KR20220027059A - Sod1 관련 질환의 치료 - Google Patents

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수잔 플레처
로렌 플린
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블랙 스완 파마슈티컬스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 SOD1과 상보성이어서, SOD1의 감소된 발현을 생성하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. SOD1의 감소된 발현은 근위축성 측색 경화증과 같은 의학적 장애에 유리하다.

Description

SOD1 관련 질환의 치료
본 발명은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)(SOD1) 유전자에서 엑손 스키핑(exon skipping)을 통해 대안적인 스플라이싱(alternative splicing)을 유도하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)(AON)에 관한 것이다. 본 발명은 AON 및 AON을 포함하는 치료학적 조성물을 SOD1 유전자에 투여함으로써 SOD1 유전자의 발현과 관련된 질환의 작용(effect)을 치료, 예방 또는 개선(ameliorating)시키는 방법을 제공한다.
배경 분야
배경 분야의 다음의 논의는 본 발명만의 이해를 촉진하는 것으로 의도된다. 논의는 언급된 임의의 자료가 본 출원의 우선일 기준으로 공통적인 일반 지식의 부분이거나 부분이었음을 승인 또는 인정하는 것이 아니다.
가용성 SOD1 효소(또한 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제로 공지됨)는 세포내 독성 슈퍼옥사이드 유리 라디칼을 무-독성 퍼옥사이드(H202)로 전환시킨다(Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 1995, 64, 97-112). 슈퍼옥사이드 음이온(O2-)은 산화 스트레스를 유발할 수 있는 잠재적으로 유해한 세포 부산물이다. 뉴런은 특히 이의 높은 대사 요구도로 인하여 산화 스트레스를 받기 쉬우므로, 다량의 슈퍼옥사이드 라디칼을 생산한다.
SOD1 유전자내 돌연변이는 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)에 연루되어 왔다. ALS는 운동 뉴런에 영향을 미치는 불치의 퇴행성 질환(fatal degenerative disease)이다. ALS는 점진적인 근육 약화(muscular weakness) 및 위축(atrophy)을 유발하여, 약 3 내지 5년 내에 마비(paralysis) 및 사망을 초래한다.
현재 상업적으로 이용가능한 ALS에 대한 유일한 치료 선택사항은 릴루졸, 및 아다라본(미국 및 일본만)이며, 이는 수명을 약 2 내지 3개월 연장시킬 수 있다. 모든 다른 이용가능한 치료 선택사항은 일시적인 처방이다. 약 5 내지 10%의 ALS 경우는 유전 인자에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. ALS의 가족성 형태의 약 20%는 SOD1 유전자에 대한 돌연변이에 의해 유발된다는 점에서, SOD1 유전자 내 가족성 ALS와 미스센스 돌연변이(missense mutation) 사이에는 긴밀한 유전적 연계가 있다(Rosen, Nature, 1993, 362, 59-62).
마우스내 SOD1의 완전한 부재가 수명을 감소시키거나 질환을 유발하지 않으므로, 이러한 돌연변이는 SOD1 활성의 손실보다는 독성 기능의 획득을 암호화(encoding)하고 있는 경향이 있다(Al-Chalabi and Leigh, Curr. Opin. Neural., 2000, 13, 397-405; Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther., 2000, 11, 25 2315-2329). 돌연변이된 SOD1은 비정상적인 기질을 지닌 활성 및 감소된 슈퍼옥사이드 라디칼 스캐빈징 능력을 증가시켰다. 지금까지, 150개 이상의 가족성 SOD1 돌연변이가 발견되었다(Cleveland, D and Rothstein, Nat. Rev. Neurosci, 2001, 2, 806-819; Andersen P, Curr. Neurol. Neurosci., 2006, 6, 1 37-46; Renton et al., Nat. Neurosci., 2014, 1, 17-23).
돌연변이에 SOD1 독성에 대해 2개의 모델이 존재한다(Cleveland and Liu, Nat. Med., 2000, 6, 1320-1321). "산화 가설(oxidative hypothesis)"은 천연 SOD1 단백질 구조가 돌연변이-의존하여 느슨해짐을 통해 촉매 구리 이온에 대한 접근을 이루는 퍼옥시니트라이트 또는 과산화수소와 같은 비정상적인 기질의 결합에 대한 독성으로 고려한다(Cleveland and Liu, Nat. Med., 2000, 6, 1320-1321). 돌연변이체 SOD1 독성에 대한 제2의 잠재적인 메카니즘은 돌연변이체 SOD1 단백질의 미스폴딩(misfolding) 및 응집을 포함한다(Cleveland and Liu, Nat. Med., 2000, 6, 1320-1321). 이러한 가설은 SOD1 돌연변이체-매개된 질환의 쥐 모델이 운동 뉴런 및, 일부 경우에, 또한 이들을 둘러싸고 성상세포내에서 우세한 세포내 혼입을 특징으로 한다는 관찰에 의해 뒷받침된다(Bruijn et al., Science, 1998, 281, 1851-1854). 또한, 브루진(Brujin) 등은 야생형 SOD1의 제거 또는 상승이 마우스에서 돌연변이체 SOD1에 의해 유도된 질환에 영향을 미치는 것이 발견되었음을 입증하고 있다(Bruijn et al., Science, 1998, 281, 1851-1854).
사람 SOD1 유전자(예를 들면, SOD1G93A 마우스)의 돌연변이체 형태를 과발현하는 유전자이식 마우스는 ALS의 대부분의 병리학적 특징을 나타내고 ALS 전임상 연구에 광범위하게 사용된다(Gurney et al., Science, 1994, 264, 5166 1772-1775). 따라서, 돌연변이체 SOD1의 벌현을 감소시키는 것은 ALS의 SOD1-연결된 형태를 치료하기 위한 이론적 전략이다.
미스폴딩된 야생형 SOD1 단백질 응집물의 축적이 또한 SOD1 돌연변이가 있는 ALS 환자에서 보고되었으며, 이는 SOD1이 신경변성에 중심적 역활을 함을 시사한다. 미스폴딩된 야생형 SOD1 축적은 C9ORF72, FUS, KIP5, ALSIN, NEK1 및 VAPB에서(Forsberg et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry., 2019, 90, 8, 861-869) 및 산발적(sporadic) ALS 환자(Forsberg et al., PLoS One, 2010, 5, 7, e11552; Rotunno et al., Front Cell Neurosci., 2013, 7 253)에서 돌연변이를 수반하는 ALS 환자의 사후 척수 조직에서 관찰되었다. 미스폴딩된 야생형 SOD1은 산화 스트레스 및 단백질 산화에 의해 유발된 해독 후 변형을 통해 발생하는 경향이 있으며, 일단 미스폴딩되면, SOD1은 다른 주요 단백질을 응집체로 프리온 유사 방식으로 봉쇄(sequester), 변질(corrupt) 또는 악화(exacerbate)시키는 경향이 있다(Xu et al., Cell Death Dis., 2018, 9, 2, 67).
유전 구조적 변화는 ALS 유전자 및 주변 유전자 영역 내에서 확인되었고 산발성 질환 위험 및 진행과 관련되었다(Pytte et al., Neurol. Genet., 2020, 6, 2). 다쿠다(Takuda) 등은 건강한 대조군에서는 분명하지 않은, 미스폴딩된 SOD1에 대해 특이적인 항체에 의해 검출된, sALS 환자의 CSF 내에서 미스폴딩된 야생형 SOD1의 존재를 보고하였다(Takuda et al., Mol. Neurodegener. 2019, 14, 47).
제US 2019/0256914 A1호는 SCAF4 및 fALS 위험과 관련된 SOD1 유전자 영역내 폴리T 구조적 변이체를 기술하고 있다.
siRNA를 사용한 돌연변이체 SOD1 발현의 억제는 먼저 SOD1-연결된 ALS 마우스에서 유의적인 치료학적 효능을 입증하였다. 라울(Raoul) 등은 사람 SOD1에게 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하는 렌티바이러스를 주사하는 것이 SOD1G93A 마우스에서 사람 SOD1 지연된 질환 발병 및 진행을 지연시켰음을 나타내었다(Raoul et al., Nat. Med. 2005, 11, 4 423-428). 독립적으로, 랄프(Ralph) 등은 사람 SOD1에 대한 RNAi의 발현을 매개하는 렌티바이러스의 근육내 주사가 동일한 ALS 마우스 모델에서 신경변성을 예방하고 생존을 연장시켜, 최대 77% 수명 증가를 초래함을 입증하였다(Ralph et al., Nat. Med., 2005, 11, 4 429-433).
뇌실 내로 변형된 AON의 연속 주입은 뇌 및 척수 전체에 SOD1 mRNA 및 단백질 수준의 효율적이고 광범위한 감소를 허용하여, SOD1G93A 돌연변이에 의해 유발된 ALS의 랫트 모델에서 질환 진행을 유의적으로 지연시키는 것으로 보고되었다(Smith et al., J Clin. Invest., 2006, 166, 2290-2296).
PC12 랫트 크롬친화세포종(pheochromocytoma) 뉴런 세포에서 SOD1의 발현은 랫트 SOD1 뉴클레오타이드 54-74 및 497-517을 표적화하는 21의 21-머(mer) AON 중 어느 하나에 의해 억제되어 세포 세포자멸사(apoptosis)를 초래한다. 세포 사멸의 진행은 항산화제의 처리에 의해 역전되었다(Troy and Shelanski, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994, 91, 6384-6387).
수개의 잠재적인 AON 표적화 SOD1이 확인되었다.
제WO 94/19493호는 SOD1을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 개시하고 있으며 일반적으로 질환이 있는 환자 치료용 의약의 제조시 돌연변이체 및 야생형 형태에서 SOD1을 암호화하는 유전자의 안티센스 DNA 동족체의 용도를 청구하고 있다.
문헌: Biferi et. al. (2017)은 다양한 정도까지 엑손 스키핑을 유도하는 것으로 확인된 SOD1을 표적화하는 5개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 개시하고 있다.
SOD1에 대해 지시된 이중 가닥 핵산 분자의 용도는 또한 제WO 2017/007813호에 개시되어 있다. 특히 특이적인 서열을 지닌 sd-rxRNA가 개시되었다.
추가로, 제WO 2016/016449호에서, SOD1을 표적화하는 4개의 AON이 엑손 스키핑을 통한 대안적인 스플라이싱(alternative splicing)을 유도하는 것으로 확인되었다.
제WO 2005/040180호 및 제US 2017/0037410 A1호는 또한 RNase H-매개된 SOD1 분해를 유도하는 2'-O-메톡시에틸 갭머(gapmer) AON를 기술하고 있다.
AON을 사용한 이러한 방법 중 어느 것도 아직까지 효과적으로 상업적으로 이용가능한 ALS 치료를 이끌지 못하였다.
그러나, 안티센스 기술은 특이적인 유전자 생성물의 발현을 감소시키는 효과적인 수단으로 대두되고 있으므로 SOD1 발현을 조절하기 위한 다수의 치료, 진단, 및 조사용 적용에 유일하게 유용한 것으로 입증될 수 있다. 안티센스 기술은 상이한 수준(전사, 스플라이싱, 안전성, 해독)에서 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 안티센스 기술을 사용한 도전은 이것이 생체내(in vivo)에서 목적한 효과를 갖는 특이적인 AON을 확인하기에 매우 어렵다는 것이다.
따라서, ALS 치료를 확인하고 개발하도록 하는 많은 수의 연구가 이루어졌음에도 불구하고, ALS의 치료를 위한 필요성이 여전히 남아있다. 이러한 치료에 대한 명확한 방향은 아직까지 존재하지 않는다.
이러한 배경의 측면에서, 본 발명이 개발되었다. 특히, 본 발명은 ALS를 개선시키기 위한 수단을 제공함으로써 지금까지 달성하기 힘들었던 질환 치료를 제공하는 것을 추구한다.
발명의 요약
본 발명은 SOD1을 암호화하는 핵산을 표적화하는 화합물, 특히 AON에 관한 것이다. 본 발명의 구현예는 SOD1 프레(pre)-mRNA에 결합할 수 있는 AON에 관한 것이다.
개괄적으로, 본 발명의 일 양태에 따라서, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 프레(pre)-mRNA를 암호화하는 핵산을 표적화한 단리되거나 정제된 AON이 제공되며, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열, 또는
b. 표적 RNA에 대해 충분한 서열 상보성(sequence complementarity)을 가져서 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하는 서열로서, 여기서 상기 서열이 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42가 또한 결합하는 표적 SOD1 프레-mRNA내 적어도 8개 이상의 연속 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 가지고,
c. 여기서 AON은 사람 SOD1의 발현을 억제한다.
바람직하게는, AON은 엑손 스키핑을 통해 SOD1 예비-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 보다 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이며 예로서 본 발명은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열이다. 가장 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이고 펩타이드 모이어티(moiety)와 함께 접합된다.
본 발명은 이의 여전히 추가의 양태에 따라서, 본 발명의 AON 서열의 cDNA 또는 클로닝된 카피 뿐만 아니라 본 발명의 AON 서열 중 하나 이상을 함유하는 벡터에 연장된다. 본 발명은 또한 이러한 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 연장된다.
또한 SOD1 프레(pre)-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON을 제공하는 단계 및 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
또한 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴링과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제학적, 예방학적 또는 치료학적 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON; 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및또는 희석제를 포함한다. 바람직하게는, SOD1 내의 돌연변이와 관련된 질환은 ALS이다.
또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON; 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
또한 대상체(subject)에서 SOD1 내의 돌연변이와 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 대상체에서 미스폴딩된 SOD1과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 대상체에서 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 바이오마커(biomarker)에 의해 확인된 대상체에서, ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은:
a) 대상체를 SOD1 억제에 대해 반응하는 경향이 있는 ALS 환자와 관련된 바이오마커의 존재에 대해 시험하는 단계; 및
b) 대상체가 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 대상체게에 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 바이오마커는 SOD1 유전자 영역내 유전적 구조적 변이체이다.
또한 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 제공된다.
또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약을 제조하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 제공된다.
또한 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 본원에 제공된다.
또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제되고 단리된 AON의 용도가 본원에 제공된다.
또한 대상체에서 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트(kit)가 본원에 제공되며, 이러한 키트는 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기(container) 속에 패키지된(packaged), 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 AON을 포함한다.
또한 대상체에서 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트가 본원에 제공되며, 이러한 키트는 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기 속에 패키지된, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 AON을 포함한다.
본 발명의 추가의 특징은 이의 몇가지 비-제한적 구현예의 다음 설명 설명에서 보다 충분히 기술된다. 이러한 설명은 본 발명을 예시할 목적을 위해 단독으로 포함된다. 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 광범위한 요약, 개시내용 또는 설명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
다음의 설명은 다음 첨부되는 도면에 대한 참고로 제공된다.
도 1은 SOD1 엑손 2, 3 또는 4 스키핑(skipping)을 유도하도록 설계된 2'O메틸 AON의 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 2는 서열 최적화 및 2'O메틸 AON의 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 3은 추가의 엑손 2, 3 및 4를 표적화하는 AON 최적화(optimisation) 및 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 4는 핵감염(nucleofection)에 의한 AON 서열 AON 6 및 AON 8을 사용한 PMO 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 5는 AON 서열 AON 6 및 AON 8을 사용한 PMO 핵감염 후 SOD1 전사체 및 단백질 분석을 나타낸다.
