KR20230076823A - 시신경 위축의 치료 - Google Patents

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잔야 그레이녹
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Abstract

개질된 백본 구조 및 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머와 적어도 75% 서열 동일성이 있는 서열을 갖는 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 mRNA 번역을 조절하기 위한 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머.

Description

시신경 위축의 치료
본 발명은 유전자 OPA1의 돌연변이에 의해 야기되는 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 안티센스 올리고머의 용도에 관한 것이다.
상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)은, 10,000명 중 1명 내지 50,000명 중 1명 꼴의 범위로 추정되는 질환 유병률의, 세계에서 가장 흔한 유전성 시신경병증이다. OPA1은 ADOA가 있는 대부분의 가족들에서 주요 원인이 되는 유전자이다.
ADOA는 이의 병리학적 특징의 정의로서 선택적인 망막 신경절 세포 손실과 함께, 고전적으로 유아기에 점진적인 시각 부전이 나타난다. 시각 부전의 발병의 평균 연령은 7세이며, 1세 내지 16세의 범위에 있다. 발병한 개체의 80%는 10세의 연령 전에 증상을 보인다. 사례의 20%까지에서, ADOA는 다른 임상적 징후, 가장 흔하게는 감각신경성 난청, 운동실조, 근육병 및 진행성 외안근 마비와 연관되어 있다. 이러한 증후군성 ADOA 변이체의 유의성은 이들 환자로부터의 골격근 생검에서 사이토크롬 c 산화효소(COX)-결손 근육 섬유 및 다중 mtDNA 결실의 식별에 의해 강조되었는데, 이는 미토콘드리아 DNA 유지에서의 OPA1의 역할을 암시한다.
OPA1은 염색체 3의 장완(3q28-q29) 상의 100kb의 게놈 DNA에 걸친 30개 엑손으로 이루어지며, 단백질 생산물은 내부 미토콘드리아 막에 공동-국부화된 960개 아미노산 폴리펩티드이다. OPA1은 기계 효소의 다이나민 슈퍼패밀리의 구성원에 의해 공유되는 매우 보존된 기능적 GTP아제 도메인을 함유하고 미토콘드리아 네트워크의 안정성을 포함하는 여러가지 중요한 세포 과정을 조절한다. 400개에 걸친 OPA1 돌연변이가 시신경 퇴화 및 시각 상실에 책임이 있는 것으로 보고되었으며 그 범위는 분리된 '우성 시신경 위축'(DOA; OMIM #165500)에서, 베어 증후군(Behr Syndrome (OMIM #210000))이 있는 일부 이중-대립유전자 사례를 포함하여, 'DOAplus'(OMIM #125250)로 명명된 보다 중증의 다중-전신성 증후군에까지 이른다.
OPA1은 미토콘드리아 기능에 없어서는 안될 편재적으로 발현되는 미토콘드리아 GTP아제이다. 인간에서, OPA1는 엑손 4, 4b 및 5b의 구별된 스플라이싱을 통해 적어도 8개 변이체를 생성한다. OPA1 전구체 단백질이 표적화되고 그들의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)에 의해 미토콘드리아로 동원된다. 미토콘드리아에서, OPA1 전구체 단백질은 내부 미토콘드리아 막에 고정된 긴 형태(l 형태)로, 또는 짧은, 가용성 형태(s 형태) 중 어느 하나로 절단된다.
완전한 OPA1 유전자의 코딩 서열은 5 kb 미만의 제한을 갖는 AAV 벡터의 능력을 넘어선다. 게다가, CRISPR/Cas9 유전자 교정은 각각의 가족의 OPA1 돌연변이에 대한 상이한 생성물을 필요로 할 것이다. 더욱이, 유전자 대체 및 유전자 편집 접근법 둘 다는 적절한 형질감염을 달성하기 위해 바이러스성 벡터의 망막하 주사를 필요로 한다. 이것은 망막 외상의 위험을 수반한다.
ADOA에 대한 새로운 치료 또는 예방 조치를 제공하거나, 또는 적어도 이전에 공지된 치료를 보완하는 방법의 제공에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 ADOA의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 개선되거나 대안적인 방법을 제공하고자 한다.
배경기술의 이전의 논의는 단지 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 의도이다. 논의는 임의의 언급된 자료가 출원의 우선일 당시에 일반 일반적인 지식이거나 그의 일부였다는 인정 또는 시인이 아니다.
본 발명은 기능적 OPA1 단백질 발현의 수준을 증가시키는 수단을 제공한다. 바람직하게는 증가된 기능적 OPA1은 ADOA를 갖는 환자, 보다 바람직하게는 OPA1 반가불충분성이 내포된 ADOA에서이다.
대략적으로, 본 발명의 일 양태에 따르면, OPA1 유전자 전사체의 5' UTR을 표적화하는 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제 및/또는 상류 개방형 판독 프레임의 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키는 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는, OPA1 단백질 또는 이의 일부의 증가된 생산을 유도하기 위한 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다.
본 발명의 일 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다. 본 발명의 또다른 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 엑손 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다.
본 발명의 양태에 따르면, 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키도록 설계된 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다.
바람직하게는, 안티센스 올리고머는 표 1에 제시된 서열 및 이의 조합물 또는 칵테일(cocktail)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
보다 특이적으로, 안티센스 올리고머는 서열번호 1-60 중 임의의 하나 이상; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57, 및 이들의 조합물 또는 칵테일을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
OPA1 유전자 전사체의 번역을 조작하기 위한 방법이 또한 제공되며, 방법은:
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머를 제공하는 단계 및 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
환자에서 OPA1 발현과 관련된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 약제학적, 예방적, 또는 치료적 조성물이 또한 제공되며, 조성물은:
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머 및
b) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
바람직하게는 OPA1 발현과 연관된 질환은 기능적 OPA1 단백질 발현의 감소된 수준과 연관되어 있다. 바람직하게는 감소된 기능적 OPA1은 ADOA를 갖는 환자, 보다 바람직하게는 OPA1 반가불충분성이 내포된 ADOA에서이다.
OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법이 또한 제공되며, 방법은:
a) 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하는 의약(medicament)의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 정제된 및 단리된 안티센스 올리고머의 용도가 또한 제공된다.
환자에서 OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 키트가 또한 제공되며, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 안티센스 올리고머 및 이의 조합물 또는 칵테일을 포함하고 적합한 용기에 이의 사용을 위한 설명서와 함께 패키징된다.
바람직하게는 환자에서 OPA1 발현과 연관된 질환은 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)이다. OPA1 발현과 연관된 질환이 있는 대상체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
이제 본 발명의 추가의 양태가 첨부된 비-제한적인 실시예 및 도면을 참조하여 기재될 것이다.
본 발명의 추가의 특징이 다음의 상세한 설명의 이의 여러 가지 비-제한적인 실시예에서 보다 완전히 기재된다. 이 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함된다. 상기에서 제시된 바와 같이 본 발명의 광범위한 요약, 개시내용 또는 상세한 설명에 대한 제한으로 이해되어서는 안된다. 상세한 설명은 다음의 첨부된 도면을 참조하여 이루어질 것이다:
도 1은 OPA1 5' UTR 및 상류 개방 판독 프레임(uORF)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 개략도이다.
도 2는 HEK293 세포에서 2'-O-메톡시에틸-(2'-MOE) ASO(5 및 20 nM)의 스크리닝을 나타낸다. HEK293 세포를 나타낸 바와 같이 OPA1 5' UTR을 표적화하는 2'-MOE ASO로 48시간동안 형질감염시켰다. 엑손 7x 스키핑(skipping)을 유도하는 양성 대조군 ASO가 비교를 위해 포함되었다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 OPA1 단백질 발현 및 로딩 대조군으로서 베타-액틴을 나타낸다(a, c). OPA1 발현의 밴드 강도는 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1 발현은 1로 설정하였다(b, c).
도 3은 HEK293 세포에서 PMO(50 및 100 μM)의 스크리닝을 나타낸다. HEK293 세포를 나타낸 바와 같이 OPA1 5' UTR을 표적화하는 PMO로 48시간동안 형질감염시켰다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 OPA1 단백질 발현 및 로딩 대조군으로서 베타-액틴을 나타낸다(a, c). OPA1 발현의 밴드 강도는 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1 발현은 1로 설정하였다(b, d).
도 4는 ADOA 환자 섬유아세포에서 PMO(50 및 100 μM)의 스크리닝을 나타낸다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 24시간(a) 및 48시간(b)에서 OPA1 5' UTR을 표적화하는 PMO로 형질감염된 환자 섬유아세포에서의 OPA1 발현을 나타낸다. OPA1 발현의 밴드 강도는 24시간(b) 및 48시간(d)에 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1의 발현은 1로 설정하였다(b,d).
도 5는 ADOA 환자 섬유아세포에서의 PMO(50 및 100 μM)의 스크리닝을 나타낸다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 48시간(a)에서 OPA1 5' UTR을 표적화하는 PMO로 형질감염된 환자 섬유아세포에서의 OPA1 발현을 나타낸다. 바아(Bar) 그래프는 OPA1 단백질 발현의 평균 ±SEM을 의미한다(n=1-8회 독립적인 실험). OPA1 발현의 밴드 강도는 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1의 발현은 1로 설정하였다(b).
도 6은 ADOA 환자 섬유아세포에서 의도적인 불일치를 포함하는 H1A(+10+32)에 인접한 마이크로워크드(microwalked) PMO(25 및 50 μM)의 스크리닝을 나타낸다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 48시간(a)에서 OPA1 5' UTR을 표적화하는 PMO로 형질감염된 환자 섬유아세포에서의 OPA1 발현을 나타낸다. 바아 그래프는 OPA1 단백질 발현의 평균 ±SEM을 의미한다(n=2회 독립적인 실험). OPA1 발현의 밴드 강도는 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1의 발현은 1로 설정하였다(b)
도 7은 ADOA 환자 섬유아세포에서 의도적인 불일치를 포함하는 H1A(+44+67)에 인접한 마이크로워크드 PMO(25 및 50 μM)의 스크리닝을 나타낸다. 웨스턴블롯 겔 이미지는 48시간(a)에서 OPA1 5' UTR을 표적화하는 PMO로 형질감염된 환자 섬유아세포에서의 OPA1 발현을 나타낸다. 바아 그래프는 OPA1 단백질 발현의 평균 ±SEM을 의미한다(n=1회 독립적인 실험). OPA1 발현의 밴드 강도는 베타 액틴으로 정규화하였다(imageJ™에 의해 평가됨). 비처리된 세포에서의 OPA1의 발현은 1로 설정하였다(b)
도 8은 PPMO H1A(+10+32)를 이용한 처리 다음에 ADOA 환자 섬유아세포에서의 OPA1 단백질의 상향조절을 나타낸다.
도 9는 PPMO H1A(+10+32)를 이용한 처리 다음에 4명의 상이한 ADOA 환자로부터의 섬유아세포에서의 증가된 미토콘드리아 ATP 수준을 나타낸다.
도 10은 PPMO H1A(+10+32)를 이용한 처리 다음에 3명의 상이한 ADOA 환자로부터의 섬유아세포에서의 상대적 아폽토시스 수준의 감소를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
안티센스 올리고뉴클레오티드
ADOA는 망막 신경절 세포의 퇴화를 특징으로 하고, 사례의 적어도 75%가 OPA1 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. OPA1는 편재적으로 발현되며 망막에서 가장 풍부하다. OPA1 단백질은 미토콘드리아 구조, 기능 및 아폽토시스의 제어에서 중요한 역할을 수행하는 미토콘드리아 GTP아제이다.
망막 신경절 세포에서의 미토콘드리아의 독특한 분포는 망막 신경절 세포에서의 이 네트워크의 중요한 기능을 가리키며 OPA1 상실에 대한 이들 세포의 민감도의 기초가 될 수 있다(이들 세포의 광-산화 스트레스에의 노출에 의해 또한 잠재적으로 촉진됨). 대다수의 OPA1 돌연변이(~27% 미스센스, 27% 스플라이스 변이체, 23.5% 구조이동, 16.5% 넌센스, 6% 결실 또는 복제)는 mRNA 붕괴에 의한 전사체의 퇴화로 이어지며, 이는 반가불충분성이 ADOA 병인의 기초가 되는 주요 메커니즘이라는 가설을 뒷받침한다. 반가불충분성으로 이어지는 OPA1 돌연변이는 결함이 있는 복합체 I-구동 ATP 합성을 포함하는 손상된 미토콘드리아 기능을 야기한다. ATP는 세포에서 주된 에너지 화폐이므로, 불충분한 ATP는 궁극적으로 세포 기능장애 및 사망으로 이어진다.
