CN114774530B - 检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测LHON致病突变的CRISPR‑Cas组合物、试剂盒和方法，涉及基因检测技术领域。本发明提供的CRISPR‑Cas组合物和试剂盒包括Cas12a蛋白和SEQ ID NO.1/11/17所示的crRNA，其可用于精准地检测样品的LHON的三个原发突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)，具有检测快速、简便易操作、特异性和灵敏度高、可视化，无需大型仪器和昂贵试剂等特点，为LHON快速诊断提供了分子基础，而且适用于在人群中大规模筛查突变携带者，为其遗传咨询和产前诊断提供帮助。

Description

检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法。

背景技术

Leber遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON，MIM535000)是最早发现、最典型、最普遍的线粒体遗传病。LHON最主要的临床特征是双侧的、无痛的、急性或亚急性发作的母系遗传病。LHON主要的病理特征是视神经和视网膜神经元的退化，最终导致视力丧失。LHON通常在男性20-30岁时发病，表现出明显的性别倾向(80％-90％)；很多女性虽然携带LHON突变基因，但是不发病，称之为不完全外显(incompletepenetrance)，但是携带LHON突变的女性会通过母系遗传把突变传给后代，这对后代视力存在一定的危险。因此，对于LHON相关致病基因突变位点的检测对于遗传咨询还产前诊断是非常必要的。

LHON是由于线粒体基因突变引起的疾病。90％的LHON突变是由于m.3460G>A(ND1基因)、m.11778G>A(ND4基因)和m.14484T>C(ND6基因)三个位点之一(个例是两个位点均突变)引起的。因此，这三个突变位点的基因检测对于LHON诊断是非常重要的。

目前，常见的检测LHON致病的这三个突变位点的方法有桑格测序(Sangersequencing)、二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)、定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)、等位基因特异PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR),单链构象多态性PCR(Single StrandConformation Polymorphism of PCR，PCR-SSCP)和限制性片段长度多态性PCR(Restriction Fragment Length Polymorphism of PCR，PCR-RFLP)。这些检测方法耗时2h-24h不等(二代测序除外，二代测序周期为3周)，且都存在一定的缺点，如需要大型仪器，或需要专业人员操作，不适合在基层社区实验室开展。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法；本发明提供的CRISPR-Cas组合物基于CRISPR-Cas技术实现对LHON致病突变的检测，精准地检测样品的LHON致病三个原发突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)是否有突变，具有检测快速(从采血至检出时长为28分钟)、简便易操作、特异性和灵敏度高(1％的突变率也可以检出)、可视化，无需大型仪器和昂贵试剂等特点中的一个、一些或全部；本发明提供的组合物、试剂盒或方法不仅为LHON快速诊断提供了分子基础，而且适用于在人群中大规模筛查突变携带者，为其遗传咨询和产前诊断提供帮助。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物，LHON致病突变选择如下突变中的至少一种：

m.11778G>A、m.3460G>A、以及m.14484T>C；

所述CRISPR-Cas组合物包括独立存在的如下组分：Cas12a蛋白和crRNA；

crRNA选自检测m.11778G>A的SEQ ID NO.1、检测m.3460G>A的SEQ ID NO.11、以及检测m.14484T>C的SEQ ID NO.17的至少一种。

上述crRNA可以通过本领域熟知的化学方法合成或转录获得例如：设计并合成序列如SEQ ID NO.1所示的crRNA；构建载体pUC57-T7-crRNA，用转录试剂盒体外转录，即可获得所述crRNA。

上述Cas12a蛋白可以通过本领域熟知的基因工程技术获得，例如使用经密码子优化的SEQ ID NO.45，将其构建到pET28a表达载体上，通过低温诱导可溶蛋白表达，然后经过亲和纯化及分子筛纯化即获得目的蛋白Cas12a。

为了保证检测的特异性，本发明提供的crRNA已经过NCBI核酸数据库检索，确定与包括人、动植物和微生物等在内的基因组无高同源性匹配。为了提高crRNA对突变型和野生型的区分度，所提供的的crRNA上被人为引入了一个错配碱基，进一步摒除crRNA与野生型结合产生的杂信号。

