CN113584167A - 一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测FLT3‑F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒，所述crDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测FLT3‑F691L突变的等温扩增引物，包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物；所述试剂盒含有所述crDNA或者所述的crRNA、以及Cas12a蛋白、荧光探针和所述等温扩增引物。本发明首次采用CRISPR荧光法检测FLT3基因F691L突变，具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL)、特异形的特点。

Description

一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒。
背景技术
基因研究和诊断是实现精准医疗的关键，其中耐药突变的检测对于指导临床用药和判断预后具有重要意义。FLT3(fms-样酪氨酸激酶-3)基因是III型酪氨酸激酶受体家族成员，其突变与急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)的发生发展密切相关，约三分之一的AML患者具有FLT3基因突变。近几年FLT3抑制剂如Gilteritinib和Quizartinib的上市为AML患者带来了希望，然而耐药突变的产生会导致无效治疗。FLT3基因的F691L突变是导致FLT3抑制剂获得性耐药的最常见原因之一。
目前FLT3基因F691L突变的检测是通过常规PCR和测序技术实现。但现有的技术存在一些缺陷，如需要专业人员操作PCR仪、一代测序灵敏度不高、二代测序耗时长以及成本较高等，不适合用于床旁检测和推广到基层社区。
因此，有必要开发一种更高效、灵敏的基于CRISPR/Cas13系统的FLT3-F691L突变的检测试剂盒。
发明内容
本发明目的是提供一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒，特异性强，灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述技术方案中，所述crRNA的制备方法为设计并直接合成crRNA，或者构建载体pUC57-T7-crRNA，用转录试剂盒进行体外转录获得crRNA。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物，所述等温扩增引物包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物。
在本发明的第三方面，提供了所述的crRNA或/和所述的用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物在制备用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒上的用途。
在本发明的第四方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，含有所述crDNA或者所述的crRNA、以及Cas12a蛋白和荧光探针。
进一步地，所述荧光探针为ssDNA-FQ reporter，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
作为本发明实施例的一种实施方式，所述ssDNA-FQ reporter的5’端修饰有6-羧基荧光素(6-FAM)基团，3’端修饰有荧光淬灭剂(BHQ1)基团。标记产物如下：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA-FQ reporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
上述技术方案中，所述Cas12a蛋白可以购买或者制备得到，所述Cas12a蛋白的制备步骤为：优化Cas12a蛋白的核酸序列原核密码子，获得优化序列SEQ ID NO.21，将该序列构建到pET28a表达载体上，经低温诱导表达可溶蛋白，再经过亲和纯化及分子筛纯化可获得目的蛋白；
作为优选方案，所述试剂盒使用时，检测体系包括：Cas12a蛋白200ng、crRNA1pM和ssDNA-FQ reporter 25pmol。
作为优选方案，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂，起到防止DNA降解的作用。
进一步地，所述试剂盒还包括RPA等温扩增体系，所述RPA等温扩增体系包括RPA等温扩增引物对：上引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下引物，核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。
作为以上实施方式之一，所述试剂盒为液体试剂盒时，所述试剂盒为液体试剂盒时，将所述检测体系孵育后，结果既可通过酶标仪的荧光读数判读，也可在蓝光灯下直接用肉眼观察。对于本发明使用的ssDNA-FQ reporter，酶标仪检测的激发光应设置为485nm～520nm，而肉眼观察时使用的蓝光灯波长为485nm。
在荧光检测的过程中，若被检测样本DNA中含有FLT3基因F691L突变，则酶标仪可显示逐渐上升的荧光读数，而在蓝光灯下肉眼可观察到绿色荧光反应。反之，若被检测样本DNA中无FLT3基因F691L突变，则酶标仪不会产生逐渐上升的荧光读数，在蓝光灯下肉眼也不能观察到绿色荧光反应。
所述试剂盒的使用方法包括：
提取待测的样品基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板扩增获得DNA扩增产物；
将所述的扩增产物、crRNA、Cas12a蛋白和荧光探针和无酶水构成的检测反应体系进行检测。
进一步地，所述以所述基因组DNA为模板扩增获得DNA扩增产物采用RPA等温扩增体系，所述RPA等温扩增体系包括RPA等温扩增引物，包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物。
更进一步地，所述cDNA为模板扩增获得DNA扩增产物采用RPA等温扩增体系包括：10μM,2.4μL Primer A，10μM,2.4μL Primer B，29.5μLRPA反应buffer，2μLTemplate，13.2μL ddH2O。
作为本发明实施例的一种实施方式，使用20μL的Cas12a检测体系，所述检测反应体系包括：：10*缓冲液2μL，40U/μL RNA酶抑制剂1μL，Cas12a蛋白200ng 1μL，ssDNA-FQreporter 25pmol，1μM crRNA 1μL，检测样品XμL，无酶水14-XμL。
作为以上实施方式之一，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒时；所述胶体金检测试剂盒包括所述的检测试剂以及胶体金载体，所述胶体金载体包括底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有单克隆抗体包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近结合垫的一侧设有质控线，靠近吸水垫的一侧设有检测线；所述质控线上涂有链霉亲和素；所述检测控线上涂有捕获抗体。采用胶体金试剂盒检测时，所述荧光探针的序列的5’端或3’端均标记有荧光基团，3’端或5’端标记有生物素。具体地，本发明选用所述荧光探针的序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种。所述胶体金检测试剂盒使用时，将扩增产物、Cas12a蛋白/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区。将所述检测体系滴加在所述试剂盒中的样品垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断为阳性；否则为阴性。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒，具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL)、特异形的特点，具体地：
