CN117279667A - 用于治疗tardbp相关疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及反义寡核苷酸的领域，其用于降低编码蛋白TAR DNA结合蛋白43(TDP43)的反式激活应答DNA结合蛋白43(TARDBP)基因的表达。本发明还涉及反义寡核苷酸的领域，其用于防止随后的stathmin‑2下调。本发明还提供通过施用反义寡核苷酸和包含靶向TARDBP的AON和靶向STMN2的AON的治疗组合物来治疗与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物组合物和方法。

Description

用于治疗TARDBP相关疾病的组合物和方法
技术领域
本发明涉及反义寡核苷酸(AON)，其降低编码蛋白TAR DNA结合蛋白43(TDP43)的反式激活应答DNA结合蛋白43(TARDBP)基因的表达。本发明提供了通过施用AON和包含靶向TARDBP的AON的治疗组合物来治疗、预防TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法。本发明还涉及靶向编码STMN2的核酸并且能够结合STMN2前mRNA(pre-mRNA)的AON。
背景技术
以下对背景技术的讨论仅旨在促进对本发明的理解。讨论并非承认或认可所提及的任何材料在申请的优先权日时是或曾经是公知常识的一部分。
TDP43蛋白质病涉及TDP43在神经元和神经胶质细胞中的异常错误定位、磷酸化、泛素化和切割。TDP43蛋白质病发生在多种神经退行性疾病中。组织学研究证实，TDP43存在于大多数肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者神经元的细胞质聚集体中，包括那些在TARDBP基因中具有致病性变异的患者以及散发病例，以及那些具有C9ORF72六核苷酸重复扩增的患者(Giordana等人，Brain Pathology,2010；Takeuchi等人，Acta NeuropathologicaCommunications 2016；Schipper等人，Neuropathology and Applied Neurobiology,2016)。现在认为TDP43在脑和脊髓中的泛素阳性细胞质神经元包涵体中的错误定位和聚集是ALS的病理标志。TDP43蛋白质病也见于额颞叶变性(FTLD)最常见的亚型(Gao等人，Journal of neurochemistry,2018)，也称为额颞叶变性或额颞叶痴呆(FTD)，以及见于30％至70％的阿尔茨海默病(AD)病例(Josephs等人，Acta Neuropathologica,2016)。TDP43病理学也是其他几种神经退行性或神经肌肉疾病的特征，包括佩里综合征(PS)(Mishima,T.等人，Journal of neuropathology and experimental neurology,2017.76(8):第676-682页)，慢性创伤性脑病(CTE)(McKee,A.C.等人，Acta neuropathologica,2015.131(1):p.75-86)，1型脑铁积累神经变性(NBIAT1)(Haraguchi,T.等人，Neuropathology,2011.31(5):第531-539页)，抗IgLON5综合征(AIS)(Cagnin,A.等人，Journal of Alzheimer's disease,2017.59(1):第13-20页)，神经元蜡样脂褐质沉着症(NCL)(J.K.等人,Acta neuropathologica,2014.127(6):第845-860页)，路易体痴呆(LBD)(Arai,T.等人，Acta neuropathologica,2009.117(2):第125-136页)，包涵体肌病(IBMY)(Weihl,C.C.等人，Journal of Neurology,Neurosurgery&Psychiatry,2008.79(10):第1186-1189页)，包涵体肌炎(IBM)(Huntley,M.L.等人，LaboratoryInvestigation,2019.99(7):第1041-1048页)，以及其他几种非常罕见的疾病。
TARDBP基因与ALS有关。ALS是一种影响运动神经元的致命的退行性疾病。ALS通常发生在中年，表现为持续不断的进行性肌肉萎缩和无力，在大多数情况下，对呼吸肌的影响将生存期限制在疾病发生后2至4年(Chio等人，World Federation of NeurologyResearch Group on Motor Neuron Diseases,2009)。ALS是最常见的成人运动神经元疾病，发病率为每100,000人中有2人患病，患病率为每100,000人中有5.4人患病(Chio等人，Neuroepidemiology,2013)。目前的治疗选择基于症状管理和呼吸支持，唯一批准的药物只能延长几个月的生存期(Cetin H.等人，Neuroepidemiology,2015.44:p.6-1)或仅对某些患者提供适度的益处(Sawada,Expert Opinion on Pharmacotherapy,2017.18(7):第735-738页)。缺乏减缓或暂停疾病进展的有效治疗。
虽然TDP43通常集中在细胞核中，但其包含核定位信号和核输出信号，并在细胞核和细胞质之间来回穿梭(Ayala等人，Journal of Cell Science,2008.121(22):第3778-3785页)。TDP43的表达通过反馈机制自我调节，在该机制中，当在核中过剩时，蛋白质结合其自身前mRNA的3'UTR内的一个区域。这触发了替代聚腺苷酸化信号和剪接事件的使用，导致mRNA转录本被降解而不被翻译(Koyama等人，Nucleic acids research,2016.44(12):第5820-5836页；-Vázquez,S.E.等人，Genes&Development,2012.26(15):第1679-1684页；D'Alton等人，RNA,2015.21(8):第1419-1432页)。
ALS中TDP43的细胞质错误定位导致其失控的上调。这导致细胞质中TDP43的水平增加和潜在毒性聚集的形成，而细胞核中的TDP43水平仍然被耗尽(Koyama等人，NucleicAcid Res.2016.Jul；44(12):第5820-36页)。TDP43过表达的啮齿动物模型一致地发现，野生型和突变型TDP43的过表达均可导致神经退行性表型(Ash等人，Human MolecularGenetics,2010.19(16):第3206-3218页；Wils等人，PNAS USA,2010.107(8):第3858-3863页；Kabashi等人，Human Molecular Genetics,2010.19(4):第671-683页；Stallings等人，Neurobiology of Disease,2010.40(2):第404-414页；Xu等人，MolecularNeurodegeneration,2011.6(1):第73页；Liachko等人，The Journal of Neuroscience,2010.30(48):第16208-16219页)。
TDP43作为基因表达的调节剂发挥作用，参与多个RNA加工步骤，在前mRNA剪接、mRNA稳定性调节、mRNA转运、翻译和非编码RNA调节中发挥作用(Ratti,A.he E.Buratti,Journal of Neurochemistry,2016.138(S1):第95-111页；Buratti,E.和F.E.Baralle,RNABiology,2010.7(4):第420-429页；Tollervey等人，Nature Neuroscience,2011.14(4):第452-458页)。其还在应激颗粒动力学中发挥作用。应激颗粒在应激时通过非必需转录本和促凋亡蛋白的翻译停滞促进细胞存活(Protter,D.S.W.和R.Parker,Trends in CellBiology,2016.26(9):第668-679页)。
TDP43在细胞核和细胞质中均发挥作用，但主要存在于细胞核中。通过其在剪接和转录中的作用，TDP43参与许多其他基因的调节，其细胞核耗尽可能导致细胞中的各种下游效应。
增加的细胞质TDP43影响整体mRNA翻译、应激颗粒动力学、线粒体功能和其他细胞通路。TDP43参与调节翻译，其细胞质增加显示导致蛋白质合成的整体减少(Russo等人，Human Molecular Genetics,2017.26(8):第1407-1418页)。TDP43还参与应激颗粒的形成和维持(Khalfallah,Y.等人，Scientific Reports,2018.8(1):第1-13页)。具有朊病毒样结构域的蛋白质(例如TDP43)被认为对于应激颗粒的可逆组装至关重要，因为它们能够形成多个瞬时弱的相互作用(Harrison,A.F.和J.Shorter,The Biochemical Journal,2017.474(8):第1417-1438页)。增加的细胞质TDP43可干扰应激颗粒动力学，导致其功能障碍。TDP43过表达也以多种方式影响线粒体功能(Wang,W.,等人，Nature Medicine,2016.22(8):第869-87827页；Prasad,A.等人,Frontiers in Molecular Neuroscience,2019.12(25))。细胞质TDP43的积累也可以通过朊病毒样传播机制促进疾病进展(Nonaka,T.等人，Cell Reports,2013.4(1):第124-134页)。
细胞核TDP43的耗尽是一个问题，并且正在探索改善TDP43核耗尽的最坏影响的治疗策略。然而，增加的细胞质TDP43与显著的不良后果有关。因此，减少细胞质TDP43的策略可对治疗与TDP43蛋白质病相关的疾病有效。
AON介导的TDP43下调可降低细胞质TDP43过表达对这些过程的影响。WO2019/013141描述了许多针对TARDBP的AON。然而，这些AON中没有一个能够导致对与TDP43蛋白质病相关的疾病进行有效的商业化治疗。
通过其在剪接和转录中的作用，TDP43参与许多其他基因的调节，其细胞核耗尽可能导致细胞中的各种下游效应。细胞核TDP43耗尽导致数百种RNA的差异表达或剪接(Klim等人,Nature Neuroscience,2019.22(2):第167-179页)[1][1]。最近的研究表明，ALS中的TDP43蛋白质病改变神经元蛋白stathmin-2的表达，这可能与增强的神经元易损性有直接的功能联系。
Stathmin-2是由STMN2基因编码的神经元磷蛋白。它是一种膜相关蛋白，定位于高尔基体并分布在核周细胞质、轴突和神经元的生长锥的囊泡中(Chauvin,S.和A.Sobel,Neuronal stathmins:A family of phosphoproteins cooperating for neuronaldevelopment,plasticity and regeneration.Progress in Neurobiology,2015.126:第1-18页)。Stathmin-2在神经系统中高度表达，并在神经元分化、可塑性和再生过程中上调(Chauvin和Sobel 2015)。
Stathmin-2通过调节生长锥内的微管动力学刺激神经突生长(Morii,H.,Y.Shiraishi-Yamaguchi,and N.Mori,SCG10,a microtubuledestabilizing factor,stimulates the neurite outgrowth by modulating microtubuledynamics in rathippocampal primary cultured neurons.Journal of Neurobiology,2006.66(10):第1101-1114页)。微管是微管蛋白的聚合物，构成细胞骨架的一部分，为细胞提供结构和形状。微管是动态结构，经历组装和解聚阶段，这取决于环境中游离微管蛋白的量(Chauvin和Sobel 2015)。Stathmins，包括stathmin-2，通过其隔离和释放调节可用的微管蛋白的量。stathmin-2的磷酸化是微管蛋白隔离的负调节因子，促进管释放和聚合(Poulain和Sobel,Molecular and Cellular Neuroscience,2007.34(2):第137-146页)。stathmin-2的严格调节是适当的神经突生成所必需的。Stathmin-2耗尽诱导延长的生长锥暂停和增加的表面积(Poulain和Sobel,Molecular and Cellular Neuroscience,2007.34(2):第137-146页)。中等水平的stathmin-2刺激神经突生长，而过表达会由于过度的微管分解而导致神经突撤回(Morii等人，Neurobiology,2006.66(10):第1101-1114页)。Stathmins在中枢和周围神经系统的再生过程中发挥重要作用(Chauvin和Sobel 2015)[2]，并在周围神经再生过程中和脑创伤后上调(Voria等人，Experimental Neurology,2006.197(1):第258-267页；Shin等人，Experimental neurology,2014.252:第1-11页)。Stathmin-2还在其他神经元功能中发挥作用，包括细胞内运输和神经内分泌分泌(Mahapatra等人，Biochemistry,2008.47(27):第7167-7178页)。
在神经元中，stathmin-2水平受TDP43调节。TDP43能够结合STMN2前mRNA的第一内含子内的位点；这抑制了将隐藏的外显子包括在成熟的mRNA转录本中，从而允许完整的STMN2 mRNA和蛋白质被表达。当TDP43水平降低时，它与STMN2前mRNA的结合减少，使隐藏的外显子暴露并导致其包括在成熟的mRNA转录本中。隐藏的外显子包含提前的终止密码子和提前的聚腺苷酸化位点，其利用产生截短和无功能的mRNA，导致stathmin-2表达降低(Melamed等人，Nature neuroscience,2019.22(2):第180-190页)。
对耗尽了TDP43的ALS患者iPSC衍生的运动神经元的研究报告了stathmin-2表达减少，导致轴突生长和再生减少，这可以通过增加其表达来恢复(Melamed等人，Natureneuroscience,2019.22(2):第180-190页)。已在来自ALS患者组织样本的运动神经元中体内确认了Stathmin-2表达降低和含有隐藏的外显子的STMN2转录本表达增加(Klim等人，Nature Neuroscience,2019.22(2):第167-179页；Melamed,Z.e.等人，Natureneuroscience,2019.22(2):第180-190页)。结合旨在减少TDP43表达和防止随后的stathmin-2下调的AON的治疗策略可以减少细胞质TDP43过表达的影响，同时防止由stathmin-2耗尽引起的神经元易损性。
反义技术正在成为减少特定基因产物表达的有效手段，因此可证明在许多用于调节TARDBP表达的治疗、诊断和研究应用中具有独特的用途。反义技术可以在多种不同水平(转录、剪接、稳定性、翻译)上影响基因表达。然而，反义技术面临的挑战是仍然难以识别具有预期体内效果的特定AON。
因此，尽管进行了大量研究，但仍然需要开发和识别对ALS等神经系统病症的有效治疗。这种治疗仍然没有明确的途径。
正是在这种背景下开发了本发明。特别地，本发明寻求提供用于改善与TDP43蛋白质病相关的疾病中的TDP43蛋白质病(proteinopathy)的方法。
发明内容
本发明涉及靶向编码TARDBP的核酸的化合物，特别是AON。本发明的实施方案涉及能够与TARDBP前mRNA结合的AON。本发明还涉及靶向编码STMN2的核酸的化合物，特别是AON。本发明的实施方案涉及能够结合STMN2前mRNA的AON。
广义上，根据本发明的第一方面，提供了靶向编码TARDBP前mRNA的核酸分子的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸具有核碱基序列，其是：(a)选自：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:38至58、或其变体；或者(b)与靶TARDBP前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基(nucleobase)互补、也与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58或其变体结合，其中反义寡核苷酸抑制TARDBP基因的表达并且其中反义寡核苷酸基本上是分离的或纯化的。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸抑制TDP43的表达。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸结合TARDBP上的外显子3。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸通过外显子跳跃诱导TARDBP前mRNA的备选剪接。
在进一步的实施方案中，外显子是外显子3。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是肽-磷酰二胺吗啉代寡聚物缀合物。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸选自：SEQ ID NO:12、16、24和25。优选地，反义寡核苷酸是SEQ ID NO:16、25。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
在本发明的第二个方面，提供了一种靶向编码STMN2前mRNA的核酸分子的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有选自以下的核碱基序列：(a)SEQ ID NO:29至SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:62至66，或其变体；或(b)与靶STMN2前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66或其变体结合，其中反义寡核苷酸防止STMN2基因的下调和/或增加STMN2基因的表达，并且其中反义寡核苷酸基本上是分离的或纯化的。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸防止或减少stathmin-2表达的下调或增加。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸与人STMN2的内含子1中的隐藏的外显子结合。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸导致隐藏的外显子被排除在成熟mRNA转录本之外。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是肽-磷酰二胺吗啉代寡聚物缀合物。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸选自：SEQ ID NO:36和37。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