도 6은 SOD1 환자 섬유아세포에서 AON 서열 AON 6 및 AON 8을 사용한 PMO 핵감염 후 SOD1 단백질 분석을 나타낸다.
도 7은 SOD1-연결된 환자 유도된 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)(iPSC) 유래된 운동 뉴런을 사용한 PMO 전기천공(electroporation) 후 SOD1 전사체 및 단백질 분석을 나타낸다.
도 8은 SOD1A4V iPSC-유래된 운동 뉴런에서 세포 생존능 마커로서 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 수준에서 SOD1 단백질 녹다운(knockdown)의 효과를 나타낸다.
도 9는 PMO 형질감염된(50 및 25 μM) SOD1D90A 섬유아세포 내에서 과산화수소 손상 후 반응성 산소종(reactive oxygen species)(ROS)의 세포내 수준에서 SOD1 단백질 억제의 효과를 나타낸다.
도 10은 SOD1D90A 섬유아세포내로 전기천공 후 SOD1 단백질 수준 및 세포 독성에 있어서 AON 8 PMO 및 RNase H 포스포로티오에이트 AON의 효과의 비교를 나타낸다.
도 11은 유전자이식 SOD1G93A 마우스에서 SOD1 PMO(AON 6 및 AON 8)의 생체내(in vivo) 평가 후 분해된 뇌 조직으로부터의 SOD1 전사체 및 단백질 분석을 나타낸다.
도 12는 본 발명에서 SOD1 전사체 및 AON의 결합 위치의 도해를 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 AON 치료요법을 사용하여 ALS의 증상을 개선시키는 예방학적 또는 치료학적 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 프레(pre)-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화하는 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 제공한며, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열, 또는
b. 표적 RNA에 대해 엑손 스키핑을 유도하기에 충분히 서열 상보성인 서열로서, 여기서 상기 서열은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 41가 또한 결합된 표적 SOD1 프레-mRNA 내에서 적어도 8개 이상의 연속 핵염기에 대해 상보성인 서열을 갖고
c. 여기서 AON은 사람 SOD1의 발현을 억제한다.
바람직하게는, AON은 엑손 스키핑을 통해 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 보다 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이고 예로서, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열이다.
편의상, 다음의 단락은 일반적으로 본원에 사용된 용어의 다양한 의미를 요약한다. 이러한 논의에 이어서, 본 발명의 조성물, 의약의 용도 및 방법에 관한 일반적인 양태가 논의되고, 이어서 본 발명의 다양한 구현예의 특성을 입증하는 구체적인 실시예 및 이들을 사용할 수 있는 방법이 논의된다.
1. 정의
명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정의 용어 및 어구의 의미가 하기 제공된다. 당해 분야의 용도와 본원에 제공된 이의 정의 사이에 명확한 차이가 존재하는 경우, 명세서 내 본원에 제공된 정의가 우선한다.
당해 분야의 기술자는 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변화 및 변형을 허용할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변화 및 변형을 포함한다. 본 발명은 또한 명세서 내에 지칭되거나 나타낸 모든 단계, 특징, 제형 및 화합물을 개별적으로 또는 총괄적으로 및 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.
본 내용에 인용된 각각의 문서, 참고문헌, 특허원 또는 특허는 이의 전문이 본원에 참고로 포함되며, 이는 이것이 본 내용의 일부로서 판독자가 읽고 고려할 수 있는 것을 의미한다. 본 내용애 인용된 이러한 문서, 참고문헌, 특허원 또는 특허는 단지 간결성의 이류이다. 그러나, 인용된 자료 또는 자료 속에 함유된 정보 중 어느 것도 통상의 상식인 것으로 이해될 수 없다.
본원에 언급되거나 본원의 참고문헌에 포함된 임의의 문서에 언급된 임의의 생성물에 대한 제조업자의 설명서, 기술, 생성물 명세, 및 생성물 시이트는 이에 의해 참고로 본원에 포함되며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 임의의 구체적인 구현예에 의해 영역이 한정되지 않아야 한다. 이러한 구현예는 단지 예시 목적으로만 의도된다. 기능적 등가 생성물, 제형 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이 명확하게 본 발명의 영역내에 있다.
작업 실시예 외에, 또는 달리 나타낸 경우, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형된 것으로 이해될 수 있다. 용어 "약"은 퍼센트와 관련하여 사용된 경우 ±1%를 의미할 수 있다.
본원에 기술된 발명은 하나 이상의 범위의 값(예컨대, 크기, 농도 등)을 포함할 수 있다. 값의 범위는 범위 내 모든 값, 예를 들면, 범위를 정의하는 값 및 범위에 대해 경계부를 정의하는 이러한 값에 바로 인접한 값과 동일하거나 실질적으로 동일한 결과를 도출하는 범위에 인접한 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 당해 분야의 기술자는 범위의 상한치 또는 하한치의 10% 변화가 전체적으로 적절할 수 있으며 본 발명에 포함됨을 이해할 것이다. 보다 특히, 범위의 상한치 또는 하한치에서의 변화가 5%일 것이거나 당해 분야에서 일반적으로 인식되는 바와 같이, 어느쪽이든 보다 크다.
본 출원에서, 단수의 사용은 또한 달리 구체적으로 기술하지 않는 한, 복수를 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 기술하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들면, "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한되지 않는다. 또한, "성분" 또는 "구성성분"과 같은 용어는 하나의 단위 및, 달리 구체적으로 기술하지 않는 한 하나 이상의 소단위를 포함하는 성분 및 구성성분 둘 다를 포함한다. 또한, 용어 "부위"의 사용은 모이어티의 부분 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변화는 기술된 정수 또는 정수의 그룹을 포함함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하는 것으로 이해되지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여하다"는 이의 목적한 작용 부위에서 조성물의 적어도 부분적인 국재화를 야기하는 방법 또는 경로에 의해 대상체내로 조성물을 대체하여 목적한 효과를 생산함을 지칭한다. 본원에 기술된 화합물 또는 조성물은 경구 또는 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장, 및 국소(예를 들면, 볼 및 설하) 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 임으의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원에 사용된 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 찾을 수 있으며 전체에 적용될 수 있다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 과학적 및 기술적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특징은 이제 다음의 비-제한적인 설명 및 실시예를 참고로 논의될 것이다.
2. 구현예
본 발명의 구현예는 일반적으로 증진된 안티센스 화합물, 및 이의 방법 또는 용도에 관한 것이며, 이는 구체적으로 SOD1 유전자의 발현을 억제하도록 설계된다. SOD1 유전자 내 돌연변이 및 미스폴딩은 ALS와 같은 질환에 연루되어 왔다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 ALS를 앓는 환자에서 SOD1의 발현을 억제하는 것이 이러한 환자의 생존을 증진시키는 효과를 가질 수 있다는 이해를 기반으로 한다. 이는 ALS 환자에서 SOD1 유전자내 돌연변이가 독성 기능의 획득을 야기하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 따라서, SOD1 유전자의 억제는 ALS 환자의 증진된 생존을 야기하는 것으로 가설화되어 있다. 이러한 치료요법으로부터 유리할 수 있는 ALS 환자는 SOD1 유전자 내에 돌연변이 또는 미스폴딩을 가질 수 있다. 그러나, SOD1 돌연변이 또는 미스폴딩을 나타내지 않는 ALS 환자는 SOD1 유전자를 억제하는 치료에 반응할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 SOD1를 암호화하는 핵산 분자에서 선택된 표적에 결합함으로써 엑손 스키핑을 유도할 수 있고, 후속적으로 유전자의 더 이상 완전한 SOD1 유전자를 암호화하지 않는, 대안적인 스플라이싱을 야기한다. 따라서, 대안적으로 스플라이싱된 유전자는 완전한 SOD1 효소의 발현의 하향조절을 야기할 것이다.
A. 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 SOD1 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자를 표적화하는 하나 이상의 단리되거나 정제된 AON을 제공하며, 여기서 AON은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록(하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같음)으로부터 선택되는 핵염기 서열을 가지며 여기서 AON은 사람 SOD1의 발현을 억제한다. 바람직하게는, AON은 엑손 스키핑을 통해 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 보다 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
보다 일반적으로, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자를 표적화하는 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 제공하며, 여기서 AON은:
a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열, 또는
b.표적 RNA에 대해 엑손 스키핑을유도하기에 충분히 서열 상보성인 서열로서, 여기서 상기 서열은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42가 또한 결합하는 표적 SOD1 프레-mRNA내 적어도 8개 이상의 연속된 핵염기에 대해 상보성인 서열을 갖고,
c. 여기서 AON은 사람 SOD1의 발현을 억제한다.
바람직하게는, AON은 엑손 스키핑을 통해 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 보다 바람직하게는, AON은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
[표 1]
Figure pct00001
5-3'로 나타낸 역 상보성 서열. 참고 점(0)은 5' 및 3' 스플라이스 부위의 첫번째 염기에서 설정되며; 따라서 "+"는 엑손내 뉴클레오타이드 결합을 지칭하고 "-"는 인트론내 뉴클레오타이드 결합을 나타낸다.
본 발명의 AON은 표적화된 엑손의 정확한 스플라이싱에 요구되는 사람 SOD1(hSOD1) 프레-mRNA 내 적합한 서열을 보완함으로써, 표적화된 엑손이 성숙한 mRNA 내로 혼입될 수 있는 스플라이싱 반응을 차단하도록 설계되어 있다.
용어 "안티센스 올리고머" 및 "안티센스 화합물" 및 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "AON"은 상호교환적으로 사용되며 염기-쌍화 모이어티가 왓슨-크릭 염기 쌍화(Watson-Crick base pairing)에 의해 핵산(전형적으로 RNA) 내 표적 서열에 하이브리하도록 하는 소단위간 연결에 의해 연결된, 염기-쌍화 모이어티를 각각 지님으로써 표적 서열 내에서 핵산:올리고머 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성하는 사이클릭 소단위의 선형 서열을 지칭한다. 사이클릭 소단위는 리보스 또는 다른 펜토스 당을 기반으로 하거나, 바람직한 구현예에서, 모르폴리노 그룹(하기 모르폴리노 올리고머의 설명 참고)을 기반으로 한다. 올리고머는 표적 서열에 대해 정확한 또는 거의 서열 상보성을 가질 수 있고; 올리고머의 말단 근처의 서열내 변화는 일반적으로 내부에서의 변화에 대해 바람직하다. 또한 당해 분야에 공지된 다른 안티센스 제제 중에서 펩타이드 핵산(PNA), 록킹된 핵산(locked nucleic acid) 핵산(LNA), 및 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드가 고려된다.
"단리된"은, 이의 천연 상태에서 이와 일반적으로 동반하는 구성성분으로부터 실질적으로 또는 필수적으로 유리된 물질을 의미한다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은, "단리된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "단리된 올리고뉴클레오타이드)는 이를 천연적으로 존재하는 상태에서 플랭킹하는 서열로부터 정제 또는 제거된 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 게놈내 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭할 수 있다. 용어 "단리하는"은 세포와 관련된 경우 공급원 대상체(예컨대, 폴리뉴클레오타이드 반복체 질환을 지닌 대상체)로부터 세포(예컨대, 섬유아세포, 림프아구)의 정제를 지칭한다. mRNA 또는 단백질의 내용에서, "단리하는"은 공급원, 예컨대, 세포로부터 mRNA 또는 단백질의 회수를 지칭한다.
AON은 이것이 하이브리드화된 표적 서열 "에 대해 지시된" 또는 "이에 대해 표적화된"으로 일컬어질 수 있다. 특정의 구현예에서, 표적 서열은 폴리아데닐화 부위 또는 주변 영역을 포함하는 역을 포함한다. 표적 서열은 전형적으로 mRNA의 AUG 출발 코돈, 해독 억제 올리고머, 또는 예비-프로세싱된 mRNA의 스플라이스 부위, 스플라이스 억제 올리고머(SSO)를 포함하는 영역이다. 스플라이스 부위에 대한 표적 서열은 예비-프로세싱된 mRNA 내 정상의 스플라이스 수용체 연결부의 하부로 이의 5' 말단 1 내지 약 25개의 염기쌍을 갖는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 표적 서열은 스플라이스 부위를 포함하는 예비-가공된 mRNA의 임의의 영역이거나 엑손 암호화 서열 내에 전체적으로 함유되거나 스플라이스 수용체 또는 공여체 부위에 이어진다. 올리고머가 상술한 방식으로 표적의 핵산에 대해 표적화되는 경우, 이는 일반적으로 생물학적으로 관련된 표적, 예를 들면, 단백질, 바이러스, 또는 세균"에 대해 표적화된" 것으로 일컬어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "충분한 길이" 또는 "충분한 서열 상보성"은 표적 SOD1 프레-mRNA 내 적어도 8개, 보다 전형적으로 8 내지 30개의 연속된 핵염기에 대해 상보성인 AON을 지칭한다. 일부 구현예에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 SOD1 프레-mRNA 내에 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 연속된 핵염기를 포함한다. 다른 구현예에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 SOD1 프레-mRNA내에 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속된 핵염기를 포함한다. 바람직하게는, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10 내지 약 50 뉴클레오타이드, 예를 들면, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40개 이상의 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 10 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 15 내지 약 25개 뉴클레오타이드이다. 여전히 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 20 내지 30, 또는 20 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 여전히 다른 구현예에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 22 내지 28개, 25 내지 28개, 24 내지 29개 또는 25 내지 30개 뉴클레오타이드이다.
특정의 구현예에서, AON은 표적 RNA(예컨대, 프레-mRNA)의 영역을 효과적인 방식으로 차단하기에 충분한 표적 RNA에 대한 서열 상보성을 갖는다. 예시적인 구현예에서, 이러한 SOD1 프레-RNA의 차단은 엑손 스키핑을 유도하기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 표적 프레-RNA(예컨대, SOD1 유전자 프레-RNA)이다.
특정의 구현예에서, AON은 표적 서열에 대해 100% 상보성일 수 있거나 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 세포 뉴클레아제의 작용 또는 생체내에서 발생할 수 있는 다른 분해 방식을 견디기에 충분히 안정한 한, 예컨대, 변이체를 수용하기 위한 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, 특정의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이에 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
미스매치는, 존재하는 경우, 전형적으로 중간에서보다 하이브리드 듀플렉스의 말단 영역을 향해 거의 탈안정화되지 않는다. 허용된 미스매치의 수는 듀플렉스 안정성의 잘 이해된 원리에 따라, 올리고뉴클레오타이드의 길이, 듀플렉스내 G:C 염기쌍의 퍼센트, 및 듀플렉스 내 미스매치(들)의 위치에 의존할 것이다. 이러한 AON이 표적 서열에 대해 필수적으로 100% 상보성이 아니지만, 이는 표적 프레-RNA에 결합하는 절단 인자가 모듈화되도록 결합표적 서열에 대해 안정하게 및 특이적으로 결합시키는데 효과적이다.