OPA1 반가불충분성은 ADOA의 유의한 비율을 차지한다. ADOA를 야기하는 OPA1 반가불충분성은 야생형 OPA1을 상향조절함으로써 치료할 수 있다.
5' 비번역 영역(5' UTR)은 정규(canonical) 시작 코돈으로부터 바로 상류에 위치한 mRNA의 영역이다. 정규 시작 코돈은 단백질을 코딩하는 mRNA의 부분인 주요 코딩 서열(CDS)의 시작을 정의한다. 5' UTR은, 이것이 mRNA에 대한 리보좀 모집 및 시작 코돈 선택을 결정함에 있어 중요한 기능을 가지기 때문에 번역 효율성의 제어에서 주된 역할을 한다. 상류 개방 판독 프레임(uORF)은, CDS가 있는 프레임을 벗어난 프레임-내 정지가 있는 5' UTR에 시작 코돈(비-정규 시작 코돈)을 갖는 mRNA요소이다. uORF는 인간 전사체의 대략 반절에 존재하며 하류 개방 판독 프레임의 유의적으로 감소된 단백질 발현과 상관관계가 있다.
본 발명은 기능적 OPA1 발현의 수준을 증가시키는 수단을 제공한다. 바람직하게는 증가된 기능적 OPA1은 ADOA를 갖는 환자, 보다 바람직하게는 OPA1 반가불충분성이 내포된 ADOA에서이다.
임의의 이론에 얽매이지 않고, uORF 및 5' UTR 내의 번역 억제성 요소에 결합하는 안티센스 올리고머를 사용함으로써, 기능적 OPA1 단백질의 수준이 증가될 수 있다고 여겨진다. uORF 및 5' UTR 내의 번역 억제성 요소에 결합하고 이를 차단 또는 변경시키는 ASO의 사용은 프레임 밖의 주요 코딩 서열의 번역을 감소시키고 정규 시작 코돈으로부터 시작하는 프레임-내 코딩 서열의 번역을 증가시킨다. 유전자의 uORF 및 5' UTR 내의 번역 억제성 요소를 표적화함으로써 단백질 수준을 선택적으로 증가시키는 ASO의 능력은 질환으로 이어지는 OPA1 유전자에서의 임의의 돌연변이에 적용가능한 돌연변이 애그노스틱 전략(agnostic strategy)을 통해 OPA1 단백질 발현을 야생형 수준으로 회복시키는 수단을 제공한다.
본 발명에서, 안티센스 올리고머는 안티센스 올리고뉴클레오티드, ASO, AON 및 AON으로 또한 공지되어 있다-용어는 상효교환가능하다.
대략적으로, 본 발명의 일 양태에 따르면, OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 또는 이의 일부를 표적화하는 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제 및/또는 상류 개방형 판독 프레임의 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키는 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는, OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 증가된 생산을 유도하기 위한 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 일 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다. 본 발명의 또다른 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 엑손 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다.
그러므로 본 발명은 OPA1 유전자 전사체의 비정상적 번역의 개시를 방해하거나, 또는 대안적으로, 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제를 통해, 바람직하게는 OPA1 유전자 전사체의 정규 시작 코돈에서의 번역 시작을 증가시키고 이에 따라 기능적 OPA1 단백질의 수준을 증가시키기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
대략적으로, 본 발명의 일 양태에 따르면, OPA1 유전자 전사체의 uORF 또는 이의 일부에 혼성화되고 비-정규 시작 부위로부터의 OPA1 유전자 전사체의 번역의 개시를 방해하도록 설계된 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)는 5' UTR 2차 구조를 입체적으로 억제하고 uORF의 선택을 억제하기 위해 5' UTR을 표적화하도록 설계되었다. 이러한 파괴는 바람직하게는 정규 시작 부위로부터의 OPA1 유전자 전사체의 번역을 증가시킴으로써 기능적 OPA1 단백질 발현을 조절할 것이다. 비-정규 시작 부위로부터의 번역이 보다 더 기능장애 단백질로 이어지거나 또는 번역되지 않을 가능성이 있고, 정규 시작 부위로부터의 번역이 보다 더 기능적 단백질로 이어질 가능성이 있으므로, 본 발명은 비-정규 시작 부위로부터 OPA1 유전자 전사체의 번역의 개시를 감소시키고/시키거나 정규 개시 부위로부터 OPA1 유전자 전사체의 번역을 증가시키고자 한다. 이들 결과의 각각 또는 둘 다는 OPA1 단백질의 생산을 증가시킬 것이다. 증가된 OPA1 단백질 생산은 OPA1 발현과 연관된 질환(특히 ADOA)을 치료하는 데에 도움이 될 수 있다.
대략적으로, 본 발명의 또다른 양태에 따르면, 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키도록 설계된 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머가 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 일 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 uORF 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다. 본 발명의 또다른 양태에서, OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 또는 이의 일부의 근처 또는 이내의 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 제공된다.
안티센스 올리고머는 표 1로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머는: 서열번호 1-60; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
바람직하게는 본 발명의 안티센스 올리고머는:
i. OPA1 유전자 전사체의 5' UTR에 혼성화되고 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 비정상적 번역의 개시를 방해하도록; 및/또는
ii. 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키도록 작용한다.
바람직하게는 본 발명의 안티센스 올리고머는:
i. OPA1 돌연변이가 있는 환자의 세포에서 미토콘드리아 ATP 수준을 증가시키도록; 및/또는
ii. 아폽토시스를 감소시키도록
작용한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 안티센스 올리고머는 OPA1 유전자 전사체의 하나 이상의 uORF 또는 이의 일부를 표적화하도록 작용할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고머는 OPA1 유전자 전사체의 uORF에서의 비-정규 시작 코돈을 건너뛸 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 안티센스 올리고머는 OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 영역 또는 이의 일부를 표적화하도록 작용할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고머는 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키기 위해 개선된 리보솜 접근을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머는, 엄격한 혼성화 조건 하에서 이러한 서열에 혼성화될 수 있는 서열, 이에 상보적인 서열, 개질된 염기, 개질된 백본을 함유하는 서열, 및 유전자 전사체에서 번역 활성을 보유하거나 조절하는 이들의 기능적 절단 또는 확장을 포함할 수 있다 특정한 구현예에서, 안티센스 올리고머는 표적 서열에 대해 100% 상보적일 수 있거나, 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 세포 뉴클레아제의 작용 및 생체내에서 일어날 수 있는 기타 방식의 분해를 견뎌내기에 충분히 안정적인 한, 예를 들어, 변이체를 수용하기 위해 미스매치를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이에 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 2개 이상의 이러한 안티센스 올리고머를 포함하는 작제물을 포함하여, 기능적 OPA1 단백질의 증가된 번역을 유도하는 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 안티센스 올리고머의 조합물로 연장된다. 작제물은 안티센스 올리고머-기반 요법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은, 이의 계속해서 추가의 양태에 따르면, 본 발명의 안티센스 올리고머 서열의 cDNA 또는 클로닝된 사본, 뿐만 아니라 본 발명의 안티센스 올리고머 서열을 함유하는 벡터로 연장된다. 본 발명은 추가로 또한 이러한 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 연장된다.
"단리된"은 이의 본래 상태에서 정상적으로 수반하는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, "단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 올리고뉴클레오티드"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 자연 발생적인 상태에서 이의 측면에 배치된 서열로부터 정제되거나 제거된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 게놈 내의 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭할 수 있다. 용어 "단리하는"은 이것이 세포와 관련될 때 공급원 대상체(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 반복 질환이 있는 대상체)로부터의 세포(예를 들어, 섬유아세포, 림프아세포)의 정제를 지칭한다. mRNA 또는 단백질의 맥락에서, "단리하는"은 공급원, 예를 들어, 세포로부터의 mRNA 또는 단백질의 회수를 지칭한다.
안티센스 올리고머는 이것이 혼성화하는 표적 서열로 "지시된다" 또는 "이에 표적화된다"라고 말할 수 있다. 특정한 구현예에서, 표적 서열은 uORF, mRNA의 5' UTR, 또는 번역의 조절에 수반되는 기타 서열을 포함하는 영역을 포함한다. 표적 서열은 하나 이상의 uORF 내에 또는 uORF/5' UTR 영역의 바깥에 또는 uORF 접합부에 걸쳐 있을 수 있다.
특정한 구현예에서, 안티센스 올리고머는 표적 RNA(즉, 번역이 조절되는 RNA)에 충분한 서열 상보성을 가져 효과적인 방식으로 표적 RNA(예를 들어, mRNA)의 영역을 차단한다. 예시적인 구현예에서, OPA1 전사체에서 하나 이상의 uORF를 함유할 수 있는 5' UTR에 대한 그러한 결합.
표적 RNA의 일부에 결합하는 표적 RNA 서열에 대해 충분한 서열 상보성을 갖는 안티센스 올리고머는 안티센스 올리고머가 표적화된 RNA의 3-차 구조를 변경하기에 충분한 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
선택된 안티센스 올리고머는 보다 짧게, 예를 들어 약 12개 염기로, 또는 보다 길게, 예를 들어 50개 염기로 만들어질 수 있고, 서열이 표적 서열과의 혼성화 시에 번역 조절을 달성하도록 충분하게 상보적인 한, 작은 수의 미스매치를 포함하며, 임의로 RNA와 45℃ 이상의 Tm을 갖는 헤테로듀플렉스를 형성한다.
바람직하게는, 안티센스 올리고머는 표 1에 제시된 서열을 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머는 서열번호 1-60에서의 서열; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57을 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정한 구현예에서, 표적 서열과 안티센스 올리고머 사이의 상보성의 정도는 안정한 듀플렉스를 형성하기에 충분하다. 안티센스 올리고머의 표적 RNA 서열과의 상보성의 영역은 8-11개 염기만큼 짧을 수 있지만, 12-15개 이상 염기, 예를 들어, 이들 범위 사이에 있는 모든 정수를 포함하여, 10-50개 염기, 10-40개 염기, 12-30개 염기, 12-25개 염기, 15-25개 염기, 12-20개 염기, 또는 15-20개 염기일 수 있다. 약 16-17개 염기의 안티센스 올리고머는 일반적으로 독특한 상보적 서열을 갖기에 충분히 길다. 특정한 구현예에서, 상보적 염기의 최소 길이가, 본원에서 논의되는 바와 같이, 필수 결합 Tm을 달성하기 위해 필요할 수 있다.
특정한 구현예에서, 50개 염기만큼 긴 올리고뉴클레오티드가 적합할 수 있으며, 여기서 적어도 염기의 최소 개수, 예를 들어, 10-12개 염기가 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 일반적으로, 세포에서 촉진되거나 능동적인 흡수는 약 30개 염기 미만의 올리고뉴클레오티드 길이에서 최적화된다. 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 안티센스 올리고머의 경우, 결합 안정성 및 흡수의 최적 균형은 18-25개 염기의 길이에서 일반적으로 발생한다. 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기로 이루어지는 안티센스 올리고머(예를 들어, CPP-PMO, PPMO, PMO, PMO-X, PNA, LNA, 2'-OMe, 2'MOE, 2'F 올리고머, 티오모르폴리노 및 기타 혼성화 올리고머 화학작용)가 포함된다. PMO - 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머; CPP - 세포 침투 펩티드; PPMO - 펩티드-접합된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머; PNA - 펩티드 핵산; LNA - 락킹(locking)된 핵산; 2'-OMe - 2'O-메틸-개질된 올리고머; 2'MOE - 2'-O-메톡시 에틸 올리고머, 2'F - 2' 플루오로)
특정한 구현예에서, 안티센스 올리고머는 표적 서열에 대해 100% 상보적일 수 있거나, 또는, 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 세포 뉴클레아제의 작용 및 생체내에서 일어날 수 있는 기타 방식의 분해를 견뎌내기에 충분히 안정적인 한, 예를 들어, 변이체를 수용하기 위해 미스매치를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 표적 서열 사이에 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
존재하는 경우에, 미스매치는 전형적으로 중앙보다는 혼성화 듀플렉스의 말단 영역을 향해 덜 불안정하다. 허용되는 미스매치의 수는, 듀플렉스 안정성의 널리 이해되는 원칙에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 길이, 듀플렉스 내의 G:C 염기 쌍의 백분율, 및 듀플랙스 내의 미스매치(들)의 위치에 의존적일 것이다. 이러한 안티센스 올리고머는 표적 서열에 필수적으로 100% 상보적이지 않지만, mRNA 번역의 효율성을 개선하도록 표적 서열에 안정하게 및 특이적으로 결합하기에 효과적이다.
