CN116322708A - 视神经萎缩的治疗 - Google Patents

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Abstract

一种用于调节OPA1基因转录物或其部分的mRNA翻译的经分离或经纯化的反义寡聚物，所述OPA1基因转录物或其部分具有经修饰的骨架结构和与所述经分离或经纯化的反义寡聚物具有至少75％的序列同一性的序列。

Description

视神经萎缩的治疗
技术领域
本发明涉及使用反义寡聚物治疗、预防或改善由基因OPA1中的突变引起的影响。
背景技术
常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是世界上最常见的遗传性视神经病变，估计患病率在10,000分之一至50,000分之一的范围之间。OPA1是大多数患有ADOA的家族的主要致病基因。
ADOA通常在儿童早期出现进行性视力衰竭，选择性视网膜神经节细胞丢失是其定义的病理特征。视力衰竭的平均发病年龄为7岁，范围为1至16岁。80％的受影响个体在年龄10岁之前出现症状。在高达20％的病例中，ADOA与其他临床表现相关，最常见的是感觉神经性聋、共济失调、肌病和进行性外眼肌麻痹。已通过细胞色素c氧化酶(COX)缺陷肌纤维的鉴定和这些患者的骨骼肌活检中的多个mtDNA缺失突出强调了这些综合征性ADOA变体的重要性，暗示OPA1在线粒体DNA维持中的作用。
OPA1由30个外显子组成，跨越3号染色体(3q28-q29)长臂上100kb的基因组DNA，并且蛋白质产物是一种共定位于线粒体内膜上的960个氨基酸的多肽。OPA1包含由机械酶的发动蛋白超家族成员共享的一个高度保守的功能性GTP酶(GTPase)结构域，并且调控几个重要的细胞过程，包括线粒体网络的稳定性。据报道，超过400种不同的OPA1突变导致视神经变性和视力丧失，范围从孤立的“显性视神经萎缩”(DOA；OMIM#165500)到名称为‘DOAplus’(OMIM#125250)的更严重的多系统综合征，包括患有贝尔综合征(Behr Syndrom)(OMIM#210000)的一些双等位基因病例。
OPA1是一种普遍表达的线粒体GTP酶，其对于线粒体功能而言是必不可少的。在人类中，OPA1经由外显子4、4b和5b的差异剪接产生至少八种变体。通过其线粒体靶向序列(MTS)靶向OPA1前体蛋白并将其动员到线粒体。在线粒体中，OPA1前体蛋白被切割成锚定在线粒体内膜的长形式(1形式)或切割成短的可溶形式(s形式)。
完整的OPA1基因的编码序列超出了具有小于5kb限值的AAV载体的容量。此外，CRISPR/Cas9基因校正将需要针对每个家族的OPA1突变的不同产品。此外，基因替换和基因编辑方法两者都需要视网膜下注射病毒载体以实现充分的转染。这会带来视网膜创伤的风险。
需要为ADOA提供新型治疗或预防措施，或者至少提供补充先前已知治疗的方法。本发明试图提供一种用于治疗、预防或改善ADOA的影响的改进或替代方法。
背景的先前讨论仅仅意在便于理解本发明。所述讨论并不承认或认可所提及的任何材料在本申请的优先权日是或曾经是公知常识的一部分。
发明内容
本发明提供了提高功能性OPA1蛋白表达水平的手段。优选地，功能增加的OPA1存在于患有ADOA的患者中，更优选地存在于涉及OPA1单倍剂量不足的ADOA中。
广义上，根据本发明的一方面，提供了一种经分离或经纯化的反义寡聚物，其靶向OPA1基因转录物的5′UTR。优选地，提供了经分离或经纯化的反义寡聚物以通过5′UTR二级结构元件的空间抑制和/或上游开放阅读框的抑制来增加功能性OPA1蛋白的翻译。优选地，提供了一种用于诱导OPA1蛋白或其部分的产生增加的经分离或经纯化的反义寡聚物。
在本发明的一方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的5′UTR附近或之内的区域互补的靶向序列。在本发明的另一方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的外显子附近或之内的区域互补的靶向序列。
根据本发明的一方面，提供了一种经分离或经纯化的反义寡聚物，其被设计用于通过空间抑制5′UTR二级结构元件来增加功能性OPA1蛋白的翻译。优选地，反义寡聚物是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
优选地，反义寡聚物选自包括以下项的组：表1中所列出的序列及其组合或混合物。
更具体地，反义寡聚物可选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1-60中的任一个或多个；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57，以及其组合或混合物。
还提供了一种用于操作OPA1基因转录物的翻译的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种或多种如本文所述的反义寡聚物并允许一种或多种寡聚物结合至靶核酸位点。
还提供了一种药物组合物、预防组合物或治疗组合物，其用于治疗、预防或改善患者中与OPA1表达相关的疾病的影响，所述组合物包含：
a)一种或多种如本文所述的反义寡聚物，以及
b)一种或多种药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
优选地，与OPA1表达相关的疾病与功能性OPA1蛋白表达水平的降低相关。优选地，功能降低的OPA1存在于患有ADOA的患者中，更优选地存在于涉及OPA1单倍剂量不足的ADOA中。
还提供了一种用于治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向所述患者施用有效量的一种或多种反义寡聚物或包含一种或多种如本文所述的反义寡聚物的药物组合物。
还提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡聚物在制备用于治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的药物中的用途。
还提供了一种用于治疗、预防或改善患者中与OPA1表达相关的疾病的影响的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种如本文所述的反义寡聚物及其组合或混合物，所述试剂盒连同其使用说明书被包装在合适的容器中。
优选地，患者中与OPA1表达相关的疾病是常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。患有与OPA1表达相关的疾病的受试者可以是哺乳动物，包括人。
现在将参考所附非限制性示例和附图来描述本发明的另外的方面。
附图说明
本发明的进一步特征在其几个非限制性实施方案的以下说明中得以更完全地描述。所包括的本说明仅用于举例说明本发明的目的。这不应该被理解为对如上所述的本发明的概括总结、公开或说明的限制。将参考附图来进行描述，其中：
图1是靶向OPA1 5′UTR和上游开放阅读框(uORF)的反义寡核苷酸的示意图。
图2显示了在HEK293细胞中对2′-O-甲氧基乙基-(2′-MOE)ASO(5和20nM)的筛选。如图所示，用靶向OPA1 5′UTR的2′-MOE ASO转染HEK293细胞48小时。包括诱导外显子7x跳跃的阳性对照ASO用于比较。蛋白质印迹凝胶图像显示OPA1蛋白表达和β肌动蛋白作为上样对照(A、C)。将OPA1表达的条带强度归一化至β肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理细胞中的OPA1表达设置为1(B、D)。
图3显示了在HEK293细胞中对PMO(50和100μM)的筛选。如所示，用靶向OPA1 5′UTR的PMO转染HEK293细胞48小时。蛋白质印迹凝胶图像显示了OPA1蛋白表达和β肌动蛋白作为上样对照(A、C)。将OPA1表达的条带强度归一化至β肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理细胞中的OPA1表达设置为1(B、D)。
图4显示了在ADOA患者成纤维细胞中对PMO(50和100μM)的筛选。蛋白质印迹凝胶图像显示在24小时(A)和48小时(B)时在转染了靶向OPA1 5′UTR的PMO的患者成纤维细胞中的OPA1表达。将OPA1表达的条带强度归一化至在24小时(B)和48小时(D)时的β肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理细胞中的OPA1表达设置为1(B、D)。
图5显示了在ADOA患者成纤维细胞中对PMO(50和100μM)的筛选。蛋白质印迹凝胶图像显示在48小时(A)时在转染了靶向OPA15′UTR的PMO的患者成纤维细胞中的OPA1表达。条形图表示OPA1蛋白表达的平均值±SEM(n＝1-8个独立实验)。将OPA1表达的条带强度归一化至β肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理的细胞中的OPA1表达设置为1(B)。
图6显示了在ADOA患者成纤维细胞中对与包括故意错配的H1A(+10+32)相邻的微行走PMO(25和50μM)的筛选。蛋白质印迹凝胶图像显示在48小时(A)时在转染了靶向OPAl5′UTR的PMO的患者成纤维细胞中的OPA1表达。条形图表示OPA1蛋白表达的平均值±SEM(n＝2个独立实验)。将OPA1表达的条带强度归一化至β肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理的细胞中的OPA1表达设置为1(B)。
图7显示了在ADOA患者成纤维细胞中对与包括故意错配的H1A(+44+67)相邻的微行走PMO(25和50μM)的筛选。蛋白质印迹凝胶图像显示在48小时(A)时在转染了靶向OPA15′UTR的PMO的患者成纤维细胞中的OPA1表达。条形图表示OPA1蛋白表达的平均值±SEM(n＝1个独立实验)。将OPA1表达的条带强度归一化至β-肌动蛋白(通过imageJTM进行评估)。将未处理的细胞中的OPA1表达设置为1(B)。
图8显示了用PPMO H1A(+10+32)处理后在ADOA患者成纤维细胞中OPA1蛋白的上调。
图9显示了在用PPMO H1A(+1 0+32)处理后在来自4名不同ADOA患者的成纤维细胞中线粒体ATP水平提高。
图10显示了在用PPMO H1A(+10+32)处理后在来自3名不同ADOA患者的成纤维细胞中相对细胞凋亡水平降低。
发明描述
具体实施方式
反义寡核苷酸
ADOA的特点是视网膜神经节细胞变性，并且至少75％的病例是由OPA1基因突变引起的。OPAl普遍表达并且在视网膜上最为丰富。OPA1蛋白是一种在线粒体结构、功能和细胞凋亡控制中起着重要作用的线粒体GTP酶。
线粒体在视网膜神经节细胞中的独特分布指出了该网络在视网膜神经节细胞中的关键功能，并且可能是这些细胞对OPA1丢失的敏感性的基础(也可能因这些细胞暴露于光氧化应激而沉淀)。大多数OPA1突变(约27％错义、27％剪接变异、23.5％移码、16.5％无义、6％缺失或重复)导致转录物因mRNA衰变而降解，从而支持了单倍剂量不足是在ADOA发病机制下面的主要机制的假设。导致单倍剂量不足的OPA1突变会导致线粒体功能受损，包括复合物I驱动的ATP合成缺陷。由于ATP是细胞中的主要能量货币，ATP不足最终会导致细胞功能失常和死亡。
OPA1单倍剂量不足占ADOA的很大比例。导致ADOA的OPA1单倍剂量不足可通过上调野生型OPA1进行治疗。
5′非翻译区(5′UTR)是正好位于规范起始密码子上游的mRNA区域。规范起始密码子定义了主要编码序列(CDS)的开始，它是编码蛋白质的mRNA的一部分。5′UTR在控制翻译效率方面起着重要作用，因为它在核糖体向mRNA募集和决定起始密码子选择方面具有关键功能。上游开放阅读框(uORF)是mRNA元件，其在5′UTR中具有起始密码子(非规范起始密码子)，并且在CDS的框外具有框内终止密码子。uORF存在于大约一半的人转录物中，并且与下游开放阅读框的蛋白质表达显著降低相关。