AON과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소 절단에 대한 듀플렉스의 민감성의 함수이다. 상보성-서열 RNA와 관련하여 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 통상의 방법, 예를 들면, 문헌: Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, (1985), 107-108에 기술되거나 문헌: Miyada C. G. and Wallace R. B., (1987), Methods Enzymol. 154, 94-107에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정의 구현예에서, AON는 상보성-서열 RNA와 관련하여 체온보다 더 높은 및 바람직하게는 약 45℃ 내지 50℃보다 큰 결합 Tm을 가질 수 있다. 60 내지 80℃ 범위 이상에서의 Tm이 또한 포함된다.
변이체의 추가의 예는 임의의 서열 번호: 1 내지 42의 전체 길이에 걸쳐 약 또는 적어도 약 70% 서열 동일성 또는 상동성, 예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 AON을 포함한다. AON 6(서열 번호: 6)과 관련하여, 일부 구현예에서, 본 발명의 AON은 처음 9개의 뉴클레오타이드
Figure pct00002
(서열 번호: 43)과 관련하여 100% 서열 동일성 또는 상동성 및 뉴클레오타이드 10 내지 25
Figure pct00003
(서열 번호: 44)와 관련하여 적어도 70% 서열 동일성 또는 상동성을 나타낸다. AON 27(서열 번호: 27)과 관련하여, 본 발명의 AON은 처음 9개의 뉴클레오타이드
Figure pct00004
(서열 번호: 43)와 관련하여 100% 서열 동일성 또는 상동성 및 뉴클레오타이드 10 내지 25
Figure pct00005
(서열 번호: 45)와 관련하여 적어도 70% 서열 상동성을 나타낸다.
보다 구체적으로, SOD1 유전자 전사체 또는 이의 부분에서 엑손 스키핑을 유도하기 위해 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 AON이 제공된다. 양태에서, AON은 SOD1 유전자 내에 엑손 1, 2, 3 또는 4의 스키핑을 유도한다. 바람직하게는, AON은 엑손 2 또는 3의 스키핑을 유도한다. 가장 바람직하게는, AON은 엑손 3의 스키핑을 유도한다.
AON이 결합하는 프레-mRNA SOD1 상의 위치는 엑손 스키핑을 유도하는 이의 능력과 관련된다. 양태에서, AON은 도 12에 "핫스폿(hotspot)"으로 나타낸 강력하게 예측된 엑손성 스플라이싱 인핸서 결합 영역에 결합한다.
AON은 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 제공된 것으로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호:6, 8, 13, 27, 29, 또는 34를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호: 8 또는 29이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호: 8 또는 29의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(morpholino oligomer)이다.
B. 사용 방법
본 발명은 또한 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은:
(a) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON을 제공하는 단계 및
(b) 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, AON은 표 1 또는 표 2에 나타낸 것들로부터 선택될 수 있다. 서열은 바람직하게는 서열 번호: 1 내지 42 중 어느 하나, 및 이의 조합 또는 콕테일로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이는 엄격한 하이브리드화 조건(stringent hybridisation condition) 하에서 이러한 서열이 하이브리드화할 수 있는 서열, 이에 대해 상보성인 서열, 변형된 염기를 함유하는 서열, 변형된 골격, 및 SOD1 유전자 전사체 내에서 RNA 프로세싱 활성을 지니거나 조절하는 기능적 트렁케이션(truncation) 또는 이의 연장부를 함유하는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호:6, 8, 13, 27, 29, 또는 34를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 서열 번호: 8 또는 29이다.
본 방법에 사용된 AON은 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 양태에서, AON은 SOD1 프레-mRNA 내 엑손 스키핑을 유도함을 통해 대안적인 스플라이싱을 유도한다. 바람직하게는, AON은 SOD1 유전자내에 엑손 1, 2, 3 또는 4의 스키핑을 유도한다. 바람직하게는, AON은 엑손 2 또는 3의 스키핑을 유도한다. 가장 바람직하게는, AON은 엑손 3의 스키핑을 유도한다.
표적 서열 및 선택적인 하이브리드화
올리고머 및 DNA, cDNA 또는 RNA는 각각의 분자 내 상응하는 위치의 다수의 수가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유된 경우 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화가능한" 및 "상보성"은 충분한 정도의 상보성 또는 쌍화로 올리고머와 DNA, cDNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생함을 나타내는데 사용된 용어이다. AON의 서열은 특이적으로 하이브리드화가능하게 될 이의 표적 서열의 것에 대해 100% 상보성일 필요는 없다. AON은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA 생성물의 정상 기능을 방해하는 경우 특이적으로 하이브리드화가능하며, 특이적인 결합이 요구되는 조건, 즉, 생체내 검정 또는 치료학적 처리의 경우의 생리학적 조건, 및 검정이 수행된 조건 하에서 비-표적 서열에 대한 AON의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
선택적인 하이브리드화는 낮은, 중간 또는 높은 엄격성(stringency) 조건 하에 있을 수 있지만 바람직하게는 고 엄격성 하에 있다. 당해 분야의 기술자는 하이브리드화의 엄격성이 염기 조성, 상보성 가닥의 길이 및 하이브리드화 핵산 사이의 뉴클레오타이드 염기 미스매치의 수 외에, 염 농도, 온도, 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향받을 것을 인식할 것이다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로, 30℃ 초과, 전형적으로 37℃ 초과, 및 바람직하게는 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃, 및 전형적으로 60 내지 80℃ 이상인 온도를 포함할 것이다. 엄격한 염 조건은 통상적으로 1000 mM 미만, 전형적으로 500 mM 미만, 및 바람직하게는 200 mM 미만이다. 그러나, 매개변수의 조합은 임의의 단일 매개변수의 척도보다 훨씬 더 중요하다. 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 65℃ 및 0.1 x SSC(1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트트산나트륨 pH 7.0)이다. 따라서, 본 발명의 AON은 표 1 또는 표 2에 제공된 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 올리고머를 포함할 수 있다.
주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 온도이다. 이러한 하이브리드화는 표적 서열에 대한 AON의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성 뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다.
전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 안티센스 올리고머의 뉴클레오타이드와 적어도 약 14 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)에 걸쳐 적어도 약 55%, 바람직하게는 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성이 존재하는 경우, 발생할 것이다. 기술된 바와 같은, 상동성 비교의 길이는 보다 긴 스트레치 이상일 수 있고 특정의 구현예에서 흔히 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 약 12개 뉴클레오타이드, 보다 일반적으로 적어도 약 20개, 흔히 적어도 약 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 29, 30, 31 또는 32개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오타이드 이상일 수 있다.
따라서, 본 발명의 AON 서열은 바람직하게는 본원의 서열 목록에 나타낸 서열에 대해 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 86, 87, 88, 89 또는 90% 상동성을 갖는다. 보다 바람직하게는 적어도 91, 92, 93 94, 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96, 97, 98% 또는 99%의 상동성이 존재한다. 일반적으로, 안티센스 올리고머의 길이가 짧을 수록, 선택적인 하이브리드화를 수득하는데 요구되는 상동성이 더 크다. 결과적으로, 본 발명의 AON은 약 30개 미만의 뉴클레오타이드로 이루어지고, 동일성 퍼센트는 본원의 서열 목록에 나타낸 AON과 비교하여 75% 초과, 바람직하게는 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96, 97, 98% 또는 99% 초과인 것이 바람직하다. 서열 번호: 6과 관련하여, 일부 구현예에서, 본 발명의 AON은 처음 9개의 뉴클레오타이드
Figure pct00006
(서열 번호: 43)와 관련하여 100% 서열 동일성 및 뉴클레오타이드 10 내지 25
Figure pct00007
(서열 번호: 44)와 관련하여 적어도 70% 서열 동일성을 나타낸다. AON 27과 관련하여, 본 발명의 AON은 처음 9개의 뉴클레오타이드
Figure pct00008
(서열 번호: 43)와 관련하여 100% 서열 동일성 및 적어도 70% 서열 identity 또는 homology in respect of 뉴클레오타이드 10 내지 25
Figure pct00009
(서열 번호: 45)와 관련하여 적어도 70% 서열 동일성 또는 상동성을 나타낸다. 뉴클레오타이드 상동성 비교는 GCG Wisconsin Bestfit 프로그램 또는 GAP(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)과 같은 서열 비교 프로그램으로 수행할 수 있다. 이러한 방식으로 본원에 인용된 것에 대해 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 정렬 내로 갭의 삽입에 의해 비교할 수 있고, 이러한 갭은 예를 들면, GAP에 사용된 비교 알고리즘에 의해 측정된다.
본 발명의 AON은 감소된 상동성의 영역, 및 표적 서열과 정확한 상동성 영역을 가질 수 있다. 올리고머가 이의 전체 길이에 대해 정확한 상동성을 갖는 것은 필수적이지 않다. 예를 들면, 올리고머는 표적 서열에 대해 동일한 적어도 4 또는 5개의 염기의 연속된 스트레치, 바람직하게는 표적 서열에 대해 동일한 적어도 6 또는 7개의 염기의 연속된 스트레치, 보다 바람직하게는 표적 서열에 대해 동일한 적어도 8 또는 9개의 염기의 스트레치를 가질 수 있다. 올리고머는 표적 서열에 대해 동일한 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 염기의 스트레치를 가질 수 있다. 올리고머 서열의 나머지 스트레치는 표적 서열과 간헐적으로 동일할 수 있는데; 예를 들면, 나머지 서열은 동일한 염기에 이어, 동일하지 않은 염기, 이후에 동일한 염기를 가질 수 있다. 대안적으로(또는 또한) 올리고머 서열은 완전한 상동성 미만의 스트레치로 편재된 동일한 서열(예를 들면, 3, 4, 5 또는 6개 염기)의 몇가지 스트레치를 가질 수 있다. 이러한 서열 미스매치는 바람직하게는 절단 변형 활성을 손실하지 않거나 거의 손실하지 않는다.
생리학적 반응
일 양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 생리학적 반응을 유도한다. 바람직하게는, 방법은 SOD1의 발현을 감소시킨다.
용어 "조절하다(modulate 또는 modulates)"는 임의로 정의된 및/또는 통계적으로 유의적인 양에 의해 하나 이상의 정량가능한 매개변수를 "증가"시키거나 "감소"시킴을 포함한다. 용어 "증가하다" 또는 "증가하는", "향상시키다" 또는 "향상시키는" 또는 "자극하다" 또는 "자극하는"은 일반적으로 AON에 의해 유발되지 않거나 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 관련하여 세포 또는 대상체에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하부 효과(downstream effect))을 생산하거나 유발하는 하나 또는 다수의 AON 또는 조성물의 능력을 지칭한다.
"향상하다" 또는 "향상하는", 또는 "증가하다" 또는 "증가하는", 또는 "자극하다" 또는 "자극하는"은 일반적으로 안티센스 화합물에 의해 유발되지 않거나 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 비교하여, 세포 또는 대상체에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하부 효과)을 생산하거나 유발하는 하나 또는 다수의 안티센스 화합물 또는 조성물의 능력을 지칭한다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의적인" 양이며, 안티센스 화합물에 의해 생산되지 않거나(제제의 부재하에 생산됨) 또는 대조군 화합물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상(예컨대, 500, 1000배)(이들 사이의 모든 정수 및 소수점 및 1 초과 포함), 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등)인 증가를 포함할 수 있다.
용어 "감소하는" 또는 "감소하다"는 일반적으로 AON에 의해 유발되지 않거나 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 관련하여 세포 또는 대상체에서 감소된 생리학적 반응(즉, 하부 효과)를 생산하거나 유발하는 하나 또는 다수의 AON 또는 조성물의 능력을 지칭한다. 용어 "감소하다" 또는 "억제하다"는 일반적으로 진단 분야에서 통상의 기술에 따라 측정된 것으로서, 본원에 기술된 질환 또는 상태의 증상과 같은 관련된 생리학적 또는 세포 반응을 "감소시키는" 하나 이상의 본 발명의 안티센스 화합물의 능력에 관한 것일 수 있다. 관련 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이며 SOD1 관련 상태의 증상 또는 병리학에서의 감소를 포함할 수 있다. 반응에서 "감소하다"는 안티센스 화합물에 의해 생산되지 않거나 대조군 조성물에 의해 생산된 반응과 비교하여 통계적으로 유의적일 수 있고 이들 사이의 모든 정수를 포함하는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이며 SOD1 발현의 양에 있어서의 감소를 포함할 수 있다. "증가된" 및 "향상된" 양은 전형적으로 통계적으로 유의적인 양이며, AON에 의해 생산되지 않거나(제제의 부재하에 생산되거나) 대조군 화합물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상(예컨대, 500, 1000배)(이들 사이의 모든 정수 및 소수점 및 1 이상, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8)의 증가를 포함할 수 있다. 용어 "감소하다" 또는 "억제하다"는 일반적으로 진단 분야에서의 통상의 기술에 따라 측정된 것으로서, 본원에 기술된 질환 또는 상태의 증상과 같은, 관련된 생리학적 또는 세포 반응을 "감소시키는" 하나 이상의 AON 또는 조성물의 능력에 관한 것일 수 있다. 관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이고 SOD1에 대한 돌연변이, 예를 들면, ALS와 관련된 질환의 증상 또는 병리학에서의 감소를 포함할 수 있다. 반으에서 용어 "감소하다"는 AON에 의해 생산되지 않거나 대조군 조성물에 의해 생산된 반응과 비교하여 통계적으로 유의적일 수 있고, 이들 사이의 모든 정수를 포함하는, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 증가를 포함할 수 있다.
변형된 AON
일부 구현예에서, AON은 천연적으로 존재하는 핵산 분자의 화학적 조성을 가지는데, 즉, AON은 변형되거나 치환된 염기, 당, 또는 소단위간 연결을 포함하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 AON은 비-천연적으로 존재하는 핵산 분자, 또는 "올리고뉴클레오타이드 유사체"이다. 예를 들면, 비-천연적으로 존재하는 핵산은 하나 이상의 비-천연 염기, 당, 및/또는 소단위간 연결, 예컨대, 천연적으로 존재하는 핵산 분자에서 발견된 것과 관련하여 변형되거나 치환된 소단위간 연결, 예컨대, 염기, 당, 및/또는 연결을 포함할 수 있다. 예시적인 변형이 하기 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 비-천연적으로 존재하는 핵산은 하나 이상의 유형의 변형, 예컨대 당 및 염기 변형, 당 및 연결 변형, 염기 및 연결 변형, 또는 염기, 당, 및 연결 변형을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, AON은 비-천연(예컨대, 변형되거나 치환된) 염기를 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 비-천연(즉, 변형되거나 치환된) 당을 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 비-천연(예컨대, 변형되거나 치환된) 소단위간 연결을 함유한다. 일부 구현예에서, AON은 하나 이상의 유형의 변형 또는 치환, 예컨대, 비-천연 염기 및/또는 비-천연 당, 및/또는 비-천연 소단위간 연결을 함유한다.