안티센스 올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소적 절단에의 듀플렉스의 민감성의 함수이다. 상보적-서열 RNA에 관하여 올리고뉴클레오티드의 Tm은 통상적인 방법, 예컨대 Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108에 기재된 것에 의해 또는 Miyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligonucleotide Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 특정한 구현예에서, 안티센스 올리고머는, 상보적-서열 RNA에 관하여, 체온보다 높은, 및 바람직하게는 약 45℃ 또는 50℃ 초과의 결합 Tm을 가질 수 있다. 60-80℃ 이상의 범위 내의 Tm이 또한 포함된다.
변이체의 추가적인 예는 표 1에 제공되는 서열 중 임의의 것, 또는 서열번호 1-60 중 임의의 것; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57의 전체 길이에 걸쳐 약 또는 적어도 약 70% 서열 동일성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 안티센스 올리고머를 포함한다.
보다 특이적으로, OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부에서 mRNA 번역의 효율을 개선하기 위한 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 안티센스 올리고머가 제공된다. 안티센스 올리고머는 바람직하게는 표 1에 제공된 것들 또는 서열번호 1-60; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57로부터 선택된다.
mRNA 번역의 수정은 바람직하게는 OPA1 유전자 전사체에의 리보솜 접근을 가능하게 하거나 변경하여 표준 시작 코돈에의 우선적인 리보솜 결합을 가능하게 한다.
안티센스 올리고머를 사용한 본 발명의 mRNA 번역의 수정은 uORF 및/또는 5' UTR 영역의 하나의 일부에의 리보솜 접근을 변경할 수 있거나 한 번에 uORF 및/또는 5’ UTR 영역의 2가지 이상의 일부에의 리보솜 접근을 변경할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머는 OPA1 유전자 전사체의 변경된 번역을 유도하도록 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 안티센스 올리고머의 조합물일 수 있다. 조합물은 2개 이상의 안티센스 올리고머의 칵테일 및/또는 함께 이어진 2개 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 작제물일 수 있다.
[표 1] 본 연구에서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열의 목록. PMO-유도된 OPA1 상향조절의 효율 점수; 1; 1.1-배 초과 OPA1 상향조절, 0; OPA1 상향조절 없음, -1; OPA1 하향조절
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
OPA1 유전자 전사체의 번역을 조절하기 위한 방법이 또한 제공되며, 방법은:
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머를 제공하는 단계 및 올리고머(들)이 표적 핵산 부위에 결합하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 여전히 또다른 양태에 따르면, 표 1 또는 서열번호 1-60; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30, 및 57, 및 이에 대해 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열의 DNA 등가물을 포함하는 OPA1에 대한 표적 핵산 서열의 번역 조작이 제공된다.
콘센서스(consensus) uORF 조절 요소를 완전히 차폐하도록 안티센스 올리고머를 설계하는 것은 표적화된 유전자 전사체의 번역에서 필연적으로 변화를 생성하지는 않을 수 있다. 더욱이, 본 발명자들은 안티센스 올리고머 크기 또는 길이 그 자체가 안티센스 올리고머를 설계할 때 항상 주요한 요인은 아니라는 사실을 발견하였다. 일부 표적과 함께, 20개 염기만큼 짧은 안티센스 올리고머는 번역에서 약간의 변화를 유도할 수 있었으며, 특정한 사례에서는 같은 조절 요소로 지시된 다른 보다 긴(예를 들어 25개 염기) 올리고머보다 더 효율적이었다.
본 발명자들은 번역을 재지정하기 위해 안티센스 올리고머에 의해 차단 또는 차폐될 수 있는 어떤 표준 모티프가 있는 것으로 나타나지 않는다는 사실을 또한 발견하였다. 안티센스 올리고머가 설계되어야만 하고, 그들의 개별적인 효능이 실증적으로 평가되어야 한다는 사실이 발견되었다.
보다 특이적으로, 안티센스 올리고머는 표 1에 제시된 것들로부터 선택될 수 있다. 서열은 바람직하게는 서열번호 1-60 중 임의의 하나 이상; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57, 및 이들의 조합물 또는 칵테일로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 이것은 엄격한 혼성화 조건 하에서 이러한 서열에 혼성화될 수 있는 서열, 이에 상보적인 서열, 개질된 염기, 개질된 백본을 함유하는 서열, 및 OPA1 유전자 전사체에서 mRNA 번역 활성을 보유하거나 조절하는 이들의 기능적 절단 또는 확장을 포함한다.
올리고머 및 DNA, cDNA 또는 RNA는, 각각의 분자에서 상응하는 위치의 충분한 수가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 차지되어 있을 때 서로 상보적이다. 이에 따라, "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보적인"은 상보성의 충분한 정도 또는 올리고머와 DNA, cDNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 쌍을 나타내기 위해 사용되는 용어이다. 안티센스 올리고머의 서열은 이의 표적 서열의 것과 특이적으로 혼성화할 수 있기 위해서 100% 상보적일 필요는 없다는 사실이 당해 분야에서 이해된다. 안티센스 올리고머는 표적 DNA 또는 RNA 분자에의 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA 생산물의 정상적인 기능을 방해할 때 특이적으로 혼성화가능하며, 특정한 결합이 바람직한 조건 하, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 치료의 사례에서의, 및 시험관내 검정의 사례에서의 생리적 조건 하에서, 검정이 수행되는 조건 하에서, 안티센스 올리고머의 비-표적 서열에의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다.
선택적인 혼성화는 낮은, 중간 또는 높은 엄격도 조건 하에 있을 수 있지만, 바람직하게는 높은 엄격도 하에 있다. 당업자는 혼성화의 엄격함이 염기 조성, 상보적 가닥의 길이 및 혼성화 핵산 사이의 뉴클레오티드 염기 미스매치의 수에 더하여, 염 농도, 온도, 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향을 받을 것임을 인지할 것이다. 엄격한 온도 조건은 30℃ 초과, 전형적으로 37℃ 초과, 및 바람직하게는 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃, 및 전형적으로 60℃ 내지 80℃ 이상의 온도를 일반적으로 포함할 것이다. 엄격한 염 조건은 보통 1000 mM 미만, 전형적으로는 500 mM 미만, 및 바람직하게는 200 mM 미만일 것이다. 그러나, 매개변수의 조합은 임의의 단일 매개변수의 수치보다 훨씬 더 중요하다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 65℃ 및 0.1 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산나트륨 pH 7.0임). 이에 따라, 본 발명의 안티센스 올리고머는 표 1에 제공된 서열 또는 서열번호 1-60; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57에 선택적으로 혼성화되는 올리고머를 포함할 수 있다.
전형적으로, 선택적인 혼성화는 적어도 약 14개 뉴클레오티드의 범위에 걸쳐 적어도 약 55% 동일성, 바람직하게는 안티센스 올리고머의 뉴클레오티드와 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성이 있을 때 발생할 것이다. 기재된 바와 같이, 동일성 비교의 길이는 보다 더 긴 범위에 걸칠 수 있으며 특정한 구현예에서 적어도 약 9개 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 12개 뉴클레오티드, 보다 대개 적어도 약 20개, 종종 적어도 약 21, 22, 23, 또는 24개 뉴클레오티드, 적어도 약 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드, 적어도 약 29, 30, 31 또는 32개 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 이상 뉴클레오티드의 범위에 종종 걸칠 것이다.
이에 따라, 본 발명의 안티센스 올리고머 서열은 바람직하게는 본원에 나열된 서열에서 나타난 서열에 대해 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 86, 87, 88, 89 또는 90% 상동성을 갖는다. 보다 바람직하게는 적어도 91, 92, 93 94, 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96, 97, 98% 또는 99% 동일성이 있다. 일반적으로, 안티센스 올리고머의 길이가 더 짧을수록, 선택적인 혼성화를 수득하기 위해 필요로 하는 동일성은 더 커진다. 결과적으로, 본 발명의 안티센스 올리고머가 약 30개 미만의 뉴클레오티드로 이루어지는 경우에, 백분율 동일성은 본원에 나열된 서열에 제시된 안티센스 올리고머와 비교하여 75% 초과, 바람직하게는 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96, 97, 98% 또는 99% 초과인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 동일성 비교는 서열 비교 프로그램, 예컨대 GCG 위스콘슨 베스핏 프로그램(Wisconsin Bestfit program) 또는 GAP(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)에 의해 수행될 수 있다. 이 방식으로 본원에 인용된 것과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열이 정렬에의 갭의 삽입에 의해 비교될 수 있으며, 이러한 갭은 예를 들어, GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
본 발명의 안티센스 올리고머는 감소된 동일성의 영역, 및 표적 서열과의 정확한 동일성 영역을 가질 수 있다. 올리고머가 그의 전체 길이에 대해 정확한 동일성을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 올리고머는 표적 서열과 동일한 적어도 4개 또는 5개 염기의 계속된 범위, 바람직하게는 표적 서열과 동일한 적어도 6개 또는 7개 염기의 계속된 범위, 보다 바람직하게는 표적 서열과 동일한 적어도 8개 또는 9개 염기의 계속된 범위를 가질 수 있다. 올리고머는 표적 서열과 동일한 적어도 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개 염기의 범위를 가질 수 있다. 올리고머 서열의 나머지 범위는 표적 서열과 간헐적으로 동일할 수 있다; 예를 들어, 나머지 서열은 동일 염기, 뒤이은 비-동일한 염기, 뒤이은 동일한 염기를 가질 수 있다. 대안적으로(또는 뿐만 아니라) 올리고머 서열은 완전한 동일성보다 적은 범위로 산재된 동일한 서열의 여러가지 범위(예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기)를 가질 수 있다. 이러한 서열 미스매치는 번역 조절 활성을 갖지 않거나 번역 조절 활성의 매우 적은 손실만을 가질 것이다. 심지어 보다 바람직하게는, 이러한 서열 미스매치는 증가된 번역 조절 활성을 가질 것이다.
용어 "조절하다" 또는 "조절하다"는 하나 이상의 정량화가 가능한 매개변수를, 임의로 정의된 및/또는 통계학적으로 유의한 양만큼 "증가시키는 것" 또는 "감소시키는 것"을 포함한다. 용어 "증가하다" 또는 "증가하는", "강화하다" 또는 "강화하는" 또는 "자극하다" 또는 "자극하는" 또는 "늘리다" 또는 "늘리는"은 세포 또는 대상체에서 안티센스 올리고머 없이 또는 대조군 화합물에 의해 야기되는 반응에 비해 보다 큰 생리적 반응(즉, 다운스트림 영향)을 생산하거나 야기하는 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는 조성물의 능력을 일반적으로 지칭한다. 용어 "감소하다" 또는 "감소하는"은 세포 또는 대상체에서 안티센스 올리고머 없이 또는 대조군 화합물에 의해 야기되는 반응에 비해 감소된 생리적 반응(즉, 다운스트림 효과)을 생산하거나 야기하는 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는 조성물의 능력을 일반적으로 지칭한다.
관련있는 생리적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)는 당업자에게 명백할 것이며 세포, 조직, 또는 기능적 OPA1 단백질의 발현의 증가가 필요한 대상체에서의 기능적 OPA1 단백질의 발현의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "늘어난" 양은 통계적으로 유의한 양일 수 있으며, 안티센스 올리고머가 존재하지 않거나(제제의 부재) 또는 대조군 화합물이 사용될 때 생성된 양보다 많은, 1.1배, 1.2배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 이상(예를 들어, 500배, 100배)(1 사이의 및 1 위의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8을 포함하여)인 증가를 포함할 수 있다.
용어 "감소하다" 또는 "억제하다"는 진단 분야에서 통상적인 기술에 따라 측정된 바와 같이, 관련있는 생리적 또는 세포 반응, 예컨대 본원에 기재된 질환의 증상을 "감소시키기" 위한 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는 조성물의 능력과 일반적으로 관련될 수 있다. 관련있는 생리적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)는 당업자에게 명백할 것이며, 질환, 예컨대 ADOA의 증상 또는 병리의 감소를 포함할 것이다.
