CN109280704A - Rasd1作为标志物在制备b-all诊断和预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

Rasd1作为标志物在制备b-all诊断和预后评估试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了RASD1作为标志物在制备B‑ALL诊断和预后评估试剂盒中的应用。本发明首次研究了RASD1基因在B‑ALL诊断和预后评估中的作用，研究结果表明：RASD1在B‑ALL中的表达水平显著高于正常对照，且RASD1高表达是B‑ALL患者总生存和无复发生存的独立危险因素。说明RASD1在B‑ALL的分层诊断和预后评估中发挥重要作用。

Description

RASD1作为标志物在制备B-ALL诊断和预后评估试剂盒中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及RASD1作为标志物在制备B-ALL诊断和预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
B系急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)是一种生物学和临床异质性淋巴系统恶性肿瘤。分层诊断和靶向治疗显著提高了B-ALL患者的完全缓解率和长期生存率，但仍有部分B-ALL患者无经典不良预后因素，可其仍存在较大的临床异质性。发现新的B-ALL预后分子标记物，有助于使预后分层更精准化并发现新的治疗靶点(Brown PA,Shah B,Fathi A et al.NCCN Guidelines Insights:AcuteLymphoblastic Leukemia,Version 1.2017.J Natl Compr Canc Netw2017,15(9):1091-1102)。
RASD1是RAS家族的成员之一，RAS家族在肿瘤生长和扩增中发挥重要作用，且RASD1基因位于人17p11.2染色体，这一区域的缺失和突变与多种癌症的发生相关。因此，RASD1可能在肿瘤发生发展中发挥重要作用。在多种肿瘤的研究中发现，RASD1扮演着一个抑制肿瘤细胞生长、迁移，促进肿瘤细胞凋亡的角色：过表达RASD1可抑制乳腺癌、肾细胞癌和肺腺癌细胞系的增殖(Vaidyanathan G,Cismowski MJ,Wang G et al.The Ras-relatedprotein AGS1/RASD1suppresses cell growth.Oncogene2004,23(34):5858-5863；DalginGS,Holloway DT,Liou LS et al.Identification and characterization of renalcell carcinoma gene markers.Cancer Inform2007,3:65-92)；RASD1通过抑制AKT/mTOR信号通路抑制脑胶质瘤细胞迁移(Gao S,Jin L,Liu G et al.Overexpression ofRASD1inhibits glioma cell migration/invasion and inactivates the AKT/mTORsignaling pathway.Sci Rep2017,7(1):3202)；多发性骨髓瘤的RASD1甲基化导致基因失活、地塞米松耐药(Nojima M,Maruyama R,Yasui H et al.Genomic screening for genessilenced by DNA methylation revealed an association between RASD1inactivationand dexamethasone resistance in multiple myeloma.Clin Cancer Res2009,15(13):4356-4364)。但是也有报道认为，RASD1发挥促癌作用：RASD1在骨肉瘤和前列腺癌中升高，过表达RASD1可促进骨肉瘤细胞的增殖(Both J,Wu T,Ten Asbroek AL et al.OncogenicProperties of Candidate Oncogenes in Chromosome Region 17p11.2p12in HumanOsteosarcoma.Cytogenet Genome Res2016,150(1):52-59；O'Neill D,Jones D,Wade Met al.Development and exploitation of a novel mutant androgen receptormodelling strategy to identify new targets for advanced prostate cancertherapy.Oncotarget2015,6(28):26029-26040；Both J,Wu T,Bras J etal.Identification of novel candidate oncogenes in chromosome region 17p11.2-p12in human osteosarcoma.PLoS One2012,7(1):e30907；Baniwal SK,Khalid O,Gabet Yet al.Runx2transcriptome of prostate cancer cells:insights into invasivenessand bone metastasis.Mol Cancer2010,9:258)。