CN112501301A - 一种用于定量检测bcr-abl融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于定量检测BCR‑ABL融合基因的引物和探针组合,包括用于特异性扩增BCR‑ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针;所述特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物,所述特异性探针为Seq ID No.3所示序列;所述内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物,所述内标探针为Seq ID No.6所示序列;所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR‑ABL融合基因模板。本申请提供的引物和探针组合,能够对BCR‑ABL融合基因模板分别进行扩增,并实现分别建立BCR‑ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线,从而实现对样本中BCR‑ABL和ABL的比值进行定量检测。
Description
技术领域
本申请涉及基因突变检测领域,具体涉及一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。
背景技术
慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增殖肿瘤,占所有白血病的15%-20%,全世界年发病率(1.0-1.5)/10万,临床上分慢性期(chronic phase,CP)、加速期(accelerated phase,AP)、和急变期(blastic phase,BP或blast crisis,BC)。95%以上的CML患者存在特征性的遗传学异常,即细胞中含有异常的染色体——费城染色体Ph(Philadelphia chromosome),费城染色体是由位于第9号染色体长臂远端的白血病原癌基因ABL易位至第22号染色体BCR基因的断裂点形成的,在分子水平上产生了BCR-ABL融合基因,其编码的蛋白主要是P210,具有酪氨酸激酶活性,可导致持续且异常活化的酪氨酸激酶,干扰细胞的正常增殖和凋亡程序,导致白血病的发生。据统计,在CML患者中,BCR-ABL融合基因阳性率为99%。
目前对CML患者的治疗已从传统的姑息性治疗、化疗发展到使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKI)进行分子靶向治疗。研究表明,BCR-ABL融合基因的表达水平与TKI临床疗效有很好的相关性,并且能预先对临床病情变化提出警示,对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义,因此,定期检测BCR-ABL融合基因的表达水平至关重要。美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《CML临床实践指南》(2012版)明确将P210检测作为慢粒白血病患者初筛和酪氨酸激酶抑制剂疗效跟踪的预后指标,并提出了更早的治疗方案决策时间点(3个月),同时建议IM治疗3个月内未实现BCR-ABL/ABL≤10%的患者,换用第二代TKI药物,考虑异基因造血干细胞移植或临床试验,并停用IM。
目前,可以利用荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因的含量,监测CML患者的TKI用药治疗过程,但是原位杂交实验操作复杂,若样本处理不当则难以检出。另一方面,荧光原位杂交方法需要进行骨髓穿刺活检来获得可培养的中期细胞,实验耗时长,对技术要求高,患者痛苦大,适用于初诊和复发的检测,无法作为持续监测和预后观察的方法长期使用。
此外,也有研究通过实时定量PCR方法和逆转录技术结合,采用一步法检测样本中BCR-ABL融合基因的表达水平,并采用两套参考品标准曲线对目的基因和内参基因进行分别定量以达到对BCR-ABL融合基因定量检测的目的。
然而,现有检测BCR-ABL融合基因的方法均只能对BCR-ABL融合基因进行定量,而无法对BCR-ABL和ABL的比值进行定量。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。
为了实现上述目的,本申请采用了以下技术方案:
本申请的第一方面公开了一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合,其特征在于,包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针;
特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物,特异性探针为Seq ID No.3所示序列;内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物,内标探针为Seq ID No.6所示序列;
Seq ID No.1:5’-TTCCGCTGACCATCAATAAGG-3’
Seq ID No.2:5’-CTTCACTCAGACCCTGAGGCT-3’
Seq ID No.3:5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’
Seq ID No.4:5’-GGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGA-3’
Seq ID No.5:5’-ATGTAGTTGCTTGGGACCCAG-3’
Seq ID No.6:5’-TTGGCCATTTTTGGTTTGGGCTTCACA-3’;
