KR20200044235A - CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법 및 이의 용도 - Google Patents

CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난분해성 물질 분해효소의 유전자 기능 구명을 위한 기반 기술로서 뿐만 아니라 외래 유전자의 도입 없이도 목재부후균의 일종인 표고버섯을 포함하는 다양한 식용버섯의 육종에 적용될 수 있어, 활용 가치가 높은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법, 및 이를 도입하여 식용버섯을 육종하는 방법에 관한 것이다.

Description

CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법 및 이의 용도{Method of gene editing of lignin degrading enzymes from Phanerocheate chrysosporium by CRISPR-Cas9 system and use of the same}
본 발명은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 난분해성 물질 분해효소의 유전자 기능 구명을 위한 기반 기술로서 뿐만 아니라 외래 유전자의 도입 없이도 목재부후균의 일종인 표고버섯을 포함하는 다양한 식용버섯의 육종에 적용될 수 있어, 활용 가치가 높은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법, 및 이를 도입하여 식용버섯을 육종하는 방법에 관한 것이다.
유색고약버섯(Phanerocheate chrysosporium)은 구멍장이버섯목(Polyporales), 유색고약버섯과(Phanerochaetaceae), 유색고약버섯속(Phanerochaete)에 속하는 목재부후균으로서, 자실체의 형태는 배착성이고, 소형에서 차츰 합류하여 넓게 확산하며, 견고하게 부착하고, 황백색을 띄고 있으며, 자실층의 표면은 거의 평탄하고, 그 주변부는 보통 불명확한 특징을 가지고 있다.
유색고약버섯은 리그닌 분해효소 시스템(manganese peroxidase, lignin peroxidase, multi-copper oxidase)에 의해 목재 내의 난분해성 물질인 리그닌을 효과적으로 분해한다(비특허문헌1, 비특허문헌 2).
이러한 리그닌 분해 기능을 강화하는 방법으로 리그닌 분해효소의 유전자를 조절하여 효소의 활성을 높게 할 수 있다. 최근에 동물 세포 중심으로 CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 조작이 제한되어 있는 진핵생물에서 외래 유전자의 도입 없이 효과적으로 유전자 조작이 가능하게 되었다(비특허문헌 3).
한편, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 특허문헌으로는 CRISPR-Cas9 기반 치료(특허문헌 1), CRISPR 하이브리드 DNA/RNA 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법(특허문헌 2), CRISPR-CAS 매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드(특허문헌 3) 등이 개시되어 있으나, CRISPR-Cas9 시스템을 유색고약버섯 리그닌 분해효소의 유전자 편집에 이용한 예는 아직 알려져 있지 않은 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2018-0041120호 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0126875호 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0134649호
Pollegioni L, Tonin F, Rosini E. (2015). Lignin-degrading enzymes. FEBS journal 282, 1190-1213. Hong CY, Ryu SH, Jeong H, Lee SS, Kim M, Choi IG (2018). Phanerochaete chrysosporium multienzyme catabolic system for in vivo modification of synthetic lignin to succinic acid. ACS chemical biology 12(7), 1749-1759. Chu VT, Weber T, Wefers B, Wurst W, Sander S, Rajewsky, K, Kuhn, R. (2015). Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature Biotechnology 33, 543-548.
