CN110894530B - 结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法 - Google Patents

结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA、检测试剂盒与检测方法，所述crRNA包括：KRAS‑exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.14‑16任一所示；KRAS‑exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.17‑18任一所示；NRAS‑exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.19‑20任一所示；BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.21‑22任一所示。本发明设计与结肠癌相关分子标志物突变靶点的4个crRNA，结合CRISPR‑cpf1系统进行突变检测，此方法具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。

Description

结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
肿瘤是人体在各种不良因素的作用下，身体里某个或者某些部位组织中的细胞发生异常增生而形成的新生物，发生异常增生的细胞就是肿瘤细胞。
结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发生率高居全球恶性肿瘤第四位，年累及人数约100万，年死亡人数近50万。尽管结直肠息肉和癌症早期可能不会有症状，简单的筛查可以发现许多赘生物和息肉。用乙状结肠镜和结肠镜可以发现和切除结直肠息肉，降低其发展为癌症的风险。然而仍然发现较晚会有风险，因此准确获知肿瘤的生物学信息，从而在基因分型指导下进行个体化治疗对于指导临床用药至关重要。结肠癌发病率最为常见的是部分基因的突变会导致结肠癌的产生，如在部分患者中能检测到KRAS、NRAS、BRAF等等基因发生突变，将对结直肠癌的早期检测与预防具有极大的意义。
然而目前在现阶段临床可通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative realtime polymerase chain reaction，Q-PCR)、非放射性原位杂交技术(fluorescence insitu hybridization，Fish)、多重引物PCR(multiplex PCR)等方式对患者进行相关位点的基因突变检测，这些技术存在一次只能检测一个基因或检测成本高等问题，而且无法应用到大规模的临床样本研究，因此，亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法，特异性强，灵敏度高，最低检测极限达到10拷贝/uL。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crDNA，所述crDNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.5-7任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.8-9任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.10-11任一所示；
BRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.12-13任一所示。
本发明的目的之二在于提供一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA，所述crRNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.14-16任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.17-18任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.19-20任一所示；
BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.21-22任一所示。
本发明的目的之三在于提供一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，含有所述crDNA或者所述的crRNA。
优选地，所述试剂盒还包括cpf1蛋白和荧光探针。
优选地，所述荧光探针选自如下探针中的一个：
荧光探针1：其序列如SEQ ID NO.23所示；
荧光探针2：其序列如SEQ ID NO.24所示；
荧光探针3：其序列如SEQ ID NO.25所示；
所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
优选地，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。
优选地，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒或实时荧光定量检测试剂盒。
本发明的目的之四在于提供所述的crRNA、以及所述的试剂盒在用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变上的用途。
本发明的目的之五在于提供一种一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测方法，包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、crRNA、cpf1蛋白、SEQ ID NO.23-25任一所示的荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
优选地，将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测或者将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。
作为以上实施方式之一，将扩增产物、cpf1蛋白/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区。本发明提供了一种基于CRISPR-cpf1系统以胶体金可视化检测荧光基团，以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便，无需仪器，具有很强的适用范围和场所，实用性极强。
作为以上另一种优选方式之一，将扩增产物、cpf1/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后荧光检测仪测定荧光值。可以做成便携式检测仪可以随时随地及时检测，这些应用和方法为后续试剂盒的开发，临床诊断的应用提供了平台，适用于大规模临床样本检测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明提供的用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法，设计与人基因突变靶点相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR-cpf1系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL；)、特异，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到含有相应突变的目标核酸：
