 나타내는 전사체의 81%로 가장 효과적이었다. 가장 큰 엑손 스키핑을 생산한 서열(AON 8, 9, 및 10, 서열 번호: 8, 9 및 10)을 이후에 광범위한 농도(50, 10 및 1nM)에서 시험하였고 엑손 스키핑은 1nM 이하에서 관찰되었다(도 4b).
실시예 3 - AON의 최적화
초기 AON 스크리닝에 이어서, TARDBP 엑손 2를 표적화하는 AON을 칵테일(cocktail)(각각 50nM에서 2개의 AON을 함께 형질감염시킴) 속에서 또는 AON 3(서열 번호: 3) 단독보다 더 큰 녹다운을 나타내는 조합이 없는 단일 AON으로서 시험하였다(도 3b).
스크리닝 후에, TARDBP 엑손 2 및 3을 표적화하는 AON을 마이크로-워킹(micro-walking)(AON 서열을 상부 또는 하부에 수개 염기까지 이동시켜, 올리고머 길이를 여전히 유지하면서, 최적의 표적 부위를 확인함)에 의해 최적화하고 형질감염 후 엑손 스키핑의 수준을 원래의 AON 서열, 대조군 AON 및 처리되지 않은 샘플과 비교하였다.
엑손 2 표적화된 AON 3(서열 번호: 3)을 5개의 염기 삼부로 및 5 및 10개의 염기 하부로 미세-워킹함으로써 AON 12, 13 및 14(서열 번호: 12, 13 및 14)를 생산하고 50 및 100nM 농도에서 이러한 AON 3(서열 번호: 3)보다 TARDBP 전사체의 보다 큰 녹다운을 생산하는 AON 12 (서열 번호 12)를 사용하여 시험하였다(도 3c).
엑손 3 표적화된 AON(AON 8, 9 및 10, 서열 번호 8, 9 및 10)을 5개 염기 상부 및 하부로 미세-워킹하고(AON 15 내지 20, 서열 번호 15 내지 20) 다양한 농도에서 수개의 실험에서 시험함으로써 가장 큰 효율을 나타내는 AON 16(서열 번호 16)을 지닌 선도 분자를 측정하였다(도 4c 및 4d).
실시예 4 - 엑손 2 표적화된 AON에 대한 전체 길이(전장) 전사체 녹다운의 메카니즘
엑손 2의 스키핑이 분명하지 않으므로, 엑손 2 표적화된 AON의 작용 메카니즘을 추가로 탐구하였다. 관찰된 결과(전사체 녹다운 그러나 스키핑 없음)는 다양한 원인으로부터 야기될 수 있었다. 일부 경우에, 엑손 스키핑이 발생하였지만, 수득되는 전사체는 너무 신속하게 또는 효율적으로 분해되어 제때 하나의 스냅샷(snapshot)에서 관찰하는 경우 검출하기 어렵다. 엑손 스키핑이 보다 이른 시점에 명확한지의 여부를 점검하기 위하여, 시간 과정을 50nM의 AON 농도에서 형질감염된 세포 및 형질감염 후 4, 8, 12 및 24시간째에 수집한 세포를 사용하여 취하였다. 엑손 스키핑은 보다 이른 시점에서 관찰되지 않았다. 녹다운은 형질감염 후 4시간째로부터 관찰될 수 있었다(도 5a).
다른 가능성은 AON이 인트론을 전사체 내에 유지시키는 것이다. 이는 PCR에서 연장 시간이 인트론을 함유하는 전사체가 증폭되도록 하기에 충분히 길지 않는 경우 겔에서 녹다운과 유사하게 보일 수 있었다. 프라이머를 인트론 보유를 관찰하도록 설계하였지만 보유된 인트론의 수준은 처리된, 비처리된 및 대조군 처리된 세포 추출물에 걸쳐 균일하였다(도 5b).
녹다운의 메카니즘을 추가로 조사하기 위하여, 다수의 전략적으로 위치된 프라이머 세트를 활용하여 전사체 수준을 분석하였다. 녹다운은 결합 부위가 전방 및 역방 프라이머 사이에 있는 경우 관찰되지만 프라이머 둘 다가 결합 부위 전 및 후에 있는 경우 관찰되지 않았고 이는 절단이 AON 결합 부위 근처에서 발생할 수 있음을 나타낸다(도 5c).
