JP2023552493A - Ｔａｒｄｂｐ関連疾患を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、タンパク質ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）をコードするトランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子の発現を低減させるために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの分野に関する。本発明はまた、その後のスタスミン－２の下方調節を防止するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの分野に関する。本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにＴＡＲＤＢＰを標的とするＡＯＮおよびＳＴＭＮ２を標的とするＡＯＮを含む治療用組成物の投与によってＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置するための医薬組成物および方法を提供する。

Description

本発明は、タンパク質ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）をコードするトランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子の発現を低減させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。本発明は、ＡＯＮおよびＴＡＲＤＢＰを標的とするＡＯＮを含む治療用組成物の投与によって、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善する方法を提供する。本発明はまた、ＳＴＭＮ２をコードする核酸を標的とし、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡに結合することができるＡＯＮに関する。

背景技術の以下の考察は、本発明の理解を容易にすることのみを意図している。考察は、言及された資料のいずれかが、出願の優先日における共通の一般知識であるか、またはその一部であったことを承認するものではなく、または認めるものでもない。

ＴＤＰ４３タンパク質症は、ニューロンおよびグリア細胞におけるＴＤＰ４３の異常な誤局在化、リン酸化、ユビキチン化および切断を伴う。ＴＤＰ４３タンパク質症は、いくつかの神経変性疾患にわたって起こる。組織学的研究により、ＴＤＰ４３が、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子における病原性バリエーションを有する者、同様にまた、散発性症例における者、および、Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する者を含めて、大部分の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のニューロンにおける細胞質凝集物において存在することが確認されている（Ｇｉｏｒｄａｎａら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１０年；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１６；Ｓｃｈｉｐｐｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６）。脳および脊髄におけるユビキチン陽性細胞質ニューロン封入体におけるＴＤＰ４３の誤局在化および凝集は、現在、ＡＬＳの病理学的特徴であると考えられている。ＴＤＰ４３タンパク質症はまた、前頭側頭変性症または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）としても知られている前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の最も一般的なサブタイプにおいて（Ｇａｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８）、およびアルツハイマー病（ＡＤ）症例の３０～７０％において、見られる（Ｊｏｓｅｐｈｓら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１６年）。ＴＤＰ４３病理はまた、ペリー症候群（ＰＳ）（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１７．７６（８）：ｐ．６７６－６８２）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）（ＭｃＫｅｅ，Ａ．Ｃ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１５．１３１（１）：ｐ．７５～８６）、脳鉄蓄積を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡＴ１）（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１１．３１（５）：ｐ．５３１－５３９）、抗ＩｇＬＯＮ５症候群（ＡＩＳ）（Ｃａｇｎｉｎ，Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、２０１７．５９（１）：ｐ．１３－２０）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）（Ｇｏｅｔｚｌ，Ｊ．Ｋ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１４．１２７（６）：ｐ．８４５－８６０）、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）（Ａｒａｉ，Ｔ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２００９．１１７（２）：ｐ．１２５～１３６）、封入体ミオパチー（ＩＢＭＹ）（Ｗｅｉｈｌ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ＆Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２００８．７９（１０）：ｐ．１１８６～１１８９）、封入体筋炎（ＩＢＭ）（Ｈｕｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１９．９９（７）：ｐ．１０４１－１０４８）およびいくつかの他の非常にまれな疾患を含むいくつかの他の神経変性疾患または神経筋疾患における特徴である。

ＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＡＬＳに関与している。ＡＬＳは、運動ニューロンに影響を及ぼす致死的な変性疾患である。ＡＬＳは、典型的には中年期に発症し、絶え間なく進行する筋萎縮および衰弱として現れ、呼吸筋に対する影響により、ほとんどの場合、疾患発症後２～４年に生存が制限される（Ｃｈｉｏら、Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９）。ＡＬＳは、最も一般的な成人の運動ニューロン疾患であり、１００，０００人あたり２人の発生率および１００，０００人あたり５．４人の有病率である（Ｃｈｉｏら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、２０１３年）。現在の処置選択肢は、症状管理および呼吸支援に基づいており、承認された唯一の医薬品は、わずか数ヶ月間生存を延長する（Ｃｅｔｉｎ Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、２０１５．４４：ｐ．６－１）か、一部の患者にわずかな利益しかもたらさない（Ｓａｗａｄａ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１７．１８（７）：ｐ．７３５－７３８）。疾患の進行を遅らせるかまたは停止させる有効な処置はない。

通常は核に濃縮されるが、ＴＤＰ４３は核局在化シグナルと核外輸送シグナルの両方を含有し、核と細胞質との間を往復する（Ａｙａｌａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８．１２１（２２）：ｐ．３７７８～３７８５）。ＴＤＰ４３の発現は、核過剰にある場合、タンパク質が自身のプレｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の領域に結合するフィードバック機構を介して、自己調節される。これは、翻訳されるのではなく分解されるｍＲＮＡ転写物をもたらす代替的なポリアデニル化シグナルおよびスプライシング事象の使用を引き起こす（Ｋｏｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６．４４（１２）：ｐ．５８２０～５８３６；Ａｖｅｎｄａｎｏ－Ｖａｚｑｕｅｚ、Ｓ．Ｅ．，ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１２．２６（１５）：ｐ．１６７９－１６８４；Ｄ’Ａｌｔｏｎら、ＲＮＡ、２０１５．２１（８）：ｐ．１４１９－１４３２）。

ＡＬＳにおけるＴＤＰ４３の細胞質の誤局在化は、その暴走的な上方調節をもたらす。これは、細胞質におけるＴＤＰ４３のレベルの増加および潜在的に毒性の凝集物の形成をもたらすが、核におけるＴＤＰ４３レベルは枯渇したままである（Ｋｏｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０１６．Ｊｕｌ；４４（１２）：ｐ ５８２０－３６）。ＴＤＰ４３過剰発現げっ歯類モデルは、野生型と変異体の両方のＴＤＰ４３の過剰発現が神経変性表現型を引き起こし得ることを一貫して見出している（Ａｓｈら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０．１９（１６）：ｐ．３２０６－３２１８；Ｗｉｌｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、２０１０．１０７（８）：ｐ．３８５８－３８６３；Ｋａｂａｓｈｉ，ら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０．１９（４）：ｐ．６７１－６８３；Ｓｔａｌｌｉｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１０．４０（２）：ｐ．４０４－４１４；Ｘｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、２０１１．６（１）：ｐ．７３；Ｌｉａｃｈｋｏら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０．３０（４８）：ｐ．１６２０８－１６２１９）。

ＴＤＰ４３は、遺伝子発現の調節因子として機能し、プレｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡ安定性の調節、ｍＲＮＡ輸送、翻訳および非コードＲＮＡの調節における役割を有するいくつかのＲＮＡプロセシングステップに関与する（Ｒａｔｔｉ，Ａ．およびＥ．Ｂｕｒａｔｔｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６．１３８（Ｓ１）：ｐ．９５－１１１；Ｂｕｒａｔｔｉ、Ｅ．およびＦ．Ｅ．Ｂａｒａｌｌｅ、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０．７（４）：ｐ．４２０～４２９；Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１．１４（４）：ｐ．４５２－４５８）。それは、ストレス顆粒のダイナミクスにおいても役割を果たす。ストレス顆粒は、ストレス下にある場合、非必須転写物およびアポトーシス促進性タンパク質の翻訳停止によって細胞生存を促進する（Ｐｒｏｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｗ．およびＲ．Ｐａｒｋｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６．２６（９）：ｐ．６６８－６７９）。

ＴＤＰ４３は、核および細胞質の両方に機能を有するが、主に核に存在する。スプライシングおよび転写におけるその役割を通して、ＴＤＰ４３は多くの他の遺伝子の調節に関与し、その核枯渇は細胞における様々な下流効果をもたらす可能性がある。

細胞質ＴＤＰ４３の増加は、全体的なｍＲＮＡ翻訳、ストレス顆粒のダイナミクス、ミトコンドリア機能および他の細胞経路に影響を及ぼす。ＴＤＰ４３は翻訳の調節に関与しており、その細胞質の増加はタンパク質合成の全体的な減少をもたらすことが示されている（Ｒｕｓｓｏら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１７．２６（８）：ｐ．１４０７－１４１８）。ＴＤＰ４３は、ストレス顆粒の形成および維持にも関与している（Ｋｈａｌｆａｌｌａｈ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１８．８（１）：ｐ．１－１３）。ＴＤＰ４３などのプリオン様ドメインを有するタンパク質は、複数の一過性の弱い相互作用を形成する能力のために、ストレス顆粒の可逆的集合にとって不可欠であると考えられている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｆ．およびＪ．Ｓｈｏｒｔｅｒ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１７．４７４（８）：ｐ．１４１７－１４３８）。細胞質ＴＤＰ４３の増加は、それらの機能障害につながるストレス顆粒のダイナミクスを妨害し得る。ＴＤＰ４３過剰発現はまた、ミトコンドリア機能にいくつかの方法で影響を及ぼす（Ｗａｎｇ，Ｗ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１６．２２（８）：ｐ．８６９－８７８２７；Ｐｒａｓａｄ，Ａ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．１２（２５））。細胞質ＴＤＰ４３の蓄積はまた、プリオン様増殖機構を介して、疾患進行に寄与し得る（Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１３．４（１）：ｐ．１２４－１３４）。

核ＴＤＰ４３の枯渇は問題であり、ＴＤＰ４３の核枯渇の最悪の影響を改善する治療戦略が研究されている。しかしながら、細胞質ＴＤＰ４３の増加は、重大な有害結果に関連する。したがって、細胞質ＴＤＰ４３を低減させる戦略は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患を処置するために有効であり得る。

ＡＯＮ媒介性ＴＤＰ４３下方調節は、これらのプロセスに対する細胞質ＴＤＰ４３過剰発現の影響を低減し得る。国際公開第２０１９／０１３１４１号は、ＴＡＲＤＢＰを対象としたいくつかのＡＯＮを記載している。しかしながら、これらのＡＯＮのいずれも、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患のための有効な市販の処置を未だもたらしていない。

スプライシングおよび転写におけるその役割を通して、ＴＤＰ４３は多くの他の遺伝子の調節に関与し、その核枯渇は細胞における様々な下流効果をもたらす可能性がある。核ＴＤＰ４３枯渇は、数百のＲＮＡの差次的発現またはスプライシングをもたらす（Ｋｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１６７－１７９）［１］［１］。最近の研究は、ＡＬＳにおけるＴＤＰ４３タンパク質症がニューロンタンパク質スタスミン－２の発現を変化させること、およびこれがニューロンの脆弱性の増強に対する直接的な機能的関連を有し得ることを示している。

スタスミン－２は、ＳＴＭＮ２遺伝子によってコードされるニューロンのリンタンパク質である。これは、ゴルジに局在するとともに、ニューロンの核周囲の細胞質、軸索および成長円錐に小胞として分布する膜結合タンパク質である（Ｃｈａｕｖｉｎ，Ｓ．およびＡ．Ｓｏｂｅｌ、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔａｔｈｍｉｎｓ：Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５．１２６：ｐ．１－１８）。スタスミン－２は、神経系で高度に発現され、神経分化、可塑性および再生中に上方調節される（Ｃｈａｕｖｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ ２０１５）。

スタスミン－２は、成長円錐内の微小管ダイナミクスのモジュレーションを介して神経突起伸長を刺激する（Ｍｏｒｉｉ，Ｈ．、Ｙ．Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ－Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、およびＮ．Ｍｏｒｉ、ＳＣＧ１０、ａ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６．６６（１０）：ｐ．１１０１－１１１４）。微小管は、細胞骨格の一部を構成し、細胞に構造および形状を提供するチューブリンのポリマーである。微小管は、環境中の遊離チューブリンの量に依存する集合および解重合の段階を経る動的構造である（Ｃｈａｕｖｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ ２０１５）。スタスミン－２を含むスタスミンは、その隔離および放出を介して利用可能なチューブリンの量を調節する。スタスミン－２のリン酸化は、チューブリン隔離の負の調節因子であり、管状放出および重合を促進する（Ｐｏｕｌａｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３４（２）：ｐ．１３７～１４６）。スタスミン－２の厳密な調節は、適切な神経突起生成に必要である。スタスミン－２枯渇は、成長円錐休止の延長および表面積の増加を誘導する（Ｐｏｕｌａｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３４（２）：ｐ．１３７～１４６）。中程度のレベルのスタスミン－２は、神経突起伸長を刺激するが、過剰発現は過剰な微小管分解に起因する神経突起退縮をもたらす（Ｍｏｒｉｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６．６６（１０）：ｐ．１１０１－１１１４）。スタスミンは、中枢神経系および末梢神経系における再生過程において重要な役割を果たし（Ｃｈａｕｖｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ ２０１５）［２］、末梢神経再生中および脳外傷後に上方調節される（Ｖｏｒｉａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００６．１９７（１）：ｐ．２５８－２６７；Ｓｈｉｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１４．２５２：ｐ．１－１１）。スタスミン－２はまた、細胞内輸送および神経内分泌の分泌を含む他のニューロン機能において役割を果たす（Ｍａｈａｐａｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８．４７（２７）：ｐ．７１６７－７１７８）。

ニューロンにおいて、スタスミン－２レベルは、ＴＤＰ４３によって調節される。ＴＤＰ４３は、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの第１イントロン内の部位に結合することができる。これにより、成熟ｍＲＮＡ転写物への潜在性エクソンの包含が抑制され、完全なＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が可能になる。ＴＤＰ４３レベルが低下すると、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡへのその結合が減少し、潜在性エクソンが露出したままになり、成熟ｍＲＮＡ転写物中にその封入をもたらす。潜在性エクソンは、未熟終止コドン並びに未熟ポリアデニル化部位を含み、その利用は、短縮型で非機能性のｍＲＮＡをもたらし、スタスミン－２発現の減少をもたらす（Ｍｅｌａｍｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１８０～１９０）。

ＴＤＰ４３を枯渇させたＡＬＳ患者のｉＰＳＣ由来運動ニューロンにおける研究は、その発現を増加させることによって回復され得る軸索伸長および再生の低減をもたらすスタスミン－２発現の低減を報告している（Ｍｅｌａｍｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１８０～１９０）。潜在性エクソンを含有する低減したスタスミン－２転写物発現およびＳＴＭＮ２転写物の発現の増加が、ＡＬＳ患者から採取される組織サンプルに由来する運動ニューロンにおいてインビボで確認されている（Ｋｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１６７－１７９；Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｚ．ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１８０～１９０）。ＴＤＰ４３発現を減少させ、その後のスタスミン－２の下方調節を防ぐように設計されたＡＯＮを組み合わせる治療戦略は、細胞質ＴＤＰ４３過剰発現の影響を低減させ、同時にスタスミン－２枯渇によって引き起こされるニューロンの脆弱性から保護することができる。

アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるための有効な手段として出現しており、したがって、ＴＡＲＤＢＰ発現の調節のための多くの治療、診断、および研究用途において独特に有用であることが判明し得る。アンチセンス技術は、様々な異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で、遺伝子発現に影響を及ぼし得る。しかしながら、アンチセンス技術の課題は、インビボで所望の効果を有する特定のＡＯＮを同定することが依然として困難であることである。
したがって、かなりの量の研究にもかかわらず、ＡＬＳなどの神経学的状態のための効果的な処置を開発し、特定することが依然として必要とされている。この処置への明確な経路はまだない。
この背景に鑑みて、本発明が開発された。特に、本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患においてＴＤＰ４３タンパク質症を改善するための手段を提供しようとする。