(1)在对KRAS-exon2的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
(2)在对KRAS-exon3的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
(3)在对NRAS-exon2的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
(4)在对BRAF的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
附图说明
图1为KRAS-exon2的特异性检测结果；
图2为KRAS-exon3的特异性检测结果；
图3为NRAS-exon2的特异性检测结果；
图4为BRAF的特异性检测结果；
图5为KRAS-exon2的灵敏性检测结果；
图6为KRAS-exon3的灵敏性检测结果；
图7为NRAS-exon2的灵敏性检测结果；
图8为BRAF的灵敏性检测结果。
具体实施方式
实施例1靶向基因突变位点crRNA的的设计及获得
1、基于CRISPR-cpf1系统的结肠癌检测位点的发现
我们根据最新出具的《NCCN指南》，获得结肠癌常用突变检测分子标志物基因。根据基因序列及大量临床检测数据确定基因常见突变位点序列，针对这些不同区域设计crRNA并构建CRISPR-cpf1系统进行研究。结果表明，以SEQ ID NO.1-4所示区域序列为基于CRISPR-cpf1系统的结肠癌突变检测位点(加粗部分为突变区域)，具有很好的检测效果。
表1
Figure BDA0002335829410000051
2、靶向基因突变位点crRNA的设计
(1)靶向基因突变位点crRNA设计原则
由于CRISPR-cpf1系统是一种新型的靶向DNA基因编辑系统，其中cpf1与crRNA结合形成监测复合物，crRNA的向导区域用互补序列识别目标DNA，并且cpf1降解目标DNA链，所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与cpf1蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据cpf1蛋白来确定，使其能够与选定的cpf1蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。crRNA向导序列不能离起始密码子(ATG)太近；长度为22-24个核苷酸。
2.crDNA序列的选择
所述与cpf1蛋白结合的锚定序列SEQ ID NO.16所示；所述crRNA向导序列根据SEQID NO.1-4所示序列中突变位点区域设计；最后得到了4个突变位点的crDNA片段。
KRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.5-7任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.8-9任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.10-11任一所示；
BRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.12-13任一所示。
3、crRNA的获得
将所得的4个突变位点的crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶(转录反应体系如表2所示)作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA。
表2
Figure BDA0002335829410000061
所得crRNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.14-16任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.17-18任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.19-20所示；
BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.21-22所示。
实施例2结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒及检测方法
1、试剂盒的组成
本试剂盒包括结肠癌检测的4条crRNA(4个突变位点的crRNA如实施例1所示获得)或者4个突变位点的crDNA(当试剂盒中为crDNA时，需要操作者先将crDNA片段分别在T7RNA聚合酶作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(见表3)、cpf1蛋白、无酶水、DNA酶抑制剂；
表3
荧光探针 序列(5’-3’)
探针1 HEX-(CH2)6-CTCACTACAGACGCACGCTA-BHQ1(如SEQ ID NO.23所示)
探针2 HEX-CTCACTACAGACGCACGCTA-BHQ1(如SEQ ID NO.24所示)
探针3 HEX-CACATCAGCAGCCTACAGCA-BHQ1(如SEQ ID NO.25所示)
优选地，所述试剂盒还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对：KRAS-exon2突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.26-27所示；KRAS-exon3突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.28-29所示；NRAS-exon2突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.30-31所示；BRAF基因突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ IDNO.32-33所示。
2、结肠癌相关分子标志物基因突变的检测方法
(1)取50-100ng待样本的DNA，加入等温扩增体系中(RPA等温扩增反应成分，对应的等温扩增引物对同上所述)；扩增体系如表4所示。
表4
Figure BDA0002335829410000071
Figure BDA0002335829410000081
(2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：crRNA、cpf1蛋白、荧光探针和无酶水一起制成检测体系如表5所示。
表5
Figure BDA0002335829410000082
用100-250nM纯化的cpf1，50-100nM crRNA，1-5μl合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，5-10μl目的DNA扩增产物，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时设立阴性对照组。将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测或者将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。反应结束后统计分析荧光值变化情况。