실시예 5 - PA1 표적화된 AON 설계 및 스크리닝
폴리아데닐화 신호를 차단함으로써 PA1의 사용을 입체적으로 억제할 수 있는 AON을 설계하였다. 이는 해독된 전사체(I)의 감소 및 해독되지 않은 전사체(II, III, IV)의 증가를 초래할 수 있었다.
20 및 25개 염기 길이의 2개의 AON을 2'-O-메틸 PS 화학을 사용하여 초기에 합성함으로써 TARDBP(AON 21, 22, 서열 번호: 21 및 22)의 PA1을 표적화하였다. 이를 상기 방법에서 기술된 바와 같이 사람 섬유아세포 세포에서 농도 범위(200, 50, 12.5 및 3nM)에서 선도 엑손 스키핑 AON(서열 번호 16)을 따라 시험하였다. 전사체의 일부 녹다운이 관찰되었지만, 녹다운의 수준은 AON 16(서열 번호: 16) 보다 더 낮았다(도 6a).
시간 경과를 50 및 25nM 농도에서 형질감된 세포 및 형질강염 후 12, 24, 48 및 72시간재에 수집한 RNA를 사용하여 취함으로써 녹다운이 보다 이른 또는 늦은 시점에서 증진되었는지를 관찰하였다. 녹다운이 관찰되었지만, 이는 모든 시점에 걸쳐 더 낮았고 선도 엑손 3 스키핑 AON보다 PA1 표적화된 AON의 경우 더 낮았다(도 6b). 길이가 30개 염기인 추가의 AON을 설계하고(AON 23, 서열 번호: 23) 100, 50 및 25nM에서 최종 실험에서 시험하였다. 녹다운의 보다 큰 수준이 이러한 실험에서 모든 3개의 PA1 표적화된 AO에 대해 관찰되었지만 추가의 길이는 녹다운에서의 증가를 초래하지 않았고 하우스키핑 유전자의 일부 녹다운은 보다 높은 농도에서 관찰되었다(도 6c).
실시예 6 - PMO로서 서열 번호: 12 및 16의 전사체 및 단백질 분석
엑손 2 표적화된 AON 12(서열 번호: 12) 및 엑손 3 표적화된 AON 16(서열 번호: 16)을 합성하고 PMO(서열 번호: 24 및 서열 번호: 25)로서 평가하였다. PMO를 정상 섬유아세포 내로의 핵감염에 의해 전달한 다음, 상술한 바와 같이 RT-PCR을 사용하여 평가하였다.
핵감염에 의한 PMO 전달은 핵감염 P2 키트가 들어있는 Nucleofection X 유닛(unit)으로, CA-137 프로그램(Lonza, 오스트레일리아 말보른 소재)을 사용하여 수행하였다. PMO를 5% FBS DMEM가 보충된 큐벳(cuvette) 속에서 150 μM에서 초기에 형질감염시키고 1, 3 및 5일(RNA 분석) 및 3 및 5일(단백질 분석) 동안 항온처리하였다.
TARDBP 전사체의 RT-PCR 분석을 도 7a에 나타낸다. PMO AON 24는 시험한 어떠한 시점에서도 TARDBP RNA의 녹다운 또는 엑손 2 스키핑을 유발하지 않았다. PMO AON 25는 모든 3개의 시점에서 관찰된 엑손 3의 스키핑 및 전사체 녹다운을 유도하지 않았고 형질감염 후 24시간 째에 가장 강력하였다. 단백질 녹다운을 또한 하기 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 측정하였다.
물질 및 방법 - 웨스턴 블롯팅
세포 분해물을 125 mM 트리스/HCl pH 6.8, 15% SDS, 10% 글리세롤, 1.25 μM PMSF(Sigma-Aldrich, 오스트레일리아 NSW 소재) 1x 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich) 0.004% 브로모페놀 블루 및 2.5 mM 디티오트레이톨을 사용하여 제조한 다음 6회 초음파처리하였다(1초 펄스). 샘플을 94℃에서 5분 동안 가열하고, 빙상에서 냉각시키고 14,000 x g에서 2분 동안 원심분리한 다음 겔 위에 로딩(loading)하였다.