在本发明的另一个方面，提供了一种诱导TARDBP前mRNA备选剪接的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一个或多个根据本发明第一方面的反义寡核苷酸；和(b)使寡聚物与靶核酸位点结合。
在本发明的另一方面，提供了一种诱导STMN2前mRNA备选剪接的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一个或多个本发明第二方面的反义寡核苷酸；和(b)使寡聚物与靶核酸位点结合。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的组合物，所述组合物包含：(a)根据本发明第一方面的一个或多个反义寡核苷酸；和(b)一种或多种治疗上可接受的载体和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，所述组合物还包含一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物组合物，所述组合物包含：(a)根据本发明第一方面的一个或多个反义寡核苷酸；和(b)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM。
在另一个实施方案中，所述药物组合物还包含一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的药物组合物的步骤。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD和FTLD、PS、IBMY、IBM、CTE、LBD和NCL。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD和FTLD、PS、IBMY和IBM。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD和FTLD。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防由生物标志物识别的患者中与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善由生物标志物识别的患者中与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，所述方法包括以下步骤：(a)测试受试者是否存在生物标志物，所述生物标志物与TDP43蛋白质病相关疾病的患者可能对TDP43抑制响应相关；(b)如果发现所述受试者表达该生物标志物，则向所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
在进一步的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM。
在进一步的实施方案中，生物标志物是截短的STMN2转录本。
在本发明的另一个方面，提供了一种降低受试者中TDP43表达和/或降低受试者中由自身调节引起的TDP43过表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物的步骤。
在本发明的另一个方面，提供了一种预防或减少STMN2基因下调以维持stathmin-2的正常生理水平和/或在stathmin-2表达已经降低的受试者中增加stathmin-2表达的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：(a)根据本发明第二方面的一个或多个反义寡核苷酸；和(b)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在本发明的另一方面，提供了一种方法：(1)其降低受试者中TDP43的表达；和/或(2)降低受试者中由自身调节引起的TDP43过表达，并防止或降低STMN2基因的下调以维持受试者中stathmin-2正常的生理水平或升高的水平，所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：一个或多个根据本发明第一方面的反义寡核苷酸；一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸；和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在本发明的另一方面，提供了一种方法：(1)其降低受试者中TDP43的表达；和/或(2)降低受试者中由自身调节引起的TDP43过表达，并防止或降低STMN2基因的下调以维持受试者中stathmin-2正常的生理水平或增加的水平，所述方法包括以下步骤：向受试者施用有效量的(a)药物组合物，其包含一个或多个根据本发明第一方面的反义寡核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂；和(b)第二药物组合物，其包含一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，其中将两种药物组合物同时或依次施用于受试者。
在本发明的另一方面，提供了包含一个或多个根据本发明第一方面的反义寡核苷酸的表达载体。
在优选的实施方案中，所述表达载体包含一个或多个本发明第二方面的反义寡核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了包含一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸的表达载体。
在本发明的另一方面，提供了包含根据本发明第一方面的反义寡核苷酸的细胞。
在优选的实施方案中，所述细胞包含一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了包含根据本发明第二方面的反义寡核苷酸的细胞。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明第一方面的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明第一方面的反义寡核苷酸用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的用途。
在一个优选的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM。
在一个优选的实施方案中，用途包括一个或多个根据本发明第二方面的反义寡核苷酸的用途。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗、预防受试者中与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的试剂盒，其中所述试剂盒至少包含根据本发明第一方面的反义寡核苷酸，连同其使用说明包装在合适的容器中。
在一个优选的实施方案中，与TDP43蛋白质病相关的疾病选自：ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含根据本发明第二方面的反义寡核苷酸。
根据其又一方面，本发明延伸至本发明的AON序列的cDNA或克隆拷贝，以及包含一个或多个本发明的AON序列的载体。本发明进一步延伸至包含此类序列和/或载体的细胞。
本发明的其他特征将在以下几个非限制性实施方案的描述中得到更全面的描述。仅出于举例说明本发明的目的包括该描述。不应将其理解为对上述本发明的广泛概括、公开内容或描述的限制。
附图说明
以下描述是参考下面的附图提供的。
图1显示了使用不同聚腺苷酸化位点时产生的TARDBP转录本的示意图。
图2显示了TARDBP上外显子2和3靶向AON中每个的结合位置示意图。
图3显示了在人成纤维细胞中用TARDBP外显子2靶向AO转染后，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的TARDBP转录本分析。
图4显示了在人成纤维细胞中用TARDBP外显子3靶向AON转染后，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的TARDBP转录本分析。
图5显示了通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的TARDBP转录本分析，用于研究外显子2靶向AON SEQ ID NO:3和12诱导的TARDBP转录本敲低的机制。
图6显示了在用旨在阻断TARDBP聚腺苷酸化位点1(PA1)的AON转染人成纤维细胞后，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的TARDBP转录本分析。
图7显示了通过用150μM的TARDBP靶向PMO AON ID 24和25核转染转染人成纤维细胞后，TARDBP转录本分析和TDP43蛋白水平。
图8显示了通过用100和50μM浓度的TARDBP靶向PMO(AON 25)核转染转染人成纤维细胞3次的结果。误差条表示平均值的标准误差。
图9显示了在人SH-SY5Y细胞中用TARDBP靶向PMO(AON 25)转染后，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的STMN2转录本分析。
图10显示了STMN2内含子1中STMN2隐藏外显子靶向AON的结合位置示意图。
图11显示了用TARDBP第3外显子跳过的PMO(SEQ ID NO:25)单独或与STMN2隐藏外显子靶向2′O甲基-PS AON(SEQ ID 29、30或31)一起或对照寡聚物(AON ID 28)通过电穿孔转染人SH-SH5Y细胞后的STMN2转录本分析。
图12显示了通过将AON序列沿SEQ ID NO:29(SEQ ID 32和33)和SEQ ID NO:30(SEQ ID 34和35)上游和下游移位5个碱基进行序列优化后，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的STMN2转录本分析。误差条表示平均值的标准误差。
图13显示了用TARDBP第3外显子跳过的PMO(SEQ ID NO:25)或SEQ ID NO:25和STMN2靶向的SEQ ID 36或37的组合通过电穿孔转染人SH-SH5Y细胞后的STMN2转录本分析。
图14显示了用TARDBP外显子3跳过PMO(SEQ ID No：25)或SEQ ID NO:25和STMN2靶向SEQ ID 36或37的组合转染SH-SY5Y细胞3次的STMN2转录本分析结果。误差条表示平均值的标准误差。
图15显示了TARDBP SEQ ID NO:25和STMN2 SEQ ID 36或37共处理细胞的代表性蛋白质印迹图像和密度测量分析。误差条表示平均值的标准误差。
图16显示了用SEQ ID NO:37通过电穿孔转染人SH-SH5Y细胞后的STMN2转录本分析。误差条表示平均值的标准误差。
图17显示了对仅SEQ ID NO:37处理的细胞通过蛋白质印迹分析的代表性stathmin-2表达的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种使用AON疗法的预防或治疗方法，用于改善或减缓与TDP43蛋白质病(包括ALS、AD、FTLD、PS、CTE、NBIAT1、AIS、NCL、LBD、IBMY和IBM)相关疾病的症状的进一步进展。更具体地，本发明提供了分离或纯化的靶向编码TARDBP前mRNA的核酸分子的AON，其中AON具有以下核碱基序列：
a.选自包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:58(含)或其变体的列表，或
或
b.与靶TARDBP前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58(含)或其变体结合的序列，和
c.其中AON抑制人TARDBP的表达。
本发明还提供分离或纯化的反义寡核苷酸，其靶向编码STMN2前mRNA的核酸分子，其中AON具有如下核碱基序列：
a.选自包括SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:66(含)的列表，或
b.与靶STMN2前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID No:62至66(含)结合的序列，和其中AON在stathmin-2减少时维持stathmin-2正常的生理水平和/或增加stathmin-2的表达。
为方便起见，以下部分大体概述了本文使用的术语的各种含义。在该讨论之后，讨论了关于本发明的组合物、药物的用途和方法的一般方面，接着是展示本发明的各种实施方案的性质以及如何使用它们的具体实施例。
1.定义
下文提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果本领域术语的使用与其在本文提供的定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的定义为准。
本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的那些之外还可以进行变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括单独地或共同地在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
本文中引用的每份文件、参考文献、专利申请或专利均通过引用明确地整体并入本文，这意味着读者应将其阅读并视为本文的一部分。文中引用的文件、参考文献、专利申请或专利，为简明起见，文中不再重复。然而，所引用的材料或该材料中包含的信息均不应被理解为公知常识。
本文中提及的任何产品或通过引用并入本文的任何文件中的制造商的说明书、说明书、产品说明书和产品手册均通过引用并入本文，并可用于实施本发明。
本发明的范围不受本文描述的任何特定实施方案的限制。这些实施方案旨在仅用于示例的目的。功能等同的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
除了在操作实施例中，或在另外指明的情况下，本文中使用的所有表示成分量或反应条件的数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以表示±1％。
本文所述的发明可包括值(例如，大小、浓度等)的一个或多个范围。值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括定义该范围的值，以及与该范围相邻的值，其导致与紧邻定义范围边界的该值的值相同或基本相同的结果。例如，本领域的技术人员将理解范围的上限或下限的10％的变化可以是完全合适的并且包含在本发明中。更具体地，范围的上限或下限的变化将为5％或如本领域普遍认可的，甚至更大。
在本申请中，除非另有特别说明，单数的使用也包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式，例如“包含”和“包括的”的使用不是限制性的。同样，术语，例如“元件”或“成分”即包括包含一个单元的元件和成分，也包括包含多于一个亚单元的元件和成分，除非另外特别说明。此外，术语“部分”的使用可包括部分的一部分或整个部分。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或诸如“含有”、“包含”的变体将理解为暗示包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。
如本文所用，术语“施用”是指通过导致组合物至少部分定位在其所需的作用部位从而产生所需效果的方法或途径将组合物置于受试者中。本文所述的化合物或组合物可以通过本领域已知的任何适当途径施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、肺、鼻、直肠和局部(包括颊和舌下)施用。
本文使用的选定术语的其他定义可在本发明的详细描述中找到并贯穿全文。除非另有定义，本文使用的所有其他科学和技术术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
现在将参照以下非限制性描述和实施例来讨论本发明的特征。
2.实施方案
本发明的实施方案通常涉及改进的反义化合物及其方法或用途，其专门设计用于抑制TARDBP的表达。TARDBP在细胞质中的错误定位与TDP43蛋白质病相关的疾病有关，包括ALS、FTLD和AD。
不受理论的束缚，本发明基于这样的理解，即在患有与TDP43蛋白质病相关的疾病的患者中抑制TDP43的表达可能具有减缓这些患者症状的进展和/或提高存活率的作用。这是因为TDP43蛋白质病，包括导致TDP43失控上调的TDP43细胞质的错误定位，与许多神经系统病症有关，包括ALS、FTLD和AD。因此，假设抑制TARDBP基因(其编码TDP43)会导致减缓患有与TDP43蛋白质病相关的疾病(包括ALS、FTLD和AD)的患者的症状进展和/或提高存活率。可以从这种疗法中获益的患者可能在TARDBP基因中具有突变或错误折叠。然而，未表现出TARDBP突变或错误折叠的患者也可能对抑制TARDBP基因的治疗有反应。
本发明的实施方案一般还涉及改进的反义化合物及其方法或用途，其专门设计用于防止随后的stathmin-2下调。Stathmin-2在中枢和周围神经系统的再生过程中起重要作用。已在来自ALS患者组织样本的运动神经元中在体内确认stathmin-2表达减少。不受理论的束缚，本发明还基于以下理解：结合旨在减少TDP43表达的AON和旨在防止随后的stathmin-2下调的AON的治疗策略可以减少细胞质TDP43过表达的影响，同时防止由stathmin-2耗尽引起的神经元易损性。可以通过将AON靶向STMN2转录本来维持stathmin-2蛋白的正常生理水平。
A.反义寡核苷酸
本发明提供了一种或多种分离的或纯化的AON，其靶向编码TARDBP前mRNA的核酸分子，其中AON具有选自以下列表的核碱基序列：所述列表包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58(含)(如下表1和2中所列)，并且其中AON抑制人TDP43的表达。优选地，AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
更一般地，本发明提供分离的或纯化的反义寡核苷酸，其靶向编码TARDBP前mRNA的核酸分子，其中AON具有以下核碱基序列：
a.选自包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58(含)的列表，或
b.与靶TARDBP前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQID NO:1至SEQID NO:25、SEQ ID NO:38至58(含)结合的序列，和
c.其中AON抑制人TARDBP的表达。