따라서, (i) 변형된 골격 구조, 예컨대, 천연적으로 존재하는 올리고- 및 폴리뉴클레오타이드에서 발견된 표준 포스포디에스테르 연결 외의 골격, 및/또는 (ii) 변형된 당 모이어티, 예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티 보다는 오히려 모르폴리노 모이어티를 갖는 비-천연적으로 존재하는 AON이 포함된다. 올리고뉴클레오타이드 유사체는 표준 폴리뉴클레오타이드 염기에 대한 왓슨-크릭 염기 쌍화에 의해 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하며, 여기서 유사체 골격은 표준 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 단일 가닥 RNA 또는 단일 가닥 DNA)내 올리고뉴클레오타이드 유사체 분자와 염기 사이에 서열-특이적인 방식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 나타낸다. 바람직한 유사체는 실질적으로 하전되지 않은, 인 함유 골격을 갖는 것이다.
AON을 생산하는 한가지 방법은 2' 하이드록시리보스 위치의 메틸화이며 포스포로티오에이트 골격의 혼입은, 본 발명의 당해 분야의 기술자가 본 발명의 목적에서 사용가능할 수 있는 적합한 골격의 다른 형태를 인지할 것이지만, RNA와 표면적으로 유사하지만 뉴클레아제 분해에 대해 훨씬 더 내성인 분자를 생산한다.
안티센스 올리고머와의 듀플렉스 형성 동안 예비-RNA의 분해를 피하기 위하여, 본 방법에 사용된 AON를 조정하여 내인성 Rnase H에 의한 분해를 최소화하거나 방지할 수 있다. Rnase H를 활성화시키지 않는 안티센스 분자는 공지된 기술(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,149,797호)에 따라 이루어질 수 있다. 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 서열일 수 있는, 이러한 안티센스 분자는 단순히 이의 하나의 구성원으로서 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 듀플렉스 분자에 대한 Rnase H의 결합을 입체적으로 방해 또는 방지하는 임의의 구조적 변형을 함유하며, 이러한 구조적 변형은 듀플렉스 형성을 실질적으로 방해 또는 파괴하지 않는다. 듀플렉스 형성에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 부위는 이에 결합하는 Rnase H에 포함된 부위와는 실질적으로 상이하므로, Rnase H를 활성화시키지 않는 다수의 안티센스 분자가 이용가능하다. Rnase H를 함유하는 세포내 또는 조 추출물로서, 메틸화되지 않은 올리고머를 사용한 RNA의 처리는 프레-mRNA:AON 듀플렉스의 분해를 이끈다. 이러한 분해를 통과(by-passing)하거나 유도하지 않을 수 있는 변형된 AON의 임의의 형태가 본 발명에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 내성은 본 발명의 AON을 변형시켜 이것이 부분적으로 불포화된 지방족 탄화수소 쇄 및 카복실산 그룹, 에스테르 그룹, 및 알코올 그룹을 포함하는 하나 이상의 극성 또는 하전된 그룹을 포함하도록 함으로서 달성할 수 있다.
RNA와 듀플렉스된 경우 세포 Rnase H에 의해 절단되지 않는 AON의 예는 2'-O-메틸 유도체이다. 이러한 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오타이드는 세포 환경 및 동물 조직 속에서 안정하며, RNA와의 이의 듀플렉스는 이의 리보- 또는 데옥시리보-대응부보다 더 높은 Tm 값을 갖는다. 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 플루오르화된 마지막 3'-말단 뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 여전히 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 바람직하게는 마지막 4개의 3'-말단 뉴클레오타이드 염기 사이에 포스포로티오에이트 결합 연결을 갖는, 마지막 3-말단 뉴클레오타이드 중 적어도 2개 사이에 포스포로티오에이트 결합을 갖는다.
감소된 RNA 절단은 대안적인 올리고뉴클레오타이드 화학으로 달성될 수 있다(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,149,797호). 예를 들면, AON은 포스포르아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO); PMO-X; PPMO; 펩타이드 핵산(PNA); 록킹된(locked) 핵산(LNA) 및 알파-L-LNA, 2'-아미노 LNA, 4'-메틸 LNA 및 4'-O-메틸 LNA를 포함하는 유도체; 에틸렌 브릿지된 핵산(ENA) 및 이의 유도체; 포스포로티오에이트 올리고머; 트리사이클로-DNA 올리고머(tcDNA); 트리사이클로포스포로티오에이트 올리고머; 2' O-메틸-변형된 올리고머(2'-Ome); 2'-O-메톡시 에틸(2'-MOE); 2'-플루오로, 2'-플루로아라비노(FANA); 록킹되지 않은 핵산(UNA); 헥시톨 핵산(HNA); 사이클로헥세닐 핵산(CeNA); 2'-아미노(2'-NH2); 2'-O-에틸렌아민 또는 믹스머(mixmer) 또는 갭머(gapmer)로서 앞서의 임의의 조합을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 변형된 AON은 펩타이드에 접합될 수 있다. 바람직하게는, AON은 PPMO, 즉, 아미드, 마레이미드 또는 클릭 화학(바람직하게는 예를 들면, 사이클로옥틴 연결을 통해 구리가 없는 클릭 화학을 사용)을 통해 펩타이드 모이어티에 화학적으로 접합된 PMO 올리고뉴클레오타이드이고 적합한 링커, 예를 들면, 절단가능하거나 pH-민감성인 링커를 포함한다. 펩타이드 모이어티는 3' 또는 5' 말단을 통해 연결될 수 있다. 가장 바람직하게는, 펩타이드 모이어티는 세포를 침투하여 핵에 도달하는 AON의 능력을 증진시킬 수 있는 펩타이드이다. 예를 들면, 펩타이드 모이어티는 아르기닌이 풍부한 펩타이드, 양이온성 펩타이드 및/또는 생물다양성 미생물의 게놈으로부터 유래된 펩타이드의 라이브러리로부터 선택되는 펩타이드일 수 있다(Hoffman et al., Sci Rep, 8, 1, 12538). 펩타이드는 비-천연 아미노산 및/또는 화학적으로 변형된 아미노산을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다.
세포 침투 펩타이드를 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머에 가하여 헤포 흡수 및 핵 국재화(nuclear localization)를 향상시킬 수 있다. 상이한 세포 침투 펩타이드는 문헌: Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther., 16(9), 1624-1629에 나타낸 바와 같이, 흡수 효능 및 표적 조직 특이성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 용어 "세포 침투 펩타이드" 및 "CPP"는 상호교환적으로 사용되며 또한 전달 펩타이드(transport peptide), 담체 펩타이드 또는 펩타이드 형질도입 도메인으로 불리는 양이온성 세포 침투 펩타이드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 펩타이드는 주어진 세포 배양 집단의 세포 의 100% 내에서 세포 침투를 유도하는 능력을 가지며 전신계 투여시 생체내에서 다수 조직 내에 거대분자 전좌(translocation)를 허용한다. 펩타이드는 또한 조직 또는 기관에 대한 국재화된 전달 후 세포 흡수를 향상시킬 수 있다.
전달 효능을 추가로 증진시키기 위하여, 상기 언급한 변형된 뉴클레오타이드는 흔히 당 또는 핵염기 모이어티에 대한 지방산/지질/콜레스테롤/아미노산/탄수화물/다당류/나노입자 등과 접합된다. 이러한 접합된 뉴클레오타이드 유도체를 또한 사용하여 AON을 작제함으로써 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 사람 SOD1 유전자 전사체의 안티센스 올리고머-유도된 엑손 스키핑은 포스포로티오에이트 골격 상에 올리고리보뉴클레오타이드, PNAs, 2Ome 또는 MOE 변형된 염기를 사용할 수 있다. 2OMeAON가 올리고 설계에 사용될 수 있지만, 양이온성 리포플렉스(lipoplex)로서 전달되는 경우 시험관내에서 이의 효율적인 흡수로 인하여, 이러한 화합물은 뉴클레아제 분해에 대해 민감하며 생체내 또는 임상 적용에 이상적인 것으로 고려되지 않는다. 대안적인 화학을 사용하여 본 발명의 AON을 생성하는 경우, 본원에 제공된 서열의 우라실(U)은 티민(T)으로 대체될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 AON은 표 2에 나타낸 바와 같은 서열 번호: 22 내지 서열 번호: 42를 갖는다:
[표 2]
Figure pct00010
Figure pct00011
5-3'로 나타낸 역 상보성 서열. 참고 점(0)은 5' 및 3' 스플라이스 부위의 첫번째 염기에 설정되며; 따라서 "+"는 엑손 내 뉴클레오타이드 결합을 나타내고 "-"는 인트론내 뉴클레오타이드 결합을 나타낸다.
예를 들면, 이러한 안티센스 분자는 뉴클레오타이드내 브릿징 포스페이트 잔기 중 적어도 하나, 또는 모두가 변형된 포스페이트, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포르 아미데이트인 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드간 브릿징 포스페이트 잔기 중 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 다른 비-제한적인 예에서, 이러한 안티센스 분자는 뉴클레오타이드 중 적어도 하나, 또는 모두가 2' 저급 알킬 모이어티(예컨대, C1-C4의 직쇄 또는 측쇄된, 포화되거나 불포화된 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 함유하는 분자이다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 중 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
본 발명에 유용한 AON의 구체적인 예는 변형된 골격 또는 비-천연 소단위간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 골격 내 인 원자를 보유하는 것 및 골격 내에 인 원자를 가지지 않는 것을 포함한다. 이의 뉴클레오사이드간 골격 내에 인 원자를 가지지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오사이드인 것으로 고려될 수 있다.
다른 안티센스 분자에서, 당 및 뉴클레오사이드간 연결 둘 다, 즉, 뉴클레오타이드 단위의 골격은 신규 그룹으로 대체된다. 기본 단위는 적절한 핵산 표적 분자와의 하이브리드화를 위해 유지된다. 하나의 이러한 올리고머성 화합물인, 탁월한 하이브리드화 특성을 가진 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오타이드 모사체가 펩타이드 핵산(PNA)로서 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 뉴클레오-염기는 유지되며 골격의 아미드 부위의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 핵염기(당해 분야에서 단순히 "염기"로 흔히 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형된 또는 치환된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 핵산 내에서 가장 일반적으로 발견된 하나 이상의 푸린 또는 피리미딘 염기가 거의 일반적이지 않거나 비-천연인 염기로 대체된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
푸린 염기는 이미다졸 환에 융합된 피리미딘 환을 포함하고; 아데닌 및 구아닌은 핵산 속에서 가장 일반적으로 발견된 2개의 푸린 핵염기이다. 이는 다른 천연적으로 존재하는 푸린, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이포크산틴, 및 7-메틸구아닌으로 치환될 수 있다.
피리미딘 염기는 6원의 피리미딘 환을 포함하고; 사이토신, 우라실, 및 티민은 핵산 속에서 가장 일반적으로 발견된 피리미딘 염기이다. 이는 다른 천연적으로 존재하는 피리미딘, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 슈도우라실, 및 4-티오우라실로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오타이드는 우라실 대신에 티민 염기를 함유한다.
다른 변형되거나 치환된 염기는 2,6-디아미노푸린, 오로트산, 아그마티딘, 라이시딘, 2-티오피리미딘(예컨대, 2-티오우라실, 2-티오티민), G-글램프(clamp) 및 이의 유도체, 5-치환된 피리미딘(예컨대, 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐사이토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, Super T), 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-아자-2,6-디아미노푸린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노푸린, Super G, Super A, 및 N4-에틸사이토신, 또는 이의 유도체; N2-사이클로펜틸구아닌(cPent-G), N2-사이클로펜틸-2-아미노푸린(cPent-AP), 및 N2-프로필-2-아미노푸린(Pr-AP), 슈도우라실 또는 이의 유도체; 및 2,6-디플루오로톨루엔과 같은 변형 또는 공통 염기 또는 무염기성 부위와 같은 부재 염기(예컨대, 1-데옥시리보스, 1,2-디데옥시리보스, 1-데옥시-2-O-메틸리보스); 또는 환 산소가 질소로 대체된 피롤리딘 유도체(아자리보스))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Super A, Super G 및 Super T의 유도체의 예는 미국 특허 제6,683,173호(Epoch Biosciences)에서 찾을 수 있다. cPent-G, cPent-AP 및 Pr-AP는 siRNA 내에 혼입되는 경우 면역자극성 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200). 슈도우라실은 우리딘에서와 같이 일정한 N-글리코시드보다는 오히려 c-글리코시드를 지닌, 우라실의 천연적으로 존재하는 이성체화된 버젼이다. 슈도우리딘-함유 합성 mRNA는 우리딘-함유 mPvNA와 비교하여 증진된 안전성 프로파일을 가질 수 있다(참고: 제WO 2009127230호).
특정의 변형되거나 치환된 뉴클레오-염기는 본 발명의 AON의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들면, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안전성을 0.6 ?T 1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우에도, 현재 바람직한 염기 치환이다.
일부 구현예에서, 변형되거나 치환된 뉴클레오-염기는 AON의 정제를 촉진시키는데 유용하다. 예를 들면, 특정의 구현예에서, AON은 3개 이상(예컨대,, 3, 4, 5, 6개 이상)의 연속된 구아닌 염기를 함유할 수 있다. 특정의 AON에서, 3개 이상의 연속적인 구아닌 염기의 엄격성은 정제를 복잡하게 하는 올리고뉴클레오타이드의 응집을 야기할 수 있다. 이러한 AON에서, 하나 이상의 연속적인 구아닌은 아노신으로 치환될 수 있다. 3개 이상의 연속적인 구아닌 염기의 스트링에서 이노신을 하나 이상의 구아닌으로 치환하는 것은 AON의 응집을 감소시킬 수 있으므로, 정제를 촉진시킨다.
일 구현예에서, AON의 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드에 하나 이상의 모이어티 또는 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 접합체(conjugate)를 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예컨대, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주어진 화합물내 모든 위치가 균일하게 변형될 필요가 없으며, 실제로 상술한 변형 중 하나 이상은 단일 화합물 속에 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 내 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 AON을 포함한다. 본 발명의 내용에서 "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라(chimera)"는 안티센스 분자, 특히 올리고뉴클레오타이드이며, 이는 각각 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 올리고뉴클레오타이드 화합물의 경우에 뉴클레오타이드로 제조된, 2개 이상의 화학적으로 명백한 영역을 함유한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하며 여기서 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 위한 추가의 영역을 부여하도록 변형된다.
본 발명에 따라 사용된 안티센스 분자는 고체 상 합성의 잘 공지된 기술을 통해 편리하게 및 통상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성용 장치는 수개의 판매업자, 예를 들면, Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티)으로부터 시판된다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 하나의 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다.
다른 비-제한적인 예에서, 이러한 AON은 뉴클레오타이드 중 적어도 하나, 또는 모두가 2' 저급 알킬 모이어티(예를 들면, C1-C4, 직쇄 또는 측쇄의, 포화되거나 불포화된 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 함유한다. 예를 들면, 뉴클레오타이드의 모든 다른 하나는 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
상술된 AON이 본 발명의 AON의 바람직한 형태이지만, 본 발명은 다른 올리고머성 안티센스 분자, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 후술된 바와 같은 올리고머 모사체(oligomer mimetic)를 포함한다.
다른 바람직한 화학은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 올리고머성 화합물이며, 이는 임의의 공지된 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 분해되지 않는다. 이러한 화합물은 하전되지 않고, RNA 가닥에 결합되는 경우 RNase H 활성을 활성화시키지 않으며 생체내 투여 후 지속적인 절단 인자 결합 조율(modulation)을 발휘하는 것으로 밝혀졌다(Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-197).