Pierce BCA 단백질 검정 키트(Protein assay kit)(Life Technologies)에 의해 측정된, 대략 15 μg의 전체 단백질을 샘플 당 NuPAGE Novex 4-12% BIS/트리스 겔(Life Technologies) 상에 분자량 마커(Magic Mark)(BioRad)를 따라 로딩하고 200 V에서 55분 동안 분리하였다. 단백질을 350mA에서 1시간 동안 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막 상에 이전시켰다. 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 막을 밤새 4℃에서 TDP43 1차 항체(1:1,000, Proteintech), 및 베타-액틴 항체(1:50,000, Sigma-Aldrich)를 함유하는 1x TBST 중 5% 탈지 분유 분말 속에서 항온처리하였다. 면역검출(immunodetection)을 항-토끼 HRP 2차 항체(1:10,000, Dako) 및 TDP43에 대한 Immobilon HRP 화학발광성 기질(Merck)을 사용하여 수행하였다. 베타-액틴의 면역검출을 Western Breeze 화학발광성 면역검출 키트(Chemiluminescent Immunodetection Kit)(Life Technologies)ㄹㄹ 사용하여 검출에 사용된 CDP Star 화학발광성 기질로 수행하였다. 웨스턴 블롯 영상을 Vilber Lourmat Fusion FX 시스템 상에서 Fusion 소프트웨어를 사용하여 포획하고 Image J 소프트웨어를 영상 분석에 사용하였다.
결과
엑손 2 표적화된 PMO(서열 번호: 24)는 어떠한 TDP43 단백질 녹다운도 유발하지 않았다. 엑손 3 표적화된 PMO(서열 번호: 25)는 3 및 5일 시점에서 TDP43 단백질 녹다운을 유발하지 않았고 형질감염 후 3일 째에 최대이었고 단백질은 하우스키핑 단백질(β-액틴)에 대해 표준화하는 경우 대조군 세포에서 관찰된 수준의 40%까지 녹 다운되었다(도 7b).
서열 번호: 25를 100 및 50μM에서 1, 3 및 5일째에 수집한 RNA 및 3일째에 수집한 단백질로 상술한 바와 같은 형질감염을 사용하는 3개의 독립된 실험에서 시험하였다. 엑손 3 스키핑 및 녹다운은 농도 둘 다에서 모든 3개 시점에서 관찰되었지만 형질감염 후 24시간 째에 100μM에서 최대이었다(대표적인 겔 영상 도 8a). 엑손 3 스키핑을 생거 서열분석(Sanger sequencing)으로 확인하였다(도 8c). TDP43 수준은 AON의 부재하에서 형질감염된 대조군 세포(Zap)와 비교하여 100μM에서 형질감염 후 3일째에 74%(p-값 0.012)까지 및 50μM에서 62%(p-값 0.027) 까지 녹다운되었다(도 8b 및 8d).
실시예 7 - STMN2 상향조절을 시험하기 위한 세포 모델의 개발
스타트민-2 단백질 수준을 증가시키는 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 AON의 능력을 평가하기 위하여, 스타트민-2가 감소된 세포 모델이 필요하였다. ALS 환자에서 관찰된 뉴우런 TDP43 고갈 및 스타트민-2 하향조절을 모사하기 위하여, 엑손 3 스키핑을 통해 TDP43 녹다운을 유도할 수 있는, TARDBP 엑손 3 표적화된 PMO(서열 번호: 25)를 SH-SY5Y 세포 내로 NeonTM 형질감염 시스템(Life Technologies)을 사용하여 형질감염시켰다.
SH-SY5Y 세포를 100 또는 50μM의 TARDBP 표적화된 PMO(서열 번호: 25) 또는 GeneTools로부터 구입한 100μM의 음성 대조군 올리고(AON ID 12)로 형질감염시켰다. 모든 농도는 전기천공 동안 팁(tip) 속의 농도를 지칭한다. 대조군 세포를 또한 어떠한 AO의 부재하에 전기천공시켰다(Zap 처리된 세포). 세포를 분석을 위해 항온처리 1 일 3일 후 수집하였다. RNA를 세포로부터 추출하고 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다.
