CN117568311A - 一种用于精准基因编辑的工程化crispr酶和系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于精准基因编辑的工程化CRISPR酶和系统及其应用，所述的CRISPR酶具有如如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，所述的基因编辑系统包含CRISPR融合蛋白和引导RNA组分。本发明用于真核细胞的基因编辑、基因靶向、基因切割、基因编辑动物的制备、动物疾病模型的建立、疾病组织的建立、动物遗传物种资源的保存与改造，实现高效的基因编辑，编辑产物可预期，副产物极少，弥补了现有基因编辑工具的不足。

Description

一种用于精准基因编辑的工程化CRISPR酶和系统及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种用于精准基因编辑的工程化CRISPR酶和系统及其应用。
背景技术
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，是一种革命性的基因编辑系统，由CRISPR相关蛋白和向导RNA组成。它可以精确地切割DNA的特定靶位点，引起双链断裂，进而触发细胞内源性DNA修复机制。这个过程可以导致靶基因的敲除、敲入或替换，从而改变目标基因的功能。
在CRISPR中，细胞内源性修复途径包括非同源末端连接和同源重组修复。非同源末端连接是一种相对较常见的修复途径，它会直接将断裂的DNA末端连接起来，但这种连接过程往往是随机的，可能导致突变的产生。相比之下，同源重组修复是一种精确的修复途径，它需要依赖外源供体模板，这个模板可以提供与靶位点匹配的序列。通过同源重组修复，可以实现精确的基因编辑，例如点突变、插入特定序列或删除特定片段。精确的基因编辑相比于随机突变，具有更广阔的应用前景和更低的安全风险。
然而，同源重组修复的发生率较低，这导致了利用同源重组进行精确基因编辑的难度增加。此外，同源重组修复还需要引入外源供体模板，这进一步增加了操作的复杂性和技术挑战。因此，提高同源重组修复的效率和准确性以及简化操作流程是当前CRISPR研究的重要方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于精准基因编辑的工程化CRISPR酶和基因编辑系统及其应用，实现高效的基因编辑，编辑产物可预期，副产物极少，弥补了现有基因编辑工具的不足。本发明提供的蛋白基于一个新的CRISPR核酸酶，将其命名为RhoCas12a蛋白，具有如SEQ ID No：1所述的氨基酸序列，RhoCas12a蛋白经过氨基酸优化、添加多个新的功能域后，在真核细胞中具备高效精准基因编辑的功能，将修饰后的蛋白命名为CdtCasRT融合蛋白，具有如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
根据Cas蛋白的序列比对结果显示，RhoCas12a蛋白与已报道的Cas蛋白具有较低的序列一致性。进一步通过Cas蛋白的进化树分析发现，RhoCas12a蛋白属于Cas12a蛋白分支，与目前发现的其他Cas12a蛋白具有一定的氨基酸差异，可以被视为一种新的Cas12a蛋白。
一个明显的事实是，有些氨基酸残基的改变并不影响蛋白质的功能活性。因此，对RhoCas12a蛋白的一些氨基酸残基进行改变，只要这些改变不影响RhoCas12a蛋白的所需功能和活性，也在本发明的保护范围内。
RhoCas12a蛋白生物学功能包括但不限于，与引导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在引导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性。
同时，本发明提供了基于RhoCas12a蛋白构建的工程化的CdtCasRT融合蛋白，具体而言，该融合蛋白包括氨基酸替换和优化的RhoCas12a蛋白，并在其N端添加了小鼠来源的入核蛋白Cdt的入核相关的功能域，二者通过链接肽序列相连，并在RhoCas12a蛋白C端添加了反转录蛋白RT，以及多个核定位信号(NLS)和蛋白检测标签(HATag)。CdtCasRT融合蛋白可以与相应的引导RNA结合，并且将其暴露的3’端反转录后，作为供体模版引发靶位点的精确基因编辑。