반응의 "감소"는 안티센스 올리고머 없이 또는 대조군 조성물에 의해 생산된 반응과 비교하여 통계적으로 유의할 수 있으며, 이 사이의 모든 정수를 포함하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고머의 길이는, 이것이 mRNA 분자 내의 의도된 위치에 선택적으로 결합할 수 있는 한 다를 수 있다. 이러한 서열의 길이는 본원에 기재된 선택 절차에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 안티센스 올리고머는 길이가 약 10개 뉴클레오티드에서, 길이가 약 50개 뉴클레오티드까지일 것이다. 그러나, 이 범위 내의 임의의 길이의 뉴클레오티드가 방법에서 사용될 수 있음이 인식될 것이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머의 길이는 길이가 10개 내지 40개, 10개 내지 35개, 15개 내지 30개 뉴클레오티드 또는 길이가 20개 내지 30개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 길이가 약 25개 내지 30개 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 올리고머는 길이가 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵염기가 왓슨-크릭 염기 쌍에 의해 RNA에서 표적 서열에 혼성화하도록 하는 "안티센스 올리고머"는 표적 서열 내에서 올리고뉴클레오티드:RNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 뉴클레오티드의 선형의 서열, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 용어 "안티센스 올리고머", "안티센스 올리고뉴클레오티드", "올리고머" 및 "안티센스 화합물"은 올리고뉴클레오티드를 지칭하도록 상호교환적으로 사용될 수 있다. 환형 서브유닛(subunit)은 리보스 또는 또다른 펜토스 당 또는, 특정 구현예에서, 모르폴리노 그룹(하기의 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 상세한 설명을 참조)에 기반할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다른 안티센스 제제 중에서도, 펩티드 핵산(PNA), 락킹된 핵산(LNA), 및 2'-O-메틸올리고뉴클레오티드 또한 고려된다.
(i) 개질된 백본 구조, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 올리고- 및 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 표준 포스포디에스테르 연결 이외의 백본, 및/또는 (ii) 개질된 당 모이어티, 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티보다 모르폴리노 모이어티를 갖는 안티센스 올리고머 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하여, 비-자연적으로 발생하는 올리고머, 또는 "올리고뉴클레오티드 유사체"가 포함된다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 표준 폴리뉴클레오티드 염기에의 왓슨-크릭 쌍에 의해 수소 결합을 할 수 있는 염기를 뒷받침하며, 여기서 유사체 백본은 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA) 내의 염기 사이에 서열-특이적 방식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 바람직한 유사체는 실질적으로 비하전된, 인 함유 백본을 갖는 것들이다.
안티센스 올리고머를 생산하기 위한 하나의 방법은 2' 히드록시리보스 위치의 메틸화이며 포스포로티오에이트 백본의 혼입은 표면적으로는 RNA와 유사하지만 뉴클레아제 분해에 보다 더 저항성인 분자를 생산하지만, 본 발명의 기술 분야의 당업자는 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 적합한 백본의 다른 형태를 알 것이다.
안티센스 올리고머와의 듀플렉스 형성 동안 프리-mRNA 및/또는 mRNA의 분해를 피하기 위해, 방법에서 사용되는 안티센스 올리고머는 내인성 RN아제 H에 의한 절단을 최소화하거나 예방하도록 조정될 수 있다. 이 특성은, 비메틸화된 올리고머와의 RNA 처리는 세포내 또는 Rn아제 H를 함유하는 조 추출물에서, 프리-mRNA:안티센스 및/또는 mRNA:안티센스 올리고머 듀플렉스의 분해로 이어지므로 매우 바람직하다. 이러한 분해를 우회하거나 유도하지 않을 수 있는 개질된 안티센스 올리고머의 임의의 형태가 본 방법에서 사용될 수 있다. 뉴클레아제 저항성은 본 발명의 안티센스 올리고머가 부분적으로 불포화된 지방족 탄화수소 사슬, 및 카복실 그룹, 에스테르 그룹, 및 알코올 그룹을 포함하는 하나 이상의 극성 또는 하전된 그룹을 포함하도록 본 발명의 안티센스 올리고머를 개질함으로써 달성될 수 있다.
RN아제 H를 활성화하지 않는 안티센스 올리고머는 공지된 기술에 따라 만들어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 5,149,797 참조). 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열일 수 있는 이러한 안티센스 올리고머는 RN아제 H의 이의 하나의 구성원으로서 올리고머를 함유하는 듀플렉스 분자에의 결합을 입체적으로 저해하거나 예방하는 임의의 구조적 개질을 단순히 함유하며, 이 구조적 개질은 듀플렉스 형성을 실질적으로 저해하거나 방해하지 않는다. 듀플렉스 형성에 관여하는 올리고머의 부분은 이에 대한 RN아제 H 결합에 관여하는 부분과 실질적으로 상이하기 때문에, RN아제 H를 활성화하지 않는 수많은 안티센스 올리고머가 이용가능하다. 예를 들어, 이러한 안티센스 올리고머는, 적어도 하나, 또는 모든 뉴클레오티드-간 브릿징(bridging) 포스페이트 잔기가 개질된 포스페이트, 예컨대 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 보라노포스페이트, 아미드 결합 및 포스포라미데이트인 올리고머일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드간 브릿징 포스페이트 잔기 중 다른 하나마다 기재된 바와 같이 개질될 수 있다. 또다른 비-제한적인 실시예에서, 이러한 안티센스 올리고머는 적어도 하나, 또는 모든 뉴클레오티드가 2' 저급 알킬 모이어티(예컨대, 예를 들어, C1-C4, 선형 또는 분지형, 포화된 또는 불포화된 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)을 함유하는 분자이다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 다른 하나마다 기재된 바와 같이 개질될 수 있다.
RNA와 듀플렉스화될 때 세포내 RN아제 H에 의해 절단되지 않는 안티센스 올리고머의 예는 2'-O-메틸 유도체이다. 이러한 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드는 세포내 환경에서 및 동물 조직에서 안정하며, 그들의 RNA와의 듀플렉스는 그들의 리보- 또는 데옥시리보- 대응물보다 높은 Tm 값을 갖는다. 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 저항성 안티센스 올리고머는 불소화된 적어도 하나의 마지막 3' 말단 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 여전히 대안적으로, 본 발명의 뉴클레아제 저항성 안티센스 올리고머는 적어도 2개의 마지막 3-말단 뉴클레오티드 베이스 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 갖고, 바람직하게는 마지막 4개 3' 말단 뉴클레오티드 염기 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 갖는다.
번역의 증가된 조절은 대안적인 올리고뉴클레오티드 화학작용과 함께 또한 달성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고머는: 포스포르아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO); PMO-X; PPMO; 펩티드 핵산(PNA); 락킹된 핵산(LNA) 및 알파-L-LNA, 2'-아미노 LNA, 4'-메틸 LNA 및 4'-O-메틸 LNA를 포함하는 유도체; 에틸렌 브릿징된 핵산(ENA) 및 이들의 유도체; 포스포로티오에이트 올리고머; 트리시클로-DNA 올리고머(tcDNA); 트리시클로포스포로티오에이트 올리고머; 2'-O-메틸-개질된 올리고머(2'-O-Me); 2'-O-메톡시 에틸(2'-MOE); 2'-플루오로(2'F), 2'-플루오로아라비노(FANA); 언락킹된 핵산(UNA); 헥시톨 핵산(HNA); 시클로헥세닐 핵산(CeNA); 2'-아미노(2'-NH2); 2'-O-에틸렌아민 또는 믹스머(mixer)로서의 또는 갭머(gapmer)로서의 전술한 임의의 조합물을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 추가로 전달 효율을 향상시키기 위해, 상기에 언급된 개질된 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기 모이어티와 종종 지방산/지질/콜레스테롤/아미노산/탄수화물/다당류/나노입자 등이 접합된다. 이들 접합된 뉴클레오티드 유도체는 엑손 스키핑 안티센스 올리고머를 작제하는 데에 또한 사용될 수 있다. 인간 OPA1 유전자 전사체의 안티센스 올리고머-유도된 번역 조절은 올리고리보뉴클레오티드, PNA, 포스포로티오에이트 백본 상의 2'-O-Me 또는 MOE 개질된 염기를 일반적으로 사용하였다. 2-O-Me ASO가 올리고 설계를 위해 사용되지만, 양이온 리포플렉스로서 전달될 때 시험관내에서의 그들의 효율적인 흡수로 인해, 이들 화합물은 뉴클레아제 분해에 민감하며 생체내 또는 임상 적용에 이상적이지 않은 것으로 간주된다. 본 발명의 안티센스 올리고머를 생성하기 위해 대안적인 화학작용이 사용될 때, 본원에서 제공되는 서열의 타이민(T)은 우라실(U)로 대체될 수 있다.
상기에 기재된 안티센스 올리고머가 본 발명의 안티센스 올리고머의 바람직한 형태인 동시에, 본 발명은, 이에 제한되지는 않으나 올리고머 모방체, 예컨대 하기에 기재된 것들을 포함하는 다른 올리고머성 안티센스 분자를 포함한다.
본 발명에서 유용한 바람직한 안티센스 올리고머의 특이적인 예는 개질된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드-간 연결을 함유하는 올리고머를 포함한다. 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 개질된 백본을 갖는 올리고머는 백본 내에 인 원자를 보유하는 것 및 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 및 때때로 당해 분야에서 언급된 바와 같이, 뉴클레오시드-간 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 개질된 올리고머가 안티센스 올리고머로 또한 간주될 수 있다.
다른 바람직한 올리고머 모방체에서, 당 및 뉴클레오티드 단위의 뉴클레오시드-간 연결, 즉, 백본은 신규한 그룹으로 대체될 수 있다. 염기 유닛은 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 하나의 이러한 올리고머성 화합물인, 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고머 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고머의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵-염기는 보유되며 백본의 아미드 부분의 아자(aza) 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
또다른 바람직한 화학작용은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 올리고머성 화합물이며, 이는 임의의 공지된 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 분해되지 않는다. 이들 화합물은 비하전되어 있으며, RNA 가닥에 결합될 때 RN아제 H 활성을 활성화하지 않는다.
개질된 올리고머는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 또한 함유할 수 있다. 올리고머는 핵염기(종종 당해 분야에서 간단히 "염기"로서 지칭됨) 개질 또는 치환을 또한 포함할 수 있다. 특정한 핵염기는 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화도를 증가시키기 위해 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃만큼, 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 개질과 조합될 때 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 올리고머의 또다른 개질은 올리고머의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고머에 화학적으로 연결하는 것을 수반한다. 이러한 모이어티는, 이에 제한되지는 않으나, 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 미리스틸, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함한다.
세포 침투 펩티드는 세포 흡수 및 핵 위치화를 향상시키기 위해 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머에 부가되었다. Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther. 16 9, 1624-1629에 나타난 바와 같이, 상이한 펩티드 태그가 흡수의 효율 및 표적 조적 특이성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 개질될 필요는 없으며, 실제로 상기 언급된 개질 중 하나 이상이 단일 화합물 또는 심지어 올리고머 내의 단일 뉴클레오시드 내에 혼입될 수 있다. 본 발명은 키메릭 화합물인 안티센스 올리고머를 또한 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "키메릭" 안티센스 올리고머 또는 "키메라"는 각각이 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 올리고머 화합물의 사례에서 뉴클레오티드로 이루어진 2개 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 함유하는 안티센스 올리고머, 특히 올리고머이다. 이들 올리고머는, 올리고머가 개질되어 올리고머 또는 안티센스 올리고머에 뉴클레아제 분해에의 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수, 및 표적 핵산에의 증가된 결합 친화도에 대한 추가적인 영역을 부여하도록 올리고머가 개질된 적어도 하나의 영역을 전형적으로 함유한다.
안티센스 올리고머 및 이의 변이체의 활성은 당해 분야에서의 통상적인 기술에 따라 검정될 수 있다. 조사된 RNA 및 단백질의 발현 수준은 전사된 핵산 또는 단백질의 발현을 검출하기 위한 매우 다양한 널리-공지된 방법 중 임의의 것에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적인 예는 RNA의 스플라이싱된 형태의 RT-PCR에 뒤이은 PCR 생성물의 크기 분리, 핵산 혼성화 방법, 예를 들어, 노던 블롯 및/또는 핵산 어레이의 사용; 핵산 증폭 방법; 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법; 단백질 정제 방법; 및 단백질 기능 또는 활성 검정을 포함한다. 단백질 발현 수준은 세포, 조직 또는 유기체로부터의 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA 검정에 의해, 및 다운스트림 기능적 또는 생리적 효과를 평가함으로써 평가될 수 있다.
2개 이상의 상이한 크기의 전사체가 존재하는 경우, 생성된 단백질은 관련있는 단백질의 발현을 검출하기 위한 매우 다양한 널리-공지된 방법 중 임의의 것에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적인 예는 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법; 단백질 정제 방법; 질량 분석; 및 단백질 기능 또는 활성 검정을 포함한다.