可选地，在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的dsDNA扩增引物对：

所述dsDNA扩增引物对选自如下引物对中的至少一种：

引物对1：SEQ ID NO.26与SEQ ID NO.27(扩增m.11778G>A位点附近的片段)、引物对2：SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.35(扩增m.3460G>A位点附近的片段)、以及引物对3：SEQID NO.37和SEQ ID NO.43(扩增m.14484T>C位点附近的片段)。

上述引物对可通过RPA扩增获得dsDNA片段，用于后续荧光检测。

可选地，在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的可被Cas12a非特异性地切割的荧光探针，所述荧光探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有猝灭基团。

可选地，在一些实施方案中，荧光基团为6-羧基荧光素(6-FAM)，所述猝灭基团为BHQ1。在其他一些实施方案中，本领域技术人员可以选择本领域合适的荧光基团和猝灭基团。

需要说明的是，检测结果判读既可利用酶标仪进行荧光读数，也可在荧光灯下进行肉眼观察。对于本发明中的荧光探针，酶标仪的检测激发光设定为485nm～520nm，肉眼观察使用的荧光灯波长光源为485nm。

可选地，在一些实施方案中，所述荧光探针的核酸序列如SEQ ID NO.44所示。在其他一些实施方案中，本领域技术人员也可以选择使用具有其他核酸序列的荧光探针，只要其能够在Cas12a被激活的情况，能够被Cas12a非特异性地切割即可。

可选地，在一些实施方案中，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的限制性内切酶SfaNI和/或BsaHⅠ。

限制性内切酶SfaNI和BsaHⅠ可以将野生型的序列切割(SfaNI切割野生型m.11778G附近的序列，BsaHⅠ切割野生型m.3460G附近的序列)，对突变后的序列不切割，在扩增体系中加入SfaNI或BsaHⅠ，有助于可以提高检测特异性。

另一方面，本发明提供一种检测LHON致病突变的试剂盒，其包括如上任一项所述的CRISPR-Cas组合物。

另一方面，本发明提供一种检测LHON致病突变的方法，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的，其包括：使用如上任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或者如上所述的试剂盒进行检测。

另一方面，本发明提供一种检测LHON致病突变的方法，LHON致病突变选择如下突变中的至少一种：m.11778G>A、m.3460G>A、以及m.14484T>C；

当检测m.11778G>A突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

当检测m.3460G>A突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该rRNA的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；

当检测m.14484T>C突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该rRNA的核酸序列如SEQ ID NO.17所示。

可选地，在一些实施方案中，所述方法还包括：在将上述任意一种扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合后，往混合体系中加入可被Cas12a非特异性地切割的荧光探针，所述荧光探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有猝灭基团；

可选地，在一些实施方案中，所述荧光探针的核酸序列如SEQ ID NO.44所示。

可选地，在一些实施方案中，当检测m.11778G>A突变时，所述核酸样品的扩增体系中含有限制性内切酶SfaNⅠ；

当检测m.3460G>A突变时，所述核酸样品的扩增体系中含有限制性内切酶BsaHI。

可选地，在一些实施方案中，当检测m.11778G>A突变时，使用SEQ ID NO.26与SEQID NO.27所示的引物对进行扩增；

当检测m.3460G>A突变时，使用SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.35所示的引物对进行扩增；

当检测m.14484T>C突变时，使用SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.43所示的引物对进行扩增。

可选地，在一些实施方案中，在上述各混合体系中，Cas12a蛋白的含量为200ng/μL、crRNA 1μM和荧光探针为25pmol。当然，在其他，在一些实施方案中，这三种组分的含量可以在±5％的范围内变化。