本发明提供了提高功能性OPA1表达水平的手段。优选地，功能增加的OPA1存在于患有ADOA的患者中，更优选地存在于其中涉及OPAl单倍剂量不足的ADOA中。
不拘泥于任何理论，据信通过使用与5′UTR中的uORF和翻译抑制元件结合的反义寡聚物，可以增加功能性OPA1蛋白的水平。使用结合并阻断或改变5′UTR中的uORF和翻译抑制元件的ASO减少了框外主编码序列的翻译并增加了从规范起始密码子开始的框内编码序列的翻译。ASO通过靶向基因5′UTR中的uORF和翻译抑制元件来选择性地提高蛋白质水平的能力提供了一种通过突变不可知论策略将OPA1蛋白表达恢复到野生型水平的手段，该策略适用于OPA1基因中导致疾病的任何突变。
在本发明中，反义寡聚物也称为反义寡核苷酸、ASO、AON和AON-该术语可以互换。
广义上，根据本发明的一方面，提供了一种分离或纯化的反义寡聚物，其靶向OPA1基因转录物或其部分的5′UTR。优选地，提供了分离或纯化的反义寡聚物以通过5′UTR二级结构元件的空间抑制和/或上游开放阅读框的抑制来增加功能性OPA1蛋白的翻译。优选地，提供了一种用于诱导OPA1基因转录物或其部分的产生增加的分离或纯化的反义寡聚物。
例如，在本发明的一方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的5′UTR附近或之内的区域互补的靶向序列。在本发明的另一方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的外显子附近或之内的区域互补的靶向序列。
因此，本发明提供了反义寡核苷酸来破坏OPA1基因转录物异常翻译的起始，或者可替代地通过5′UTR二级结构元件的空间抑制，优选地增加从OPA1基因转录物的规范起始密码子开始的翻译，因而增加功能性OPA1蛋白的水平。
广义上，根据本发明的一方面，提供了一种分离或纯化的反义寡聚物，其被设计用于与OPA1基因转录物或其部分的uORF杂交并破坏从非规范起始位点开始的OPA1基因转录物的翻译起始。反义寡核苷酸(ASO)被设计用于靶向5′UTR，目的是在空间上抑制5′UTR二级结构并抑制uORF的选择。这种破坏将优选地通过增加来自规范起始位点的OPA1基因转录物的翻译来调节功能性OPA1蛋白表达。由于从非规范起始位点的翻译更有可能导致功能障碍的蛋白质或不翻译，而从规范起始位点的翻译更有可能导致功能性蛋白质，本发明试图减少OPA1基因转录物的翻译从非规范起始位点起始和/或增加OPA1基因转录物从规范起始位点翻译。这些结果中的任一个或两个将增加OPA1蛋白的产生。OPA1蛋白产生增加可能有助于治疗与OPA1表达相关的疾病(特别是ADOA)。
广义上，根据本发明的另一方面，提供了一种分离或纯化的反义寡聚物，其被设计用于通过空间抑制5′UTR二级结构元件来增加功能性OPA1蛋白的翻译。
例如，在本发明的一方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的uORF附近或之内的区域互补的靶向序列。在本发明的另-方面，提供了一种具有10个至50个核苷酸的反义寡聚物，其包含与OPA1基因转录物或其部分的5′UTR附近或之内的区域互补的靶向序列。
反义寡聚物可选自表1。优选地，反义寡聚物选自包含以下项的列表：SEQ ID NO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57。
优选地，本发明的反义寡聚物用于：
i.与OPA1基因转录物的5′UTR杂交并且破坏OPA1基因转录物或其部分的异常翻译的启动；并且/或者
ii.通过5′UTR二级结构元件的空间抑制而增加功能性OPA1蛋白的翻译。
优选地，本发明的反义寡聚物用于在具有OPA1突变的患者细胞中：
i.提高线粒体ATP水平；并且/或者
ii.减少细胞凋亡。
根据本发明的一方面，反义寡聚物可用于靶向OPA1基因转录物或其部分的一个或多个uORF。例如，反义寡聚物可绕过OPA1基因转录物的uORF中的非规范起始密码子。
根据本发明的另一方面，反义寡聚物可用于靶向OPA1基因转录物或其部分的5′UTR区。例如，反义寡聚物可使核糖体接近改善以增加功能性OPA1蛋白的翻译成为可能。
本发明的反义寡聚物可包含：在严格杂交条件下可与此类序列杂交的序列，与其互补的序列，含有经修饰的碱基、经修饰的骨架的序列，以及其具有或调节基因转录物的翻译活性的功能性截短或延伸。在某些实施方案中，反义寡聚物可与靶序列100％互补，或者可包括错配，例如，以适应变体，只要寡核苷酸与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酸酶和其他在体内可能发生的降解模式的作用即可。因此，某些寡核苷酸可能在寡核苷酸与靶序列之间具有约或至少约70％的序列互补性，例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互补性。
本发明还扩展到能够结合所选靶标以诱导功能性OPA1蛋白的翻译增加的两种或更多种反义寡聚物的组合，包括包含两种或更多种此类反义寡聚物的构建体。所述构建体可用于基于反义寡聚物的疗法。
根据其又另一方面，本发明延伸至本发明的反义寡聚物序列的cDNA或克隆拷贝，以及包含本发明的反义寡聚物序列的载体。本发明还进一步延伸至包含此类序列和/或载体的细胞。
“分离的”意指大体上或基本上不含通常伴随在其自然状态下的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”可指已经从天然存在状态下其侧翼的序列中纯化或去除的多核苷酸，例如，从与基因组中的片段相邻的序列中去除的DNA片段。当其涉及细胞时，术语“分离”是指从源受试者(例如，患有多核苷酸重复疾病的受试者)纯化细胞(例如，成纤维细胞、成淋巴细胞)。在mRNA或蛋白质的上下文中，“分离”是指从来源(例如细胞)中回收mRNA或蛋白质。
反义寡聚物可被说成“针对”或“靶向”与其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列包括包含uORF、mRNA的5′UTR或参与翻译调节的其他序列的区域。靶序列可在一个或多个uORF之内或在uORF/5′UTR区域之外或跨越uORF连接。
在某些实施方案中，反义寡聚物与靶RNA(即，翻译被调节的RNA)具有足够的序列互补性以有效地阻断靶RNA(例如，mRNA)的区域。在示例性实施方案中，这种与5′UTR的结合可能包含OPA1转录物中的一个或多个uORF。
反义寡聚物与靶RNA序列具有足够的序列互补性以结合靶RNA的部分意味着反义寡聚物具有足以改变靶RNA的三维结构的序列。
选定的反义寡聚物可以制作得更短，例如约12个碱基或更长，例如约50个碱基，并且包括少量错配，只要该序列足够互补以在与靶序列杂交时影响翻译调节，并且任选地与RNA形成Tm为45℃或更高温度的异源双链体。
优选地，反义寡聚物选自包含表1中所列出的序列的组。优选地，反义寡聚物选自包含以下序列的组：SEQ ID NO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57。
在某些实施方案中，靶序列与反义寡聚物之间的互补程度足以形成稳定的双链体。反义寡聚物与靶RNA序列的互补区域可以短至8-11个碱基，但可以是12-15个碱基或更多，例如10-50个碱基、10-40个碱基、12-30个碱基、12-25个碱基、15-25个碱基、12-20个碱基或15-20个碱基，包括这些范围之间的所有整数。约16-17个碱基的反义寡聚物通常足够长以具有独特的互补序列。在某些实施方案中，可能需要最小长度的互补碱基来实现必需的结合Tm，如本文所讨论的。
在某些实施方案中，长至50个碱基的寡核苷酸可能是合适的，其中至少最少数量的碱基(例如10-12个碱基)与靶序列互补。然而，通常，细胞中的促进或主动摄取在寡核苷酸长度小于约30个碱基时得到优化。对于磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)反义寡聚物，结合稳定性和摄取的最佳平衡通常发生在18-25个碱基的长度。包括由约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基组成的反义寡聚物(例如，CPP-PMO、PPMO、PMO、PMO-X、PNA、LNA、2′-OMe、2′MOE、2′F寡聚物、硫代吗啉代和其他混合寡聚物化学物质)。PMO-磷酰二胺吗啉代寡聚物；CPP-细胞穿透肽；PPMO-肽缀合的磷酰二胺吗啉代寡聚物；PNA-肽核酸；LNA-锁核酸；2′-OMe-2′O-甲基修饰的寡聚物；2′MOE-2′-O-甲氧基乙基寡聚物，2′F-2′氟)
在某些实施方案中，反义寡聚物可与靶序列100％互补，或者可包括错配，例如，以适应变体，只要寡核苷酸与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酸酶的作用和在体内可能发生的其他降解模式即可。因此，某些寡核苷酸可能在寡核苷酸与靶序列之间具有约或至少约70％的序列互补性，例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互补性。
错配(如果存在)通常对混合双链体末端区域比对中间区域的去稳定性低。根据熟知的双链体稳定性原则，所允许的错配数量将取决于寡核苷酸的长度、双链中G：C碱基对的百分比以及双链体中错配的位置。虽然这种反义寡聚物不一定与靶序列100％互补，但可有效稳定地且特异性地结合靶序列，从而提高mRNA翻译的效率。
在反义寡聚物与靶序列之间形成的双链体的稳定性是结合Tm和双链体对细胞酶促切割的敏感性的函数。寡核苷酸相对于互补序列RNA的Tm可通过常规方法测量，诸如Hames等人，Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，1985，第107-108页所述的那些，或者如Miyada C.G.和Wallace R.B.，1987，Oligonucleotide Hybridization Techniques，Methods Enzymol.第154卷，第94-107页中所述。在某些实施方案中，相对于互补序列RNA，反义寡聚物的结合Tm可高于体温并且优选地高于约45℃或50℃。还包括在60-80℃范围内或更高温度的Tm。
变体的另外示例包括在表1中提供的任何序列或以下序列中任一者的全长上具有约或至少约70％的序列同一性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的反义寡聚物：SEQ ID NO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQID NO：5、22、23、25、30和57。
更具体地，提供了能够结合所选的靶位点以提高OPA1基因转录物或其部分中的mRNA翻译效率的反义寡聚物。反义寡聚物优选地选自表1或以下中提供的那些：SEQ ID NO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57。
mRNA翻译的修饰优选地使核糖体能够接近或改变核糖体以接近OPA1基因转录物以使得核糖体能够优先结合规范起始密码子。
使用反义寡聚物对本发明的mRNA翻译进行修饰可改变核糖体以接近uORF和/或5′UTR区域的一部分，或者可改变核糖体以一次接近uORF和/或5′UTR区域的两个或更多个部分。
本发明的反义寡聚物可以是能够结合所选靶标以诱导OPA1基因转录物的翻译改变的两种或更多种反义寡聚物的组合。所述组合可以是两种或更多种反义寡聚物的混合物和/或包含连接在一起的两种或更多种反义寡聚物的构建体。