본 발명은 OPA1 유전자 전사체의 안티센스 올리고머 유도된 번역 조절, 임상적으로 관련있는 올리고머 화학작용, 및 기능적 OPA1 단백질을 치료적 수준으로 지시하는 전달 시스템을 제공한다. 기능적 OPA1 번역의 양에서의, 및 이에 따른 OPA1 유전자 전사로부터의 OPA1 단백질의 임상적으로 관련있는 증가는:
1) 올리고머 전달을 강화하기 위한 (i) 표적 모티프, (ii) 안티센스 올리고머 길이 및 올리고머 칵테일의 개발, (iii) 화학작용의 선택, 및 (iv) 세포-침투 펩티드(CPP)의 첨가의 실험적 평가를 통한, 섬유아세포 세포주를 사용한 시험관내 올리고머 정제; 및
2) 번역을 증가시키기 위한 ATG 또는 거의 동족의 시작 코돈, 억제 또는 효과적인 입체 장애를 통해 OPA1 번역을 조절하는 신규한 접근법에 대한 상세한 평가에 의해 달성된다.
OPA1 번역의 조절은 비-1차 uORF의 번역 억제(최대로 효율적인 1차 uORF로부터의 번역의 개시를 강제함), 또는 2차 구조의 입체 장애로 인한 증가된 번역 효율에 의해 달성될 수 있다. 각각의 방법의 상대적 효율은 예측가능하지 않으며 어떤 방법이 가장 효과적일지에 대한 내재적인 불확실성을 수반한다.
이와 같이, OPA1 mRNA의 번역이 특정한 안티센스 올리고머로 조절될 수 있다는 사실이 본원에서 입증된다. 이 방법으로 OPA1 단백질의 양의 기능적으로 유의한 증가가 수득될 수 있으며, 그럼으로써 OPA1 반가불충분성에 의해 야기되는 ADOA와 연관된 중증의 병리를 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 안티센스 올리고머는 고상 합성의 널리-공지된 기술을 통해 편리하게 만들어질 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아, 포스터 시티)를 포함하는 여러 판매회사에 의해 판매된다. 개질된 고체 지지체 상에서 올리고머를 합성하기 위한 하나의 방법은 미국 특허 번호 4,458,066에 기재되어 있다.
당해 분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가적으로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 올리고머, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 널리 공지되어 있다. 하나의 이러한 자동화된 구현예에서, 디에틸-포스포르아미다이트가 시작 재료로서 사용될 수 있고 Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머는 시험관내에서 합성되며 생물학적 기원의 안티센스 조성물, 또는 안티센스 올리고머의 생체내 합성을 지시하도록 설계된 유전적 벡터 작제물을 포함하지 않는다. 본 발명의 분자는 또한, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화 분자 등과 같은 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 그렇지 않으면 회합될 수 있다.
안티센스 올리고머는 경구, 국소, 비경구 또는 기타 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 특히 국소 안구 및 주사용 안구 투여를 위한 제형일 수 있다. 제형은 투여 또는 활성의 부위에서 흡수, 분포 및/또는 흡수작용을 돕기 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 안티센스 올리고머는 OPA1 생성에 대한 영향이 공간적으로 제한되고 전신적이지 않도록, 눈에 국소적으로 또는 안구내 주사 또는 안구내 이식에 의해 전달하기 위해 제형화된다.
치료 방법
본 발명의 여전히 추가의 양태에 따르면, 안티센스 올리고머-기반 요법에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머가 제공된다. 바람직하게는, 요법은 OPA1 발현과 관련된 질환을 위한 것이다. 보다 바람직하게는, OPA1 발현과 관련된 질환을 위한 요법은 ADOA를 위한 요법이다. 바람직하게는 OPA1 발현과 연관된 질환은 기능적 OPA1 단백질 발현의 감소된 수준과 연관되어 있다. 바람직하게는 감소된 기능적 OPA1은 ADOA를 갖는 환자, 보다 바람직하게는 OPA1 반가불충분성이 내포된 ADOA에서이다.
보다 특이적으로, 안티센스 올리고머는 표 1, 또는 서열번호 1-60 중 임의의 하나 이상으로 이루어진 군; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57, 및 이들의 조합물 또는 칵테일로부터 선택될 수 있다. 이것은 엄격한 혼성화 조건 하에서 이러한 서열에 혼성화될 수 있는 서열, 이에 상보적인 서열, 개질된 염기, 개질된 백본을 함유하는 서열, 및 OPA1 유전자 전사체의 번역을 보유하거나 조절하는 이들의 기능적 절단 또는 확장을 포함한다.
본 발명은 OPA1 유전자 전사체의 번역 조절을 유도하도록 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 안티센스 올리고머의 조합물로 또한 확장된다. 조합물은 2개 이상의 안티센스 올리고머의 칵테일, 안티센스 올리고머-기반 요법에서 사용하기 위해 이어진 2개 이상 2개 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 작제물일 수 있다.
그러므로 OPA1 발현과 관련된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a) 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 환자에서 OPA1 발현과 연관된 질환은 ADOA이다.
그러므로, 본 발명은 ADOA의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법을 제공하며, 방법은:
a) 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 요법은 번역 조절 전략을 통해 기능적 OPA1 단백질의 수준을 증가시키기 위해 사용된다. OPA1 단백질의 수준의 증가는 바람직하게는 OPA1 유전자 전사체의 5' UTR 또는 이의 일부에서의 비-표준 개시 요소로부터의 번역을 감소시킴으로써, 및/또는 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부에의 리보솜 접근을 변경시킴을 통해 OPA1에 대한 정규 시작 코돈으로부터의 증가된 번역을 가능하게 함으로써 달성된다.
바람직하게는 안티센스 올리고머의 투여는 증상을 보이는 OPA1 돌연변이가 있는 대상체에서의 OPA1 단백질의 발현보다 1.1배 내지 2.5배 높은 OPA1 단백질의 발현을 초래한다.
기능적 OPA1의 증가는 바람직하게는 OPA1- 관련 질환, 예컨대 ADOA의 증상의 질, 지속기간 또는 중증도의 감소로 이어질 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간) 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에 사용되는 임의의 유형의 개입이다. 치료는, 이에 제한되지는 않으나, 약제학적 조성물의 투여를 포함하고, 예방적으로 또는 병리적 사건의 개시 또는 병인과의 접촉에 이어서 수행될 수 있다. 또한 치료 중인 질환의 진행 속도를 감소시키거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이의 발병의 중증도를 감소시키는 것과 관련될 수 있는 "예방적" 치료가 포함된다. "치료" 또는 "예방"은 질환, 또는 이의 연관된 증상의 완전한 박멸, 치유, 또는 예방을 반드시 나타내지는 않는다.
OPA1 발현과 연관된 질환이 있는 대상체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머는 또한 대체 요법, 예컨대 약물 요법과 함께 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하는 방법을 제공하며, 여기서 본 발명의 안티센스 올리고머는 OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하는 것과 연관된 또다른 대체 요법과 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 바람직하게는, 질환은 ADOA이다.
전달
본 발명의 안티센스 올리고머는 예방제 또는 치료제로서 또한 사용될 수 있으며, 이는 질환의 치료의 목적을 위해 이용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합된, 치료적으로 유효량의, OPA1 mRNA 내의 선택된 표적에 결합하여, 본원에 기재된 바와 같이 효율적이고 일정한 번역 조절을 유도하는 안티센스 올리고머를 제공한다.
환자에서 OPA1 발현과 관련된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 약제학적, 예방적, 또는 치료적 조성물이 또한 제공되며, 조성물은:
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머 및
b) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제
를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고머는 전신 영향을 피하기 위해 편재된 안구 경로를 통해 전달된다. 투여의 경로는, 이에 제한되지는 않으나, 유리체강내, 전안방내, 결막하, 테논낭밑, 안구뒤, 공막뒤, 또는 국소(점적제, 안약, 크림 등)를 포함한다. 전달 방법은, 예를 들어, 주사기 및 약물 전달 장치, 예컨대 이식된 유리체 전달 장치(즉, VITRASERT®)에 의한 주사를 포함한다.
보다 바람직하게는, 안티센스 올리고머는 눈 당 0.005 내지 5 mg, 눈 당 0.005 내지 1 mg, 눈 당 0.005 내지 0.5 mg, 눈 당 0.01 내지 5 mg, 눈 당 0.02 내지 1 mg, 눈 당 0.01 내지 0.5 g, 눈 당 0.01 내지 0.1 mg, 눈 당 0.01 내지 0.5 mg, 눈 당 2 내지 20 mg, 눈 당 0.5 내지 20 mg, 또는 보다 바람직하게는 눈 당 5 내지 20 mg으로 유리체강내 주사를 통해 투여된다. 안티센스 올리고머는, 예를 들어, 눈 당 약 0.01 mg, 눈 당 0.02 mg, 눈 당 0.03 mg, 눈 당 0.04 mg, 눈 당 0.05 mg, 눈 당 0.06 mg, 눈 당 0.07 mg, 눈 당 0.08 mg, 눈 당 0.09 mg, 눈 당 0.1 mg, 눈 당 0.2 mg, 눈 당 0.3 mg, 눈 당 0.4 mg, 눈 당 0.5 mg, 눈 당 1 mg, 눈 당 2 mg으로 유리체강내 주사를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머는 눈 당 약 0.01 내지 0.5 mg으로 유리체강내 주사를 통해 투여된다.
안티센스 올리고머는 짧은 기간 동안, 예를 들어, 2주 이하 동안 매일 정기적인 간격으로 투여될 수 있다. 그러나, 많은 사례에서, 올리고머는 보다 긴 시간의 기간 동안 간헐적으로 투여된다. 투여는 항생제 또는 다른 치료적 치료의 투여에 뒤이어, 또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 치료 섭생은 치료 하의 대상체의 면역검정, 기타 생화학적 시험 및 생리적 시험의 결과에 기반하여, 나타난 바와 같이 조정될 수 있다(용량, 빈도, 경로 등).
복용은 치료될 질환 상태의 중증도 및 반응성에 따라 달라질 수 있으며, 치료의 과정은 수일에서 수개월, 또는 치료가 효과가 있거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속된다. 대안적으로, 복용은 질환 진행률에 대해 적정될 수 있다. 기준선 진행이 확립된다. 그후에 초기 1회의 복용 후 진행률을 모니터링하여 속도의 감소가 있는지 확인한다. 바람직하게는, 복용 후 진행이 없다. 바람직하게는, 재-복용은 진행률이 변화되지 않았을 경우에만 필요하다. 성공적인 치료는 바람직하게는 질환의 추가의 무 진행 또는 심지어 시각의 약간의 회복을 초래한다. 최적의 복용 스케줄은 환자의 신체에서의 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적 복용량, 복용 방법론 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다.
최적 복용량은 개별 올리고머의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 발견된 EC50에 기반하여 일반적으로 추정될 수 있다.
일반적으로, 복용량은 눈 당 0.005 내지 5 mg로 유리체강내 주사를 통해 투여되며 1일마다, 1주마다, 1개월마다 또는 1년마다 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년마다 1회 투여될 수 있다. 복용에 대한 반복 속도는 질환의 진행률에 의존한다. 당업자는 체액 또는 조직에서 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 복용에 대한 반복 속도를 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 다음에, 질환 상태의 재발을 예방하기 위해 환자가 유지 요법을 받도록 하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 올리고머는 유지 용량으로 투여되고, 용량은 눈 당 0.005 내지 5 mg로, 1일마다, 1주마다, 1개월마다 또는 1년마다 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년마다 1회 유리체강내 주사를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머를 사용하는 효과적인 생체 내 치료 섭생은 투여의 기간, 용량, 빈도 및 경로, 뿐만 아니라 치료 하의 대상체의 상태(즉, 예방적 투여 대 국부적 또는 전신 감염에 반응한 투여)에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 이러한 생체내 요법은 최적의 치료적 결과를 달성하기 위해, 종종 치료 하의 장애의 특정한 유형에 적합한 시험에 의한 모니터링, 및 용량 또는 치료 섭생의 상응하는 조정을 필요로 할 것이다.
치료는, 예를 들어, 당해 분야에 공지된 질환의 일반적인 지표에 의해 모니터링될 수 있다. 본 발명의 생체내 투여된 안티센스 올리고머의 효능은 안티센스 올리고머의 투여에 앞서, 투여 동안 및 이후에 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플(조직, 혈액, 소변 등)로부터 결정될 수 있다. 이러한 샘플의 검정은 (1) 당업자에게 공지된 절차, 예를 들어, 전기영동 겔 이동성 검정을 사용하여 표적 및 비-표적 서열이 있는 헤테로듀플렉스 형성의 존재 또는 부재를 모니터링하는 것; (2) 표준 기술, 예컨대 RT-PCR, 노던 블롯팅, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정된 참조 정상 mRNA 또는 단백질과 관련하여 돌연변이 mRNA의 양을 모니터링하는 것을 포함한다.