本发明的检测基本原理如下：

基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统开发的核酸快速检测系统在COVID-19、African Swine Fever Virus和Dengue Virus等传染病领域被广泛使用。CRISPR相关蛋白Cas12a可以在针对靶序列设计的crRNA的引导下特异性识别和切割靶序列，同时发挥强大的反式酶切活性切割非特异性单链DNA(ssDNA)。基于Cas12a的上述特性，本发明的发明人研究开发了一种精准快速的检测方法，用于临床样本中m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C基因突变的检测。

Cas12a和crRNA复合体特异性结合并激活Cas12a的核酸内切酶活性，非特异性地切割荧光探针，释放出激活荧光基团，利用酶标仪可检测到上升的荧光读数，而肉眼可观察到荧光灯下的绿色反应。相反地，若检测样本中不存在m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C突变，将不会产生上升的荧光读数，肉眼也不会观察到绿色反应。

与现有技术相比，除前文所述优点以外，本发明还具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供了一种灵敏、特异、快速且可视化的基于CRISPR/Cas12a的组合物、试剂盒或方法，检测LHON三个原发常见位点突变检测技术(m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C)。

2、本发明涉及的快速检测技术，其检测结果可在荧光灯下进行肉眼直接判读，方便快捷，适合用于推广到基层实验室，进行大规模筛查。

3、本发明系首次采用Cas12a荧光法检测LHON三个原发常见位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)基因突变，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅展示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明CRISPR-Cas系统对LHON三个原发常见突变位点进行检测的流程示意图；

图2为不同crRNA检测m.11778突变体、野生型和水对照的相对荧光值结果示意图；

图3为不同crRNA检测m.3460突变体、野生型和水对照的相对荧光值结果示意图；

图4为不同crRNA检测m.14484突变体、野生型和水对照的相对荧光值结果示意图；

图5为不同RPA引物组合扩增等量质粒(m.11778位点)所得产物的相对荧光值结果示意图；

图6为不同RPA引物组合扩增等量质粒(m.3460位点)所得产物的相对荧光值结果示意图；

图7为不同RPA引物组合扩增等量质粒(m.14484位点)所得产物的相对荧光值结果示意图；

图8为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.11778质粒的酶标仪检测灵敏度结果示意图；

图9为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.3460质粒的酶标仪检测灵敏度结果示意图

图10为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.14484质粒的酶标仪检测灵敏度结果示意图

图11为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.11778质粒的肉眼观察灵敏度结果示意图；

图12为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.3460质粒的肉眼观察灵敏度结果示意图；

图13为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.14484质粒的肉眼观察灵敏度结果示意图；

图14为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.11778突变病人和正常人外周血不同浓度基因组DNA的肉眼观察特异性结果示意图；

图15为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.3460突变病人和正常人外周血不同浓度基因组DNA的肉眼观察特异性结果示意图；

图16为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.14484突变病人和正常人外周血不同浓度基因组DNA的肉眼观察特异性结果示意图；

图17为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.11778G>A不同突变率基因组DNA的肉眼观察结果示意图；

图18为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.3460G>A不同突变率基因组DNA的结果示意图；

图19为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测m.14484T>C不同突变率基因组DNA的结果示意图；

图20为采用本发明CRISPR-Cas系统荧光检测24例LHON患者血液样本的肉眼观察结果与患者一代测序峰图对比结果示意图。

图21为样本14外周血DNA进行一代测序m.11778位点的峰图和二代测序m.11778位点的示意图。

图22为表1中不同crRNA匹配到目靶序列上的位置关系图。

图23为LHON的三个原发常见突变位点(m.3460、m.11778和m.14484在线粒体(mtDNA)上的位置示意图。

图24为对LHON三个常见原发位点突变的不同检测方法的比较。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明中的RPA扩增试剂盒GenDx ERA Kit购自先达基因公司；检测所用crRNA和ssDNA探针合成由南京金斯瑞公司完成；核酸预处理使用先达基因公司的快速核酸释放剂。

附图1为由本发明CRISPR-Cas系统对LHON三个原发常见突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)进行检测的流程示意图，由本发明CRISPR-Cas系统对LHON三个原发常见突变位点(m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C)进行检测包括以下3部分：待测血液样本核酸释放、Cas12a检测体系构建和荧光检测。