변형된 올리고머는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 올리고머는 핵염기(흔히 당해 분야에서 단순히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 특정의 핵염기가 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들면, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃까지 증가시는 것으로 밝혀졌다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 피리미딘 염기는 5-치환된 피리미딘 염기이고, 여기서 피리미딘 염기는 사이토신, 티민 및 우라실로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 5-치환된 피리미딘 염기는 5-메틸사이토신이다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 퓨린 염기는 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기를 포함한다. 일 구현예에서, N-2, N-6 치환된 퓨린 염기는 2,6-디아미노퓨린이다.
일 구현예에서, AON은 단독으로 또는 다른 변형, 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된 하나 이상의 5-메틸사이토신 치환을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, AON은 단독 또는 다른 변형과 함께 하나 이상의 2,6-디아미노퓨린 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, AON은 하나 이상의 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 또는 접합체, 예를 들면, AON의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 향상시키는 아르기닌이 풍부한 세포 침투 펩타이드에 화학적으로 연결되어 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 아르기닌이 풍부한 폴리펩타이드는 이의 N-말단 또는 C-말단에서 안티센스 화합물의 3' 또는 5' 말단에 공유결합으로 커플링되어 있다. 또한, 예시적인 구현예에서, 안티센스 화합물은 모르폴리노 소단위 및 하나의 소단위의 모르폴리노 질소를 인접한 소단위의 5' 엑소사이클릭 탄소에 결합시키는 인-함유 소단위간 연결로 구성된다.
다른 양태에서, 본 발명은 상술한 AON, 예컨대, 서열 번호: 1 내지 41의 AON을 혼입시키는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 변형된 레트로바이러스 또는 비-레트로바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
AON의 활성을 측정하기 위한 검정
AON의 활성 및 이의 변이체는 당해 분야의 통상의 기술에 따라 검정할 수 있다. 예를 들면, 조사된(surveyed) RNA 및 단백질의 동형 형태 및 발현 수준은 전사된 핵산 또는 단백질의 동형 및/또는 발현을 검출하기 위한 임의의 다양한 잘 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적 예는 RNA의 동형의 RT-PCR에 이은 PCR 생성물의 크기 분리, 핵산 하이브리드화 방법, 예컨대, 노던 블롯(Northern blot) 및/또는 핵산 배열의 사용; 세포내 RNA 전사체를 검출하기 위한 형광성 반응계내(in situ) 하이브리드화; 핵산 증폭 방법; 단백질을 검출하기 위한 면역학적 방법; 단백질 정제 방법; 및 단백질 기능 또는 활성 검정을 포함한다.
RNA 발현 수준은 세포, 조직 또는 기관으로부터 RNA/cDNA(즉, 전사된 폴리뉴클레오타이드)를 제조하고, RNA/cDNA를, 검정된 핵산, 또는 이의 단편의 상보체인, 참고 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화시킴으로써 평가할 수 있다. cDNA는 임의의 다양한 폴리머라제 쇄 반응 또는 시험관내 전사 방법 후 상보성 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 사용하여 임의로 증폭시킬 수 있으며; 바람직하게는, 이는 증폭되지 않는다. 하나 이상의 전사체의 예는 또한 전사체(들)의 발현 수준을 평가하기 위한 정량적 PCR을 사용항 검출할 수 있다.
AON을 제작하는 방법
본 발명에 따라 사용된 AON은 잘-공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하게 제조할 수 있다. 이러한 합성용 장치는 수개의 판매회사, 예를 들면, Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 시판된다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고머를 합성하는 하나의 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다.
당해 분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단을 추가로 또는 대안적으로 사용할 수 있다. 올리고머, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것은 잘 공지되어 있다. 하나의 이러한 자동화 구현예에서, 디에틸-포스포르아미디트는 출발 물질로서 사용되며 문헌: Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 AON은 시험관내에서 합성되며 생물학적 기원의 안티센스 조성물, 또는 안티센스 올리고머의 생체내 합성을 지시하도록 고안된 유전적 벡터 작제물을 포함하지 않는다. 본 발명의 분자는 흡수, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위한, 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 연합될 수 있다.
벡터
본 발명의 올리고머성, SOD1-표적화 서열을 발현시킬 수 있는 벡터 전달 시스템, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은, 서열 번호: 1 내지 42의 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는 벡터가 또한 포함된다.
"벡터" 또는 "핵산 작제물"은 폴리뉴클레오타이드 분자, 바람직하게는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드가 삽입 또는 클로닝될 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 유일한 제한 부위를 함유하고 표적 세포 또는 조직 또는 선조 세포 또는 이의 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포내에서 자율적 복제(autonomous replication)할 수 있거나 정의된 숙주의 게놈과 통합되어 클로닝된 서열이 재생가능하게 될 수 있다.
따라서, 벡터는 자가 복제하는 벡터, 즉, 이의 복제가 염색체 복제와는 독립적인, 염색체외 실체로서 존재하는 벡터, 예컨대, 선형 또는 폐쇄된 환형 플라스미드, 염색체외 성분, 미니-염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제(self-replication)를 보증하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포내로 도입되는 경우 게놈내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들)와 함게 복제되는 것일 수 있다.
C. 치료 방법
본 발명의 AON은 질환의 치료 목적을 위해 활용될 수 있는, 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명은 SOD1 RNA 내에서 선택된 표적에 결합하여 본원에 기술된 바와 같은 SOD1의 발현을 감소시킬 수 있는, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합된, 치료학적 유효량의 AON을 제공한다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적한 치료학적 효과를 생산하는데 효과적인, 단일 용량 또는 일련의 용량의 부분으로서, 포유동물 대상체에게 투여된, 치료학적 화합물, 예를 들면, 안티센스 올리고머의 양을 지칭한다.
따라서, 본 발명은 SOD1에 대한 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물을 제공하여, 이러한 조성물은:
a) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON, 및
b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
바람직하게는, SOD1에 대한 미스폴딩 또는 돌연변이와 관련된 질환은 ALS이다.
그러나, SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩을 필수적으로 나타내지 않는 ALS를 앓는 환자를 또한 본 발명의 AON으로 치료할 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개산시키기 위한, 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물을 제공하며, 이러한 조성물은:
a) 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON, 및
b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
또한 SOD1 내의 돌연변이와 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 또한 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 하나 이상의 AON 또는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 SOD1 내의 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 유전적 또는 다른 바이오마커를 사용하여 본 발명의 AON을 통해 SOD1 억제에 가장 잘 반응하는 경향이 있는 ALS 환자를 확인할 수 있다. ALS 질환 위험과 관련된 유전적인 구조적 변이는 ALS 유전자 및 주변 유전자 영역 내에서 확인되었다. 이러한 변이는 유전적 바이오마커로서 사용되어 본 발명의 방법에 대해 반응하는 경향이 있는 환자를 확인할 수 있다. 비-유전적 바이오마커를 또한 사용하여 본 발명의 방법에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인할 수 있다.
본 발명은 바이오마커에 의해 확인된 대상체에서, ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은:
a) 대상체를 SOD1 억제에 반응하는 경향이 있는 ALS 환자와 관련된 바이오마커의 존재에 대해 시험하는 단계; 및
b) 대상체가 바이오마커를 발현함이 발견된 경우, 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 바이오마커는 SOD1 유전자 영역내 유전적인 구조적 변이체, 예를 들면, SCAF4 내 구조적 변이체, 또는 SOD1 관련/상호작용 유전자 영역, 예를 들면, SQSTM1 내 유전적인 구조적 변이체이다. 바이오마커는 당해 분야에 공지된 검정을 통해 환자 내에서 확인할 수 있다.
또한 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제 및 단리된 AON의 용도가 본원에 제공된다.
또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 정제 및 단리된 AON의 용도가 본원에 제공된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 AON은 표 1 또는 2에 제공된 AON의 목록으로부터 선택되거나 보다 바람직하게는 서열 번호: 6, 8, 13, 27, 29 또는 34로부터 선택된다. 예로서, AON은 서열 번호: 8 또는 29이다.
조성물은 약 1 nM 내지 1000 μM의 본 발명의 각각의 목적한 안티센스 올리고머(들)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 약 1 μM 내지 500 μM, 10 μM 내지 500 μM, 50 μM 내지 750 μM, 10 μM 내지 500 μM, 1 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 50 μM, 바람직하게는 25 μM 내지 100 μM의 본 발명의 각각의 안티센스 올리고머(들)를 포함할 수 이다. 조성물은 또한 바람직하게는 약 1 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 500 nM, 50 nM 내지 750 nM, 10 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 50 nM, 가장 바람직하게는 50 nM 내지 100 nM의 본 발명의 각각의 안티센스 올리고머(들)를 포함할 수 있다.
조성물은 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM, 6nM, 7nM, 8nM, 9nM, 10nM, 20nM, 50nM, 75nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 300nM, 350nM, 400nM, 450nM, 500nM, 550nM, 600nM, 650nM, 700nM, 750nM, 800nM, 850nM, 900nM, 950nM 또는 1000nM의 본 발명의 각각의 목적한 안티센스 올리고머(들)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에게 전달하기에 적합한 형태의 SOD1에 대한 돌연변이와 관련된 질환 또는 병리학의 증상의 예방학적 또는 치료학적 치료, 예방 또는 개선시 보조하도록 조정된 하나 이상의 AON을 추가로 제공한다.
어구 "약제학적으로 허용되는"은 대상체에게 투여되는 경우, 생리학적으로 내성이고 전형적으로 알레르기성 또는 유사하게 원치않는 반응, 예를 들면, 위 경련(gastric upset)을 생산하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면, 물 및 오일, 예를 들면, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들면, 땅콩 오일, 대두 오일, 광 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물 및 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사가능한 용액 용 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약제학적 담체는 문헌: Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)에 기술되어 있다.
D. 의약의 제조
일 구현예에서, 본 발명은 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 SOD1 RNA내 선택된 표적에 결합하는 AON의 용도를 제공한다. 따라서, ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위해 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다.
또한 SOD1 내의 돌연변이와 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다.
SOD1 내의 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다.
본 발명은 SOD1 내의 돌연변이와 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바에 따른 정제 및 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
또한 SOD1 내의 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바에 따른 정제 및 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바에 따른 정제 및 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도가 제공된다.
또한 SOD1 억제에 대해 반응하는 경향이 있는 ALS 환자와 관련된 바이오마커를 발현하는 대상체에서 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 의약의 제조를 위해 본원에 기술된 하나 이상의 AON의 용도가 제공된다.
바람직하게는, 바이오마커는 SOD1 유전자 영역 내 유전적인 구조적 변이체, 예를 들면, SCAF4 내 구조적 돌연변이체, 또는 SOD1 관련/상호작용 유전자 영역, 예를 들면, SQSTM1 내 유전적인 구조적 변이체이다. CSF 내에서 미스폴딩된 SOD1의 검출은 또한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 바이오마커는 당해 분야에 공지된 검정을 통해 환자내에서 확인될 수 있다.
바람직하게는, 의약의 제조에 사용된 AON은 표 1 또는 2에 제공된 AON의 목록으로부터 선택되거나 보다 바람직하게는 서열 번호: 6, 8, 13 27, 29 또는 34로부터 선택된다. 예로서, AON은 서열 번호: 8 또는 29이다.
E. 약제학적 조성물
본 발명의 형태에서, 약제학적으로 허용되는 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제, 및/또는 담체와 함께 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 AON을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 다양한 완충액 성분(예컨대, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 강도 및 첨가제, 예를 들면, 세제 및 가용화제(예컨대, 트윈(Tween) 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 방부제(예컨대, 티머솔, 벤질 알코올) 및 팽창 물질(bulking substance)(예컨대, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 물질은 중합체성 화합물, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 입자화 제제 또는 리포좀 내로 혼입될 수 있다. 하이알루론산을 또한 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소 속도(rate of in vivo clearance)에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함된, 문헌: Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712을 참고한다. 조성물은 액체형으로 제조될 수 있거나, 건조된 분말, 예를 들면, 동결건조된 형태일 수 있다.
본 발명에 따라 제공된 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 수단으로 투여될 수 있음이 인식될 것이다. 바람직하게는, 투여용 약제학적 조성물은 주사에 의해, 경구적으로, 국소적으로 또는 폐 또는 비강 경로에 의해 투여된다. AON은 보다 바람직하게는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여 경로로 전달될 수 있다. 적절한 경로는 당해 분야의 기술자에 의해 치료 하에 대상체의 상태에 적절한 것으로서 투여될 수 있다. 혈관 및 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 및 뇌척수액은 일부 비-제한 부위이며 여기서 AON이 도입될 수 있다. 직접적인 CNS 전달이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 뇌실내(intracerebro-ventricular) 또는 척추강내가 투여 경로로서 사용될 수 있다.
국소 투여용 제형은 본 개시내용의 올리고머가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이팅제 및 표면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합된다. 지질 및 리포좀은 중성(예컨대, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린) 음성(예컨대, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예컨대, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)를 포함한다. 국소 또는 다른 투여의 경우, 본 개시내용의 올리고머는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나 이에 대해, 특히 양이온성 리포좀에 대해 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고머는 지질, 특히 양이온성 지질에 착화될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호 및/또는 1999년 5월 20일자로 출원된 미국 특허원 일련 번호 제09/315,298호에 추가로 기술되어 있다.
특정의 구현예에서, 본 개시내용의 AON은 경피 방법(예컨대, 이와 함께 이러한 AON이 리포좀내로 임의로 패키징되는 AON의 혼입을 통해)에 의해 전달될 수 있다. 이러한 경피 및 유액/리포좀-매개된 전달 방법은 당해 분야, 예컨대, 미국 특허 제6,965,025호에 AON의 전달을 위해 기술되어 있다.
본원에 기술된 AON은 이식가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는 당해 분야에 인식된 공정, 예컨대, 미국 특허 제6,969,400호에 기술된 합성 이식체 설계를 사용한 당해 분야에서 인식된 공정이다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 산제 또는 입제, 미세입자화제, 나노입자화제, 현탁제 또는 물 또는 비-수성 매질 중 액제, 캡슐제, 겔 캡슐제, 사셰제(sachet), 정제 또는 미니정제(minitablet)를 포함한다. 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 요구될 수 있다. 경구 제형은, 본 개시내용의 올리고머가 하나 이상의 침투 향상제, 표면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 것이다. 표면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 담즙산/염 및 지방산 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 침투 향상제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과 조합된 지방산/염을 제공한다. 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 개시내용의 올리고머는 경구적으로, 분무된 건조 입자를 포함하는 과립형으로 전달될 수 있거나, 착화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. 올리고머 착화제(complexing agent) 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기술된다. 올리고머의 경구 제형 및 이의 제조는 미국 제6,887,906호, 1999년 5월 20일자로 출원된 제09/315,298호 및/또는 제US20030027780호에 기술되어 있다.