본 발명자들은 유색고약버섯의 균사로부터 원형질체를 분리하고, 여기에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용하여 제작된 리그닌 분해효소 유전자의 가이드 RNA(guide RNA)와 Cas9 단백질을 삽입함으로써, 유전자 편집을 할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 난분해성 물질 분해효소의 유전자 기능 구명을 위한 기반 기술로서 뿐만 아니라 외래 유전자의 도입 없이도 목재부후균의 일종인 표고버섯을 포함하는 다양한 식용버섯의 육종에 적용될 수 있어, 활용 가치가 높은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 유색고약버섯(Phanerocheate chrysosporium)의 원형질을 분리하는 단계, (b) 상기 분리된 유색고약버섯의 원형질 내로 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 삽입하는 단계, 및 (c) 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집을 확인하는 단계를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 유색고약버섯의 pclip1 및 pcmco1 중에서 선택되는 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 (b) 단계가 상기 분리된 원형질 100 ㎕에 cas9 단백질 20 ㎍, 각각의 sgRNA 35 ㎍, 100 mM 헤파린, 250 mM 스퍼미딘(spermidine) 및 100 mM 오린트리카복실산(aurintricarboxylic acid)을 섞은 후, 얼음에서 30분 동안 방치한 다음, 폴리에틸렌글리콜 용액 0.5 ㎖를 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 폴리에틸렌글리콜 용액이 40%(w/v) 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 40%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 3350, 10 mM CaCl2 및 10mM 트리스(Tris)로 이루어지고, 상기 용액의 pH가 7.5인 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 (c) 단계가 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 삽입된 원형질을 배양하여 형성된 균사체로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 DNA 크기의 변화를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머가 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 pcmco1 프라이머쌍, 및 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 LIP 프라이머쌍 중에서 선택되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 유전자 편집방법을 도입하여 식용버섯을 육종하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 식용버섯이 목재부후균 유래인 것을 특징으로 하는 식용버섯을 육종하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 식용버섯이 표고버섯을 포함하는 것을 특징으로 하는 식용버섯을 육종하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 유전자 편집방법은 난분해성 물질 분해효소의 유전자 기능 구명을 위한 기반 기술로서 뿐만 아니라, 외래 유전자의 도입 없이도 목재부후균의 일종인 표고버섯을 포함하는 다양한 식용버섯의 육종에 적용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 In vitro 에서 pclip1 sgRNA의 유색고약버섯 게놈 유전자 편집 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 In vitro 에서 pcmco1 sgRNA의 유색고약버섯 게놈 유전자 편집 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 유색고약버섯의 원형질을 나타낸 것이다.
도 4a는 pcmco1 유전자의 유전자 편집을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 pclip1 유전자의 유전자 편집을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> Single guide RNA 제작 및 In vitro 유색고약버섯 게놈 유전자 편집
유색고약버섯의 pclip1과 pcmco1의 전체 염기서열에서 sgRNA(single guide RNA)와 Cas9 단백질을 ㈜툴젠에 의뢰하여 제작하고 유색고약버섯의 게놈 유전자를 이용하여 in vitro 상의 게놈 유전자 편집을 조사하였다.
유전자 편집 결과는 sgRNA의 염기서열이 포함된 pclip1과 pcmco1의 프라이머쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행한 후 산물을 전기영동하여 확인하였는데, 상기 PCR은 95℃ 3분, (94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분) 30 싸이클, 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다.
하기 표 1은 유색고약버섯의 게놈 유전자 편집에 사용한 sgRNA 및 primer 염기서열을 나타낸 것이다.
유전자 sgRNA명 sgRNA 염기서열 PCR 프라이머 염기서열
pclip1 pclip1_sg1 GGCGCGCTTCTCCTTGACCACGG (서열 1) F-CGCTTCTGCATGCTGTGATA
(서열 9)
R-TCGTCGAAGATCATGATGGA
(서열 10)
pclip1_sg2 GGCGCGCTTCTCCTTGACCACGG (서열 2)
pclip1_sg3 ATCCAGCAGAACCTGTTCCAAGG (서열 3)
pclip1_sg4 CGTGGGCCTCAGCGCCGCACTGG (서열 4)
pcmco1 pcmco1_sg1 CTCGGGACCGCCTGTCGTCCAGG (서열 5) F-GTTGGTGCTGCTCCTAGCTC
(서열 11)
R-ATACGGTGTGGCGCTCTTAG
(서열 12)
pcmco1_sg2 AGTTGTCCATTGAGGGCACCTGG (서열 6)
pcmco1_sg3 TCGGACCTGAGGCGGTTGGCCGG (서열 7)
pcmco1_sg4 GAAATGCTGGGTGCGCCGGACGG (서열 8)
In vitro 상에서 sgRNA와 Cas9 단백질에 의해 유색고약버섯의 게놈 DNA가 편접되는지 확인한 결과, 도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 4종류의 sgRNA가 편집이 일어났으나 pclip1의 경우 pclip1_sg2과 pclip1_sg3가 유전자 편집이 더 잘 일어나는 것을 알 수 있었다.