国際公開第２０１９／０１３１４１号

Ｇｉｏｒｄａｎａら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１０年 Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１６ Ｓｃｈｉｐｐｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６ Ｇａｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８ Ｊｏｓｅｐｈｓら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１６年 Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１７．７６（８）：ｐ．６７６－６８２ ＭｃＫｅｅ，Ａ．Ｃ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１５．１３１（１）：ｐ．７５～８６ Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１１．３１（５）：ｐ．５３１－５３９ Ｃａｇｎｉｎ，Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、２０１７．５９（１）：ｐ．１３－２０ Ｇｏｅｔｚｌ，Ｊ．Ｋ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２０１４．１２７（６）：ｐ．８４５－８６０ Ａｒａｉ，Ｔ．ら、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２００９．１１７（２）：ｐ．１２５～１３６ Ｗｅｉｈｌ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ＆Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２００８．７９（１０）：ｐ．１１８６～１１８９ Ｈｕｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１９．９９（７）：ｐ．１０４１－１０４８ Ｃｈｉｏら、Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９ Ｃｈｉｏら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、２０１３年 Ｃｅｔｉｎ Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、２０１５．４４：ｐ．６－１ Ｓａｗａｄａ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１７．１８（７）：ｐ．７３５－７３８ Ａｙａｌａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８．１２１（２２）：ｐ．３７７８～３７８５ Ｋｏｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６．４４（１２）：ｐ．５８２０～５８３６ Ａｖｅｎｄａｎｏ－Ｖａｚｑｕｅｚ、Ｓ．Ｅ．，ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１２．２６（１５）：ｐ．１６７９－１６８４ Ｄ’Ａｌｔｏｎら、ＲＮＡ、２０１５．２１（８）：ｐ．１４１９－１４３２ Ａｓｈら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０．１９（１６）：ｐ．３２０６－３２１８ Ｗｉｌｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、２０１０．１０７（８）：ｐ．３８５８－３８６３ Ｋａｂａｓｈｉ，ら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０．１９（４）：ｐ．６７１－６８３ Ｓｔａｌｌｉｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１０．４０（２）：ｐ．４０４－４１４ Ｘｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、２０１１．６（１）：ｐ．７３ Ｌｉａｃｈｋｏら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０．３０（４８）：ｐ．１６２０８－１６２１９ Ｒａｔｔｉ，Ａ．およびＥ．Ｂｕｒａｔｔｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６．１３８（Ｓ１）：ｐ．９５－１１１ Ｂｕｒａｔｔｉ、Ｅ．およびＦ．Ｅ．Ｂａｒａｌｌｅ、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０．７（４）：ｐ．４２０～４２９ Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１．１４（４）：ｐ．４５２－４５８ Ｐｒｏｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｗ．およびＲ．Ｐａｒｋｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６．２６（９）：ｐ．６６８－６７９ Ｒｕｓｓｏら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１７．２６（８）：ｐ．１４０７－１４１８ Ｋｈａｌｆａｌｌａｈ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１８．８（１）：ｐ．１－１３ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｆ．およびＪ．Ｓｈｏｒｔｅｒ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１７．４７４（８）：ｐ．１４１７－１４３８ Ｗａｎｇ，Ｗ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１６．２２（８）：ｐ．８６９－８７８２７ Ｐｒａｓａｄ，Ａ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．１２（２５） Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１３．４（１）：ｐ．１２４－１３４ Ｋｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１６７－１７９ Ｃｈａｕｖｉｎ，Ｓ．およびＡ．Ｓｏｂｅｌ、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔａｔｈｍｉｎｓ：Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５．１２６：ｐ．１－１８ Ｍｏｒｉｉ，Ｈ．、Ｙ．Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ－Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、およびＮ．Ｍｏｒｉ、ＳＣＧ１０、ａ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６．６６（１０）：ｐ．１１０１－１１１４ Ｐｏｕｌａｉｎ ａｎｄ Ｓｏｂｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３４（２）：ｐ．１３７～１４６ Ｖｏｒｉａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００６．１９７（１）：ｐ．２５８－２６７ Ｓｈｉｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１４．２５２：ｐ．１－１１ Ｍａｈａｐａｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８．４７（２７）：ｐ．７１６７－７１７８ Ｍｅｌａｍｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１８０～１９０ Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｚ．ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９．２２（２）：ｐ．１８０～１９０

本発明は、ＴＡＲＤＢＰをコードする核酸を標的とする化合物、特にＡＯＮを対象にする。本発明の実施形態は、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡに結合することができるＡＯＮに関する。本発明はまた、ＳＴＭＮ２をコードする核酸を標的とする化合物、特にＡＯＮに関する。本発明の実施形態は、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡに結合することができるＡＯＮに関する。

概して、本発明の第１の態様によれば、提供されるのは、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ａ）配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８またはそれらのバリアントからなるリストから選択されるか、またはｂ）配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８も結合する標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡまたはそれらのバリアント中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的である、核酸塩基配列を有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を阻害し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、実質的に単離または精製されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ４３の発現を阻害する。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＲＤＢＰ上のエクソン３に結合する。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングを介して、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する。

更なる実施形態では、エクソンはエクソン３である。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド－ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマー・コンジュゲートである。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４および配列番号２５からなるリストから選択される。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６、配列番号２５である。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

本発明の第２の態様では、提供されるのは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ａ）配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６またはそれらのバリアントからなるリストから選択されるか、またはｂ）配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６も結合する標的ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ中またはそれらのバリアント中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的である、核酸塩基配列を有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止し、かつ／またはＳＴＭＮ２遺伝子の発現を増加させ、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、実質的に単離または精製されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スタスミン－２の下方調節を防止若しくは低減するか、またはその発現を増加させる。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＴＭＮ２のイントロン１の潜在性エクソンに結合する。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性エクソンが成熟ｍＲＮＡ転写物から排除されることをもたらす。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド－ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマー・コンジュゲートである。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３６および３７からなるリストから選択される。

更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する方法であって、（ａ）本発明の第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するステップと、（ｂ）オリゴマー（複数可）を標的核酸部位に結合させるステップと、を含む方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する方法であって、（ａ）１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを本発明の第２の態様に提供するステップと、（ｂ）オリゴマー（複数可）を標的核酸部位に結合させるステップと、を含む方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための組成物であって、組成物が、（ａ）本発明の第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物と、（ｂ）１つまたはそれを超える治療的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む組成物である。

更なる実施形態では、組成物は、本発明の第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを更に含む。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬組成物であって、組成物が、（ａ）本発明の第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物と、（ｂ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む医薬組成物である。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

更なる実施形態では、医薬組成物は、本発明の第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを更に含む。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善する方法であって、方法が、有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法である。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤおよびＦＴＬＤ、ＰＳ、ＩＢＭＹ、ＩＢＭ、ＣＴＥ、ＬＢＤ、並びにＮＣＬからなる群から選択される。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤおよびＦＴＬＤ、ＰＳ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤおよびＦＴＬＤからなる群から選択される。

本発明の別の態様では、提供されるのは、バイオマーカーによって同定された患者におけるＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善する方法であって、方法が、（ａ）ＴＤＰ４３抑制に応答する可能性があるＴＤＰ４３タンパク質症患者に関連する疾患に関連するバイオマーカーの存在について対象を試験するステップと、（ｂ）対象がバイオマーカーを発現することが判明した場合、有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与するステップと、を含む、方法である。

更なる実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

更なる実施形態では、バイオマーカーは短縮型ＳＴＭＮ２転写物である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を低下させる方法であって、方法が、有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止または低減して、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持する、および／または対象においてスタスミン－２の発現が低減している場合にスタスミン－２発現を増加させる方法であって、方法が、有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）本発明の第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、（ｂ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む、方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、（１）対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または（２）対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を減少させる、およびＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止または低減して、対象においてスタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、またはスタスミン－２のレベルを増加させる方法であって、方法が、有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、医薬組成物が、第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む、方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、（１）対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または（２）対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を減少させる、およびＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止または低減して、対象においてスタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、またはスタスミン－２のレベルを増加させる方法であって、方法が、有効量の（ａ）第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む医薬組成物、および（ｂ）第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む第２の医薬組成物を、対象に投与するステップを含み、２つの医薬組成物が、対象に同時にまたは逐次投与される、方法である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、本発明の第１の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターである。

好ましい実施形態では、発現ベクターは、本発明の第２の態様の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の別の態様では、提供されるのは、本発明の第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターである。

本発明の別の態様では、提供されるのは、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞である。

好ましい実施形態では、細胞は、本発明の第２の態様による１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の別の態様では、提供されるのは、本発明の第２の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。

本発明の別の態様では、提供されるのは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。

好ましい実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、使用は、本発明の第２の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つまたはそれを超える使用を含む。

本発明の別の態様では、提供されるのは、対象におけるＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するためのキットであり、キットは、その使用のための指示とともに、適切な容器に包装された、少なくとも本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

好ましい実施形態では、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患が、ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、キットは、本発明の第２の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを更に含む。

本発明は、そのなお更なる態様によれば、本発明のＡＯＮ配列のｃＤＮＡまたはクローン化コピー、並びに本発明の１つまたはそれを超えるＡＯＮ配列を含有するベクターに及ぶ。本発明は、そのような配列および／またはベクターを含有する細胞に更に及ぶ。

本発明の更なる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態の以下の説明においてより完全に説明される。この説明は、単に本発明を例示する目的で含まれる。上記の本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されるべきではない。

以下の説明は、以下の添付図面を参照して提供される。

図１は、異なるポリアデニル化部位を利用した場合に産生されるＴＡＲＤＢＰの転写物の概略図を示す。

図２は、ＴＡＲＤＢＰ上のエクソン２および３標的化ＡＯＮのそれぞれの結合位置の概略図を示す。

図３は、ヒト線維芽細胞におけるＴＡＲＤＢＰエクソン２標的化ＡＯを用いたトランスフェクション後のＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＴＡＲＤＢＰ転写物分析を示す。

図４は、ヒト線維芽細胞におけるＴＡＲＤＢＰエクソン３標的化ＡＯＮを用いたトランスフェクション後のＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＴＡＲＤＢＰ転写物分析を示す。

図５は、エクソン２標的化ＡＯＮ配列番号３および１２によって誘導されるＴＡＲＤＢＰ転写物ノックダウンの機構の調査のためのＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＴＡＲＤＢＰ転写物分析を示す。

図６は、ＴＡＲＤＢＰポリアデニル化部位１（ＰＡ１）を遮断するように設計されたＡＯＮを用いたヒト線維芽細胞のトランスフェクション後のＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＴＡＲＤＢＰ転写物分析を示す。

図７は、１５０μＭのＴＡＲＤＢＰ標的化ＰＭＯ ＡＯＮ ＩＤ２４および２５を用いたヌクレオフェクションによるヒト線維芽細胞のトランスフェクション後のＴＡＲＤＢＰ転写物分析およびＴＤＰ４３タンパク質レベルを示す。

図８は、１００μＭおよび５０μＭの濃度のＴＡＲＤＢＰ標的化ＰＭＯ（ＡＯＮ ２５）を用いたヌクレオフェクションによるヒト線維芽細胞の３回のトランスフェクションの結果を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

図９は、ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における、ＴＡＲＤＢＰ標的化ＰＭＯ（ＡＯＮ ２５）を用いたトランスフェクション後のＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＳＴＭＮ２転写物分析を示す。

図１０は、ＳＴＭＮ２のイントロン１におけるＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化ＡＯＮの結合位置の概略図を示す。

図１１は、単独で、またはＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化２’Ｏメチル－ＰＳ ＡＯＮ（配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１）若しくは対照オリゴ（ＡＯＮ ＩＤ２８）と組み合わせて、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）を用いたエレクトロポレーションによるヒトＳＨ－ＳＨ５Ｙ細胞のトランスフェクション後のＳＴＭＮ２転写物分析を示す。

図１２は、ＡＯＮ配列を配列番号２９（配列番号３２および３３）および配列番号３０（配列番号３４および３５）の５塩基上流および下流にシフトさせることによる配列最適化後のＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によるＳＴＭＮ２転写物分析を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

図１３は、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）または配列番号２５とＳＴＭＮ２標的化配列番号３６若しくは３７との組み合わせを用いたエレクトロポレーションによるヒトＳＨ－ＳＨ５Ｙ細胞のトランスフェクション後のＳＴＭＮ２転写物分析を示す。

図１４は、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）または配列番号２５とＳＴＭＮ２標的化配列番号３６若しくは３７との組み合わせを用いたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の３回のトランスフェクションについてのＳＴＭＮ２転写物分析結果を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

図１５は、ＴＡＲＤＢＰ配列番号２５およびＳＴＭＮ２配列番号３６または３７の共処理細胞についての代表的なウエスタンブロット画像およびデンシトメトリー分析を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

図１６は、配列番号３７を用いたエレクトロポレーションによるヒトＳＨ－ＳＨ５Ｙ細胞のトランスフェクション後のＳＴＭＮ２転写物分析を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

図１７は、配列番号３７のみで処理した細胞についてのウエスタンブロットタンパク質分析によって表されるスタスミン－２発現の結果を示す。

詳細な説明
本発明は、ＡＯＮ治療を使用して、ＴＤＰ４３タンパク質症（ＡＬＳ、ＡＤ、ＦＴＬＤ、ＰＳ、ＣＴＥ、ＮＢＩＡＴ１、ＡＩＳ、ＮＣＬ、ＬＢＤ、ＩＢＭＹおよびＩＢＭを含む）に関連する疾患の症状を改善するかまたはその更なる進行を遅らせるための予防的または治療的方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡをコードする核酸分子に対して標的化される単離または精製ＡＯＮを提供し、ＡＯＮが、
ａ．配列番号１～配列番号２５；配列番号３８～配列番号５８（両端を含む）またはそれらのバリアントを含むリストから選択されるか、または
ｂ．配列番号１～配列番号２５；配列番号３８～配列番号５８（両端を含む）またはそのバリアントも結合する、標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的な配列である、核酸塩基配列を有し、かつ
ｃ．ＡＯＮが、ヒトＴＡＲＤＢＰの発現を阻害する。

本発明はまた、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とする（target to a nucleic acid molecule）単離または精製アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ＡＯＮが、
ａ．配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６（両端を含む）を含むリストから選択されるか、または
ｂ．配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６（両端を含む）も結合する標的ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的な配列である、核酸塩基配列を有し、かつ
ＡＯＮは、低減された場合に、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持し、および／またはスタスミン－２の発現を増加させる。

便宜上、以下のセクションは、一般に、本明細書で使用される用語の様々な意味を概説する。この考察に続いて、本発明の組成物、医薬品の使用および方法に関する一般的な態様が考察され、続いて、本発明の様々な実施形態の特性およびそれらをどのように使用することができるかを示す具体例が考察される。
１．定義

本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。当技術分野における用語の使用と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内で提供される定義が優先するものとする。

当業者は、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外の変形および修正を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変形および修正を含む。本発明はまた、本明細書で言及されるかまたは示されるステップ、特徴、製剤および化合物のすべてを個々にまたは集合的に、およびステップまたは特徴のありとあらゆる組み合わせまたは任意の２つまたはそれを超えるものを含む。

本テキストに引用されている各文書、参考文献、特許出願または特許は、参照によりその全体が本テキストに明示的に組み込まれており、これは、このテキストの一部として読者によって読まれ検討されるべきであることを意味する。本テキストで引用された文書、参考文献、特許出願または特許が本明細書で繰り返されていないことは、単に簡潔さのためである。しかしながら、引用された資料またはその資料に含まれる情報のいずれもが、共通の一般的知識であると理解されるべきではない。

本明細書で言及される任意の製品または参照により本明細書に組み込まれる任意の文書についての製造業者の指示、説明、製品仕様、および製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用することができる。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のいずれによっても範囲において限定されるものではない。これらの実施形態は、例示のみを目的としている。機能的に等価な生成物、製剤および方法は、本明細書中に記載されるような本発明の範囲内であることは明らかである。

操作例以外、または他に指示される場合、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。

本明細書に記載の発明は、１つまたはそれを超える値の範囲（例えば、サイズ、濃度など）を含むことができる。値の範囲は、範囲を定義する値、および範囲への境界を定義する値に直接隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値を含む、範囲内のすべての値を含むと理解される。例えば、当業者であれば、範囲の上限または下限の１０％の変動が完全に適切であってよく、本発明に包含されることを理解する。より具体的には、範囲の上限または下限の変動は、５％であるか、または当技術分野で一般的に認識されているように、いずれか大きい方である。