其中,Seq ID No.3所示序列的探针和Seq ID No.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰,3’端具有荧光淬灭基团修饰,Seq ID No.6所示序列的探针和Seq ID No.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同;
特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。
需要说明的是,本申请通过用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针分别对相同的BCR-ABL融合基因模板进行扩增,能够实现根据一套BCR-ABL融合基因模板建立BCR-ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线,并对样本中BCR-ABL和ABL的比值进行定量检测。
本申请的第二方面公开了一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒,包括上述引物和探针组合。
本申请的一种实现方式中,试剂盒还包括逆转录试剂、内参试剂、定量标准品;内参试剂包括阳性参考品、阴性参考品和国际单位换算参考品;阳性参考品和国际单位换算参考品分别含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA按不同比值混合的混合物。
需要说明的是,本申请通过国际单位换算参考品将BCR-ABL和ABL的比值溯源到国际单位标准品,从而在监测CML患者TKI用药治疗过程中,根据溯源到国际单位标准品BCR-ABL和ABL的比值,能够参照国际标准对CML患者TKI用药治疗过程指进行分级指导,确定MMR分级治疗方案。
本申请的一种实现方式中,阳性参考品中含有强阳性参考品和弱阳性参考品,强阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值大于弱阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值,国际单位换算参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值溯源到国际单位标准品;
优选地,强阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为1.5%的混合物;弱阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.0005%的混合物;国际单位换算参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.015%的混合物。
需要说明的是,本申请采用BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值不同的混合物作为多个阳性参考品,既能够用于判断高浓度BCR-ABL融合基因的待测样本是否能有效扩增,也能够用于判断低浓度BCR-ABL融合基因的待测样本是否有效进行反应,因而能够监测不同浓度BCR-ABL融合基因的PCR扩增反应的有效性,同时还能将BCR-ABL和ABL的比值溯源到国际单位标准品,实现参照国际标准对CML患者TKI用药治疗过程进行分级指导。
本申请的一种实现方式中,定量标准品包括不同浓度的BCR-ABL融合基因质粒;
优选地,定量标准品包括浓度分别为101copies、102copies、103copies、104copies、105copies和106copies的BCR-ABL融合基因质粒。
需要说明的是,本申请采用一套BCR-ABL融合基因质粒,分别使用特异性扩增BCR-ABL融合基因的PCR反应液和特异性扩增ABL基因的PCR反应液,能够建立BCR-ABL融合基因和ABL基因的两套标准曲线,从而能够实现对待测样本中BCR-ABL和ABL的比值进行定量检测。
本申请的一种实现方式中,逆转录试剂包括逆转录酶液和逆转录缓冲液。
本申请的一种实现方式中,试剂盒还包括:用于实时荧光PCR反应的扩增酶液和PCR缓冲液。
本申请的一种实现方式中,试剂盒的逆转录程序包括,25℃恒温10分钟,46℃恒温45分钟,然后85℃恒温5分钟灭活,反应完成后4℃待机。
本申请的一种实现方式中,试剂盒的实时荧光PCR扩增程序为,95℃预变性10分钟,然后进入50个循环:94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒,在退火与延伸时进行荧光收集。
本申请的第三方面公开了一种上述试剂盒的使用方法,包括:
提取全血样本RNA,采用逆转录试剂将全血样本RNA逆转录为全血样本cDNA,并对阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品进行相同的逆转录处理;
采用上述特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针,分别对逆转录后获得的全血样本cDNA、阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品进行PCR扩增,并检测PCR扩增信号;
根据PCR扩增信号确定待测样本中BCR-ABL和ABL的比值。
需要说明的是,本申请提供的上述试剂盒的使用方法,采用新鲜外周血即可检测BCR-ABL和ABL的比值,不需组织切片或骨髓穿刺样本,因而有利于在CML患者TKI用药治疗过程中,作为持续监测和预后观察的方法长期使用;进一步,根据国际单位换算参考品能够将BCR-ABL和ABL的比值溯源到国际单位标准品,进而可按照国际标准对CML患者TKI用药治疗过程进行分级指导。