本发明还提供了一种或多种分离的或纯化的AON，其靶向编码STMN2前mRNA的核酸分子，其中AON具有选自以下列表的核碱基序列：所述列表包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66(含)(如下表1和2中所列)，并且其中AON维持stathmin-2的正常生理水平或减少stathmin-2的下调。更一般地，本发明还提供分离的或纯化的反义寡核苷酸，其靶向编码STMN2前mRNA的核酸分子，其中AON具有如下核碱基序列：
a.选自包括SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66(含)的列表，或
b.与靶STMN2前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID No:62至66(含)结合的序列，和
c.其中这些AON维持stathmin-2的正常生理水平或减少stathmin-2的下调。
优选地，AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
表1
参考点(0)设置在5'和3'剪接位点的第一个碱基；因此，“+”表示外显子内的核苷酸结合，“-”表示内含子内的核苷酸结合。
在本发明的任何AON中，本文提供的序列的尿嘧啶(U)可以被胸腺嘧啶(T)替代。例如，本发明的AON具有如表2中所列的序列。
表2
参考点(0)设置在5'和3'剪接位点的第一个碱基；因此，“+”表示外显子内的核苷酸结合，“-”表示内含子内的核苷酸结合。
本文档实施例中描述的其他AON包括表3中列出的那些。
表3
本发明的某些AON被设计为互补人TARDBP前mRNA内外显子2和3内合适的序列。在优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补人TARDBP前mRNA的外显子3内合适的序列并诱导外显子的跳跃。最优选地，本发明的AON是SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:25。
在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补外显子2内合适的序列。在一个实施方案中，AON是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24。
本发明的某些AON还设计为互补人STMN2前mRNA内含子1中隐藏外显子中合适的序列。在一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补人STMN2前mRNA内含子1中隐藏外显子内合适的序列。选择抑制剪接增强子结合的位点，如使用靶向三个增强子位点热点的AON的在线剪接预测工具所预测的那样。减少剪接增强子的结合降低了剪接体对外显子的识别，导致隐藏外显子被排除在成熟的mRNA转录本之外。这将导致产生的stathmin-2水平增加，因为不包含隐藏外显子的成熟STMN2转录本被翻译。
优选地，设计成互补人STMN2前mRNA内合适的序列的AON选自SEQ ID NO:29至SEQID NO:37、SEQ ID NO:62至66的列表，或更优选地选自SEQ ID NO:33、35、36和37。
术语“反义寡聚物”和“反义化合物”和“反义寡核苷酸”或“AON”可互换使用，是指环状亚基的线性序列，每个环状亚基带有碱基配对的部分，所述部分通过亚基间键连接，以允许碱基配对部分通过Watson-Crick碱基配对与核酸(通常是RNA)中的靶序列杂交，在靶序列内形成核酸：寡聚物异源双链体。环状亚基基于核糖或另一种戊糖，或者在优选的实施方案中，基于吗啉代基团(参见下文中吗啉代寡聚物的描述)。寡聚物可能与靶序列具有精确的或接近的序列互补性；寡聚物末端附近的序列变化通常优于内部变化。还考虑了肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2'-O-甲基寡核苷酸，以及本领域已知的其他反义试剂。
术语“寡核苷酸”包括多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其中RNA是通过转录DNA模板制备或获得的。根据本发明，核酸可以作为单链或双链和线性或共价环状闭合分子存在。
“分离的”是指基本上或实质上不含通常在其天然状态中伴随的组分的物质。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”可指已纯化或从其天然存在状态下的侧翼序列中移除的多核苷酸，例如，从基因组中片段相邻的序列中移出的DNA片段。当涉及细胞时，术语“分离”是指从来源受试者(例如，患有多核苷酸重复疾病的受试者)纯化细胞(例如，成纤维细胞、成淋巴细胞)。在mRNA或蛋白质的上下文中，“分离”是指从来源(例如细胞)回收mRNA或蛋白质。
AON可以称为“定向”或“靶向”与其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列包括含有聚腺苷酸化位点和周围区域的区域。靶序列通常是一个区域，包括mRNA的AUG起始密码子、翻译抑制寡聚物或加工前mRNA的剪接位点、剪接抑制寡聚物(SSO)。剪接位点的靶序列可包括这样的mRNA序列，其5'末端具有在加工前mRNA中正常剪接受体接头下游的1至约25个碱基对。优选的靶序列是加工前mRNA的任何区域，其包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点。当寡聚物以上述方式靶向靶标的核酸时，更一般地称所述寡聚物“靶向”生物学相关靶标，例如蛋白质、病毒或细菌。
如本文所用，“足够长度”或“足够序列互补性”是指与靶TARDBP前mRNA(或STMN2前mRNA)中的至少1个、更典型地1-30个连续核碱基互补的AON。在一些实施方案中，足够长度的反义包括靶TARDBP前mRNA中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续的核碱基。在其他实施方案中，足够长度的反义包括靶TARDBP前mRNA(或STMN2前mRNA)中的至少16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的核碱基。优选地，足够长度的寡核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸，包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个或更多个核苷酸的寡核苷酸。在一个实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为10至约30个核苷酸。在另一个实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为15至约25个核苷酸。在又一个实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为20至30、或20至50个核苷酸。在又一个实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为22至28、25至28、24至29或25至30个核苷酸。
在某些实施方案中，AON与靶RNA具有足够的序列互补性，从而以有效的方式阻断靶RNA(例如，前mRNA)的区域。在一些实施方案中，这种对TARDBP前mRNA的阻断用于诱导外显子跳跃。在一些实施方案中，靶RNA是靶前mRNA(例如，TARDBP基因前mRNA)。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列5'-A-G-T-3'与序列"'-T-C-A-5’互补。互补性可以是“部分”的，其中只有核酸碱基中的一些根据碱基配对规则匹配。或者核酸之间可以“完全的”或“全部的”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。因此，本文所用的“互补”序列是指寡核苷酸序列与靶RNA或DNA序列具有某种互补性。
为了本发明的目的，核苷酸序列的互补是能够与所示核苷酸序列形成双链DNA或RNA分子的核苷酸序列，并且其可以根据Chargaff规则(A<>T；G<>C；A<>U)用其互补核苷酸替代核苷酸而来自所示的核苷酸序列，并且在5'至3'方向读取，即与所示核苷酸序列的方向相反。这也包括DNA/RNA的合成类似物(例如，2′F-ANA寡聚物)。
术语“同源性”或“同一性”是指互补性的程度。寡核苷酸序列与靶RNA或DNA的互补序列之间可能存在部分同源性或完全序列同一性。部分相同的序列是与靶RNA或DNA至少部分杂交的寡核苷酸，导致部分异源双链体的形成，并导致靶RNA或DNA的部分或全部降解。完全相同的序列是与靶RNA或DNA完全杂交的寡核苷酸，导致完全异源双链体的形成，并导致靶RNA或DNA的部分或全部降解。
在某些实施方案中，AON可以与靶序列100％互补，或者可以包括错配，例如，以容纳变体，只要寡核苷酸和靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酶的作用和其他体内可能发生的降解模式。因此，某些寡核苷酸可在寡核苷酸和靶序列之间具有大约或至少大约70％的序列互补性，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互补性。
错配(如果存在)通常对杂合双链体末端区域的不稳定性低于中间区域。根据众所周知的双链体稳定性原则，允许的错配数量将取决于寡核苷酸的长度、双链体中G:C碱基对的百分比以及双链体中错配的位置。虽然这样的AON不一定与靶序列100％互补，但它可以有效地稳定地并且特异性地结合靶序列，从而调节与靶前体RNA结合的切割因子。
AON和靶序列之间形成的双链体的稳定性是结合Tm和双链体对细胞酶促裂解的敏感性的函数。寡核苷酸相对于互补序列RNA的Tm可以通过常规方法测量，例如Hames等人,Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,(1985),107-108或Miyada C.G.和WallaceR.B.,(1987),Methods Enzymol.154,94-107中描述的方法。在某些实施方案中，AON具有的相对于互补序列RNA的结合Tm可高于体温，优选高于约45℃或50℃。60-80℃或更高范围内的Tm也包括在内。
变体的其他示例包括AON，其在SEQ ID NO:1-66中任意的全长上具有大约或至少大约70％的序列同一性或同源性，例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性。
在优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补人TARDBP前mRNA的外显子3内合适的序列并诱导外显子的跳跃。
在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补外显子2内合适的序列。
优选地，提供了能够结合选定靶位点以在TARDBP基因转录本或其部分中诱导外显子跳跃的AON。一方面，AON诱导TARDBP基因中外显子2或3的跳跃。最优选地，AON诱导外显子3的跳跃。
在另一个实施方案中，AON通过阻断聚腺苷酸化信号在空间上抑制PA1的使用，从而诱导TARDBP前mRNA的备选剪接。不受理论的束缚，TARDBP转录本通过使用备选剪接和几种聚腺苷酸化信号(PA1、PA2和PA4)自我调节(如Koyama等人，2016年所述)。当TDP43在核中丰富时，其能够结合转录本(内含子7)的3-UTR中的位置。这会阻止PA1的使用并触发PA4或PA2的使用。当这种情况发生时，内含子7受体位点保留在转录本中，允许内含子7从转录本中剪接出来，并触发随后的内含子6和8的剪接。产生的转录本(II或III)经历无义介导的mRNA衰变。也可保留少量未剪接的转录本，并保留在细胞核中。当TDP43从细胞核中耗尽并且不能与内含子7结合时，使用PA1。Int 7受体位点不保留在转录本中，因为它位于PA1的下游。该转录本(I)被翻译成蛋白质。转录本的示意图见图1。因此，通过阻断聚腺苷酸化信号在空间上抑制PA1使用的AON可导致翻译的转录本(I)的减少，以及未翻译的转录本(II、III、IV)的增加。
AON优选选自表1或表2中提供的那些。例如，本发明中使用的AON选自包含SEQ IDNO:12、16、24和25的列表。最优选地，AON选自包含SEQ ID NO:16或25的列表。
在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计为互补人STMN2前mRNA内含子1中隐藏外显子内合适的序列。选择抑制剪接增强子结合的位点，如使用靶向三个增强子位点热点的AON的在线剪接预测工具所预测的那样。减少剪接增强子的结合降低了剪接体对外显子的识别，导致隐藏外显子被排除在成熟的mRNA转录本之外。这将导致随着不包含隐藏外显子的成熟STMN2转录本被翻译，产生的stathmin-2水平增加。
B.使用方法
本发明还提供了一种抑制TDP43表达的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供本文所述的一种或多种AON，和
(b)允许寡聚物与靶核酸位点结合。
更具体地，AON可以选自表1或表2中列出的那些。序列优选选自以下SEQ ID No:中的任一个或多个：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58，及其组合或混合物。这包括可以在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列、与其互补的序列、含有修饰碱基、修饰骨架和其功能性截短或延伸的序列，其具有或调节TARDBP基因转录本中RNA的加工活性。
优选地，用于本发明的AON选自包含SEQ ID NO：12、16、24和25的列表。最优选地，AON选自包含SEQ ID NO：16或25的列表。
在一个优选实施方案中，本发明方法中使用的AON诱导TARDBP前mRNA的备选剪接。一方面，AON通过诱导TARDBP前mRNA中的外显子跳跃来诱导备选剪接。优选地，AON诱导外显子2或3的跳跃。最优选地，AON诱导外显子3的跳跃。在另一个实施方案中，AON可以通过一些其他机制减少TDP43的表达。
作为一个优选实施方案，AON还可以选自SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:62至66。本发明的这些AON设计为互补人STMN2前mRNA内含子1中隐藏外显子中合适的序列。在一个优选的实施方案中，本发明的某些AON被设计成互补人STMN2前mRNA的内含子1中的隐藏外显子内的合适序列。选择抑制剪接增强子结合的位点，如使用靶向三个增强子位点热点的AON的在线剪接预测工具所预测的那样。减少剪接增强子的结合降低了剪接体对外显子的识别，导致隐藏外显子被排除在成熟的mRNA转录本之外。这将导致因不包含隐藏外显子的成熟STMN2转录本被翻译，产生的stathmin-2水平增加。
一种治疗策略，其组合：(1)设计用于减少TDP43表达的AON(SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:38至58)；和(2)设计用于防止或减少随后的stathmin-2下调的AON(SEQID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66)，所述治疗策略将减少细胞质TDP43过表达的影响，同时防止由stathmin-2耗尽引起的神经元易损性。一方面，本发明试图提供一种方法，其用于改善患有与TDP43蛋白质病相关疾病的受试者的TDP43蛋白质病，同时维持正常的stathmin-2生理水平。
优选地，设计用于防止随后的stathmin-2下调的AON选自SEQ ID NO:29至SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:62至66的列表，或更优选地选自SEQ ID NO:33、35、36和37。
靶序列和选择性杂交
当每个分子中足够数量的相应位置被可以相互氢键结合的核苷酸占据时，寡聚物与DNA、cDNA或RNA彼此互补。因此，“特异性可杂交的”和“互补的”是用于指示足够程度的互补性或配对的术语，使得稳定和特异性结合发生在寡聚物和DNA、cDNA或RNA靶标之间。本领域理解AON的序列不需要与其靶序列100％互补才能特异性杂交。当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA产物的正常功能时，AON是特异性杂交的，并且存在足够程度的互补性以避免AON与非靶序列在特异性结合所需的条件下非特异性结合，即，在体内测定或治疗处理的情况下，是生理条件下；以及在体外测定的情况下，是在进行测定的条件下。
选择性杂交可以在低、中或高严格条件下进行，但优选在高严格条件下进行。本领域的技术人员将认识到，除了碱基组成、互补链的长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数量之外，杂交的严格性还会受到盐浓度、温度或有机溶剂等条件的影响。严格的温度条件通常包括温度超过30℃，通常超过37℃，并且优选超过45℃，优选至少50℃，通常为60℃-80℃或更高。严格的盐条件通常低于1000mM，通常低于500mM，优选低于200mM。然而，参数的组合比任何单个参数的测量重要得多。严格杂交条件的一个示例是65℃和0.1x SSC(1x SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)。因此，本发明的AON可包括与表1或表2中提供的序列选择性杂交的寡聚物。
在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交时的温度。这种杂交可发生在AON与靶序列“接近”或“基本”互补时，以及精确互补时。
通常，当在至少约14个核苷酸的片段上存在与反义寡聚物的核苷酸至少约55％的同一性，优选至少约65％、更优选至少约75％、最优选至少约90％、95％、98％或99％同一性时，将发生选择性杂交。如所描述的，同源性比较的长度可以在更长的片段上，并且在某些实施方案中通常将在至少约9个核苷酸的片段上，通常至少约12个核苷酸，更通常至少约20个、通常至少约21、22、23或24个核苷酸，至少约25、26、27或28个核苷酸，至少约29、30、31或32个核苷酸，至少约36个或更多个核苷酸。
因此，在一些实施方案中，本发明的AON序列优选与本文序列表中显示的序列具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少86、87、88、89或90％的同源性。更优选具有至少91、92、93、94或95％，更优选至少96、97、98％或99％的同源性。通常，反义寡聚物的长度越短，获得选择性杂交所需的同源性越大。因此，当本发明的AON由少于约30个核苷酸组成时，与本文序列表中列出的AON相比，优选同一性百分比大于75％，优选大于85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95％、96、97、98％或99％。核苷酸同源性比较可以通过序列比较程序进行，例如GCG Wisconsin Bestfit程序或GAP(Deveraux等人,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)。以这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文引用的那些序列长度相似或基本不同的序列，例如通过GAP使用的比较算法来确定这样的空位。
