KR20180041120A

KR20180041120A - Cprispr/cas9-기반 치료

Info

Publication number: KR20180041120A
Application number: KR1020187002971A
Authority: KR
Inventors: 앨버트 에스. 준; 비노드 재스쿨라-란가; 도날드 잭
Original assignee: 더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2018-04-23
Also published as: US20200010854A1; CA2989331A1; EA201890203A1; WO2017004616A1; CN108350446A; BR112017028201A2; EP3317409A4; CL2017003411A1; EP3317409A1; AU2016287836A1; JP2018520149A; IL256279A; MX2017016921A

Abstract

안구 및 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환 예컨대, 각막 이상증 및 미소부수체 발현 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 기재된다. 방법은 뉴클레아제 시스템 예컨대, 게놈 DNA를 절단 및/또는 복구하기 위해 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR)/CRISPR 관련 (Cas) 9 (CRISPR-Cas9)를 사용한다. 이런 방법은 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성 관련 복구(HDR)와 조합된 복구 주형을 포함하는 DNA 이중-가닥 절단(DSB) 복구 시스템을 추가로 포함할 수 있다.

Description

CPRISPR/CAS9-기반 치료

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 그 내용 전체가 본원에 참조로 통합된 2015년 7월 2일 출원된 미국 가출원 번호 62/188,013에 대한 우선권을 주장한다.

각막 이상증은 일반적으로 유전되며, 양측성이며, 대칭성이며, 서서히 진행되며, 대부분 환경 또는 전신적 인자와 관련되지 않은 질환의 군이다(1,2). 각막 이상증은 각막의 임의의 해부학적 층, 세포 유형, 또는 조직에 영향을 미칠 수 있어 각막 선명도 손실 및 시력 저하를 초래할 수 있다(1,3). 한 군으로서의 각막 이상증은 미국 인구의 4% 초과에서 발병되고 있으며, 각막 이식은 현저한 시력 손실을 초래하는 충분한 중증도의 각막 이상증에 대한 확실한 치료법이다. 푹스 각막 내피 이상증(FECD)은 미국 인구의 대략 4%에서 발병되는 가장 일반적인 각막 이상증이다. FECD 사례의 대략 70%는 전사 인자 4(TCF4) 유전자에서 미소부수체 트리뉴클레오티드 반복 확장에 의해 초래된다(4). 추가적인 미소부수체 확장 질환이 기술되어 있다(5).

따라서, 안구 및 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환 예컨대, 각막 이상증, 및 눈 및 신체 전반에 걸친 다른 조직 및 기관에 영향을 미치는 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위한 신규하고 개선된 요법이 절실하게 필요하다.

발명의 개요

안구 및 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환 예컨대, 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 기술된다. 방법은 뉴클레아제 시스템 예컨대, 게놈 DNA를 절단 및/또는 복구하기 위해 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat:CRISPR)/CRISPR 관련 (Cas) 9 (CRISPR-Cas9)를 사용한다. CRISPR-Cas9-기반 유전자 편집은 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 초래하는 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 교정하여 이러한 군의 질환에 대한 유전자 치료법을 제공하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 한 양태는 대상체에서 안구 조직에 영향을 미치는 질환을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 가이드 DNA 및 게놈 표적화된 뉴클레아제를 포함하는 치료학적 유효량의 뉴클레아제 시스템을 대상체의 안구 영역에 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제는 단백질, RNA, DNA, 또는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공될 수 있다.

특정 구체예에서, 가이드 DNA는 RNA 분자(gRNA), DNA 분자, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공될 수 있다.

특정 구체예에서, 가이드 DNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 RNA 분자(gRNA), DNA 분자, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는 이들의 임의의 조합물로서 제공될 수 있다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 CRISPR-Cas9일 수 있다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 절제시킨다.

특정 구체예에서, 시스템은 DNA 이중-가닥 절단(DSB) 복구 시스템을 추가로 포함한다.

특정 구체예에서, DSB 복구 시스템은 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 비-상동성 말단 연결(Non-Homologous End-Joining: NHEJ) 또는 상동성 관련 복구(Homology Directed Repair: HDR)와 조합된 또는 이의 부재하의 복구 주형을 포함하며, 상기 부위는 게놈 돌연변이를 교정하거나 편집한다.

특정 구체예에서, DSB 복구 시스템은 숙주 세포 기계 장치에 의해 제공된다.

특정 구체예에서, 게놈 표적화된 뉴클레아제는 Cas9일 수 있다.

특정 구체예에서, 질병은 각막 이상증 또는 미소부수체 확장 질환일 수 있다.

특정 구체예에서, 안구 영역은 각막일 수 있다.

특정 구체예에서, 가이드 DNA는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 표적화된 게놈 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 표적 게놈 서열은 SEQ ID NO:1-172 및 174-342에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 눈의 표면에 국소 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 각막 또는 공막 상 또는 외부, 안내, 결막하, 테논낭하, 또는 눈뒤 공간, 또는 눈꺼풀 안 또는 주위에 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 이식, 주입, 또는 바이러스에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 가이드 DNA 및 게놈 표적화된 뉴클레아제를 포함하는 치료학적 유효량의 뉴클레아제 시스템을 대상체의 비-안구 조직에 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제는 단백질, RNA, DNA 또는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공된다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 CRISPR-Cas9일 수 있다.

특정 구체예에서, 방법은 DNA 이중-가닥 절단(DSB) 복구 시스템을 추가로 포함한다.

특정 구체예에서, DSB 복구 시스템은 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성 관련 복구(HDR)와 조합된 복구 주형을 포함하며, 상기 부위는 게놈 돌연변이를 교정하거나 편집한다.

특정 구체예에서, 질병은 미소부수체 확장 질환일 수 있다.

특정 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 국소, 혈관내, 피내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 피하, 국부적, 피부경유, 기관내, 복강내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 세정, 주사를 통해 직접적으로, 또는 투여 및 제형화를 통해 경구로 투여된다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만, 단지 예시로서 제공됨이 이해되어야 하는데, 왜냐하면 본 발명의 사상 및 범위 내에 다양한 변경 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하게 될 것이기 때문이다.