这些发现表明，RASD1不同于其他RAS家族成员，可能在不同的癌细胞中发挥不同的作用。曾有报道RASD1可调控正常B细胞的增殖和活性(Lindsey JW.Dexamethasone-induced Ras-related protein 1is a potentialregulatory protein in B lymphocytes.Int Immunol2007,19(5):583-590)；但迄今为止，国内外尚未见RASD1与B-ALL的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质的新用途。
本发明提供了检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质在如下1)或4)中任一种中的应用：
1)制备诊断或辅助诊断B系急性淋巴细胞白血病的产品：
2)制备预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品；
3)制备评估或辅助评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后效果的产品；
4)制备评估或辅助评估B系急性淋巴细胞白血病患者死亡风险的产品。
上述应用中，所述物质为检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白所需的试剂和/或仪器。
进一步的，所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
更进一步的，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂包括检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对和探针。所述引物对具体由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成，所述探针具体为序列表中序列3所示的单链DNA分子。所述试剂还包括用于PCR扩增的TaqMan Master Mix和RNase-Free Water。所述仪器具体可为ABI 7500FAST PCR扩增仪。
本发明的另一个目的是提供一种预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品。
本发明提供的预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品包含检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质。
进一步的，所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
更进一步的，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂包括检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对和探针与检测内参基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对和探针。所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对具体由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的探针具体为序列表中序列3所示的单链DNA分子。所述检测内参基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对具体由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分子组成，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的探针具体为序列表中序列6所示的单链DNA分子。所述探针的两端均还标记有荧光基团和淬灭基团。
所述试剂还包括用于PCR扩增的TaqMan Master Mix和RNase-Free Water。所述仪器具体可为ABI 7500FAST PCR扩增仪。
上述预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品还包括记载有如下标准的可读载体：若待测者的RASD1基因编码的mRNA的相对表达量≥0.065％，则待测者为或候选为B系急性淋巴细胞白血病患者；若待测者的RASD1基因的相对表达量＜0.065％，则待测者不为或候选不为B系急性淋巴细胞白血病患者。
进一步的，所述待测者的RASD1基因编码的mRNA的相对表达量的计算方法如下：待测者目的基因RASD1编码的mRNA的相对表达量＝(待测者目的基因RASD1的拷贝数/待测者内参基因的拷贝数)×100％。
更进一步的，采用标准曲线法计算所述待测者目的基因RASD1的拷贝数和所述待测者内参基因的拷贝数。所述内参基因可为ABL1基因。具体计算方法如下：