本发明的CdtCasRT融合蛋白的产生方式并不限于任何特定方法。例如，可以使用基因工程方法，比如重组蛋白原核表达技术，来产生CdtCasRT融合蛋白。
同时，本发明提供了一种DNA片段，其序列如SEQ ID No：3所示，具体包括：
(1)编码本发明的CdtCasRT融合蛋白的DNA序列。
(2)与本发明的CdtCasRT融合蛋白的DNA序列相比具有一个、多个或全部密码子优化的序列。
(3)与本发明的CdtCasRT融合蛋白的DNA序列相比具有一个、多个删除或增加的功能域序列的序列。
(4)与上述任一所述的DNA序列互补、反向或反向互补的DNA序列。
同时，本发明提供了一种引导RNA，该引导RNA包括一个骨架区、一个靶向核酸的靶向序列、反转录序列。所述引导RNA的骨架序列如SEQ ID No：4所示，可由SEQ ID No：5所示的DNA片段进行编码。
骨架区也可以称为蛋白质结合区段或蛋白质结合序列，而靶向核酸的靶向序列也可以被称为靶向核酸的靶向区段或靶向靶序列的引导序列。本发明中骨架区序列是固定的，靶向序列和反转录序列则根据靶点区域进行设计。所述引导RNA的骨架区能够与本发明的CdtCasRT融合蛋白结合形成核酸蛋白复合物，该复合物具有结合靶基因，并在靶基因上实现精确基因编辑的功能。
本发明的靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段含有与目标核酸序列反向互补的核苷酸序列，即该靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段能够通过碱基配对的方式与目标核酸以特异性的方式相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可以被改变或修饰，以适应与目标核酸中的任意所需序列进行杂交。
同时，本发明还提供了一种质粒载体，其包含可以表达上述CdtCasRT融合蛋白和引导RNA的DNA序列，以及相关的调控序列。载体的调控序列包含但不限于：启动子、终止子、报导基因表达盒、抗性基因表达盒以及载体骨架；所述的载体形式包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体等。
同时，本发明提供了一种工程化的非自然CRISPR/Cas系统精确基因编辑系统，该系统由编码CdtCasRT融合蛋白的DNA序列以及一种或多种引导RNA或编码引导RNA的DNA序列组成。引导RNA包括结合于CdtCasRT融合蛋白的骨架区、靶向靶基因的靶向序列、反转录序列三个部分，其中靶向序列和反转录序列根据靶基因序列的不同是可变化的。值得注意的是，所述的引导RNA也可以是化学合成的。
所述CRISPR/Cas系统可以与靶基因杂交，可对靶基因序列进行精确基因编辑，即可预期的DNA序列的删除、敲入和替换，并不会或极少产生非预期的副产物。上述精确基因编辑后，可引起靶基因表达产物的改变。
同时，本发明还提供了一种激活态的CRISPR复合物，该复合物包括以下三个组分：
(1)蛋白组分，即CdtCasRT融合蛋白。
(2)核酸组分，即上述的引导RNA。
(3)靶基因组分，结合在所述向导RNA上的靶序列。靶基因与引导RNA的靶向序列形成反向互补，可引发CdtCasRT融合蛋白对靶基因的精确基因编辑。
同时，本发明还提供了一种体外培养的工程化的真核细胞，所述真核细胞包含本发明所述的CdtCasRT融合蛋白、引导RNA、CRISPR组合物、激活的CRISPR复合物、载体中的一种或多种。
本发明所述的真核细胞一般范围为所有哺乳动物类，包括人、鼠、猴、牛等的体外培养的原代细胞，或常用的细胞株(例如HEK293、HELA、CHO、Cos-7、等)，此外，也包含一些植物细胞，如拟南芥、玉米、水稻等。
本发明所述的CdtCasRT融合蛋白、引导RNA、CRISPR组合物、激活的CRISPR复合物、载体、工程化的真核细胞可用于以下任一至多个用途：真核细胞的基因编辑、基因靶向、基因切割、基因编辑动物的制备、疾病模型动物或组织构建、动物遗传种质资源的保存与改造。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种工程化的CRISPR融合蛋白，可以无需额外提供供体DNA片段的条件下对靶位点进行高效的精确基因编辑，编辑产物可预期，无明显脱靶现象，副产物极少，具有比常规基因编辑更好的安全性。