도 1은 각 돌연변이와 중첩되는 gRNA 서열 및 각막 이상증의 원인인 것으로 공지된 유전자에서 우성 돌연변이를 파괴하는 이들의 능력을 이용하여, Cas9에 의해 표적가능한 것으로 확인된 2개의 부위를 기술하는 4개의 패널 (A)-(D)를 함유한다. 패널 (A)는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 HEK293 세포에서 TGFBI 엑손 124의 표적화를 묘사한다. 비-상동성 말단 연결에 의한 유전자 변형 %(% 인델(Indel))을 아래에 나타낸다. 패널 (B)는 정량화에 사용된 피크를 나타내는 겔의 이미지 트레이스를 묘사한다. 패널 (C)는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 HEK293 세포에서 TGFBI 엑손 555의 표적화를 묘사한다. 비-상동성 말단 연결에 의한 유전자 변형 %(% 인델)을 아래에 나타낸다. 패널 (D)는 정량화에 사용된 피크를 나타내는 겔의 이미지 트레이스를 묘사한다.
도 2는 TCF4 유전자의 엑손 2 및 엑손 3 사이의 인트론 내부의 표적 서열에 상응하는 gRNA 서열을 사용하여 Cas9에 의해 표적화가능한 것으로서 확인된 부위를 기술하는 3개의 패널 (A)-(C)를 함유한다. 패널 (A)는 푹스 각막 이상증을 초래하는 트리뉴클레오티드 반복 확장의 인트론 서열 다운스트림(표 4)을 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템 6 gRNA를 사용한 HEK293 세포에서 묘사된다. 분자량 사다리는 맨 왼쪽 및 맨 오른쪽 레인에 도시된다. 대조군 레인은 gRNA가 없고 Cas9 형질감염이 없음을 나타낸다. Cas9 레인은 Cas9로의 형질감염을 나타내나 gRNA는 없음을 나타낸다. 화살표는 비-상동성 말단 연결에 의해 생성된 주요 분해 생성물을 나타내며, 비-상동성 말단 연결에 의한 유전자 변형 %는 아래에 나타낸다. 패널 (B)는 정량화에 사용된 피크를 나타내는 겔의 이미지 트레이스를 묘사한다. 패널 (C)는 각 gRNA에 대한 예상된 분해 크기를 묘사한다.
도 3은 TCF4 유전자의 엑손 2 및 엑손 3 사이의 인트론 내부의 표적 서열에 상응하는 gRNA 서열을 사용하여 Cas9에 의해 표적화가능한 것으로서 확인된 부위를 기술하는 3개의 패널 (A)-(C)를 함유한다. 패널 (A)는 푹스 각막 이상증을 초래하는 트리뉴클레오티드 반복 확장의 인트론 서열 업스트림(표 3)을 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템 6 gRNA를 사용한 HEK293 세포에 묘사된다. 분자량 사다리는 맨 오른쪽 레인에 도시된다. 대조군 레인은 gRNA가 없고 Cas9 형질감염이 없음을 나타낸다. 화살표는 비-상동성 말단 연결에 의해 생성된 주요 분해 생성물을 나타내며, 비-상동성 말단 연결에 의한 유전자 변형 %는 아래에 나타낸다. 패널 (B)는 정량화에 사용된 피크를 나타내는 겔의 이미지 트레이스를 묘사한다. 패널 (C)는 각 gRNA에 대한 예상된 분해 크기를 묘사한다.

상세한 설명

눈 질환 예컨대, 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 기술된다. 방법은 뉴클레아제 시스템 예컨대, 게놈 DNA를 절단, 닉킹(nick) 및/또는 복구하기 위해 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat:CRISPR)/CRISPR 관련 (Cas) 9 (CRISPR-Cas9)를 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "안 질환"은 비제한적으로, 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 포함하는 눈의 질환을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "각막 이상증" 또는 "각막 이상증들"은 일반적으로 유전되며, 양측성이며, 대칭성이며, 서서히 진행되며, 대부분 환경 또는 전신적 인자와 관련되지 않은 질환의 군을 기술한다(1,2). 각막 이상증은 (비제한적으로) 하기를 포함한다: 상피 기저막 이상증(일명 맵-도트-핑거프린트 이상증(Map-Dot-Fingerprint Dystrophy), 코간 소낭포 상피 이상증(Cogan Microcystic Epithelial Dystrophy), 앞 기저막 이상증(Anterior Basement Membrane Dystrophy)); 상피 재발성 미란 이상증 (일명, 프란체스쉐티 각막 이상증(Franceschetti Corneal Dystrophy), 이영양증 스몰란디엔시스(Dystrophia Smolandiensis), 이영양증 헬싱란디카(Dystrophia Helsinglandica)); 상피하 점액 각막 이상증(Subepithelial Mucinous Corneal Dystrophy); 메스만 각막 이상증(Meesmann Corneal Dystrophy) (일명 유년기 유전성 상피 이영양증(Juvenile Hereditary Epithelial Dystrophy), 스토커 홀트 이상증(Stocker Holt Dystrophy)); 리쉬 상피성 각막 이상증(Lisch Epithelial Corneal Dystrophy ) (일명, 밴드형 및 와상문 소낭체 이상증); 젤라틴 드롭-형 각막 이상증(Gelatinous Drop-like Corneal Dystrophy )(일명, 상피하 아밀로이드증, (그레이슨(Grayson)의) 원발성 가족성 아밀로이드증(Primary Familial Amyloidosis)); 레이스-버클러스 각막 이상증(Reis-Bucklers Corneal Dystrophy) (일명, 보우만 층의 각막 이상증(Corneal Dystrophy of Bowman layer), 타입 I (CDB I), (와일들(Weidle)의) 지도형 각막 이상증(Geographic Corneal Dystrophy), 비정형 과립 각막 이상증(Atypical granular Corneal Dystrophy), 과립형 각막 이상증(Granular Corneal Dystrophy), 타입 3(Type 3), 앞경계막 이상증(Anterior Limiting Membrane Dystrophy), 타입 1, 표재 과립형 각막 이상증(Superficial Granular Corneal Dystrophy)); 티엘-벵케 각막 이상증(Thiel-Behnke Corneal Dystrophy)(일명, 보우만 층의 각막 이상증(Corneal Dystrophy of Bowman layer), 타입 II(CDB2), 벌집형 각막 이상증(Honeycomb-Shaped Corneal Dystrophy), 앞경계막 이상증, 타입 II, 곱슬 섬유 각막 이상증(Curly Fibers Corneal Dystrophy), 와르덴버그-존커 각막 이상증(Waardenburg-Jonkers Corneal Dystrophy)); 격자형 각막 이상증(Lattice Corneal Dystrophy), 타입 1(클래식)(일명, 비버-하브-딤머 이상증(Biber-Haab-Dimmer Dystrophy)); 격자형 각막 이상증, 타입 2 (일명 가족성 아밀로이드증 (핀란드 타입 또는 겔솔린 타입), 머레토자 증후군(Meretoja Syndrome)); 격자형 각막 이상증, 타입 III; 격자형 각막 이상증, 타입 IIIA; 격자형 각막 이상증, 타입 I/IIIA; 격자형 각막 이상증, 타입 IV; 다형성 (각막) 아밀로이드증; 과립형 각막 이상증, 타입 1(일명 각막 이상증 그뢰노우 타입 I(Corneal Dystrophy Groenouw Type I)); 과립형 각막 이상증, 타입 2(일명, 아벨리노 이상증(Avellino Dystrophy), 조합된 과립형-격자형 이상증(Combined Granular-Lattice Dystrophy)); 황반 각막 이상증(Macular Corneal Dystrophy)(일명 그뢰노우 각막 이상증 타입 II(Groenouw Corneal Dystrophy Type II), 페르 스페클드 이상증(Fehr Speckled Dystrophy)); 슈나이더 각막 이상증(Schnyder Corneal Dystrophy)(일명 슈나이더 결정질 각막 이상증(Schnyder Crystalline Corneal Dystrophy)(SCCD), 슈나이더 결정질 이상증 신 결정(Schnyder Crystalline Dystrophy Sine Crystal), 슈나이더의 유전성 결정질 간질 이상증(Hereditary Crystalline Stromal Dystrophy of Schnyder), 결정질 간질 이상증, 중심 간질 결정질 각막 이상증(Central Stromal Crystalline Corneal Dystrophy), 슈나이더의 각막 결정질 이상증(Corneal Crystalline Dystrophy of Schnyder), 슈나이더 각막 결정질 이상증(Schnyder Corneal Crystalline Dystrophy)); 선천성 기질 각막 이상증(Congenital Stromal Corneal Dystrophy) (일명 선천적 유전성 기질 이상증(Congenital Hereditary Stromal Dystrophy)); 반점 각막 이상증(Fleck Corneal Dystrophy)(일명 프란체스코-니텐스 스페클드(마우세테) 각막 이상증(

)); 후부 무정형 각막 이상증(Posterior Amorphous Corneal Dystrophy) (일명 후부 무정형 기질 이상증(Posterior Amorphous Stromal Dystrophy)); 프랑소와의 중심 혼탁 이상증(Central Cloudy Dystrophy of Francois); 프리-데세멧 각막 이상증(Pre-Descemet Corneal Dystrophy); 푹스 각막 내피 이상증(Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy)(일명 각막 내피 이상증(Endoepithelial Corneal Dystrophy)); 후부 다형 각막 이상증(Posterior Polymorphous Corneal Dystrophy)(일명 후부 다형 이상증(Posterior Polymorphous Dystrophy), 슐리히팅 이상증(Schlichting Dystrophy)); 선천적 유전성 내피 이상증(Congenital Hereditary Endothelial Dystrophy)(일명 마우메네 각막 이상증(Maumenee Corneal Dystrophy)); X-연결된 각막 내피 이상증(X-linked Endothelial Corneal Dystrophy).