전사체 분석
RNA를 제조업자의 설명서에 따라, DNase 처리(Life Technologies)를 포함하는 MagMAX-96 전체 RNA 단리 키트를 사용하여 추출하였다. RT-PCR을 제조업자의 설명서에 따라, 백금 Taq 폴리머라제(Life Technologies)로 1-단계 전사체(One-step Superscript) III RT-PCR 키트를 사용하여 수행하였다. 생성물을 TARDBP 엑손 1 내지 6을 거쳐 증폭시켜 대조군 및 비처리 세포(Fwd: (서열 번호: 67), Rev: (서열 번호: 68))와 비교한 TARDBP 수준/녹다운을 온도 프로파일, 55℃에서 30분, 94℃에서 2분에 이어 94℃에서 40초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 1분 30초의 24 주기를 사용하여 측정하였다. STMN2 수준을 엑손 1 내지 3(Fwd: (서열 번호: 71), Rev: (서열 번호: 72)) 또는 1 내지 5 (Fwd: (서열 번호: 71) Rev: (서열 번호: 73))에 걸쳐 온도 프로파일, 55℃에서 30분, 94℃에서 2분에 이어 94℃에서 30초, 60℃에서 20초 및 68℃에서 1분 15초의 28 주기를 1 내지 3에 대해 또는 이의 26 주기를 1 내지 5에 대해 사용하여 증폭시킴으로써 측정하였다. 크립틱 엑손을 함유하는 전사체가 크립틱 엑손 내 부위에서 폴리아데닐화되므로, 크립틱 엑손을 함유하는 STMN2 전사체는 크립틱 엑손 서열(Fwd: (서열 번호: 71) Rev: (서열 번호: 74))의 엑손 1로부터 말단을 향한 위치까지 온도 프로파일, 55℃에서 30분, 94℃에서 2분에 이어 94℃에서 30초, 60℃에서 20초 및 68℃에서 1분의 29 주기를 사용하여 증폭시킴에 의해 검출되었다. 크립틱 엑손을 함유하는 전사체의 서열은 상거 서열분석을 통해 확인하였다(도 9b). 적용가능한 경우, 결과를 다음의 프라이머(Fwd: (서열 번호: 69), Rev: (서열 번호: 70)를 사용하여 엑손 2 내지 3에 걸쳐 증폭된 관련되지 않은 하우스키핑 대조군 유전자(TBP)의 전사체 수준으로 표준화하였다.
PCR 생성물을 트리스-아세테이트-EDTA 완충제 속에서 2% 아가로스 겔상에서 분획화하고 영상을 겐 문서화 시스템(Vilber Lourmat, 독일 에베르하르트젤 소재)에서 포획하였다. 밀도 분석(densitometric analysis)을 Image J를 사용하여 수행하였다. TARDBP의 엑손 스키핑을 밴드 중량에 의해 정량화하여 전체 길이의 TARDBP 및 엑손 스키핑된 생성물의 비를 추정하였다. 생성물 확인을 필요한 경우 밴드 정제 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. STMN2 전사체 수준은 하우스키핑 유전자에 대한 표준화 및 대조군 처리된 샘플 또는 비처리된 샘플과의 비교에 의해 측정하였다.
TARDBP 엑손 3 스키핑 및 전사체 녹다운을 1 및 3 시점 둘 다에서 관찰되었지만 형질감염 후 1일째에 가장 강력하였다. STMN2 전사체를 함유하는 비-크립틱 엑손은 3일 항온처리 후 TARDBP AON으로 처리한 경우 대조군 처리된 세포와 비교하여 80%까지 녹다운되었다. 이는 3일 시점에서 가장 강력한 STMN2 전사체를 함유하는 크립틱 엑손의 양에서의 큰 증가와 일치하였다. STMN2 녹다운은 없거나, ㅋ크립틱 엑손은 대조군의 어느 것에서도 검출되지 않았다.(도 9a).
실시예 8 - STMN2 표적화된 AON의 설계
AON을 STMN2의 인트론 1내 크립틱 엑손 내의 부위를 표적화하도록 설계하였다. 3개의 인핸서 부위 핫스폿에 대해 표적화된 AON을 사용한 온라인 스플라이스 에측 모델에 의해 에측된 스플라이싱 인핸서의 결합을 억제할 수 있는 부위를 선택하였다. 스플라이싱 인핸서의 감소된 결합은 스플라이세오솜에 의한 엑손의 인식을 감소시켜, 크립틱 엑손이 성숙한 mRNA 전사체로부터 배재되도록 한다. 이는 크립틱 엑손을 함유하지 않는 성숙한 STMN2 전사체가 해독되므로 스타트민-2의 증가된 수준이 생산되도록 한다. AON 번호, 서열, 유전자 좌표, 및 화학은 표 1에서 알 수 있다. AON 결합 및 인핸서 부위는 도 10에서 알 수 있다. 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 골격을 지닌 AON은 ChemGenes Corporation(미국 매사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 주문하였다. 포스포로디아미데이트 골격(PMO)를 지닌 AON은 GeneTools LLC(미국 오레곤주 필로마쓰 소재)로부터 주문하였다.