本发明的AON可以具有同源性降低的区域，以及与靶序列完全同源的区域。寡聚物不必在其整个长度上具有精确的同源性。例如，寡聚物可具有与靶序列相同的至少4或5个碱基的连续片段，优选可具有与靶序列相同的至少6或7个碱基的连续片段，更优选可具有与靶序列相同的至少8或9个碱基的连续片段。寡聚物可具有与靶序列相同的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碱基的片段。寡聚物序列的剩余片段可与靶序列断断续续地相同；例如，剩余序列可以有一个相同的碱基，然后是一个不相同的碱基，然后是一个相同的碱基。或者(或同时)寡聚物序列可具有相同序列的几个片段(例如3、4、5或6个碱基)，其中散布着不具有完全同源的片段。这样的序列错配将优选没有或具有非常少的切割修饰活性损失。
生理反应
一方面，本发明的方法在受试者中诱导生理反应。优选地，所述方法降低TDP43的表达。
术语“调节”包括“增加”或“减少”一个或多个可量化的参数，可选地增加或减少限定的和/或统计学上显著的量。术语“增加”、“增强”或“刺激”通常指相对于无AON或对照化合物引起的反应，一种或多种AON或组合物在细胞或受试者中产生或引起更大生理反应(即下游效应)的能力。
通过“增强”，或“增加”，或“刺激”，通常指与无反义化合物或对照化合物引起的反应相比，一种或多种反义化合物或组合物在细胞或受试者中产生或引起更大生理反应(即下游效应)的能力。“增加”或“增强”的量通常是“具有统计学显著性”的量，可以包括的增加是为由无反义化合物(不存在试剂)或对照化合物产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如，500、1000倍)(包括上述之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)。
术语“减少”通常指相对于无AON或对照化合物引起的反应，一种或多种AON或组合物在细胞或受试者中产生或引起减少的生理反应(即下游效应)的能力。术语“减少”或“抑制”一般可涉及本发明的一种或多种反义化合物“减少”相关生理或细胞反应的能力，例如本文所述疾病或病症的症状，如根据诊断领域的常规技术所测量的。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括TDB-43相关病症的症状或病理的减轻。与无反义化合物或对照组合物产生的反应相比，反应的“减少”可能具有统计学显著性，并且可以包括减少1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％，包括上述之间的所有整数。
相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括TDB-43表达的量的减少。“增加”或“增强”的量通常是具有统计学显著性的量，可以包括的增加是为由无AON(不存在试剂)或对照化合物产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如，500、1000倍)(包括上述之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8)。术语“减少”或“抑制”一般可涉及一种或多种AON或组合物“减少”相关生理或细胞反应的能力，例如本文所述疾病或病症的症状，如根据诊断领域的常规技术所测量的。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括TDB-43蛋白质病相关疾病的症状或病理的减轻，例如ALS、FTLD、AD。与无AON或对照组合物产生的反应相比，反应的“减少”可具有统计学显著性，并且可以包括减少1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％，包括上述之间的所有整数。
相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括维持stathmin-2表达的量，并且包括防止stathmin-2的下调。“维持”所述的量通常是具有统计学显著性的量，并且可包括未降低的stathmin-2水平。优选地，stathmin-2的水平未降低，其中降低为比由无AON(不存在试剂)或对照化合物产生的stathmin-2的量低1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50倍或更低(例如,500,1000倍)(包括上述之间和1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8)。优选地，stathmin-2的表达没有降低到引起不利的相关生理或细胞反应的水平，导致如本文所述的疾病或病症(如ALS、FTLD、AD)的症状，如根据诊断领域的常规技术所测量的。在一个实施方案中，施用STMN2AON后，stathmin-2表达增加。在另一个实施方案中，施用STMN2 AON后，stathmin-2表达增加，然后防止任何进一步耗尽或防止由TDP43 AON引起的耗尽。
修饰的AON
在一些实施方案中，AON具有天然存在的核酸分子的化学组成，即AON不包括修饰或取代的碱基、糖或亚基间的键。
在一个优选的实施方案中，本发明的AON是非天然存在的核酸分子，或“寡核苷酸类似物”。例如，非天然存在的核酸可包括一个或多个非天然碱基、糖和/或亚基间的键，例如，相对于天然存在的核酸分子中发现的碱基、糖和/或键已被修饰或取代的碱基、糖和/或键。下面描述示例性修饰。在一些实施方案中，非天然存在的核酸包括多于一种类型的修饰，例如糖和碱基修饰、糖和键修饰、碱基和键修饰或碱基、糖和键修饰。例如，在一些实施方案中，AON含有非天然(例如，修饰或取代的)碱基。在一些实施方案中，AON含有非天然(例如，修饰或取代的)糖。在一些实施方案中，AON包含非天然(例如，修饰或取代的)亚基间的键。在一些实施方案中，AON含有多于一种类型的修饰或取代，例如非天然碱基和/或非天然糖，和/或非天然亚基间的键。
因此，包括非天然存在的AON，其具有(i)修饰的骨架结构，例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的骨架，和/或(ii)修饰的糖部分，例如吗啉代部分而不是核糖或脱氧核糖部分。寡核苷酸类似物支持能够通过Watson-Crick碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键的碱基，其中类似物骨架以允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(例如，单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式形成氢键的方式呈现碱基。优选的类似物是那些具有基本上不带电荷的含磷骨架的类似物。
产生AON的一种方法是2'羟基核糖位置的甲基化和硫代磷酸酯骨架的掺入产生表面上类似于RNA的分子，但对核酶降解更具抗性，尽管本发明领域的技术人员将意识到可用于本发明目的的其他形式的合适的骨架。
为了避免在与反义寡聚物形成双链体的过程中前体RNA的降解，可以对方法中使用的AON进行调整，以最大限度地减少或防止内源性RNase H的切割。可以根据已知技术制备不激活RNase H的反义分子(参见，例如，美国专利No.5,149,797)。这样的反义分子，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，仅包含空间上阻碍或阻止Rnase H与含有寡核苷酸作为其一个成员的双链体分子的结合的任何结构修饰，该结构修饰基本上不阻碍或破坏双链体形成。因为参与双链体形成的寡核苷酸部分与参与RNase H与其结合的那些部分实质上不同，所以可以使用许多不激活RNase H的反义分子。这种特性是高度优选的，因为用未甲基化的寡聚物的RNA处理中，无论是在细胞内还是在含有RNase H的粗提取物中，都会导致前mRNA：AON双链体的降解。在本方法中可以使用任何形式的能够旁路或不诱导这种降解的修饰的AON。核酶抗性可以通过修饰本发明的AON使其包含部分不饱和的脂族烃链和一个或多个极性或带电基团包括羧酸基团、酯基团和醇基团来实现。
与RNA形成双链体时，不被细胞Rnase H切割的AON的一个示例是2′-O-甲基衍生物。这种2'-O-甲基-寡核糖核苷酸在细胞环境和动物组织中是稳定的，它们与RNA的双链体具有比其核糖或脱氧核糖对应物更高的Tm值。或者，本发明的核酶抗性AON可以具有至少一个被氟化的最后的3'-末端核苷酸。又或者，本发明的核酶抗性AON具有连接在最后的3-末端核苷酸碱基中的至少两个之间的硫代磷酸酯键，优选地具有连接在最后的四个3'-末端核苷酸碱基之间的硫代磷酸酯键。
减少的RNA切割也可以用替代的寡核苷酸化学来实现(参见，例如，美国专利号5,149,797)。例如，AON可以选自包括以下的列表：氨基磷酸酯或磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)；PMO-X；PPMO；肽核酸(PNA)；锁定核酸(LNA)和衍生物，包括α-L-LNA、2'-氨基LNA、4'-甲基LNA和4'-O-甲基LNA；亚乙基桥核酸(ENA)及其衍生物；硫代磷酸酯寡聚物；三环DNA寡聚物(tcDNA)；三环硫代磷酸酯寡聚物；2′-O-甲基修饰的寡聚物(2′-Ome)；2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)；2'-氟，2'-氟阿拉伯糖基(FANA)；解锁核酸(UNA)；己糖醇核酸(HNA)；环己烯基核酸(CeNA)；2'-氨基(2'-NH2)；2'-O-亚乙基胺或上述作为混合物或间隔物的任何组合。PMO的主要益处是增加的安全性。它们的中性电荷使它们不易受蛋白质相互作用的影响，同时血小板活化和免疫活化降低。这也减少了核酶的降解。它们也已在DMD患者中安全使用超过5年。
一方面，本发明的修饰的AON可以缀合至肽。优选地，AON是PPMO，即PMO寡核苷酸通过酰胺、马来酰亚胺或点击化学(优选使用无铜点击化学例如通过环辛炔键)化学缀合到肽部分，并且包括合适的接头，例如可裂解的或pH-敏感的接头。肽部分可以通过3'或5'末端连接。最优选地，肽部分是能够提高AON穿透细胞并到达细胞核的能力的肽。例如，肽部分可以是富含精氨酸的肽、阳离子肽和/或选自衍生自生物多样性微生物基因组的肽文库的肽(Hoffman等人，Sci Rep,8,1,12538)。肽可以包含或不包含非天然氨基酸和/或化学修饰的氨基酸。
细胞穿透肽已添加到磷酰二胺吗啉代寡聚物，以增强细胞摄取和核定位。不同的细胞穿透肽已被证明会影响摄取效率和靶组织特异性，如Jearawiriyapaisarn等人(2008),Mol.Ther.,16(9),1624–1629所示。术语“细胞穿透肽”和“CPP”可互换使用，指阳离子细胞穿透肽，也称为转运肽、载体肽或肽转导结构域。如本文所示，这些肽具有在给定细胞培养群体的100％细胞内诱导细胞穿透的能力，并允许在全身施用后在体内多个组织内进行大分子易位。在局部递送至组织或器官后，肽还能够增强细胞摄取。
为了进一步提高递送效率，上述修饰的核苷酸通常与脂肪酸/脂质/胆固醇/氨基酸/碳水化合物/多糖/纳米颗粒等缀合到糖或核碱基部分。这些缀合的核苷酸衍生物也可用于构建AON以诱导外显子跳跃。反义寡聚物诱导的人TARDBP基因转录本的备选剪接可以使用硫代磷酸酯骨架上的寡核糖核苷酸、PNA、2'-Ome或2'-MOE修饰的碱基。由于作为阳离子脂质复合物递送时，2'-Ome AON在体外有效摄取，因而其用于寡聚物设计，但是这些化合物易受核酶降解，因此不被认为是体内或临床应用的理想选择。当替代化学用于产生本发明的AON时，本文提供的序列的尿嘧啶(U)可以被胸腺嘧啶(T)替代。
例如，此类反义分子可以是寡核苷酸，其中至少一个或所有核苷酸间桥连的磷酸残基是修饰的磷酸，例如膦酸甲酯、硫代磷酸甲酯、吗啉代磷酸酯、哌叠氮磷酸酯和氨基磷酸酯。例如，每隔一个核苷酸间桥接的磷酸残基可如所述进行修饰。在另一个非限制性示例中，此类反义分子是这样的分子，其中至少一个或所有核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，Ci-C4直链或支链、饱和或不饱和烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)。例如，每隔一个核苷酸可如所述进行修饰。
可用于本发明的AON的具体示例包括含有修饰骨架或非天然亚基间键的寡核苷酸。
具有修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的那些寡核苷酸。在其核苷间骨架中没有磷原子的修饰寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。
在其他反义分子中，核苷酸单元的糖和核苷间键，即骨架都被新基团取代。保持碱基单位与合适的核酸靶标化合物杂交。一种这样的寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)：已被证明具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架取代，特别是被氨基乙基甘氨酸骨架取代。核碱基被保留并直接或间接地结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。
修饰的寡核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。含有修饰或取代碱基的寡核苷酸包括这样的寡核苷酸，其中一个或多个核酸中最常见的嘌呤或嘧啶碱基被较不常见或非天然碱基取代。
嘌呤碱基包含与咪唑环融合的嘧啶环；腺嘌呤和鸟嘌呤是核酸中最常见的两种嘌呤碱基。这些可以被其他天然存在的嘌呤取代，包括但不限于N6-甲基腺嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。
嘧啶碱基包含六元嘧啶环；胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶是核酸中最常见的嘧啶碱基。这些可以被其他天然存在的嘧啶取代，包括但不限于5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、假尿嘧啶和4-硫尿嘧啶。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸含有胸腺嘧啶碱基以代替尿嘧啶。
其他修饰或取代的碱基包括但不限于2,6-二氨基嘌呤、乳清酸、胍丁胺、赖氨酸、2-硫代嘧啶(例如2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、G-钳及其衍生物、5-取代嘧啶(例如5-卤尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、Super T)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、SuperG、Super A和N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)、和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)、假尿嘧啶或其衍生物；和简并或通用碱基，如2,6-二氟甲苯或缺失碱基，如无碱基位点(例如，1-脱氧核糖、1,2-双脱氧核糖、1-脱氧-2-O-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环氧已被取代为氮(氮杂糖))。Super A、Super G和Super T的衍生物的示例可以在美国专利6,683,173(Epoch Biosciences)中找到。当掺入siRNA时，cPent-G、cPent-AP和Pr-AP显示可降低免疫刺激作用(PeacockH.等人J.Am.Chem.Soc.2011,133,9200)。假尿嘧啶是尿嘧啶的一种天然存在异构化形式，具有C-糖苷而不是尿苷中的常规N-糖苷。与含尿苷的mPvNA相比，含假尿苷的合成mRNA可能具有更高的安全性(参见WO 2009127230)。
某些修饰或取代的核碱基特别适用于增加本发明AON的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，甚至尤其是与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
在一些实施方案中，修饰或取代的核碱基可用于促进AON的纯化。例如，在某些实施方案中，AON可含有三个或更多个(例如，3、4、5、6个或更多个)连续的鸟嘌呤碱基。在某些AON中，一串三个或更多个连续的鸟嘌呤碱基会导致寡核苷酸聚集，从而使纯化复杂化。在这样的AON中，一个或多个连续的鸟嘌呤可以被肌苷取代。在一串三个或更多连续的鸟嘌呤碱基中用肌苷取代一个或多个鸟嘌呤可以减少AON聚集，从而促进纯化。
在一个实施方案中，AON的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接至寡核苷酸。这样的部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八胺或己氨基-羰基-氧胆固醇部分。
给定化合物中的所有位置不必均一地进行修饰，事实上，多于一种的上述修饰可以掺入单个化合物中，或者甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷中。本发明还包括作为嵌合化合物的AON。在本发明的上下文中，“嵌合”反义化合物或“嵌合物”是反义分子，特别是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，所述单体单元在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰以赋予对核酶降解的增加的抗性、增加的细胞摄取、以及用于增加对靶核酸的结合亲和力的额外区域。
根据本发明使用的反义分子可以通过熟知的固相合成方便且常规地制备。用于此类合成的设备由多家供应商出售，包括例如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。一种用于在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法描述于美国专利号4,458,066中。
在另一个非限制性示例中，此类AON是这样的分子，其中至少一个或所有核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，C1-C4直链或支链、饱和或不饱和烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)。例如，每隔一个核苷酸可如所述进行修饰。
虽然上述AON是本发明AON的优选形式，但本发明包括其他寡聚反义分子，包括但不限于如下所述的寡聚模拟物。