상기 질환 모두는 공지된 또는 추정의 유전자 돌연변이에 의해 초래된다. 이제 기술될 각막 이상증은 공지된 또는 추정의 유전자 돌연변이에 의해 초래될 것이다. 따라서, 모든 유전자 각막 이상증은 뉴클레아제 시스템 예컨대, 돌연변이체 대립유전자의 교정 또는 불활성화를 포함하는 유전자 요법을 위한 CRISPR-Cas9으로 처리될 수 있다.

또한, 단연쇄 반복(short tandem repeat)으로 불리는 본원에 사용된 "미소부수체 서열"은 전형적으로 5-50회 범위로 반복되는 짧은 DNA 서열(일반적으로, 2-5개 뉴클레오티드)이다. 이러한 서열은 인간 게놈에 전반에 걸쳐 존재하며, 돌연변이될 수 있고/거나 반복 횟수가 증가될 수 있다. 일부 미소부수체 서열은 이들이 특정 길이를 넘어 확장되는 경우, 미소부수체 확장 질환을 초래할 수 있다. 모든 공지된 또는 이제 기술될 미소부수체 확장 질환은 공지된 또는 추정의 유전자의 확장에 의해 초래될 것이다. 따라서, 모든 미소부수체 확장 질환은 돌연변이체 대립유전자의 교정 또는 불활성화를 포함하는 CRISPR-Cas9 유전자 요법으로 처리될 수 있다.

본원에 사용된 미소부수체 확장 질환은 하기 질환을 (비제한적으로) 포함하는 안구 및 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환을 포함할 수 있다: 눈꺼풀틈새축소, 안검하수 및 거꿀눈구석주름 합지증; 쇄골두개이형성증; 선천성 중추성 과소환기 증후군, 하다드 증후군 DM(근위 이영양증); FRAXA(허약 X 증후군); FRAXE(허약 XE 정신 지체); FRDA(프리드리히 운동 실조증); 푹스 각막 내피 이상증; FXTAS(허약 X- 관련 떨림/운동 실조 증후군); 손-발-생식기 증후군; HD (헌팅턴병); 전뇌기능상실; 성장 호르몬 결핍이 있는 정신 지체; 정신 지체, 간질, 웨스트 증후군, 파팅톤 증후군; 구강인두 근육 이상증; SBMA(척추 및 전구 근 위축); SCA1(척수소뇌성 실조증 타입 1); SCA12(척수소뇌성 실조증 타입 12); SCA17(척수소뇌성 실조증 타입 17); SCA2(척수소뇌성 실조증 타입 2); SCA3(척수소뇌성 실조증 타입 3 또는 마카도-조셉병); SCA6(척수소뇌성 실조증 타입 6); SCA7(척수소뇌성 실조증 타입 7); SCA8(척수소뇌성 실조증 타입 8); 합다지증(Synpolydactyly).

본원에 사용된 바와 같이, 대상체의 "눈", "눈 영역" 또는 "안구 영역"이라는 용어는 각막, 결막, 공막, 와(fovea), 황반, 시신경, 망막, 수정체, 홍채, 동공, 안내, 결막하, 테논낭하, 또는 구후판 공간, 또는 눈꺼풀 안 또는 그 주변 및 눈의 다른 해부학적 특징부를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR))/CRISPR 관련 (CRISPR associated (Cas)) 9 뉴클레아제는 게놈 DNA를 절단하고/거나 복구하기 위한 매우 범용의 정확한 접근법이다(6). CRISPR-Cas9-기반 유전자 편집은 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 초래하는 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 교정시키는데 사용될 수 있으며, 이에 의해 이러한 군의 질환에 대한 유전자 치료법을 제공한다. S. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 자연 발생 CRISPR 시스템은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제에 결합하는 추가의 구조적 RNA 부분 및 20개 뉴클레오티드(nt) 표적 서열로 구성된 단일 가이드 RNA(gRNA)를 사용하도록 변형되었다(6,7). S. 피오게네스로부터의 CRISPR-Cas9 시스템은 5'-NGG-3' 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)에 인접한 임의의 20nt 서열에서 절단할 가능성이 있거나, 대안적인 PAM 서열 및 바이오인포매틱스는 맵 표적 부위에 도구를 제공한다(8,10). Cas9에 의한 DNA 절단은 비-상동성 말단 연결(NHEJ)을 포함하는 내인성 세포 메카니즘에 의해 복구되며, 이는 원래의 돌연변이체 대립유전자를 불활성화시킬 수 있는 삽입 결실 돌연변이를 유도한다. 따라서, CRISPR-Cas9는 단백질 코딩 돌연변이에 충분히 인접하게 가까이 DNA를 절단하여 프레임이동을 통해 이를 불활성화시킴으로써 질환 초래 유전자 돌연변이를 교정할 수 있다. 대안적으로, CRISPR-Cas9는 돌연변이의 양 측면에서 DNA를 절단하여 이를 절제하거나, 간격이 200bp 정도 미만인 경우, 돌연변이 또는 반복부에 측면인접한 상이한 가닥을 닉킹시킴으로써, 또는 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 상동성 관련 복구(HDR)의 사용을 통해 코딩 또는 비-코딩되는 질환 초래 유전자 돌연변이를 교정할 수 있다. 이와 같이, 특이적 돌연변이 서열이 유전자 편집되고 복구될 수 있다.

각막 세포에 적용된 CRISPR-Cas9는 각막 이상증을 초래하는 유전자 결함을 교정할 수 있으며, 따라서 이들 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. CRISPR-Cas9 치료제는 눈 표면으로, 임플란트를 통해 또는 주입을 통해 국소 투여될 수 있다. 이식 또는 주입은 각막, 공막, 안내, 결막하, 테논낭하, 또는 눈뒤 공간, 또는 눈꺼풀 안 또는 주위에서 수행될 수 있다. CRISPR-Cas9는 또한, 푹스 각막 내피 이상증 외에도 다른 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위해 각막 또는 눈 외부에 적용될 수 있다. 각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위한 CRISPR-Cas9 접근법은 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 절제하기 위해 단일 또는 다중 가이드 RNA를 사용할 수 있거나, 유전자 돌연변이를 교정하기 위해 복구 주형을 사용한다. 다른 구체예에서, CRISPR-Cas9 치료는 미소부수체 확장 질환을 초래하는 유전자 결함을 교정하기 위해 비-안구 조직에 적용될 수 있다.