2、本发明的CRISPR核酸酶属于Cas12a蛋白家族，不同于目前常用的Cas9酶及其衍生的各类基因编辑工具，本发明构建的工程化的CRISPR融合蛋白可在高AT含量的靶位点区域进行高效的基因编辑，弥补了现有基因编辑工具的不足。
3、本发明提供的工程化的CRISPR融合蛋白包含了能够高效入核的功能域，与常规的只依靠多肽入核信号的CRISPR核酸酶相比，具有更高的入核效率，从而在真核细胞中具有更高基因编辑效率。
附图说明
图1为CdtCasRT融合蛋白在HEK293T细胞中β地中海贫-28(A>G)位点的基因编辑结果。
图2为CdtCasRT融合蛋白在HEK293T细胞中β地中海贫CD17(A>T)位点的基因编辑结果。
图3为CdtCasRT融合蛋白在HEK293T细胞中β地中海贫CD41/42(-TCTT)位点的基因编辑结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，在实施例中，如无特殊说明，则所用的技术手段均为本领域的常规技术手段。这些技术手段可以参考《分子克隆实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)、《分子生物学实验设计》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)、《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)等。另外，在实施例中，未特别指明的情况下，实验条件和使用的试剂和设备均符合常规标准或厂家推荐的标准。如果涉及到的试剂或设备未具体说明其来源，则是普遍可在市场上获取的常规商品。本领域技术人员应该清楚，实施例仅以说明本研究为目的，并不意味着限制了本研究所要求保护的范围。
实施例1：CdtCasRT融合蛋白的制备
1、CdtCasRT融合蛋白序列信息的获取
通过对培养物的宏基因测序，结合蛋白质聚类分析，得到一类新型的Cas核酸酶，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，本发明将其命名为RhoCas12a蛋白，具有如SEQ ID No：1所述的氨基酸序列，RhoCas12a蛋白经过氨基酸优化、添加多个新的功能域后，在真核细胞中具备高效精准基因编辑的功能，将修饰后的蛋白命名为CdtCasRT融合蛋白，具有如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。根据氨基酸序列确定CdtCasRT融合蛋白的人密码子偏好的DNA序列信息，化学合成全长DNA序列，序列如SEQ ID No：3所示。
2、CdtCasRT融合蛋白序列扩增片段的获得
利用聚合酶链式反应(PCR)获取目的片段，反应体系如表1所示，反应程序如表2所示。
表1PCR反应体系
表2PCR扩增程序
3、PCR产物酶切与载体连接
PCR产物经过电泳分离在1％琼脂糖胶中。在分离后，目标条带被切下并回收。回收过程可以利用试剂盒进行。首先，使用溶解缓冲液加热将琼脂糖胶块溶解，然后将其加入吸附柱中，并进行离心，使DNA吸附在柱子上。最后，使用灭菌水进行洗脱。为了提高实验效率，可以利用限制性内切酶对PCR产物进行消化。双重消化可以用来提高效率。双酶切体系的具体构成可以参见表3。
表3酶切体系
在本实施例使用了细菌表达载体pGEX-6P-1作为质粒，该质粒具有氨苄抗性，并且其N末端带有GST标签。通过使用谷胱甘肽琼脂糖珠进行纯化，可以纯化裂解的蛋白。连接酶采用T4连接酶，并在室温下进行连接，连接的时间为2-3个小时。连接体系的构成可参见表4。
表4连接体系
4、连接产物的转化
为了使经过体外重组的DNA进入宿主细菌并大量表达，需要利用转化技术。转化实际上也是一种自然现象，许多细菌都会发生转化。但是在实验条件下，需要高效率的转化。因此，一般采用感受态细胞充当载体。感受态细胞是一种特殊的细胞，转化效率很高，大肠杆菌是一种常用的宿主。本实验采用热激转化方法，转化体系如表5所示。将连接产物加入到DE5α型感受态细胞中，置于冰上30分钟，然后在42℃水浴锅中热冲击90秒，再置于冰上150秒。接下来，在37℃的摇床上摇动40-60分钟，加入400μL的无抗LB培养基。然后，吸取200-400μL的培养液，并加入耐氨苄抗性的LB固体培养基，涂抹均匀，最后在37℃温箱中过夜培养即可。