핵내 올리고머 전달은 안티센스 올리고머의 주요 과제이다. 상이한 세포-침투 펩티드(CPP)는 상이한 조건 및 세포주에서 다양한 정도로 PMO를 국부화시키고, 신규한 CPP가 표적 세포에 PMO를 전달하는 그들의 능력에 대해 본 발명자들에 의해 평가되었다. 용어 CPP 또는 "세포 섭취를 강화하는 펩티드 모이어티"는 상호교환적으로 사용되며 또한 "수송 펩티드", "담체 펩티드", 또는 "펩티드 도입 도메인"으로 명명된 양이온성 세포 침투 펩티드로 지칭된다. 본원에서 나타난 바와 같이, 펩티드는 주어진 세포 배양 집단의 약 또는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이내의 세포의 세포 침투를 유도하는 능력을 가지며, 전신 투여 시 생체내 다수의 조직 내의 거대 분자 이동(translocation) 및/또는 안내로 투여될 때 거대분자 이동을 허용한다. CPP는 당해 분야에 널리-공지되어 있으며, 예를 들어, 이의 전문이 참조로 통합되는 미국 특허 번호 2010/0016215에 개시되어 있다.
그러므로 본 발명은 치료적 약제학적 조성물의 제조를 위해 세포-침투 펩티드와 조합한 본 발명의 안티센스 올리고머를 제공한다.
부형제
본 발명의 안티센스 올리고머는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 조성물로 전달된다. 조성물은 본 발명의 바람직한 안티센스 올리고머(들) 각각을 약 1 nM 내지 1000 nM 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 본 발명의 안티센스 올리고머(들) 각각을 약 1 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 500 nM, 50 nM 내지 750 nM, 100 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 50 nM, 1 nM 내지 40 nM, 1 nM 내지 30 nM, 1 nM 내지 20 nM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM 포함할 수 있다.
조성물은 본 발명의 바람직한 안티센스 올리고머(들) 각각을 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM 또는 1000 nM 포함할 수 있다.
본 발명은 질환, 예컨대 OPA1 발현 관련 질환 또는 병리의 증상의 예방적 또는 치료적 치료, 예방 또는 완화를 돕기 위해 조정된 하나 이상의 안티센스 올리고머를 환자에 전달하기에 적합한 형태로 추가로 제공한다.
어구 "약제학적으로 허용가능한"은 생리적으로 견딜 수 있고 환자에게 투여될 때 전형적으로 알러지 또는 유사하게 불쾌한 반응, 예컨대 위장 장애 등을 일으키지 않는 분자 본체(entity) 및 조성물을 지칭한다. 용어 "담체"는 화합물과 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다. 물 또는 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 특히 주사가능한 용액을 위한 담체로서 이용된다. 적합한 약제학적 담체는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, PA (2013)에 기재되어 있다.
본 발명의 보다 특이적인 형태에서, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 안정화제, 유화제, 보조제, 및/또는 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 안티센스 올리고머의 치료적으로 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 다양한 완충액 함량(예를 들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 강도 및 첨가제, 예컨대 계면활성제 및 가용화제(예를 들어, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들어, 티메르솔(Thimersol), 벤질 알코올) 및 벌킹(bulking) 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 물질은 중합체성 화합물, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 특정한 미립자 제제 또는 리포좀으로 혼입될 수 있다. 히알루론산 또한 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, PA (2013)을 참조한다. 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나, 또는 건조된 분말, 예컨대 동결건조된 형태일 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다는 사실이 인식될 것이다. 투여를 위한 약제학적 조성물은 주사에 의해, 경구로, 국소적으로 또는 폐 또는 비강 경로에 의해 투여된다. 예를 들어, 안티센스 올리고머는 국소, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여 경로에 의해 전달될 수 있다. 적절한 경로는, 치료 하의 대상체의 조건에 적절하게 당업자에 의해 결정될 것이다. 바람직하게는 안티센스 올리고머는 OPA1 생산에 대한 영향이 공간적으로 제한되고 전신적이지 않도록, 눈에 국소적으로 또는 안구내 주사 또는 안구내 이식에 의해 전달된다.
국소 투여를 위한 제형은 본 개시내용의 올리고머가 국소 전달 제제, 예컨대 하이드로겔, 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이팅제 및 계면활성제와 혼합되어 있는 것을 포함한다. 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린) 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 국소 또는 기타 투여를 위해, 본 개시내용의 올리고머는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 이와, 특히 양이온성 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고머는 지질과, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이들의 용도가 미국 특허 번호 6,287,860 및/또는 1999년 5월 20일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 09/315,298에 추가로 기재되어 있다.
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 안티센스 올리고머는 안구 표면에의 전달을 포함하는 국소 또는 경피 방법(예를 들어, 안티센스 올리고머를, 예를 들어 에멀전으로 혼입시키고, 이러한 안티센스 올리고머를 임의로 리포좀 내에 패키징시키는 것을 통해)에 의해 전달될 수 있다. 이러한 전달의 국소 또는 경피 및 에멀전/리포좀-매개 방법은 당해 분야의 안티센스 올리고머의 전달에 대해, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,965,025에 기재되어 있다. 바람직하게는 국소 전달은 눈에의 전달이다.
본원에 기재된 안티센스 올리고머는 이식가능한 장치를 통해 또한 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,969,400에 기재되어 있는 합성 임플란트 설계와 함께, 당해 분야에서 인정된 과정이다. 바람직하게는 임플란트는 안티센스 올리고머의 지속적인 전달을 위해 눈 안으로 이식될 수 있다.
안구 주사, 국소 안구 전달 및 안구 임플란트를 포함하는 안구 투여를 위한 조성물 및 제형은, 또한 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 침투 강화제, 담체 화합물 및 기타 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있는 멸균 수성 용액을 포함할 수 있다.
치료적으로 유용한 양의 안티센스 올리고머의 전달은 이전에 발표된 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고머의 전달은 안티센스 올리고머 및 유효량의 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 조성물을 통할 수 있다. 이 방법의 예는 미국 특허 출원 US20040248833에 기재되어 있다. 핵으로의 안티센스 올리고머의 전달의 기타 방법은 Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47에, 및 Gebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811에 기재되어 있다. 핵산 분자를 네이키드(naked) DNA로서 또는 지질 담체와 복합체화된 발현 벡터의 방식으로 세포 내에 도입하기 위한 방법은 US 6,806,084에 기재되어 있다.
안티센스 올리고머는 당해 분야에서 인정된 기술(예를 들어, 형질감염, 전기천공, 융합, 리포좀, 콜로이드 중합체성 입자 및 바이러스 및 비-바이러스 벡터 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 수단)을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 선택되는 전달의 방법은 적어도 치료될 세포 및 세포의 위치에 의존할 것이고 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 국부화는 리포좀을 지시하기 위해 표면 상에 특이적인 마커가 있는 리포좀, 표적 세포를 함유하는 조직으로의 직접적인 주입, 특이적인 수용체-매개 흡수 등에 의해 달성될 수 있다.
안티센스 올리고머를 콜로이드 분산 시스템 중 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 콜로이드 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포좀 또는 리포좀 제형를 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 이들 콜로이드 분산 시스템은 치료적 약제학적 조성물의 제조 시 사용될 수 있다.
리포좀은 인공적인 막 비히클이며, 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용하다. 이들 제형은 순 양이온, 음이온, 또는 중성 전하 특징을 가질 수 있으며, 시험관내, 생체내 및 생체외 전달 방법을 위해 유용한 특징을 갖는다. 큰 단층 비히클이 큰 거대분자를 함유하는 수성 완충제의 상당한 백분율을 캡슐화할 수 있는 것으로 나타났다. RNA 및 DNA는 수성 내부 내에 캡슐화될 수 있고 생물학적으로 활성화 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981).
리포좀이 효율적인 유전자 전달 비히클이 되기 위해서, 다음의 특징이 존재해야한다: (1) 그들의 생물학적 활성을 손상시키지 않으면서 고효율로 관심있는 안티센스 올리고머의 캡슐화; (2) 비-표적 세포와 비교 시 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합; (3) 고효율로 비히클의 수성 내용물을 표적 세포 세포질로 전달; 및 (4) 유전 정보의 정확하고 효과적인 발현(Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). 리포좀의 조성물은 대개 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합된, 대개 인지질, 특히 높은 상-전이-온도 인지질의 조합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 양이온성 리포좀은 음성으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성한다고 여겨지는 양성으로 하전된 리포좀이다. pH-민감성 또는 음성으로-하전된 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기보다 DNA를 덫에 걸리게 하는 것으로 여겨진다. 양이온성 및 비양이온성 리포좀 둘 다 세포에 DNA를 전달하기 위해 사용되었다.
리포좀은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함하며, 이 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 리포좀에 혼입될 때 이러한 특수화된 지질이 결여된 리포좀에 비해 강화된 순환 수명을 초래하는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 비히클-형성 지질 부분의 일부가 하나 이상의 당지질을 포함하거나 하나 이상의 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도체화된 것들이다. 리포좀 및 그들의 용도는 미국 6,287,860에 추가로 기재되어 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 안티센스 올리고머는, 예를 들어, 리포좀-매개 흡수, 지질 접합체, 폴리리신-매개 흡수, 나노입자-매개 흡수, 및 수용체-매개 엔도사이토시스, 뿐만 아니라 전달의 추가적인 비-식작용 방식, 예컨대 미세주입, 투과화(예를 들어, 스트렙토리신-O 투과화, 음이온성 펩티드 투과화), 전기천공법, 및 당해 분야에 공지된 전달의 다양한 비-침습적 비-식작용 방법(Dokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49 참조, 이의 전문은 참조로 통합됨)을 수반하는 방법을 사용하여 전달될 수 있다.
안티센스 올리고머는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 또한 조합되어 약제학적 조성물을 생산할 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 식염수 용액, 예를 들어 인산-완충 식염수를 포함한다. 조성물은 국소, 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내, 경구, 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
기재된 투여의 경로는, 숙련된 의사가 임의의 특정한 동물 및 상태에 대한 최적 투여의 경로 및 임의의 복용량을 용이하게 결정할 수 있을 것이므로 단지 지침으로서 의도된다.
시험관내 및 생체내 둘 다로 기능적 새로운 유전 물질을 세포내로 도입하기 위한 다수의 접근법이 시도되었다(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). 이들 접근법은 변형된 레트로바이러스 내로 발현될 유전자의 통합(앞의 Friedmann (1989); Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); 비-레트로바이러스 벡터 내로의 통합(Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434); 또는 리포좀을 통한 이종 프로모터-인핸서 요소에 연결된 전이유전자의 전달(앞의 Friedmann (1989); Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; 및 Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855); 리간드-특이적으로 커플링된, 양이온-기반 수송 시스템(Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) 또는 네이키드 DNA, 발현 벡터의 사용(앞의 Nabel et al. (1990)); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468)을 포함한다. 전이유전자의 조직 내로의 직접 주입은 국부적 발현만 생산한다(앞의 Rosenfeld (1992)); 앞의 Rosenfeld et al. (1991); 앞의 Brigham et al. (1989); 앞의 Nabel (1990); 및 앞의 Hazinski et al. (1991)). 브링엄(Bringham) 등 그룹(Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 및 Clinical Research (1991) 39 (초록))은 DNA 리포좀 복합체의 정맥내 또는 기관내 투여 다음에 마우스 폐의 생체내 형질감염만을 보고하였다. 인간 유전자 요법 절차의 리뷰 논문의 예는: Anderson, Science (1992) 256:808-813; Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther; 8(5):313-23; Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol; 35(3):164-78; Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18):1313-9; Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv; 2(2):237-54이다.
본 발명의 안티센스 올리고머는 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에의 투여 시 생물학적으로 활성인 대사산물 또는 이의 잔여물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 기타 화합물을 아우른다. 따라서, 예로서, 본 개시내용은 또한 본 발명의 화합물의 전구약물 및 약제학적으로 허용가능한 염, 이러한 전구약물의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 기타 생물학적 등가물에 관한 것이다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염, 즉 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 이에 대해 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올라고머의 경우에, 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 이에 제한되지는 않으나 (a) 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대 스퍼민 및 스퍼미딘 등으로 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가염; (c) 유기산, 예컨대, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등으로 형성된 염; 및 (d) 원소 음이온, 예컨대 염소, 브롬, 및 요오드로부터 형성된 염을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 국소 치료가 바람직한지 또는 전신 치료가 바람직한지에 및 치료될 영역에 의존하여 많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과 및 점막, 뿐만 아니라 직장 전달을 포함), 폐(예를 들어, 네뷸라이저, 기관내, 비강내, 표피 및 경피를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해), 경구 또는 비경구 경로를 통해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 안구내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어 척수강내 또는 심실내, 투여를 포함한다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 개질이 있는 올리고머는 안구내 투여에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 안티센스 올리고머는 안구내 경로를 통해 전달된다.