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还提供了一种用于调节OPA1基因转录物的翻译的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种或多种如本文所述的反义寡聚物并允许寡聚物结合至靶核酸位点。
根据本发明的又另一方面，提供了OPA1的翻译操作靶核酸序列，其包含选自表1或由SEQ ID NO：1-60组成的组的核酸序列的DNA等同物；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57，以及与之互补的序列。
设计反义寡聚物以完全掩盖共有的uORF调控元件可能不一定生产靶基因转录物翻译的改变。此外，本发明人已经发现反义寡聚物本身的大小或长度在设计反义寡聚物时并不总是主要因素。对于一些靶标，短至20个碱基的反义寡聚物能够诱导翻译的一些变化，在某些情况下比针对相同调控元件的其他较长(例如25个碱基)寡聚物更有效。
本发明人还已经发现似乎没有任何标准基序可被反义寡聚物阻断或掩蔽以重定向翻译。已经发现必须设计反义寡聚物，并且根据经验评估它们的个体功效。
更具体地，反义寡聚物可选自表1中列出的那些。序列优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1-60中的任一个或多个；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57，以及其组合或混合物。这包括可在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列，与其互补的序列，含有经修饰的碱基、经修饰的骨架的序列，以及其具有或调节OPA1基因转录物中的mRNA翻译活性的功能性截短或延伸。
当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此氢键结合的核苷酸占据时，寡聚物与DNA、cDNA或RNA彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够程度的互补性或配对使得稳定和特异性结合发生在寡聚物与DNA、cDNA或RNA靶标之间的术语。本领域中应当理解，反义寡聚物的序列不需要与其可特异性杂交的靶序列100％互补。当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰了靶DNA或RNA产物的正常功能时，反义寡聚物是可特异性杂交的，并且存在足够程度的互补性以避免反义寡聚物在需要特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性治疗的情况下在生理条件下，以及在体外测定的情况下在进行测定的条件下)与非靶序列的非特异性结合。
选择性杂交可在低、中或高严格条件下进行，但优选地在高严格条件下进行。本领域的技术人员将认识到，除了碱基组成、互补链的长度和在杂交核酸之间的核苷酸碱基错配的数量之外，杂交的严格性还将受到诸如盐浓度、温度或有机溶剂等条件的影响。严格温度条件通常将包括超过30℃、通常超过37℃、以及优选超过45℃、优选至少50℃、以及通常60℃-80℃或更高的温度。严格盐条件通常低于1000mM，通常低于500mM，以及优选低于200mM。然而，参数的组合比任何单个参数的测量重要得多。严格杂交条件的示例是65℃和0.1x SSC(1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠pH7.0)。因此，本发明的反义寡聚物可包括与表1中或以下提供的序列选择性地杂交的寡聚物：SEQ ID NO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57。
通常，当在至少约14个核苷酸的区段上存在至少约55％的同一性，优选地与反义寡聚物的核苷酸有至少约65％、更优选地至少约75％、以及最优选地至少约90％、95％、98％或99％的同一性时，将发生选择性杂交。如所描述的，同一性比较的长度可在更长的区段内，并且在某些实施方案中通常将在至少约九个核苷酸的区段内，通常至少约12个核苷酸，更通常至少约20个，通常至少约21个、22个、23个或24个核苷酸，至少约25个、26个、27个或28个核苷酸，至少约29个、30个、31个或32个核苷酸，至少约36个或更多个核苷酸。
因此，本发明的反义寡聚物序列与本文序列表中所示的序列优选地具有至少75％、更优选地至少85％、更优选地至少86％、87％、88％、89％或90％的同源性。更优选地存在至少91％、92％、93％、94％或95％，更优选地至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，反义寡聚物的长度越短，获得选择性杂交所需的同一性就越大。因此，当本发明的反义寡聚物由少于约30个核苷酸组成时，与本文序列表中列出的反义寡聚物相比，优选地同一性百分比大于75％，优选地大于85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95％、96、97、98％或99％。核苷酸同一性比较可通过序列比较程序进行，所述序列比较程序诸如GCG WisconsinBestfit程序或GAP(Deveraux等人，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)。以这种方式，可通过在比对中插入空位(例如通过由GAP使用的比较算法来确定此类空位)来比较与本文引用的那些长度相似或大体不同的序列。
本发明的反义寡聚物可具有同一性降低的区域以及与靶序列完全同一性的区域。寡聚物不必在其整个长度上都具有完全同一性。例如，寡聚物可具有与靶序列相同的至少4个或5个碱基的连续区段，优选地与靶序列相同的至少6个或7个碱基的连续区段，更优选地与靶序列相同的至少8个或9个碱基的连续区段。寡聚物可具有与靶序列相同的至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或26个碱基的区段。寡聚物序列的剩余区段可能与靶序列断断续续地相同；例如，剩余的序列可能具有一个相同的碱基，接着是一个不相同的碱基，接着是一个相同的碱基。可替代地(或同时)，寡聚物序列可具有散布着不完全同一性的区段的几个相同序列(例如3个、4个、5个或6个碱基)的区段。这种序列错配将优选地没有或很少损失翻译调节活性。甚至更优选地，此类序列错配将具有增加的翻译调节活性。
术语“调节(modulate或modulates)”包括“增加”或“减少”一个或多个可量化的参数，任选地增加或减少限定的量和/或统计学上显著的量。术语“增加(increase或increasing)”、“增强(enhance或enhancing)”、或“刺激(stimulate或stimulating)”、或“增强(augment或augmenting)”一般指相对于无反义寡聚物或对照化合物引起的反应，一种或多种反义寡聚物或组合物在细胞或受试者中产生或引起更大的生理反应(即下游效应)的能力。术语“减少(decreasing或decrease)”一般指相对于无反义寡聚物或对照化合物引起的反应，一种或多种反义寡聚物或组合物在细胞或受试者中产生或引起降低的生理反应(即下游效应)的能力。
相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可包括功能性OPA1蛋白在有需要的细胞、组织或受试者中的表达增加。“增加”或“增大”的量可能是具统计学上显著的量，并且可包括比当不存在反义寡聚物(不存在药剂)或使用对照化合物时产生的量多了1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍(例如500倍、1000倍)(包括介于两者之间及1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8)的增加。
术语“减少”或“抑制”一般可涉及一种或多种反义寡聚物或组合物“减少”相关生理或细胞反应的能力，诸如在诊断领域根据常规技术所测量的本文所述的疾病的症状。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可包括疾病诸如ADOA的症状或病理学的减轻。
与无反义寡聚物或对照组合物产生的反应相比，反应的“降低”可能是统计学上显著的，并且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的降低，包括介于两者之间的所有整数。
反义寡聚物的长度可变化，只要它能够选择性地结合mRNA分子内的预期位置即可。可根据本文所述的选择程序来确定此类序列的长度。通常，反义寡聚物的长度将为约10个核苷酸，长度至多为约50个核苷酸。然而，应当了解，此范围内的任何长度的核苷酸都可用于该方法中。优选地，反义寡聚物的长度为10个与40个之间、10个与35个之间、15个与30个之间的核苷酸或长度为20个至30个核苷酸，最优选地长度为约25个至30个核苷酸。例如，寡聚物的长度可以是20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。
如本文所用，“反义寡聚物”是指核苷酸的线性序列或核苷酸类似物，其允许核碱基通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以在靶序列中形成寡核苷酸：RNA异源双链体。术语“反义寡聚物”、“反义寡核苷酸”、“寡聚物”和“反义化合物”可互换使用以指代寡核苷酸。环状亚基可以基于核糖或另一种戊糖，或者在某些实施方案中基于吗啉代基团(参见下文对吗啉代寡核苷酸的描述)。还考虑了肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2′-O-甲基寡核苷酸，以及本领域已知的其他反义剂。
包括了非天然存在的反义寡聚物或“寡核苷酸类似物”，包括具有以下项的反义寡聚物或寡核苷酸：(i)经修饰的骨架结构，例如不同于在天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的骨架，和/或(ii)经修饰的糖部分，例如不同于核糖或脱氧核糖部分的吗啉代部分。寡核苷酸类似物支持能够通过与标准多核苷酸碱基的沃森-克里克碱基配对进行氢键结合，其中类似物骨架以允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(例如，单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式形成这种氢键的方式呈现碱基。优选的类似物是那些具有基本上不带电荷的含磷骨架的类似物。
用于产生反义寡聚物的一种方法是2′羟基核糖位置的甲基化和硫代磷酸酯骨架的掺入产生表面上类似于RNA但对核酸酶降解具有强得多的抗性的分子，但是本发明领域的技术人员将意识到可用于本发明目的的其他形式的合适骨架。
为了避免前体mRNA和/或mRNA在与反义寡聚物形成双链体期间降解，可对方法中使用的反义寡聚物进行调整，以最大限度地减少或防止内源性RNA酶H的切割。这种特性是高度优选的，因为处理具有未甲基化寡聚物的RNA，无论是在细胞内还是在含有RNA酶H的粗提取物中，都会导致前体mRNA：反义和/或mRNA：反义寡聚物双链体的降解。任何形式的能够绕过或不诱导这种降解的经修饰的反义寡聚物都可用于本发明的方法中。核酸酶抗性可通过修饰本发明的反义寡聚物以使其包含部分不饱和的脂族烃链和一个或多个极性或带电基团(包括羧酸基团、酯基团和醇基团)来实现。