实施例1：筛选针对LHON三个原发常见突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的crRNA

1.1核酸制备

本实施例中LHON三个原发常见突变位点(m.3460、m.11778和m.14484，其在线粒体上的位置如图23所示)野生型基因片段是扩增自293T细胞系基因组，将之分别整合到pGem-Tvector上即得到模拟野生型基因组的质粒，利用携带m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C突变的引物扩增质粒全长，再通过自连即可得到模拟突变型基因组的质粒。

1.2LHON三个原发常见突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的crRNA的设计和制备：

在m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C位点附近分别寻找包含Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的覆盖突变点且与突变型匹配的crRNA，为了进一步降低WT的杂信号，在crRNA上非突变位点处再设计一处错配碱基(见图22)；完成设计后，交由南京金斯瑞公司直接合成crRNA；

m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C位点附近部分序列如下：

ND1 WT：

attcctaatgcttaccgaacgaaaaattctaggctatatacaactacgcaaaggccccaacgttgtaggcccctacgggctactacaacccttcgctgacGccataaaactcttcaccaaagagcccctaaaacccgccacatctaccatcaccctctacatcaccgccccgaccttagctctcaccatcgctcttctact

下划线大写字母代表：m.3460位点；

ND4 WT：

tgaagcttcaccggcgcagtcattctcataatcgcccacgggcttacatcctcattactattctgcctagcaaactcaaactacgaacgcactcacagtcGcatcataatcctctctcaaggacttcaaactctactcccactaatagctttttgatgacttctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccactatt

下划线大写字母代表：m.11778位点；

ND6 WT：

gctaaccccactaaaacactcaccaagacctcaacccctgacccccatgcctcaggatactcctcaatagccatcgctgtagtatatccaaagacaaccaTcattccccctaaataaattaaaaaaactattaaacccatataacctcccccaaaattcagaataataacacacccgaccacaccgctaacaatcaatact。

下划线大写字母代表：m.14484位点。

本发明提供的crRNA序列如表1所示：

表1针对m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C突变特异性crRNA

1.3利用PCR产物筛选crRNA

利用PCR引物(SEQ ID NO.20和21，SEQ ID NO.22和23，SEQ ID NO.24和25，如表2所示)对所构建的野生型和突变型质粒进行扩增，将经AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen,CA,USA)纯化的PCR产物用ddH₂O稀释调整为1*e10拷贝/μL，取1μL作为检测样品进行Cas12a荧光检测反应。

表2PCR引物序列

SEQ Name	Primer name	Primer sequence
			SEQ ID NO.20	m.11778F1	aatcagccacatagccctcg
SEQ ID NO.21	m.11778R1	tttgatcaggagaacgtggt
			SEQ ID NO.22	m.3460F1	cacccaagaacagggtttgt
SEQ ID NO.23	m.3460R1	GCGGTGATGTAGAGGGTGAT
			SEQ ID NO.24	m.14484F1	caccaccccatcatactctt
SEQ ID NO.25	m.14484R1	atggggtttgtggggttttc

1.4Cas12a荧光检测反应

本发明采用20μL检测体系，成分如表3：

表3 Cas12a荧光检测体系

ssDNA FQ Reporter为荧光探针，核酸序列为SEQ ID NO.44，5’端为6-FAM，3’端为BHQ1。

对于每一个crRNA，均设计检测样品分别为野生型、突变型和ddH2O的三个反应管，以检测和比较交叉反应、灵敏度及背景信号。将混匀的体系置于37℃下反应15min。