단위 복용량 형태로 편리하게 존재할 수 있는 본 발명의 약제학적 제형은 약제학적 산업에서 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 회합시키고, 그후에, 필요한 경우, 제품을 성형함으로써 제조된다.
용도
본 발명의 또다른 양태에 따르면, OPA1 단백질 발현과 연관된 질환의 조절 또는 제어를 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 안티센스 올리고머의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 OPA1 단백질 발현과 연관된 질환의 치료용 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 정제된 및 단리된 안티센스 올리고머의 용도를 또한 제공한다.
OPA1 단백질 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하는 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 정제된 및 단리된 안티센스 올리고머의 용도가 또한 제공된다.
바람직하게는, OPA1-관련 질환은 ADOA이다. 바람직하게는 OPA1 단백질 발현과 연관된 질환은 기능적 OPA1 단백질의 감소된 수준과 연관되어 있다. 바람직하게는 감소된 수준의 기능적 OPA1 단백질은 ADOA를 갖는 환자, 보다 바람직하게는 OPA1 반가불충분성이 내포된 ADOA에서이다.
본 발명은, 이의 계속해서 추가의 양태에 따르면, 본 발명의 안티센스 올리고머 서열의 cDNA 또는 클로닝된 사본, 뿐만 아니라 본 발명의 안티센스 올리고머 서열을 함유하는 벡터로 연장된다. 본 발명은 추가로 또한 이러한 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 연장된다.
키트
환자에서 OPA1 단백질 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 키트가 또한 제공되며, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 안티센스 올리고머 및 이의 조합물 또는 칵테일을 포함하고 적합한 용기에 이의 사용을 위한 설명서와 함께 패키징된다. 바람직하게는 OPA1 단백질 발현과 연관된 질환은 ADOA이다.
바람직한 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 또는 표 1, 또는 서열번호 1-60의 적어도 하나의 안티센스 올리고머; 보다 바람직하게는 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57; 보다 더 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이, 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57, 또는 안티센스 올리고머의 칵테일을 함유할 것이다. 키트는 주변 시약, 예컨대 완충제, 안정제 등을 또한 함유할 것이다.
키트의 구성성분이 하나 이상의 액체 용액 중 제공될 때, 액체 용액은 수용액, 예를 들어 멸균 수용액일 수 있다. 생체내 사용을 위해, 발현 작제물이 약제학적으로 허용가능한 주사가능한 조성물 내로 제형화될 수 있다. 이 사례에서 용기 수단은 그 자체로 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기, 또는 기타 이와 유사한 장치일 수 있으며, 이때 제형은 동물의 영향을 받는 부위, 예컨대 폐에 적용될 수 있고, 동물에 주사되거나, 심지어 키트의 다른 구성성분과 함께 적용되고 혼합될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 키트는 OPA1 유전자 전사체 상의 선택된 표적에 결합하여 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부에서의 번역을 수정할 수 있는 안티센스 올리고머의 치료적으로 유효량을 포함하는 조성물을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 제형은 사전-측정되고/되거나, 사전-혼합되고/되거나 사전-패키징된다. 바람직하게는 안구내 용액은 멸균되어 있다.
본 발명의 키트는 사용자 규정준수을 용이하게 하도록 설계된 설명서를 또한 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 설명서는 임의의 라벨, 삽입물 등을 지칭하며 패키징 재료의 하나 이상의 표면에 위치할 수 있거나, 설명서가 별도의 시트, 또는 이들의 조합물 상에 제공될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 제형을 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일 구현예에서, 설명서는 ADOA의 치료에 적합한 본 발명의 제형을 나타낸다. 이러한 설명서는 복용량의 설명, 뿐만 아니라 눈으로의 국소 전달을 통한 또는 안구내 주사를 통한 투여를 위한 설명을 또한 포함할 수 있다.
안티센스 올리고머 및 적합한 부형제가 개별적으로 패키징되어 의사 또는 사용자가 구성성분을 필요한 만큼 약제학적으로 허용가능한 조성물로 제형화하도록 할 수 있다. 대안적으로, 안티센스 올리고머 및 적합한 부형제가 함께 패키징되어, 그럼으로써 의사 또는 사용자에 의한 최소한의 제형화를 필요로 할 수 있다. 어떠한 경우에도 패키징은 활성 성분의 화학적, 물리적 및 미적 온전함을 유지해야 한다.
일반사항
당업자는 본원에 기재된 발명이 특이적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변형 및 수정을 포함한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 명세서에서 언급되거나 나타난 모든 단계, 특징, 제형 및 화합물 및 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상의 단계 또는 특징을 포함한다.
이 본문에서 인용된 각각의 문서, 참조문헌, 특허 출원 또는 특허는 그들의 전문이 참조로 본원에 명시적으로 통합되어 있으며, 이는 독자에 의해 이 텍스트의 일부로 읽히고 간주되어야 함을 의미한다. 이 본문에서 인용된 문서, 참조문헌, 특허 출원 또는 특허가 이 본문에서 반복되지 않는다는 것은 단지 간결함을 위한 것이다.
본원에서 언급된 임의의 제품에 대한 또는 본원에 참조로 통합된 임의의 문서에서의 임의의 제조업체의 설명서, 상세한 설명, 제품 사양, 및 제품 시트는 이로써 본원에 참조로 통합되며 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 특이적인 실시예에 의해 범주가 제한되지 않는다. 이들 구현예는 예시의 목적으로만을 위해 의도된다. 기능적으로 등가의 제품, 제형 및 방법은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 명백히 있다.
본원에서 기재된 발명은 하나 이상의 범위의 값(예를 들어, 크기, 변위 및 전계 강도 등)을 포함할 수 있다. 값의 범위는 범위를 정의하는 값 및 범위의 경계를 정의하는 해당 값에 바로 인접한 값과 같거나 실질적으로 같은 결과로 이어지는 범위에 인접한 값을 포함하여, 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 이런 이유로, "약 80%"는 "약 80%" 및 또는 "80%"를 의미한다. 최소한에서, 각각의 수치 매개변수는 유효 자릿수 및 일반적인 반올림 방식을 고려하여 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 변형어, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 명시된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 또한 본 개시내용, 특히 청구범위 및/또는 문단에서, 용어, 예컨대 "포함하다", "포함된", "포함하는"은 미국 특허법에서 그들에게 있다고 하는 의미를 가질 수 있음에 유의한다; 예를 들어, 이들은 "포함하다", "포함된", "포함하는" 등을 의미할 수 있다; 및 용어, 예컨대 "~로 본질적으로 이루어지는" 및 "~로 본질적으로 이루어진다"는 미국 특허법에서 그들의 것으로 생각되는 의미를 가지며, 예를 들어, 그들은 명시적으로 언급되지 않은 요소는 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다.
본원에서 사용되는 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 발견될 수 있으며 전체적으로 적용될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기타 과학적 및 기술적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 용어 "활성제"는 하나의 활성제를 의미할 수 있거나 2개 이상의 활성제를 아우를 수 있다.
본 명세서에 포함된 뉴클레오티드 및 아미노산 정보를 함유하는 서열 식별 번호("서열번호")는 상세한 설명의 끝에서 수집되며 프로그램 패턴트인 버전 3.0(Patentln Version 3.0)을 사용하여 준비되었다. 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 숫자 표시자 <210>에 뒤이은 서열 식별자(예를 들어, <210>1, <210>2 등)로 서열 목록에서 식별된다. 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 길이, 서열의 유형 및 공급원 유기체는 각각 숫자 표시자 필드 <211>, <212> 및 <213>에 제공된 정보에 의해 나타난다. 본 명세서에서 지칭되는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 숫자 표시자 필드 <400>에 뒤이은 서열 식별자(예를 들어, <400>1, <400>2 등)로 제공된다.
안티센스 올리고머 명명법 시스템은 상이한 안티센스 올리고머를 구별하기 위해 제안되고 공개되었다(Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654 참조). 이 명명법은, 하기에 나타난 바와 같이, 모두 같은 표적 영역으로 지시되는, 여러가지 약간 상이한 안티센스 올리고머를 시험할 때 특히 관련이 있다:
H # A/D (x:y)
첫 번째 문자는 종을 지정한다(예를 들어, H: 인간, M: 뮤린)
"#"는 표적 엑손 숫자를 지정한다
"A/D"는 각각 엑손의 시작 및 말단에서의 수용체 또는 공여체 스플라이스 부위를 나타낸다
(x y)는 "-" 또는 "+"가 각각 인트론 또는 엑소닉 서열을 나타내는 어닐링 좌표를 나타낸다. 예로서, A(-6+18)은 표적 엑손에 선행하는 인트론의 마지막 6개의 염기 및 표적 엑손의 처음 18개 염기를 나타낼 것이다. 가장 가까운 스플라이스 부위는 수용체일 것이므로 이들 좌표에 "A"가 선행한다. 공여체 스플라이스 부위에서 어닐링 좌표를 기재하는 것은 D(+2-18)일 수 있으며, 여기서 마지막 2개의 엑소닉 염기 및 처음 18개 인트로닉 염기가 안티센스 올리고머의 어닐링 부위에 해당한다. A(+65+85)로 표시되는, 즉 해당 엑손의 시작부터 65번째부터 85번째까지의 뉴클레오티드의 부위일 전체가 엑소닉인 어닐링 좌표.
다음의 실시예는 상기에-기재된 발명을 사용하는 방식을 보다 완전하게 기재하고, 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 양태를 수행하기 위해 고려되는 최선의 방식을 제시하는 역할을 한다. 이들 방법은 결코 본 발명의 진정한 범주를 제한하는 역할을 하지 않으며, 오히려 예시적인 목적으로 제공되는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1
ASO 설계
OPA1의 5' UTR 영역이 도 1에 나타나있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)는 5' UTR 2차 구조를 입체적으로 억제하고 uORF의 선택을 억제하기 위해 5' UTR을 표적화하도록 설계되었다.
실시예 2
인간 배아 신장 세포에서 OPA1 의 5'UTR을 표적화하는 2'-O-메톡시에틸(2'MOE) ASO 스크리닝
5' UTR을 표적화하는 2'MOE-ASO의 스크리닝을 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여, 제조업자의 설명서에 따라 HEK293 세포에서 수행하였다. 싸이토버스터(CytoBuster) 단백질 추출 시약(머크 밀리포어(Merck Millipore))를 사용하여, 제조업자의 설명서를 따라 형질감염된 세포로부터 총 단백질을 수확하였고 (48시간) TBST 완충액 중 5% BSA 중 1:500의 희석으로 토끼 항-OPA1 단클론성 항체(세포 시그널링(Cell Signaling), 카탈로그 번호 67589)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 스크리닝 2'MOE-ASO는 양성 대조군 ASO와 동시에 형질감염되었다. 그러나, 양성 대조군과 비교하여 설계된 2'-MOE-ASO 서열에서 OPA1 상향조절은 관찰되지 않았다(도 2).
실시예 3
인간 배아 신장 세포에서 OPA1 의 5'UTR을 표적화하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 스크리닝
OPA1의 5' UTR을 표적화하는 PMO를 네온(NEON®) 전기천공 시스템(써모피셔(ThermoFisher®))을 사용하여 HEK293 세포 내로 뉴클레오펙션(nucleofection)하였다. 싸이토버스터 단백질 추출 시약으로 형질감염-이후 48시간에 총 단백질을 수확하였고 OPA1 단백질 수준을 웨스턴 블롯 검정에 의해 결정하였다. PMO OPA1_H1A(+10+32)는 비처리된 HEK293 세포와 비교하여 1.5배까지 OPA1 단백질 발현을 유도하였다(도 3).