本出願では、別段特に明記しない限り、単数形の使用は複数形も含む。本出願では、「または」の使用は、別段明記しない限り、「および／または」を意味する。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素（element）」または「構成成分（component）」などの用語は、別段特に明記しない限り、１つの単位を含む要素（elements）および構成成分（components）と、２つ以上のサブユニットを含む要素（elements）および構成成分（components）の両方を包含する。また、「部分（portion）」という用語の使用は、部分（moiety）の一部または部分全体を含むことができる。

本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」」などの変形は、記載された整数または整数群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数群の排除を意味しないと理解される。

本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の効果が生じるように、その所望の作用部位での組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による対象への組成物の配置を指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含むがこれらに限定されない経口または非経口経路を含む、当技術分野で公知の任意の適切な経路によって投与することができる。

本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な記載の中に見出され、全体を通して適用され得る。他に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

以下の非限定的な説明および実施例を参照して、本発明の特徴をここで説明する。
２．実施形態

本発明の実施形態は、一般に、ＴＡＲＤＢＰの発現を抑制するように特に設計された改善されたアンチセンス化合物およびその方法または使用に関する。細胞質におけるＴＡＲＤＢＰの誤局在化は、ＡＬＳ、ＦＴＬＤおよびＡＤを含むＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に関与している。

理論に拘束されるものではないが、本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に罹患している患者におけるＴＤＰ４３の発現の抑制が、これらの患者の症状の進行を遅らせるおよび／または生存を改善する効果を有し得るという理解に基づいている。これは、ＴＤＰ４３の暴走的な上方調節（runaway upregulation）をもたらすＴＤＰ４３の細胞質の誤局在化を含むＴＤＰ４３タンパク質症が、ＡＬＳ、ＦＴＬＤおよびＡＤを含むいくつかの神経学的状態に関連するからである。したがって、（ＴＤＰ４３をコードする）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の抑制は、ＡＬＳ、ＦＴＬＤおよびＡＤを含むＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に罹患している患者の症状の進行の遅延および／または生存の改善をもたらすと仮定される。この治療から利益を得ることができる患者は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に変異またはミスフォールディングを有し得る。しかしながら、ＴＡＲＤＢＰ変異またはミスフォールディングを示さない患者は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を抑制する処置にも応答し得る。

本発明の実施形態はまた、一般に、スタスミン－２のその後の下方調節を防止するように特に設計された、改良されたアンチセンス化合物およびその方法または使用に関する。スタスミン－２は、中枢神経系および末梢神経系における再生過程において重要な役割を果たす。低減されたスタスミン－２発現が、ＡＬＳ患者から採取される組織サンプルに由来する運動ニューロンにおいてインビボで確認されている。理論に拘束されるものではないが、本発明はまた、ＴＤＰ４３発現を低減させるように設計されたＡＯＮと、その後のスタスミン－２の下方調節を防止するように設計されたＡＯＮとを組み合わせる治療戦略が、細胞質ＴＤＰ４３過剰発現の影響を低減させ、同時にスタスミン－２枯渇によって引き起こされるニューロンの脆弱性から保護することができるという理解に基づいている。スタスミン－２タンパク質の正常な生理学的レベルは、ＡＯＮをＳＴＭＮ２転写物に標的化することによって維持され得る。

Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ＴＡＲＤＢＰ プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とする１つまたはそれを超える単離または精製ＡＯＮを提供し、ＡＯＮが、配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８（両端を含む）を含むリスト（以下の表１および表２に示すとおり）から選択される核酸塩基配列を有し、かつＡＯＮは、ヒトＴＤＰ４３の発現を阻害する。好ましくは、ＡＯＮは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

より一般には、本発明は、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とする単離または精製アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ＡＯＮが、
ａ．配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８（両端を含む）を含むリストから選択されるか、または
ｂ．配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８（両端を含む）も結合する標的ＴＡＲＤＢＰ プレｍＲＮＡ中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的な配列である、核酸塩基配列を有し、かつ
ｃ．ＡＯＮが、ヒトＴＡＲＤＢＰの発現を阻害する。

本発明はまた、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とする１つまたはそれを超える単離または精製ＡＯＮを提供し、ＡＯＮが、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６（両端を含む）を含むリスト（以下の表１および表２に示すとおり）から選択される核酸塩基配列を有し、かつこれらのＡＯＮは、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、または下方調節を低減させる。より一般には、本発明はまた、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とする単離または精製アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ＡＯＮが、
ａ．配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６（両端を含む）を含むリストから選択されるか、または
ｂ．配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６（両端を含む）も結合する標的ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的な配列である、核酸塩基配列を有し、かつ
ｃ．これらのＡＯＮが、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、またはスタスミン－２の下方調節を低減させる。

好ましくは、ＡＯＮは、ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

本発明のＡＯＮのいずれにおいても、本明細書で提供される配列のウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）で置き換えられ得る。例えば、本発明のＡＯＮは、表２に列挙される配列を有する。

この文書の例に記載されている更なるＡＯＮは、表３に列挙されているものを含む。

本発明の特定のＡＯＮは、エクソン２および３内のヒトＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ内の適切な配列を補完するように設計される。好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡのエクソン３内の適切な配列を補完し、エクソンのスキッピングを誘導するように設計される。最も好ましくは、本発明のＡＯＮは、配列番号１６または配列番号２５のものである。

別の好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、エクソン２内の適切な配列を補完するように設計される。一実施形態では、ＡＯＮは、配列番号１２または配列番号２４のものである。

本発明の特定のＡＯＮはまた、イントロン１のヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ潜在性エクソン内の適切な配列を補完するように設計される。好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン１における潜在性エクソン内の適切な配列を補完するように設計される。３つのエンハンサー部位ホットスポットを標的とするＡＯＮを用いたオンラインスプライス予測ツールによって予測されるスプライシングエンハンサーの結合を阻害する部位を選択した。スプライシングエンハンサーの結合が低減すると、スプライソソームによるエクソンの認識が低減し、潜在性エクソンが成熟ｍＲＮＡ転写物から排除される。これは、潜在性エクソンを含まない成熟ＳＴＭＮ２転写物が翻訳されるときに産生されるスタスミン－２のレベルの増加をもたらすであろう。

好ましくは、ヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ内の適切な配列を補完するように設計されたＡＯＮは、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６のリストから選択され、またはより好ましくは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７から選択される。

「アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＯＮ」という用語は、互換的に使用され、環状サブユニットの直鎖配列を指し、それぞれが、ワトソン・クリック型塩基対合によって塩基対合部分が核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするサブユニット間結合によって結合された塩基対合部分を有する。環状サブユニットは、リボース若しくは別のペントース糖、または好ましい実施形態ではモルホリノ基に基づく（以下のモルホリノオリゴマーの説明を参照）。オリゴマーは、標的配列に対して正確または近い配列相補性を有し得る。オリゴマーの終端付近の配列のバリエーションは、一般に、内部のバリエーションよりも好ましい。当技術分野で公知の他のアンチセンス剤の中でも、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドも企図される。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを含み、ＲＮＡはＤＮＡ鋳型の転写によって調製または得られる。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖および直鎖または共有結合的に環状に閉じた分子として存在し得る。

「単離された」とは、その天然の状態で通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、天然に存在する状態で隣接する配列から精製または除去されたポリヌクレオチド、例えばゲノム中の断片に隣接する配列から除去されるＤＮＡ断片を指し得る。細胞に関する「単離する」という用語は、供給源対象（例えば、ポリヌクレオチドリピート疾患を有する対象）からの細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の精製を指す。ｍＲＮＡまたはタンパク質との関連において、「単離する」とは、供給源、例えば細胞からのｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を指す。

ＡＯＮは、それがハイブリダイズする標的配列「に向けられる」または「に対して標的化される」と言うことができる。特定の実施形態では、標的配列は、ポリアデニル化部位および周囲領域を含む領域を含む。標的配列は、典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、またはプレプロセッシングｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、プレプロセッシングｍＲＮＡの通常のスプライスアクセプター接合部の下流にその５’末端１から約２５塩基対を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。好ましい標的配列は、スプライス部位を含むか、または完全にエクソンコード配列内に含まれるか、またはスプライスアクセプター若しくはドナー部位にまたがるプレプロセッシングｍＲＮＡの任意の領域である。オリゴマーは、より一般には、上記の方法で標的の核酸に対して標的化される場合、タンパク質、ウイルスまたは細菌などの生物学的に関連する標的「に対して標的化される」と言われる。

本明細書で使用される場合、「十分な長さ」または「十分な配列相補性」は、標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ（またはＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ）中の少なくとも１つ、より典型的には１～３０個の連続する核酸塩基に相補的なＡＯＮを指す。いくつかの実施形態では、十分な長さのアンチセンスは、標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続する核酸塩基を含む。他の実施形態では、十分な長さのアンチセンスは、標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ（またはＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ）中に少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続する核酸塩基を含む。好ましくは、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長であり、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０またはそれを超えるヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０～約３０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１５～約２５ヌクレオチド長である。更に別の実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、２０～３０、または２０～５０ヌクレオチド長である。更に別の実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、２２～２８、２５～２８、２４～２９または２５～３０ヌクレオチド長である。

特定の実施形態では、ＡＯＮは、標的ＲＮＡの領域（例えばプレｍＲＮＡ）を効果的に遮断するのに十分な標的ＲＮＡに対する配列相補性を有する。いくつかの実施形態では、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡのそのような遮断は、エクソンスキッピングを誘導するのに役立つ。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは標的プレｍＲＮＡ（例えば、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子プレｍＲＮＡ）である。

本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド｛すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列「’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する「部分的（partial）」であり得る。あるいは、核酸間に「完全な」または「全」相補性が存在し得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。したがって、本明細書で使用される「補完」配列は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に対してある程度の相補性を有するオリゴヌクレオチド配列を指す。

本発明の目的のために、ヌクレオチド配列の相補体は、表されたヌクレオチド配列で二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を形成することができるであろうヌクレオチド配列であり、Ｃｈａｒｇａｆｆの規則（Ａ＜＞Ｔ；Ｇ＜＞Ｃ；Ａ＜＞Ｕ）に従って、ヌクレオチドをそれらの相補的ヌクレオチドで置き換え、５’から３’方向、すなわち表されたヌクレオチド配列の反対方向に読み取ることによって、表されたヌクレオチド配列から誘導され得る。これには、ＤＮＡ／ＲＮＡの合成類似体（例えば、２’Ｆ－ＡＮＡオリゴ）も含まれる。

「相同性」または「同一性」という用語は、相補性の程度を指す。オリゴヌクレオチド配列と標的ＲＮＡまたはＤＮＡの補完配列との間に部分的な相同性または完全な配列同一性があり得る。部分的に同一の配列は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡと少なくとも部分的にハイブリダイズし、部分的なヘテロ二重鎖の形成および標的ＲＮＡまたはＤＮＡの部分的または全体的な分解をもたらすオリゴヌクレオチドである。完全に同一の配列は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡと完全にハイブリッド形成し、完全なヘテロ二本鎖の形成および標的ＲＮＡまたはＤＮＡの部分的または完全な分解をもたらすオリゴヌクレオチドである。

特定の実施形態では、ＡＯＮは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に形成されたヘテロ二本鎖が細胞ヌクレアーゼの作用およびインビボで起こり得る他の分解様式に耐えるのに十分に安定である限り、標的配列に１００％相補的であり得るか、または例えばバリアントを適応させるためにミスマッチを含み得る。したがって、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に、約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有し得る。

ミスマッチは、存在する場合、典型的には、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって中央よりも不安定化が少ない。許容されるミスマッチの数は、十分に理解されている二重鎖安定性の原理に従って、オリゴヌクレオチドの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対のパーセンテージ、および二重鎖中のミスマッチ（複数可）の位置に依存する。そのようなＡＯＮは、必ずしも標的配列に１００％相補的ではないが、標的配列に安定的かつ特異的に結合することが有効であり、その結果、標的プレＲＮＡへの切断因子結合がモジュレートされる。

ＡＯＮと標的配列との間に形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍおよび細胞の酵素的切断に対する二重鎖の感受性の関数である。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴヌクレオチドのＴｍは、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８５）、１０７－１０８に記載されているものなど、またはＭｉｙａｄａ Ｃ．Ｇ．およびＷａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．、（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、９４～１０７に記載されているような従来の方法によって測定され得る。特定の実施形態では、ＡＯＮは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温より高い、好ましくは約４５℃または５０℃より高い結合Ｔｍを有し得る。６０～８０℃またはそれを超える範囲のＴｍも含まれる。

バリアントの更なる例としては、配列番号１～６６のいずれかの全長にわたって、約または少なくとも約７０％の配列同一性または相同性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または相同性を有するＡＯＮが挙げられる。

好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡのエクソン３内の適切な配列を補完し、エクソンのスキッピングを誘導するように設計される。

別の好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、エクソン２内の適切な配列を補完するように設計される。

好ましくは、提供されるのは、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子転写物またはその一部においてエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的部位に結合することができるＡＯＮである。一態様では、ＡＯＮは、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン２または３のスキッピングを誘導する。最も好ましくは、ＡＯＮは、エクソン３のスキッピングを誘導する。

別の実施形態では、ＡＯＮは、ポリアデニル化シグナルを遮断することによってＰＡ１の使用を立体的に阻害することによって、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する。理論に束縛されるものではないが、ＴＡＲＤＢＰ転写物は、選択的スプライシングおよびいくつかのポリアデニル化シグナル（ＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ４）の使用によって自己調節される（Ｋｏｙａｍａら、２０１６に記載されているように）。ＴＤＰ４３が核に豊富にある場合、ＴＤＰ４３は転写物の３－ＵＴＲ中の位置に結合することができる（イントロン７）。これが、ＰＡ１の使用を遮断し、ＰＡ４またはＰＡ２の使用を誘発する。これが起こると、イントロン７のアクセプター部位が転写物中に残り、イントロン７が転写物からスプライスされ、イントロン６および８からの後続のスプライシングを引き起こす。得られた転写物（ＩＩまたはＩＩＩ）は、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構の対象となる。少量のスプライシングされていない転写物も残っていてもよく、核内に保持される。ＴＤＰ４３が核から枯渇し、イントロン７に結合できない場合、ＰＡ１が使用される。Ｉｎｔ７アクセプター部位は、ＰＡ１の下流にあるので転写物中には残存しない。この転写物（Ｉ）は、タンパク質に翻訳される。転写物の概略図を図１に見ることができる。したがって、ポリアデニル化シグナルを遮断することによってＰＡ１の使用を立体的に阻害するＡＯＮは、翻訳された転写物（Ｉ）の減少および非翻訳転写物（ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）の増加をもたらし得る。

ＡＯＮは、好ましくは表１または表２に示すものから選択される。例えば、本発明で使用されるＡＯＮは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４および配列番号２５を含むリストから選択される。最も好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１６または２５を含むリストから選択される。

別の好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン１の潜在性エクソン内の適切な配列を補完するように設計される。３つのエンハンサー部位ホットスポットを標的とするＡＯＮを用いたオンラインスプライス予測ツールによって予測されるスプライシングエンハンサーの結合を阻害する部位を選択した。スプライシングエンハンサーの結合が低減すると、スプライソソームによるエクソンの認識が低減し、潜在性エクソンが成熟ｍＲＮＡ転写物から排除される。これは、潜在性エクソンを含まない成熟ＳＴＭＮ２転写物が翻訳されるときに産生されるスタスミン－２のレベルの増加をもたらすであろう。

Ｂ．使用方法
本発明は更に、ＴＤＰ４３の発現を阻害する方法を提供し、方法は、
（ａ）本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮを提供するステップと、
（ｂ）オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップと、を含む。