특정 구체예에서, CRISPR-Cas9 처리 투여 경로는 접촉되는 세포 또는 조직의 위치 및 성질에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 혈관내, 피내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 피하, 국부, 피부 경유, 경막내, 복강내, 동맥내, 관내, 종양내, 흡입, 관류, 세정, 직접 주사 및 경구 투여 및 제형화, 또는 하기 투여 경로 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 용어 "전신 투여"는 조성물의 대상체의 순환계로의 도입을 발생시키거나 그렇지 않으면 신체 전반에 걸쳐 이의 확산을 허용하는 방식의 투여를 지칭한다. "부위" 투여는 복강내, 경막내, 경막하와 같은 특정적이고 다소 더욱 제한된 해부학적 공간으로의 투여 또는 특정 기관으로의 투여를 나타낸다. "국부 투여"는 종양 덩어리내로의 종양내 주입, 피하 주입, 피내 또는 근육내 주입과 같은 제한되거나 외피가 있는 해부학적 공간으로의 조성물 또는 약물의 투여를 지칭한다. 당업자는 국부 투여 또는 부위 투여가 또한 조성물의 순환계 내로의 유입을 유도할 수 있음을 즉, 조성물이 전신 내지 한 등급 또는 또 다른 등급이 되게 하는 경향이 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 용어 "혈관내"는 전신, 부위 및/또는 국부 투여의 여부에 상관없이 환자의 혈관 또는 활관들 내로, 혈관 또는 활관들 내부로, 또는 혈관 또는 활관들에를 의미하는 환자의 혈관 내로의 전달을 나타내는 것으로 이해된다. 특정 구체예에서, 투여는 정맥 (정맥내)으로 여겨지는 혈관내로 이루어질 수 있고, 다른 투여는 동맥으로 간주되는 혈관내로 이루어질 수 있다. 정맥은 비제한적으로, 내 경정맥, 말초 정맥, 관상 정맥, 간정맥, 문맥, 위 복재 정맥, 폐 정맥, 상 대정맥, 하 대정맥, 위 정맥, 비 정맥, 하 장간막 정맥, 상 장간막 정맥, 뇌 정맥 및/또는 대퇴 정맥을 포함한다. 동맥은 비제한적으로, 관상 동맥, 폐동맥, 상완 동맥, 내 경동맥, 대동맥 궁, 대퇴 동맥, 말초 동맥 및/또는 섬모 동맥을 포함한다. 전달은 세동맥 또는 모세혈관으로 또는 이를 통해 이루어질 수 있는 것으로 고려된다.

CRISPR-Cas 시스템은 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하는 진핵 세포에서 표적화된 게놈 편집을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 게놈 편집을 용이하게 하기 위해, 변형될 세포는 가이드 RNA 분자 자체, 또는 가이드-RNA 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터와 함께 Cas9를 인코딩하는 발현 벡터 또는 Cas9 단백질, DNA 또는 RNA 자체로 공동-형질감염된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, Cas9의 도입은 단백질, RNA, DNA, 또는 Cas9를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 Cas9에서 형질감염에 의해 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 가이드 DNA 자체는 RNA 분자(gRNA), DNA 분자, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 직접 투여될 수 있다.

많은 다양한 CRISPR-Cas 시스템이 표적화된 게놈 변형을 용이하게 하도록 변형될 수 있는 반면, 표적화된 게놈 변형에서 가장 일반적으로 사용된 CRISPR-Cas 시스템은 S. 피오게네스로부터의 CRISPR-Cas9 시스템이다. CRISPR-Cas9 시스템은 가이드-RNA 분자에 의해 표적화된 부위에서 이중-가닥 DNA 절단을 촉매하는데 단지 단일 단백질 Cas9만을 필요로 한다.

다중 가이드 RNA 서열은 세포 게놈 내부에서 다중 부위의 동시 편집을 용이하게 하는 단일 CRISPR 어레이로 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 가이드 RNA는 중개 서열의 결실을 용이하게 하기 위해 근접하게 위치한 서열을 표적으로 할 수 있다. 일부 구체예에서, Cas9는 코돈-최적화된 서열에 의해 인코딩된다. 코돈-최적화된 플라스미드 및 공학처리된 Cas9 닉카제를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 Cas9를 인코딩하는 플라스미드는 Addgene (http://www.addgene.org/CRISPR/)으로부터 공개적으로 입수가능하다.

CRISPR-Cas 시스템의 표적화된 게놈 공학처리로의 적용에 대한 추가적인 정보는 문헌 [in Jinek et al., Science 337:816-821 (2012); Cho et al., Nature Biotechnology 31:230-232 (2013); Cong et al., Science 339:819-823 (2013); Jinek et al., eLife 2:e00471 (2013); Mali et al., Science 339:823-826 (2013); Qi et al., Cell 152:1173-1183 (2013); Fu et al., Nature Biotechnology 31:822-826 (2013); Fu et al., Nature Biotechnology 31:822-826 (2013); Hsu et al., Nature Biotechnology 31:827-832 (2013); Mali et al., Nature Biotechnology 31:833-838 (2013); Pattanayak et al., Nature Biotechnology 31:839-843 (2013)] 및 WO/2013/142578에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

본원에 제공된 방법의 일부 구체예에서, 표적 핵산 서열은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 변형된다. 일부 구체예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR-Cas9 시스템이다. 일부 구체예에서, 대상체에 Cas9를 인코딩하는 핵산 및 눈의 표적 핵산 서열에 특이적인 가이드-RNA를 인코딩하는 핵산이 투여된다.

일부 구체예에서, 가이드-RNA는 표적-특이적 가이드 서열(예를 들어, 표적 DNA 서열의 서열에 상보적인 서열) 및 가이드-RNA 스캐폴드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적-특이적 가이드 서열이 SEQ ID NO:1-172 및 174-342 중 어느 하나, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된 핵산 서열이다. 표적-특이적 가이드 서열은 SEQ ID NO: 1-172 및 174-342에 제시된 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵산 서열을 포함할 수 있다.

지금 본 발명을 충분히 설명하였으므로, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 다양한 균등한 파라미터, 농도 및 조건 범위 내에서 본 발명이 수행될 수 있음을 알 것이다.

본 설명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떤 식으로는 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예

각막 이상증을 초래하는 것으로 알려진 돌연변이를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 가이드 RNA (gRNA)를 확인하였다(표 1a-1c). 표 1의 gRNA ID에 해당하는 인간 게놈 서열을 표 2에 기록하였다.

TGFBI (형질전환 성장 인자 베타-유도된) 유전자의 돌연변이는 레이스-버클러스 각막 이상증, 티엘-벵케 각막 이상증, 격자형 각막 이상증, 과립형 각막 이상증, 타입 1, 및 과립형 각막 이상증, 타입 2를 포함하는 여러 형태의 각막 이상증을 초래하는 것으로 공지되어 있다(1). 2개의 핫스팟 R124 및 R555에서 미스센스 돌연변이는 TGFBI-관련 각막 이상증의 거의 50%를 차지한다(9).

각막 이상증을 위한 CRISPR-기반 치료의 가능성을 입증하기 위해, TGFBI의 R124 및 R555 둘 모두를 인코딩하는 게놈 서열과 중첩되는 2개의 Cas9 표적화 부위를 확인하였다 - 각각 엑손 4 및 12에 위치한 5'-TCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3' (SEQ ID NO: 145), 및 5'-AGAGAACGGAGCAGACTCTTGGG-3'(SEQ ID NO: 171). 이들 잔기에서 특이적 아미노산 치환은 임상적으로 구별되는 각막 이상증을 초래한다: R124C - 격자형 각막 이상증, 타입 I; R124H - 과립형 각막 이상증, 타입 2; R555W-과립형 각막 이상증, 타입 1; 및 R555Q - 레이스-버클러스 각막 이상증.

2개의 표적 부위를 기술된 바와 같이 pH1v1(Addgene 60244)에서 클로닝하고(8), HEK293 세포를 Cas9 및 가이드 RNA(gRNA) 작제물로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 또는 60시간째에, 게놈 DNA를 수거하고, 표적 절단 부위를 둘러싸는 서열을 부록 A에 열거된 프라이머에 따라 증폭시켰다(하기 참조). 그 후, PCR 생성물을 정제하고 T7 Endo I 검정을 수행하기 전에 정량하였다.