실시예 4
ADOA 환자 섬유아세포에서 OPA1의 5' UTR을 표적화하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 스크리닝
네온® 전기천공 시스템을 사용하여 OPA1의 5' UTR을 표적화하는 PMO를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG)를 운반하는 환자 섬유아세포 내로 형질감염시켰다. 총 단백질을 형질감염-이후 24시간 및 48시간에서 수집하였고 웨스턴 블롯 검정에 의해 평가하였다. PMO의 대부분이 비처리된 대조군과 비교하여 시간-의존적인 방식으로 OPA1 단백질 발현을 상향조절하였다. PMO OPA1_H1A(+10+32)는 가장 높은 OPA1 단백질 발현의 상향조절을 나타내었다; 비처리된 환자 섬유아세포와 비교하여 48 시간에 2배까지(도 4).
네온® 전기천공 시스템을 사용하여 OPA1의 5' UTR을 표적화하는 PMO를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG)를 운반하는 환자 섬유아세포에서 형질감염시켰다. 총 단백질을 형질감염-이후 48시간에서 수확하였고 OPA1 단백질 발현에 대해 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 평가하였다. PMO OPA1_H1A(-2+21), H1A(+2+25), H1A(+7+31), H1A(+12+36), H1A(+17+41) 및 H1A(+44+67)는 PMO H1A(+10+32) 처리된 조건과 비교하여 보다 높은 OPA1 단백질 발현의 상향조절을 나타내었다(도 5a 및 5b).
실시예 5
마이크로워크드 PMO 설계
네온® 전기천공 시스템을 사용하여 OPA1_H1A(+10+32)에 인접한 OPA1의 5' UTR을 표적화하는 마이크로워크드 PMO를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG)를 운반하는 환자 섬유아세포에서 형질감염시켰다. 싸이토버스터 단백질 추출 시약(머크 밀리포어)를 사용하여, 제조업자의 설명서를 따라 형질감염된 세포로부터 총 단백질을 수확하였고 (48시간) TBST 완충액 중 5% BSA 중 1:250의 희석으로 토끼 항-OPA1 단클론성 항체(세포 시그널링, 카탈로그 번호 67589)를, 뒤이은 염소 항-토끼 IgG H&L 항체(앱캠(abcam), 카탈로그 번호 ab216773, IRDye® 800CW)를 사용하여 웨스턴 블롯 검정에 의해 평가하였다. 베타-액틴은 로딩 컨트롤로서 역할을 하였으며 단클론성 마우스 항-β-액틴 항체(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 A5441)를, 뒤이은 염소 항-마우스 IgG H&L 항체(앱캠, 카탈로그 번호 ab216776, IRDye® 680RD)를 사용하여 검출하였다. PMO H1A(+10+32)1mm10C>T는 모 서열 H1A(+10+32)에 의해 유도된 것보다 더 위로 OPA1 발현을 증가시켰다(도 6).
네온® 전기천공 시스템을 사용하여 PMO OPA1_H1A(+44+67)에 인접한 OPA1의 5' UTR을 표적화하는 마이크로워크드 PMO를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG)를 운반하는 환자 섬유아세포에서 형질감염시켰다. 싸이토버스터 단백질 추출 시약(머크 밀리포어)를 사용하여, 제조업자의 설명서를 따라 형질감염된 세포로부터 총 단백질을 수확하였고 (48시간) TBST 완충액 중 5% BSA 중 1:250의 희석으로 토끼 항-OPA1 단클론성 항체(세포 시그널링, 카탈로그 번호 67589)를, 뒤이은 염소 항-토끼 IgG H&L 항체(앱캠), 카탈로그 번호 ab216773, IRDye® 800CW)를 사용하여 웨스턴 블롯 검정에 의해 평가하였다. 베타-액틴은 로딩 컨트롤로서 역할을 하였으며 단클론성 마우스 항-β-액틴 항체(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 A5441)를, 뒤이은 염소 항-마우스 IgG H&L 항체(앱캠, 카탈로그 번호 ab216776, IRDye® 680RD)를 사용하여 검출하였다. PMO H1A(+47+71)2mmC>T, H1A(+49+73)2mmC>T, 및 H1A(+50+74)2mmC>T는 모 서열 H1A(+44+67)에 의해 유도된 것보다 더 위로 OPA1 발현을 증가시켰다(도 7a 및 7b).
실시예 6
ADOA 환자 섬유아세포에서 OPA1 의 5'UTR을 표적화하는 펩티드-접합된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PPMO) 스크리닝
PPMO_H1A(+10+32)를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG, c.985-1G>A 및 c.2608delA)를 운반하는 ADOA 환자 섬유아세포와 함께 7일 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯 분석을 사용한 OPA1 단백질 발현의 평가를 위해 세포를 수확하고 베타-액틴 발현으로 정규화하였다. PPMO_H1A(+10+32)는 용량 의존적인 방식으로 OPA1 단백질 발현을 증가시켰다(도 8). 미토콘드리아 기능의 개선을 PPMO_H1A(+10+32) 처리 다음에 평가하였다. 처리 이후 7일에, 그뒤에 PPMO-처리된 세포를 5 mM 2-데옥시-D-포도당(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 D8375) 및 5 mM 피루브산나트륨(써모 피셔, 카탈로그 번호 11360-070)과 함께 18시간 동안 인큐베이션하고 제조업체의 설명서에 따라 쎌티트레-글로(CellTitre-Glo) 발광 세포 생존능 분석(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 G7572)을 사용하여 미토콘드리아 ATP에 대해 정량화하였다. PPMO_H1A(+10+32)는 4명의 ADOA 환자에서 섬유아세포 내의 미토콘드리아 ATP 수준을 증가시켰다(도 9).
실시예 7
ADOA 환자 섬유아세포에서 OPA1 의 5'UTR을 표적화하는 PPMO 스크리닝
PPMO_H1A(+10+32)를 OPA1 돌연변이(c.2708_2711delTTAG 및 c.985-1G>A)를 운반하는 환자 섬유아세포와 함께 7일 동안 인큐베이션하고 아폽토시스에 대한 보호 효과에 대해 평가하였다. PPMO-처리된 세포를 세포 수확에 앞서 25-50 μM 올리고마이신으로 4시간 동안 처리하였다. 세포를 아넥신 V 및 프로피디움 요오드화물로 염색하고 유세포분석을 사용하여 세포 아폽토시스에 대해 분석하였다. PPMO_H1A(+10+32)는 3명의 ADOA 환자로부터의 섬유아세포에서 용량 의존적인 방식으로 아폽토시스로부터 세포를 보호하였다(도 10). NT: 시험되지 않음.
SEQUENCE LISTING <110> Vision Pharma Pty Ltd <120> Treatment of Optic Atrophy <130> 289920 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 accagcgcat gcgcacagtg cgt 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggaccagcg catgcgcaca gt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtccgctgag gaccagcgca t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tttctaggcg ggcagcacga a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 caaccacttc accctttcta ggc 23 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aaccacttca ccctttcta 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 acccgtactc agtccgtcac ggaaa 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgtactcagt ccgtcacgga aa 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 acttccgcaa gagcctgaca ggcac 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggacttccgc aagagcctga 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 caatggcgca tggacttccg caaga 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctcccaatgg cgcatggact 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cccaggaagt ggtcctcag 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ggctcccggt ccaggaatg 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcacgcaggt gctgagacg 19 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cgtggaggac cagtgcatgc gc 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aacggtccgc ggaggaccag c 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gcacgaacgg tccgcggagg ac 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggcagtacga acggtctgcg ga 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ggtgggcagc acgaatggtc cg 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tctaggcggg cagcacgaac gg 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cctttctagg cgggcagcac ga 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tcaccctttc taggcgggca gc 22 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 aaccacttca ccctttctag gcggg 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaaacaacca cttcaccctt tctag 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tcacggaaac aaccacttca ccctt 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gtccgtcacg gaaacaacca cttca 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 actcagtccg tcacggaaac aacca 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 caggcacccg tactcagtcc gtcac 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cctgacaggc acccgtactc agtcc 25 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gagcctgaca ggcacccgta ctc 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gcaagagcct gacaggcacc cg 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 aagtggccct cagcagcaag gg 22 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 acctaggaag tggtcctcag cagc 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ggaatgaccc aggaagtggc cctca 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gtccaggaat gacccaggaa gtggc 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ctgacaggca cccgtactca gtccg 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gcctgacagg cacccgtact cagtc 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 agcctgacag gcacccgtac tcagt 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gagcctgaca ggcacccgta ctcag 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 agagcctgac aggcacccgt actca 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 aagagcctga caggcacccg tactc 25 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 caagagcctg acaggcaccc gtact 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gcaagagcct gacaggcacc cgtac 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 ctgacaggca ttcgtactca gtccg 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gcctgacagg cacttgtact cagtc 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 agcctgacag gcattcgtac tcagt 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gagcttgaca ggcacctgta ctcag 25 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 agagcttgac aggcactcgt actca 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 aagagcttga caggcactcg tactc 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 caagagcttg acaggcatcc gtact 25 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gcaagagctt gacaggcatc cgtac 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 aacaaccact tcaccctttc taggc 25 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 acaaccactt caccctttct aggc 24 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 acaaccactt caccctttct aggcg 25 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 aaacaaccac ttcacccttt ctagg 25 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 caaccacttt accctttcta ggc 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 caaccacttc atcctttcta ggc 23 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 acttccgcaa gagcctga 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 tcccaatggc gcatggac 18

Claims (19)

  1. 개질된 백본 구조 및 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머에 대해 적어도 75% 서열 동일성이 있는 서열을 갖는 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 mRNA 번역을 조절하기 위한 단리된 또는 정제된 안티센스 올리고머.
  2. 제1항에 있어서, 바람직하게는 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 정규 시작 코돈으로부터의 증가된 번역을 유도하는 안티센스 올리고머.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1-60을 포함하는 목록으로부터 선택되는 안티센스 올리고머.
  4. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머는 다음을 포함하는 목록으로부터 선택된 대안적인 화학작용 또는 개질이 적용되는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치를 함유하는 안티센스 올리고머: (i) 개질된 당 모이어티; (ii) RN아제 H에 대한 저항성; 및/또는 (iii) 올리고머성 모방 화학작용.
  5. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머는 (i) 모이어티에의 화학적 접합; 및/또는 (ii) 세포 침투 펩티드를 이용한 태깅(tagging)에 의해 추가로 개질되는 안티센스 올리고머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고머.
  7. 제1항에 있어서, 상기 임의의 티민(T)이 뉴클레오티드 서열에 존재할 때, 티민(T)은 우라실(U)로 대체될 수 있는 안티센스 올리고머.
  8. 제1항에 있어서,
    i. OPA1 유전자 전사체의 5' UTR에 하이브리드화되고 OPA1 유전자 전사체 또는 이의 일부의 비정상적 번역의 개시를 방해하고/하거나
    ii. 5' UTR 2차 구조 요소의 입체적 억제를 통해 기능적 OPA1 단백질의 번역을 증가시키도록
    작용하는 안티센스 올리고머.
  9. 제1항에 있어서, OPA1 돌연변이가 있는 환자의 세포에서
    i. 미토콘드리아 ATP 수준을 증가시키고/시키거나
    ii. 아폽토시스를 감소시키도록
    작용하는 안티센스 올리고머.
  10. 환자에서 OPA1 발현과 관련된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 약제학적, 예방적, 또는 치료적 조성물로서,
    a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고머, 및
    b) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제
    를 포함하는 조성물.
  11. OPA1 유전자 전사체의 번역을 조절하기 위한 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고머를 제공하는 단계 및 올리고머(들)를 표적 핵산 부위에 결합하도록 허용하는 단계를 포함하는 방법.
  12. OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법으로서,
    a) 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고머 또는 제10항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  13. OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 의약(medicament)의 제조를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 정제된 및 단리된 안티센스 올리고머의 용도.
  14. 환자에서 OPA1 발현과 연관된 질환의 영향을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 키트로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 적어도 안티센스 올리고머를 포함하고, 적합한 용기에 이의 사용을 위한 설명서와 함께 패키징되는 키트.
  15. 제10항, 제11항, 제12항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPA1 발현 관련 질환은 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)인 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  16. 제10항, 제11항, 제12항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPA1 발현과 연관된 질환이 있는 대상체는 인간인 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  17. 제10항, 제11항, 제12항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 증상을 보이는 OPA1 돌연변이가 있는 대상체에서의 OPA1 단백질의 발현보다 1.1 내지 2.5배 더 높은 OPA1 단백질의 발현을 초래하는 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  18. 제1항에 있어서, 서열번호 5, 9, 13, 16-18, 20-27, 30, 32, 42, 49-52, 54-55 및 57을 포함하는 목록으로부터 선택되는 안티센스 올리고머.
  19. 제1항에 있어서, 서열번호 5, 22, 23, 25, 30 및 57을 포함하는 목록으로부터 선택되는 안티센스 올리고머.
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