CN114774525A - 一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒 - Google Patents

一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测BCR‑ABL融合基因的ERA引物和探针，包括检测BCR‑ABL1基因的ERA引物和探针及检测BCR‑ABL2基因的ERA引物和探针，ERA引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNO:1‑4所示。检测BCR‑ABL融合基因的方法：以待测样本DNA为模板，采用上述检测BCR‑ABL1基因的ERA引物和探针及检测BCR‑ABL2基因的ERA引物和探针进行酶促重组等温扩增，然后对扩增产物进行检测，根据检测结果进行判断。与现有检测BCR‑ABL1基因的方法相比，本发明检测方法能够快速、灵敏、特异的检测出两种类型的BCR‑ABL融合基因，并且操作简单，不需要复杂仪器，检测成本低。

Description

一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针及试剂盒。
背景技术
慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％。针对CML分子发病机制的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)将CML的治疗带入了分子靶向治疗阶段，显著延长了患者的生存时间。CML发病机制主要为9号染色体和22号染色体易位形成Ph染色体，产生BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因中BCR基因的断裂区主要分为三个类型：Major-BCR(M-BCR)、minor(m-BCR)和u-BCR。其中，M-BCR区BCR基因的断裂点通常被限制在一个5.8kb的DNA片段区域，断裂点发生在外显子e13和e14或e14和e15之间，断裂后的BCR基因外显子上游留在22号染色体上，并与ABL基因断裂后的外显子a2融合，转录为e13a2或e14a2型mRNA，编码P210融合蛋白，见于95％以上的CML病例中；m-BCR区域的BCR基因断裂点通常发生在外显子e1和e2之间，转录为e1a2型的mRNA，编码P190融合蛋白，见于3％非典型CML和2/3的Ph+急性B淋巴细胞白血病病例中；u-BCR区域的BCR基因断裂点通常发生在外显子e19和e20之间，转录为e19a2型mRNA，编码P230融合蛋白，常见于慢性中性粒细胞白血病病例中。CML表现为持续、进行性外周血白细胞数量增加，且分类中出现不同分化阶段的粒细胞(主要以中性粒细胞增多为主)，90％以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的Ph染色体及其分子标志BCR-ABL融合基因。因此，BCR-ABL融合基因检测已经成为CML诊断的“黄金标准”。
目前检测BCR-ABL融合基因的方法主要有荧光原位杂交法、荧光定量PCR法、基因芯片法、PCR测序法等。然而，该类方法均存在设备依赖性、成本高、实验方法繁琐，时间长等缺点。
酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)方法自近年来被开发出来后，因其快速(15-30分钟)、简易(无需特殊设备)、灵敏、特异等特点近年来被广泛用于病毒、细菌等物种的鉴定工作，为物种大规模快速检测做出了巨大贡献。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中检测BCR-ABL融合基因的方法存在的不足，提供一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针及试剂盒。
技术方案
一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针，包括检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针；
所述检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL1-F1引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针，所述BCR-ABL1-F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述BCR-ABL12-R反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述BCR-ABL12-PB探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL2-F78引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针，所述BCR-ABL2-F78引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述BCR-ABL12-R反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述BCR-ABL12-PB探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
一种检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，包括上述检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针。
进一步，所述试剂盒还包括溶解剂和激活剂。
一种检测BCR-ABL融合基因的方法：以待测样本DNA为模板，采用上述检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针进行酶促重组等温扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行检测，根据检测结果进行判断。
所述检测BCR-ABL1基因的反应体系为：
Figure BDA0003577220470000021
所述检测BCR-ABL2基因的反应体系为：
Figure BDA0003577220470000022
Figure BDA0003577220470000031
所述酶促重组等温扩增的反应条件为：37℃下恒温反应20min。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针及试剂盒，能够快速(15-30分钟)、灵敏、特异的检测出三种类型的BCR-ABL融合基因，检测覆盖度高，并且操作简单，不需要复杂仪器，检测成本低。
附图说明
图1为针对BCR-ABL1型BCR-ABL融合基因的灵敏度和特异性检测结果，
图2为针对BCR-ABL2型BCR-ABL融合基因的灵敏度和特异性检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
引物和探针的设计与合成：
利用BCR-ABL1(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和BCR-ABL2(核苷酸序列如SEQID NO:6所示)融合位点附近特异序列，设计检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针，包括检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针，共设计了3条ERA引物和一条特异性荧光探针，核苷酸序列见表1：
表1引物和探针序列
Figure BDA0003577220470000032
引物和探针序列送至金斯瑞有限公司合成，合成后稀释为10uM备用。其中，检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL1-F1引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针，检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL2-F78引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针。
实施例2
一种检测BCR-ABL融合基因的方法：以待测样本DNA为模板，采用实施例1的检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针进行酶促重组等温扩增，所述酶促重组等温扩增的反应条件为：37℃下恒温反应20min；得到扩增产物。对扩增产物进行检测，由于本发明中设计有特异性较强的寡核苷酸链—TaqMan探针，探针与靶序列互补配对，在扩增产物进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得探针上的5’端荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团分离，发射荧光，荧光信号与产物的量相匹配，因而可根据荧光信号的强弱来判断产物扩增量的结果。
检测BCR-ABL1基因亚型的反应体系见表2：
表2
Figure BDA0003577220470000041
检测BCR-ABL2基因亚型的反应体系见表3：