실시예 9 - STMN2 표적화된 2'-O-메틸 AON의 시험
SH-SH5Y 세포를 100μM의 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25) 단ㄴ독으로 또는 5 또는 10μM의 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 2'-O-메틸-PS AON(서열 번호: 29, 30 또는 31) 또는 100μM의 대조군 올리고(AON ID 28)와 함께 Neon 형질감염 시스템을 사용하여 형질감염시켰다. 모든 농도는 전기천공 동안 팁 속의 농도를 지칭한다. 대조군 세포는 AO의 부재하에서 전기천공하였다(Zap). 세포를 RNA 추출및 분석을 위해 1일 및 3일 항온처리 후 수집하였다. RNA를 세포로부터 추출하고 RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통해 밀도 분석을 사용하여 분석하였다.
TARDBP는 대조군과 비교하여 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25)으로 처리된 세포에서 1일 후 대략 70%까지 녹다운되었다. 크립틱 엑손을 함유하는 STMN2 전사체는 대조군 세포에서 미량의 수준으로 검출되었지만 서열 번호: 25 단독으로 처리한 세포에서는 풍부하였다. 이러한 크립틱 엑손 발현은 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 AON으로 공-형질감염시킨 세포에서 더 낮았다. 서열 번호: 25 단독으로 처리한 세포와 비교하여, 수준은 10μM에서 형질감염 후 1일째에 서열 번호: 29 처리된 세포에서 29%로, 서열 번호: 30으로 처리한 세포에서 15%로 및 서열 번호: 31로 처리한 세포에서 75%로 감소하였다 서열 번호: 25 단독으로 처리한 세포에서, 전체 길이 STMN2 전사체의 수준을 1일까지 비처리된 대조군 세포에서 관찰된 수준의 46% 까지 감소하였고 3일 후 14%까지 감소하였다. STMN2 표적화된 AO로 공-형질감염된 세포에서, 전체 길이의 STMN2 수준은 더 높게 남았고 3일째에 최대 차이가 관찰되었다. AON 30(10μM)으로 형질감염된 세포에서, 전체 길이 STMN2 수준을 3일 후 서열 번호: 25 단독으로 처리한 세포에서 보다 3.7배 더 높았다. 서열 번호: 29(10μM)로 처리한 세포는 3배 증가하였고 AON 31(10μM)로 처리한 세포는 1.8배 증가하였다. 용량 반응은 전체 길이 STMN2 전사체를 거의 발현하지 않는 5μM에서 처리한 세포를 사용하여 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30에 대해 관찰되었다. AON 31의 경우, 전체 길이 STMN2 수준은 농도 둘 다에서 유사하였다. 이러한 실험을 유사한 결과로 반복되었다. 대표적인 겔 영상은 도 11a에서 알 수 있고 실험 둘 다로부터의 밀도 분석은 도 11b에서 알 수 있다.
실시예 10 - STMN2 AON 서열의 최적화
STMN2 AON 서열은 AON 서열을 서열 번호: 29(서열 번호: 32 및 서열 번호: 33) 및 서열 번호: 30(서열 번호: 34 및 35)의 5개 염기 상부 및 하부로 이동시킴에 의해 최적화시켰다. 이를 앞서 기술된 방법을 사용하여 2개 실험에서 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30을 따라 시험하였다. 크립틱 엑손의 제1의 인핸서 부위 핫스폿에 대해 표적화된 3개의 AON 중에서, 서열 번호: 33은 2개 실험에서 서열 번호: 25 단독으로 형질감염시킨 세포와 비교하여 가장 큰 크립틱 엑손 억제 및 전체 길이 STMN2 발현에서 가장 큰 증가를 생산하였고, STMN2 발현은 4.5배 증가하였다. 크립틱 엑손의 제2의 인핸서 부위 핫스폿에 대해 표적화된 AON의 경우, 서열 번호: 30 및 서열 번호: 35는 10μM에서 형질감염된 경우 서열 번호: 25 단독으로 처리된 세포의 3 내지 5배에서 전체 길이 STMN2 수준을 생성하였다. 5μM에서 서열 번호: 35 공-처리된 세포는 2개 실험에서 서열 번호: 30 공-처리된 세포보다 보다 큰 전체 길이 STMN2 수준을 가졌다. 1개 실험으로부터의 대표적인 겔 영상은 도 12b에서 알 수 있다. 서열 번호: 33 및 서열 번호: 35를 선택하여 추가의 시험 및 단백질 분석을 위한 PMO(서열 번호: 36 및 37)로서 합성하였다.