또한, pcmco1의 경우에는 pcmco1_sg2와 pcmco1_sg4가 유전자 편집이 더 잘 일어나는 것을 알 수 있었다.
따라서, 유색고약버섯의 세포에 삽입하여 유전자 편집을 시도하기 위해 사용될 sgRNA는 제작된 모든 sgRNA를 사용할 수 있으며, 특히 pclip1_sg2과 pclip1_sg3 그리고 pcmco1_sg2와 pcmco1_sg4를 이용한다면 유색고약버섯의 게놈 유전자상에서 유전자 편집이 더 잘 일어날 가능성이 높다.
< 실시예 2> 유색고약버섯의 원형질 분리
PDA 배지에서 배양한 유색고약버섯을 수술용 칼로 잘라 PDB 배지 100 ㎖에 넣고 5일간 1차 배양하였다. 배양 5일째에 자란 균사체를 갈아서 PDB 배지 100 ㎖에 균사의 균질액 20 ㎖를 접종하여 2차 배양하였다.
5일 후 같은 방법으로 블렌딩한 균사체 20 ㎖을 CKMM 최소배지(1% 말토오스, 0.2% KNO3, 40㎖ 미량원소(2.73 g CaCl2, 10.25 g MgCl2·6H20, 1.33 g FeCl3·6H20, 1.33 g 구연산, 1.1 g MnSO4, 1.0 g ZnSO4 /1000 ㎖), 25㎖ 염 용액(10 g ammonium tartrate, 20 g KH2PO4, 45 g Na2HPO4, 5.6 g Na2SO4 /500 ㎖), 1㎖ 티아민 용액(0.1mg/㎖) 100㎖에 넣고 1일 배양하였다. 이때 모든 배양은 25℃, 120 rpm에서 실시하였다.
배양된 균사를 원심분리(3000 rpm, 15 min, 25 ℃)하여 균사체만 회수하였다. 균사체는 삼투압 안정제로 0.6 M MgSO4를 이용하여 두번 세척(3000 rpm, 10 min, 25℃)하여 원형질 분리에 이용하였다.
원형질을 형성하는 세포벽 분해효소로 lysing enzyme(sigma사), Usukizyme(Kyowa Chemical Product사)을 각각 삼투압 안정배지인 Osmotic medium(1.2 M MgSO4,10mM Naphosphate(pH5.8))에 5%, 0.5%가 되도록 효소 반응액을 만들어 30℃, 80 rpm에서 4시간 동안 반응을 시켰다.
2시간 이후부터 시간 별로 반응액의 일부를 취하여 현미경으로 원형질이 형성되는 것을 확인하여 최대로 유도되었을 때 Miracloth를 이용하여 배양액을 거른후, 걸러진 원형질액에는 균사가 포함되어 있으므로 1.2 M STC 버퍼(1.2M 솔비톨, 10 mM CaCl2, 10mM 트리스, pH7.5)를 이용하여 두번의 세척단계(9000rpm, 4℃, 20min)를 거친 다음, 마지막으로 Miracloth에 한번 더 걸러주었다.
걸러진 원형질액은 헤모사이토미터를 이용하여 ㎖당 1*107의 농도가 되도록 STC 버퍼양을 조정하였다. 도 3은 상기의 과정을 통해 얻어진 유색고약버섯의 원형질을 나타낸 것이다.