表3
Figure BDA0003577220470000042
上述反应体系中，溶解剂及配套反应缓冲液均为先达基因生物科技有限公司产品。
实施例3
以构建于PUC57载体的BCR-ABL融合基因BCR-ABL1和BCR-ABL2序列质粒(由江苏金斯瑞生物公司合成构建)作为实验材料，对检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针进行灵敏度及特异性实验，步骤如下：
1)灵敏度实验设灵敏度阴性对照组(模板由ddH2O代替)和BCR-ABL灵敏度实验组(模板为10copies、102copies、103copies、104copies和105copies的BCR-ABL融合基因质粒)，特异性实验设阴性对照组(模板由ddH2O代替)和BCR-ABL特异性实验组(模板为104copies的BCR-ABL融合基因质粒)，按照表2-3的反应体系中自上而下的顺序往灭菌PCR管中进行加样；
2)轻轻用手指弹试管底部20次，使其充分混合，放入瞬时离心机离心数秒，使反应液沉到底部；
3)将配置好的反应试管置于荧光定量PCR仪中，37℃下恒温反应20分钟，30秒收集一次荧光信号。
测试结果见图1和图2，图1为针对BCR-ABL1型BCR-ABL融合基因的灵敏度和特异性检测结果，其中，图1A为灵敏度检测结果，图1B为特异性检测结果；图2为针对BCR-ABL2型BCR-ABL融合基因的灵敏度和特异性检测结果，其中，图2A为灵敏度检测结果，图2B为特异性检测结果。由图1A和图2A可以看出，本发明每反应中最低可检测出10copies的BCR-ABL1和BCR-ABL2融合基因，且随每反应中BCR-ABL融合基因拷贝数量的增加，检测结果中荧光值越高，表明灵敏度良好；由图1B和2B可以看出，采用本发明的特异性探针及引物进行扩增后，仅能扩增出引物和探针对应的BCR-ABL融合基因型，并未出现非特异性扩增，表明该扩增反应特异性良好。
采用本发明的特异性探针及引物检测基因BCR-ABL1融合基因，为e14a2型融合，编码P210蛋白，突变频率为52.64％；检测基因BCR-ABL2融合基因，为e14a2型融合，编码P210融合蛋白，突变频率为32.68％。BCR-ABL1和BCR-ABL2在编码P210融合蛋白的融合基因的突变比率中占99.4％。说明检测覆盖度比较高。
序列表：
SEQ ID NO:1
BCR-ABL1-F1
CTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCA
SEQ ID NO:2
BCR-ABL2-F78
TGTGAAACTCCAGACTGTCCACAGCATTCC
SEQ ID NO:3
BCR-ABL12-R
TTCCTTAGAGTTCCAACGAGCGGCTTCACT
SEQ ID NO:4
BCR-ABL12-PB
AGCCCTTCAGCGGCCTGTAGCATCTGACT(THF)TGTGCCTCAGGGTCT
SEQ ID NO:5
BCR-ABL1基因
ATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGTTGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACCCCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACAAGTCCTCAGGCTACCACTATGGGGTCAGCGCCTGTGAGGGCTGCAAGGGCTTC
SEQ ID NO:6
BCR-ABL2基因
TATGGCTGTGGTACAGTCAGTGCCCGGGGCACACCCCGTGCCAGTGTACGCCTTCTCCATCAAAGGCCCTTCCTATGGAGAGGATGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGACCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACAAGTCCTCAGGCTACCACTATGGGGTCAGCGCCTGTGAGGGCTGCAAGGGCT
序列表
<110> 孙家和 杨应鑫 朱烨颖 朱奕玮 陆祺 桑倩倩 梁睿 单双双
<120> 一种检测 BCR-ABL 融合基因的ERA引物和探针及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<400> 1
ctctatgggt ttctgaatgt catcgtcca 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<400> 2
tgtgaaactc cagactgtcc acagcattcc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<400> 3
ttccttagag ttccaacgag cggcttcact 30
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<220>
<221> iDNA
<223> y=THF(四氢呋喃）
<400> 4
agcccttcag cggcctgtag catctgacty tgtgcctcag ggtct 45
<210> 5
<211> 342
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<400> 5
atggagtctg aggaggggaa ggaggcaagg ttggctcgga gctccccgga gcagcccagg 60
cccagcacct ccaaggcagt ctcaccaccc cacctggatg gaccgcctag ccccaggagc 120
cccgtcatag gaagtgaggt cttcctgccc aacagcaacc acgtggccag tggcgccggg 180
gaggcagcca ttgagaccca gagcagcagt tctgaagaga tagtgcccag ccctccctcg 240
ccaccccctc taccccgcat ctacaagcct tgctttgtct gtcaggacaa gtcctcaggc 300
taccactatg gggtcagcgc ctgtgagggc tgcaagggct tc 342
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 慢性髓系白血病(Abies magnifica)
<400> 6
tatggctgtg gtacagtcag tgcccggggc acaccccgtg ccagtgtacg ccttctccat 60
caaaggccct tcctatggag aggatgtctc caatacaacg acagcccaga agaggaagtg 120
cagccagacc cagtgcccca ggaaggtcat caagatggag tctgaggagg ggaaggaggc 180
aagccattga gacccagagc agcagttctg aagagatagt gcccagccct ccctcgccac 240
cccctctacc ccgcatctac aagccttgct ttgtctgtca ggacaagtcc tcaggctacc 300
actatggggt cagcgcctgt gagggctgca agggct 336

Claims (3)

1.一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针，其特征在于，包括检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针；
所述检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL1-F1引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针，所述BCR-ABL1-F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述BCR-ABL12-R反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述BCR-ABL12-PB探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针包括BCR-ABL2-F78引物、BCR-ABL12-R反向引物和BCR-ABL12-PB探针，所述BCR-ABL2-F78引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述BCR-ABL12-R反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述BCR-ABL12-PB探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测BCR-ABL1基因的ERA引物和探针以及检测BCR-ABL2基因的ERA引物和探针。
3.如权利要求2所述检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括溶解剂和激活剂。
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