1)标准曲线函数的获得
将阳性对照质粒(阳性对照质粒为将序列7所示的RASD1基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体)和内参对照质粒(内参对照质粒为将序列8所示的ABL1基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体)分别进行10倍梯度稀释得到每微升分别含有不同个拷贝数的RASD1基因片段和ABL1基因片段。分别以含有不同拷贝数的基因片段为模板，分别采用检测RASD1的引物对和探针与检测ABL1的引物对和探针进行RQ-PCR，分别得到扩增曲线及对应的Ct值。根据不同的内参对照质粒拷贝数及对应的Ct值，得到内参对照质粒的荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10ABL1＝(Ct-38.47)/-3.22；根据不同的阳性对照质粒拷贝数及对应的Ct值，得到阳性对照质粒的荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10RASD1＝(Ct-37.43)/-3.13；
2)以待测者的cDNA为模板，分别采用扩增RASD1的引物对和探针及扩增ABL1的引物对和探针进行RQ-PCR，分别得到扩增曲线及对应的Ct值，将所述Ct值分别带入步骤1)获得的标准曲线函数中，计算得到待测者目的基因RASD1及内参基因ABL1的拷贝数。
所述1)中，检测RASD1的引物对具体由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成，检测RASD1的探针具体为序列表中序列3所示的单链DNA分子。检测ABL1的引物对具体由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分子组成，检测ABL1的探针具体为序列表中序列6所示的单链DNA分子。所述检测RASD1的探针的两端还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团具体为FAM，所述淬灭基团具体为BHQ。所述检测ABL1的探针的两端也标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团具体为FAM，所述淬灭基团具体为TAMARA。
所述2)中，所述待测者的cDNA为待测者骨髓液中的cDNA，具体为将待测者骨髓液中的RNA进行逆转录得到的。
本发明又有一个目的是提供一种评估或辅助评估待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体预后效果的产品。
本发明提供的评估或辅助评估待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体预后效果的产品包含检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质。
进一步的，所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
更进一步的，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂包括检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对和探针与检测内参基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对和探针。所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对具体由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的探针具体为序列表中序列3所示的单链DNA分子。所述检测内参基因编码的mRNA的相对表达量所使用的引物对具体由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分子组成，所述检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所使用的探针具体为序列表中序列6所示的单链DNA分子。所述探针的两端均还标记有荧光基团和淬灭基团。
所述试剂还包括用于PCR扩增的TaqMan Master Mix和RNase-Free Water。所述仪器具体可为ABI 7500FAST PCR扩增仪。
上述评估或辅助评估待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体预后效果的产品还包括记载有如下标准的可读载体：RASD1高表达患者的死亡风险高于或候选高于RASD1低表达患者。
所述RASD1高表达患者是指RASD1基因编码的mRNA的相对表达量≥0.66％的B系急性淋巴细胞白血病患者；所述RASD1低表达患者是指RASD1基因编码的mRNA的相对表达量＜0.66％的B系急性淋巴细胞白血病患者。所述RASD1基因编码的mRNA的相对表达量的计算方法同上述预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品中的RASD1基因编码的mRNA的相对表达量的计算方法。