실시예 11 - TARDBP 및 STMN2 표적화된 PMO를 사용한 공-형질감염 후 전사체 및 단백질 분석
PMO 서열 번호: 36 및 37을 SH-SY5Y 세포 속에서 동일한 모델 및 상기 기술된 방법을 사용하여 시험하였다. 세포를 100μM의 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25)로 또는 100μM의 서열 번호: 25 및 STMN2 표적화된 서열 번호: 36 또는 37으로 25μM 내지 1μM(전기천공에서 네온 팁(neon tip) 속의 농도) 범위의 농도에서 형질감염 후 1, 3 및 5일째에 전사체 분석을 위해 수집한 세포를 사용하여 형질감염시켰다. 실험은 3회 수행하였다. 전사체 분석은 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25) 단독으로 처리된 세포에서 크게 상향조절된, 크립틱 엑손의 발현이 서열 번호: 36 및 37 둘 다에 의해 억제되며 명확한 용량 반응이 관찰됨을 나타내었다. 도 13은 RNA 전사체 분석의 대표적인 겔 영상을 나타낸다. 3개의 실험으로부터의 밀도 분석은 25μM의 형질감염 농도에서 서열 번호: 36 및 서열 번호: 37 둘 다가 크립틱 엑손의 발현을 시험한 모든 시점에서 대조군 세포(비처리, Zap 및 대조군 AON 처리됨)에서 관찰된 수준에서 또는 수준 아래의 수준에서 크립틱 엑손의 발현을 억제하였음을 나타내었다. 5μM 농도에서 형질감염 후 5일째에, 서열 번호: 37은 크립틱 엑손의 발현을 4.7%까지 서열 번호: 36은 STMN2 표적화된 AON의 첨가없이 TDP43 고갈된 세포에서 관찰된 것의 25%까지 억제하였다. 1μM 농도에서 처리후 5일째에, 서열 번호: 37 공-처리된 세포는 TARDBP 서열 번호: 25 단독으로 처리된 세포로서 크립틱 엑손 함유 전사체의 수준의 25.9%를 및 서열 번호: 36 공-처리된 세포는 이의 62.9%를 발현하였다(도 14). 3개의 독립된 실험으로부터의 밀도 분석은 도 14a에서 알 수 있다.
서열 번호: 25로 처리된 세포에서, 전체 길이 STMN2 전사체의 발현은 형질감염 후 5일째에 비처리된 세포에서의 수준의 14.4%로 감소하였다. 전체 길이 STMN2 전사체의 발현은 25μM 또는 5μM 농도에서 서열 번호: 36 또는 서열 번호: 37로 공-형질감염된 경우 대조군 세포와 유사한 수준에서 유지되었다. 1μM에서 전체 길이 STMN2 전사체의 발현은 5일 후 서열 번호: 36의 경우 59.2%로 및 AON 27의 경우 79.2%로 감소하였다(도 14b).
단백질 분석을 웨스턴 블롯에 의해 수행하였다. 대표적인 웨스턴 블롯 영상은 도 15a에서 알 수 있다. 3개의 실험으로부터의 밀도 분석은 스타트민-2 발현이 TARDBP 엑손 3 스키핑 PMO(서열 번호: 25)으로 처리한 후 3일째에 완전히 억제되었고 5일째까지 대조군 수준의 13%까지 단지 약간 상승하였음을 나타내었다. 세포를 TARDBP 표적화된 서열 번호: 25 및 STMN2 표적화된 서열 번호: 36 또는 37를 사용하여 25μM 또는 5μM 농도에서 공-형질감염시킨 경우, 스타트민-2 수준은 비처리된 대조군 그룹과 유사한 수준에서 유지되었다. 스타트민-2 발현은 형질감염 후 5일째에 서열 번호: 25 및 서열 번호: 36으로 공-철리된 세포의 경우 1μM의 시험된 최저 농도에서 대조군 수준의 60%까지 강하(drop-off)되었다(도 15b).