より具体的には、ＡＯＮは、表１または表２に示すものから選択されてもよい。配列は、好ましくは、配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８、およびそれらの組み合わせまたはカクテルのうちのいずれか１つまたはそれを超えるものからなる群から選択される。これには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、そのような配列にハイブリダイズすることができる配列、それに相補的な配列、修飾塩基を含む配列、修飾骨格、およびＴＡＲＤＢＰ遺伝子転写物中のＲＮＡプロセシング活性を保有またはモジュレートするその機能的な短縮化（truncation）または伸長が含まれる。

好ましくは、本発明で使用されるＡＯＮは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４および配列番号２５を含むリストから選択される。最も好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１６または２５を含むリストから選択される。

１つの好ましい実施形態では、本方法において使用されるＡＯＮは、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する。一態様では、ＡＯＮは、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導することによって選択的スプライシングを誘導する。好ましくは、ＡＯＮは、エクソン２または３のスキッピングを誘導する。最も好ましくは、ＡＯＮは、エクソン３のスキッピングを誘導する。別の実施形態では、ＡＯＮは、何らかの他の機構によってＴＤＰ４３の発現を低減させ得る。

好ましい実施形態として、ＡＯＮはまた、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６から選択され得る。本発明のこれらのＡＯＮは、イントロン１のヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ潜在性エクソン内の適切な配列を補完するように設計される。好ましい実施形態では、本発明の特定のＡＯＮは、ヒトＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン１の潜在性エクソン内の適切な配列を補完するように設計される。３つのエンハンサー部位ホットスポットを標的とするＡＯＮを用いたオンラインスプライス予測ツールによって予測されるスプライシングエンハンサーの結合を阻害する部位を選択した。スプライシングエンハンサーの結合が低減すると、スプライソソームによるエクソンの認識が低減し、潜在性エクソンが成熟ｍＲＮＡ転写物から排除される。これは、潜在性エクソンを含まない成熟ＳＴＭＮ２転写物が翻訳されるときに産生されるスタスミン－２のレベルの増加をもたらすであろう。

以下を組み合わせた治療戦略：（１）ＴＤＰ４３発現を低減させるように設計されたＡＯＮ（配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８）；（２）スタスミン－２のその後の下方調節を防止または低減するように設計されたＡＯＮ（配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６）は、細胞質ＴＤＰ４３過剰発現の影響を低減させ、同時にスタスミン－２枯渇によって引き起こされるニューロンの脆弱性から保護するだろう。一態様では、本発明は、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持しながら、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に罹患している対象においてＴＤＰ４３タンパク質症を改善するための手段を提供しようとする。

好ましくは、スタスミン－２のその後の下方調節を防止するように設計されたＡＯＮは、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６のリストから選択され、またはより好ましくは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７から選択される。
標的配列および選択的ハイブリダイゼーション

オリゴマーおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的結合が生じるような十分な程度の相補性または対合を示すために使用される用語である。ＡＯＮの配列は、明確にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列の配列に１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解されている。ＡＯＮは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡ産物の正常な機能を妨害する場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下で、およびインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で、非標的配列へのＡＯＮの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。

選択的ハイブリダイゼーションは、低、中または高ストリンジェンシー条件下であり得るが、好ましくは高ストリンジェンシー下である。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、塩基組成、相補鎖の長さおよびハイブリダイゼーション核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒などの条件によって影響されることを認識する。ストリンジェントな温度条件は、一般に、３０℃を超える、典型的には３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃～８０℃またはそれを超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの尺度よりもはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０）である。したがって、本発明のＡＯＮは、表１または表２に提供される配列に選択的にハイブリダイズするオリゴマーを含み得る。

所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対するＡＯＮの「近くの」または「実質的な」相補性で、並びに正確な相補性で起こり得る。

典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーのヌクレオチドと一続きの少なくとも約１４ヌクレオチドにわたって少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％または９９％の同一性がある場合に起こる。記載されるように、相同性比較の長さは、より長い範囲（longer stretches）にわたる場合があり、特定の実施形態では、多くの場合、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２０、多くの場合少なくとも約２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７または２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１または３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドにわたる。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＡＯＮ配列は、本明細書の配列表に示される配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９または９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９１、９２、９３、９４または９５％、より好ましくは少なくとも９６、９７、９８％または９９％の相同性がある。一般に、アンチセンスオリゴマーの長さが短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るために必要な相同性は大きくなる。結果として、本発明のＡＯＮが約３０個未満のヌクレオチドからなる場合、パーセンテージ同一性は、本明細書の配列表に記載のＡＯＮと比較して７５％超、好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、９６、９７、９８％または９９％超であることが好ましい。ヌクレオチド相同性比較は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＢｅｓｔｆｉｔプログラムまたはＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２、３８７～３９５）などの配列比較プログラムによって行うことができる。このようにして、本明細書に引用したものと類似または実質的に異なる長さの配列を、アラインメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。

本発明のＡＯＮは、低減された相同性の領域、および標的配列と正確な相同性の領域を有し得る。オリゴマーがその全長にわたって正確な相同性を有する必要はない。例えば、オリゴマーは、標的配列と同一の連続する一続きの少なくとも４または５塩基、好ましくは標的配列と同一の連続する一続きの少なくとも６または７塩基、より好ましくは標的配列と同一の連続する一続きの少なくとも８または９塩基を有し得る。オリゴマーは、標的配列と同一の一続きの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６塩基を有し得る。オリゴマー配列の残りの範囲は、標的配列と断続的に同一であり得る。例えば、残りの配列は、同一の塩基と、その後に続く非同一の塩基と、その後に続く同一の塩基とを有し得る。あるいは（または同様に）、オリゴマー配列は、完全な相同性未満の範囲が散在するいくつかのストレッチの同一の配列（例えば、３、４、５または６塩基）を有し得る。そのような配列ミスマッチは、好ましくは、切断修飾活性の喪失を有さないかまたはほとんど有さない。

生理学的応答
一態様では、本発明の方法は、対象において生理学的応答を誘導する。好ましくは、この方法は、ＴＤＰ４３の発現を低減させる。

「モジュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「モジュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」という用語は、必要に応じて定義された量および／または統計的に有意な量によって、１つまたはそれを超える定量可能なパラメータを「増加させる」または「減少させる」ことを含む。用語「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増加させること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」または「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」または「刺激すること（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」は、一般に、ＡＯＮなしまたは対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きな生理学的応答（すなわち、下流効果）を生じさせるまたは引き起こす１つまたは複数のＡＯＮ若しくは組成物の能力を指す。

「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増加させること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」または「刺激すること（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」とは、一般に、１つまたは複数のアンチセンス化合物若しくは組成物が、アンチセンス化合物なしまたは対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きな生理学的応答（すなわち、下流効果）を生成または引き起こす能力を指す。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、アンチセンス化合物なし（薬剤の非存在）または対照化合物によって生成された量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれを超える（例えば、５００倍、１０００倍）（１の間および１より大きいすべての整数および小数点を含む）、例えば１．５、１．６、１．７、１．８倍など）の増加を含み得る。

「減少すること（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語は、一般に、ＡＯＮまたは対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象におい低減した生理学的応答（すなわち、下流効果）を生成または引き起こす１つまたは複数のＡＯＮ若しくは組成物の能力を指す。「低減する」または「阻害する」という用語は、一般に、診断分野における日常的な技術に従って測定した場合に、関連する生理学的または細胞応答、例えば本明細書に記載の疾患または状態の症状を「減少させる」本発明の１つまたはそれを超えるアンチセンス化合物の能力に関することができる。関連する生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者に明らかであり、ＴＤＢ－４３関連状態の症状または病理の低減を含み得る。応答の「減少」は、アンチセンス化合物なしまたは対照組成物によって生成される応答と比較して統計的に有意であってよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含んでよく、その間のすべての整数を含む。

関連する生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者には明らかであり、ＴＤＰ４３発現量の減少を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には統計学的に有意な量であり、ＡＯＮなし（薬剤の非存在）または対照化合物によって生成された量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれを超える（例えば、５００倍、１０００倍）（１の間および１より大きいすべての整数および小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８を含む）増加を含み得る。「低減する」または「阻害する」という用語は、一般に、診断分野における日常的な技術に従って測定した場合に、関連する生理学的または細胞応答、例えば本明細書に記載の疾患または状態の症状を「減少させる」本発明の１つまたはそれを超えるＡＯＮまたは組成物の能力に関することができる。関連する生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者には明らかであり、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＬＤ、ＡＤなど）の症状または病理の低減を含み得る。応答の「減少」は、ＡＯＮなしまたは対照組成物によって生成される応答と比較して統計的に有意であってよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含んでよく、その間のすべての整数を含む。

関連する生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者に明らかであり、スタスミン－２発現の量を維持することを含んでよく、スタスミン－２の下方調節を防止することを含む。量を「維持すること」は、典型的には統計学的に有意な量であり、減少していないスタスミン－２レベルを含み得る。好ましくは、スタスミン－２のレベルは減少しておらず、減少は、ＡＯＮなし（薬剤の非存在）または対照化合物によって生成されたスタスミン－２の量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれ未満（例えば、５００倍、１０００倍）である（１の間および１より大きいすべての整数および小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８を含む）。好ましくは、スタスミン－２発現は、診断分野における日常的な技術に従って測定される場合、本明細書中に記載されるＡＬＳ、ＦＴＬＤ、ＡＤなどの疾患または状態の症状をもたらす有害な関連する生理学的応答または細胞応答を引き起こすレベルまで低減していない。一実施形態では、ＳＴＭＮ２ ＡＯＮの投与後、スタスミン－２発現が増加する。更なる実施形態では、ＳＴＭＮ２ ＡＯＮの投与後、更なる枯渇を防止する前またはＴＤＰ４３ ＡＯＮによって引き起こされる枯渇を防止する前に、スタスミン－２発現が増加する。

修飾ＡＯＮ
いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、天然に存在する核酸分子の化学組成を有する、すなわち、ＡＯＮは、修飾または置換された塩基、糖、またはサブユニット間結合を含まない。

好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、天然に存在しない核酸分子または「オリゴヌクレオチド類似体」である。例えば、天然に存在しない核酸は、１つまたはそれを超える非天然の塩基、糖、および／またはサブユニット間結合、例えば、天然に存在する核酸分子に見られるものに対して修飾または置換された塩基、糖、および／または結合を含み得る。例示的な修飾を以下に説明する。いくつかの実施形態では、天然に存在しない核酸は、２種類以上の修飾、例えば、糖および塩基修飾、糖および結合修飾、塩基および結合修飾、または塩基、糖および結合修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、非天然（例えば、修飾または置換）塩基を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、非天然（例えば、修飾または置換）糖を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、非天然（例えば、修飾または置換）サブユニット間結合を含む。いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、２種類以上の修飾または置換、例えば、非天然塩基および／または非天然糖、および／または非天然サブユニット間結合を含む。

したがって、（ｉ）修飾された骨格構造、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、および／または（ｉｉ）修飾された糖部分、例えば、リボースまたはデオキシリボース部分ではなくモルホリノ部分を有する非天然ＡＯＮが、含まれる。オリゴヌクレオチド類似体は、ワトソン・クリック型塩基対合によって標準的なポリヌクレオチド塩基に水素結合することができる塩基を支持し、ここで、類似体骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間の配列特異的様式でのそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。好ましい類似体は、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するものである。

ＡＯＮを産生するための１つの方法は、２’ヒドロキシリボース位置のメチル化であり、ホスホロチオエート骨格の組み込みは、ＲＮＡに表面的に類似するがヌクレアーゼ分解に対してはるかに耐性である分子を産生するが、本発明の当業者は、本発明の目的で使用可能であり得る適切な骨格の他の形態を認識している。

アンチセンスオリゴマーとの二重鎖形成中のプレＲＮＡの分解を回避するために、本方法で使用されるＡＯＮは、内因性Ｒｎａｓｅ Ｈによる切断を最小化または防止するように適合され得る。Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化しないアンチセンス分子は、公知の技術（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号）に従って作製することができる。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列であり得るそのようなアンチセンス分子は、オリゴヌクレオチドをその１つのメンバーとして含む二重鎖分子へのＲｎａｓｅ Ｈの結合を、立体的に邪魔または防止する任意の構造修飾を単に含み、その構造修飾は、二重鎖形成を実質的に邪魔または妨害しない。二重鎖形成に関与するオリゴヌクレオチドの部分は、Ｒｎａｓｅ Ｈの結合に関与する部分とは実質的に異なるので、Ｒｎａｓｅ Ｈを活性化しない多数のアンチセンス分子が利用可能である。細胞内またはＲｎａｓｅ Ｈを含有する粗抽出物中の非メチル化オリゴマーによるＲＮＡの処理は、プレｍＲＮＡ：ＡＯＮ二重鎖の分解をもたらすので、この特性は非常に好ましい。このような分解を回避することができるか、または誘導しない任意の形態の修飾ＡＯＮを本方法で使用することができる。ヌクレアーゼ耐性は、部分不飽和脂肪族炭化水素鎖と、カルボン酸基、エステル基、およびアルコール基を含む１つまたはそれを超える極性基または荷電基と、を含むように、本発明のＡＯＮを修飾することによって達成され得る。

ＲＮＡと二重鎖化した場合に、細胞Ｒｎａｓｅ Ｈによって切断されないＡＯＮの例は、２’－Ｏ－メチル誘導体である。そのような２’－Ｏ－メチル－オリゴリボヌクレオチドは、細胞環境および動物組織において安定であり、ＲＮＡとのそれらの二重鎖は、それらの対応するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドよりも高いＴｍ値を有する。あるいは、本発明のヌクレアーゼ耐性ＡＯＮは、少なくとも１つの最後の３’末端ヌクレオチドがフッ素化されていてもよい。更に代替的には、本発明のヌクレアーゼ耐性ＡＯＮは、最後の３末端ヌクレオチド塩基の少なくとも２つの間に結合するホスホロチオエート結合を有し、好ましくは最後の４つの３’末端ヌクレオチド塩基の間に結合するホスホロチオエート結合を有する。

ＲＮＡ切断の減少はまた、選択的オリゴヌクレオチド化学（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号）を用いて達成され得る。例えば、ＡＯＮは、ホスホロアミダートまたはホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマー（ＰＭＯ）；ＰＭＯ－Ｘ；ＰＰＭＯ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロックド核酸（ＬＮＡ）およびアルファ－Ｌ－ＬＮＡ、２’－アミノＬＮＡ、４’－メチルＬＮＡ、および４’－Ｏ－メチルＬＮＡを含む誘導体；エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）およびその誘導体；ホスホロチオエートオリゴマー；トリシクロ－ＤＮＡオリゴマー（ｔｃＤＮＡ）；トリシクロホスホロチオエートオリゴマー；２’－Ｏ－メチル修飾オリゴマー（２’－Ｏｍｅ）；２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）；２’－フルオロ、２’－フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）；ロック解除された核酸（ＵＮＡ）；ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；２’－アミノ（２’－ＮＨ２）；２’－Ｏ－エチレンアミン、またはミックスマーまたはギャップマーとしての上記の任意の組み合わせを含むリストから選択されてもよい。ＰＭＯの主な利点は、安全性プロファイルの向上である。それらの中性電荷は、血小板活性化および免疫活性化の低下を伴うタンパク質相互作用の影響を受けにくくする。これはまた、ヌクレアーゼによる分解を低減する。それらはまた、５年超にわたってＤＭＤ患者において安全に使用されてきた。

一態様では、本発明の修飾ＡＯＮを、ペプチドにコンジュゲートさせることができる。好ましくは、ＡＯＮはＰＰＭＯ、すなわち、アミド、マレイミドまたはクリックケミストリーを介して（好ましくは、例えばシクロオクチン結合を介して銅を含まないクリックケミストリーを使用する）ペプチド部分に化学的にコンジュゲートされたＰＭＯオリゴヌクレオチドであり、切断可能またはｐＨ感受性リンカーなどの適切なリンカーを含む。ペプチド部分は、３’末端または５’末端のいずれかを介して結合され得る。最も好ましくは、ペプチド部分は、ＡＯＮが細胞を透過して核に到達する能力を改善することができるペプチドである。例えば、ペプチド部分は、アルギニンに富むペプチド、カチオン性ペプチド、および／または生物多様性微生物のゲノムに由来するペプチドのライブラリから選択されるペプチドであり得る（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、８、１、１２５３８）。ペプチドは、非天然アミノ酸および／または化学修飾アミノ酸を含んでも含まなくてもよい。