上述应用或产品中，所述待测者为大于14岁的成人，所述待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体由大于14岁的成人组成的群体。
上述应用或产品中，所述产品具体可为试剂盒。
本发明首次研究了RASD1基因在B-ALL诊断和预后评估中的作用，研究结果表明：RASD1在初诊B-ALL患者中的表达水平显著高于正常对照，且RASD1高表达是B-ALL患者总生存和无复发生存的独立危险因素。说明RASD1在B-ALL的分层诊断和预后评估中发挥重要作用。
附图说明
图1为初诊B-ALL患者组和正常对照组的RASD1/ABL1％。
图2为RASD1低表达组(L-RASD1)和RASD1高表达组(H-RASD1)总生存率和无复发生存率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、RASD1作为标志物在B-ALL诊断和预后评估中的应用
一、病例资料
1、入组标准
本发明收集了自2011年1月至2015年1月期间郑州大学第一附属医院血液科收治的53例初诊B-ALL患者的骨髓标本。入选标准：①年龄＞14岁；②明确诊断为B-ALL；③标本采集前未进行化疗；④临床资料完整；⑤未失访。正常对照骨髓标本取自成人健康志愿者，共23例。所有健康志愿者和患者均签署知情同意书。本发明的研究方案经过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。
2、危险度分层
有任何一项以下异常者定义为高危：低二倍体(＜44染色体)，MLL/11q23易位，复杂核型(≥5个异常)和t(9；22)/BCR-ABL1；无以上异常者定义为标危。
3、治疗方案与治疗反应
治疗方案：治疗方案参照文献“Yao QM,Liu KY,Gale RP et al.Prognosticimpact of IKZF1deletion in adults with common B-cell acute lymphoblasticleukemia.BMC Cancer2016,16:269”中的方法。具体如下：所有患者均接受诱导化疗，若达完全缓解，给予巩固治疗2疗程；部分患者再行0-2疗程巩固化疗后行造血干细胞移植；未移植的患者继续接受巩固治疗1.5-2年，后继续进行维持化疗至少2年。诱导化疗采用VDCLP方案(长春新碱1.5mg/m2/d或长春地辛2mg/m2/d，d1、8、15、22；柔红霉素45mg/m2/d或去甲氧柔红霉素8mg/m2/d，d1-3、d15-17；环磷酰胺800mg/m2/d，d1、15；泼尼松60mg/m2/d，d1-19；左旋门冬酰胺酶10,000U/m2/d，d19-28或培门冬酶2500U/m2，每2周1次)。巩固治疗方案包括hyper-CVAD(A)(环磷酰胺600mg/m2/d，d1-3；柔红霉素50mg/m2/d，d4-5；长春新碱2mg/m2/d，d4；地塞米松40mg/d，d1-4、d11-14)；hyper-CVAD(B)(甲氨蝶呤1g/m2/d，d1；阿糖胞苷6g/m2/d，d2-7)；CAM(环磷酰胺800mg/m2/d，d1；阿糖胞苷100mg/m2/d，d1-7；6-巯基嘌呤75mg/m2/d口服，d1-7)交替应用。维持治疗包括6-巯基嘌呤50mg/m2每日1次和甲氨蝶呤20mg/m2每周1次。存在BCR-ABL1融合基因或费城染色体的患者在全程治疗过程中同时给予酪氨酸激酶抑制剂治疗。中枢神经系统白血病预防：接受8～10次三联药物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松)鞘内注射。29例患者接受异基因造血干细胞移植，其中，19例为HLA全相合的供者，10例为HLA半相合的供者。HLA全相合移植患者，预处理方案包括：白舒菲、阿糖胞苷、环磷酰胺以及甲环己亚硝脲。HLA半相合移植患者，预处理方案在全相合基础上加用抗人胸腺球蛋白。所有供者均接受rhG-CSF 5μg/(kg·d)，连续皮下注射5～6天，第5～6天应用COBE血细胞分离机采集外周血干细胞。移植物抗宿主病预防采用环孢素、骁悉和短程甲氨蝶呤联合方案。
治疗反应：完全缓解(complete remission，CR)定义为：骨髓中白血病细胞＜5％，无髓外白血病，中性粒细胞＞1×109/L，血小板＞100×109/L，持续4周以上。复发定义为：完全缓解后骨髓中白血病细胞＞5％或外周血中出现白血病细胞或髓外出现白血病细胞。
4、评价终点
无复发生存(relapse-free survival，RFS)定义为从初次完全缓解至首次复发的时间，复发为事件。总生存(overall survival，OS)定义为从初次诊断至死亡的时间，死亡为事件。
二、实验方法
1、标本采集
采集骨髓液3mL，加入EDTA抗凝管，应用Ficoll分离液，经密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。
2、检测RASD1mRNA的相对表达量
应用传统TRIzol(美国Invitrogen公司)方法提取总RNA，应用逆转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行RQ-PCR。RQ-PCR利用ABI7500FAST PCR扩增仪完成，采用ABI公司Universal PCR Master Mix进行PCR扩增反应，10μL PCR反应体系如表1所示，引物和探针序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)如表2所示，循环体系为：50℃2min，95℃10min，然后95℃15s，60℃1min进行50个循环。