1.5全波长酶标仪荧光检测

将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应30min时的荧光值。不同crRNA检测突变体、野生型和水对照的相对荧光值检测结果如图2所示，结果表明m.11778G>A crRNA1检测的特异性和灵敏度均较好，因此选择m.11778G>A crRNA1作为检测m.11778突变的crRNA；

m.3460G>A crRNA4检测的特异性和灵敏度均较好，因此选择m.3460G>A crRNA4作为检测m.3460突变的crRNA(图3)；

m.14484T>C crRNA5检测的特异性和灵敏度均较好，因此选择m.14484T>C crRNA5作为检测m.14484突变的crRNA(图4)。

实施例2：筛选扩增m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C区域的RPA引物

2.1RPA引物设计与合成

本实施例利用等温扩增技术对模拟质粒的m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C区域进行预扩增，用于后续的Cas12a检测反应。根据等温扩增引物设计的要求，设计For引物与Reverse引物，序列为SEQ ID NO.26至SEQ ID NO.43(如表4所示)，交由南京金斯瑞公司直接合成。将For和Reverse引物两两搭配，筛选出最高效的引物组合。

2.2RPA等温扩增反应

本实施例以m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C模拟质粒为模板筛选RPA扩增引物。根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e4拷贝模拟质粒的样品。具体操作步骤为：将2.5μL RPA-F，2.5μL RPA-R，1μL模拟质粒样品和42μL反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μL激活剂混匀，于37℃下反应15min。产物可直接用于下一步检测。

表4 m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C位点RPA扩增引物序列

2.3Cas12a荧光检测反应

本实施采用20μL检测体系，成分如表3，其中样品为上述反应产物，取5μL检测。不同RPA引物组合扩增等量质粒所得产物的全波长酶标仪荧光检测结果如图5-图7所示。结果表明11778-RPA-F1和11778-RPA-R1组合的扩增效率最好(图5)，因此选择11778-RPA-F1和11778-RPA-R1作为后续m.11778G>A检测的RPA引物；3460-RPA-F4和3460-RPA-R2组合的扩增效率最好(图6)，因此选择3460-RPA-F4和3460-RPA-R2作为后续m.3460G>A检测的RPA引物；14484-RPA-F1和14484-RPA-R6组合的扩增效率最好(图7)，因此选择14484-RPA-F1和14484-RPA-R6作为后续m.14484T>C检测的RPA引物。

实施例3：m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C位点的检测灵敏度

本实施例中，为测定采用本发明CRISPR-Cas系统对m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C的检测灵敏度，根据病人DNA不同浓度进行测试(1000ng、500ng、100ng、50ng、10ng、1ng和阴性对照NC)利用如实施例2中所述的荧光检测方法，分别对上述梯度稀释样品进行检测。操作简述如下：取1μL样品作为模板，分别加入到50μl RPA等温扩增体系中进行扩增，于37℃下反应15min。分别取5μL产物，加入到20μL表3中所述的Cas12a检测体系中，于37℃下反应30min后进行荧光结果判读。

本实施例中，荧光结果置于485nm激发光下肉眼观察或酶标仪检测，结果如图8-图13所示，由图可知，针对m.11778G>A位点，正常人DNA对m.11778G>A crRNA1有很强的交叉反应，随后在体系中加入了1μl的限制性内切酶SfaNⅠ，1μl SfaNⅠ足以酶切1-1000ng的基因组DNA；针对m.3460G>A位点，正常人DNA对m.3460G>A crRNA4有很强的交叉反应。随后在体系中加入了3μl的限制性内切酶BsaHⅠ，3μl BsaHⅠ足以酶切1-1000ng的基因组DNA；针对m.14484T>C位点，m.14484T>C crRNA5能特异识别m.14484T>C基因组DNA和正常人基因组DNA。由图可知，采用本发明CRISPR-Cas系统用肉眼直接观察也可实现对1ng突变基因组DNA高灵敏度检出。

实施例4：m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C基因组DNA的检测特异性

本实施例中，为测定采用本发明CRISPR-Cas系统对m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C的检测特异性，分别将m.11778G>A病人基因组DNA(100％突变)和正常人基因组DNA(0％突变)混样(m.11778G>A突变率100％、50％、25％、10％、5％和1％)、m.3460G>A病人基因组DNA(100％突变)和正常人基因组DNA(0％突变)混样(m.3460G>A突变率100％、50％、25％、10％、5％和1％)以及m.14484T>C病人基因组DNA(100％突变)和正常人基因组DNA(0％突变)混样(m.14484T>C突变率100％、50％、25％、10％、5％和1％)。