細胞透過性ペプチドは、細胞取り込みおよび核局在化を増強するためにホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーに付加されている。Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１６（９）、１６２４－１６２９に示されているように、細胞透過性ペプチドは、取り込み効率と標的組織特異性に影響を与えることが示されている。「細胞透過性ペプチド」および「ＣＰＰ」という用語は互換的に使用され、輸送ペプチド、担体ペプチド、またはペプチド形質導入ドメインとも呼ばれるカチオン性細胞透過性ペプチドを指す。ペプチドは、本明細書に示されるように、所与の細胞培養集団の細胞の１００％以内に細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与の際にインビボで複数の組織内での高分子移行を可能にする。ペプチドはまた、組織または器官への局在化送達後に細胞取り込みを増強することができる。

送達効力を更に改善するために、上記修飾ヌクレオチドは、多くの場合、脂肪酸／脂質／コレステロール／アミノ酸／炭水化物／多糖類／ナノ粒子などと糖または核酸塩基部分にコンジュゲートされる。これらのコンジュゲートされたヌクレオチド誘導体を使用してＡＯＮを構築して、エクソンスキッピングを誘導することもできる。ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子転写物のアンチセンスオリゴマー誘導性選択的スプライシングは、ホスホロチオエート骨格上のオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ、２’－Ｏｍｅまたは２’－ＭＯＥ修飾塩基を使用することができる。２’－Ｏｍｅ ＡＯＮはオリゴ設計のために使用されるが、カチオン性リポプレックスとして送達された場合のそれらのインビトロでの効率的な取り込みのために、これらの化合物はヌクレアーゼ分解を受けやすく、インビボまたは臨床用途にとって理想的であるとは考えられていない。代替化学物質を使用して本発明のＡＯＮを生成する場合、本明細書で提供される配列のウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）で置き換えられ得る。

例えば、そのようなアンチセンス分子は、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つのまたは全部が修飾ホスフェート、例えば、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよび蛍光体アミデートであるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、記載されるようにヌクレオチド間架橋リン酸残基の１つおきが、修飾され得る。別の非限定的な例では、そのようなアンチセンス分子は、ヌクレオチドの少なくとも１つまたは全部が２’低級アルキル部分（例えば、Ｃｉ－Ｃ４、直鎖または分枝した飽和若しくは不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニルおよびイソプロピル）を含む分子である。例えば、記載されるようにヌクレオチドの１つおきが、修飾され得る。

本発明において有用なＡＯＮの具体例としては、修飾骨格または非天然サブユニット間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を有しないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。

他のアンチセンス分子では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が新規な基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。

修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたはそれを超える置換された糖部分を含有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含み得る。修飾または置換された塩基を含有するオリゴヌクレオチドには、核酸中に最も一般的に見られる１つまたはそれを超えるプリンまたはピリミジン塩基が、あまり一般的でないまたは非天然の塩基で置き換えられているオリゴヌクレオチドが含まれる。

プリン塩基は、イミダゾール環に縮合したピリミジン環を含む。アデニンおよびグアニンは、核酸に最も一般的に見られる２つのプリン核酸塩基である。これらは、Ｎ_６－メチルアデニン、Ｎ_２－メチルグアニン、ヒポキサンチン、および７－メチルグアニンを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するプリンで置換されてもよい。

ピリミジン塩基は６員ピリミジン環を含む。シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸に最も一般的に見られるピリミジン塩基である。これらは、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウラシル、および４－チオウラシルを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するピリミジンで置換されてもよい。１つの実施形態では、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。

他の修飾または置換塩基としては、限定されないが、２，６－ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン（agmatidine）、リシジン、２－チオピリミジン（例えば、２－チオウラシル、２－チオチミン）、Ｇ－クランプおよびその誘導体、５－置換ピリミジン（例えば、５－ハロウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－アミノメチルウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－アミノメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ）、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－アザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ Ｇ、Ｓｕｐｅｒ ＡおよびＮ４－エチルシトシン、若しくはそれらの誘導体；Ｎ_２－シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ－Ｇ）、Ｎ_２－シクロペンチル－２－アミノプリン（ｃＰｅｎｔ－ＡＰ）およびＮ_２－プロピル－２－アミノプリン（Ｐｒ－ＡＰ）、プソイドウラシル若しくはそれらの誘導体；縮重塩基若しくはユニバーサル塩基、例えば２，６－ジフルオロトルエン、若しくは塩基が存在しない、例えば無塩基部位（例えば、１－デオキシリボース、１，２－ジデオキシリボース、１－デオキシ－２－Ｏ－メチルリボース；または環酸素が窒素で置き換えられたピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられる。Ｓｕｐｅｒ Ａ、Ｓｕｐｅｒ ＧおよびＳｕｐｅｒ Ｔの誘導体の例は、米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見出すことができる。ｃＰｅｎｔ－Ｇ、ｃＰｅｎｔ－ＡＰおよびＰｒ－ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれると免疫刺激効果を低減させることが示された（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１、１３３、９２００）。プソイドウラシルは、ウリジンのような通常のＮ－グリコシドではなくＣ－グリコシドを有する、ウラシルの天然に存在する異性化バージョンである。プソイドウリジン含有合成ｍＲＮＡは、ウリジン含有ｍＰｖＮＡと比較して改善された安全性プロファイルを有し得る（国際公開第２００９１２７２３０号参照）。

特定の修飾または置換された核酸塩基は、本発明のＡＯＮの結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており、現在好ましい塩基置換であり、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合は更により好ましい。

いくつかの実施形態では、修飾または置換された核酸塩基は、ＡＯＮの精製を容易にするために有用である。例えば、特定の実施形態では、ＡＯＮは、３つまたはそれを超える（例えば、３、４、５、６またはそれを超える）連続するグアニン塩基を含み得る。特定のＡＯＮでは、一連の３つまたはそれを超える連続するグアニン塩基がオリゴヌクレオチドの凝集をもたらし、精製を複雑にする可能性がある。このようなＡＯＮでは、連続するグアニンの１つまたはそれより多くをイノシンで置換することができる。一連の３つまたはそれを超える連続するグアニン塩基における１つまたはそれを超えるグアニンに対するイノシンの置換は、ＡＯＮの凝集を低減させ、それによって精製を容易にすることができる。

一実施形態では、ＡＯＮの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１つまたはそれを超える部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを含む。そのような部分には、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－３６グリセロール－３－Ｈ－ホスホネート(di-hexadecyl-rac-glycerol or triethylammonium 1 ,2-di-O-hexadecyl-rac-36lycerol-3-H-phosphonate)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。

所与の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、上述の修飾の２つ以上が単一の化合物またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。本発明には、キメラ化合物であるＡＯＮも含まれる。本発明の文脈における「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成される２つまたはそれを超える化学的に異なる領域を含むアンチセンス分子、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および標的核酸に対する結合親和性の増加のための追加の領域を付与するように、オリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも１つの領域を含む。

本発明に従って使用されるアンチセンス分子は、固相合成の周知の技術によって都合よく日常的に作製され得る。そのような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）を含むいくつかのベンダーによって販売されている。修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。

別の非限定的な例では、そのようなＡＯＮは、ヌクレオチドの少なくとも１つのまたは全部が２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ_１－Ｃ_４、直鎖または分枝した飽和若しくは不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニルおよびイソプロピル）を含む分子である。例えば、記載されるようにヌクレオチドの１つおきが、修飾され得る。

上記のＡＯＮは本発明のＡＯＮの好ましい形態であるが、本発明は、以下に記載されるようなオリゴマー模倣物を含むがこれらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス分子を含む。

別の好ましい化学物質は、任意の既知のヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって分解されないホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマー（ＰＭＯ）オリゴマー化合物である。これらの化合物は非荷電であり、ＲＮＡ鎖に結合したときにＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化せず、インビボ投与後に持続的な切断因子結合モジュレーションを発揮することが示されている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９７；７、１８７－１９７）。好ましくは、本発明のＡＯＮはホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマーである。

修飾オリゴマーはまた、１つまたはそれを超える置換された糖部分を含んでもよい。オリゴマーはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含み得る。特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、更により詳細には、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのピリミジン塩基は、５－置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される。一実施形態では、５－置換ピリミジン塩基は５－メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのプリン塩基は、Ｎ－２、Ｎ－６置換プリン塩基を含む。一実施形態では、Ｎ－２、Ｎ－６置換プリン塩基は、２，６－ジアミノプリンである。

一実施形態では、ＡＯＮは、単独で、または２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾などの別の修飾と組み合わせて、１つまたはそれを超える５－メチルシトシン置換を含む。更に別の実施形態では、ＡＯＮは、単独でまたは別の修飾と組み合わせて、１つまたはそれを超える２，６－ジアミノプリン置換を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＯＮは、ＡＯＮの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する、ポリエチレングリコール部分などの１つまたはそれを超える部分、またはアルギニンに富む細胞透過性ペプチドなどのコンジュゲートに化学的に結合される。例示的な一実施形態では、アルギニンに富むポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端残基において、アンチセンス化合物の３’または５’末端に共有結合している。また、例示的な実施形態では、アンチセンス化合物は、モルホリノサブユニットと、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間結合とから構成される。

別の態様では、本発明は、上記のＡＯＮ、例えば配列番号１～６６のＡＯＮを組み込んだ発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどの修飾レトロウイルスまたは非レトロウイルスベクターである。
ＡＯＮの活性を測定するためのアッセイ

ＡＯＮおよびそのバリアントの活性は、当技術分野における日常的な技術に従ってアッセイすることができる。例えば、調査されたＲＮＡおよびタンパク質のアイソフォーム形態および発現レベルは、アイソフォームおよび／または転写された核酸若しくはタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評価され得る。そのような方法の非限定的な例としては、ＲＮＡのアイソフォームのＲＴ－ＰＣＲとそれに続くＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸ハイブリダイゼーション法、例えばノーザンブロットおよび／または核酸アレイの使用；細胞内のＲＮＡ転写物を検出するための蛍光インサイツハイブリダイゼーション；核酸増幅方法；タンパク質を検出するための免疫学的方法；タンパク質精製方法；およびタンパク質機能または活性アッセイが挙げられる。

ＲＮＡ発現レベルは、細胞、組織または生物からＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写ポリヌクレオチド）を調製することによって、およびＲＮＡ／ｃＤＮＡをアッセイされた核酸またはその断片の相補体である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって評価することができる。ｃＤＮＡは、必要に応じて、相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、様々なポリメラーゼ連鎖反応またはインビトロ転写法のいずれかを使用して増幅され得る。好ましくは、増幅されない。１つまたはそれを超える転写物の発現は、転写物の発現レベルを評価するために定量的ＰＣＲを使用して検出することもできる。

ＡＯＮの製造方法
本発明に従って使用されるＡＯＮは、固相合成の周知の技術によって好都合に作製され得る。そのような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）を含むいくつかのベンダーによって販売されている。修飾固体支持体上でオリゴマーを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。

追加的または代替的に、当技術分野で公知のそのような合成のための任意の他の手段を使用することができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴマーを調製するために同様の技術を使用することは周知である。そのような自動化された一実施形態では、ジエチル－ホスホロアミダイトが出発材料として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅ，ら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９－１８６２に記載されているように合成され得る。

本発明のＡＯＮはインビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンスオリゴマーのインビボ合成を指示するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。本発明の分子はまた、取り込み、分布および／または吸収を補助するために、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造物または化合物の混合物と混合、封入、コンジュゲート化または他の方法で会合されてもよい。
ベクター

本発明のオリゴマーのＴＡＲＤＢＰ標的化配列を発現することができるベクター送達系、例えば本明細書に記載の配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８のうちの１つまたはそれを超えるいずれかを含むポリヌクレオチド配列を発現するベクターも含まれる。

本明細書に記載の配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６のうちの１つまたはそれを超えるいずれかを含むポリヌクレオチド配列を発現するベクターなど、本発明のオリゴマーＳＴＭＮ２標的化配列を発現することができるベクター送達系も含まれる。

「ベクター」または「核酸構築物」とは、ポリヌクレオチドが挿入またはクローニングされ得るポリヌクレオチド分子、好ましくは例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは、１つまたはそれを超えるユニークな制限部位を含有し、クローン化配列が再現可能であるように、標的細胞若しくは組織またはその前駆細胞若しくは組織を含む定義された宿主細胞において自律複製することができ、または定義された宿主のゲノムと一体化することができる。

したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖または閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含むことができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）とともに複製されるものであり得る。

Ｃ．処置方法
本発明のＡＯＮはまた、疾患の処置の目的で利用され得る予防的または治療的なものとして使用することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と混合され、治療有効量で、本明細書に記載のＴＡＲＤＢＰの発現を低減させるために、ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡ中の選択された標的に結合するＡＯＮを提供する。

ＴＤＰ４３は細胞質で産生され、核に移入される。細胞質中のＴＤＰ４３の凝集は、核輸送のためのＴＤＰ４３の利用可能性を枯渇させる可能性があり、その結果、自己調節が起こり、ＴＡＲＤＢＰ ｍＲＮＡの上方調節が引き起こされ、ＴＤＰ４３が増加する可能性がある。理論に束縛されるものではないが、本発明のＡＯＮの投与によってＴＡＲＤＢＰ ｍＲＮＡの発現を減少させると、凝集体中に蓄積されるよりも多くのＴＤＰ４３が輸送に利用可能であると予想されるので、凝集体中のＴＤＰ４３の低減、したがってＴＤＰ４３核輸送の改善がもたらされ得る。

「有効量」または「治療有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部としてのいずれかが哺乳動物対象に投与された、所望の治療効果をもたらすのに有効な治療化合物、例えばアンチセンスオリゴマーの量を指す。

したがって、本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬、予防用組成物または治療用組成物を提供し、組成物は、
ａ）本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮと、
ｂ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む。

好ましくは、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患は、ＡＬＳ、ＦＴＬＤまたはＡＤである。

ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための方法が提供され、方法は、有効量の１つまたはそれを超えるＡＯＮまたは本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮを含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む。

本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための方法を提供し、方法は有効量の１つまたはそれを超えるＡＯＮまたは本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮを含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む。

ＡＬＳの影響を処置するため、防止するため、または改善するための方法もまた提供され、方法は、有効量の１つまたはそれを超えるＡＯＮまたは本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮを含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む。

本発明の方法は、ＴＤＰ４３タンパク質症およびそれらの症状に関連する疾患を処置、予防またはその進行を遅らせるための更なる処置と組み合わせて投与することができる。更なる処置には、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に関連する他の標的に向けられるＡＯＮが含まれ得る。例えば、追加の処置は、ＳＯＤ１に向けられるＡＯＮを含むことができる。

更なる態様では、遺伝子または他のバイオマーカーを使用して、本発明のＡＯＮを介してＴＤＰ４３抑制に良好に応答する可能性が最も高い患者を同定することができる。ＡＬＳ疾患リスクに関連する遺伝子構造バリエーションが、ＡＬＳ遺伝子および周囲の遺伝子領域内で同定されている。これらのバリエーションは、本発明の方法に応答する可能性がある患者を同定するための遺伝子バイオマーカーとして使用することができる。非遺伝子バイオマーカーを使用して、本発明の方法に応答する可能性がある患者を同定することもできる。短縮型ＳＴＭＮ２はまた、ＦＴＤにおけるＴＤＰ４３病理のマーカーであることが見出されている（Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０２０ １３０（１１）：６０８０－６０９２）。好ましくは、バイオマーカーは、短縮型ＳＴＭＮ２の形態である。