可根据已知技术制备不激活RNA酶H的反义寡聚物(参见例如，美国专利5149797)中所述的那些。此类反义寡聚物，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，仅包含空间上阻碍或阻止RNA酶H与含有寡聚物作为其一个成员的双链体分子结合的任何结构修饰，该结构修饰基本上不阻碍或破坏双链体形成。由于参与双链体形成的寡聚物部分与参与RNA酶H与之结合的那些部分大体上不同，因此可使用许多不激活RNA酶H的反义寡聚物。例如，此类反义寡聚物可以是这样的寡聚物，其中至少一个或所有核苷酸间桥连磷酸残基是经修饰的磷酸，诸如膦酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸吗啉酯、磷酸哌嗪酯、硼烷磷酸酯、酰胺键和氨基磷酸酯。例如，每隔一个核苷酸间桥接磷酸残基可如所描述的进行修饰。在另一个非限制性示例中，此类反义寡聚物是其中至少一个或所有核苷酸都含有2′低级烷基部分(例如，C1-C4、直链或支链、饱和或不饱和烷基，诸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的分子。例如，每隔一个核苷酸可如所描述的进行修饰。
当与RNA双链化时不被细胞RNA酶H切割的反义寡聚物的一个示例是2′-O-甲基衍生物。此类2′-O-甲基-寡核糖核苷酸在细胞环境和动物组织中是稳定的，并且它们与RNA的双链体比它们的核糖-或脱氧核糖-对应物具有更高的Tm值。可替代地，本发明的核酸酶抗性反义寡聚物可具有至少一个最后的氟化3′-末端核苷酸。仍可替代地，本发明的核酸酶抗性反义寡聚物具有在至少两个最后的3-末端核苷酸碱基之间连接的硫代磷酸酯键，优选地具有在最后四个3′-末端核苷酸碱基之间连接的硫代磷酸酯键。
增加的翻译调节也可用替代的寡核苷酸化学来实现。例如，反义寡聚物可选自包括以下项的列表：氨基磷酸酯或磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)；PMO-X；PPMO；肽核酸(PNA)；锁核酸(LNA)和衍生物，包括α-L-LNA、2′-氨基LNA、4′-甲基LNA和4′-O-甲基LNA；亚乙基桥连核酸(ENA)及其衍生物；硫代磷酸酯寡聚物；三环-DNA寡聚物(tcDNA)；三环硫代磷酸酯寡聚物；2′-O-甲基修饰的寡聚物(2′-O-Me)；2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)；2′-氟(2′F)、2′-氟阿拉伯糖(FANA)；解锁核酸(UNA)；己糖醇核酸(HNA)；环己烯基核酸(CeNA)；2′-氨基(2′-NH2)；2′-O-亚乙基胺或前述作为混合体(mixmer)或间隙体(gapmer)的任何组合。为了进一步改善递送效率，上述经修饰的核苷酸通常与脂肪酸/脂质/胆固醇/氨基酸/碳水化合物/多糖/纳米颗粒等一起缀合至糖或核碱基部分。这些缀合的核苷酸衍生物也可用于构建外显子跳跃反义寡聚物。反义寡聚物诱导的人OPA1基因转录物的翻译调节通常使用寡核糖核苷酸、PNA、2′-O-Me或硫代磷酸酯骨架上的MOE修饰的碱基。尽管将2′-O-Me ASO用于寡聚物设计，但由于它们在作为阳离子脂复合物递送时可在体外有效摄取，因此这些化合物易受核酸酶降解的影响，因此被认为不是体内或临床应用的理想选择。当替代化学用于产生本发明的反义寡聚物时，本文提供的序列的胸腺嘧啶(T)可被尿嘧啶(U)替代。
虽然上述反义寡聚物是本发明反义寡聚物的优选形式，但本发明包括其他寡聚反义分子，包括但不限于诸如下文所述的寡聚物模拟物。
可用于本发明的优选反义寡聚物的具体示例包括含有经修饰的骨架或非天然核苷间键的寡聚物。如本说明书中所定义，具有经修饰的骨架的寡聚物包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域有时所引用的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的寡聚物也可被认为是反义寡聚物。
在其他优选的寡聚物模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)两者都被新基团替代。保持碱基单位用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物(已显示具有优良杂交性质的寡聚物模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡聚物的糖骨架被含酰胺的骨架(具体地氨基乙基甘氨酸骨架)替代。核碱基被保留下来并且直接或间接地结合骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。
另一种优选的化学物质是磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)寡聚化合物，它不被任何已知的核酸酶或蛋白酶降解。这些化合物不带电，并且当与RNA链结合时不会激活RNA酶H活性。
经修饰的寡聚物还可包含一个或多个经取代的糖部分。寡聚物还可包括核碱基(在本领域中常常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基特别有用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示会将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，甚至更具体地当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
本发明的寡聚物的另一种修饰涉及将增强寡聚物的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接至所述寡聚物。此类部分包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋甘油-3-H-膦酸酯)、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、肉豆蔻基或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
已将细胞穿透肽添加到磷酰二胺吗啉代寡聚物中，以增强细胞摄取和核定位。已显示不同的肽标签会影响摄取效率和靶组织特异性，如Jearawiriyapaisarn等人(2008)，Mol.Ther.169，1624-1629中所示。
给定化合物中的所有位置不必均一地进行修饰，并且事实上，不止一种上述修饰可掺入单个化合物中，或甚至可掺入寡聚物中的单个核苷中。本发明还包括作为嵌合化合物的反义寡聚物。在本发明的上下文中，“嵌合”反义寡聚物或“嵌合体”是反义寡聚物，特别是寡聚物，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元(即在寡聚化合物的情况下为核苷酸)构成。这些寡聚物通常含有其中寡聚物被修饰以赋予寡聚物或反义寡聚物增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取的至少一个区域，以及用于增加对靶核酸的结合亲和力的附加区域。
可根据本领域的常规技术测定反义寡聚物及其变体的活性。可通过用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的多种熟知的方法中的任何一种来评估所调查的RNA和蛋白质的表达水平。此类方法的非限制性示例包括RNA的剪接形式的RT-PCR，接着是PCR产物的大小分离，核酸杂交方法，例如Northern印迹和/或使用核酸阵列；核酸扩增方法；检测蛋白质的免疫学方法；蛋白质纯化方法；和蛋白质功能或活性测定。可通过从细胞、组织或生物体的蛋白质印迹和/或ELISA测定法并且通过评估下游功能或生理效应来评估的蛋白质表达水平。
如果存在两种或更多种不同大小的转录物，则可通过用于检测相关蛋白质表达的多种熟知的方法中的任何一种来评估所得蛋白质。此类方法的非限制性示例包括用于检测蛋白质的免疫学方法；蛋白质纯化方法；质谱；和蛋白质功能或活性测定。
本发明提供了反义寡聚物诱导的OPA1基因转录物的翻译调节、临床相关的寡聚物化学和递送系统以将功能性OPA1蛋白质引导至治疗水平。功能性OPA1翻译的量以及因此来自OPA1基因转录的OPA1蛋白的临床相关增加通过以下方式实现：
1)使用成纤维细胞的细胞系在体外进行寡聚物精制，通过实验评估(i)靶基序、(ii)反义寡聚物长度和寡聚物混合物的开发、(iii)化学的选择以及(iv)添加细胞穿透肽(CPP)以增强寡聚物递送；以及
2)详细评估通过ATG或近同源起始密码子、抑制或有效空间位阻以增加翻译来调节OPA1翻译的新方法。
OPA1翻译的调节可通过非一级uORF的翻译抑制(强制从最有效的一级uORF起始翻译)或由于二级结构的空间位阻而提高翻译效率来实现。每种方法的相对功效是不可预测的，并且存在关于哪种方法最有效的内在不确定性。
因此，本文证明可用特定的反义寡聚物调节OPA1 mRNA的翻译。以这种方式，可获得OPA1蛋白质量的功能显著增加，从而减少与由OPA1单倍剂量不足引起的ADOA相关的严重病理学。
根据本发明使用的反义寡聚物可通过熟知的固相合成技术方便地制备。用于此类合成的设备由多家供应商出售，所述供应商包括例如Applied Biosystems(Foster City，Calif.)。一种用于在改性固体支持物上合成寡聚物的方法描述于美国专利号4,458,066中。
另外地或可替代地，可使用本领域已知的用于此类合成的任何其他手段。使用类似的技术制备寡聚物诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是熟知的。在一个这样的自动化实施方案中，二乙基-亚磷酰胺被用作起始材料并且可以如Beaucage等人，(1981)TetrahedronLetters，22：1859-1862所述的进行合成。
本发明的反义寡聚物在体外进行合成，并且不包括生物来源的反义组合物或设计用于指导反义寡聚物体内合成的遗传载体构建体。本发明的分子也可与其他分子、分子结构或化合物的混合物(例如脂质体、受体靶向分子等)一起混合、一起封装、缀合或以其他方式缔合。
可将反义寡聚物配制用于口服施用、局部施用、肠胃外施用或其他施用，特别是用于局部眼部和可注射眼部施用的制剂。可配制制剂以帮助在施用或活性部位摄取、分布和/或吸收。优选地，本发明的反义寡聚物被配制用于局部递送至眼睛或通过眼内注射或眼内植入，使得对OPA1产生的影响是空间有限的而不是全身性的。
治疗方法
根据本发明的又另一方面，提供了一种或多种如本文所述的反义寡聚物，用于基于反义寡聚物的疗法。优选地，所述疗法是针对与OPA1表达相关的疾病。更优选地，与OPA1表达相关的疾病的疗法是针对ADOA的疗法。优选地，与OPA1表达相关的疾病与功能性OPA1蛋白表达水平的降低相关。优选地，功能降低的OPA1存在于患有ADOA的患者中，更优选地存在于涉及OPA1单倍剂量不足的ADOA中。
更具体地，反义寡聚物可选自表1或由以下组成的组：SEQ ID NO：1-60中的任一个或多个；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57，以及其组合或混合物。这包括可在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列，与之互补的序列，含有经修饰的碱基、经修饰的骨架的序列，以及其具有或调节OPA1基因转录物中的mRNA翻译的功能性截短或延伸。
本发明还扩展到能够结合所选靶标以诱导OPA1基因转录物的翻译调节的两种或更多种反义寡聚物的组合。所述组合可以是两种或更多种反义寡聚物的混合物、包含连接用于基于反义寡聚物的疗法的两种或更多种或两种或更多种反义寡聚物的构建体。
因此，提供了一种用于治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向所述患者施用有效量的一种或多种反义寡聚物或包含一种或多种如本文所述的反义寡聚物的药物组合物。
优选地，患者中与OPA1表达相关的疾病是ADOA。