实施例3突变crRNA对野生型和突变型序列的特异性检测
合成野生株和突变株的靶序列，分别利用上述4个突变crRNA检测其特异性。将实施例1制备得到的4个突变位点的crRNA分别构建CRISPR-cpf1体系在体外进行切割有效性验证。
用100-250nM纯化的cpf1，250-500nM crRNA，1-5μl合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，不同稀释浓度的目的DNA，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时设立空白对照。空白对照组为每个实验组相对应的没有加crRNA及没有加cpf1的信号组。几组反应混合物同时在便携式检测仪中反应(温度设置为37℃，动力学检测每10min检测一次共1个小时)。使用荧光定量PCR仪检测体系的荧光信号变化。
1、KRAS-exon2的特异性检测
我们检测了KRAS-exon2 crRNA对野生KRAS-exon2、KRAS-exon2突变型序列的检测效果，图1为KRAS-exon2突变位点的体系荧光值结果。结果显示，结果显示，空白对照在检测的1h内荧光强度保持在4000-5000范围内不变；加入野生KRAS-exon2、突变型KRAS-exon2的模板后均出现了荧光信号的升高，其中与KRAS-exon2crRNA完全匹配的KRAS-exon2突变模板的信号与野生型模板的信号随着时间的延长普遍高于野生型对照组。
2、KRAS-exon3的特异性检测
我们检测了KRAS-exon3 crRNA对野生KRAS-exon3、KRAS-exon3突变型序列的检测效果，图2为KRAS-exon3突变位点的体系荧光值结果。结果显示，结果显示，空白对照在检测的1h内荧光强度保持在4000-5000范围内不变；加入野生KRAS-exon3、突变型KRAS-exon3的模板后均出现了荧光信号的升高，其中与KRAS-exon3crRNA完全匹配的KRAS-exon3突变模板的信号与野生型模板的信号随着时间的延长普遍高于野生型对照组。
3、NRAS-exon2的特异性检测
我们检测了NRAS-exon2 crRNA对野生NRAS-exon2、NRAS-exon2突变型序列的检测效果，图3为NRAS-exon2突变位点的体系荧光值结果。结果显示，结果显示，空白对照在检测的1h内荧光强度保持在4000-5000范围内不变；加入野生NRAS-exon2、突变型NRAS-exon2的模板后均出现了荧光信号的升高，其中与NRAS-exon2 crRNA完全匹配的NRAS-exon2突变模板的信号与野生型模板的信号随着时间的延长普遍高于野生型对照组。
4、BRAF的特异性检测
我们检测了BRAF crRNA对野生BRAF、突变型BRAF的检测效果，空白对照在检测的1h内荧光强度保持在4000-5000范围内不变；加入野生BRAF、突变型BRAF的模板后均出现了荧光信号的升高，其中与BRAF crRNA完全匹配的BRAF突变模板的信号与野生型模板的信号随着时间的延长普遍高于野生型对照组。
综上可知，结果均显示靶标crRNA检测靶标DNA的体系荧光值变化趋势明显高于阴性对照。表明本发明的用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的4个crRNA可以分别特异性地检测出对应的突变序列。
实施例4突变crRNA对野生型和突变型序列的灵敏性试验
1、KRAS-exon2突变位点的crRNA的灵敏度检测
将KRAS-exon2突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图5所示。阴性对照(NC)无条带，说明扩增过程中无污染；在250-500bp之间出现一条与目的条带大小(602bp)一致的单一条带；模板浓度在104copies/μL时，均可观察到清晰的电泳条带；而当模板浓度低于为102copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度约能达到102copies/μL左右。
2、KRAS-exon3突变位点的crRNA的灵敏度检测
将KRAS-exon3突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图6所示。阴性对照(NC)无条带，说明扩增过程中无污染；在250-500bp之间分别出现一条与目的条带大小(436bp)一致的单一条带；模板浓度在103copies/μL以上时，均可观察到清晰的电泳条带；而当模板浓度低于为102copies/μL时则条带非常浅或观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度约能达到102copies/μL左右。
3、NRAS-exon2基因突变位点的crRNA的灵敏度检测
将NRAS-exon2突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图7所示。阴性对照(NC)无条带，说明扩增过程中无污染；在250-500bp之间出现一条与目的条带大小(330bp)一致的单一条带；模板浓度在105copies/μL时，均可观察到清晰的电泳条带；而当模板浓度低于为102copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度约能达到102copies/μL左右。
4、BRAF基因突变位点的crRNA的灵敏度检测
将BRAF突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图8所示。四组模板对应的阴性对照(NC)无条带，说明扩增过程中无污染；在250-500bp之间分别出现一条与目的条带大小(300bp)一致的单一条带；模板浓度在104copies/μL以上时，均可观察到清晰的电泳条带；而当模板浓度低于为103copies/μL时则条带非常浅或观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度约能达到102copies/μL左右。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉博杰生物医学科技有限公司
<120> 结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> 突变检测位点(KRAS -exon2)
<400> 1
gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga 60
gtgccttgac gatacagcta attca 85
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 突变检测位点(KRAS -exon3)
<400> 2
tcttggatat tctcgacaca gcaggtcaag aggagtacag tgcaatgagg gaccagtaca 60
tgaggactgg ggagggcttt cttt 84
<210> 3
<211> 133
<212> DNA
<213> 突变检测位点(NRAS-exon2)
<400> 3
aacaggttct tgctggtgtg aaatgactga gtacaaactg gtggtggttg gagcaggtgg 60
tgttgggaaa agcgcactga caatccagct aatccagaac cactttgtag atgaatatga 120
tcccaccata gag 133