비경구, 척추강내 또는 심실내 투여용 조성물 및 제형은 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 침투 향상제, 담체 화합물 및 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
치료학적 유효량의 AON의 전달은 이미 발표된 방법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, AON의 세포내 전달은 AON과 유효량의 블록 공중합체의 혼합물을 폼하는 조성물을 통할 수 있다. 이러한 방법의 예는 미국 특허원 제US20040248833호에 기술되어 있다. 핵으로 AON의 다른 전달 방법은 문헌: Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47, 및 Gebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811에 기술되어 있다. 네이크드 DNA로서 또는 액체 담체에 착화된 발현 벡터의 방법에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는 방법은 제US 6,806,084호에 기술되어 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 AON 및 이를 포함하는 치료학적 조성물은 경피 방법(예컨대, AON의 예컨내 유액으로의 혼입을 통해, 이러한 AON은 리포좀 내로 임의로 패키징된다)으로 전달될 수 있다. 이러한 경피 및 유액/리포좀-매개된 전달 방법은 당해 분야, 예컨대, 미국 특허 제6,965,025호에서 AON의 전달용으로 기술되어 있다.
AON을 콜로이드성 분산 시스템 속에서 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 비드, 및 지질-기반 시스템, 예를 들면, 수중유 유액(oil-in-water emulsion), 미셀(micelle), 혼합된 미셀, 및 리포좀 또는 리포좀 제형을 포함한다. 이러한 콜로이드성 분산 시스템은 치료학적 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
리포좀은 인공 막 소낭(artificial membrane vesicle)이며, 이는 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 유용하다. 이러한 제형은 순수한 양이온성, 음이온성, 또는 중성 전하 특성을 가질 수 있고 시험관내, 생체내 및 생체외 전달 방법을 위해 유용한 특성을 갖는다. 큰 단일라멜라 소낭(large unilamellar vesicle)이 큰 거대분자를 함유하는 수성 완충액의 실질적인 퍼센트를 캡슐화할 수 있음이 밝혀졌다. RNA 및 DNA는 수성 내부 내에서 캡슐화되어 생물학적으로 활성인 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley, et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6, 77).
리포좀이 효율적인 유전자 전달 비히클이 되도록 하기 위하여, 다음의 특성이 존재할 수 있다: (1) 목적한 AON의 고 효능에서 그러나 이의 생물학적 활성을 상충하지 않는 캡슐화; (2) 비-표적 세포와 비교하여 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합; (3) 비히클의 수성 성분의 표적 세포 세포질 내로 고 효능에서의 전달; 및 (4) 유전 정보의 정확하고 효과적인 발현(Mannino, et al., 1988 Biotechniques, 6, 682). 리포좀의 조성물은 일반적으로 인지질, 특히 고 상-전이-온도 인지질의 조합, 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 양이온성 인지질은 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 것으로 여겨지는 양으로 하전된 리포좀이다. pH-민감성 또는 음으로 하전된 리포좀은 DNA와의 복합체보다는 DNA를 인트랩(entrap)하는 것으로 여겨진다. 양이온성 및 비양이온성 리포좀 둘 다를 사용하여 DNA를 세포로 전달할 수 있다.
리포좀은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함하며, 본원에 사용된 바와 같은, 이러한 용어는 리포좀 내로 혼입되는 경우 이러한 구체화된 지질을 결여한 리포좀에 대해 향상된 순환 수명을 야기한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소낭-형성 지질 부위의 부분이 하나 이상의 당지질을 포함하거나 하나 이상의 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도체화된 것이다. 리포좀 및 이의 용도는 제U.S. 6,287,860호에 추가로 기술되어 있다.
본원에 기술된 AON은 또한 이식가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는 예를 들면, 이의 내용이 이의 전문으로서 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,969,400호에 기술된 합성 이식체 설계를 지닌, 당해 분야에 인식된 공정이다.
AON은 당해 분야에 인식된 기술(예컨대, 형질감염, 전기천공, 융합, 리포좀, 콜로이드성 중합체 입자 및 바이러스 및 비-바이러스 벡터 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 수단)을 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다. 선택된 전달 방법은 적어도 치료될 세포 및 세포의 위치에 의존할 것이며 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 국재화는 리포좀을 지시하거나, 표적 세포를 함유하는 조직 내로의 주사를 지시하거나, 특이적인 수용체-매개된 흡수 등을 지시하기 위해 표면 상에 특이적인 마커를 지닌 리포좀에 의해 달성될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, AON은 예를 들면, 리포좀-매개된 흡수, 지질 접합체, 폴리라이신-매개된 흡수, 나노입자-매개된 흡수, 및 수용체-매개된 세포내이입(receptor-mediated endocytosis) 뿐만 아니라 전달의 추가의 비-세포내이입 방식, 예를 들면, 미세주사, 투과(예컨대, 스트렙토라이신-O 투과, 음이온성 펩타이드 투과), 전기천공, 및 당해 분야에 공지된 다양한 비-침입성 비-세포내이입성 전달 방법을 포함하는 방법을 사용하여 전달할 수 있다(이의 전문이 참고로 ?l마된 문헌: Dokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49를 참고).
AON은 또한 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합되어 약제학적 조성물을 생산할 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 염수 용액, 예를 들면, 인산염-완충된 염수를 포함한다. 조성물은 미경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구, 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
기술된 투여 경로는 기술자가 최적의 투여 경로 및 임의의 특수한 동물 및 상태에 대한 임의의 투여량을 용이하게 결정할 것이므로, 안내로서만 의도된다.
기능성의 신규 유전 물질을 세포내로, 시험관내 및 생체내 둘 다로 도입하기 위한 다수의 접근법이 시도되었다(Friedmann (1989) Science, 244, 1275-1280). 이러한 접근법은 발현된 유전자의 변형된 레트로바이러스내로의 통합(Friedmann (1989) 상기 참고; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); 비-레트로바이러스 벡터 내로의 통합(Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68, 143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252, 431-434); 또는 이종 프로모터-인핸서 성분에 리포좀을 통해 연결된 전이유전자의 전달(Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298, 278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249, 1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; 및 Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84, 7851-7855); 리간드-특이적인, 양이온-기반 전달 시스템에 대한 커플링(Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263, 14621-14624) 또는 네이크드 DNA, 발현 벡터의 상용(Nabel et al. (1990), 상기 참고); Wolff et al. (1990) Science, 247, 1465-1468)을 포함한다. 조직내로 전이유전자의 직접적인 주사는 단지 국재화된 발현을 생산한다(Rosenfeld (1992) 상기 참고); Rosenfeld et al. (1991) 상기 참고; Brigham et al. (1989) 상기 참고; Nabel (1990) 상기 참고; 및 Hazinski et al. (1991) 상기 참고). 문헌; Brigham et al. group ((1989) Am. J. Med. Sci. 298, 278-281 및 Clinical Research (1991) 39 (abstract))은 마우스의 폐 만의 생체내 형질감염에 이은 DNA 리포좀 복합체의 정맥내 또는 기도내 투여를 보고하였다. 사람 유전자 치료요법 과정의 고찰 문헌의 예는 다음과 같다: Anderson, (1992) Science 256, 808-813; Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther., 8(5), 313-23; Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol., 35(3), 164-78; Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18), 1313-9; Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv., 2(2), 237-54.
본 발명의 AON은 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 사람을 포함하는 동물에게 투여시, 생물학적으로 활성인 대사산물 또는 이의 잔기를 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 예로서, 본 개시내용은 또한, 본 발명의 화학물의 전구약물(prodrug) 및 약제학적으로 허용되는 염, 이러한 전구-약물의 약제학적으로 허용되능 염, 및 다른 생물등가물을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 약제학적으로 허용되는 염: 즉, 모 화합물의 목적한 생물학적 활성을 보유하며 이에 대한 목적하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올리고머의 경우, 약제학적으로 허용되는 염의 바람직한 예는 (a) 양이온, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들면,스페르민 및 스페르미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함게 형성된 산 부가 염; (c) 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산,, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산, 등과 같은 유기 산과 함께 형성된 염; 및 (d) 원소 음이온, 예를 들면, 염소, 브롬 및 요오드로부터 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 및 치료될 부위에 의존하다 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들면, 눈 및 점막 뿐만 아니라 직장 전달), 폐, 예를 들면, 흡입 또는 분말의 통기(insufflation) 또는 에어로졸(예를 들면, 분무기, 기관내, 비강내, 상피 및 경피에 의해), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사; 또는 두개내, 예컨대, 척추강내 또는 심실내 투여를 포함한다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 지닌 올리고머는 경구 투여에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 바람직하게는, AON은 피하 또는 정맥내 경로를 통해 전달된다.
단위 투여량 형태로 편리하게 제공될 수 있는, 본 발명의 약제학적 제형은 약제 산업에 잘 공지된 통상의 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)을 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 연합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조한다.
다음의 실시예는 단지 나열하기 위함이며 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 실시예는 본 발명을 예시할 목적을 위해서만 포함된다. 이는 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 광범위한 요약, 개시내용 또는 설명을 한정하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 추가의 설명없이, 당해 분야의 기술자는 선행 설명을 사용하여 본 발명을 이의 충분한 정도까지 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 앞서의 및 다음의 실시예에서, 모든 온도는 교정되지 않는 섭씨 도로 설정되며; 달리 나타내지 않는 한, 모든 부 및 퍼센트는 중량기준이다.
실시예
실시예
실시예 1 - 원래의 AON의 설계
스플라이스-스위칭(splice-switching) AON을 설계하여 5' 및 3' 스플라이스 부위 및 온라인 스플라이스 예측 도구에 의해 예측된 것으로서 엑손내 엑손 스플라이스 인핸서 부위를 표적화하였다.
이러한 원래의 AON에 대한 서열은 표 1에, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 12 및 14로서 나타낸다. AON 명명법은 만(Mann) 등의 문헌(Mann et al, J Gene Med., 2002 4 (6), 644-654)을 기반으로 하며, 이에 의해 종, 유전자, 엑손 번호, 수용체 또는 공여체 표적화 및 어닐링 배위가 기술되며, 여기서 "-"는 인트론성 위치이고 "+"는 본원에 기술된 바와 같이, 스플라이스 위치로부터의 엑손성 위치를 명시한다. 일부 상세한 올리고머 어닐링 배위는 표 1에 나타나 있다. 도 12는 SOD1 상의 각각의 AON의 결합 위치의 개략도를 나타내다.
2'O 메틸 변형 및 포스포로티오에이트 골격을 지닌 AON은 TriLink Biotechnologies, Inc(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 주문하였다. 포스포로디아미데이트 골격을 지닌 PMO는 Genetools LLC(미국 오레건 주 필로매쓰 소재)로부터 주문하였다.
실시예 2 - 전사체 분석을 사용한 AON 스크리닝
SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 2´O메틸 AON(50, 25 및 12.5 nM)의 형질감염 후 수행하였다. AON 형질감염 후 SOD1 엑손 스키핑의 수준을 샴(sham) 대조군 처리된 및 처리되지 않은 샘플과 비교하였다.
물질 및 방법
섬유아세포의 형질감염
정상의 사람 피부 섬유아세포를 확립된 기술에 따라 24 웰 플레이트(well plate) 내로 10% FBS DMEM 속에 씨딩(seeding)된 15,000개의 세포를 사용하는 확립된 기술에 따라 증식시켰다. 모든 2´O메틸 PS-AO를 리포펙타민 3000(형질감염 용적 ml 당 3 μl)(Life Technologies, 오스트레일리아, 멜보른 소재)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시키고, AO 형질감염된 세포를 24시간 동안 항온처리하였다.
전사체 분석
RNA를 DNase 처리(Life Technologies)를 포함하는 MagMAX-96 총 RNA 분석 키트를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 추출하였다. RT-PCR을 백금 Taq 폴리머라제(Life Technologies)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 1-단계(One-step) Superscript III RT-PCR 키트로 수행하였다. 생성물을 SOD1 엑손 1 내지 5(Fwd:
Figure pct00012
(서열 번호: 46), Rev:
Figure pct00013
(서열 번호: 47))에 걸쳐서 온도 프로파일, 55℃에서 30분, 94℃에서 2분에 이어, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 1분의 22 주기로 증폭시켰다.
PCR 생성물을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액 중 2% 아가로스 겔 상에서 분획화하고 영상을 겔 문서화 시스템(gel documentation system)에서 포획하고 Bio1D 소트프웨어(Vilber Lourmat, 독일 에베르하르첼 소재)로 분석하여 밴드 중량을 정량하고 총 길이의 SOD1 및 엑손 스키핑된 생성물의 비을 평가하였다. 생성물 확인은 밴드 정제 및 필요한 경우 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 엑손 스키핑의 효능은 RT-PCR에 의해 생성된 총 생성물과 비교하여 스피킹된 엑손(들)을 지닌 전사체의 퍼센트를 계산함으로써 측정하였다.
도 1은 2´O메틸 AON(50, 25 및 12.5 nM) designed to induce SOD1 엑손 2, 3 또는 4 스키핑을 유도하도록 설계된 2´O메틸 AON(50, 25 및 12.5 nM)의 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
실시예 4 - AON의 최적화
AON 스크리닝 후, SOD1 엑손 2, 3 및 4를 표적화하는 AON을 마이크로-워킹(micro-walking)으로 최적화하고, 형질감염 후 엑손 스키핑의 수준을 원래의 AON 서열, 샴 대조군 AON 및 미처리 샘플과 비교하였다.
AON 서열을 3 내지 5개의 염기에 의해 상하로 이동시켜 최적의 표적 부위를 확인하였으며, 이 동안 올리고마 길이는 여전히 유지시켰다. 추가의 최적화는 20 내지 50개 뉴클레오타이드의 AON 길이를 변화시키면서 수행하였다.
도 2는 원래의 AON 서열, 샴 대조군 및 미처리 샘플과 비교하여, 서열 최적화 후, RT-PCR 분석을 나타낸다. 도 3은 엑손 1의 공여체 부위에 대해 표적화하도록 설계된 AON에 대한 추가의 최적화 결과, 및 샴 대조군 및 미처리 샘플의 것과 비교하여 정체 길이의 SOD1 전사체의 수준을 나타낸다.
AON 1 내지 5(이는 표 1에서 서열 번호: 1 내지 5에 상응한다)를 설계하여 엑손 2 스키핑을 유도하였다. 이러한 AON 중에서, 엑손 2 공여체 스플라이스 부위를 표적화하는 AON 5는 전사체 스키핑 엑손 2의 대략 20%로, 엑손 2 스키핑을 유도하는데 가장 효과적인 것으로 여겨진다.
AON 5를 4개 염기까지 길이로 연장시킴으로써 최적화시켜 AON 6(서열 번호: 6)을 생산하였다. AON 6은 엑손 2 스키핑을 향상시키는 것으로 여겨지지 않지만, 여전히 전체 길이의 SOD1의 녹다운(knockdown) 수준을 증진시킨다(도 3). SOD1 전사체로부터의 엑손 2의 배제가 판독 프레임을 파괴하고 엑손 4에서 미성숙 말단 코돈을 생산함을 고려할 때, 이는 넌센스(nonsense) 매개된 쇠퇴(decay) 및 낮은 수준의 전체 길이의 SOD1 전사체를 생성하는 것으로 예측된다. AON 5 염기 상부(AON18)를 이동시켜 AON 6 서열을 마이크로-워킹시키는 것은 유사한 수준의 엑손 2 스키핑 및 AON 6으로의 SOD1 녹다운을 유도하며, 이는 당해 영역(도 12, 핫 스폿(Hot Spot) 1)이 엑슨 2 스키핑 및 SOD1 녹다운에 대한 최적의 표적이 되도록 유도함으로써 SPp30c 및 SC35 결합 부위를 표적화함을 나타낸다.