因此，本发明提供了一种治疗、预防或改善ADOA的影响的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向所述患者施用有效量的一种或多种反义寡聚物或包含一种或多种如本文所述的反义寡聚物的药物组合物。
优选地，所述疗法用于通过翻译调节策略提高功能性OPA1蛋白的水平。OPA1蛋白水平的提高优选地通过减少从OPA1基因转录物或其部分的5′UTR中的非规范起始元件的翻译来实现，和/或通过改变核糖体以接近OPA1基因转录物或其部分来增加从OPA1的规范起始密码子的翻译。
优选地，反义寡聚物的施用导致OPA1蛋白的表达比OPA1蛋白在具有症状性OPA1突变的受试者中的表达高1.1倍至2.5倍。
功能性OPA1的增加将优选地导致OPA1相关疾病诸如ADOA症状的数量、持续时间或严重程度的降低。
如本文所用，受试者(例如哺乳动物，诸如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可预防性地或在病理事件开始或与病原体接触之后进行。还包括“预防性”治疗，其可针对降低所治疗疾病的进展速率、延迟该疾病的发作或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或其相关症状。
患有与OPA1表达相关的疾病的受试者可以是哺乳动物，包括人。
本发明的反义寡聚物也可与替代疗法诸如药物疗法结合使用。
因此，本发明提供了一种治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的方法，其中本发明的反义寡聚物与另一种与治疗、预防或改善OPA1表达相关疾病的影响有关的替代疗法顺序或同时施用。优选地，所述疾病是ADOA。
递送
本发明的反义寡聚物还可用作预防剂或治疗剂，其可用于治疗疾病的目的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了与OPA1 mRNA中的所选靶标结合以诱导如本文所述的有效且一致的翻译调节的反义寡聚物，其以治疗有效量与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂混合。
还提供了一种药物、预防或治疗组合物，其用于治疗、预防或改善患者中与OPA1表达相关的疾病的影响，所述组合物包含：
a)一种或多种如本文所述的反义寡聚物，以及
b)一种或多种药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
优选地，本发明的反义寡聚物通过局部眼部途径递送以避免全身作用。施用途径包括但不限于玻璃体内、前房内、结膜下、球筋膜下、眼球后、后巩膜(posteriorjuxtascleral)或局部(滴剂、洗眼液、乳膏等)。递送方法包括例如通过注射器和药物递送装置注射，诸如植入的玻璃体递送装置(即，
Figure BDA0004154186880000311
)。
更优选地，以如下的量通过玻璃体内注射施用反义寡聚物：每只眼睛在0.005-5mg之间、每只眼睛0.005-1mg之间、每只眼睛0.005-0.5mg之间、每只眼睛0.01-5mg之间、每只眼睛0.02-1mg之间、每只眼睛0.01-0.5mg之间、每只眼睛0.01-0.1mg之间、每只眼睛0.01-0.5mg之间、每只眼睛2-20mg之间、每只眼睛0.5-20mg之间，或更优选地每只眼睛在5-20mg之间。反义寡聚物可通过玻璃体内注射以如下的量施用：例如每只眼睛约0.01mg、每只眼睛0.02mg、每只眼睛0.03mg、每只眼睛0.04mg、每只眼睛0.05mg、每只眼睛0.06mg、每只眼睛0.07mg、每只眼睛0.08mg、每只眼睛0.09mg、每只眼睛0.1mg、每只眼睛0.2mg、每只眼睛0.3mg、每只眼睛0.4mg、每只眼睛0.5mg、每只眼睛1mg、每只眼睛2mg。优选地，反义寡聚物通过玻璃体内注射以每只眼睛约0.01-0.5mg施用。
反义寡聚物可以规律间隔施用一个短的时间段，例如，每天施用，持续两周或更短时间。然而，在许多情况下，寡聚物在较长时间段内间歇地施用。施用之后可以是在施用抗生素或其他治疗性治疗或施用与施用抗生素或其他治疗性治疗之同时。治疗方案可以根据治疗受试者的免疫测定、其他生物化学测试和生理学检查的结果按指示进行调节(剂量、频率、途径等)。
剂量可取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。可替代地，可根据疾病进展速率滴定剂量。建立基线进展。然后监测初始停止剂量一次后的进展速率，以检查速率是否有所降低。优选地，给药后没有进展。优选地，只有当进展速率未改变，才必需重新给药。成功的治疗优选地导致疾病不再进一步进展或甚至视力有所恢复。最佳给药方案可从患者体内药物积累的测量值进行计算。本领域的普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。
最佳剂量可能根据单个寡聚物的相对效力有所不同，并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50进行估计。
通常，通过玻璃体内注射施用的剂量在每只眼睛0.005-5mg之间，并且所述剂量可每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或者甚至每2年至20年给予一次。给药的重复率取决于疾病的进展速率。本领域的普通技术人员可根据所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度容易地估计给药的重复率。在成功治疗后，可能需要让患者经历维持疗法以防止疾病状态的复发，其中所述寡聚物以维持剂量施用，所述剂量可通过玻璃体内注射以每只眼睛0.005-5mg之间的量施用，每天、每周、每月或每年一次或多次，甚至每2年至20年一次。
使用本发明的反义寡聚物的有效体内治疗方案可根据施用的持续时间、剂量、频率和途径以及接受治疗的受试者的状况(即预防性施用与响应于局部或全身感染而施用)而有所不同。因此，这种体内疗法将通常需要通过适合于治疗中特定类型障碍的测试进行监测，并且相应调整剂量或治疗方案，以便实现最佳治疗结果。
可例如通过本领域已知的疾病的一般指标来监测治疗。体内施用的本发明的反义寡聚物的功效可从在施用反义寡聚物之前、期间和之后取自受试者的生物样品(组织、血液、尿液等)来确定。此类样品的测定包括(1)使用本领域技术人员已知的程序(例如电泳凝胶迁移率测定)监测是否存在与靶序列和非靶序列的异源双链体形成；(2)监测突变mRNA相对于参考正常mRNA或蛋白质的量，如通过标准技术诸如RT-PCR、Northern印迹、ELISA或蛋白质印迹所确定的。
核内寡聚物递送是反义寡聚物的主要挑战。不同的细胞穿透肽(CPP)在不同条件和细胞系中不同程度地定位PMO，并且本发明人已经评估了新型CPP将PMO递送至靶细胞的能力。术语CPP或“增强细胞摄取的肽部分”可互换使用，并且指阳离子细胞穿透肽，也称为“转运肽”、“载剂肽”或“肽转导结构域”。如本文所示，肽具有在给定细胞培养群体的约或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞内诱导细胞渗透的能力，并且允许在全身施用时在体内多个组织内发生大分子易位和/或在眼内施用时允许大分子易位。CPP在本领域中是熟知的并且例如在美国申请号2010/0016215中被公开，所述申请以引用的方式整体并入。
因此，本发明提供了本发明的反义寡聚物与细胞穿透肽的组合，用于制造治疗药物组合物。
赋形剂
本发明的反义寡聚物优选地以药学上可接受的组合物递送。所述组合物可包含约1nM至1000nM的本发明的所需一种或多种反义寡聚物中的每一种。优选地，所述组合物可包含约1nM至500nM、10nM至500nM、50nM至750nM、100nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM，最优选在1nM与10nM之间的本发明的一种或多种反义寡聚物中的每一种。
所述组合物可包含约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM或1000nM的本发明的所需一种或多种反义寡聚物中的每一种。
本发明进一步提供了一种或多种反义寡聚物，其适于以适合于递送至患者的形式帮助预防性或治疗性治疗、预防或改善疾病(诸如OPA1表达相关疾病或病理)的症状。
如本文所用的并且除非另外指示，否则短语“药学上可接受的”是指在施用于患者时为生理上可耐受的并且通常不会产生过敏反应或类似不良反应(诸如胃部不适等)的分子实体和组合物。术语“载剂”是指施用了化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体诸如水和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液优选地用作载剂，特别是用于可注射溶液。合适的药物载剂描述于Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press，PA(2013)。
在本发明的一个更具体的形式中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种本发明的反义寡聚物，连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。此类组合物包括各种缓冲液含量(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂，以及添加剂，诸如去污剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。所述材料可掺入聚合化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体中。也可使用透明质酸。此类组合物可能影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press，PA(2013)。所述组合物可以液体形式制备，或者可以干粉形式(诸如冻干形式)制备。
应当了解，根据本发明提供的药物组合物可通过本领域已知的任何方式施用。用于施用的药物组合物通过注射、口服、局部或通过肺或鼻途径施用。例如，反义寡聚物可通过局部、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下施用途径递送。适当的途径可由本领域技术人员酌情根据接受治疗的受试者的状况来确定。优选地，将本发明的反义寡聚物局部递送至眼睛或通过眼内注射或眼内植入，使得对OPA1产生的影响是空间有限的而不是全身性的。
用于局部施用的制剂包括其中本公开的寡聚物与局部递送剂诸如水凝胶、脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些制剂。脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。对于局部或其他施用，可将本公开的寡聚物封装在脂质体中或可与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，寡聚物可与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐以及它们的用途在美国专利号6,287,860和/或1999年5月20日提交的美国专利申请序列号09/315,298中进一步进行了描述。
在某些实施方案中，本公开的反义寡聚物可通过局部或经皮方法递送(例如，通过将反义寡聚物掺入例如乳液中，其中此类反义寡聚物任选地包装到脂质体中)，包括递送至眼表面。这种局部或透皮和乳液/脂质体介导的递送方法在本领域中描述用于递送反义寡聚物，例如，在美国专利号6,965,025中。优选地，局部递送是递送至眼睛。