실시예 12 - STMN2 표적화된 AON 37 단독으로 전사체 및 단백질 분석
스타트민-2의 과소-발현(under-expression) 뿐만 아니라 과발현(overexpression)은 유해할 수 있다. TDP43이 핵으로부터 감소되거나 고갈되지 않는 세포에서 STMN2 크립틱 엑손 표적화된 AON의 효과를 측정하기 위하여, AON 37을 SH-SY5Y 세포 내로 3개 농도에서 3개의 독립된 실험에서 형질감염시켰다. 대조군 세포를 대조군 서열 번호: 3(서열 번호: 28)으로 형질감염시키거나 AON의 부재하에(Zap) 핵감염시켰다. 세포를 또한 TARDBP 표적화된 서열 번호: 25(형질감염 효율의 대조군으로서)로 형질감염시켰다. RT-PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 전사체 분석은 STMN2 전사체 수준이 시험한 어느 시점에서도(형질감염 후 5일째까지) AON 37을 사용한 형질감염 후 대조군 세포에서 관찰된 수준과 유의적으로 상이하지 않았음을 나타내었다. STMN2 수준은 서열 번호: 25 처리된 세포에서 예측된 수준까지 감소하였고 이는 형질감염 효율이 양호하였음을 나타낸다. 도 16a는 3개의 독립된 실험으로부터 대표적인 겔 영상을 나타내고 도 16b은 3개의 독립된 실험으로부터의 밀도 분석을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석은 서열 번호: 37로 처리한 세포에서 스타트민-2 단백질 수준이 3 및 5일 후에 대조군 세포에서 관찰된 수준까지 근접하게 남았음을 나타내었다(도 17a).
SEQUENCE LISTING <110> Perron Institute for Neurological and Translational Science Limited <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING TARDBP ASSOCIATED DISEASES <130> 289439 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 1 uuccuaaaga gaaaagagau augaa 25 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Human <400> 2 ccaucgucuu ccgaugguau 20 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 3 gcuguaaccg uggagagcag caccg 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 4 acacgccccu ggaaacuggg cugua 25 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 5 gggcaugcag aauuccuucu ac 22 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 6 accuuuugga uaguugacaa cauac 25 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 7 auccauuuuu cuuuuguuau cuaaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 8 cuuucacugc ugaugaagca ucugu 25 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 9 aacacuauua aaucggaugu uuucu 25 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 10 cagguccugu ucgguuguuu uccau 25 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 11 uuuaccugca ccauaagaac uucuc 25 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 12 aaccguggag agcagcaccg uccca 25 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 13 acugggcugu aaccguggag agcag 25 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 14 uggaaacugg gcuguaaccg uggag 25 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 15 acugcugaug aagcaucugu cucau 25 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 16 uuucacuuuc acugcugaug aagca 25 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 17 uauuaaaucg gauguuuucu ggacu 25 <210> 18 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 18 gacccaacac uauuaaaucg gaugu 25 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 19 ccuguucggu uguuuuccau gggag 25 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 20 ucuuucaggu ccuguucggu uguuu 25 <210> 21 <211> 20 <212> RNA <213> Human <400> 21 caguuuuauu uaagaauuuc 20 <210> 22 <211> 28 <212> RNA <213> Human <400> 22 guuuuauuua agaauuucca acaaugac 28 <210> 23 <211> 30 <212> RNA <213> Human <400> 23 gacacauauu auuuaaauca guuuuauuua 30 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 24 aaccgtggag agcagcaccg tccca 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 25 tttcactttc actgctgatg aagca 25 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Human <400> 26 caccuuccuu cuuuuugauu 20 <210> 27 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 27 ggauguccug agucuagacc cuccg 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 28 cctcttacct cagttacaat ttata 25 <210> 29 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 29 cgaaggucuu cugccgaguc cugca 25 <210> 30 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 30 cauucacauu cauuucuucu uaggc 25 <210> 31 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 31 uuuguuuuaa uuucuucagu auugc 25 <210> 32 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 32 gucuucugcc gaguccugca auaug 25 <210> 33 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 33 ucucucgaag gucuucugcc gaguc 25 <210> 34 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 34 acauucauuu cuucuuaggc aggcu 25 <210> 35 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 35 agccgcauuc acauucauuu cuucu 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 36 tctctcgaag gtcttctgcc gagtc 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 37 agccgcattc acattcattt cttct 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 38 ttcctaaaga gaaaagagat atgaa 25 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 39 ccatcgtctt ccgatggtat 20 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 40 gctgtaaccg tggagagcag caccg 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 41 acacgcccct ggaaactggg ctgta 25 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Human <400> 42 gggcatgcag aattccttct ac 22 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 43 accttttgga tagttgacaa catac 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 44 atccattttt cttttgttat ctaaa 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 45 ctttcactgc tgatgaagca tctgt 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 46 aacactatta aatcggatgt tttct 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 47 caggtcctgt tcggttgttt tccat 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 48 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<211> 19 <212> DNA <213> Human <400> 74 gtcaactgtg ccacaagcc 19