AON 7 내지 10(이는 표 1에서 서열 번호 7 내지 10에 상응한다)는 엑손 3 스키핑을 유도하도록 설계되었으며 이후 형질감염은 낮은 수준의 엑손 3, 및 엑손 2+3 스키핑을 유도한다. 엑손 스플라이싱 인핸서 부위를 표적화하는 AON 8은, 대조군 처리된 및 비처리된 샘플의 것과 비교하여 AON8 처리된 샘플에서 관찰된 전체 길이의 SOD1 전사체의 수준에 있어서 명확한 감소와 함께, 엑손 3 스키핑을 유도하는데 가장 효과적인 것으로 여겨진다(도 2). 엑손 3 스키핑을 유도하는 것은 판독 프레임을 파괴하고 엑손 4 내 미성숙 말단 코돈을 유도하여, 넌센스 매개된 쇠퇴, 및 보다 낮은 수준의 SOD1 전사체를 생성하는 것으로 예측된다.
5개 염기 상부(AON 19, 표 1에서 서열 번호: 19에 상응함)의 마이크로-워킹에 의한 AON 8의 최적화하는 AON 8의 것과 유사한 수준의 엑손 3 스키핑 및 SOD1 녹다운을 유도한다(도 3). 이러한 AO는 2개의 SRp40 결합 부위를 표적화하며, 도 12에서와 같은 핫 스폿 2로서 나타내어져 있다. 또한, AON 8 및 19는 AON 6과 비교하여 보다 큰 SOD1 녹다운을 유도하며(도 3), 이는 엑손 3이 넌센스 매개된 쇠퇴 및 SOD1 녹다운을 유도하기 위한 바람직한 표적임을 나타낸다.
AON 11 내지 15(이는 표 1에서 서열 번호: 11에 상응한다)를 설계하여 엑손 4 스키핑을 유도하였다. AON 13은 SOD1 녹다운을 유도하기 위해 AON을 표적화하는 가장 효과적인 엑손 4이다(도 2). 엑손 4를 결여하는 전사체는 또한 파괴된 판독 프레임, 및 미성숙 종결 코돈을 가지므로, 넌센스 매개된 쇠퇴가 또한 예측될 수 있다.
AON을 표적화하는 엑손 4의 최적화는 엑손 4 스키핑을 유도하는데 실패하였고, 아직 미처리 샘플의 것과 비교하여 전체 길이의 SOD1 전사체에서 명확한 용량 의존성 감소가 존재한다. AON 13 10개 염기 상부(AON 21, 표 1에서 서열 번호: 21에 상응)의 이동은 AON 13과 비교하여 SOD1 녹다운을 유도하는데 약간 덜 효과적이었다. 이러한 AON은 도 12에서 핫 스폿 3으로 나타낸, ETR-3 스플라이스 인핸서 도메인을 표적화한다.
실시예 5 - PMO로서 AON 6 및 AON 8의 전사체 평가
2'O메틸 AO 최적화에 이어서, AON 6 및 AON 8을 합성하고 PMO로서 평가하였다. PMO를 정상의 섬유아세포로 핵감염(nucleofection)에 의해 전달한 다음, 상술한 바와 같은 RT-PCR을 사용하여 평가하였다.
핵감염에 의한 PMO 전달은 핵감염 X 유닛을 사용하여 핵감염 P2 키트(Nucleofection P2 kit)로, CA-137 프로그램(Lonza, 오스트레일리아 멜보른 소재)을 사용하여 수행하였다. PMO를 5% FBS DMEM이 보충된 큐베트(cuvette) 내에서 200 μM, 100 μM 또는 50 μM에서 형질감염시키고 24시간(RNA 분석) 및 5일(단백질 분석) 동안 항온처리하였다.
도 4는 PMO 형질감염 후 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸다(200 μM 및 100 μM). SMN의 RT-PCR은 로딩 대조군으로서 포함되었고, AON 형질감염 후 엑손 스키핑의 수준은 샴 대조군 및 미처리 샘플의 것과 비교된다.
이러한 PMO는 이의 2'O메틸 대응부와 비교하여 전체 길이의 SOD1 녹다운을 유도하는데 보다 효과적인 것으로 여겨진다. 둘 다 PMO에 의해 유도된 엑손 스키핑 및 SOD1 녹다운의 수준에서 명확한 용량 반응이 존재하였다. 하우스 키핑 PCR을 수행하여(SMN) SOD1의 녹 다운이 특이적이고 모든 레인에 걸쳐 균일한 로딩을 확인한다.
실시예 6 - 정상 및 SOD1 D90A 섬유아세포에서 PMO로서 AON 6 및 AON 8 전사체 및 단백질 분석
웨스턴 블롯팅을 사용한 전사 및 단백질 분석을 SOD1 D90A 돌연변이를 수반한 정상 및 환자 섬유아세포 상에서 AON 6 및 8을 사용한 PMO 형질감염에 따라 수행하였다.
PMO를 200 및 100 μM(n=3)에서 핵감염으로 전달하였다. 결과는 도 5에 나타낸다. PMO를 또한 SOD1 D90A 섬유아세포에서 200, 100 및 50 μM에서의 형질감염으로 전달하였다. 핵감염은 상술한 바와 같이 수행하였다.
물질 및 방법 - 웨스턴 블롯팅
세포 분해물을 125 mM 트리스/HCl pH 6.8, 15% SDS, 10% 글리세롤, 1.25 μM PMSF(Sigma-Aldrich, NSW, 오스트레일리아, 1x 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich) 0.004% 브로모페놀 블루 및 2.5 mM 디티오트레이톨)을 사용하여 제조한 다음 6회 초음파처리(1초 펄스)하였다. 샘플을 94℃에서 5분 동안 가열하고, 빙상에서 냉각시키고 14,000 xg에서 2분 동안 원심분리한 다음 겔 위에 로딩(loading)하였다.
Pierce BCA 단백질 검정 키트(Life Technologies)로 측정한, 총 단백질(30 μg)을 NuPAGE Novex 4-12% BIS/트리스 겔(Life Technologies) 위에서 샘플당 로딩하고 200 V에서 55분 동안 분리하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 iBlot(Life Technologies)를 사용하여 다음의 전달 프로토콜에 따라 전달하였다: 1분 동안 20 V, 4분 동안 23 V 및 2분 동안 25 V. 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 막을 밤새 4℃에서 5% 탈지 분말 속에서 SOD1 1차 항체(1:1000, Cell Signalling), 및 베타-투불린 1차 항체(1:2500, Life Technologies)를 함유하는 를 함유하는 1x TBST 속에서 항온처리하였다. 면역검출을 항-토끼 HRP 2차 항체(1:10,000, Dako) 및 Immobilon HRP 화학발광성 기질(Merck)을 사용하여 수행하였다. 웨스턴 블롯 영상을 Vilber Lourmat Fusion FX 시스템 상에서 융합 소프트웨어(Fusion software)를 사용하여 포획하고 Bio-1D 소프트웨어를 영상 분석에 사용하였다.
결과
도 5는 AON 6 및 AON 8(RNA의 경우 200 μM 및 100 μM 및 단백질의 경우 200 μM)을 사용한 PMO 핵감염에 따른 SOD1 전사체 및 단백질 분석을 나타낸다. 도 5(a)는 SOD1 전사체의 RT-PCR를 나타내고, TBP 전사체 분석을 로딩 대조군을 포함하였으며; 도 5(b)는 SOD1 및 β-투불린(로딩 대조군) 수준의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 5(c)는 β-투불린에 대해 표준화되고 비처리 섬유아세포로부터의 SOD1 수준과 비교한 배-변화로서 나타낸 AON 처리된 세포내 SOD1 수준의 평균 밀도계 분석(average densitometrical analysis)를 나타내는 그래프를 나타낸다. 평균을 정상 및 SOD1 환자 섬유아세포에서 수행된 3개의 별개의 실험으로부터 취하였다. 형질감염된 샴 대조군(sham control) 및 비처리 샘플을 SOD1 형질감염된 섬유아세포로부터의 샘플에 대한 비교를 위해 포함시켰다. 오차 바아는 평균의 표준 오차를 나타내고, P 값은 쌍을 이룬 t-시험을 사용하여 측정하였다.
도 6는 200, 100 및 50 μM에서 SOD1 D90A 돌연변이를 수반하는 SOD1 환자 섬유아세포 내에서 AON 6 및 AON 8을 지닌 PMO 형질감염 후 SOD1 단백질 분석을 나타낸다. 도 6(a)는 SOD1 및 β-투불린(로딩 대조군) 수준의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 6(b)는 β-투불린에 대해 표준화되고 미처리 섬유아세포로부터의 SOD1 수준과 비교하여 배-변화로서 나타낸 AON 처리된 세포내 SOD1 수준의 밀도계 분석을 나타내는 그래프이다. 형질감염된 샴 대조군 및 미처리 샘플을 SOD1 형질감염된 섬유아세포로부터의 샘플에 대해 비교하기 위해 포함시켰다.
AON 6 및 AON 8 PMO를 사용한 형질감염 후 단백질 분석은 SOD1 D90A 돌연변이를 수반한 정상 및 환자 섬유아세포 내 SOD1 단백질 수준의 일관된 녹다운을 나타내었다. 도 5는 미처리 섬유아세포내 수준과 비교하여 AON 6을 사용하여 83%(P=0.001) 및 AON 8을 사용하여 63%(P=0.014)까지 SOD1 수준의 평균 녹-다움을 나타내었다. 도 6은 AON에 대해 명확한 용량 반응을 나타낸 SOD1 D90A 섬유아세포내에서 200, 100 및 50 μM에서 PMO의 핵감염을 나타내고, SOD1 단백질의 수준은 미처리 섬유아세포와 비교하는 경우 보다 높은 AON 농도로 감소하였다.
실시예 7 - SOD1-연결된 환자 유도된 다능성 줄기 세포의 분화 및 형질감염
A4V, G85R 및 L144H 돌연변이를 수반하는 다능성 줄기 세포(iPSC)를 유도한 SOD1-연결된 환자를 문헌: Du et al. 2015, Nature Comms, 6:6626에 공지된 프로토콜을 사용하여 70% Hb9 및 80% ChAT 양성 척추 운동 뉴런으로 분화시켰다.
iPS 세포를 DMEM/F12 및 0.1 mM 아스코르브산(Life Technologies) 1x 글루타맥스(Glutamax)(Life Technologies), 3 μM CHIR99021(Torcis), 2 μM DMH-1(Torcis) 및 2 μM SB431542(Stemgent)이 보충된 핵기저 배지(Neurobasal media)(1:1)(Life Technologies) 속에서 6일 동안 신경상피 세포로 분화시켰다. CHIR99021을 1 μM 및 0.5 μM 루르모르파민(Stemgent)으로 감소시키고 0.1 μM 레티노산(Stemgent)을 추가로 6일 동안 가하여 OLIG2 양성 운동 뉴런 선조 세포로 분화시켰다. 뉴런 선조세포를 추가로 6일 동안 0.5 μM 레티노산 및 0.1 μM 푸르모르파민을 함유하는 DMEM/F12 신경기저 배지(1:1) 속에서 MNX1 양성 운동 뉴런으로 분화시켰다. MNX1 양성 운동 뉴런을 Accumax(eBioscience)를 사용하여 단일 세포로 분리시키고 Neon 전기천공기(electroporator)(Life Technologies)를 사용하여 100 μM 및 50 μM에서 다음의 매개변수를 사용하여 SOD1 PMO로 형질감염시켰다: 1300 V를 사용하여 10초 동안 3회 펄스. 현탁액 속에서 형질감염된 세포를 매트리겔 코팅된 플레이트 상으로 대체하고 성숙한 ChAT 양성 운동 뉴런으로 추가로 10일 동안 0.1 μM 푸르모르파민, 0.5 μM 레티노산 및 0.1 μM 화합물 E(Calbiochem)를 사용하여 분화시켰다. 모든 단계에서, 배지를 격일마다 교체하였다. 형질감염 및 10일 분화 프로노콜 후, 세포 배양물 상층액을 수집하고 LDH 분석(하기)을 위해 -80℃에서 저장하고 세포를 상기와 같이 RNA 및 단백질 분석을 위해 수거하였다.
실시예 8 - AON 6 및 AON 8 PMO의 iPSC 유래된 운동 뉴런으로의 형질감염
SOD1-연결된 다능성 줄기 세포 유래된 운동 뉴런으로 AON 6 및 AON 8을 사용한 PMO 전기천공을 상기와 같이 수행하였다(100 및 50μM).
실시예 9 - iPSC 유래된 운동 뉴런에서 PMO로서 AON 6 및 AON 8의 전사체 및 단백질 분석
AON 6 및 AON 8 PMO를 SOD1 A4V, G85R 및 L144H 돌연변이를 수반하는 SOD1-연결된 ALS 환자 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래된 운동 뉴런에서 평가하였다. 전사체 분석은 상술한 바와 같이 RT-PCR을 사용하여 수행하였고, 단백질 분석은 상술한 바와 같은 웨스턴 블롯팅을 사용하여 수행하였다.
결과는 도 7에 나타낸다. 도 7(a)는 로딩 대조군으로서 포함된 TBP 전사체 분석을 사용한 SOD1 전사체에 거친 RT-PCR을 나타내고, 도 7(b)는 SOD1 및 β-투불린(로딩 대조군) 수준의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 7(c)는 β-투불린에 대해 표준화되고 PBS로 처리된 운동 뉴런에서 SOD1 수준과 비교하여 배-변화로서 나타낸 AON 처리된 세포에서 SOD1 수준의 밀도계 분석을 나타내는 그래프를 나타낸다. 샴 대조군 형질감염된 샘플을 SOD1 AON 형질감염된 운동 뉴런으로부터의 샘플과 비교하기 위해 포함시켰다.
농도(100 및 50 μM) 둘 다에서, AON 6 및 AON 8 PMO 둘 다는 모든 3명의 환자 세포 균주에서 SOD1 단백질 수준의 유의적인 녹다운을 유도하였다. AON 8은 운동 뉴런에서 가장 일관되고 효과적인 PMO이었고, 93% 이하의 녹다운을 모든 3개의 세포 균주에서 보다 높은 농도(P=0.001)에서 유도하였다.
실시예 10 - SOD1A4V 환자 운동 뉴런에서 PMO 형질감염 후 세포 생존능의 평가
SOD1 A4V 환자 운동 뉴런(100 및 50 μM)에서 PMO 형질감염 후, 락테이트 하이드로게나제(LDH) 수준을 세포 사멸의 척도로서 세포 배양 상층액 속에서 평가하였다.
LDH 수준을 상층액 속에서 LDH CytoTox 96 세포독성 검정 키트(Promega, G1780)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. AON 형질감염된 세포로부터의 상층액 속에서 LDH 수준을 PBS 대조군 형질감염된 세포로부터의 상층액 속에서 검출된 수준으로 표준화하였다.