本文所述的反义寡聚物也可通过可植入装置递送。这种装置的设计是本领域公认的过程，例如，合成植入物设计在例如美国专利号6,969,400中有所描述。优选地，植入物能够被植入眼中以持续递送反义寡聚物。
用于眼部施用(包括眼部注射、局部眼部递送和眼部植入)的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其还可含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，诸如但不限于渗透增强剂、载剂化合物和其他药学上可接受的载剂或赋形剂。
治疗有用量的反义寡聚物的递送可通过先前公开的方法实现。例如，反义寡聚物的递送可通过包含反义寡聚物和有效量的嵌段共聚物的共混物的组合物进行。美国专利申请US20040248833中描述了该方法的示例。以下文献中描述了将反义寡聚物递送至细胞核的其他方法：Mann CJ等人(2001)Proc，Natl.Acad.Science，98(1)42-47；以及Gebski等人(2003)Human Molecular Genetics，12(15)：1801-1811。US 6,806,084中描述了一种通过作为裸DNA或与脂质载剂复合的表达载体将核酸分子引入细胞的方法。
可使用本领域认可的技术(例如，转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒和病毒和非病毒载体以及本领域已知的其他手段)将反义寡聚物引入细胞中。所选的递送方法将至少取决于待处理的细胞和细胞的位置并且对于技术人员而言将是显而易见的。例如，可通过表面上具有引导脂质体的特定标记的脂质体、直接注射到含有靶细胞的组织中、特异性受体介导的摄取等来实现定位。
可能需要在胶体分散系统中递送反义寡聚物。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统(包括水包油乳液)、胶束、混合胶束和脂质体或脂质体制剂。这些胶体分散系统可用于制造治疗性药物组合物。
脂质体是人工膜囊泡，其可用作体外和体内递送媒介物。这些制剂可具有净阳离子、阴离子或中性电荷特性，并且具有可用于体外、体内和离体递送方法的特性。已经表明，大的单层囊泡可封装相当大百分比的含有大分子的水性缓冲液。可将RNA和DNA封装在水性内部中并以生物活性形式递送至细胞(Fraley等人，Trends Biochem.Sci.6：77，1981)。
为了使脂质体成为一种有效的基因转移媒介物，应具备以下特性：(1)以高效率封装感兴趣的反义寡聚物，同时不损害其生物活性；(2)与非靶细胞相比优先和大量结合靶细胞；(3)将囊泡的水性内容物以高效率递送至靶细胞的细胞质；和(4)准确有效地表达遗传信息(Mannino等人，Biotechniques，6：682，1988)。脂质体的组成通常是磷脂的组合，特别是高相变温度磷脂，通常与类固醇(尤其是胆固醇)组合。也可使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，据信其与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。据信对pH敏感或带负电荷的脂质体会捕获DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体两者均已用于将DNA递送至细胞。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，该术语如本文所用是指包含一种或多种特化脂质的脂质体，所述一种或多种特化脂质当掺入脂质体中时相对于缺乏此类特化脂质的脂质体导致循环寿命增加。空间稳定的脂质体的示例是其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂或用一种或多种亲水聚合物(诸如聚乙二醇(PEG)部分)衍生化的那些脂质体。脂质体及其用途在U.S.6,287,860中有进一步描述。
如本领域已知的，可使用例如涉及以下方面的方法来递送反义寡聚物：脂质体介导的摄取、脂质缀合物、聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的内吞作用、以及另外的非内吞的递送模式(诸如显微注射、透化(例如，链球菌溶血素-O透化、阴离子肽透化)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非内吞递送方法)(参见Dokka和Rojanasakul，Advanced Drug Delivery Reviews 44，35-49，以引用的方式整体并入)。
反义寡聚物也可与其他药学上可接受的载剂或稀释剂组合以产生药物组合物。合适的载剂和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。可将组合物配制用于局部、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或经皮施用。
所描述的施用途径仅旨在作为指导，因为熟练的从业者将能够容易地确定最佳施用途径和针对任何特定动物和病状的任何剂量。
已尝试在体外和体内将功能性新遗传物质引入细胞中的多种方法(Friedmann(1989)Science，244：1275-1280)。这些方法包括将要表达的基因整合到经修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)同上；Rosenberg(1991)Cancer Research 51(18)，增刊：5074S-5079S)；整合到非逆转录病毒载体中(Rosenfeld等人(1992)Cell，68：143-155；Rosenfeld等人(1991)Science，252：431-434)；或通过脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989)，同上；Brigham等人(1989)Am.J.Med.Sci.，298：278-281；Nabel等人(1990)Science，249：1285-1288；Hazinski等人(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.，4：206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，84：7851-7855)；耦合到配体特异性、基于阳离子的运输系统(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.，263：14621-14624)或使用裸DNA表达载体(Nabel等人(1990)，同上)；Wolff等人(1990)Science，247：1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)同上)；Rosenfeld等人(1991)同上；Brigham等人(1989)同上；Nabel(1990)同上；和Hazinski等人(1991)同上)。Brigham等人团队(Am.J.Med.Sci.(1989)298：278-281以及Clinical Research(1991)39(摘要))已经报道了在静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物后仅小鼠肺部的体内转染。人类基因疗法程序的评论文章的实例是：Anderson，Science(1992)256：808-813；Bateau等人(2008)，Curr Gene Ther；8(5)：313-23；Mueller等人(2008).Clin Rev Allergy Immunol；35(3)：164-78；Li等人(2006)Gene Ther.，13(18)：1313-9；Simoes等人(2005)Expert OpinDrug Deliv；2(2)：237-54。
本发明的反义寡聚物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐、或在施用于包括人在内的动物后能够(直接或间接)提供其生物活性代谢物或残余物的任何其他化合物。因此，例如，本公开还涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐、所述前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性并且不会赋予其不希望的毒理学效应的盐。对于寡聚物，药学上可接受的盐的优选示例包括但不限于：(a)与阳离子形成的盐，所述阳离子诸如钠、钾、铵、镁、钙、多胺诸如精胺和亚精胺等；(b)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)与有机酸形成的盐，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(d)由元素阴离子形成的盐，所述元素阴离子诸如氯、溴和碘。本发明的药物组合物可以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。施用可通过局部(包括眼睛和粘膜，以及直肠递送)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过雾化器)、气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或胃肠外途径进行。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、眼内或肌肉内注射或输注；或颅内(例如鞘内或脑室内)施用。具有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡聚物被认为特别可用于眼内施用。优选地，反义寡聚物经由眼内途径递送。
可方便地以单位剂量形式存在的本发明药物制剂可根据制药工业中熟知的常规技术来制备。此类技术包括使活性成分与药物载剂或赋形剂缔合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载剂或细碎固体载剂或两者均匀并紧密地缔合，然后根据需要将产物成型来制备制剂。
用途
根据本发明的另一方面，提供了一种或多种如本文所述的反义寡聚物在制备用于调节或控制与OPA1蛋白表达相关的疾病的药物中的用途。
本发明还提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡聚物在制备用于治疗与OPA1蛋白表达相关的疾病的药物中的用途。
还提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡聚物在制备用于治疗、预防或改善与OPA1蛋白表达相关的疾病的影响的药物中的用途。
优选地，OPA1相关疾病是ADOA。优选地，与OPA1蛋白表达相关的疾病与功能性OPA1蛋白水平降低相关。优选地，功能性OPA1蛋白水平的降低出现在患有ADOA的患者中，更优选地存在于涉及OPA1单倍剂量不足的ADOA中。
根据其又另一方面，本发明延伸至本发明的反义寡聚物序列的cDNA或克隆拷贝，以及包含本发明的反义寡聚物序列的载体。本发明还进一步延伸至包含此类序列和/或载体的细胞。
试剂盒
还提供了一种用于治疗、预防或改善患者中与OPA1蛋白表达相关的疾病的影响的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种如本文所述的反义寡聚物及其组合或混合物，所述试剂盒连同其使用说明书被包装在合适的容器中。优选地，与OPA1蛋白表达相关的疾病是ADOA。