表1、PCR反应体系
试剂 10μL反应体系
TaqMan Master Mix 5μL
前向引物，10μM 0.3μL
反向引物，10μM 0.3μL
探针，10μM 0.2μL
Template DNA 1μL
RNase-Free Water Up to 10μL
表2、引物和探针序列
引物 序列(5'-3')
RASD1-上游引物 CGACTCGGAGCTGAGTATCC(序列1)
RASD1-下游引物 GGTGGAAGTCCTCGATGGTA(序列2)
RASD1-探针 FAM-CAAGAACTGCTATCGCATGGTCATCCT-BHQ(序列3)
ABL1-上游引物 CCGCTGACCATCAATAAGGAA(序列4)
ABL1-下游引物 GATGTAGTTGCTTGGGACCCA(序列5)
ABL1-探针 FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMARA(序列6)
根据标准曲线法计算样本目的基因RASD1与内参基因ABL1的拷贝数，具体方法如下：
①含有RASD1基因片段的阳性对照质粒的制备
阳性对照质粒为将序列7所示的RASD1基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体。
②含有ABL1基因片段的内参对照质粒的制备
内参对照质粒为将序列8所示的ABL1基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体。
③阴性对照质粒
将pMD18-T质粒作为阴性对照质粒。
④灵敏度检测
将阳性对照质粒和内参对照质粒分别进行10倍梯度稀释得到每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的RASD1基因片段和ABL1基因片段。分别以含有不同拷贝数的基因片段为模板，分别采用扩增RASD1的引物对和探针与扩增ABL1的引物对和探针进行RQ-PCR。然后根据不同的内参对照质粒拷贝数及对应的Ct值，得到内参对照质粒荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10ABL1＝(Ct-38.47)/-3.22，相关系数达0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。根据不同的阳性对照质粒拷贝数及对应的Ct值，得到阳性对照质粒荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10RASD1＝(Ct-37.43)/-3.13，相关系数达0.99以上，检测RASD1基因的灵敏度达10个拷贝。
通过样本目的基因RASD1及内参基因ABL1的扩增曲线及设定的阈值得到目的基因RASD1及内参基因ABL1的Ct值，分别将其带入上述标准曲线，得到目的基因RASD1及内参基因ABL1的拷贝数，并根据如下公式计算样本目的基因RASD1的相对表达量：样本目的基因RASD1的相对表达量＝(RASD1的拷贝数/ABL1的拷贝数)×100％。
3、免疫表型、微小残留病灶、细胞遗传学和基因检测
骨髓标本应用四色流式细胞仪分析其免疫表型，定义如下：(1)early precursorB-ALL(pro-B-ALL)定义为CD10阴性、CD19阳性、cCD79a阳性、cCD22阳性和TdT阳性；(2)common B-ALL(com-B-ALL)为CD10阳性；(3)precursor B-cell ALL(pre-B-ALL)为胞质μ+、sIg-和CD10+/-。微小残留病灶(MRD)应用四色流式细胞仪分析白血病相关的异常免疫表型。G显带法进行细胞遗传学分析。BCR-ABL1和MLL易位用RQ-PCR进行定量；联合多重RQ-PCR和MLPA检测IKZF1突变(按照文献“Yao QM,Liu KY,Gale RP et al.Prognostic impact ofIKZF1deletion in adults with common B-cell acute lymphoblastic leukemia.BMCCancer2016,16:269”中的方法)。
4、统计学处理
应用SPSS18.0、Graphpad Prism 5.01进行统计学分析。两组数据的比较，定性数据采用卡方检验或Fisher确切概率法，定量数据采用Mann-Whitney U检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。受试者工作(receiver operating characteristic，ROC)曲线用来评价诊断指标的特异性和敏感性。约登指数用于计算理想的cut-off值。生存分析用Kaplan-Meier进行分析，应用log-rank法进行检验。应用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，应用后退法将P＞0.1的变量逐渐剔除，P＜0.05为具有统计学意义。
三、实验结果
1、初诊B-ALL患者骨髓细胞中的RASD1转录水平显著高于正常对照