另一种优选的化学物质是磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)寡聚化合物，它不会被任何已知的核酶或蛋白酶降解。这些化合物不带电荷，当与RNA链结合时不会激活RNase H活性，并且已显示在体内施用后发挥持续的裂解因子结合调节作用(Summerton and Weller,Antisense Nucleic Acid Drug Development,1997；7,187-197)。优选地，本发明的AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
修饰的寡聚物还可以包含一个或多个取代的糖部分。寡聚物还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基特别适用于增加本发明寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，甚至尤其是与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。在一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘧啶碱基包括5-取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在一个实施方案中，5-取代的嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘌呤碱基包含N-2、N-6取代的嘌呤碱基。在一个实施方案中，N-2、N-6取代的嘌呤碱基是2，6-二氨基嘌呤。
在一个实施方案中，AON包括一个或多个单独的5-甲基胞嘧啶取代或与另一种修饰组合，例如2'-O-甲氧基乙基糖修饰。在又一个实施方案中，AON包括一个或多个单独的2,6-二氨基嘌呤取代，或与另一种修饰组合。
在一些实施方案中，AON化学连接到一个或多个部分，例如聚乙二醇部分，或缀合物，例如增强AON的活性、细胞分布或细胞摄取的富含精氨酸的细胞穿透肽。在一个示例性实施方案中，富含精氨酸的多肽在其N-末端或C-末端残基处共价偶联至反义化合物的3'或5'末端。此外，在示例性实施方案中，反义化合物由吗啉代亚基和将一个亚基的吗啉代氮连接到相邻亚基的5'环外碳的含磷亚基间键组成。
另一方面，本发明提供了掺入上述AON的表达载体，例如SEQ ID NO:1-66的AON。在一些实施方案中，表达载体是修饰的逆转录病毒或非逆转录病毒载体，例如腺相关病毒载体。
用于测量AON活性的测定法
可以根据本领域的常规技术测定AON及其变体的活性。例如，所调查的RNA和蛋白质的同种型形式和表达水平可以通过用于检测同种型和/或转录的核酸或蛋白质的表达的多种众所周知的方法中的任意来评估。此类方法的非限制性示例包括RNA同种型的RT-PCR，随后进行PCR产物的大小分离、核酸杂交方法例如Northern印迹和/或核酸阵列的使用；荧光原位杂交检测细胞内的RNA转录本；核酸扩增方法；检测蛋白质的免疫学方法；蛋白质纯化方法；和蛋白质功能或活性测定法。
可以通过从细胞、组织或生物体中制备RNA/cDNA(即转录的多核苷酸)，并通过将RNA/cDNA与参考多核苷酸杂交来评估RNA表达水平，参考多核苷酸是所测定核酸的互补物，或其片段。cDNA可以任选地在与互补多核苷酸杂交之前使用多种聚合酶链式反应或体外转录方法中的任意进行扩增；优选地，其不被扩增。还可以使用定量PCR来检测一种或多种转录本的表达以评估转录本的表达水平。
AON的制备方法
根据本发明使用的AON可以通过熟知的固相合成方便地制备。用于此类合成的设备由多家供应商出售，包括例如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。一种用于在修饰的固体支持物上合成寡聚物的方法描述于美国专利号4,458,066中。
可以额外地或替代地使用本领域已知的用于此类合成的任何其他方法。使用类似的技术制备寡聚物如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。在一个这样的自动化实施方案中，二乙基-亚磷酰胺被用作起始材料并且可以如Beaucage,等人(1981)TetrahedronLetters,22:1859-1862所描述的那样合成。
本发明的AON是体外合成的，并且不包括生物来源的反义组合物，或设计用于指导反义寡聚物的体内合成的遗传载体构建体。本发明的分子也可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、封装、缀合或以其他方式结合，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂，以帮助摄取、分布和/或吸收。
载体
还包括能够表达本发明的寡聚的、靶向TARDBP的序列的载体递送系统，例如表达包含如本文所述的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58中任一种或多种的多核苷酸序列的载体。
还包括能够表达本发明的寡聚的、靶向STMN2的序列的载体递送系统，例如表达包含如本文所述的SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66中任一种或多种的多核苷酸序列的载体。
“载体”或“核酸构建体”是指多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，其中可插入或克隆多核苷酸。载体优选包含一个或多个独特的限制性位点，并且能够在限定宿主细胞中自我复制，所述限定宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织、或能够与限定宿主的基因组整合，使得克隆的序列是可复制。
因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体，或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何装置。或者，载体可以是这样的载体，当其被引入宿主细胞时，其被整合到基因组中并与其整合到的染色体一起复制。
C.治疗方法
本发明的AON也可用作预防或治疗剂，其可用于治疗疾病的目的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了与TARDBP前mRNA中的选定靶标结合以降低如本文所述的TARDBP表达的治疗有效量的AON，其与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
TDP43在细胞质中产生并输入到细胞核中。TDP43在细胞质中的聚集会耗尽可用于核运输的TDP43，这可能导致引起TARDBP mRNA上调的自我调节，从而导致TDP43增加。不受理论的束缚，通过施用本发明的AON降低TARDBP mRNA的表达，可导致聚集体中TDP43的减少，因此改善TDP43的核运输，预期更多的TDP43可用于运输而不是在聚集体中积累。
“有效量”或“治疗有效量”是指作为单剂量或作为一系列剂量的一部分施用给哺乳动物受试者的治疗化合物(例如反义寡聚物)的量，其有效产生期望的治疗效果。
因此，本发明提供了一种药物、预防或治疗组合物，用于治疗、预防或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响，该组合物包含：
a)如本文所述的一种或多种AON，和
b)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
优选地，所述与TDP43蛋白质病相关的疾病是ALS、FTLD或AD。
还提供了一种用于治疗、预防或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用有效量的一种或多种AON或包含一种或多种本文所述的AON的药物组合物。
本发明提供了一种用于治疗、预防或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用本文所述的有效量的一种或多种AON或包含一种或多种AON的药物组合物。
还提供了一种用于治疗、预防或改善ALS的影响的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用本文所述的有效量的一种或多种AON或包含一种或多种AON的药物组合物。
本发明的方法可以与用于治疗、预防或减缓与TDP43蛋白质病相关的疾病及其症状的进展的其他治疗组合施用。其他治疗可包括针对与TDP43蛋白质病相关疾病相关的其他靶标的AON。例如，其他治疗可以包括针对SOD1的AON。
另一方面，遗传或其他生物标志物可用于鉴定最有可能对通过本发明的AON抑制TDP43反应良好的患者。与ALS疾病风险相关的遗传结构变异已在ALS基因和周围基因区域中得到鉴定。这些变异可用作遗传生物标志物以鉴定可能对本发明的方法反应的患者。非遗传生物标志物也可用于鉴定可能对本发明的方法反应的患者。还发现截短的STMN2是FTD中TDP43病理学的标志物(Prudencio等人J Clin Invest.2020 130(11):6080-6092)。优选地，生物标志物是截短的STMN2形式。
本发明提供了一种用于在通过生物标志物鉴定的受试者中治疗、预防ALS、FTLD或AD或改善ALS、FTLD或AD的影响的方法，该方法包括以下步骤：
a)测试受试者是否存在与ALS患者可能对TDP43抑制反应相关的生物标志物；和
b)如果发现受试者表达生物标志物，则向所述受试者施用如本文所述的有效量的一种或多种AON或包含一种或多种AON的药物组合物。
本文还提供了如本文所述的纯化和分离的AON在治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响中的用途。
本文还提供了如本文所述的纯化和分离的AON在治疗、预防ALS、FTLD或AD或改善ALS、FTLD或AD的影响中的用途。
优选地，用于本发明的AON选自表1或2中提供的AON列表，或更优选地选自SEQ IDNO:12、16、24或25。
本发明还提供了一种治疗方法，包括以下组合：(1)设计用于减少TDP43表达的AON(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38至58)；和(2)设计用于防止随后的stathmin-2下调的AON(SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66)，以减少细胞质TDP43过表达的影响，同时防止由stathmin-2耗尽引起的神经元易损性。在一个实施方案中，本发明试图提供一种方法，用于改善患有与TDP43蛋白质病相关疾病的受试者的TDP43蛋白质病，同时维持正常的stathmin-2生理水平或减少stathmin-2下调。
优选地，设计用于防止随后的stathmin-2下调的AON选自SEQ ID NO:29至SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:62至66的列表，或更优选地选自SEQ ID NO:33、35、36和37。
组合物可包含约1nM至1000μM的本发明所需的反义寡聚物中的每一种。优选地，该组合物可包含约1μM至500μM、10μM至500μM、50μM至750μM、10μM至500μM、1μM至100μM、1μM至50μM，优选25μM至100μM的本发明反义寡聚物中的每一种。该组合物还可以优选包含约1nM至500nM、10nM至500nM、50nM至750nM、10nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM，最优选50nM至100nM本发明的反义寡聚物中的每一种。
该组合物可包含约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM或1000nM的本发明所需的反义寡聚物中的每一种。
本发明进一步提供了一种或多种适合于以适合递送至受试者的形式帮助预防性或治疗性治疗、预防或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病或病理的症状的AON。
短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物，其在生理学上是可耐受的并且当施用于受试者时通常不会产生过敏或类似的不良反应，例如胃部不适等。术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选使用水或盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体描述于Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA,(1990)。
包含一种或多种AON的药物组合物可以一系列的治疗方案施用于受试者。例如，药物组合物可以每小时一次、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每六个月一次、每年一次施用。合适的方案可由本领域技术人员基于待治疗病症的性质来确定。
D.药物制备
在一个实施方案中，本发明提供结合TARDBP RNA中的选定靶标的AON在制备用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物中的用途。因此，提供了本文所述的一种或多种AON用于制备治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物中的用途。优选地，该疾病是ALS、FTLD、FTD或AD。
本发明提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关疾病相关疾病的影响的药物中的用途。
本发明还提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防ALS、FTLD或AD或改善ALS、FTLD或AD的影响的药物中的用途。
还提供了一种或多种本文所述的AON用于制备在受试者中治疗、预防与TDP43蛋白质病相关疾病或改善与TDP43蛋白质病相关疾病的影响的药物中的用途，所述受试者表达与患者可能对TDP43抑制反应相关的生物标志物。
优选地，用于制备药物的AON选自表1或2中提供的AON的列表或更优选地选自SEQID NO:12、16、24或25。
在进一步的实施方案中，本发明还提供结合STMN2 RNA中的选定靶标的AON在制备维持stathmin-2的正常生理水平或减少stathmin-2的下调的药物中的用途。优选地，所用的AON选自表1或2中提供的AON的列表，或更优选地选自SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQID NO:62至66。最优选地，所述AON选自SEQ ID NO:33、35、36和37。
E.药物组合物
在本发明的一种形式中，提供了药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的AON以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物包括具有各种缓冲液含量(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、以及添加剂，例如洗涤剂和增溶剂(例如，吐温80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(如乳糖、甘露醇)。该物质可以掺入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体中。也可以使用透明质酸。此类组合物可影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如，Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.(1990,MackPublishing Co.,Easton,PA 18042)，第1435-1712页，其通过引用并入本文。组合物可以以液体形式制备，或者可以以干粉形式制备，例如冻干形式。
应当理解，根据本发明提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式施用。优选地，用于施用的药物组合物通过注射、口服、局部或通过肺或鼻途径施用。AON更优选通过静脉内、鞘内、动脉内、腹膜内、肌肉内或皮下施用途径递送。适当的途径可由本领域技术人员根据接受治疗的受试者的情况确定。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可以引入AON的一些非限制性部位。可采用直接CNS递送，例如，脑室内或鞘内施用可用作施用途径。
用于局部施用的制剂包括以下那些：其中本公开的寡聚物与局部递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合。脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。对于局部或其他施用，本公开的寡聚物可被封装在脂质体中或可与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体。或者，寡聚物可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐以及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860和/或1999年5月20日提交的美国专利申请系列号09/315,298中。
在某些实施方案中，本公开的AON可以通过透皮方法递送(例如，通过将AON掺入例如乳剂中，并且这样的AON任选地包装到脂质体中)。这种透皮和乳剂/脂质体介导的递送方法在本领域中被描述用于递送AON，例如，在美国专利号6,965,025中。
本文所述的AON也可以通过可植入装置递送。这种装置的设计是本领域公认的过程，例如，使用合成的植入物设计，描述于例如美国专利号6,969,400中。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒、微粒、纳米颗粒、悬浮液或水或非水介质中的溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是理想的。口服制剂是那些制剂，其中本公开的寡聚物与一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂一起施用。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。胆汁酸/盐和脂肪酸以及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。在一些实施方案中，本公开提供渗透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本公开的寡聚物可以以颗粒形式口服递送，包括喷雾干燥颗粒或复合以形成微米或纳米颗粒。寡聚物复合剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。1999年5月20日提交的US6,887,906、09/315,298和/或US20030027780中详细描述了寡聚物的口服制剂及其制备。
用于肠胃外、鞘内或脑室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