由于采用以上技术方案,本申请的有益效果在于:
本申请用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合,能够通过特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针,对相同的BCR-ABL融合基因模板分别进行扩增,并可根据扩增结果分别建立BCR-ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线,实现对待测样本中BCR-ABL融合基因和ABL基因的比值进行定量检测。
附图说明
图1为本实施例提供的BCR-ABL标准曲线;
图2为本实施例提供的ABL标准曲线;
图3为本实施例提供的BCR-ABL理论拷贝数对数和实际拷贝数对数的线性关系图;
图4为本实施例提供的BCR-ABL和ABL理论拷贝数比值对数和实际拷贝数比值对数的线性关系图;
图5为本实施例提供的BCR-ABL和ABL理论拷贝数比值对数和国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值对数线的性关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他、材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本实施例用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合,能够通过特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针,对相同的BCR-ABL融合基因模板进行扩增,并建立BCR-ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线,实现对待测样本中BCR-ABL融合基因和ABL基因的比值进行定量检测;进一步,本实施例用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒,能够根据内参试剂中的国际单位换算参考品,将BCR-ABL融合基因和ABL基因的比值溯源到国际单位标准品,并参照国际标准对CML患者TKI用药治疗过程进行分级指导。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和方法
1、样本处理
本实施例使用德国QIAGEN公司生产的核酸提取试剂盒提取全血样本RNA,并将提取出的全血样本RNA逆转录为cDNA以得到待测样本。本实施例中QIAGEN核酸提取试剂盒也可用其他品牌试剂盒代替,使用其他品牌试剂盒只需保证核酸提取质量即可。
2、主要试剂和仪器
a、试剂
本实施例中用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒包括逆转录试剂、强阳性参考品、弱阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品、定量标准品。本实施例试剂盒中各试剂的原料均可按照本领域技术人员熟知的方式外购或自制获得。
本实施例逆转录试剂包括逆转录酶液和逆转录缓冲液,其中,逆转录酶液采用逆转录酶和甘油以及Tris-HCl缓冲液混合,以得到逆转录酶浓度为10X的逆转录酶液,并分装至100ul/管,逆转录缓冲液浓度为3.33X,分装到300ul/管。
本实施例将1.5%K562细胞混合到KG1a细胞中,提取总RNA并调整浓度到0.07ug/ul,分装为15ul/管,得到强阳性参考品;将0.0005%K562细胞混合到KG1a细胞中,提取总RNA并调整浓度到0.07ug/ul,分装至15ul/管,得到弱阳性参考品。
本实施例采用纯水作为阴性参考品。
本实施例国际单位换算参考品采用0.015%K562细胞混合到KG1a细胞中,提取总RNA并调整浓度到0.07ug/ul,分装为15ul/管,每一批次国际单位换算参考品用国际单位标准品进行标定。
本实施例国际单位标准品采用NIBSC标准品。
本实施例采用TE buffer调整的不同浓度的BCR-ABL融合基因质粒作为定量标准品,包括浓度分别为101copies、102copies、103copies、104copies、105copies和106copies的BCR-ABL融合基因质粒。
本实施例试剂盒还包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的引物对和探针、用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针以及扩增酶,其中,扩增酶和甘油以及Tris-HCl缓冲液混合得到扩增酶液,并分装至85ul每管;用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针,采用工艺用水与PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混匀,分别得到用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的反应液以及用于特异性扩增ABL基因的反应液。
b、仪器
本实施例实时荧光PCR分析仪型号为Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM,并采用仪器自带的Rotor-Gene Q Series Software对PCR扩增曲线进行分析。
本实施例采用采用FAM通道也即Green通道采集BCR-ABL融合基因或者ABL基因的PCR扩增信号。
3、设计特异性引物对及特异性探针