간단하게는, 200ng의 PCR 생성물을 변성시키고, 이어서 헤테로듀플렉스의 형성을 가능하게 하기 위해 서서히 재-어닐링시키고, T7 엔도뉴클레아제 I을 PCR 생성물에 첨가하고 25/30분 동안 37℃에서 인큐베이션하여 헤테로듀플렉스를 절단하였다. 얼음 상에 PCR 생성물을 올려 놓아 반응을 중단시키고, 정제하고, 최종적으로 6% TBE PAGE 겔에서 진행시켜 생성물을 분해하였다. 겔을 Promega로부터의 SYBR-Gold/Diamond Nucleic Acid 염료로 염색하고 시각화하고 ImageJ를 사용하여 정량하였다. 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 빈도를 이항-유도 방정식을 사용하여 계산하였다: 게놈 변형 % =

; 여기에서, "a" 및 "b"의 값은 배경 차분 후 절단된 단편의 통합 영역과 동일하며, "c"는 배경 차분 후 비-절단된 PCR 생성물의 통합된 영역과 동일하다.

결과(도 1)는 모든 확인된 부위가 반복 영역(TCF4)의 5' 또는 3'를 표적으로 하거나 각 돌연변이(TGFB1)와 중첩되는 gRNA 서열을 사용하여 Cas9에 의해 검출가능하였음을 나타낸다. 이들 결과는 각막 이상증에서 원인이 되는 것으로 알려진 유전자에서 우성 돌연변이를 파괴하는 능력을 입증한다.

각막 이상증 및 미소부수체 확장 질환을 치료하기 위한 CRISPR-Cas9 접근법은 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 절제하기 위해 단일 또는 다중 가이드 RNA를 사용할 수 있거나, 유전자 돌연변이를 교정하기 위해 복구 주형 및 상동성 관련 복구를 이용한다. FECD를 초래하는 TCF4 미소부수체 확장의 경우, 미소부수체 확장의 양 쪽의 영역 또는 미소부수체 확장의 한쪽 영역을 표적으로 하는 하나 이상의 gRNA가 사용될 수 있다. 표 3은 FECD를 초래하는 TCF4 미소부수체 확장의 gRNA 표적 서열 업스트림에 대한 ID 및 상응하는 인간 게놈 서열을 보여준다. 표 4는 동일한 TCF4 미소부수체 확장의 gRNA 표적 서열 다운스트림에 대한 ID 및 상응하는 인간 게놈 서열을 보여준다. 이러한 gRNA 또는 TCF4 유전자의 다른 것들은 FECD를 야기하는 미소부수체 확장을 교정하기 위해 어떤 조합으로도 사용될 수 있다. 미소부수체 확장의 양 쪽 영역 또는 미소부수체 확장의 한쪽 영역을 표적으로 하는 하나 이상의 gRNA를 사용하는 유사한 접근법이 표 5에 기록된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 미소부수체 확장 질환에 사용될 수 있다.

부록 A

표 1a: 각막에 영향을 미치며 gRNA 표적 서열과 중첩되는 알려진 유전자 돌연변이(ID) 및 유전자(들).

표 1b: 각막에 영향을 미치며 gRNA 표적 서열과 중첩되는 알려진 유전자 돌연변이(ID) 및 질병(들).

표 1c: 각막에 영향을 미치며 gRNA 표적 서열과 중첩되는 알려진 유전자 돌연변이(ID) 및 gRNA(들).

표 2: 표 1의 gRNA 표적 서열(ID) 및 상응하는 인간 게놈 서열

표 3: 푹스 각막 내피 이상증을 초래하는 미소부수체 확장의 TCF4 유전자 업스트림에서 gRNA 표적 서열(ID) 및 인간 게놈 서열.

표 4: 푹스 각막 내피 이상증을 초래하는 미소부수체 확장의 TCF4 유전자 다운스트림에서 gRNA 표적 서열(ID) 및 인간 게놈 서열.

표 5: 괄호 안의 영향을 받은 유전자(들)를 갖는 미소부수체 확장 질환/질병.