可以通过先前公布的方法实现治疗有用量的AON的递送。例如，AON的细胞内递送可以通过包含AON和有效量的嵌段共聚物的混合物的组合物进行。美国专利申请US20040248833中描述了该方法的示例。将AON递送至细胞核的其他方法描述于Mann CJ等人(2001)Proc,Natl.Acad.Science,98(1)42-47,和Gebski等人(2003)Human MolecularGenetics,12(15):1801-1811。US6,806,084中描述了一种通过作为裸DNA或与脂质载体复合的表达载体将核酸分子引入细胞的方法。
在某些实施方案中，本发明的AON和包含其的治疗组合物可以通过透皮方法递送(例如，通过将AON掺入例如乳剂中，并且这样的AON任选地包装到脂质体中)。这种透皮和乳剂/脂质体介导的递送方法在本领域中被描述用于递送AON，例如，在美国专利号6,965,025中。
可能需要在胶体分散系统中递送AON。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体或脂质体制剂。这些胶体分散系统可用于制备治疗性药物组合物。
脂质体是人工膜囊泡，可用作体外和体内的递送载体。这些制剂可具有净阳离子、阴离子或中性电荷特性，并且具有适用于体外、体内和离体递送方法的特性。已经表明，大的单层囊泡可以封装相当大百分比的含有大分子的水性缓冲液。RNA和DNA可以封装在水性内部，并以生物活性形式递送到细胞(Fraley等人，1981,Trends Biochem.Sci.,6,77)。
为了使脂质体成为有效的基因转移载体，应具备以下特性：(1)在不损害其生物活性的情况下高效封装感兴趣的AON；(2)与非靶细胞相比优先和大量结合靶细胞；(3)将囊泡的水性内容物高效地递送至靶细胞的细胞质；以及(4)准确有效地表达遗传信息(Mannino等人，1988Biotechniques,6,682)。脂质体的组成通常是磷脂的组合，特别是高相变温度的磷脂，通常与类固醇，尤其是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，据信其与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。对pH敏感或带负电荷的脂质体被认为会捕获DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体均已用于将DNA递送至细胞。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如本文所用，该术语是指包含一种或多种专门的脂质的脂质体，当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类专门的脂质的脂质体，导致增加的循环寿命。空间稳定的脂质体的示例是那些脂质体，其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂或用一种或多种亲水聚合物衍生而成，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂质体及其用途在US 6,287,860中进一步描述。
可以使用本领域公认的技术(例如，转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒和病毒、非病毒载体以及本领域已知的其他方法)将AON引入细胞中。选择的递送方法将至少取决于待处理的细胞和细胞的位置，并且对于技术人员来说是显而易见的。例如，可以通过表面具有引导脂质体的特定标志物的脂质体、直接注射到含有靶细胞的组织中、特异性受体介导的摄取等来实现定位。
如本领域已知的，可以使用以下方法递送AON，例如涉及脂质体介导的摄取、脂质缀合物、聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的内吞作用以及其他非内吞的递送模式，例如显微注射、透化(例如，链球菌溶血素-O透化、阴离子肽透化)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非内吞递送方法(参见Dokka和Rojanasakul,Advanced DrugDelivery Reviews44,35-49，通过引用整体并入)。
AON也可以与其他药学上可接受的载体或稀释剂组合以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。该组合物可以配制用于肠胃外、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、口服或透皮施用。
所描述的施用途径仅旨在作为指导，因为熟练的从业者将能够容易地确定最佳施用途径和任何特定动物和病症的任何剂量。
已尝试在体外和体内将功能性新遗传物质引入细胞的多种方法(Friedmann(1989)Science,244,1275-1280)。这些方法包括将待表达的基因整合到修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)同上；Rosenberg(1991)Cancer Research 51(18),suppl.:5074S-5079S)；整合到非逆转录病毒载体中(Rosenfeld等人(1992)Cell,68,143-155；Rosenfeld等人(1991)Science,252,431-434)；或通过脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989),同上；Brigham等人(1989)Am.J.Med.Sci.,298,278-281；Nabel等人(1990)Science,249,1285-1288；Hazinski,等人(1991)Am.J.Resp.CellMolec.Biol.,4:206-209；和Wang and Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),84,7851-7855)；偶联到配体特异性、基于阳离子的运输系统(Wu and Wu(1988)J.Biol.Chem.,263,14621-14624)，或使用裸DNA表达载体(Nabel等人(1990),同上)；Wolff等人(1990)Science,247,1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)同上)；Rosenfeld等人(1991)同上；Brigham等人(1989)同上；Nabel(1990)同上；和Hazinski等人(1991)同上)。The Brigham等人，group((1989)Am.J.Med.Sci.298,278-281和Clinical Research(1991)39(摘要))已经报道了在静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物后仅在小鼠肺的体内转染。人基因治疗方法的综述性文章的示例是：Anderson,(1992)Science 256,808-813；Barteau等人(2008),Curr Gene Ther.,8(5),313-23；Mueller等人(2008)；Clin Rev Allergy Immunol.,35(3),164-78；Li等人(2006)Gene Ther.,13(18),1313-9；Simoes等人(2005)Expert Opin Drug Deliv.,2(2),237-54。
本发明的AON包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其他化合物，在对动物(包括人)施用后，其能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残余物。因此，作为示例，本公开还涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等价物。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即保留母体化合物所需的生物活性并且不赋予不希望其有的毒理学作用的盐。对于寡聚物，优选的药学上可接受的盐的示例包括但不限于：(a)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸，棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(d)由元素阴离子如氯、溴和碘形成的盐。本发明的药物组合物可以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗，以及待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼部和粘膜，以及直肠递送)、肺部的，例如通过吸入或粉末吹入或气雾剂(包括通过雾化器，气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用。具有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的寡聚物被认为特别适用于口服施用。优选地，AON通过皮下或静脉内途径递送。
可以根据制药工业中熟知的常规技术制备可以方便地以单位剂量形式存在的本发明的药物制剂。这样的技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂组合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地组合，然后，如果需要，将产品成型来制备制剂。
以下实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。包括这些实施例仅仅是为了举例说明本发明的目的。不应将其理解为对上述本发明的广泛概括、公开内容或描述的限制。无需进一步详述，相信本领域技术人员可以使用前述描述来最大限度地利用本发明。在前面和下面的实施例中，所有的温度都是以摄氏度为单位的；并且，除非另有说明，所有份数和百分比均按重量计。
实施例
实施例
实施例1–原始AON的设计
靶向外显子2和外显子3的剪接转换AON被设计用于结合外显子内的外显子剪接位点和剪接增强子位点，如通过在线剪接预测工具所预测的那样。跳过这些外显子中的任何一个都将导致转录本阅读框移位，从而产生下一个外显子中的提前终止密码子(TAA)。已知具有提前终止密码子的转录本会通过无义介导的衰变而衰变，这是一种在所有真核细胞中运行的RNA监视机制。
AON的序列、基因坐标和SEQ ID列于表1和表2中。AON 1至66(如图所示)对应于SEQID No：1至66。
AON具有2′-O-甲基糖修饰和硫代磷酸酯(PS)骨架化学。AON命名法基于Mann等人(The Journal of Gene Medicine,2002.4(6):p.644-654)描述的命名法，其中描述了物种、基因、外显子数、靶向的受体或供体和退火坐标，其中“-”表示内含子位置，“+”表示从剪接位点的外显子位置，如本文所述。图2显示了每个AON在TARDBP上的结合位置的示意图。
具有2'-O-甲基修饰和PS骨架的AON购自TriLink Biotechnologies,Inc(美国加利福尼亚州圣地亚哥)或ChemGenes Corporation(美国马萨诸塞州威尔明顿)。具有磷酰二胺骨架(PMO)的AON购自Genetools LLC(Philomath，OR，美国)。
实施例2–使用转录本分析进行AON筛选
在转染2′-O-甲基AON后，对TARDBP转录本进行了RT-PCR分析。将AON转染后的TARDBP敲低或外显子跳跃水平与对照处理和未处理样品的水平进行比较。
对照序列包括靶向无关基因SMN的AON，ctrl AON 1(SEQ ID NO:26,CACCUUCCUUCUUUUUGAUU)，以及阴性对照寡核苷酸购自GeneTools：ctrl AON 2(SEQ ID NO:27；GGAUGUCCUGAGUCUAGACCCUCCG)和ctrl AON 3(SEQ ID NO:28,CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA)。
材料和方法
成纤维细胞的转染
正常人真皮成纤维细胞根据已建立的技术增殖，将15,000个细胞接种到含10％FBSDMEM的24孔板中，并在转染前于37℃孵育24小时。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000(每ml转染体积3μl)(Life Technologies，澳大利亚墨尔本)转染所有2'-O-甲基PS-AO，并将AO转染的细胞孵育24小时。
转录本分析
根据制造商的说明，使用MagMAX-96总RNA分离试剂盒提取RNA，包括DNase处理(Life Technologies)。根据制造商的说明，使用带有Platinum Taq聚合酶(LifeTechnologies)的One-step Superscript III RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。跨越TARDBP外显子1至6扩增产物(Fwd:CATTTTGTGGGAGCGAAGCG(SEQ ID NO:67),Rev:ACGCACCAAAGTTCATCCCA(SEQ ID NO:68))，其中温度模式，55℃30分钟，94℃ 2分钟，然后是24个循环的94℃ 40秒，55℃ 30秒和68℃1分30秒。在适用的情况下，将结果相对于使用以下引物进行的跨越外显子2至3扩增的无关管家对照基因(TBP)的转录本水平进行归一化：(Fwd:AGCGCAAGGGTTTCTGGTTT(SEQ ID NO:69),Rev:GGAGTCATGGGGGAGGGATA(SEQ ID NO:70))。
PCR产物在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中在2％琼脂糖凝胶上分离，在凝胶记录系统(Vilber Lourmat，Eberhardzell，德国)上捕获图像。使用Image J进行光密度分析。外显子跳跃通过条带重量进行定量，以估计全长TARDBP和外显子跳跃产物的比率。必要时通过条带纯化和DNA测序确认产物身份。外显子跳跃的效率是通过计算与RT-PCR产生的总产物相比具有跳跃的外显子的转录本的百分比来确定的。全长转录本敲低的百分比通过相对于管家基因进行归一化并将全长转录本与对照处理或未处理的样品进行比较来确定。
首先在25和50nM下测试靶向外显子2的AO(AON 1至6，SEQ ID NOID：1至6)。没有看到外显子2跳跃的证据，但是在AON 1至6(SEQ ID NO:1至6)的每个中检测到全长转录本的敲低/减少，其中AON 3(SEQ ID NO:3)产生最大的敲低(图3a)。
首先在200和50nM下测试靶向外显子3的AON(AON 7至11，SEQ ID NO ID：7至11)。所有测试的序列都能够诱导外显子3跳跃(图4a)。AON 10(SEQ ID NO:10)在以50nM处理时最有效，81％或转录本显示外显子3跳跃。然后在一系列浓度(50、10和1nM)下测试产生最大外显子跳跃的序列(AON8、9和10，SEQ ID NO:8,9和10)，低至1nM可见外显子跳跃(图4b)。
实施例3–AON的优化
在最初的AON筛选之后，在混合物(共转染2个AON，每个50nM)中或作为单个AON测试了靶向TARDBP外显子2的AON，没有组合显示比单独的AON3(SEQ ID NO 3)更大的敲低(图3b)。
筛选后，通过微步移(将AON序列向上或向下游移动几个碱基以确定最佳靶位点，同时仍保持寡聚物长度)优化靶向TARDBP外显子2和3的AON，并且将转染后外显子跳跃水平与原始AON序列、对照AON和未处理样品相比。
靶向外显子2的AON 3(SEQ ID NO:3)向上游微步移5个碱基、以及向下游微步移5个和10个碱基，产生AON 12、13和14(SEQ ID 12、13和14)，并在50和100nM浓度进行测试，其中AON 12(SEQ ID NO 12)产生比AON 3(SEQ ID NO:3)更大的TARDBP转录本敲低(图3c)。
靶向外显子3的AON(AON 8、9和10，SEQ ID No 8、9和10)向上游和下游各微步移5个碱基(AON 15至20，SEQ ID No 15至20)，并在几个实验中以浓度范围进行了测试以确定了最主要的分子，AON 16(SEQ ID NO 16)显示最高的效率(图4c和4d)。
实施例4–靶向外显子2的AON的全长转录本敲低机制
由于没有外显子2跳跃，因此进一步探索了靶向外显子2的AON的作用机制。看到的结果(转录本敲低但没有跳跃)可能是由各种原因造成的。在某些情况下，发生外显子跳跃，但由此产生的转录本会迅速或有效地降解，以至于在及时查看一个快照时很难检测到。为了检查外显子跳跃在较早的时间点是否明显，对以50nM的AON浓度转染的细胞进行了时间进程，在转染后4、8、12和24小时收集细胞。在较早的时间点没有发现外显子跳跃。转染后4小时可以看到敲低(图5a)。
另一种可能性是AON导致内含子保留在转录本中。如果PCR中的延伸时间不足长到允许包含内含子的转录本被扩增，这可能看起来像凝胶上的敲低。设计引物以寻找内含子保留，但保留的内含子水平在处理、未处理和对照处理的细胞提取物中是一致的(图5b)。
为了进一步探究敲低的机制，使用了多个策略性放置的引物组并分析了转录本水平。当结合位点位于正向和反向引物之间时可以看到敲低，但当两个引物都位于结合位点之前或之后时则看不到，这表明切割可能发生在AON结合位点附近(图5c)。
实施例5–靶向PA1的AON设计和筛选
AON被设计为通过阻断聚腺苷酸化信号在空间上抑制PA1的使用。这可能导致翻译的转录本(I)的减少和未翻译的转录本(II、III、IV)的增加。
最初使用2'-O-甲基PS化学合成两个20和25个碱基长的AON，以靶向TARDBP的PA1(AON 21、22，SEQ ID NO：21和22)。如上文方法所述，在人成纤维细胞中以浓度范围(200、50、12.5和3nM)测试这些AON与主要的外显子跳跃AON(SEQ ID NO 16)。观察到转录本的一些敲低，但是敲低水平低于AON 16(SEQ ID NO:16)(图6a)。
对以50和25nM浓度转染的细胞进行时间进程实验，并在转染后12、24、48和72小时收集RNA，以查看敲低是否在更早或更晚的时间点得到提高。尽管观察到敲低，但其在所有时间点上都较低，并且靶向PA1的AON的敲低低于主要外显子3跳跃AON(图6b)。设计了另外一个长度为30个碱基的AON(AON 23，SEQ ID NO：23)，并在100、50和25nM的最终实验中进行了测试。虽然在本实验中观察到所有3个靶向PA1的AO的敲低水平更高，但额外的长度不会导致敲低的增加，并且在较高浓度下观察到管家基因的一些敲低(图6c)。
实施例6–SEQ ID NO:12和16作为PMO的转录本和蛋白质分析
合成了靶向外显子2的AON 12(SEQ ID NO：12)和靶向外显子3的AON 16(SEQ IDNO:16)，并和PMO(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)进行了评估。通过核转染将PMO递送到正常成纤维细胞中，然后如上所述使用RT-PCR进行评估。