本实施例根据BCR-ABL融合基因序列,设计引物和探针组合,包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针,特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。本实施例特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针由瑞士Scandinavian Gene Synthesis AB公司合成。
本实施例用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物,特异性探针为Seq ID No.3所示序列;
Seq ID No.1:5’-CAAATGAAGGACAAACAGGACGA-3’
Seq ID No.2:5’-GGGACATCTTCCTCCTCATCTTC-3’
Seq ID No.3:5’-TGTCCTCCTCATCCTCCTCATCCTCATC-3’;
其中,Seq ID No.3所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰,3’端具有荧光淬灭基团修饰。
本实施例用于特异性扩增ABL基因的PCR反应液中含有用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针,内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物,内标探针为Seq ID No.6所示序列;
Seq ID No.4:5’-CAAATGAAGGACAAACAGGACGA-3’
Seq ID No.5:5’-GGGACATCTTCCTCCTCATCTTC-3’
Seq ID No.6:5’-TGTCCTCCTCATCCTCCTCATCCTCATC-3’;
其中,Seq ID No.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰,3’端具有荧光淬灭基团修饰,Seq ID No.6所示序列的探针和Seq ID No.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同。
4、逆转录反应液
本实施例将全血样本RNA按照表1所示方式和逆转录试剂混合,得到全血样本RNA对应的逆转录反应液25μl,以用于按照下述逆转录程序进行逆转录反应,其中,逆转录酶和逆转录缓冲液终浓度均为1×。
本实施例阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品按照和全血样本RNA相同的方式与逆转录试剂混合,得到各参考品和定量标准品对应的逆转录反应液。
表1逆转录反应体系
组份名称 | 组分体积/μl |
逆转录酶液10× | 2.5 |
逆转录缓冲液3.33× | 7.5 |
全血样本RNA | 15 |
5、逆转录程序
本实施例中逆转录程序为:25℃恒温10分钟,46℃恒温45分钟,然后85℃恒温5分钟灭活,反应完成后4℃待机。
本实施例全血样本RNA按照上述逆转录程序进行逆转录处理后得到全血样本cDNA。本实施例对阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品对应的逆转录反应液,采用和全血样本RNA相同的方式进行逆转录处理,得到逆转录处理后的各参考品和定量标准品。
6、PCR扩增反应液
本实施例将全血样本cDNA和用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的反应液、扩增酶液,按照表2所示方式混合,得到全血样本cDNA对应的BCR-ABL PCR扩增反应液25μl,其中,全血样本cDNA取5μl,用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的反应液取19.75μl,扩增酶液取0.25μl,以用于后续按照PCR扩增程序扩增BCR-ABL融合基因。
表2 PCR扩增反应液
本实施例将全血样本cDNA和用于特异性扩增ABL基因的反应液、扩增酶液,按照表2所示方式混合,得到全血样本cDNA对应的ABL PCR扩增反应液25μl,其中,逆转录处理后的各样品分别取5μl,用于特异性扩增ABL基因的反应液取19.75μl,扩增酶液取0.25μl,以用于后续按照PCR扩增程序扩增ABL基因。
本实施例对阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品对应的逆转录反应液,采用和全血样本cDNA相同的方式,分别配置各参考品和定量标准品对应的BCR-ABL PCR扩增反应液以及ABL PCR扩增反应液。
7、PCR扩增程序
本实施例实时荧光PCR扩增程序为:95℃预变性10分钟,然后进入50个循环:94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒,在退火与延伸时进行荧光收集。
本实施例对全血样本cDNA对应的BCR-ABL PCR扩增反应液以及ABL PCR扩增反应液分别采用上述PCR扩增程序进行扩增,扩增结束后,获取全血样本cDNA对应的BCR-ABLPCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线,并使用PCR扩增仪自带的软件(Rotor-Gene Q SeriesSoftware)分析PCR扩增曲线的Ct值。
本实施例对阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品对应的BCR-ABL PCR扩增反应液以及ABL PCR扩增反应液,按照全血样本cDNA采用的PCR扩增程序进行扩增,扩增结束后,获取各参考品和定量标准品对应的的BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线,并使用PCR扩增仪自带的软件(Rotor-Gene Q Series Software)分析PCR扩增曲线的Ct值。