本発明は、バイオマーカーによって同定される対象におけるＡＬＳ、ＦＴＬＤまたはＡＤの影響を処置、予防または改善するための方法を提供し、方法が、
ａ）ＴＤＰ４３抑制に応答する可能性があるＡＬＳ患者に関連するバイオマーカーの存在について対象を試験するステップと、
ｂ）対象がバイオマーカーを発現することが判明した場合、有効量の１つまたはそれを超えるＡＯＮまたは本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮを含む医薬組成物を、対象に投与するステップと、を含む。

ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための、本明細書に記載の精製および単離されたＡＯＮの使用も本明細書で提供される。

ＡＬＳ、ＦＴＬＤまたはＡＤの影響を処置、予防または改善するための、本明細書中に記載されるような精製および単離されたＡＯＮの使用もまた、本明細書中に提供される。

好ましくは、本発明で使用されるＡＯＮは、表１若しくは表２に提供されるＡＯＮのリストから選択され、またはより好ましくは配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４若しくは配列番号２５から選択される。

本発明はまた、（１）ＴＤＰ４３発現を低下させるように設計されたＡＯＮ（配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８）；（２）スタスミン－２枯渇によって引き起こされるニューロン脆弱性から保護しながら、細胞質ＴＤＰ４３過剰発現の影響を低減するために、その後のスタスミン－２（配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６）の下方調節を防止するように設計されたＡＯＮの組み合わせを含む処置方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に罹患している対象において、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するかまたはその下方調節を低減させながら、ＴＤＰ４３タンパク質症を改善するための手段を提供しようとする。

好ましくは、スタスミン－２のその後の下方調節を防止するように設計されたＡＯＮは、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６のリストから選択され、またはより好ましくは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７から選択される。

組成物は、約１ｎＭ～１０００μＭのそれぞれの本発明の所望のアンチセンスオリゴマー（複数可）を含み得る。好ましくは、組成物は、約１μＭ～５００μＭ、１０μＭ～５００μＭ、５０μＭ～７５０μＭ、１０μＭ～５００μＭ、１μＭ～１００μＭ、１μＭ～５０μＭ、好ましくは２５μＭ～１００μＭの間の本発明のアンチセンスオリゴマー（複数可）をそれぞれ含み得る。組成物はまた、好ましくは約１ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～７５０ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、最も好ましくは５０ｎＭ～１００ｎＭの間の本発明のアンチセンスオリゴマー（複数可）をそれぞれ含み得る。

組成物は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭまたは１０００ｎＭの本発明の所望のアンチセンスオリゴマー（複数可）をそれぞれ含み得る。

本発明は更に、対象への送達に適した形態のＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患または病理の症状の予防的または治療的処置、予防または改善を支援するように適合された１つまたはそれを超えるＡＯＮを提供する。

「薬学的に許容され得る」という語句は、生理学的に忍容性であり、対象に投与した場合、典型的にはアレルギー反応または同様に有害反応、例えば胃の不調などを引き起こさない分子実体および組成物を指す。「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水または食塩水並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射用液剤のための担体として好ましく使用される。適切な医薬担体は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（１９９０年）に記載されている。

１つまたはそれを超えるＡＯＮを含む医薬組成物は、ある範囲の処置レジメンで対象に投与することができる。例えば、医薬組成物は、毎時、毎日３回、毎日２回、毎日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、毎週１回、２週間毎に１回、毎月１回、２ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、および毎年１回投与することができる。適切なレジメンは、処置される状態の性質に基づいて当業者によって決定され得る。

Ｄ．医薬品の製造
一実施形態では、本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための、ＴＡＲＤＢＰ ＲＮＡ中の選択された標的に結合するＡＯＮの使用を提供する。したがって、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮの使用が提供される。好ましくは、疾患はＡＬＳ、ＦＴＬＤ、ＦＴＤまたはＡＤである。

本発明は、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための、本明細書に記載されるような（according as described herein）精製および単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。

本発明はまた、ＡＬＳ、ＦＴＬＤまたはＡＤの影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための、本明細書に記載されるような精製および単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。

ＴＤＰ４３抑制に応答する可能性がある患者に関連するバイオマーカーを発現する対象において、ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための本明細書に記載の１つまたはそれを超えるＡＯＮの使用も提供される。

好ましくは、医薬品の製造のために使用されるＡＯＮは、表１若しくは２に提供されるＡＯＮのリストから選択され、またはより好ましくは配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４若しくは２５から選択される。

更なる実施形態では、本発明はまた、医薬品の製造のためのＳＴＭＮ２ ＲＮＡ中の選択された標的に結合するＡＯＮの使用を提供して、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するかまたはスタスミン－２の下方調節を低減させる。好ましくは、使用されるＡＯＮは、表１若しくは表２に提供されるＡＯＮのリストから選択され、またはより好ましくは、配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６から選択される。最も好ましくは、ＡＯＮは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７から選択される。

Ｅ．医薬組成物
本発明の形態では、治療有効量の本発明の１つまたはそれを超えるＡＯＮを、薬学的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、並びに洗剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、ポリソルベート（登録商標）８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール（Thimersol）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物またはリポソームに組み込むことができる。ヒアルロン酸を用いてもよい。そのような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １８０４２）１４３５～１７１２頁を参照のこと。組成物は、液体形態で調製されてもよく、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。

本発明に従って提供される医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得ることが理解される。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射によって、経口的に、局所的に、または肺若しくは鼻経路によって投与される。ＡＯＮは、より好ましくは、静脈内、髄腔内、動脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与経路によって送達される。適切な経路は、処置中の対象の状態に応じて、当業者によって決定され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＡＯＮが導入され得るいくつかの非限定的な部位である。直接ＣＮＳ送達を使用することができ、例えば、脳室内投与または髄腔内投与を投与経路として使用することができる。

局所投与のための製剤には、本開示のオリゴマーが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが含まれる。脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が、含まれる。局所投与または他の投与のために、本開示のオリゴマーは、リポソーム内に封入されてもよく、または特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。あるいは、オリゴマーは、脂質、特にカチオン性脂質に複合体化され得る。脂肪酸およびエステル、その薬学的に許容され得る塩、並びにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号および／または１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願番号第０９／３１５，２９８号に更に記載されている。

特定の実施形態では、本開示のＡＯＮは、経皮的方法（例えば、ＡＯＮを例えばエマルジョンに組み込むことによって、そのようなＡＯＮを必要に応じてリポソームにパッケージングする）によって送達することができる。そのような経皮およびエマルジョン／リポソーム媒介性送達方法は、当技術分野におけるＡＯＮの送達について、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号に記載されている。

本明細書に記載のＡＯＮは、植込み型デバイスを介して送達されてもよい。そのようなデバイスの設計は、当該技術分野で認識されているプロセスであり、例えば、米国特許第６，９６９，４００号明細書に記載されている合成インプラント設計を有する。

経口投与のための組成物および製剤には、粉剤・散剤（powder）または顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水若しくは非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。経口製剤は、本開示のオリゴマーが１つまたはそれを超える透過エンハンサー界面活性剤およびキレート剤と併せて投与されるものである。界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステル若しくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。胆汁酸／塩および脂肪酸並びにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示は、透過エンハンサーの組み合わせ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩を提供する。例示的な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる透過エンハンサーとしては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示のオリゴマーは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。オリゴマー複合体化剤およびその使用は、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載されている。オリゴマーの経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５，２９８号および／または米国特許出願公開第２００３００２７７８０号に詳細に記載されている。

非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤、例えば限定されないが、透過エンハンサー、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤も含有し得る滅菌水性液剤を含み得る。

治療上有用な量のＡＯＮの送達は、以前に公開された方法によって達成され得る。例えば、ＡＯＮの細胞内送達は、ＡＯＮと有効量のブロックコポリマーとの混合物を含む組成物によるものであり得る。この方法の一例は、米国特許出願公開第２００４０２４８８３３号に記載されている。ＡＯＮを核に送達する他の方法は、Ｍａｎｎ ＣＪら（２００１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、９８（１）４２－４７、およびＧｅｂｓｋｉら（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２（１５）：１８０１－１８１１に記載されている。裸のＤＮＡとして、または脂質担体に複合体化された発現ベクターによって核酸分子を細胞に導入する方法は、米国特許第６，８０６，０８４号に記載されている。

特定の実施形態では、本発明のＡＯＮおよびそれを含む治療用組成物は、経皮的方法（例えば、ＡＯＮを例えばエマルジョンに組み込むことによって、そのようなＡＯＮを必要に応じてリポソームにパッケージングする）によって送達することができる。そのような経皮およびエマルジョン／リポソーム媒介性送達方法は、当技術分野におけるＡＯＮの送達について、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号に記載されている。

ＡＯＮをコロイド分散系で送達することが望ましい場合がある。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームまたはリポソーム製剤を含む脂質ベースの系が含まれる。これらのコロイド分散系は、治療用医薬組成物の製造に使用することができる。

リポソームは人工膜小胞であり、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用である。これらの製剤は、正味のカチオン性、アニオン性または中性電荷特性を有してよく、インビトロ、インビボおよびエクスビボ送達方法に有用な特性を有し得る。大きな単層小胞は、大きな高分子を含有するかなりのパーセンテージの水性緩衝液を封入することができることが示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡを水性内部に封入し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙら、１９８１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６、７７）。

リポソームが効率的な遺伝子導入ビヒクルであるためには、以下の特徴が存在すべきである。（１）生物学的活性を損なわずに、高効率で目的のＡＯＮの封入；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞への優先的かつ実質的な結合；（３）標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の高効率での送達；（４）遺伝情報の正確かつ効果的な発現（Ｍａｎｎｉｎｏら、１９８８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６、６８２）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質と、通常ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質も使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。カチオン性リポソームは、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正に帯電したリポソームである。ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉すると考えられている。カチオン性リポソームおよび非カチオン性リポソームの両方が、ＤＮＡを細胞に送達するために使用されてきた。

リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに組み込まれた場合に、そのような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命の延長をもたらす１つまたはそれを超える特殊化された脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１つまたはそれを超える糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたはそれを超える親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソームおよびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号に更に記載されている。

ＡＯＮは、当技術分野で認識されている技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子並びにウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、並びに当技術分野で公知の他の手段）を使用して細胞に導入することができる。選択される送達方法は、少なくとも処置される細胞および細胞の位置に依存し、当業者には明らかである。例えば、リポソームを誘導するための表面上の特異的マーカーを有するリポソーム、標的細胞を含む組織への直接注射、特異的受容体媒介性取り込みなどによって、局在化を達成することができる。

当技術分野で知られているように、ＡＯＮは、例えば、リポソーム媒介性取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリジン媒介性取り込み、ナノ粒子媒介性取り込み、および受容体媒介性エンドサイトーシス、並びに当技術分野で知られている更なる非エンドサイトーシス送達様式、例えばマイクロインジェクション、透過処理（例えば、ストレプトリジン－Ｏ透過処理、アニオン性ペプチド透過処理）、エレクトロポレーション、および当技術分野で知られている様々な非侵襲性非エンドサイトーシス送達方法（参照によりその全体が組み込まれる、ＤｏｋｋａおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４、３５～４９を参照されたい）を含む方法を使用して、送達され得る。

ＡＯＮはまた、他の薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物を製造し得る。適切な担体および希釈剤としては、等張食塩液、例えばリン酸緩衝食塩水が挙げられる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口、または経皮投与のために製剤化され得る。

記載される投与経路は、当業者が任意の特定の動物および状態のための最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することができるので、指標としてのみ意図される。

インビトロおよびインビボの両方で、機能的な新しい遺伝物質を細胞に導入するための複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１２７５～１２８０）。これらのアプローチには、発現される遺伝子の修飾レトロウイルスへの組み込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１８）、ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ－５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクターへの組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６８、１４３～１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２、４３１～４３４）；またはリポソームを介した異種プロモーター－エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、上記；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２９８、２７８－２８１；Ｎａｂｅｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、１２８５－１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４：２０６－２０９；およびＷａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８４、７８５１－７８５５）；リガンド特異的カチオンに基づく輸送系と結合（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１４６２１－１４６２４）または裸のＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら（１９９０）、上記）；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５－１４６８）が含まれる。組織への導入遺伝子の直接注射は、局在化発現のみをもたらす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；およびＨａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらグループ（（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８、２７８－２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内投与後のマウスの肺のみのインビボトランスフェクションを報告している。ヒト遺伝子治療手順の総説論文の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、８０８－８１３；Ｂａｒｔｅａｕら（２００８）、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（５）、３１３－２３；Ｍｕｅｌｌｅｒら（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３５（３）、１６４－７８；Ｌｉら（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３（１８）、１３１３－９；Ｓｉｍｏｅｓら（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２（２）、２３７－５４である。

本発明のＡＯＮは、任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与すると、生物学的に活性な代謝産物またはその残留物を（直接的または間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。したがって、一例として、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容され得る塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容され得る塩、および他の生物学的等価物を対象とする。

「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容され得る塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない塩を指す。オリゴマーの場合、薬学的に許容され得る塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンと形成された塩など；（ｂ）無機酸と形成された酸付加塩、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸と形成された塩；および（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、局所治療が望ましいか全身処置が望ましいかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所（眼および粘膜、並びに直腸送達を含む）、肺、例えば、粉末またはエアロゾル（ネブライザー、気管内、鼻腔内、表皮および経皮を含む）の吸入または吹送、経口または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射若しくは注入；または頭蓋内、例えば髄腔内若しくは脳室内投与が含まれる。少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有するオリゴマーは、経口投与に特に有用であると考えられる。好ましくは、ＡＯＮは、皮下または静脈内経路を介して送達される。

単位剤形で好都合に提供され得る本発明の医薬製剤は、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製され得る。そのような技術は、活性成分を薬学的担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または細かく分けられた固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要な場合、生成物を成形することによって調製される。

以下の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。これらの実施例は、本発明を例示する目的でのみ含まれる。それらは、上記の本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されるべきではない。更に詳述することなく、当業者は、前述の説明を使用して、本発明を最大限に利用することができると考えられる。上記および以下の例では、すべての温度は、摂氏度で補正されずに示されている。また、特に記載のない限り、すべての部およびパーセンテージは重量による。

実施例１－元のＡＯＮの設計
エクソン２およびエクソン３標的化スプライススイッチングＡＯＮは、オンラインスプライス予測ツールによって予測されるように、エクソン内のエクソンスプライス部位およびスプライシングエンハンサー部位に結合するように設計された。これらのエクソンのいずれかのスキッピングは、転写物のリーディングフレームのシフトをもたらし、次のエクソンにおける未熟終止コドン（ＴＡＡ）をもたらすであろう。未熟終止コドンを有する転写物は、すべての真核細胞において作用するＲＮＡ監視機構であるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（nonsense mediated decay）を介して分解されることが知られている。

ＡＯＮについての配列、遺伝子座標および配列番号を表１および表２に列挙する。ＡＯＮ １～６６（図において提供されるとおり）は、配列番号１～配列番号６６に対応する。

ＡＯＮは、２’－Ｏ－メチル糖修飾およびホスホロチオエート（ＰＳ）骨格化学を有していた。ＡＯＮ命名法は、Ｍａｎｎら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００２．４（６）：ｐ．６４４－６５４）によって記載されたものに基づき、種、遺伝子、エクソン番号、アクセプターまたはドナー標的化およびアニーリング座標が記載され、「－」は、イントロン位置を示し、「＋」は、本明細書中に記載されるように、スプライス部位からのエクソン位置を特定する。図２は、ＴＡＲＤＢＰ上の各ＡＯＮの結合位置の概略図を示す。

２’－Ｏ－メチル修飾およびＰＳ骨格を有するＡＯＮは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）またはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）に注文した。ホスホロジアミデート骨格を有するＡＯＮ（ＰＭＯ）は、Ｇｅｎｅｔｏｏｌｓ ＬＬＣ（米国オレゴン州フィロマス）に注文した。

実施例２－転写物分析を用いたＡＯＮスクリーニング
２’－Ｏ－メチルＡＯＮのトランスフェクション後に、ＴＡＲＤＢＰ転写物のＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。ＡＯＮトランスフェクション後のＴＡＲＤＢＰノックダウンまたはエクソンスキッピングのレベルを、対照処理および未処理試料のレベルと比較した。