참고 문헌

등가물

당업자는 관례적인 실험만을 이용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 특정 구체예가 논의된 반면, 상기 명세서는 예시적이고 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형이 본 명세서의 숙지 시 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 그 균등물의 전체 범위와 함께 청구범위, 및 이러한 변형과 함께 명세서를 참조로 하여 결정되어야 한다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY <120> CRISPR/CAS9-BASED TREATMENTS <130> JHV-151.25 <140> PCT/US2016/040962 <141> 2016-07-05 <150> 62/188,013 <151> 2015-07-02 <160> 374 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagtgatgac aggacacttg tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tggattcaag tacgtggctc tgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcctgtcatc actctttttg tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tctggctcct ttctctacac agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggctcctttc tctacacagg agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggctcctttc tctacacagg agg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gttggaatgg agaatggcct cgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tctacacagg aggtaagatt tgg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tctacacagg aggtaagatt tgg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggctcctttc tctacacagg agg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cttacctcct gtgtagagaa agg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tctctggatt ttctggccgc agg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gattttctgg ccgcaggaat tgg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 aggaattgga ttcaagtacg tgg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gtaagtgttg accaaattac cgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 acccgaataa gaagcctttt tgg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aggaattgga ttcaagtacg tgg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tctccattcc aacaacacca ggg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggattcaagt acgtggctct ggg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tgtagagaaa ggagccagac agg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gtacttgaat ccaattcctg cgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ttctccattc caacaacacc agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tctccattcc aacaacacca ggg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ttccaacaac accagggaca tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ccagggacat ggagtccgac cgg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ggtgttgttg gaatggagaa tgg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagggacatg gagtccgacc ggg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ggacatggag tccgaccggg agg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ctttttgtgg tcaatgccct tgg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 accacaaaaa gagtgatgac agg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 tgtccctggt gttgttggaa tgg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ctccatgtcc ctggtgttgt tgg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 ctccatgtcc ctggtgttgt tgg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 tgtagagaaa ggagccagac agg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ccggtcggac tccatgtccc tgg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ccaagtcacc tttctgcccc agg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 caagtcacct ttctgcccca ggg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 caagtcacct ttctgcccca ggg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gcaaacgatt ctgattcccc agg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 aaggtgactt ggggctccct ggg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 aaaggtgact tggggctccc tgg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 cccagggctc ctgccacccc tgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tggggcagaa aggtgacttg ggg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 ctggggcaga aaggtgactt ggg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cctggggcag aaaggtgact tgg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gcaggagccc tggggcagaa agg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 caggggtggc aggagccctg ggg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 ccaggggtgg caggagccct ggg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ttggggctcc ctgggcagcc tgg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 agggaatgct aagaactgct ggg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gaatgctaag aactgctggg agg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 aacgattctg attccccagg tgg 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 gagtaggtgt atgccacctg ggg 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 tgagtaggtg tatgccacct ggg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 aagggaatgc taagaactgc tgg 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 ctctccatgc tgctcggcct cgg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 atgctgctcg gcctcggcaa tgg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ggccgagcag catggagaga tgg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 attgccgagg ccgagcagca tgg 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 ctccgccagc tcccccagag tgg 23 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 tccgccagct cccccagagt ggg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 ggagctggcg gaggggccta tgg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ctctggggga gctggcggag ggg 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 actctggggg agctggcgga ggg 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 cactctgggg gagctggcgg agg 23 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gcccactctg ggggagctgg cgg 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gtggcccact ctgggggagc tgg 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 agctgtgtgg cccactctgg ggg 23 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ggccatctct ccatgctgct cgg 23 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 gcctttttgg tgttgtgtcc agg 23 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 tttttggtgt tgtgtccagg tgg 23 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 tttttggtgt tgtgtccagg tgg 23 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 gcctttttgg tgttgtgtcc agg 23 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 ttttggtgtt gtgtccaggt ggg 23 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 accaaaaagg cttcttattc ggg 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 caccaaaaag gcttcttatt cgg 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 caccaaaaag gcttcttatt cgg 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 tttttggtgt tgtgtccagg tgg 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 acctggacac aacaccaaaa agg 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 tcaagtgact tctgcccacc tgg 23 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 acccgaataa gaagcctttt tgg 23 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 tcaagtgact tctgcccacc tgg 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gagttcactg agtcactgtc ggg 23 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 cttgggcctc cccgtccagc agg 23 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 gggcctcccc gtccagcagg cgg 23 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 cctccccgtc cagcaggcgg cgg 23 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 cccgtccagc aggcggcggt agg 23 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 ctgctggacg gggaggccca agg 23 <210> 89 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ccgccgcctg ctggacgggg agg 23 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 ctaccgccgc ctgctggacg ggg 23 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 cctaccgccg cctgctggac ggg 23 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 acctaccgcc gcctgctgga cgg 23 <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 tctcaatctc cagctccagg cgg 23 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ctcaatctcc agctccaggc ggg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 aggtctcaat ctccagctcc agg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 ctcaatctcc agctccaggc ggg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 ctagagctcg caccttatcc agg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 tgagacctac cgccgcctgc tgg 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 cctccccgtc cagcaggcgg cgg 23 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 tgagacctac cgccgcctgc tgg 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 aggtctcaat ctccagctcc agg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 tgagacctac cgccgcctgc tgg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ctaccgccgc ctgctggacg ggg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 tgagacctac cgccgcctgc tgg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 tgatagatta gcttcctacc tgg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 tgatagatta gcttcctacc tgg 23 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 taaggtgcga gctctagaag agg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 ctagagctcg caccttatcc agg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 agctcgcacc ttatccaggt agg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 agctcgcacc ttatccaggt agg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 attagcttcc tacctggata agg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 attagcttcc tacctggata agg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 tgatagatta gcttcctacc tgg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 ctaccgccgc ctgctggacg ggg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 tgatagatta gcttcctacc tgg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 tgatagatta gcttcctacc tgg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 tgctggacgg ggaggcccaa ggg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 cactctgcga ggagagccgc cgg 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 actctgcgag gagagccgcc ggg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 ggagagccgc cgggacagtc cgg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gagagccgcc gggacagtcc ggg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 agagccgccg ggacagtccg ggg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 gagccgccgg gacagtccgg ggg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 gcacccccgg actgtcccgg cgg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 tgcgcacccc cggactgtcc cgg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 tgcgcacccc cggactgtcc cgg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 ggagagccgc cgggacagtc cgg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 tcactctcag tgcgcacccc cgg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 taaggtgcga gctctagaag agg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 cagtgactca gtgaactccg tgg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 gactcagtga actccgtgga agg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 gcaaaagcaa tgatggagct ggg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 ggagttcact gagtcactgt cgg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gatgaccaac aagatgcttt agg 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 catcttgttg gtcatccaca ggg 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 gcatcttgtt ggtcatccac agg 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 cgctgcctaa agcatcttgt tgg 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 ggaggaagaa acagctgctc agg 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 gaggaagaaa cagctgctca ggg 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 atggaagaga aactcatgat cgg 23 <210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 ccatcattgc ttttgctctc agg 23 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 agcaaaagca atgatggagc tgg 23 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 cctgagagca aaagcaatga tgg 23 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 tgttggtcat ccacagggag tgg 23 <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 tcagctgtac acggaccgca cgg 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 cggaccgcac ggagaagctg agg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 caggcctcag cttctccgtg cgg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 gcggtccgtg tacagctgag tgg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 caggcctcag cttctccgtg cgg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 gttctcttgg tggcagggct cgg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 caggcctcag cttctccgtg cgg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 cctgacatca tggccacaaa tgg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 cgggtgctga cccccccaat ggg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 gggtgctgac ccccccaatg ggg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 155 ccccccaatg gggactgtca tgg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 ccattggggg ggtcagcacc cgg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157 