8、阈值验证
本实施例对定量标准品的BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线进行分析,获取PCR扩增曲线的Ct值,以对本实施例PCR扩增反应的有效性进行阈值验证。
9、建立标准曲线
本实施例对定量标准品的BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线进行分析,并获得不同浓度的BCR-ABL融合基因质粒对应的BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线的Ct值,根据BCR-ABL融合基因质粒浓度和Ct值的关系,建立BCR-ABL标准曲线以及ABL标准曲线。
10、线性检测实验
本实施例线性检测是基于“CLSI/NCCLS EP6-A”标准,使用1个批次的本实施例试剂盒的试剂,以K562细胞阳性RNA作为样本A,以健康人全血样本RNA作为样本I,使用样本I中提取的健康人全血RNA,采用1:10进行梯度稀释,得到9个梯度差异样本,对本实施例试剂盒实时荧光PCR的检测结果进行线性验证,其中,样本A-I制备方法见表3:
表3样本A-I的制备方法
样本名称 | 梯度稀释方式 | 稀释倍数 |
A | 未稀释的K562细胞阳性RNA | - |
B | A:I=1:10 | 10 |
C | B:I=1:10 | 10 |
D | C:I=1:10 | 10 |
E | D:I=1:10 | 10 |
F | E:I=1:10 | 10 |
G | F:I=1:1 | 2 |
H | G:I=1:1 | 2 |
I | 健康人全血样本RNA | - |
11、重复性实验
本实施例重复性实验是根据“CLSI/NCCLS EP5-A2”标准,对上述线性检测实验中9个梯度差异样本A-I重复检测2次,对本实施例试剂盒实时荧光PCR的检测结果的重复性进行验证。
12、最低检测限实验
本实施例最低检测限的检测是基于“CLSI/NCCLS EP17-2A”标准,[Clinical andLaboratory Standards Institute(CLSI)/National Committee for ClinicalLaboratory Standards(NCCLS)],采集12个健康人的全血样本,经过样本处理得到12组健康人全血样本RNA。
对每组健康人全血样本RNA进行实时荧光检测,得到健康人全血样本RNA中BCR-ABL的空白限LOB,并对12组健康人全血样本RNA按照表4所示的方法处理得到对应的样本1-12,进而对样本1-12进行实时荧光检测,获得样本1-12的PCR扩增曲线,并根据样本1-12扩增曲线的Ct值、BCR-ABL标准曲线以及空白限LOB计算最低检测限LOD。
表4样本1-12的配制方法
样本名称 | K562细胞阳性RNA(μL) | 健康人全血样本RNA(μL) |
样本1 | 0 | 100 |
样本2 | 5 | 100 |
样本3 | 5 | 100 |
样本4 | 5 | 100 |
样本5 | 5 | 100 |
样本6 | 5 | 100 |
样本7 | 5 | 100 |
样本8 | 5 | 100 |
样本9 | 5 | 100 |
样本10 | 5 | 100 |
样本11 | 5 | 100 |
样本12 | 5 | 100 |
13、干扰物质检测实验
本实施例干扰物质的检测是基于“CLSI/NCCLS EP7-A2”标准,在全血样本RNA提取过程中引入一些可以影响PCR过程的物质,比如,胆红素、血红蛋白、人类血清白蛋白、K2-EDTA与乙醇,根据实时荧光PCR的检测结果验证这些物质对结果是否影响。
14、计算BCR-ABL和ABL的比值
本实施例利用国际单位换算参考品BCR-ABL和ABL拷贝数比值(NCNcal)及其在分析证书中指示的指定值(IS-Calvalue)来计算国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值(IS-NCN)。对每一批次国际单位换算参考通过国际单位标准品进行定量,根据国际单位换算参考的成分精确计算IS-Calvalue的值,从而得到国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值(IS-NCN),IS-NCN具体计算方式如下式所示:
IS-NCN=(NCN×IS-Calvalue)/NCNcal
其中,根据全血样本cDNA对应的BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线,获取全血样本cDNA不同扩增曲线的Ct值,利用BCR-ABL标准曲线和ABL标准曲线,计算全血样本cDNA的BCR-ABL和ABL拷贝数比值NCN;同时按照相同的方法计算国际单位换算参考品的BCR-ABL和ABL拷贝数比值NCNcal。
由于每一批次国际单位换算参考品可能有微小差别,通过国际单位标准品对国际单位换算参考品进行标定,可以将样本的检测结果溯源至国际单位标准品,从而达到准确计算MMR分级治疗方案的目的,而弱阳性对照参考品的国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值IS-NCNLC<0.01(相当于治疗标准MR4),作为对照,能够确保检测灵敏度达到治疗标准MR4.5的级别。
本实施例采用和线性检测实验相同批次的检测结果计算样本A-I的国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值,并确定其对应的MMR分级治疗方案。
二、结果和分析
1)、阈值验证结果