対照配列には、無関係な遺伝子を標的とするＡＯＮ、ＳＭＮ、対照ＡＯＮ １（配列番号２６、ＣＡＣＣＵＵＣＣＵＵＣＵＵＵＵＵＧＡＵＵ）およびＧｅｎｅＴｏｏｌｓから購入した陰性対照オリゴ：対照ＡＯＮ ２（配列番号２７；ＧＧＡＵＧＵＣＣＵＧＡＧＵＣＵＡＧＡＣＣＣＵＣＣＧ）および対照ＡＯＮ ３（配列番号２８、ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ）が含まれる。

材料および方法
線維芽細胞のトランスフェクション
正常ヒト真皮線維芽細胞を、１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ中の２４ウェルプレートに播種した１５，０００個の細胞を用いて確立された技術に従って増殖させ、トランスフェクションの前に３７℃で２４時間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００（３μｌ／トランスフェクション体積ｍｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア、メルボルン）を使用してすべての２’－Ｏ－メチルＰＳ－ＡＯをトランスフェクトし、ＡＯトランスフェクト細胞を２４時間インキュベートした。

転写物分析
ＲＮＡを、ＤＮａｓｅ処理を含むＭａｇＭＡＸ－９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して抽出した。ＲＴ－ＰＣＲは、製造業者の指示に従って、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑポリメラーゼとともにＯｎｅ－ｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。生成物を、ＴＡＲＤＢＰエクソン１～６（Ｆｗｄ：ＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧ（配列番号６７）、Ｒｅｖ：ＡＣＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡ（配列番号６８））にわたって、５５℃で３０分間、９４℃で２分間、続いて９４℃で４０秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で１分３０秒間の２４サイクルの温度プロファイルで増幅した。該当する場合、結果を、以下のプライマー（Ｆｗｄ：ＡＧＣＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴ（配列番号６９）、Ｒｅｖ：ＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号７０））を使用して、エクソン２～３にわたって増幅された無関係のハウスキーピング対照遺伝子（ＴＢＰ）の転写物レベルに対して、正規化した。

ＰＣＲ産物をトリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液中２％アガロースゲルで分画し、画像をゲル文書化システム（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ、ドイツ、Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ）で捕捉した。Ｉｍａｇｅ Ｊ．Ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇを使用して、デンシトメトリー分析を実施し、バンド重量によって定量して、全長ＴＡＲＤＢＰおよびエクソンスキッピング生成物の比を推定した。バンド精製および必要に応じてＤＮＡ配列決定によって、生成物の同一性を確認した。エクソンスキッピングの効率は、ＲＴ－ＰＣＲによって生成された全生成物と比較して、エクソンがスキッピングされた転写物のパーセンテージを計算することによって決定した。全長転写物ノックダウンのパーセンテージを、ハウスキーピング遺伝子に対する正規化および対照処理サンプルまたは未処理サンプルと比較した全長転写物の比較によって決定した。

エクソン２標的化ＡＯ（ＡＯＮ １～６、配列番号１～配列番号６）を２５ｎＭおよび５０ｎＭで最初に試験した。エクソン２スキッピングの証拠は見られなかったが、全長転写物におけるノックダウン／低減がＡＯＮ １～６（配列番号１～配列番号６）の各々において検出され、ＡＯＮ ３（配列番号３）が最大のノックダウンを生じた（図３ａ）。

エクソン３標的化ＡＯＮ（ＡＯＮ ７～１１、配列番号７～配列番号１１）を最初に２００および５０ｎＭで試験した。試験したすべての配列は、エクソン３のスキッピングを誘導することができた（図４ａ）。ＡＯＮ １０（配列番号１０）は、５０ｎＭで処理した場合、８１％またはエクソン３スキッピングを示す転写物で（with 81% or transcripts displaying exon 3 skipping）、最も効果的であった。次いで、最大のエクソンスキッピング（ＡＯＮ ８、９および１０、配列番号８、９および１０）を生じた配列を一連の濃度（５０、１０および１ｎＭ）で試験し、１ｎＭまでエクソンスキッピングが見られた（図４ｂ）。

実施例３－ＡＯＮの最適化
最初のＡＯＮスクリーニングの後、ＴＡＲＤＢＰエクソン２を標的とするＡＯＮを、カクテル（２つのＡＯＮをそれぞれ５０ｎＭで一緒にトランスフェクション）において、または単一ＡＯＮとして試験し、ＡＯＮ ３（配列番号３）単独よりも大きなノックダウンを示す組み合わせはなかった（図３ｂ）。

スクリーニング後、ＴＡＲＤＢＰエクソン２および３を標的とするＡＯＮをマイクロウォーキング（オリゴマーの長さを依然として維持しながら、ＡＯＮ配列を上流または下流に数塩基だけシフトさせて最適な標的部位を同定すること）によって最適化し、トランスフェクション後のエクソンスキッピングのレベルを元のＡＯＮ配列、対照ＡＯＮおよび未処理試料と比較した。

エクソン２を標的とするＡＯＮ ３（配列番号３）を、５塩基上流および５塩基下流および１０塩基下流でマイクロウォークして、ＡＯＮ １２、１３および１４（配列番号１２、１３および１４）を作製し、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で試験し、ＡＯＮ １２（配列番号１２）が、ＡＯＮ ３（配列番号３）よりも（that）大きなＴＡＲＤＢＰ転写物のノックダウンをもたらした（図３ｃ）。

エクソン３標的化ＡＯＮ（ＡＯＮ ８、９および１０、配列番号８、９および１０）を５塩基上および下流でマイクロウォークし（ＡＯＮ １５～２０、配列番号１５～配列番号２０）、一連の濃度でいくつかの実験で試験して、最大効率を示すＡＯＮ １６（配列番号１６）を有するリード分子を決定した（図４ｃおよび４ｄ）。

実施例４－エクソン２標的化ＡＯＮに対する完全長転写物ノックダウンの機構
エクソン２のスキッピングが明らかでなかったので、エクソン２標的化ＡＯＮの作用機構を更に調べた。見られた結果（転写物ノックダウンであるがスキッピングされていない）は、様々な原因から生じた可能性がある。場合によっては、エクソンスキッピングが起こるが、結果として生じる転写物は非常に迅速または効率的に分解されるため、１つのスナップショットをある時点に見たときに検出することは困難である。エクソンスキッピングがより早い時点で明らかであるかどうかを確認するために、５０ｎＭのＡＯＮ濃度でトランスフェクトした細胞と、トランスフェクションの４、８、１２および２４時間後に回収した細胞との時間経過を行った。より早い時点では、エクソンスキッピングは見られなかった。トランスフェクションの４時間後からノックダウンを見ることができた（図５ａ）。

別の可能性は、ＡＯＮがイントロンを転写物に保持させていたことである。ＰＣＲにおける伸長時間がイントロンを含有する転写物を増幅させるのに十分な長さでなかった場合、これはゲル上でのノックダウンのように見える可能性がある。プライマーは、イントロン保持を探すように設計されたが、保持されたイントロンのレベルは、処理、未処理および対照処理細胞抽出物にわたって均一であった（図５ｂ）。

更にノックダウンの機構を調べるために、複数の戦略的に配置されたプライマーセットを利用し、転写物レベルを分析した。ノックダウンは、結合部位がフォワードプライマーとリバースプライマーとの間にあるときに見られるが、両方のプライマーが結合部位の前または後にあるときには見られず、切断がＡＯＮ結合部位の近くで起こり得ることを示している（図５ｃ）。

実施例５－ＰＡ１標的化ＡＯＮ設計およびスクリーニング
ポリアデニル化シグナルを遮断することによってＰＡ１の使用を立体的に阻害するＡＯＮを設計した。これは、翻訳された転写物（Ｉ）の低減および非翻訳転写物（ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）の増加をもたらし得る。

ＴＡＲＤＢＰのＰＡ１を標的とするために、２’－Ｏ－メチルＰＳ化学を使用して、２０塩基長および２５塩基長の２つのＡＯＮを最初に合成した（ＡＯＮ ２１、２２、配列番号２１および２２）。それらを、上記の方法に記載されるようなヒト線維芽細胞における一連の濃度（２００、５０、１２．５および３ｎＭ）で、リードエクソンスキッピングＡＯＮ（配列番号１６）と一緒に試験した。転写物のいくらかのノックダウンが見られたが、ノックダウンのレベルはＡＯＮ １６（配列番号１６）の場合よりも低かった（図６ａ）。

５０ｎＭおよび２５ｎＭの濃度でトランスフェクトした細胞、並びにトランスフェクションの１２、２４、４８および７２時間後に回収したＲＮＡを用いて、より早い時点またはより遅い時点でノックダウンが改善されたかどうかを調べるために時間経過を行った。ノックダウンが観察されたが、それはすべての時点にわたってより低く、リードエクソン３スキッピングＡＯＮよりもＰＡ１標的化ＡＯＮについてより低かった（図６ｂ）。長さが３０塩基の更なるＡＯＮを設計し（ＡＯＮ ２３、配列番号２３）、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭの最終実験で試験した。この実験では、３つすべてのＰＡ１標的化ＡＯについてより高いレベルのノックダウンが見られたが、更なる長さはノックダウンの増加をもたらさず、ハウスキーピング遺伝子のいくらかのノックダウンがより高い濃度で見られた（図６ｃ）。

実施例６－ＰＭＯとしての配列番号１２および１６の転写物およびタンパク質分析
エクソン２標的化ＡＯＮ １２（配列番号１２）およびエクソン３標的化ＡＯＮ １６（配列番号１６）を合成し、ＰＭＯとして評価した（配列番号２４および配列番号２５）。ＰＭＯをヌクレオフェクションによって正常線維芽細胞に送達し、次いで上記のようにＲＴ－ＰＣＲを用いて評価した。

ヌクレオフェクションによるＰＭＯ送達は、ＣＡ－１３７プログラム（Ｌｏｎｚａ、オーストラリア、メルボルン）を使用して、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｐ２キットとともにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｘユニットを使用して行った。最初に、５％ ＦＢＳ ＤＭＥＭを補充したキュベット内で１５０μＭでＰＭＯをトランスフェクトし、１、３および５日間（ＲＮＡ分析）並びに３および５日間（タンパク質分析）インキュベートした。

ＴＡＲＤＢＰ転写物のＲＴ－ＰＣＲ分析を図７ａに示す。ＰＭＯ ＡＯＮ ２４は、試験したいずれの時点でもＴＡＲＤＢＰ ＲＮＡのノックダウンまたはエクソン２スキッピングを引き起こさなかった。ＰＭＯ ＡＯＮ ２５は、エクソン３のスキッピングおよび転写物ノックダウンを誘導し、これは３つの時点すべてで見られ、トランスフェクション後２４時間で最も強かった。タンパク質ノックダウンもまた、下記のようにウエスタンブロットによって測定した。

材料および方法－ウエスタンブロッティング
細胞溶解物を、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ６．８、１５％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１．２５μＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州）１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）０．００４％ブロモフェノールブルーおよび２．５ｍＭジチオスレイトールを用いて調製し、次いで、６回超音波処理した（１秒間のパルス）。サンプルを９４℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、１４，０００×ｇで２分間遠心分離した後、ゲル上にロードした。

Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって測定した約１５μｇの総タンパク質を、分子量マーカー（Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ）（ＢｉｏＲａｄ）とともにＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ＢＩＳ／Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサンプルごとにロードし、２００Ｖで５５分間分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に３５０ｍＡで１時間転写した。室温で１時間ブロッキングした後、膜を、ＴＤＰ４３一次抗体（１：１，０００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）およびβ－アクチン一次抗体（１：５０，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有する１×ＴＢＳＴ中の５％スキムミルクパウダーにおいて４℃で一晩インキュベーションした。免疫検出を、抗ウサギＨＲＰ二次抗体（１：１０，０００、Ｄａｋｏ）およびＴＤＰ４３のためのＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＨＲＰ化学発光基質（Ｍｅｒｃｋ）を使用して行った。β－アクチンの免疫検出を、検出のために使用されるＣＤＰ Ｓｔａｒ化学発光基質とともにＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｒｅｅｚｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。ウエスタンブロット画像を、Ｆｕｓｉｏｎソフトウェアを使用してＶｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸシステムで捕捉し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを画像解析のために使用した。

結果
エクソン２標的化ＰＭＯ（配列番号２４）は、いかなるＴＤＰ４３タンパク質ノックダウンも引き起こさなかった。エクソン３標的化ＰＭＯ（配列番号２５）は、３および５日の時点でＴＤＰ４３タンパク質ノックダウンを引き起こし、トランスフェクションの３日後に最大であり、ハウスキーピングタンパク質（β－アクチン）に対して正規化した場合に、上記タンパク質は対照細胞で見られるレベルの４０％までノックダウンされた（図７ｂ）。

配列番号２５を、１、３および５日に収集したＲＮＡおよび３日に収集したタンパク質を用いて、上記のとおりのヌクレオフェクションを使用してさらに３回の独立した実験において１００および５０μＭで試験した。エクソン３のスキッピングおよびノックダウンは、両方の濃度で３つの時点すべてで見られたが、トランスフェクションの２４時間後における１００μＭで最も高かった（代表的なゲル画像、図８ａ）。エクソン３のスキッピングは、サンガー配列決定によって確認された（図８ｃ）。ＴＤＰ４３レベルを、ＡＯＮが存在しないヌクレオフェクションを受けた対照細胞（Ｚａｐ）と比較して、１００μＭでのトランスフェクションの３日後に７４％（ｐ値０．０１２）および５０μＭで６２％（ｐ値０．０２７）ノックダウンした（図８ｂおよび８ｄ）。

実施例７－ＳＴＭＮ２上方調節を試験するための細胞モデルの開発
ＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化ＡＯＮが、スタスミン－２タンパク質レベルを増加させる能力を評価するために、スタスミン－２が減少した細胞モデルが必要であった。ＡＬＳ患者に見られるニューロンのＴＤＰ４３枯渇およびスタスミン－２の下方調節を模倣するために、エクソン３のスキッピングを介してＴＤＰ４３ノックダウンを誘導することができるＴＡＲＤＢＰエクソン３標的化ＰＭＯ（配列番号２５）を、Ｎｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクトした。

ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に、１００または５０μＭのＴＡＲＤＢＰ標的化ＰＭＯ（配列番号２５）またはＧｅｎｅＴｏｏｌｓから購入した１００μＭの陰性対照オリゴ（ＡＯＮ ＩＤ １２）のいずれかをトランスフェクトした。すべての濃度は、エレクトロポレーション中のチップ内の濃度を指す。対照細胞はまた、ＡＯが存在しないエレクトロポレーションを受けた（Ｚａｐ処理細胞）。１および３日間のインキュベーション後に分析のために細胞を収集した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によって分析した。

転写物分析
ＲＮＡを、ＤＮａｓｅ処理を含むＭａｇＭＡＸ－９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して抽出した。ＲＴ－ＰＣＲは、製造業者の指示従って、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑポリメラーゼとともにＯｎｅ－ｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。生成物をＴＡＲＤＢＰエクソン１～６にわたって増幅して、対照および未処理細胞と比較してＴＡＲＤＢＰレベル／ノックダウンを測定し（Ｆｗｄ：ＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧ（配列番号６７）、Ｒｅｖ：ＡＣＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡ（配列番号６８））、温度プロファイルは、５５℃で３０分間、９４℃で２分間、続いて２４サイクルの９４℃で４０秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で１分３０秒間であった。ＳＴＭＮ２レベルは、エクソン１～３（Ｆｗｄ：ＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣ（配列番号７１）、Ｒｅｖ：ＡＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧ（配列番号７２））またはエクソン１～５（Ｆｗｄ：ＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣ（配列番号７１）Ｒｅｖ：ＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＡ（配列番号７３））にわたって増幅することによって測定し、温度プロファイルは、５５℃で３０分間、９４℃で２分間、続いて、９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間、６８℃で１分１５秒間を、１～３で２８サイクル、または１～５で２６サイクルであった。潜在性エクソンを含有する転写物は、潜在性エクソン内の部位でポリアデニル化されるので、潜在性エクソンを含有するＳＴＭＮ２転写物は、エクソン１から潜在性エクソン配列の末端に向かう位置まで増幅することによって検出され（Ｆｗｄ：ＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣ（配列番号７１）Ｒｅｖ：ＧＴＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＣ（配列番号７４））、温度プロファイルは、プロファイル、５５℃で３０分間、９４℃で２分間、続いて２９サイクルの９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間および６８℃で１分間であった。潜在性エクソンを含有する転写物の配列は、サンガー配列決定によって確認された（図９ｂ）。該当する場合、結果を、以下のプライマーを使用してエクソン２～３にわたって増幅された無関係なハウスキーピング対照遺伝子（ＴＢＰ）の転写物レベルに対して正規化した（Ｆｗｄ：ＡＧＣＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴ（配列番号６９）、Ｒｅｖ：ＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号７０）。