< 실시예 3> 유색고약버섯 원형질 내로 sgRNA 삽입
상기 실시예 2에 따라 분리된 원형질체 액(1*107) 100㎕에 Cas9 단백질 20 ㎍, pclip1의 sgRNA 중에서 서열번호 2와 서열번호 3, pcmco1의 sgRNA 중에서 서열번호 6과 서열번호 8의 sgRNA 각각 35 ㎍, 100 mM 헤파린, 250 mM 스퍼미딘(spermidine), 100 mM 오린트리카복실산(aurintricarboxylic acid)을 섞은 후 얼음에서 30분 동안 방치한 다음, PEG 용액(40% PEG, 10 mM CaCl2, 10mM 트리스, pH7.5) 0.5㎖을 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 이 과정에서 PEG에 의해 가이드 RNA(pclip1의 sgRNA 및 pcmco1의 sgRNA)가 원형질 내로 도입된다.
반응이 완료된 반응액에 CKMM+1M 솔비톨 배지를 1㎖ 첨가하여 25℃ 배양기에서 하루 동안 정치 배양하였다. 정치 배양이 완료된 반응액은 CKMM 탑 아가(CKMM 0.8% 아가)에 재부유시켜 CKMM 바톰 어거(CKMM 1.5% 아가)에 부어서 굳힌 후, 25 ℃ 배양기에 두어 균사가 형성되는지 확인하였다.
25℃에서 수일간 배양한 후 발생하는 균사를 PDA 영양배지로 옮겨 배양하였다. 하기 표 2는 본 실시예를 통하여 확보한 sgRNA가 도입된 균사의 개수를 나타낸 것이다.
Figure pat00001
< 실시예 4> 유전자 편집 확인
균사가 형성되는 것이 보이기 시작하면 균사 부분만 떠서 PDA 배지로 옮겨 25℃에서 페트리디쉬를 완전히 덮을 때까지 충분히 배양을 하였다.
배양이 완료된 균사체로부터 게놈 DNA를 추출한 후, sgRNA의 염기서열을 포함하여 일부 유전자를 증폭하는 하기 표 3의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 이때 상기 PCR은 95℃ 3분, (94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 30 싸이클), 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다.
프라이머 염기서열
MCO_F 5’-GGT CGG TGC TGC TCC TAG-3’(서열번호 13)
MCO_R 5’-GGG AAG GTT GGA TGA ACG-3’(서열번호 14)
LIP_F 5’-ATG GCC TTC AAG CAG CTC-3’(서열번호 15)
LIP_R 5’-GCA GGA GCA CGA CCA GTG-3’(서열번호 16)
PCR 산물을 전기영동한 결과, 도 4a 및 도 4b에서 보는 바와 같이, 유전자 편집을 시도하지 않은 대조군과 유전자 크기의 차이가 있는 시료는 pcmco1 유전자의 sgRNA를 삽입한 균사 1, 2, 3, 8, 9번, 그리고 pclip1 유전자의 sgRNA를 삽입한 균사 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10번으로 이들 균사는 유전자 편집에 의해 DNA 크기의 변화가 생긴 것으로 판단된다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 유전자 편집방법은 난분해성 물질 분해효소의 유전자 기능 구명을 위한 기반 기술로서 뿐만 아니라, 외래 유전자의 도입 없이도 목재부후균의 일종인 표고버섯을 포함하는 다양한 식용버섯의 육종에 적용될 수 있는 장점이 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
<110> Republic of Korea <120> Method of gene editing of lignin degrading enzymes from Phanerocheate chrysosporium by CRISPR-Cas9 system and use of the same <130> 11168 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pclip1_sg1 <400> 1 ggcgcgcttc tccttgacca cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pclip1_sg2 <400> 2 ggcgcgcttc tccttgacca cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pclip1_sg3 <400> 3 atccagcaga acctgttcca agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pclip1_sg4 <400> 4 cgtgggcctc agcgccgcac tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pcmco1_sg1 <400> 5 ctcgggaccg cctgtcgtcc agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pcmco1_sg2 <400> 6 agttgtccat tgagggcacc tgg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pcmco1_sg3 <400> 7 tcggacctga ggcggttggc cgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of pcmco1_sg4 <400> 8 gaaatgctgg gtgcgccgga cgg 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pclip1 <400> 9 cgcttctgca tgctgtgata 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of pclip1 <400> 10 tcgtcgaaga tcatgatgga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pcmco1 <400> 11 gttggtgctg ctcctagctc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of pcmco1 <400> 12 atacggtgtg gcgctcttag 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of MCO <400> 13 ggtcggtgct gctcctag 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of MCO <400> 14 gggaaggttg gatgaacg 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of LIP <400> 15 atggccttca agcagctc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of LIP <400> 16 gcaggagcac gaccagtg 18