表5转化体系
5、转化子的筛选
进行阳性克隆的筛选，观察平板上的菌落，挑选单一且大小均匀的菌落。把挑选的菌落枪头或牙签放入对应抗性的培养基中，在37℃培养箱中培养至菌液浑浊。接着进行菌液PCR，该过程中，通过95℃的变性作用，菌液能够裂解，使菌体内的DNA释放出来作为模板，然后根据PCR的原理进行目标片段的扩增。扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，菌液PCR的体系如表6。观察凝胶中的条带是否有阳性克隆。菌液PCR的程序如表7，最后挑选单个克隆，并进行质粒大量扩增。
表6菌液PCR体系
表7菌液PCR程序
6、重组质粒的提取与鉴定
在挑选阳性克隆后，将它们在相应抗性的LB培养基中进行培养。本实验使用LB培养基，37℃培养8-10小时，直到菌液浑浊。然后进行质粒提取。本实验使用酶切法进行质粒鉴定。质粒酶切鉴定体系如表8所示。接着进行质粒切割实验，在琼脂糖凝胶电泳中观察切割出的条带。最后，对质粒进行测序以确保序列的正确性。
表8质粒酶切鉴定体系
7、CdtCasRT融合蛋白的表达
本实验在大肠杆菌C43(DE3)中表达CdtCasRT融合蛋白。首先，将阳性单克隆在氨苄抗性的LB培养基中以37℃、220rpm过夜培养，然后在1L的氨苄抗性LB培养基中以相同条件下培养5-10小时。当菌液变得浑浊并且其OD600值达到0.8-1时，将温度降至20℃。随后，使用0.3mol/L的IPTG在20℃下诱导重组蛋白的表达。由于本实验使用的载体中启动子为lac启动子，加入异丙基β-D-1硫代半乳糖吡喃糖苷之前，编码阻遏蛋白的乳糖操纵子可发挥活性，以关闭lac启动子，使其不能表达蛋白，但是诱导后，启动子开放，从而可表达目的蛋白。
过夜诱导后，通过离心收集大肠杆菌，将ReqCas9重悬于补充有1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF(苯基甲烷磺酰氟)的重悬缓冲液中(25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mol/LNaCl、3mmol/L DTT)。通过超声波裂解获得裂解物，并通过在4℃16000rpm离心40分钟，去除菌体碎片。首先使用谷胱甘肽琼脂糖4B(GS4B)珠纯化裂解物，随后使用20mL洗涤缓冲液1和20mL洗涤缓冲液2洗涤珠子。使用洗涤缓冲液1(25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、300mmol/LNaCl、3mmol/LDTT)中的蛋白磷酸酶在4℃过夜切割结合的蛋白质，以移除GST标签。经过这一步骤，切割的CdtCasRT融合蛋白从GS4B树脂洗脱出来，并进一步纯化。
8、CdtCasRT融合蛋白的纯化
本实施例中使用亲和层析和离子交换层析进行CdtCasRT融合蛋白的纯化。所用的纯化方法基于GST亲和层析技术，将谷胱甘肽转移酶作为亲和标签。GST的分子量大约为26kD，它的原理是通过特异性结合GSH和GET实现分离。谷胱甘肽琼脂糖4B(GS4B)珠(GEHealthcare)可以吸附带有GST标签的重组蛋白。最终，蛋白磷酸酶用于切除GST标签。根据蛋白质的等电点，选择不同的离子交换柱，CdtCasRT的等电点约在9左右，并且能够结合核酸，因此本实验选用了阳离子交换柱。然后，使用肝素柱去除核酸。阳离子交换柱所用的缓冲液A为25mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、3mmol/L DTT；缓冲液B为25mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L NaCl、3mmol/L DTT。肝素柱所用的缓冲液为25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、3mmol/L DTT，缓冲液B为25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L NaCl、3mmol/LDTT。
本实施例纯化的CdtCasRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
实施例2：引导RNA的制备与纯化