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 突变检测位点(BRAF)
<400> 4
aataggtgat tttggtctag ctacagtgaa atctcgatgg agtgggtccc at 52
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<212> DNA
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<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gattttggtc tagctacaga catctacaag agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
aatttc 66
<210> 14
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uaauuucuac ucuuguagau ccuacgccac dagcuccaac uacc 44
<210> 15
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
uaauuucuac ucuuguagau ccuacgccad cagcuccaac uac 43
<210> 16
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uaauuucuac ucuuguagau ccuacgdcac cagcuccaac uacc 44
<210> 17
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
uaauuucuac ucuuguagau cucuugaccu gcugugucga gaa 43
<210> 18
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uaauuucuac ucuuguagau uagaccugcu gugucgagaa u 41
<210> 19
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uaauuucuac ucuuguagau ccaacaucaa cugcuccaac cac 43
<210> 20
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uaauuucuac ucuuguagau ccaacaucaa cugcuccaac ca 42
<210> 21
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
uaauuucuac ucuuguagau gucuguagcu agaccaaaau cac 43
<210> 22
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
uaauuucuac ucuuguagau gucuguagcu agaccaaaau c 41
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcactacag acgcacgcta 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctcactacag acgcacgcta 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cacatcagca gcctacagca 20
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt gg 32
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccacaaaatg attctgaatt agctgtatcg t 31
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctacaggaa gcaagtagta attgatggag aaac 34
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gccagcttat tatattcaat ttaaacccac 30
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccaacaggtt cttgctggtg tgaaatgact g 31
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctctatggtg ggatcatatt catctacaaa gtg 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cacctcagat atatttcttc atgaagacct cac 33
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctcaattct taccatccac aaaatggatc 30

Claims (6)

1.一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crDNA或crRNA；
其中所述crDNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.5-7任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.8-9任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.10-11任一所示；和
BRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.12-13任一所示；
所述crRNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.14-16任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.17-18任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.19-20任一所示；和
BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.21-22任一所示。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cpf1蛋白和荧光探针。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针选自如下探针中的一个：
荧光探针1：其序列如SEQ ID NO.23所示；
荧光探针2：其序列如SEQ ID NO.24所示；
荧光探针3：其序列如SEQ ID NO.25所示；
所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。
6.权利要求1所述的检测试剂盒在制备检测结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂中的用途。
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