Claims (19)

  1. TARDBP 프레-mRNA(TARDBP pre-mRNA)을 암호화(encoding)하는 핵산 분자에 대해 표적화된(targeted) 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로서, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는:
    (a) 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 58 또는 이의 변이체(variant)로 이루어진 목록으로부터 선택된 핵염기 서열(nucleobase sequence); 또는
    (b) 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 25, 서열 번호: 38 내지 서열 번호 58이 또한 결합하는 표적 TARDBP 프레-mRNA 내의 적어도 1개 이상의 인접한 핵염기(contiguous nucleobase) 또는 이의 변이체에 대해 상보성인 핵염기 서열을 가지며,
    여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 TARDBP 유전자의 발현을 억제하고 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 실질적으로 단리 또는 정제되는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  2. STMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는:
    (a) 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66 또는 이의 변이체로 이루어진 목록으로부터 선택되거나;
    (b) 서열 번호: 29 내지 서열 번호: 37, 서열 번호: 62 내지 66이 또한 결합하는 표적 STMN2 프레-mRNA 내의 적어도 1개 이상의 인접한 핵염기 또는 이의 변이체에 대해 상보성인 핵염기 서열을 가지며,
    여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 STMN2 유전자의 하향조절(downregulation)을 방지하고/하거나 이의 발현을 증가시키는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  3. TARDBP 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱(alternative splicing)을 유도하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 제1항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및
    b) 올리고머가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. STMN2 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    (a) 제2항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및
    (b) 올리고머(들)이 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. TDP43 단백질병증(TDP43 proteinopathy)과 관련된 질환의 영향(effect)을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 조성물로서, 상기 조성물이:
    a) 제1항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    b) 하나 이상의 치료학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 조성물.
  6. TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이:
    a) 제1항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    b) 하나 이상의 치료학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키는 방법으로서, 이러한 방법이 대상체(subject)에게 유효량의 제6항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 바이오마커(biomarker)에 의해 확인된 환자에서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) TDP43 억제에 반응하는 경향이 있는 TDP43 단백질병증 환자와 관련된 질환과 관련된 바이오마커의 존재에 대해 대상체를 시험하는 단계; 및
    (b) 대상체가 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 대상체에게 유효량의 제6항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나 대상체에서 자가 조절(auto regulation)에 의해 유발된 TDP43의 과 발현(over expression)을 감소시키는 방법으로서, 이러한 방법이 대상체에게 유효량의 제6항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. STMN2 유전자의 하향조절(downregulation)을 방지하여 스타트민-2(stathmin-2)의 정상 생리학적 수준(normal physiological level)을 유지하고/하거나 대상체내에서 스타트민-2의 발현이 감소된 경우 스타트민-2 발현을 증가시키는 방법으로서, 이러한 방법이 대상체에게 유효량의:
    (a) 제2항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. (1) 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나;
    (2) 대상체에서 자가 조절에 의해 유발된 TDP43의 과 발현을 감소시키고 STMN2 유전자의 하향조절을 방지 또는 감소시킴으로써 대상체에서 스타트민-2의 정상 생리학적 수준을 유지시키거나 이의 발현을 증가시키는 방법으로서, 이러한 방법이 대상체에게 유효량의:
    (a) 제1항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
    (b) 제2항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    (c) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. (1) 대상체에서 TDP43의 발현을 감소시키고/시키거나;
    (2) 대상체에서 자가 조절에 의해 유발된 TDP43의 과 발현을 감소시키고 STMN2 유전자의 하향조절을 방지 또는 감소시킴으로써 대상체에서 스타트민-2의 정상 생리학적 수준을 유지시키거나 이의 발현을 증가시키는 방법으로서, 이러한 방법이 대상체에게 유효량의:
    (a) 제1항 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물; 및
    (b) 제2항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 제2의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 2개의 약제학적 조성물은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  13. 제1항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제2항에 다른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  15. 제1항에 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  16. 제2항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  17. TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  18. TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한, 제1항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  19. 대상체에서 TDP43 단백질병증과 관련된 질환의 영향을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 키트(kit)로서, 여기서 키트는 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기(container) 속에 패키지된(packaged), 적어도 제1항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
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