在优选的实施方案中，试剂盒将含有至少一种如本文所述或如表1所示或SEQ IDNO：1-60；更优选地SEQ ID NO：5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57；甚至更优选地SEQ ID NO：5、22、23、25、30和57的反义寡聚物，或如本文所述的反义寡聚物的混合物。试剂盒还可含有外围试剂，诸如缓冲剂、稳定剂等。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液可以是水溶液，例如无菌水溶液。对于体内使用，可将表达构建体配制成药学上可接受的可注射组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼管或其他诸如此类的仪器，可从其中将制剂施用于动物的受影响区域，诸如肺部，注射到动物体内，或甚至应用于试剂盒的其他组件并与之混合。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含治疗有效量的反义寡聚物，所述反义寡聚物能够结合OPA1基因转录物上的所选靶标以修饰OPA1基因转录物或其部分的翻译。在替代性实施方案中，制剂是预先测量的、预先混合的和/或预先包装的。优选地，眼内溶液是无菌的。
本发明的试剂盒还可包括经设计用于促进使用者依从性的说明书。如本文所用，说明书是指任何标签、插页等，并且可位于包装材料的一个或多个表面上，或者说明书可在单独的纸上提供，或其任何组合。例如，在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括用于施用本发明的制剂的说明书。在一个实施方案中，说明书表明本发明的制剂适用于治疗ADOA。此类说明书还可包括关于剂量的说明书，以及用于通过局部递送至眼睛或通过眼内注射施用的说明书。
反义寡聚物和合适的赋形剂可单独包装，以允许从业者或使用者根据需要将组分配制成药学上可接受的组合物。可替代地，可将反义寡聚物和合适的赋形剂包装在一起，从而从业者或使用者需要最小量配制。无论如何，包装应保持活性成分的化学、物理和美学完整性。
概述
本领域技术人员将理解的是，本文所述的发明易于作出除了具体描述的那些以外的变化和修改。本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及任何和所有组合或任何两个或更多个所述步骤或特征。
在本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利都通过引用明确地完整地并入本文，这意味着读者应该将其作为本文的一部分来阅读和考虑。在本文中引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复，这仅仅是出于简洁的原因。
针对本文提及的或在通过引用并入本文的任何文件中的任何制造商的说明、描述、产品规格和任何产品的产品表都通过引用特此并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。
本发明在范围上不受本文所述的任何具体实施方案的限制。这些实施方案仅仅是为了举例说明的目的。功能等同的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明范围内。
本文描述的发明可以包括一个或多个范围的值(例如尺寸、位移和场强等)。值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括限定该范围的值，以及与该范围相邻的值，其导致与紧邻限定该范围的边界的值相同或基本相同的结果。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望特性而变化。因此，“约80％”表示“约80％”，以及还有“80％”。至少，应该根据有效数字的数目和普通的舍入方法来解释每个数值参数。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解成意指包括所陈述的整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。还应当指出的是，在本公开中尤其是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等等；并且这些术语如“基本上由......组成(consistingessentially of)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被清楚叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。
本文使用的选定术语的其他定义可以在本发明的详细说明中找到，并且适用于全文。除非另外定义，本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。术语“活性剂”可表示一种活性剂，或者可涵盖两种或更多种活性剂。
含有本说明书中包括的核苷酸和氨基酸序列信息的序列标识号(“SEQ ID NO：”)收集在说明书的末尾并且已经使用程序Patentln Version 3.0准备。每个核苷酸或氨基酸序列在序列表中通过数字指示符<210>后跟序列标识符(例如<210>1、<210＞2等)来标识。每个核苷酸或氨基酸序列的长度、序列类型和来源生物体分别由数字指示符字段<211>、<212>和<213>中提供的信息指示。说明书中提及的核苷酸和氨基酸序列由数字指示符字段<400>后跟序列标识符(例如<400＞1、<400>2等)中提供的信息定义。
提出并公开了反义寡聚物命名系统以区分不同的反义寡聚物(参见Mann等人，(2002)J Gen Med 4，644-654)。当测试几种略有不同的反义寡聚物(所有反义寡聚物都针对相同的靶区域)时，这种命名法变得尤为适切，如下所示：
H#A/D(x：y)
第一个字母表示物种(例如，H：人类，M：鼠类)
“#”表示靶外显子号
“A/D”分别表示外显子起始和末端处的受体或供体剪接位点
(xy)表示退火坐标，其中“-”或“+”分别表示内含子或外显子序列。作为一个实例，A(-6+18)表示靶外显子之前的内含子的最后6个碱基和靶外显子的前18个碱基。最近的剪接位点将是受体，因此这些坐标将以“A”开头。描述供体剪接位点的退火坐标可以是D(+2-18)，其中最后2个外显子碱基和前18个内含子碱基对应于反义寡聚物的退火位点。由A(+65+85)表示的完全外显子退火坐标是从该外显子开始的第65个与第85个核苷酸之间(包含端值)的位点。
以下实施例用于更全面地描述使用上述发明的方式，以及阐述经考虑的实现本发明各个方面的最佳模式。应当理解，这些方法决不用于限制本发明的真实范围，而是为了说明的目的提出的。
实施例
实施例1
设计ASO
OPA1的5′UTR区域如图1所示。反义寡核苷酸(ASO)被设计用于靶向5′UTR，目的是在空间上抑制5′UTR二级结构并抑制uORF的选择。
实施例2
在人胚肾细胞中筛选靶向OPA1的5′UTR的2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)ASO。
根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)在HEK293细胞中筛选靶向5′UTR的2′MOE-ASO。按照制造商的说明书使用CytoBuster蛋白提取试剂(Merck Millipore)从转染的细胞中收获总蛋白(48小时)，并且在5％BSA的TBST缓冲液中以1∶500的稀释度使用兔抗OPA1单克隆抗体(Cell Signaling，目录号67589)通过蛋白质印记进行评估。将筛选的2′MOE-ASO与阳性对照ASO平行转染。然而，与阳性对照相比，在设计的2′MOE-ASO序列中未观察到OPA1上调(图2)。
实施例3
在人胚肾细胞中筛选靶向OPA1的5′UTR的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)
使用
Figure BDA0004154186880000451
电穿孔系统/>
Figure BDA0004154186880000452
将靶向OPA1的5′UTR的PMO核转染到HEK293细胞中。在转染后48小时用CytoBuster蛋白提取试剂收集总蛋白，并且通过蛋白质印迹测定来确定OPA1蛋白水平。与未处理的HEK293细胞相比，PMO OPAI_H1A(+10+32)诱导OPA1蛋白表达高达1.5倍(图3)。
实施例4
在ADOA患者成纤维细胞中筛选靶向OPA1的5′UTR的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)
使用
Figure BDA0004154186880000461
电穿孔系统将靶向OPAl的5′UTR的PMO转染到携带OPA1突变(c.2708_2711delTTAG)的患者成纤维细胞中。在转染后24小时和48小时收集总蛋白，并且将其通过蛋白质印迹测定评估。与未处理的对照相比，大多数PMO以时间依赖性方式上调OPA1蛋白表达。PMO OPA1_H1A(+10+32)显示出最高的对OPA1蛋白表达的上调；与未经处理的患者成纤维细胞相比，在48小时时高达2倍(图4)。
使用
Figure BDA0004154186880000462
电穿孔系统将靶向OPA1的5′UTR的PMO转染到携带OPA1突变(c.27082711delTTAG)的患者成纤维细胞中。在转染后48小时收集总蛋白，并且使用蛋白质印迹测定评估OPA1蛋白表达。与经PMO H1A(+10+32)处理的条件相比，PMO OPA1_H1A(-2+21)、H1A(+2+25)、H1A(+7+31)、H1A(+12+36)、H1A(+17+41)和H1A(+44+67)显示出更高的对OPA1蛋白表达的上调(图5A和5B)。
实施例5
设计微步行PMO
使用
Figure BDA0004154186880000463
电穿孔系统将靶向与OPA1_H1A(+10+32)相邻的OPA1的5′UTR的微行走PMO转染到携带OPA1突变(c.2708_2711delTTAG)的患者成纤维细胞中。按照制造商的说明书使用CytoBuster蛋白提取试剂(Merck Millipore)从转染的细胞中收获总蛋白(48小时)，并且在5％BSA的TBST缓冲液中以1∶250的稀释度使用兔抗OPA1单克隆抗体(CellSignaling，目录号67589)，接着使用山羊抗兔IgG H&L抗体(abcam，目录号ab216773，
Figure BDA0004154186880000464
800CW)通过蛋白质印记测定进行评估。将β肌动蛋白用作上样对照，并且使用单克隆小鼠抗β肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich，目录号A5441)、接着使用山羊抗小鼠IgG H&L抗体(abcam，目录号ab216776，/>
Figure BDA0004154186880000465
680RD)进行检测。PMO H1A(+10+32)1mm10C>T将OPA1表达增加到高于由亲本序列H1A(+10+32)诱导的表达(图6)。
使用
Figure BDA0004154186880000471
电穿孔系统将靶向与PMO OPA1_H1A(+44+67)相邻的OPA1的5′UTR的微行走PMO转染到携带OPA1突变(c.2708_2711delTTAG)的患者成纤维细胞中。按照制造商的说明书使用CytoBu ster蛋白提取试剂(Merck Millipore)从转染的细胞中收获总蛋白(48小时)，并且在5％BSA的TBST缓冲液中以1∶250的稀释度使用兔抗OPA1单克隆抗体(CellSignaling，目录号67589)，接着使用山羊抗兔IgG H&L抗体(abcam，目录号ab216773，
Figure BDA0004154186880000472
800CW)通过蛋白质印记测定进行评估。将β肌动蛋白用作上样对照，并且使用单克隆小鼠抗β肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich，目录号A5441)、接着使用山羊抗小鼠IgG H&L抗体(abcam，目录号ab216776，/>