actgtcatgg atgtcctgaa ggg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 158 catgacagtc cccattgggg ggg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 159 ccatgacagt ccccattggg ggg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 tccatgacag tccccattgg ggg 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 atccatgaca gtccccattg ggg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 catccatgac agtccccatt ggg 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 acatccatga cagtccccat tgg 23 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 taaagcgatt gtctcccttc agg 23 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165 agactgtgta gactccttcc cgg 23 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 gcggtccgtg tacagctgag tgg 23 <210> 167 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 gagccctgcc accaagagaa cgg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 ggctcggaag gcttcatttg tgg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 gcggtccgtg tacagctgag tgg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 aagagaacgg agcagactct tgg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 agagaacgga gcagactctt ggg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 ccgggtgctg acccccccaa tgg 23 <210> 173 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc cctcagctgt acacggaccg cag 53 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 gctcggaagg cttcatttgt ggg 23 <210> 175 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 gctccgttct cttggtggca ggg 23 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 tgctccgttc tcttggtggc agg 23 <210> 177 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 177 agtctgctcc gttctcttgg tgg 23 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 178 aagagtctgc tccgttctct tgg 23 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 179 catcatggcc acaaatggcg tgg 23 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 180 ccatttgtgg ccatgatgtc agg 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 181 gacatggacc acgccatttg tgg 23 <210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 182 gcggtccgtg tacagctgag tgg 23 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 183 ttttctttca ggcttcccag agg 23 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 184 ttttctttca ggcttcccag agg 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 185 gactgtcatg gatgtcctga agg 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 186 acctagtcgc acagacctct ggg 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 187 aggaggaaaa gcaaacaact ggg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 188 ggaaaagcaa acaactggga agg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 189 aaagcaaaca actgggaagg agg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 190 acaactggga aggaggtatc cgg 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 caactgggaa ggaggtatcc ggg 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 tggggcagaa aggtgacttg ggg 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 193 ttaagtaggc gttgcagtaa tgg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 taggaggaaa agcaaacaac tgg 23 <210> 195 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 195 aaagagcccc acttggaagg cgg 23 <210> 196 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 196 gccccacttg gaaggcggtt tgg 23 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 197 gattttattt gtgtgttttg tgg 23 <210> 198 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 198 tccaaaccgc cttccaagtg ggg 23 <210> 199 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 199 atccaaaccg ccttccaagt ggg 23 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 200 aatccaaacc gccttccaag tgg 23 <210> 201 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 201 catcttacac caaactcatc tgg 23 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 202 tttttaatgc cagatgagtt tgg 23 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 203 attcattctc ctgacatgtc tgg 23 <210> 204 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 204 ttcattctcc tgacatgtct ggg 23 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 205 ctcctgacat gtctgggact tgg 23 <210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> Homo 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23 <210> 310 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 310 aatcctatac gagatggaaa tgg 23 <210> 311 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 311 caggcaaatc ctatacgaga tgg 23 <210> 312 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 312 tatttgggtt cacatatgac agg 23 <210> 313 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 313 tggcactttt atttttattt ggg 23 <210> 314 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 314 gtggcacttt tatttttatt tgg 23 <210> 315 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 315 attctcattt cgtctctaac agg 23 <210> 316 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 316 aaatgagaat ttagtgcagg tgg 23 <210> 317 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 317 acgaaatgag aatttagtgc agg 23 <210> 318 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 318 gcatttattt cgaccctaat tgg 23 <210> 319 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 319 ctcttcttcg acgtatctag tgg 23 <210> 320 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 320 aagaagaggg aaaccaatta ggg 23 <210> 321 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 321 gaagaagagg gaaaccaatt agg 23 <210> 322 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 322 actagatacg tcgaagaaga ggg 23 <210> 323 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 323 cactagatac gtcgaagaag agg 23 <210> 324 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 324 tcagagcctg caaaaagcaa agg 23 <210> 325 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 325 gcaaaaagca aaggaacgaa tgg 23 <210> 326 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 326 tgcaggctct gactcaggga agg 23 <210> 327 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 327 tttttgcagg ctctgactca ggg 23 <210> 328 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 328 ctttttgcag gctctgactc agg 23 <210> 329 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 329 ttcgttcctt tgctttttgc agg 23 <210> 330 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 330 agaaagtgca acaagcagaa agg 23 <210> 331 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 331 gaaagtgcaa caagcagaaa ggg 23 <210> 332 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 332 aaagtgcaac aagcagaaag ggg 23 <210> 333 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 333 aagtgcaaca agcagaaagg ggg 23 <210> 334 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 334 ggctgcaaag ctgcctgcct agg 23 <210> 335 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 335 gctgcaaagc tgcctgccta ggg 23 <210> 336 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 336 ctgcctaggg ctacgtttcc tgg 23 <210> 337 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 337 caggaaacgt agccctaggc agg 23 <210> 338 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 338 ttgccaggaa acgtagccct agg 23 <210> 339 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 339 aaagccattt ctccaaaaga agg 23 <210> 340 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 340 tggctttcgg aagttttgcc agg 23 <210> 341 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 341 tcttttggag aaatggcttt cgg 23 <210> 342 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 342 tagaccttct tttggagaaa tgg 23 <210> 343 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 343 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaactgcggt ccgtgtacag ctgagg 56 <210> 344 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 344 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccagagaacg gagcagactc ttg 53 <210> 345 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 345 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacaagagt ctgctccgtt ctctgg 56 <210> 346 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 346 ccacctgtag atgtaccgtg ctctc 25 <210> 347 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 347 aggggctgca gactctgtgt ttaag 25 <210> 348 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 348 aaggaaaata cctctcagcg tggtg 25 <210> 349 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 349 aggcctaggg gtagtaaagg cttcc 25 <210> 350 <211> 588 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 350 ccacctgtag atgtaccgtg ctctctgtca gagaagggag ggtgtggttg ggctggaccc 60 ccagaggcca tccctccttc tgtcttctgc tcctgcagcc ctaccactct caaaccttta 120 cgagaccctg ggagtcgttg gatccaccac cactcagctg tacacggacc gcacggagaa 180 gctgaggcct gagatggagg ggcccggcag cttcaccatc ttcgccccta gcaacgaggc 240 ctgggcctcc ttgccagctg tgagatgacc tccgtctgcc cgggggactc ttatggggaa 300 ctgccttact tccccgaggg gtgggcatga tgaatgggag tctgcagtca tttcctactg 360 tttcaggaag ctttctcctt aaccccttag aaaaggctgt ggaacttgag ctaaaatatg 420 tcttaccagg ttgcgtctaa tgccccccgt tccctactgg gcagaaagac ttgggtgctt 480 cctgaggagg gatccttggc agaagagagg cctgggctca cgagggctga gaacatgttt 540 cccagagttg caaggaccca tctcttaaac acagagtctg cagcccct 588 <210> 351 <211> 424 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 351 aaggaaaata cctctcagcg tggtgaggta tttaaggaaa atacctgttg acaggtgaca 60 ttttctgtgt gtgtatctac agcatgctgg tagctgccat ccagtctgca ggactgacgg 120 agaccctcaa ccgggaagga gtctacacag tctttgctcc cacaaatgaa gccttccgag 180 ccctgccacc aagagaacgg agcagactct tgggtaaaga ccaacttaag tacacgtctc 240 catttttcta aagtagtgat ccctcagggc cccagcagca aacagttggc acatcaagga 300 ttgacttgaa gggattttat gacaagacta ttagtgaaag agtgggcggg actaaaggaa 360 ctagcaaagg atgaggccaa ccagggacta gcaaccctgg gaagccttta ctacccctag 420 gcct 424 <210> 352 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 352 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccttgccagg aaacgtagcc ctg 53 <210> 353 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 353 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacagggct acgtttcctg gcaag 55 <210> 354 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 354 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc cccaggaaac gtagccctag gcg 53 <210> 355 <211> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 360 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccggctgcaa agctgcctgc ctg 53 <210> 361 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 361 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacaggcag gcagctttgc agccg 55 <210> 362 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 362 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccaagtgcaa caagcagaaa ggg 53 <210> 363 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 363 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaaccctttc tgcttgttgc acttg 55 <210> 364 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 364 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccaaagagcc ccacttggaa ggg 53 <210> 365 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 365 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacccttcc aagtggggct ctttg 55 <210> 366 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 366 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccgccccact tggaaggcgg ttg 53 <210> 367 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 367 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacaaccgc cttccaagtg gggcg 55 <210> 368 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 368 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc cctccaaacc gccttccaag tgg 53 <210> 369 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 369 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaaccacttg gaaggcggtt tggag 55 <210> 370 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 370 cttataagtt ctgtatgaga ccactttttc ccatccaaac cgccttccaa gtg 53 <210> 371 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 371 ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacacttgg aaggcggttt ggatg 55 <210> 372 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 372 tgctttggat tggtaggacc tgttc 25 <210> 373 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 373 ggataatgca caccttccct gagtc 25 <210> 374 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 374 tgctttggat tggtaggacc tgttccttac atcttacctc ctagttacat cttttcctag 60 gattcttaaa actagtatgg atatgctgag catacattct ttagaacctt ttggactgtt 120 ttggtaaatt tcgtagtcgt aggatcagca caaagcggaa cttgacacac ttgtggagtt 180 ttacggctgt acttggtcct tctccatccc tttgcttcct tttcctaaac caagtcccag 240 acatgtcagg agaatgaatt catttttaat gccagatgag tttggtgtaa gatgcatttg 300 taaagcaaaa taaaaagaat ccacaaaaca cacaaataaa atccaaaccg ccttccaagt 360 ggggctcttt catgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc 420 tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctcc tcctcctcct cctccttctc ctcctcctcc 480 tcctcttcta gaccttcttt tggagaaatg gctttcggaa gttttgccag gaaacgtagc 540 cctaggcagg cagctttgca gccccctttc tgcttgttgc actttctcca ttcgttcctt 600 tgctttttgc aggctctgac tcagggaagg tgtgcattat cc 642