ＰＣＲ産物をトリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液中２％アガロースゲルで分画し、画像をゲル文書化システム（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ、ドイツ、Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ）で捕捉した。Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してデンシトメトリー分析を実施し、ＴＡＲＤＢＰのエクソンスキッピングをバンド重量によって定量して、全長ＴＡＲＤＢＰおよびエクソンスキッピング生成物の比を推定した。バンド精製および必要に応じてＤＮＡ配列決定によって、生成物の同一性を確認した。ＳＴＭＮ２転写物レベルを、ハウスキーピング遺伝子に対する正規化および対照処理または未処理試料との比較によって決定した。

ＴＡＲＤＢＰエクソン３のスキッピングおよび転写物ノックダウンは、１および３時点の両方で見られたが、トランスフェクションの１日後に最も強かった。ＳＴＭＮ２転写物を含有する非潜在性エクソンは、３日間のインキュベーション後にＴＡＲＤＢＰ ＡＯＮで処理した場合、対照処理細胞と比較して８０％ノックダウンされた。これは、ＳＴＭＮ２転写物を含有する潜在性エクソンの量の大きな増加を伴い、これは３日の時点で最も強かった。ＳＴＭＮ２ノックダウンはなく、また、潜在性エクソンも対照のいずれにおいても検出されなかった。（図９ａ）。

実施例８－ＳＴＭＮ２標的化ＡＯＮの設計
ＡＯＮは、ＳＴＭＮ２のイントロン１の潜在性エクソン内の部位を標的とするように設計された。３つのエンハンサー部位ホットスポットを標的とするＡＯＮを用いたオンラインスプライス予測ツールによって予測されるスプライシングエンハンサーの結合を阻害する部位を選択した。スプライシングエンハンサーの結合が低減すると、スプライソソームによるエクソンの認識が低減し、潜在性エクソンが成熟ｍＲＮＡ転写物から排除される。これは、潜在性エクソンを含まない成熟ＳＴＭＮ２転写物が翻訳されるときに産生されるスタスミン－２のレベルの増加をもたらすであろう。ＡＯＮ ＩＤ、配列、遺伝子座標および化学を表１に見ることができる。ＡＯＮ結合およびエンハンサー部位を図１０に見ることができる。２’－Ｏ－メチル修飾およびホスホロチオエート骨格を有するＡＯＮは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）に注文した。ホスホロジアミデート骨格を有するＡＯＮ（ＰＭＯ）は、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ ＬＬＣ（米国オレゴン州フィロマス）に注文した。

実施例９－ＳＴＭＮ２標的２’－Ｏ－メチルＡＯＮの試験
ＳＨ－ＳＨ５Ｙ細胞を、１００μＭのＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）単独でまたは５若しくは１０μＭのＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化２’－Ｏ－メチル－ＰＳ ＡＯＮ（配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１）の１つと組み合わせて、または１００μＭの対照オリゴ（ＡＯＮ ＩＤ ２８）で、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムを用いて、トランスフェクトした。すべての濃度は、エレクトロポレーション中のチップ内の濃度を指す。対照細胞はまた、ＡＯが存在しないエレクトロポレーションを受けた（Ｚａｐ）。１日および３日のインキュベーション後、ＲＮＡ抽出および分析のために細胞を回収した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ－ＰＣＲおよびデンシトメトリー分析を用いたアガロースゲル電気泳動によって分析した。

対照と比較して、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）で処理した細胞において、ＴＡＲＤＢＰを１日後に約７０％ノックダウンした。潜在性エクソンを含有するＳＴＭＮ２転写物は、対照細胞では微量で検出されたが、配列番号２５のみで処理した細胞では豊富であった。この潜在性エクソン発現は、ＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化ＡＯＮで共トランスフェクトした細胞ではより低かった。配列番号２５のみで処理した細胞と比較して、１０μＭでのトランスフェクションの１日後、レベルは配列番号２９で処理した細胞では２９％に、配列番号３０で処理した細胞では１５％に、配列番号３１で処理した細胞では７６％に低減した。配列番号２５のみで処理した細胞では、全長ＳＴＭＮ２転写物のレベルは、１日までに未処理対照細胞で見られたレベルの４６％に低減し、３日後には１４％に低下した。ＳＴＭＮ２標的化ＡＯを共トランスフェクトした細胞では、全長ＳＴＭＮ２レベルはより高く維持され、３日目に最大の差が見られた。ＡＯＮ ３０（１０μＭ）でトランスフェクトした細胞では、３日後、全長ＳＴＭＮ２レベルは、配列番号２５のみで処理した細胞よりも３．７倍高かった。配列番号２９（１０μＭ）で処理した細胞は３倍の増加を有し、ＡＯＮ ３１（１０μＭ）で処理した細胞は１．８倍の増加を有した。配列番号２９および配列番号３０について用量応答が見られ、５μＭで処理した細胞は全長ＳＴＭＮ２転写物の発現がわずかに少なかった。ＡＯＮ ３１の場合、全長ＳＴＭＮ２レベルは両濃度で類似していた。この実験を繰り返し、同様の結果を得た。代表的なゲル画像を図１１ａに、デンシトメトリー分析を図１１ｂの両方の実験から見ることができる。

実施例１０－ＳＴＭＮ２ ＡＯＮ配列の最適化
ＳＴＭＮ２ ＡＯＮ配列を、配列番号２９（配列番号３２および配列番号３３）および配列番号３０（配列番号３４および３５）の５塩基上流および下流にＡＯＮ配列をシフトさせることによって最適化した。これらは、前述の方法を用いた２回の実験において配列番号２９および配列番号３０と一緒に試験した。潜在性エクソンの第一エンハンサー部位ホットスポットを標的とする３つのＡＯＮのうち、配列番号３３は、２回の実験において、配列番号２５のみでトランスフェクトした細胞と比較して、最大の潜在性エクソン抑制および全長ＳＴＭＮ２発現の最大の増加をもたらし、ＳＴＭＮ２発現は最大４．５倍増加した。潜在性エクソンの第２のエンハンサー部位ホットスポットを標的とするＡＯＮについて、配列番号３０および配列番号３５は同様の結果をもたらし、１０μＭでトランスフェクトした場合、配列番号２５のみで処理した細胞の３～５倍の全長ＳＴＭＮ２レベルであった。５μＭでは、配列番号３５で共処理した細胞は、２回の実験において配列番号３０で共処理した細胞よりも全長ＳＴＭＮ２レベルが高かった。１回の実験からの代表的なゲル画像を図１２ａに見ることができ、２回の実験からのデンシトメトリー分析を図１２ｂに見ることができる。配列番号３３および配列番号３５は、更なる試験およびタンパク質分析のためにＰＭＯ（配列番号３６および３７）として合成されたものとして選択された。

実施例１１－ＴＡＲＤＢＰおよびＳＴＭＮ２標的化ＰＭＯによる同時トランスフェクション後の転写物およびタンパク質分析
ＰＭＯ配列番号３６および３７を、上記と同じモデルおよび方法を用いてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において試験した。細胞を、１００μＭ ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）、または１００μＭ 配列番号２５と２５μＭから１μＭまでの範囲の濃度（エレクトロポレーションでのネオンチップの濃度）のＳＴＭＮ２標的化配列番号３６若しくは３７との組み合わせのいずれかでトランスフェクトし、トランスフェクションの１、３および５日後に転写物分析のために細胞を収集した。実験は３回行った。転写物分析は、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）のみで処理した細胞で大きく上方調節された潜在性エクソンの発現が、配列番号３６および３７の両方によって抑制されることを示し、明確な用量応答が見られた。図１３は、ＲＮＡ転写物分析の代表的なゲル画像を示す。３回の実験からのデンシトメトリー分析は、２５μＭのトランスフェクション濃度で、配列番号３６および配列番号３７の両方が、試験したすべての時点で対照細胞（未処理、Ｚａｐおよび対照ＡＯＮ処理）で見られるレベル以下のレベルまで潜在性エクソンの発現を抑制したことを示した。５μＭ濃度でのトランスフェクションの５日後、配列番号３７は、潜在性エクソンの発現を４．７％に、配列番号３６は、ＳＴＭＮ２標的化ＡＯＮの添加なしのＴＤＰ４３枯渇細胞で見られた発現の２５％に抑制した。１μＭ濃度での処理の５日後、配列番号３７で共処理した細胞は、ＴＡＲＤＢＰ配列番号２５のみで処理した細胞として、転写物を含有する潜在性エクソンのレベルの２５．９％を発現し、配列番号３６で共処理した細胞は６２．９％を発現した（図１４）。３回の独立した実験からのデンシトメトリー分析を図１４ａに見ることができる。

配列番号２５のみで処理した細胞では、全長ＳＴＭＮ２転写物の発現は、トランスフェクションの５日後に未処理対照細胞のレベルの１４．４％に低減した。全長ＳＴＭＮ２転写物の発現は、２５μＭまたは５μＭの濃度で配列番号３６または配列番号３７を共トランスフェクトした場合、対照細胞と同様のレベルで維持された。１μＭでは、全長ＳＴＭＮ２転写物の発現は、５日後に配列番号３６については５９．２％に、ＡＯＮ ３７については７９．２％に低減した（図１４ｂ）。

タンパク質分析をウエスタンブロットによって行った。代表的なウエスタンブロット画像を図１５ａに見ることができる。３回の実験からのデンシトメトリー分析は、スタスミン－２発現が、ＴＡＲＤＢＰエクソン３スキッピングＰＭＯ（配列番号２５）による処理の３日後に完全に抑制され、５日までに対照レベルの１３％までわずかに上昇しただけであることを示した。細胞に２５μＭまたは５μＭの濃度でＴＡＲＤＢＰ標的化配列番号２５およびＳＴＭＮ２標的化配列番号３６または３７を共トランスフェクトした場合、スタスミン－２レベルは未処理対照細胞と同様のレベルに維持された。トランスフェクションの５日後、配列番号２５および配列番号３６で共処理した細胞について、１μＭの試験した最低濃度で、スタスミン－２発現が対照レベルの６０％に低下した（図１５ｂ）。

実施例１２－ＳＴＭＮ２標的化ＡＯＮ ３７のみの後の転写物およびタンパク質分析
スタスミン－２の発現不足および過剰発現の両方が有害であり得る。ＴＤＰ４３が核から低減も枯渇もしていない細胞において、ＳＴＭＮ２潜在性エクソン標的化ＡＯＮの効果を決定するために、ＡＯＮ ３７を、３回の独立した実験において３つの濃度でＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクトした。対照細胞に対照配列番号３（配列番号２８）をトランスフェクトするか、またはＡＯＮが存在しないヌクレオフェクションを受けさせた（Ｚａｐ）。細胞に、ＴＡＲＤＢＰ標的化配列番号２５（トランスフェクション効率の対照として）もトランスフェクトした。ＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動による転写物分析は、ＳＴＭＮ２転写物レベルが、試験した任意の時点（トランスフェクションの５日後まで）でＡＯＮ ３７をトランスフェクトした後に対照細胞で見られるレベルと有意に異ならないことを示した。ＳＴＭＮ２レベルは、配列番号２５で処理した細胞において予想されるレベルまで低減し、トランスフェクション効率が良好であることを示した。図１６ａは、３回の独立した実験からの代表的なゲル画像および１６ｂデンシトメトリー分析を示す。ウエスタンブロット分析は、配列番号３７で処理された細胞におけるスタスミン－２タンパク質レベルが、３日後および５日後に、対照細胞において見られるレベルに近いままであることを示した（図１７ａ）。

Claims (19)

1. ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
   ａ）配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８またはそれらのバリアントからなるリストから選択されるか、または
   ｂ）配列番号１～配列番号２５、配列番号３８～配列番号５８も結合する標的ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡまたはそれらのバリアント中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的である、核酸塩基配列を有し、
   前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を阻害し、
   前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、実質的に単離または精製されている、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
   ａ）配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６またはそれらのバリアントからなるリストから選択されるか、または
   ｂ）配列番号２９～配列番号３７、配列番号６２～配列番号６６も結合する標的ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ中またはそれらのバリアント中の少なくとも１つまたはそれを超える連続する核酸塩基に相補的である、核酸塩基配列を有し、
   前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止し、かつ／または前記ＳＴＭＮ２遺伝子の発現を増加させ、
   前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、実質的に単離または精製されている、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. ＴＡＲＤＢＰプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する方法であって、前記方法が、
   ａ）請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つまたはそれを超えるものを提供するステップと、
   ｂ）前記オリゴマー（複数可）を標的核酸部位に結合させるステップと、を含む、方法。
4. ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導する方法であって、
   ａ）請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つまたはそれを超えるものを提供するステップと、
   ｂ）前記オリゴマー（複数可）を標的核酸部位に結合させるステップと、を含む、方法。
5. ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための組成物であって、前記組成物が、
   ａ）請求項１に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
   ｂ）１つまたはそれを超える治療的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む、組成物。
6. ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬組成物であって、前記組成物が、
   ａ）請求項１に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
   ｂ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む、組成物。
7. ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善する方法であって、前記方法が、有効量の請求項６に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
8. バイオマーカーによって同定された患者におけるＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善する方法であって、前記方法が、
   ａ）ＴＤＰ４３抑制に応答する可能性があるＴＤＰ４３タンパク質症患者に関連する疾患に関連するバイオマーカーの存在について対象を試験するステップと、
   ｂ）前記対象が前記バイオマーカーを発現することが判明した場合、有効量の請求項６に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップと、を含む、方法。
9. 対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を低下させる方法であって、前記方法が、有効量の請求項６に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
10. ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止して、スタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持する、および／または対象においてスタスミン－２の発現が低減している場合にスタスミン－２発現を増加させる方法であって、前記方法が、有効量の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記医薬組成物が、
    （ａ）請求項２に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む、方法。
11. （１）対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または
    （２）対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を減少させる、
    および前記ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止または低減して、前記対象においてスタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、またはスタスミン－２の発現を増加させる方法であって、
    前記方法が、有効量の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記医薬組成物が、
    （ａ）請求項１に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）請求項２に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
    （ｃ）１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、
    を含む、方法。
12. （１）対象におけるＴＤＰ４３の発現を低下させる、および／または
    （２）対象における自己調節によって引き起こされるＴＤＰ４３の過剰発現を減少させる、
    および前記ＳＴＭＮ２遺伝子の下方調節を防止または低減して、前記対象においてスタスミン－２の正常な生理学的レベルを維持するか、またはスタスミン－２の発現を増加させる方法であって、
    前記方法が、有効量の
    （ａ）請求項１に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む医薬組成物、および
    （ｂ）請求項２に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と、を含む第２の医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含み、
    前記２つの医薬組成物が、前記対象に同時にまたは逐次投与される、方法。
13. 請求項１に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター。
14. 請求項２に記載の１つまたはそれを超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター。
15. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞。
16. 請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞。
17. ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための医薬品を製造するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
18. ＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
19. 対象におけるＴＤＰ４３タンパク質症に関連する疾患の影響を処置、予防または改善するためのキットであって、その使用のための指示とともに、適切な容器に包装された、少なくとも請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むキット。