利用如实施例2中所述的荧光检测方法，分别对上述不同突变率样本进行检测。操作简述如下：取1μL上述样品作为模板，分别加入到50μLRPA等温扩增体系中进行扩增(m.3460G>A位点需加入3μl BsaHⅠ，m.11778G>A需加入1μl SfaNⅠ)，于37℃下反应15min。分别取5μL产物，加入到表3中所述的20μL Cas12a检测体系中，于37℃下反应30min后进行荧光结果判读。检测结果如图14-图19所示，采用本发明CRISPR-Cas系统采用酶标仪检测可实现对m11778G>A、m.3460G>A和m.14484T>C 1％突变率的高灵敏度检出；肉眼直接判读荧光反应时，将37℃下反应10min、20min和30min后的检测体系置于485nm激发光下，肉眼直接观察荧光反应，阳性结果为反应产物发出绿色荧光，阴性结果为无色，由图可知，采用本发明CRISPR-Cas系统用肉眼直接观察也可实现对1％突变率的高灵敏度检出。

实施例5：利用Cas12a荧光检测法快速检测病人样本

本实施例中所用的LHON病人外周血样本均为按照相关法律法规合格操作获得。

首先将10μL外周血样本与100μL核酸释放剂，于95℃下孵育3min。

取1μL孵育产物用于后续RPA和Cas12a荧光检测，步骤同实施例2～4，简述如下：分别取1μL核酸释放剂处理产物加入50μLRPA反应体系中，混匀后于37℃下反应15min；分别取5μl RPA反应产物加入到表3中所述的Cas12a荧光检测体系中，使总体积为20μL，混匀后于37℃下反应10min。

在本实施例中，试验结果如图20所示，由图可知，除了14号病人结果不同，其余23例患者样本在荧光灯下的肉眼判读结果与一代测序一致，随后对14号病人做了二代测序，发现该病人是m.11778G>A突变(低于10％)，与本发明检测结果一致(图21)。对于低突变率，一代测序存在自身的不足，无法检出，这也是本发明的优势之一。

上述实施例提供的检测方法以临床血液样本(5-10μl)加入100μl核酸释放剂释放基因组DNA为模板；利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术对包含m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C位点的DNA片段进行扩增(m.11778G>A加入内切酶SfaNⅠ，m.3460G>A位点加入内切酶BsaHⅠ)；最后，Cas12a-crRNA复合物特异性地结合m.3460G>A或m.11778G>A或m.14484T>C突变型双链DNA(dsDNA)，激活其非特异性酶切活性，切割与荧光报告分子偶联的单链DNA(ssDNA)，释放荧光信号。该方法快速、准确且易于操作，无需大型仪器，有潜力成为新型LHON致病突变筛查和检测技术。

本发明的检测系统，可以精准地检测LHON三个原发突变位点(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)是否有突变。该检测系统的优点是快速(从采血至检出时长为28分钟)、简便易操作、特异、灵敏(1％的突变率也可以检出)、可视化，无需大型仪器和昂贵试剂(见图24)。该检测系统不仅为LHON快速诊断提供了分子基础，而且适用于在人群中大规模筛查突变携带者，为其遗传咨询和产前诊断提供帮助。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

agucacauca uaauccucuc uca 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

agucacacca uaauccucuc uca 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

agucacagca uaauccucuc uca 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

agucacauua uaauccucuc uca 23

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

agucacauga uaauccucuc uca 23

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

agucacaucg uaauccucuc uca 23

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

agucacaucu uaauccucuc uca 23

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

uagugucagc gaaggguugu agu 23

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ugaugucagc gaaggguugu agu 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ugguaucagc gaaggguugu agu 23

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

uggugccagc gaaggguugu agu 23

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ugguguuagc gaaggguugu agu 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

gggggaaugg ugguugucuu ugg 23

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gggggaacgg ugguugucuu ugg 23