Figure BDA0004154186880000473
680RD)进行检测。PMO H1A(+47+71)2mmC>T、H1A(+49+73)2mmC>T和H1A(+50+74)2mmC＞T将OPA1表达增加到高于由亲本序列H1A(+44+67)诱导的表达(图7A和7B)。
实施例6
在ADOA患者成纤维细胞中筛选靶向OPA1的5′UTR的肽缀合的磷酰二胺吗啉代寡聚 物(PPMO)
将PPMO_H1A(+10+32)与携带OPA1突变(c.2708_2711delTTAG、c.985-1G>A和c.2608delA)的ADOA患者成纤维细胞一起孵育7天。收获细胞用于使用蛋白质印迹分析评估OPA1蛋白表达，并使用β肌动蛋白表达进行归一化。PPMO_H1A(+10+32)以剂量依赖性方式增加OPA1蛋白表达(图8)。在PPMO_H1A(+10+32)处理后评价线粒体功能的改善。在处理后第7天，将经PPMO处理的细胞随后与5mM 2-脱氧-D-葡萄糖(Sigma，目录号D8375)和5mM丙酮酸钠(Thermo Fisher，目录号11360-070)一起孵育18小时，并且按照制造商的说明书使用CellTitre-Glo发光细胞存活力测定(Promega，目录号G7572)定量线粒体ATP。PPMO_H1A(+10+32)增加了来自4名ADOA患者的成纤维细胞中的线粒体ATP水平(图9)。
实施例7
在ADOA患者成纤维细胞中筛选靶向OPA1 5′UTR的PPMO
将PPMO_H1A(+10+32)与携带OPA1突变(c.2708_2711delTTAG和c.985-1G>A)的患者成纤维细胞一起孵育7天，并且评估其针对细胞凋亡的保护效果。经PPMO处理的细胞在细胞收获之前用25-50μM寡霉素处理4小时。将细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭染色，并且使用流式细胞术分析细胞的细胞凋亡。PPMO_H1A(+10+32)在来自3名ADOA患者的成纤维细胞中以剂量依赖性方式保护细胞免于细胞凋亡(图10)。NT：未测试。
序列表
<110> 视觉制药私人有限公司(Vision Pharma Pty Ltd)
<120> 视神经萎缩的治疗
<130> 289920
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<400> 35
ggaatgaccc aggaagtggc cctca 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
gtccaggaat gacccaggaa gtggc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
ctgacaggca cccgtactca gtccg 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
gcctgacagg cacccgtact cagtc 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
agcctgacag gcacccgtac tcagt 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
gagcctgaca ggcacccgta ctcag 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
agagcctgac aggcacccgt actca 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
aagagcctga caggcacccg tactc 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
caagagcctg acaggcaccc gtact 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
gcaagagcct gacaggcacc cgtac 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
ctgacaggca ttcgtactca gtccg 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
gcctgacagg cacttgtact cagtc 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
agcctgacag gcattcgtac tcagt 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
gagcttgaca ggcacctgta ctcag 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
agagcttgac aggcactcgt actca 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
aagagcttga caggcactcg tactc 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
caagagcttg acaggcatcc gtact 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
gcaagagctt gacaggcatc cgtac 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
aacaaccact tcaccctttc taggc 25
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
acaaccactt caccctttct aggc 24
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
acaaccactt caccctttct aggcg 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
aaacaaccac ttcacccttt ctagg 25
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
caaccacttt accctttcta ggc 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
caaccacttc atcctttcta ggc 23
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
acttccgcaa gagcctga 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
tcccaatggc gcatggac 18

Claims (19)

1.一种用于调节OPA1基因转录物或其部分的mRNA翻译的经分离或经纯化的反义寡聚物，所述OPA1基因转录物或其部分具有经修饰的骨架结构和与所述经分离或经纯化的反义寡聚物具有至少75％的序列同一性的序列。
2.如权利要求1所述的反义寡聚物，所述反义寡聚物优选地诱导从所述OPA1基因转录物或其部分的规范起始密码子的翻译增加。
3.如权利要求1所述的反义寡聚物，所述反义寡聚物选自包括SEQ ID NO:1-60的列表。
4.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物含有一个或多个核苷酸位置，所述一个或多个核苷酸位置经受选自包括以下项的列表的替代化学或修饰：(i)经修饰的糖部分；(ii)对RNA酶H的抗性；和/或(iii)寡聚模拟化学。
5.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物通过以下方式进一步修饰：(i)与一部分化学缀合；和/或(ii)用细胞穿透肽标记。
6.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物是磷酰二胺吗啉代寡聚物。
7.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中当任何胸腺嘧啶(T)存在于核苷酸序列中时，所述胸腺嘧啶(T)能够被尿嘧啶(U)替代。
8.如权利要求1所述的反义寡聚物，所述反义寡聚物用于：
i.与所述OPA1基因转录物的5'UTR杂交并且破坏所述OPA1基因转录物或其部分的异常翻译的启动；并且/或者
ii.通过5'UTR二级结构元件的空间抑制而增加功能性OPA1蛋白的翻译。
9.如权利要求1所述的反义寡聚物，所述反义寡聚物用于在具有OPA1突变的患者细胞中：
i.提高线粒体ATP水平；并且/或者
ii.减少细胞凋亡。
10.一种治疗、预防或改善患者中与OPA1表达相关的疾病的影响的药物组合物、预防组合物或治疗组合物，所述组合物包含：
a)一种或多种根据权利要求1至9中任一项所述的反义寡聚物，和
b)一种或多种药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
11.一种用于调节OPA1基因转录物的翻译的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种或多种根据权利要求1至9中任一项所述的反义寡聚物，并且允许所述一种或多种寡聚物结合至靶核酸位点。
12.一种治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向所述患者施用有效量的一种或多种根据权利要求1至9中任一项所述的反义寡聚物或包含一种或多种根据权利要求10所述的反义寡聚物的药物组合物。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的经纯化和经分离的反义寡聚物的用途，其用于制造治疗、预防或改善与OPA1表达相关的疾病的影响的药物。
14.一种治疗、预防或改善患者中与OPA1表达相关的疾病的影响的试剂盒，所述试剂盒至少包含包装在合适容器中的根据权利要求1至9中任一项所述的反义寡聚物、以及其使用说明书。
15.如权利要求10所述的组合物、如权利要求11或12所述的方法、如权利要求13所述的用途或如权利要求14所述的试剂盒，其中所述OPA1表达相关疾病是常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。
16.如权利要求10所述的组合物、如权利要求11或12所述的方法、如权利要求13所述的用途或如权利要求14所述的试剂盒，其中患有所述与OPA1表达相关的疾病的受试者是人。
17.如权利要求10所述的组合物、如权利要求11或12所述的方法、如权利要求13所述的用途或如权利要求14所述的试剂盒，所述组合物、所述方法、所述用途或所述试剂盒导致与所述OPA1蛋白的表达比在具有症状性OPA1突变的受试者中的所述OPA1蛋白的表达高1.1倍至2.5倍。
18.如权利要求1的所述反义寡聚物，所述反义寡聚物选自包括SEQ ID NO:5、9、13、16-18、20-27、30、32、42、49-52、54-55和57的列表。
19.如权利要求1所述的反义寡聚物，所述反义寡聚物选自包括SEQ ID NO:5、22、23、25、30和57的列表。
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