对不同浓度的定量标准品PCR扩增曲线的Ct值进行重复检测,具体检测结果如表5所示,并得到以下阈值验证结果:当全血样本cDNA的PCR扩增曲线Ct值不小于36时,PCR扩增模板的浓度低于定量标准品的最低浓度,定量结果不可靠;当全血样本cDNA的PCR扩增曲线Ct值小于36时,能够实现对全血样本cDNA中BCR-ABL和ABL比值进行定量检测。
表5阈值验证结果
根据阈值验证结果可得到对于不同的检测项目,有效数据的标准如表6所示:
表6不同检测项目有效数据的标准
2)、建立标准曲线
根据不同浓度的定量标准品BCR-ABL PCR扩增曲线以及ABL PCR扩增曲线的Ct值进行统计分析,以BCR-ABL PCR扩增曲线的Ct值为纵坐标,以BCR-ABL融合基因质粒拷贝数的对数为横坐标,建立BCR-ABL标准曲线y=-3.359x+37.829,R2=0.9999,如图1所示,并以ABL PCR扩增曲线的Ct值为纵坐标,以BCR-ABL融合基因质粒拷贝数的对数为横坐标,建立ABL标准曲线y=-3.5036x+37.283,R2=0.99945,如图2所示。
3)、线性检测实验结果
对健康人全血样本提取出的RNA梯度稀释9个不同的阳性突变样本,从最低检测限开始到国际单位标定的BCR-ABL和ABL的比值为66%的样本,本实施例试剂盒的检测结果均为线性,具体检测结果如表7所示。
表7线性检测结果
4)、重复性实验结果
本实施例将样本A-I中BCR-ABL融合基因理论拷贝数和ABL基因理论拷贝数整理如表8所示,其中,样品A的BCR-ABL和ABL拷贝数根据样本中K562的细胞数估算得到。
表8样本A-I的BCR-ABL和ABL理论拷贝数
将样本A-I中BCR-ABL和ABL理论拷贝数转化为对数形式,同时根据样本A-I重复两次检测的结果分析BCR-ABL实际拷贝数、BCR-ABL和ABL实际拷贝数比值以及国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值的重复性,具体如表9所示:
表9重复性实验检测结果及其对数表
具体地,以BCR-ABL理论拷贝数对数为横坐标,BCR-ABL实际拷贝数对数为纵坐标,根据表9中的数据,得到BCR-ABL理论拷贝数和实际拷贝数之间的线性关系图,如图3所示,其中,Log(CN)=0.0270488+0.9939508×Log(CN理论),由此可见,BCR-ABL实际拷贝数检测线性良好。
以BCR-ABL和ABL的理论拷贝数比值对数为横坐标,以BCR-ABL和ABL实际拷贝数比值对数为纵坐标,根据表9中的数据,得到BCR-ABL和ABL理论拷贝数比值和实际拷贝数之间的线性关系图,如图4所示,其中,Log(%NCN)=-0.064746+1,0013007×Log(%NCN理论),可见BCR-ABL和ABL实际拷贝数比值检测线性良好。
以BCR-ABL和ABL理论拷贝数比值对数为横坐标,国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值对数为纵坐标,根据表9中的数据,得到BCR-ABL和ABL理论拷贝数比值和国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值之间的线性关系图,如图5所示,其中,Log(%IS-NCN)=0.005093+1.0000917×Log(NCN理论),可见国际单位标定的BCR-ABL和ABL拷贝数比值(IS-NCN)检测线性良好。
3)、最低检测限实验结果
本实施例根据BCR-ABL标准曲线和12组健康人全血样本的实时荧光PCR检测结果,在95%置信区间内,计算出本实施例试剂盒的LOD=3.13copies,具体计算过程如下:
首先,根据健康人全血样本RNA进行空白检测限LOB的建立:由于在健康人全血样本中,偶尔也会发现少量BCR-ABL拷贝数,因此,采用健康人全血样本RNA测试背景值。由于在健康人全血样本中,ABL的拷贝数远高于BCR-ABL拷贝数,因此,LOB测试仅仅考虑BCR-ABL的拷贝数背景值。
因而,根据12组健康人全血样本RNA的实时荧光PCR检测结果,计算出BCR-ABL拷贝数,将落在95%置信区间内的BCR-ABL拷贝数作为背景值,并得到:
LOB=1.05273copies
进一步,根据12组健康人全血样本RNA中,加入了少量K562细胞阳性RNA的样本2-12的实时荧光检测的有效数据,计算样本2-12中BCR-ABL拷贝数平均值为3.186copies(50%数据检出值),SD=1.265copies。
根据EP17-A中规定的检测限公式:LOD=LOB+1.645SD,计算得到LOD=3.13copies。
4)、干扰物质检测实验结果
本实施例引入的胆红素、血红蛋白、人类血清白蛋白、K2-EDTA与乙醇等干扰物质对全血样本的检测不产生干扰影响。
5)、计算BCR-ABL和ABL的比值
本实施例中各参考品实时荧光PCR检测结果如表10所示。
表10各参考品的实时荧光PCR检测结果
本实施例根据线性检测实验中样本A-I的相同批次的检测结果,计算样本A-I的国际单位标定的拷贝数比值(IS-NCN),并用于确定MMR分级治疗方案,该批次的国际单位换算参考品的IS-CalValue值为0.114,具体计算结果如表11所示:
表11样本A-I的IS-NCN的计算结果
进一步,本实施例对若干低浓度BCR-ABL融合基因的样本中BCR-ABL和ABL拷贝数比值进行检测,检测结果如表12所示。由此可见,本实施例试剂盒检测限低,能够对一定范围内低浓度的BCR-ABL融合基因进行检出,并且能够检测出较低的国际单位标定的BCR-ABL和ABL的比值,从而能够实现MMR分级方案的制定。
表12低浓度BCR-ABL融合基因样本检测结果
以上应用了具体个例对本申请进行阐述,只是用于帮助理解本申请,并不用以限制本申请。对于本申请所属技术领域的技术人员,依据本申请的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合,其特征在于,包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针;