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gggggaaagg ugguugucuu ugg 23

<210> 16

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

gggggaaggg ugguugucuu ugg 23

<210> 17

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

gggggaaugg uaguugucuu ugg 23

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

gggggaaugg ucguugucuu ugg 23

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

gggggaaugg uuguugucuu ugg 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

aatcagccac atagccctcg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

tttgatcagg agaacgtggt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

cacccaagaa cagggtttgt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

gcggtgatgt agagggtgat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

caccacccca tcatactctt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

atggggtttg tggggttttc 20

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

cctagcaaac tcaaactacg aacgcactcc cag 33

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

ttagcgaggc ttgctagaag tcatcaaaaa gc 32

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

tcccagtagg ttaatagtgg ggggtaaggc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ttaatagtgg ggggtaaggc gaggttagcg 30

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

aacgtggtta ctagcacaga gagttctccc ag 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

atatttgatc aggagaacgt ggttactagc 30

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

caactacgca aaggccccaa cgttgtaggc c 31

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

ttgtaggccc ctacgggcta ctacaaccct tcgc 34

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

tcatagtaga agagcgatgg tgagagctaa ggtc 34

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

ctaaggtcgg ggcggtgatg tagagggtg 29

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

tagatgtggc gggttttagg ggctctttgg 30

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

tagctatcgc tgtagtatat ccaaagacaa cc 32

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

ttatgggggt ttagtattga ttgttagcgg 30

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

ttagcggtgt ggtcgggtgt gttattattc tg 32

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

tattgattgt tagcggtgtg gtcgggtgtg 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

tattctgaat tttgggggag gttatatggg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