使用带有Nucleofection P2试剂盒的Nucleofection X装置，使用CA-137程序(Lonza，Melbourne，Australia)通过核转染进行PMO的递送。PMO最初在补充有5％ FBS的DMEM的比色皿中以150μM转染，孵育1、3和5天(RNA分析)以及孵育3和5天(蛋白质分析)。
TARDBP转录本的RT-PCR分析如图7a所示。PMO AON 24在测试的任何时间点都不会导致TARDBP RNA的敲低或外显子2跳跃。PMO AON 25确实诱导了外显子3的跳跃和转录本敲低，这在所有3个时间点都可见，并且在转染后24小时最强。如下所述，还通过蛋白质印迹测量蛋白质敲低。
材料和方法——蛋白质印迹
用125mM Tris/HCl pH 6.8、15％ SDS、10％甘油、1.25μMPMSF(Sigma-Aldrich，NSW，澳大利亚)1x蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)、0.004％溴酚蓝和2.5mM二硫苏糖醇制备细胞裂解物，然后超声处理6次(1秒脉冲)。样品在94℃下加热5分钟，在冰上冷却并在加载到凝胶上之前以14,000x g离心2分钟。
通过Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Life Technologies)测量约为15μg的总蛋白质，将每个样品以及分子量标记(Magic Mark)(BioRad)加载到NuPAGE Novex 4-12％ BIS/Tris凝胶(Life Technologies)上，并在200V下分离55分钟。在350mA下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1小时。在室温下封闭1小时后，将膜在含有TDP43一抗(1:1,000，Proteintech)和β-肌动蛋白一抗(1:50,000，Sigma-Aldrich)、含有5％脱脂奶粉的1x TBST中在4℃下过夜孵育。使用抗兔HRP二抗(1:10,000,Dako)和用于TDP43的Immobilon HRP化学发光底物(Merck)进行免疫检测。β-肌动蛋白的免疫检测使用Western Breeze化学发光免疫检测试剂盒(Life Technologies)进行，CDP Star化学发光底物用于检测。使用Fusion软件在Vilber Lourmat Fusion FX系统上捕获蛋白质印迹图像，并使用Image J软件进行图像分析。
结果
靶向外显子2的PMO(SEQ ID NO:24)没有引起任何TDP43蛋白的敲低。靶向外显子3的PMO(SEQ ID NO:25)确实在第3天和第5天的时间点导致TDP43蛋白敲低，并且在转染后第3天敲低最大，当相对于管家蛋白(β-肌动蛋白)归一化时，该蛋白质被敲低至对照细胞中所见水平的40％(图7b)。
在3个以上独立的实验中使用核转染在100和50μM下测试了SEQ ID NO:25，如上所述在第1、3和5天收集RNA，在第3天收集蛋白质。在两种浓度的所有3个时间点都观察到外显子3跳跃和敲低，但在转染后24小时、在100μM时最高(代表性凝胶图像图8a)。外显子3跳跃通过Sanger测序得到证实(图8c)。与用不存在AON(Zap)进行核转染的对照细胞相比，在100μM转染后3天，TDP43水平被敲低74％(p值0.012)，在50μM下被敲低62％(p值0.027)(图8b和8d)。
实施例7–开发细胞模型以测试STMN2上调
为了评估靶向STMN2隐藏外显子的AON增加stathmin-2蛋白水平的能力，需要一种细胞模型，其中stathmin-2减少。为了模拟在ALS患者中观察到的神经元TDP43耗尽和stathmin-2下调，使用NeonTM转染系统(Life Technologies)将靶向TARDBP外显子3的PMO(SEQ ID NO:25)(其能够通过外显子3跳跃诱导TDP43敲低)转染到SH-SY5Y细胞中。
用100或50μM的靶向TARDBP的PMO(SEQ ID NO:25)或100μM的从GeneTools购买的阴性对照寡核苷酸(AON ID 12)转染SH-SY5Y细胞。所有浓度均指电穿孔过程中尖端的浓度。对照细胞也在没有任何AO存在的情况下进行电穿孔(Zap处理的细胞)。孵育1天和3天后收集细胞用于分析。从细胞中提取RNA并通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行分析。
转录本分析
根据制造商的说明，使用MagMAX-96总RNA分离试剂盒提取RNA，包括DNase处理(Life Technologies)。根据制造商的说明，使用带有Platinum Taq聚合酶(LifeTechnologies)的One-step Superscript III RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。跨越TARDBP外显子1至6扩增产物，以测量与对照和未处理细胞相比的TARDBP水平/敲低(Fwd:CATTTTGTGGGAGCGAAGCG(SEQ ID NO:67),Rev:ACGCACCAAAGTTCATCCCA(SEQ ID NO:68)),其中温度模式，55℃ 30分钟，94℃ 2分钟，然后是24个循环的94℃ 40秒、55℃ 30秒和68℃ 1分30秒。STMN2水平是通过扩增跨越外显子1至3(Fwd:TGTACTCCAGCACCATTGGC(SEQ ID NO:71),Rev:AAAGTTCGTGGGGCTTCTGAG(SEQ ID NO:72))或1至5(Fwd:TGTACTCCAGCACCATTGGC(SEQ ID NO:71)Rev:TGCTTCAGCCAGACAGTTCA(SEQ ID NO:73))测量的，其中温度模式，55℃30分钟，94℃ 2分钟，然后是28个循环(外显子1至3)或26个循环(外显子1至5)的94℃ 30秒，60℃ 20秒和68℃ 1分15秒。由于含有隐藏外显子的转录本在隐藏外显子内的位点被聚腺苷酸化，因此通过从外显子1至隐藏外显子序列末端位置进行扩增来检测含有隐藏外显子的STMN2转录本(Fwd:TGTACTCCAGCACCATTGGC(SEQ ID NO:71)Rev:GTCAACTGTGCCACAAGCC(SEQ ID NO:74))，其中温度模式，55℃30分钟，94℃ 2分钟，然后是29个循环的94℃ 30秒，60℃ 20秒和68℃ 1分钟。包含隐藏外显子的转录本序列通过Sanger测序进行确认(图9b)。在适用的情况下，将结果相对于使用以下引物进行的跨越外显子2至3扩增的无关管家对照基因(TBP)的转录本水平进行归一化：(Fwd:AGCGCAAGGGTTTCTGGTTT(SEQ ID NO:69),Rev:GGAGTCATGGGGGAGGGATA(SEQ ID NO:70)。
PCR产物在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中在2％琼脂糖凝胶上分离，在凝胶记录系统(Vilber Lourmat，Eberhardzell，德国)上捕获图像。使用Image J进行光密度分析。TARDBP的外显子跳跃通过条带重量进行定量，以估计全长TARDBP和外显子跳跃产物的比率。必要时通过条带纯化和DNA测序确认产物身份。通过相对于管家基因进行归一化并与对照处理或未处理的样品进行比较来确定STMN2转录本水平。
在1和3时间点上均看到TARDBP外显子3跳跃和转录本敲低，但在转染后1天最强。当用TARDBP AON处理孵育3天后，与对照处理细胞相比，包含非隐藏外显子的STMN2转录本被敲低了80％。这伴随着含有隐藏外显子的STMN2转录本数量的大幅增加，在第3天的时间点最强。在任何对照中没有STMN2敲低，也没有检测到隐藏外显子。(图9a)。
实施例8–靶向STMN2的AON的设计
设计AON以靶向STMN2内含子1中的隐藏外显子内的位点。选择抑制剪接增强子结合的位点，如使用靶向三个增强子位点热点的AON的在线剪接预测工具所预测的那样。减少剪接增强子的结合降低了剪接体对外显子的识别，导致隐藏外显子被排除在成熟的mRNA转录本之外。这将导致因不包含隐藏外显子的成熟STMN2转录本被翻译，产生的stathmin-2水平增加。AON ID、序列、基因坐标和化学见表1。AON结合和增强子位点可以参见图10。具有2'-O-甲基修饰和硫代磷酸酯骨架的AON购自ChemGenes Corporation(Wilmington,MA,USA)。具有磷酰二胺骨架(PMO)的AON购自Genetools LLC(Philomath，OR，美国)。
实施例 9—靶向STMN2的2′-O-甲基AON的测试
使用Neon转染系统，用100μM的TARDBP外显子3跳跃PMO(SEQ ID NO:25)单独或与5或10μM靶向STMN2隐藏外显子的2′-O-甲基-PS AON(SEQ IDs 29,30或31)之一组合、或用100μM对照寡聚物(AON ID 28)转染SH-SH5Y细胞。所有浓度均指电穿孔过程中尖端的浓度。对照细胞也在不存在AO的情况下进行电穿孔(Zap)。孵育1天和3天后收集细胞用于RNA提取和分析。从细胞中提取RNA，并通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳以及光密度分析进行分析。
与对照相比，在用TARDBP外显子3跳跃PMO(SEQ ID NO:25)处理的细胞中，一天后TARDBP被敲低了大约70％。在对照细胞中检测到痕量水平的含有隐藏外显子的STMN2转录本，但在仅用SEQ ID NO:25处理的细胞中检测到大量。这种隐藏外显子表达在与靶向STMN2隐藏外显子的AON共转染的细胞中较低。以10μM转染1天后，与仅用SEQ ID NO:25处理的细胞相比，SEQ ID NO:29处理的细胞中水平降低到29％，SEQ ID NO:30处理的细胞中水平降低到15％，并且SEQ ID NO:31处理的细胞中水平降低到76％。在仅用SEQ ID NO:25处理的细胞中，全长STMN2转录本水平在第1天已经降低至未处理对照细胞中所见水平的46％，3天后降至14％。在与靶向STMN2的AO共转染的细胞中，全长STMN2水平仍然较高，在第3天时看到最大差异。在用AON 30(10μM)转染的细胞中，3天后全长STMN2水平是仅用SEQ ID NO:25处理的细胞中水平的3.7倍。用SEQ ID NO:29(10μM)处理的细胞具有3倍的增加，而那些用AON 31(10μM)处理的细胞具有1.8倍的增加。对于SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，观察到剂量反应性，其中以5μM处理的细胞表达略少的全长STMN2转录本。对于AON 31，两种浓度下的全长STMN2水平相似。重复该实验，结果相似。在图11a中可以看到代表性的凝胶图像，在图11b中可以看到两个实验的光密度分析。
实施例10–STMN2 AON序列的优化
通过将AON序列向SEQ ID NO:29(SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33)和SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:34和35)的上游和下游移动5个碱基来优化STMN2 AON序列。使用前面描述的方法在两个实验中测试这些序列和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。在靶向隐藏外显子的第一增强子位点热点的3个AON中，在两个实验中与仅转染SEQ ID NO:25的细胞相比，SEQ IDNO:33产生最大的隐藏外显子抑制和最大的全长STMN2表达的增加，其中STMN2表达的增加高达4.5倍。对于靶向隐藏外显子的第二增强子位点热点的AON，SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:35产生了类似的结果，其中在以10μM转染时全长STMN2水平是仅用SEQ ID NO:25处理的细胞的3到5倍。在两个实验中，5μM SEQ ID No:35共处理的细胞比SEQ ID NO:30共处理的细胞具有更高水平的全长STMN2。来自1个实验的代表性凝胶图像可以在图12a中看到，来自2个实验的光密度分析可以在图12b中看到。选择SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35作为PMO合成(SEQ ID 36和37)，用于进一步测试和蛋白质分析。
实施例11–靶向TARDBP和STMN2的PMO共转染后的转录本和蛋白质分析
使用与上述相同的模型和方法在SH-SY5Y细胞中测试PMO SEQ ID NO:36和37。用100μM的TARDBP外显子3跳跃PMO(SEQ ID NO:25)或100μM SEQ ID NO:25和浓度范围从25μM降低到1μM(电穿孔时neon尖端的浓度)靶向STMN2的SEQ ID 36或37的组合转染细胞，在转染后1、3和5天收集细胞用于转录本分析。实验进行了3次。转录本分析表明，在仅用TARDBP外显子3跳跃PMO(SEQ ID NO:25)处理的细胞中显著上调的隐藏外显子的表达，被SEQ ID36和37以看到的明显剂量反应所抑制。图13显示了RNA转录本分析的代表性凝胶图像。3个实验的光密度分析表明，在25μM的转染浓度下，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37在测试的所有时间点，将隐藏外显子的表达抑制到等于或低于在对照细胞(未处理、Zap和对照AON处理)中观察到的水平。以5μM浓度转染后五天，SEQ ID No:37将隐藏外显子的表达抑制到在没有添加靶向STMN2的AON的情况下在TDP43耗尽细胞中观察到水平的4.7％，SEQ ID 36抑制到所述水平的25％。以1μM浓度处理后五天，SEQ ID NO:37共处理细胞表达仅用TARDBPSEQ ID NO:25处理的细胞中含有隐藏外显子的转录本的水平的25.9％，SEQ ID NO:36共处理细胞表达62.9％(图14)。在图14a中可以看到来自3个独立实验的光密度分析。
在仅用SEQ ID NO:25处理的细胞中，转染后5天，全长STMN2转录本的表达降低至未处理的对照细胞中水平的14.4％。当用25μM或5μM浓度的SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37共转染时，全长STMN2转录本的表达维持在与对照细胞相似的水平。在1μM时，在5天后，对于SEQ ID NO:36，全长STMN2转录本的表达减少到59.2％，AON 37减少到79.2％(图14b)。
通过蛋白质印迹进行蛋白质分析。在图15a中可以看到具有代表性的蛋白质印迹图像。来自3个实验的光密度分析表明，在用TARDBP外显子3跳跃PMO(SEQ ID NO:25)处理后3天，stathmin-2表达被完全抑制，在5天仅略微上升至对照水平的13％。当用靶向TARDBP的SEQ ID NO:25和25μM或5μM浓度的靶向STMN2的SEQ ID NO:36或37共转染细胞时，stathmin-2水平维持在与未处理的对照细胞相似的水平。在最低测试浓度1μM下，SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:36共处理细胞在转染后5天stathmin-2表达下降至对照水平的60％(图15b)。
实施例12–仅靶向STMN2的AON37后转录本和蛋白质分析
stathmin-2的表达不足和过表达都是有害的。为了确定靶向STMN2隐藏外显子的AON在TDP43未从细胞核中减少或耗尽的细胞中的作用，在3个独立实验中将AON 37以3个浓度转染到SH-SY5Y细胞中。对照细胞转染对照SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:28)或在不存在AON的情况下进行核转染(Zap)。细胞也被靶向TARDBP的SEQ ID NO:25转染(作为转染效率的对照)。通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳进行的转录本分析表明，在转染AON37后测试的任何时间点(长达转染后5天)，STMN2转录本水平与对照细胞水平中看到的水平没有显著差异。在SEQ ID NO:25处理的细胞中，STMN2水平降低到预期水平，表明转染效率良好。图16a显示了来自3个独立实验的代表性凝胶图像，16b代表光密度分析。蛋白质印迹分析表明，在3天和5天后，在SEQ ID No:37处理的细胞中stathmin-2蛋白水平保持与对照细胞中所见的水平接近(图17a)。
序列表
<110> 佩伦神经与转化科学研究所有限公司
<120> 用于治疗TARDBP相关疾病的组合物和方法
<130> 289439
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 1
uuccuaaaga gaaaagagau augaa 25
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人
<400> 2
ccaucgucuu ccgaugguau 20
<210> 3
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 3
gcuguaaccg uggagagcag caccg 25
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 4
acacgccccu ggaaacuggg cugua 25
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人
<400> 5
gggcaugcag aauuccuucu ac 22
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 6
accuuuugga uaguugacaa cauac 25
<210> 7
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 7
auccauuuuu cuuuuguuau cuaaa 25
<210> 8
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 8
cuuucacugc ugaugaagca ucugu 25
<210> 9
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 9
aacacuauua aaucggaugu uuucu 25
<210> 10
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 10
cagguccugu ucgguuguuu uccau 25
<210> 11
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 11
uuuaccugca ccauaagaac uucuc 25
<210> 12
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 12
aaccguggag agcagcaccg uccca 25
<210> 13
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 13