(1)为保证突变检测的特异性，所设计的crRNA均经过NCBI核酸数据库检索，未发现与包括微生物、动植物和人等在内的基因组的高同源性匹配。为提高crRNA对野生型和突变型的区分度，人为在crRNA上引入一个错配碱基，进一步消除突变靶向性crRNA与野生型序列结合产生的交叉信号。
(2)本发明涉及的快速检测技术可在蓝光灯下用肉眼直接判读结果，简易直观，适合用于基层医疗机构和床旁检测。
(3)本发明系首次采用CRISPR荧光法检测FLT3基因F691L突变，具有快速、灵敏、特异、操作简便、无需昂贵试剂和摆脱了大型实验仪器等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明检测FLT3基因F691L突变的流程示意图；
图2为不同F691L-crRNA检测的特异性比较结果；
图3为不同ERA引物组合的扩增效率比较结果；
图4为采用本发明检测梯度突变率的FLT3基因F691L突变质粒的酶标仪结果示意图；
图5为采用本发明检测8例AML患者血液样本的肉眼观察结果与二代测序结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例的总体思路如下：
基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统开发的新型核酸检测工具为基因突变的快速灵敏检测提供了新策略，其中以CRISPR为核心的检测技术受到研究者的青睐。其原理是，在工程优化设计的特异性识别靶序列的crRNA的引导下，Cas12a蛋白可以结合并切割靶序列，同时激活其反式酶切活性，非特异性地切割周围的单链DNA(ssDNA)。当ssDNA上连接有荧光报告集团时，被切割后即可发出荧光信号，提示检测到靶序列。利用上述特性，发明人研究开发了一种灵敏快速的检测方法，用于临床病人样本中FLT3基因F691L突变的检测。
首先，对待检患者的血液样本作裂解红细胞和离心处理，富集得到有核的白细胞，加入核酸快速释放剂释放DNA；
然后，使用酶促重组等温扩增(ERA)技术对覆盖FLT3基因F691L位点的DNA区域进行扩增；
最后，加入Cas12a、crRNA与ssDNA-FQ reporter混合物特异性结合F691L突变型双链DNA(dsDNA)，并非特异性地切割ssDNA-FQ reporter，发出荧光信号。
该方法准确、快速且操作简易，无需昂贵试剂和大型仪器，非常适合基层医疗机构和床旁检测。
本发明中使用的酶促重组等温扩增试剂盒GenDx ERA Kit以及细胞DNA释放处理采用的快速核酸释放剂购自先达基因公司；检测使用的crRNA和ssDNA-FQ reporter的合成由南京金斯瑞公司完成。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒进行详细说明。
实施例1、筛选针对FLT3基因F691L突变体的crRNA
1、靶向FLT3基因F691L突变体的crRNA的设计与制备
在FLT3基因F691位点周围寻找包含TTTN的Cas12a识别序列，设计长度为23nt的与突变型互补的序列构建crRNA，为了进一步降低crRNA与野生型序列的交叉信号，共设计10条crRNA供筛选；设计的crRNA交由南京金斯瑞公司直接合成；
本发明提供的crRNA序列如表1所示：
表1-靶向FLT3基因F691L突变体的crRNA
Figure BDA0003151280880000051
2、利用基因片段筛选crRNA
将包含FLT3基因F691位点的基因片段(SEQ ID NO.11)用ddH2O调整浓度为1e10拷贝/μL，取1μL作为样品测试不同crRNA的CRISPR荧光检测反应。
3、CRISPR荧光检测反应
本发明使用20μL的Cas12a检测体系，成分为：10*缓冲液2μL，40U/μL RNA酶抑制剂1μL，Cas12a蛋白200ng 1μL，ssDNA-FQ reporter 25pmol，1μM crRNA 1μL，检测样品XμL，无酶水14-XμL。
对每个crRNA的测试均设置检测样品分别为野生型片段、突变型片段和ddH2O的三个反应管，比较检测的灵敏度和特异性。反应条件为37℃下孵育15min。反应结束后用全波长酶标仪进行荧光读数，激发光采用485nm波长，发射光波长为520nm。结果如图2所示，结果表明FLT3-F691L-crRNA3检测的特异性和灵敏度均较好，因此将FLT3-F691L-crRNA3作为检测FLT3-F691L突变的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、筛选扩增FLT3基因F691区域的ERA引物
1、ERA引物的设计与合成
本实施例使用ERA等温扩增技术对FLT3基因F691位点区域进行预扩增，用于后续的CRISPR检测反应。按照ERA引物设计原则设计出4条正向引物和4条反向引物，序列如表2所示，交由南京金斯瑞公司直接合成。将正向引物和反向引物两两搭配，筛选出扩增效率最高的引物组合。
表2-FLT3基因F691区域的ERA扩增引物序列
Figure BDA0003151280880000061
2、ERA等温扩增
本实施例以1e3拷贝/μL的含有FLT3基因F691L突变片段的质粒为模板进行ERA扩增引物的筛选。具体操作如下：在反应管中将1μL质粒样品，2.5μL ERA-F，2.5μL ERA-R和42μL反应缓冲液充分混匀，最后加入2μL激活剂，充分混匀并瞬时离心，在37℃下孵育15min。
3、CRISPR荧光检测反应
取5μL ERA扩增产物进行CRISPR荧光检测。不同ERA引物组合的扩增产物的酶标仪读数结果如图3所示。结果表明ERA-F2和ERA-R1的引物组合扩增效率最好，因此选择ERA-F2与ERA-R1作为FLT3基因F691L突变检测体系的引物。
实施例3、FLT3基因F691片段的检测特异性
本实施例以1e5拷贝/μL质粒样品进行检测，质粒的F691L突变率依次为100％，10％，1％，0.1％，0.01％，0％(即全部为野生型)。操作步骤简述如下：取1μL上述样品作为模板，以50μLERA等温扩增体系(以ERA-F2与ERA-R1为引物)进行扩增，在37℃下孵育扩增15min。后续CRISPR荧光检测如实施例2所述。
荧光结果采用酶标仪读数，结果如图4所示，结果表明采用本发明检测FLT3基因F691L突变可达到0.1％的灵敏度。
实施例4、利用本发明快速检测病人样本的FLT3基因F691L突变
本实施例中的8例急性髓系白血病患者血液样本的获取符合相关法律法规。附图1为本发明检测FLT3基因F691L突变的流程示意图，由本发明对FLT3基因F691L突变进行检测的流程包括以下5部分：富集待测血液样本的白细胞、核酸快速释放处理、ERA等温扩增目的片段、Cas12a体系检测以及荧光判读结果。具体步骤为：
首先将200～500μL血液样本与四倍体积的红细胞裂解液混合，充分裂解红细胞1min，然后用小离心机离心1min沉淀白细胞。用100μL核酸快速释放剂释放基因组DNA，反应条件为95℃下孵育3min。
取1μL核酸释放处理产物用于后续的ERA扩增和CRISPR荧光检测，步骤与实施例2～3相同。
在本实施例中，检测结果如图5所示，8例患者样本在蓝光灯下的肉眼观察结果与二代测序结果吻合，即7例为野生型，1例为4.2％突变率的FLT3基因F691L突变型。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学中南医院
<120> 一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggcauacugu ugcu 44
<210> 2
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu gguauacugu ugcu 44