所述特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物,所述特异性探针为Seq ID No.3所示序列;所述内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物,所述内标探针为Seq ID No.6所示序列;
Seq ID No.1:5’-TTCCGCTGACCATCAATAAGG-3’
Seq ID No.2:5’-CTTCACTCAGACCCTGAGGCT-3’
Seq ID No.3:5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’
Seq ID No.4:5’-GGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGA-3’
Seq ID No.5:5’-ATGTAGTTGCTTGGGACCCAG-3’
Seq ID No.6:5’-TTGGCCATTTTTGGTTTGGGCTTCACA-3’;
其中,所述Seq ID No.3所示序列的探针和所述Seq ID No.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰,3’端具有荧光淬灭基团修饰,所述Seq ID No.6所示序列的探针和所述Seq ID No.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同;
所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。
2.一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物和探针组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括逆转录试剂、内参试剂、定量标准品;所述内参试剂包括阳性参考品、阴性参考品和国际单位换算参考品;所述阳性参考品和所述国际单位换算参考品分别含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA按不同比值混合的混合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性参考品包括强阳性参考品和弱阳性参考品,所述强阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值大于弱阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值,所述国际单位换算参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值溯源到国际单位标准品;
优选地,所述强阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为1.5%的混合物;所述弱阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.0005%的混合物;所述国际单位换算参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.015%的混合物。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述定量标准品包括不同浓度的BCR-ABL融合基因质粒;
优选地,所述定量标准品包括浓度分别为101copies、102copies、103copies、104copies、105copies和106copies的BCR-ABL融合基因质粒。
6.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述逆转录试剂包括逆转录酶液和逆转录缓冲液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于实时荧光PCR反应的扩增酶液和PCR缓冲液。
8.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的逆转录程序包括,25℃恒温10分钟,46℃恒温45分钟,然后85℃恒温5分钟灭活,反应完成后4℃待机。
9.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的实时荧光PCR扩增程序为,95℃预变性10分钟,然后进入50个循环:94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒,在退火与延伸时进行荧光收集。
10.一种如权利要求3-9任一项所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括:
提取全血样本RNA,采用所述逆转录试剂将全血样本RNA逆转录为全血样本cDNA,并对阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品进行相同的逆转录处理;
采用所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针,分别对逆转录后获得的全血样本cDNA、阳性参考品、阴性参考品、国际单位换算参考品以及定量标准品进行PCR扩增,并检测PCR扩增信号;
根据PCR扩增信号确定全血样本中BCR-ABL和ABL的比值。
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