ttcttctaag ccttctccta tttatggggg 30

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

taatggggtt tgtggggttt tcttctaagc c 31

<210> 44

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

tttattt 7

<210> 45

<211> 3744

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

agcaagctgg aaaaatttac caactgctac agcctgagca agaccctgcg tttcaaagcg 60

atcccggttg gcaagaccca ggaaaacatt gacaacaaac gtctgctggt tgaggacgaa 120

aagcgtgcgg aggattataa aggtgtgaag aaactgctgg atcgttacta tctgagcttt 180

atcaacgacg tgctgcacag cattaagctg aaaaacctga acaactacat cagcctgttc 240

cgtaagaaaa cccgtaccga gaaggaaaac aaagagctgg aaaacctgga aatcaacctg 300

cgtaaggaga ttgcgaaggc gttcaagggt aacgagggct acaagagcct gttcaagaaa 360

gatatcatcg aaaccatcct gccggagttc ctggacgata aggacgaaat tgcgctggtt 420

aacagcttca acggttttac caccgcgttc accggcttct ttgataaccg tgagaacatg 480

tttagcgagg aagcgaaaag caccagcatc gcgttccgtt gcattaacga aaacctgacc 540

cgttacatca gcaacatgga cattttcgag aaggttgacg cgatctttga taaacacgag 600

gtgcaggaaa tcaaggagaa aattctgaac agcgactatg atgttgaaga tttctttgag 660

ggtgaattct ttaactttgt tctgacccaa gagggcatcg acgtgtacaa cgcgatcatt 720

ggtggcttcg tgaccgaaag cggcgagaag atcaaaggcc tgaacgagta cattaacctg 780

tataaccaga agaccaaaca aaagctgccg aaatttaagc cgctgtataa gcaggtgctg 840

agcgatcgtg aaagcctgag cttctacggc gagggctata ccagcgacga ggaagttctg 900

gaagtgtttc gtaacaccct gaacaaaaac agcgagatct tcagcagcat taagaaactg 960

gaaaagctgt tcaaaaactt tgacgagtac agcagcgcgg gtatctttgt taagaacggc 1020

ccggcgatca gcaccattag caaagatatc ttcggtgaat ggaacgtgat tcgtgacaag 1080

tggaacgcgg agtatgacga tatccacctg aagaaaaagg cggtggttac cgaaaagtac 1140

gaggacgatc gtcgtaaaag cttcaaaaag attggcagct ttagcctgga acagctgcaa 1200

gagtacgcgg acgcggatct gagcgtggtt gaaaaactga aggagatcat tatccagaag 1260

gttgatgaaa tctacaaagt gtatggtagc agcgagaagc tgttcgacgc ggattttgtt 1320

ctggagaaga gcctgaaaaa gaacgacgcg gtggttgcga tcatgaagga cctgctggat 1380

agcgtgaaaa gcttcgaaaa ctacattaag gcgttctttg gtgaaggcaa agagaccaac 1440

cgtgacgaga gcttctatgg cgattttgtt ctggcgtacg acatcctgct gaaggtggac 1500

cacatctacg atgcgattcg taactatgtt acccaaaaac cgtacagcaa ggataagttc 1560

aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg ggtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620

tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680

tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740

aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccga aagtgttctt tagcaaaaag 1800

tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860

aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920

agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980

aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040

ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100

ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160

atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220

gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280

aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340

gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400

attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460

cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520

gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580

aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640

gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700

ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760

atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820

gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880

agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940

agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000

agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060

gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120

ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180

aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240

aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300

tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360

gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420

accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480

tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540

aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600

gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660

gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720

caccaccacc accaccacca ctga 3744

Claims (12)

1.检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物，其特征在于，所述LHON致病突变选择如下突变中的至少一种：

m.11778G>A、m.3460G>A、以及m.14484T>C；

所述CRISPR-Cas组合物包括独立存在的如下组分：Cas12a蛋白和crRNA；

crRNA选自检测m.11778G>A的SEQ ID NO.1、检测m.3460G>A的SEQ ID NO.11、以及检测m.14484T>C的SEQ ID NO.17的至少一种。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas组合物，其特征在于，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的dsDNA扩增引物对：

所述dsDNA扩增引物对选自如下引物对中的至少一种：

引物对1：SEQ ID NO.26与SEQ ID NO.27、引物对2：SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.35、以及引物对3：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.43。

3.根据权利要求2所述的CRISPR-Cas组合物，其特征在于，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的可被Cas12a非特异性地切割的荧光探针，所述荧光探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有猝灭基团。

4.根据权利要求3所述的CRISPR-Cas组合物，其特征在于，所述荧光探针的核酸序列如SEQ ID NO.44所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的CRISPR-Cas组合物，其特征在于，所述CRISPR-Cas组合物还包括独立存在的限制性内切酶SfaNI和/或BsaHⅠ。

6.一种检测LHON致病突变的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物。

7.一种检测LHON致病突变的方法，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的，其特征在于，其包括：使用权利要求1-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或者权利要求6所述的试剂盒进行检测。

8.一种检测LHON致病突变的方法，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的，其特征在于，所述LHON致病突变选择如下突变中的至少一种：m.11778G>A、m.3460G>A、以及m.14484T>C；

当检测m.11778G>A突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，将扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

当检测m.3460G>A突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，将扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该rRNA的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；

当检测m.14484T>C突变时，所述方法包括：对待测核酸样品进行扩增后，将扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应，该rRNA的核酸序列如SEQ ID NO.17所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在将上述任意一种扩增产物与Cas12a蛋白和crRNA混合后，往混合体系中加入可被Cas12a非特异性地切割的荧光探针，所述荧光探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有猝灭基团。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述荧光探针的核酸序列如SEQ IDNO.44所示。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，当检测m.11778G>A突变时，所述核酸样品的扩增体系中含有限制性内切酶SfaNⅠ；

当检测m.3460G>A突变时，所述核酸样品的扩增体系中含有限制性内切酶BsaHI。

12.根据权利要求8-11任一项所述的方法，其特征在于，

当检测m.11778G>A突变时，使用SEQ ID NO.26与SEQ ID NO.27所示的引物对进行扩增；

当检测m.3460G>A突变时，使用SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.35所示的引物对进行扩增；

当检测m.14484T>C突变时，使用SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.43所示的引物对进行扩增。