acugggcugu aaccguggag agcag 25
<210> 14
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 14
uggaaacugg gcuguaaccg uggag 25
<210> 15
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 15
acugcugaug aagcaucugu cucau 25
<210> 16
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 16
uuucacuuuc acugcugaug aagca 25
<210> 17
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 17
uauuaaaucg gauguuuucu ggacu 25
<210> 18
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 18
gacccaacac uauuaaaucg gaugu 25
<210> 19
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 19
ccuguucggu uguuuuccau gggag 25
<210> 20
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 20
ucuuucaggu ccuguucggu uguuu 25
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人
<400> 21
caguuuuauu uaagaauuuc 20
<210> 22
<211> 28
<212> RNA
<213> 人
<400> 22
guuuuauuua agaauuucca acaaugac 28
<210> 23
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 23
gacacauauu auuuaaauca guuuuauuua 30
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 24
aaccgtggag agcagcaccg tccca 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 25
tttcactttc actgctgatg aagca 25
<210> 26
<211> 20
<212> RNA
<213> 人
<400> 26
caccuuccuu cuuuuugauu 20
<210> 27
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 27
ggauguccug agucuagacc cuccg 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 28
cctcttacct cagttacaat ttata 25
<210> 29
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 29
cgaaggucuu cugccgaguc cugca 25
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 30
cauucacauu cauuucuucu uaggc 25
<210> 31
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 31
uuuguuuuaa uuucuucagu auugc 25
<210> 32
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 32
gucuucugcc gaguccugca auaug 25
<210> 33
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 33
ucucucgaag gucuucugcc gaguc 25
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 34
acauucauuu cuucuuaggc aggcu 25
<210> 35
<211> 25
<212> RNA
<213> 人
<400> 35
agccgcauuc acauucauuu cuucu 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 36
tctctcgaag gtcttctgcc gagtc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 37
agccgcattc acattcattt cttct 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 38
ttcctaaaga gaaaagagat atgaa 25
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 39
ccatcgtctt ccgatggtat 20
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 40
gctgtaaccg tggagagcag caccg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 41
acacgcccct ggaaactggg ctgta 25
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人
<400> 42
gggcatgcag aattccttct ac 22
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 43
accttttgga tagttgacaa catac 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 44
atccattttt cttttgttat ctaaa 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 45
ctttcactgc tgatgaagca tctgt 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 46
aacactatta aatcggatgt tttct 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 47
caggtcctgt tcggttgttt tccat 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 48
tttacctgca ccataagaac ttctc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 49
actgggctgt aaccgtggag agcag 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 50
tggaaactgg gctgtaaccg tggag 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 51
actgctgatg aagcatctgt ctcat 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 52
tattaaatcg gatgttttct ggact 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 53
gacccaacac tattaaatcg gatgt 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 54
cctgttcggt tgttttccat gggag 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 55
tctttcaggt cctgttcggt tgttt 25
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 56
cagttttatt taagaatttc 20
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人
<400> 57
gttttattta agaatttcca acaatgac 28
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人
<400> 58
gacacatatt atttaaatca gttttattta 30
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 59
caccttcctt ctttttgatt 20
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 60
ggatgtcctg agtctagacc ctccg 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 61
cctcttacct cagttacaat ttata 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 62
cgaaggtctt ctgccgagtc ctgca 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 63
cattcacatt catttcttct taggc 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 64
tttgttttaa tttcttcagt attgc 25
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人
<400> 65
gtctctgccg agtcctgcaa tatg 24
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人
<400> 66
acattcattt cttcttaggc aggct 25
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 67
cattttgtgg gagcgaagcg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 68
acgcaccaaa gttcatccca 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 69
agcgcaaggg tttctggttt 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 70
ggagtcatgg gggagggata 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 71
tgtactccag caccattggc 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人
<400> 72
aaagttcgtg gggcttctga g 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人
<400> 73
tgcttcagcc agacagttca 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人
<400> 74
gtcaactgtg ccacaagcc 19

Claims (19)

1.一种靶向编码TARDBP前mRNA的核酸分子的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列：
a)选自以下：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:38或58、或其变体；或
b)与靶TARDBP前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:38至58或其变体结合，
其中所述反义寡核苷酸抑制TARDBP基因的表达并且
其中所述反义寡核苷酸基本上是分离的或纯化的。
2.一种靶向编码STMN2前mRNA的核酸分子的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列：
a)选自以下：SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:62至66、或其变体；或
b)与靶STMN2前mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补、也与SEQ ID NO:29至SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:62至66或其变体结合，
其中所述反义寡核苷酸防止STMN2基因的下调和/或增加其表达，并且
其中所述反义寡核苷酸基本上是分离的或纯化的。
3.一种诱导TARDBP前mRNA备选剪接的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸；和
b)允许寡聚物与靶核酸位点结合。
4.一种诱导STMN2前mRNA备选剪接的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一种或多种根据权利要求2所述的反义寡核苷酸；和
(b)允许寡聚物与靶核酸位点结合。
5.一种用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的组合物，所述组合物包含：
a)一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸；和
b)一种或多种治疗上可接受的载体和/或稀释剂。
6.一种用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物组合物，所述组合物包含：
a)一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸；和
b)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
7.一种治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求6所述的药物组合物的步骤。
8.一种用于治疗、预防由生物标志物识别的患者中与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善由生物标志物识别的患者中与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测试所述受试者是否存在与TDP43蛋白质病相关疾病患者可能对TDP43抑制反应的相关的生物标志物；和
b)如果发现受试者表达生物标志物，则向所述受试者施用有效量的权利要求6所述的药物组合物。
9.一种降低受试者中TDP43表达和/或降低受试者中由自身调节引起的TDP43过表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求6所述的药物组合物的步骤。
10.一种防止STMN2基因下调以维持stathmin-2的正常生理水平和/或在stathmin-2表达已经降低的受试者中增加stathmin-2表达的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：
(a)一种或多种根据权利要求2所述的反义寡核苷酸；和
(b)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
11.一种方法,
(1)其降低受试者中TDP43表达；和/或
(2)降低受试者中自身调节引起的TDP43过表达，并且防止或减少STMN2基因的下调以维持受试者中stathmin-2的正常生理水平或增加受试者中stathmin-2的表达，
所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：
(a)一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸；
(b)一种或多种根据权利要求2所述的反义寡核苷酸；和
(c)一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
12.一种方法，
(1)其降低受试者中TDP43表达；和/或
(2)降低受试者中自身调节引起的TDP43过表达，并且防止或减少STMN2基因的下调以维持受试者中stathmin-2的正常生理水平或增加受试者中stathmin-2的表达，
所述方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤：
(a)药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂；和
(b)第二药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求2所述的反义寡核苷酸和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，
其中两种药物组合物同时或依次施用于受试者。
13.一种表达载体，其包含一种或多种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸。
14.一种表达载体，其包含一种或多种根据权利要求2所述的反义寡核苷酸。
15.一种细胞，其包含根据权利要求1所述的反义寡核苷酸。
16.一种细胞，其包含根据权利要求2所述的反义寡核苷酸。
17.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的药物中的用途。
18.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸用于治疗、预防与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的用途。
19.一种用于治疗、预防受试者中与TDP43蛋白质病相关的疾病或改善受试者中与TDP43蛋白质病相关的疾病的影响的试剂盒，其中所述试剂盒至少包含根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，连同其使用说明包装在合适的容器中。
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