1、引导RNA体外转录模板的制备与纯化
为了体外合成sgRNA转录模板，使用带有T7启动子的特异性DNA序列作为上游引物，将sgRNA的骨架序列作为下游引物。上下游引物之间设计了17碱基的互补配对，使得它们可以作为反应模板进行PCR扩增。
在PCR反应中，扩增得到的产物可以通过2％琼脂糖凝胶电泳进行初步检测。检测时，将PCR产物与适当的分子量标记物一同加载到琼脂糖凝胶槽中进行电泳。通过与预期sgRNA的大小比较，判断电泳结果中的条带位置是否与预期一致。
如果条带位置与预期大小一致，表明PCR扩增成功，即可进行进一步的回收纯化。回收纯化方法可以使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(如Omega的琼脂糖凝胶回收试剂盒)根据说明书中的步骤进行操作。回收纯化后的DNA片段即为sgRNA的体外转录模板，可用于后续的体外转录反应。
纯化后的DNA片段具有如SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，经过体外转录后可获得如SEQ ID No：4所示的sgRNA。
2、sgRNA体外转录与纯化
在获得纯化好的sgRNA体外转录模板后，使用TranscriptAid T7 High YieldTranscription试剂盒进行体外转录。在这个过程中，所有试剂都应在冰上解冻，全程冰上加样，操作流程如下：
(1)将所有试剂低速离心，回收管壁上的残留液体。按照表9进行加样，其中用于体外转录的DNA模板量不低于1μg。混匀所有液体后，在37℃下孵育反应混合液。根据预期转录产物的长度进行孵育时间的调整，长度小于100nt的转录本至少需要孵育4～8小时，而长度大于100nt的转录本则需要孵育2小时左右。
表9体外转录体系
(2)去除残留的DNA底物：在孵育好的反应产物中加入2μL DNaseⅠ，并轻轻吹打混匀。在37℃下孵育反应混合液15分钟，以去除DNA底物。
(3)终止反应：在反应产物中加入4μL 0.5M的EDTA，并在65℃下孵育反应混合液10分钟。EDTA可以中和聚合酶反应中的Mg2+，以解除反应活性。
将体外转录得到的sgRNA通过苯酚-氯仿法手动抽提纯化，步骤如下：
(1)在体外转录得到的26μL反应产物中，以其中的20μL为基准，加入115μL DEPC处理的水和15μL 3M醋酸钠，轻轻吹打混匀后涡旋20秒。
(2)以上述操作得到的总量150μL产物为基准，加入等量的苯酚-氯仿(1:1)混合液，涡旋震荡30秒。
(3)冰浴5分钟后，将样品置于4℃离心机中以12000rpm离心1分钟。离心后，产物会呈现三层界面，上层水相中包含体外转录得到的RNA产物。小心吸取上层水相，转移到新的离心管中，中间的蛋白相和下层的有机相弃去。
(4)在取出的水相中加入两倍体积的冰浴过的无水乙醇，涡旋震荡30秒，然后置于冰浴中30分钟。接着，将样品放入4℃离心机中以12000rpm离心10分钟。
(5)在离心管内，应该可以看到白色的RNA沉淀物。将管内的液体全部吸净弃去，然后加入500μL冰浴过的70％乙醇，并用枪头将白色沉淀物研磨成颗粒状。涡旋震荡以清洗RNA沉淀，接着将样品放入4℃离心机中以12000rpm离心5分钟。
(6)将离心管内的乙醇吸净弃去，然后将管子置于冰上，在超净台中自然风干，直到白色沉淀物变成透明的片状。
(7)最后，加入20-50μL DEPC处理的水进行溶解。
(8)检测核酸浓度时，可以使用光谱仪测定OD260和OD280的比值。RNA的OD260/OD280比值在1.7-2.1之间表示RNA产品较纯。如果比值低于1.7，说明有苯酚或蛋白质的污染，可能是纯化过程中操作不当导致的。此时，可以使用苯酚-氯仿法再次进行纯化。
实施例3：CdtCasRT融合蛋白对HEK293T细胞地中海贫血基因相关位点的精确基因编辑
1、向导RNA的设计：根据NCBI上的猪HBB基因序列，查找对应的三个在人中高发的β地中海贫血基因突变，即-28(A>G)位点、CD17(A>T)位点和CD41/42(-TCTT)位点，通过根据向导RNA和PAM的设计原则，为HBB基因选定了3个编辑位点，并设计相应的向导RNA。设计的向导RNA具有如SEQ ID No.4所示的骨架序列，可以通过如SEQ ID No：5所示的核苷酸序列编码获得。
2、制备培养基：在DMEM/F-12生长培养基中加入10％的胎牛血清和青霉素-链霉素等抗生素混合物，用0.22微米的滤器滤过。