결과는 도 8에 나타낸다. 도 8(a) 및 (b)는 도 7에서와 같은 웨스턴 블롯 및 밀도측정법을 나타내고, 도 8(c)는 PMO 형질감염 후 1 및 10일째에 수집한 세포 배양 상층액으로부터의 LDH 수준의 그래프이고, 이에 의해, SOD1 AON 형질감염된 세포내 LDH 수준은 PBS 처리된 세포내 수준으로 표준화되었다. AON 6 및 AON 8 둘 다는 세포 생존능을 개선시켰고, PBS 처리된 세포와 비교하는 경우 보다 낮은 수준의 LDH가 SOD1-PMO 형질감염된 세포로부터의 상층액에서 관찰되었다.
실시예 11 - AON으로 형질감염시킨 SOD1 D90A 섬유아세포내에서 산화 스트레스의 평가
PMO 형질감염된(50 및 25 μM) SOD1D90A 섬유아세포 내에서 산화 스트레스를 유도하기 위한 과산화수소 손상 후 반응성 산소 종(ROS)의 세포내 수준에 있어서 SOD1 단백질 억제의 효과를 평가하였다.
PMO 전기천공을 재현탁 완충액 R을 사용한 Neon 전기천공기 및 다음의 매개변수를 사용하여 수행하였다: 1300 V에서 10초 동안 3회 펄스(Life Technologies). PMO를 5% FBS DMEM이 보충된 Neon 팁 속에서 50 μM, 25 μM 또는 10 μM에서 형질감염시키고 24시간 동안(RNA 분석) 및 5일 동안(단백질 분석) 항온처리하였다.
SOD1 D90A 섬유아세포를 AON으로 상술한 바와 같은 Neon 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. AON 형질감염 후 4일째에, 세포를 5 mM 과산화수소(Sigma-Aldrich)로 처리하여 산화 스트레스를 유도하고, 30분 동안(37℃) 항온처리한 다음, 과산화수소를 제거하고 신선한 배지로 대체시켰다. 섬유아세포를 추가로 24시간 동안 항온처리한 후 트립신처리하고 세포 펠렛을 BCA에 의한 총 단백질 분석 및 반응성 산소종(ROS)의 분석을 위해 2개의 튜브로 동등하게 수집하였다. ROS 분석을 위한 세포 펠렛을 PBS 속에 재현탁시키고 DCF ROS/RNS 검정 키트(Abcam, Ab238535)를 사용하여 세포내 ROS에 대해 분석함으로써 DCF 형광성을 검출하였다. 각각의 샘플을 2회 이동시키고 검정을 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 세포내 ROS의 수준을 총 단백질에 대해 표준화하였다.
결과는 도 9에 나타내며, 이는 미처리 섬유아세포에서의 수준과 비교하여 AON 6 및 AON 8로 형질감염된 섬유아세포내 ROS 수준을 나타낸다. ROS 수준을 BCA 분석에 의해 총 단백질에 대해 표준화하였다. 돌연변이체 SOD1 단백질의 녹다운은 대조군 PMO 형질감염된 및 미처리된 섬유아세포와 비교하여 보다 낮은 수준의 세포내 ROS를 갖는 AON 6 및 AON 8 PMO 형질감염된 세포를 사용한 과산화수소에 대해 세포 반응을 증진시키는 것으로 여겨진다.
실시예 12 - RNase H MOE AON을 사용한 AON 8 PMO의 비교
AON 8 PMO 효능을 SOD1 D90A 섬유아세포로의 형질감염 후, 문헌(McCampbell, et al, J Clin Invest., 2018. 128(8))에 기술된 RNase H 포스포로티오에이트 2'-O-메톡시에틸(MOE) AON을 표적화하는 SOD1과 비교하였다. 형질감염은 Neon 전기천공을 통해 일어났으며, 단백질 분석은 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 사용하여 수행하였다.
도 10은 SOD1 D90A 섬유아세포내로 전기천공(50, 25 및 10 μM) 후 SOD1 단백질 수준에서 AON 8 PMO 및 RNase H 포스포로티오에이트 및 세포 독성의 효과의 비교를 나타낸다. 도 10(a)는 SOD1 및 β-투불린(로딩 대조군) 수준의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 10(b)는 β-투불린에 대해 표준화되고 미처리 섬유아세포의 SOD1 수준과 비교하여 배수 변화로 나타낸 AON 처리된 세포내 SOD1 수준의 밀도 측정 분석을 나타내는 그래프를 나타내고; 도 10(c)는 분석 전 AON 형질감염된 섬유아세포(50 μM)의 상 대조 영상을 나타내고; 도 10(d)는 SON 형질감염, NONO에 대한 염색(백색 화살표로 나타냄) 후 및 핵 검출을 위해 Hoechst로 역염색 된 파라스펙클 단백질(paraspeckle protein)에 대한 오프-표적 효과의 면역형광성 영상을 나타낸다.
AON 8은 모든 농도에서 모다 일관되고 효과적인 AO인 것으로 여겨지며, 대조군 PMO과 비교하여 보다 높은 용량에서 82% SOD1 녹다운을 유도하며(p=0.0002) RNase H MOE AON보다 더 효과적이었다(p=0.02). AON 8은 세포 생존능 및 밀도에서 부정적인 영향을 가지지 않았지만, RNase H MOE AON은보다 높은 용량에서 유의적인 세포 사멸을 유발하였고(도 10(c)), 이는 , RNase H AON으로부터의 SOD1 수준에서 관찰된 역 용량-반응을 설명한다.
이전의 보고는 응집체로의 단백질 격리(sequestraion)를 유발하여, 트랜스크립톰(transcriptome)에 대한 전반적인 효과를 초래하고, 다른 공정 중에서도 RNA 프로세싱, 스플라이싱 및 전사에 영향을 미치는, 파라스펙클 단백질에 대한 포스포로티오에이트 AO의 오프-표적 결합으로 인한 독성 효과를 나타내었다(Flynn et al, BioRxiv, 2018, 446773; Shen et al, Nucleic Acids Res 42(13):880 8648-8662). 파라스펙클 단백질 NONO에 대한 면역염색(도 10(d))은 핵 내에서 NONO 응집체와 RNase H MOE의 오프-표적 단백질 결합을 나타낸 반면, AON 8 PMO는 오프-표적 단백질 결합을 유발하지 않았다. 이와 함께, 이러한 실험은 AON 8 PMO가 RNase H MOE AON보다 더 효과적이고 보다 안전할 수 있음을 나타낸다.
실시예 13 - AON 6 및 AON 8의 생체내 평가
3개의 유전자이식 SOD1 G93A 마우스를 AON 6 또는 AON 8로 처리하고, 뇌 및 척추 조직을 SOD1 발현에 대해 분석하였다. AON 6 및 AON 8 PMO 및 대조군 PMO를 대뇌내부심실로(intracerebroventricularly)(ICV)(100 nmol) 높은 카피 수의 유전자이식 SOD1G93A 마우스 내에 P60(n=3)에서 전달하고 P45에 희생시켰다.
유전자이식 SOD1G93A 마우스(B6.Cg-Tg(SOD1 *G93A)1Gur/J 혈통, 스톡 번호 004435, RRID:IMSR_JAX:004435)는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, 미국 매사츄세츠 중)로부터 구입하였다. 콜로니를 C57BL/6 배경으로 Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Core Animal Services에서 특이적인 병원체가 없는 조건 하에 유지시켰다. 실험 동물을 사료와 물을 자유로이(ad libitum) 접근하도록 하면서 표준 12시간 명암 조건 하에서 미세분리기(microisolator) 케이지 속에 가둔 그룹이었다.
높은 SOD1 발현 마우스를 AON 평가에 사용하였다. 30일령 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 100 nmol의 AON을 대뇌내부심실 거환 주사(intracerebroventricular bolus injection)로 정위 장치(stereotactic device)를 사용하여 투여하였다. 마우스를 45일째에 희생시키고 뇌 및 축추를 수거하고, 급속 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다. 조직을 저온유지장치(cryostat)(Leica)를 사용하여 동결절편화하고 절편을 RNA 및 단백질 분석을 위해 분해하였다. 단백질 분석을 위해, 동결절편을 칭량하고 상술한 바와 같은 집에서 만든 단백질 분해 완충액을 사용하여, 150 μl의 완충액/4.5 mg의 조직으로 분해하였다. 조직을 초음파처리하고 기술된 바와 같은 SOD1 발현에 대해 분석하였다. RNA 분석을 위한 동결절편을 MagMax 총 RNA 단리 키트(Life Technologies)와 함께 제공된 분해 완충액 속에서 분해하고 기술한 바와 같이 분석하였다.
SOD1 전사체 및 단백질 발현을 뇌 분해물 속에서 분석하였다. 전사체 분석을 상술함 바와 같이 RT-PCR을 사용하여 수행하고 단백질 분석을 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 사용하여 수행하였다. 결과는 도 11에 나타낸다. 도 11(a)는 SOD1 전사체의 RT-PCR 분석을 나타내고; 11(b)는 SOD1 및 β-투불린(로딩 대조군) 단백질 수준의 웨스턴 블롯을 나타내고; 11(c)는 β-투불린에 대해 표준화되고, 대조군 PMO 처리된 마우스와 비교한, SOD1 PMO 처리된 마우스에서 SOD1 단백질 수준의 밀도 측정 분석을 나타낸다.
저 수준의 SOD1 엑손 스키핑을 PMO 둘 다로 처리한 마우스에서 관찰하였다. 웨스턴 블롯은 SON 6 처리된 마우스에서 SOD1 단백질내 평균 33% 감소를 나타내었다. AON 8 처리된 마우스는 대조군 처리된 마우스와 비교하여 SOD1 단백질에서 통계적으로 유의적인 20% 감소를 나타내었다(p=0.04). 시험관내 및 생체내에서 PMO 효능의 차이는 사람 세포와 유전자이식 마우스 모델 사이에서 스플라이싱 세포기구(aplicing machinery) 차이에 기인하는 경향이 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Perron Institute for Neurological and Translational Science Limited <120> Treatment for SOD1 Associated Disease <130> 280776 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 guccauuacu uuccuuuaag aaaag 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 guccuuuaau gcuuccccac accuu 25 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 caggcuucag ucaguccuuu aa 22 <210> 4 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 acucaugaac auggaaucca ugcagg 26 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 acacccaccu gcuguauuau c 21 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 aacacccacc ugcuguauua ucucc 25 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uaaagugagg accugcacug gua 23 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 auccuuuggc ccaccguguu uucug 25 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 cauccuuugg cccaccgugu u 21 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 guuaccucuc uucauccuuu ggccc 25 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ccaacaugcc uaauaaugaa aaagc 25 <210> 12 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uuugucagca gucacauugc cca 23 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 caauagacac aucggccaca ccauc 25 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 ugaugcaaug gucuccugag agu 23 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 uccuuuuaug aaaacuuacc accag 25 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 ugaugaugcc cugcacuggg ccguc 25 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 cuugccuucu gcucgaaauu gauga 25 <210> 18 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ccaccugcug uauuaucucc aaacu 25 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uuggcccacc guguuuucug gauag 25 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 auuaggcaug uuggagacuu gggca 25 <210> 21 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 ugcugacaaa gauggugugg ccgau 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtccattact ttcctttaag aaaag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gtcctttaat gcttccccac acctt 25 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 caggcttcag tcagtccttt aa 22 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 actcatgaac atggaatcca tgcagg 26 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 acacccacct gctgtattat c 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 aacacccacc tgctgtatta tctcc 25 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 taaagtgagg acctgcactg gta 23 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atcctttggc ccaccgtgtt ttctg 25 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 catcctttgg cccaccgtgt t 21 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gttacctctc ttcatccttt ggccc 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ccaacatgcc taataatgaa aaagc 25 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tttgtcagca gtcacattgc cca 23 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 caatagacac atcggccaca ccatc 25 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tgatgcaatg gtctcctgag agt 23 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 tccttttatg aaaacttacc accag 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tgatgatgcc ctgcactggg ccgtc 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cttgccttct gctcgaaatt gatga 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccacctgctg tattatctcc aaact 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 ttggcccacc gtgttttctg gatag 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 attaggcatg ttggagactt gggca 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 tgctgacaaa gatggtgtgg ccgat 25 <210> 43 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 aacacccac 9 <210> 44 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 cugcuguauu aucucc 16 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 ctgctgtatt atctcc 16 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cgacgaaggc cgtgtgcgtg 20 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 agttaagggg cctcagacta ca 22

Claims (23)

  1. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 프레(pre)-mRNA을 암호화(encoding)하는 핵산 분자에 대해 표적화된 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)(AON)로서, AON이:
    a. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열, 또는
    b. b. 표적 RNA에 대해 충분한 서열 상보성(sequence complementarity)을 가져서 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하는 서열로서, 여기서 상기 서열이 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42가 또한 결합하는 표적 SOD1 프레-mRNA내 적어도 8개 이상의 연속 핵염기에 대해 상보성인 서열인 핵염기 서열을 가지고,
    c. 여기서 AON이 사람 SOD1의 발현을 억제하는, 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  2. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 프레-mRNA를 암호화하는 핵산 분자에 대해 표적화된 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 42를 포함하는 목록으로부터 선택되는 핵염기 서열을 갖고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 사람 SOD1의 발현을 억제하는 단리되거나 정제된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 엑손 스키핑을 통해 SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱(alternative splicing)을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 펩타이드-포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체(conjugate)인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 6, 8, 13, 27, 29 또는 34의 목록으로부터 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  7. SOD1 프레-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 방법으로서, 당해 방법이;
    a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 AON을 제공하는 단계; 및
    b) 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  8. SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩(misfolding)과 관련된 질환의 작용(effect)을 치료, 예방 또는 개선(ameliorating)시키기 위한 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물로서, 당해 조성물이:
    a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환이 ALS인 약제학적 조성물.
  10. ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제학적, 예방학적, 또는 치료학적 조성물로서, 이러한 조성물이:
    a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및
    b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물.
  11. SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 대상체(subject)에게 제1항 내지 제6항, 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 따른, 유효량의 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환이 ALS인 방법.
  13. ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 대상체에게 제1항 내지 제6항, 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 따른, 유효량의 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 바이오마커(biomarker)에 의해 확인된 환자 내에서 ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 대상체를 SOD1 억제에 대해 반응하는 경향이 있는 ALS 환자와 관련된 바이오마커의 존재에 대해 시험하는 단계; 및
    b) 대상체가 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제6항, 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 따른, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 안티센스올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  16. SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제되거나 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  17. SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제되거나 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환이 ALS인 용도.
  19. ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제되거나 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  20. ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제되거나 단리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
  21. 대상체에서 SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트(kit)로서, 이러한 키트가 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기(container) 속에 패키지된(packaged), 적어도 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
  22. 제21항에 있어서, SOD1 내의 돌연변이 또는 미스폴딩과 관련된 질환이 ALS인 키트.
  23. ALS의 작용을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트로서, 이러한 키트가 이의 사용을 위한 설명서와 함께, 적합한 용기 속에 패키징된, 적어도 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
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