Claims

대상체에서 안구 조직에 영향을 미치는 질환을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 가이드 DNA 및 게놈 표적화된 뉴클레아제를 포함하는 치료학적 유효량의 뉴클레아제 시스템을 대상체의 안구 영역에 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제가 단백질, RNA, DNA 또는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공되는 방법.
제1항에 있어서, 가이드 DNA가 RNA 분자(gRNA), DNA 분자, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공되는 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 CRISPR-Cas9인 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 절제하는 방법.
제1항에 있어서, DNA 이중-가닥 절단(DSB) 복구 시스템을 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, DSB 복구 시스템이 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 비-상동성 말단 연결(Non-Homologous End-Joining: NHEJ) 또는 상동성 관련 복구(Homology Directed Repair: HDR)와 조합된 또는 이의 부재하에 복구 주형을 포함하며, 상기 부위는 게놈 돌연변이를 교정하거나 편집하는 방법.
제1항에 있어서, 게놈 표적화된 뉴클레아제가 Cas9인 방법.
제1항에 있어서, 질환이 각막 이상증 또는 미소부수체 확장 질환인 방법.
제1항에 있어서, 안구 영역이 각막인 방법.
제1항에 있어서, 가이드 DNA가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 표적 게놈 서열이 SEQ ID NO:1-172 및 174-342에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 각막 이상증이 상피 기저막 이상증(Epithelial Basement Membrane Dystrophy), 상피 재발성 미란 이상증(Epithelial Recurrent Erosion Dystrophy), 상피하 점액 각막 이상증(Subepithelial Mucinous Corneal Dystrophy), 메스만 각막 이상증(Meesmann Corneal Dystrophy), 리쉬 상피성 각막 이상증(Lisch Epithelial Corneal Dystrophy), 젤라틴 드롭-형 각막 이상증(Gelatinous Drop-like Corneal Dystrophy), 레이스-버클러스 각막 이상증(Reis-Bucklers Corneal Dystrophy), 티엘-벵케 각막 이상증(Thiel-Behnke Corneal Dystrophy), 격자형 각막 이상증(Lattice Corneal Dystrophy), 타입 1(클래식), 격자형 각막 이상증, 타입 2, 격자형 각막 이상증, 타입 III, 격자형 각막 이상증, 타입 IIIA, 격자형 각막 이상증, 타입 I/IIIA, 격자형 각막 이상증, 타입 IV, 다형성 (각막) 아밀로이드증(Polymorphic (Corneal) Amyloidosis), 과립형 각막 이상증, 타입 1, 과립형 각막 이상증, 타입 2, 황반 각막 이상증(Macular Corneal Dystrophy), 슈나이더 각막 이상증(Schnyder Corneal Dystrophy), 선천성 기질 각막 이상증(Congenital Stromal Corneal Dystrophy), 반점 각막 이상증(Fleck Corneal Dystrophy), 후부 무정형 각막 이상증(Posterior Amorphous Corneal Dystrophy), 프랑소와의 중심 혼탁 이상증(Central Cloudy Dystrophy of Francois), 프리-데세멧 각막 이상증(Pre-Descemet Corneal Dystrophy), 푹스 각막 내피 이상증(Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy), 후부 다형 각막 이상증(Posterior Polymorphous Corneal Dystrophy), 선천적 유전성 내피 이상증(Congenital Hereditary Endothelial Dystrophy), 및 X-연결된 각막 내피 이상증(X-linked Endothelial Corneal Dystrophy)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 미소부수체 확장 질환이 눈꺼풀틈새축소(Blepharophimosis), 안검하수(ptosis) 및 거꿀눈구석주름 합지증(epicanthus inversus syndactyly), 쇄골두개이형성증(Cleidocranial dysplasia), 선천성 중추성 과소환기 증후군(Congenital central hypoventilation syndrome), 하다드 증후군(Haddad syndrome) DM (근위 이영양증(Myotonic dystrophy)), FRAXA (허약 X 증후군(Fragile X syndrome)), FRAXE (허약 XE 정신 지체(Fragile XE mental retardation)), FRDA (프리드리히 운동 실조증(Friedreich's ataxia)), 푹스 각막 내피 이상증(Fuchs' Endothelial Corneal Dystrophy), FXTAS (허약 X- 관련 떨림/운동 실조 증후군(Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome)), 손-발-생식기 증후군(Hand-foot-genital syndrome), HD (헌팅턴병(Huntington's disease)), 전뇌기능상실(Holoprosencephaly), 성장 호르몬 결핍이 있는 정신 지체(Mental retardation with growth hormone deficiency), 정신 지체, 간질, 웨스트 증후군(West syndrome), 파팅톤 증후군(Partington syndrome), 구강인두 근육 이상증(Oculopharyngeal muscular dystrophy), SBMA(척추 및 전구 근 위축(Spinal and bulbar muscular atrophy)), SCA1 (척수소뇌성 실조증(Spinocerebellar ataxia) 타입 1), SCA12 (척수소뇌성 실조증 타입 12), SCA17 (척수소뇌성 실조증 타입 17), SCA2 (척수소뇌성 실조증 타입 2), SCA3 (척수소뇌성 실조증 타입 3 또는 마카도-조셉병(Machado-Joseph disease)), SCA6 (척수소뇌성 실조증 타입 6), SCA7 (척수소뇌성 실조증 타입 7), SCA8 (척수소뇌성 실조증 타입 8), 합다지증(Synpolydactyly)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 눈의 표면으로 국소 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 각막 또는 공막 상 또는 외부, 안내, 결막하, 테논낭하, 또는 눈뒤 공간, 또는 눈꺼풀 안 또는 둘레에 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 이식, 주입, 또는 바이러스에 의해 투여되는 방법.
대상체에서 비-안구 조직에 영향을 미치는 질환을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 가이드 DNA 및 게놈 표적화된 뉴클레아제를 포함하는 치료학적 유효량의 뉴클레아제 시스템을 대상체의 비-안구 조직에 투여하는 것을 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 뉴클레아제가 단백질, RNA, DNA 또는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공되는 방법.
제18항에 있어서, 가이드 DNA가 RNA 분자(gRNA), DNA 분자, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로서 제공되는 방법.
제18항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 CRISPR-Cas9인 방법.
제18항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 유전자 돌연변이를 불활성화시키거나 절제하는 방법.
제18항에 있어서, DNA 이중-가닥 절단(DSB) 복구 시스템을 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, DSB 복구 시스템이 하나 이상의 CRISPR-Cas9 절단 부위를 표적으로 하는 비-상동성 말단 연결(Non-Homologous End-Joining: NHEJ) 또는 상동성 관련 복구(Homology Directed Repair: HDR)와 조합된 복구 주형을 포함하며, 상기 부위는 게놈 돌연변이를 교정하거나 편집하는 방법.
제18항에 있어서, 게놈 표적화된 뉴클레아제가 Cas9인 방법.
제18항에 있어서, 질환이 미소부수체 확장 질환인 방법.
제18항에 있어서, 가이드 DNA가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 표적화된 게놈 서열을 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 표적 게놈 서열이 SEQ ID NO:1-172 및 174-342에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 방법.
제26항에 있어서, 미소부수체 확장 질환이 눈꺼풀틈새축소, 안검하수 및 거꿀눈구석주름 합지증, 쇄골두개이형성증, 선천성 중추성 과소환기 증후군, 하다드 증후군 DM (근위 이영양증), FRAXA (허약 X 증후군), FRAXE (허약 XE 정신 지체), FRDA (프리드리히 운동 실조증), 푹스 각막 내피 이상증, FXTAS (허약 X- 관련 떨림/운동 실조 증후군), 손-발-생식기 증후군, HD (헌팅턴병), 전뇌기능상실, 성장 호르몬 결핍이 있는 정신 지체, 정신 지체, 간질, 웨스트 증후군, 파팅톤 증후군, 구강인두 근육 이상증, SBMA(척추 및 전구 근 위축), SCA1 (척수소뇌성 실조증 타입 1), SCA12 (척수소뇌성 실조증 타입 12), SCA17 (척수소뇌성 실조증 타입 17), SCA2 (척수소뇌성 실조증 타입 2), SCA3 (척수소뇌성 실조증 타입 3 또는 마카도-조셉병), SCA6 (척수소뇌성 실조증 타입 6), SCA7 (척수소뇌성 실조증 타입 7), SCA8 (척수소뇌성 실조증 타입 8), 합다지증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제18항에 있어서, 뉴클레아제 시스템이 국소, 혈관내, 피내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 피하, 국부적, 피부경유, 기관내, 복강내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 세정(lavagely), 주사를 통해 직접적으로, 또는 투여 및 제형화를 통해 경구로 투여되는 방법.