3、细胞的解冻：将新收到的冻存细胞放到37℃预热的学养水浴中，快速摇晃2-3秒，直到霰粒完全化开，再马上取出。用1毫升的生长培养基将细胞平移至15ml的管中并轻轻摇晃进行混合。离心细胞，将上清吸走后使用新的生长培养基将细胞悬于培养皿中。让细胞在37℃、5％ CO2的恒温培养箱中静置过夜。
4、制备细胞悬浮液：将CdtCasRT融合蛋白和向导RNA悬液混合在DPBS中，质量比例为1：3，最终浓度为1μg/μl。混合之后，将混合物转移到无菌的微量离心管中，将细胞用DPBS洗涤2次，将上清去掉后加入0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA消化液，室温孵育2-3分钟，轻轻振摇，200×g离心细胞，时间5min，
将细胞制备成悬浮液，用1mL培养基混合，并用1ml DPBS洗涤1次，然后离心细胞。
5、细胞电转：将细胞悬浮液和转换混合物混合，加入电穿透液中，然后将混合物转移到电穿透器中，按照恰当设置参数进行转染。转染后，将细胞悬浮液转移到37℃的CO2培养室中，放在35mm培养皿中，培养时间为24-48小时。
6、电转后的细胞提取总DNA，PCR扩增产物经TA克隆后选取单克隆菌株进行一代测序。通过与标准序列进行对比，评估基因编辑的结果。-28(A>G)位点的测序结果如图1所示，CD17(A>T)位点的测序结果如图2所示，CD41/42(-TCTT)位点的测序结果如图3所示。结果显示基因编辑成功，所编辑的位点精确、无副产物。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1. 一种用于精准基因编辑的CRISPR酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种工程化的CRISPR融合蛋白，其特征在于：所述的融合蛋白含有权利要求1所述的CRISPR酶，为以下中任意一种蛋白：
（1）氨基酸序列如SEQ ID No：2所示的蛋白；
（2）以SEQ ID No：2序列出发，发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加，并且基本保留了其源自上述序列的生物学功能的蛋白；
（3）以SEQ ID No：2序列出发，发生一个或多个功能结构域的删减或添加，并且基本保留了其源自上述序列的生物学功能的蛋白。
3. 一种DNA片段，其特征在于：所述的DNA片段可以编码权利要求2所述的CRISPR融合蛋白，其序列如SEQ ID No：3所示。
4. 一种引导RNA，其特征在于：所述引导RNA的骨架序列如SEQ ID No：4所示。
5. 一种DNA片段，其特征在于：所述DNA片段可编码权利要求4所述的引导RNA，其序列如SEQ ID No：5所示。
6.一种质粒载体，其特征在于：所述质粒载体包含权利要求3和权利要求5所述的DNA序列以及与之表达相关的调控序列。
7.一种基因编辑系统，其特征在于：包含以下CRISPR组合物：
（1）蛋白成分，包括权利要求2所述的CRISPR融合蛋白；
（2）引导RNA组分，包括权利要求4所述的引导RNA的骨架序列成分；
所述蛋白组分与引导RNA组分相互结合形成CRISPR复合物。
8.一种处于激活状态的CRISPR复合物，其特征在于：所述CRISPR复合物包含：
（1）蛋白成分，包括权利要求2所述的CRISPR融合蛋白；
（2）引导RNA组分，包括权利要求4所述的引导RNA的骨架序列成分；
（3）靶基因组分，即结合在所述的引导RNA上的靶序列；
所述蛋白组分、引导RNA组分、靶基因组分相互结合形成激活状态的CRISPR复合物。
9.一种工程化的真核细胞，其特征在于：所述真核细胞包含权利要求1所述的CRISPR核酸酶，和/或权利要求2所述的CRISPR融合蛋白，和/或权利要求3所述的DNA片段，和/或权利要求6所述的质粒载体，和/或权利要求7所述的组合物，和/或权利要求8所述的激活状态的CRISPR复合物。
10.如权利要求1-9任一所述的各物质或基因编辑系统的应用，其特征在于：用于真核细胞的基因编辑、基因靶向、基因切割、基因编辑动物的制备、动物疾病模型的建立、疾病组织的建立、动物遗传物种资源的保存与改造。
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