<210> 3
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggaauacugu ugcu 44
<210> 4
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu gggauacugu ugcu 44
<210> 5
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggacuacugu ugcu 44
<210> 6
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggauuacugu ugcu 44
<210> 7
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggaguacugu ugcu 44
<210> 8
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggaacacugu ugcu 44
<210> 9
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggaagacugu ugcu 44
<210> 10
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uaauuucuac uaaguguaga ucuugauuuu ggaaaacugu ugcu 44
<210> 11
<211> 349
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttaaagta taagaagagc taggctcaga aaaagttgta ctgtccccaa gtcagcagag 60
aaccaagccc tcctaagagt atgttgtctg ctacatagac ttctgaaata acagtttgct 120
ttgtgtatgc ctataattga aactgtaact atttcaggac caatttactt gatttttgaa 180
tactgttgct atggtgatct tctcaactat ctaagaagta aagagaaaaa tttcacagga 240
cttggacaga gattttcaag gaacacaatt tcagttttta ccccactttc caatcacatc 300
caaattccag gtaagaggct gggtcagggt ttcgtaatta cacatcata 349
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcctaagagt atgttgtctg ctacatagac 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctgaaataa cagtttgctt tgtgtatgcc 30
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttgctttgt gtatgcctat aattgaaact g 31
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctataattg aaactgtaac tatttcagga cc 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttagatagtt gagaagatca ccatagcaac ag 32
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttacttctt agatagttga gaagatcacc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttccttgaaa atctctgtcc aagtcctgtg 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acctggaatt tggatgtgat tggaaagtgg 30
<210> 20
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttattt 7
<210> 21
<211> 3744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcaagctgg aaaaatttac caactgctac agcctgagca agaccctgcg tttcaaagcg 60
atcccggttg gcaagaccca ggaaaacatt gacaacaaac gtctgctggt tgaggacgaa 120
aagcgtgcgg aggattataa aggtgtgaag aaactgctgg atcgttacta tctgagcttt 180
atcaacgacg tgctgcacag cattaagctg aaaaacctga acaactacat cagcctgttc 240
cgtaagaaaa cccgtaccga gaaggaaaac aaagagctgg aaaacctgga aatcaacctg 300
cgtaaggaga ttgcgaaggc gttcaagggt aacgagggct acaagagcct gttcaagaaa 360
gatatcatcg aaaccatcct gccggagttc ctggacgata aggacgaaat tgcgctggtt 420
aacagcttca acggttttac caccgcgttc accggcttct ttgataaccg tgagaacatg 480
tttagcgagg aagcgaaaag caccagcatc gcgttccgtt gcattaacga aaacctgacc 540
cgttacatca gcaacatgga cattttcgag aaggttgacg cgatctttga taaacacgag 600
gtgcaggaaa tcaaggagaa aattctgaac agcgactatg atgttgaaga tttctttgag 660
ggtgaattct ttaactttgt tctgacccaa gagggcatcg acgtgtacaa cgcgatcatt 720
ggtggcttcg tgaccgaaag cggcgagaag atcaaaggcc tgaacgagta cattaacctg 780
tataaccaga agaccaaaca aaagctgccg aaatttaagc cgctgtataa gcaggtgctg 840
agcgatcgtg aaagcctgag cttctacggc gagggctata ccagcgacga ggaagttctg 900
gaagtgtttc gtaacaccct gaacaaaaac agcgagatct tcagcagcat taagaaactg 960
gaaaagctgt tcaaaaactt tgacgagtac agcagcgcgg gtatctttgt taagaacggc 1020
ccggcgatca gcaccattag caaagatatc ttcggtgaat ggaacgtgat tcgtgacaag 1080
tggaacgcgg agtatgacga tatccacctg aagaaaaagg cggtggttac cgaaaagtac 1140
gaggacgatc gtcgtaaaag cttcaaaaag attggcagct ttagcctgga acagctgcaa 1200
gagtacgcgg acgcggatct gagcgtggtt gaaaaactga aggagatcat tatccagaag 1260
gttgatgaaa tctacaaagt gtatggtagc agcgagaagc tgttcgacgc ggattttgtt 1320