Claims (10)

  1. (a). 유색고약버섯(Phanerocheate chrysosporium)의 원형질을 분리하는 단계;
    (b). 상기 분리된 유색고약버섯의 원형질 내로 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 삽입하는 단계; 및
    (c). 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집을 확인하는 단계를 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 유색고약버섯의 pclip1 및 pcmco1 중에서 선택되는 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 분리된 원형질 100 ㎕에 cas9 단백질 20 ㎍, 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 각각의 sgRNA 35 ㎍, 100 mM 헤파린, 250 mM 스퍼미딘(spermidine) 및 100 mM 오린트리카복실산(aurintricarboxylic acid)을 섞은 후, 얼음에서 30분 동안 방치한 다음, 폴리에틸렌글리콜 용액 0.5 ㎖를 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 용액은 40%(w/v) 폴리에틸렌글리콜3350, 10 mM CaCl2 및 10mM 트리스(Tris)로 이루어지고, 상기 용액의 pH가 7.5인 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 삽입된 원형질을 배양하여 형성된 균사체로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 DNA 크기의 변화를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 pcmco1 프라이머쌍, 및 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 pclip1 프라이머쌍 중에서 선택되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유색고약버섯의 리그닌 분해효소의 유전자 편집방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전자 편집방법을 도입하여 식용버섯을 육종하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식용버섯은 목재부후균 유래인 것을 특징으로 하는 식용버섯을 육종하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 식용버섯은 표고버섯을 포함하는 것을 특징으로 하는 식용버섯을 육종하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201553A (zh) * 2021-06-17 2021-08-03 上海市农业科学院 Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170041640A (ko) * 2015-10-06 2017-04-17 기초과학연구원 식물 원형질체로부터 유전체 교정 식물체를 고효율로 제조하는 방법
KR20170126875A (ko) 2015-01-28 2017-11-20 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 Crispr 하이브리드 dna/rna 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법
KR20170134649A (ko) 2015-04-06 2017-12-06 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
JP2017538424A (ja) * 2014-12-16 2017-12-28 ダニスコ・ユーエス・インク ヘルパー株媒介型真菌ゲノム改変用の組成物および方法
KR20180041120A (ko) 2015-07-02 2018-04-23 더 존스 홉킨스 유니버시티 Cprispr/cas9-기반 치료

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017538424A (ja) * 2014-12-16 2017-12-28 ダニスコ・ユーエス・インク ヘルパー株媒介型真菌ゲノム改変用の組成物および方法
KR20170126875A (ko) 2015-01-28 2017-11-20 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 Crispr 하이브리드 dna/rna 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법
KR20170134649A (ko) 2015-04-06 2017-12-06 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
KR20180041120A (ko) 2015-07-02 2018-04-23 더 존스 홉킨스 유니버시티 Cprispr/cas9-기반 치료
KR20170041640A (ko) * 2015-10-06 2017-04-17 기초과학연구원 식물 원형질체로부터 유전체 교정 식물체를 고효율로 제조하는 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chu VT, Weber T, Wefers B, Wurst W, Sander S, Rajewsky, K, Kuhn, R. (2015). Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature Biotechnology 33, 543-548.
Hong CY, Ryu SH, Jeong H, Lee SS, Kim M, Choi IG (2018). Phanerochaete chrysosporium multienzyme catabolic system for in vivo modification of synthetic lignin to succinic acid. ACS chemical biology 12(7), 1749-1759.
Pollegioni L, Tonin F, Rosini E. (2015). Lignin-degrading enzymes. FEBS journal 282, 1190-1213.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201553A (zh) * 2021-06-17 2021-08-03 上海市农业科学院 Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统

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