ctggagaaga gcctgaaaaa gaacgacgcg gtggttgcga tcatgaagga cctgctggat 1380
agcgtgaaaa gcttcgaaaa ctacattaag gcgttctttg gtgaaggcaa agagaccaac 1440
cgtgacgaga gcttctatgg cgattttgtt ctggcgtacg acatcctgct gaaggtggac 1500
cacatctacg atgcgattcg taactatgtt acccaaaaac cgtacagcaa ggataagttc 1560
aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg ggtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620
tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680
tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740
aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccga aagtgttctt tagcaaaaag 1800
tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860
aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920
agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980
aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040
ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100
ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160
atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220
gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280
aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340
gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400
attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460
cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520
gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580
aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640
gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700
ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760
atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820
gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880
agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940
agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000
agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060
gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120
ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180
aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240
aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300
tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360
gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420
accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480
tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540
aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600
gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660
gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720
caccaccacc accaccacca ctga 3744

Claims (9)

1.一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
2.一种用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物，其特征在于，所述等温扩增引物包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物。
3.一种权利要求1所述的crRNA或/和权利要求2所述的用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物在制备用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒上的用途。
4.一种用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的crRNA、以及Cas12a蛋白和荧光探针。
5.如权利要求4所述的用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针为ssDNA-FQ reporter，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
6.如权利要求5所述的用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，检测体系包括：Cas12a蛋白200ng、crRNA1pM和ssDNA-FQ reporter 25pmol。
7.如权利要求4所述的用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。
8.如权利要求4所述的用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2所述的用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物。
9.如权利要求4-8任一所述的用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光检测试剂盒或者胶体金检测试剂盒。
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