正常对照组中的健康志愿者及初诊B-ALL患者骨髓细胞中的RASD1转录水平的检测结果如表3所示。RASD1在23例健康志愿者组成的正常对照中低表达，中位值0.03％(范围为0-0.06％)；RASD1在53例初诊B-ALL患者中高表达，中位值为1.18％(范围为0-1534.22％)；RASD1在初诊B-ALL患者中的mRNA水平显著高于正常对照(P＜0.0001)(图1)。ROC曲线分析显示RASD1诊断B-ALL的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.968(95％置信区间0.925～1.012；P＜0.0001)，最大约登指数对应的RASD1转录水平为0.065％。以此为成人B-ALL的诊断阈值，则RASD1在初诊成人B-ALL中的过表达率为96％。以上结果说明RASD1可预测B-ALL的发生、用于辅助诊断待测患者是否为B-ALL患者。
表3、B-ALL患者及健康志愿者的RASD1转录水平(RASD1/ABL1％)、RFS及OS
RFS status：1代表复发，0代表未复发；OS status：1代表死亡，0代表未死亡；NA：代表未缓解，无法计算RFS；B-ALL患者RASD1分组：1代表RASD1低表达组，2代表RASD1高表达组。
在实际应用中，可根据如下方法判断待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者：检测待测者骨髓液中RASD1基因编码的mRNA的相对表达量，若待测者RASD1基因编码的mRNA的相对表达量≥0.065％，则待测者为或候选为B系急性淋巴细胞白血病患者；若待测者RASD1基因编码的mRNA的相对表达量＜0.065％，则待测者不为或候选不为B系急性淋巴细胞白血病患者。
2、生存分析显示RASD1高表达的初诊B-ALL患者生存期显著缩短
检测RASD1在53例初诊成人B-ALL患者骨髓中的转录水平，根据RASD1/ABL1％(≥0.66％或＜0.66％)，将患者分为RASD1低表达组(L-RASD1)和RASD1高表达组(H-RASD1)，与临床资料关系分析显示，RASD1转录水平与年龄、性别、白细胞计数、血小板计数、骨髓原始细胞比例、免疫表型、细胞遗传学改变、危险分组和诱导化疗结束时的MRD水平等无关(表4)。RASD1低表达组的完全缓解率为20/20＝100％；RASD1高表达组的完全缓解率为27/33＝82％，两组之间无显著性差异(P＝0.072)。
表4、RASD1转录水平与初诊成人B-ALL一般临床特点的关系
注：L-RASD1：RASD1低表达；H-RASD1：RASD1高表达；WBC：白细胞计数；PLT：血小板计数；BLAST：骨髓原始细胞；MRD：微小残留病灶
中位随访时间18(1-90)个月，结果如图2所示，生存分析显示RASD1高表达组患者的3年总生存率显著低于RASD1低表达组患者(44％[95％CI 20％-61％]vs.79％[95％CI60％-97％]；P＝0.037)，两组间3年无复发生存率无显著性差异(52％[95％CI33％-71％]vs.70％[95％CI 41％-98％]；P＝0.128)。
因此，在实际应用中，可根据如下方法评估待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体的预后效果：RASD1高表达患者的死亡风险高于或候选高于RASD1低表达患者；
其中，RASD1高表达患者是指RASD1基因编码的mRNA的相对表达量≥0.66％的B系急性淋巴细胞白血病患者；RASD1低表达患者是指RASD1基因编码的mRNA的相对表达量＜0.66％的B系急性淋巴细胞白血病患者。
3、多因素分析显示RASD1高表达是初诊B-ALL患者OS和RFS的独立危险因素
将年龄(≥35岁vs.＜35岁)、RASD1表达水平(≥0.66％vs.＜0.66％)、不良预后基因或遗传学异常(有vs.无)、诱导治疗结束时的MRD水平(≥0.1％vs.＜0.1％)、是否进行异基因造血干细胞移植(是vs.否)等因素纳入COX多因素回归分析模型进行多因素分析。结果显示RASD1高表达是无复发生存的独立危险因素(HR8.37；95％CI1.85～37.85；P＝0.006)；RASD1高表达亦是总生存的独立危险因素(HR4.90；95％CI1.59～15.06；P＝0.006)。其他因素中，诱导化疗结束时MRD≥0.1％是无复发生存率(HR8.90；95％CI 2.03～39.11；P＝0.004)和总生存率(HR4.58；95％CI 1.89～11.11；P＝0.001)的独立危险因素；异基因造血干细胞移植是无复发生存率(HR0.06；95％CI0.02～0.25；P＝0.000)和总生存率(HR 0.11；95％CI 0.04～0.29；P＝0.000)的保护性因素(表5)。表明RASD1高表达是初诊B-ALL患者OS和RFS的独立危险因素。
表5、成人B-ALL患者无复发生存和总生存的多因素分析
结局 HR(95％CI) P值
无复发生存
RASD1：高表达vs.低表达 8.37(1.85～37.85) 0.006
MRD(≥vs.＜0.1％) 8.90(2.03～39.11) 0.004
移植vs.化疗 0.06(0.02～0.25) 0.000
总生存
RASD1：高表达vs.低表达 4.90(1.59～15.06) 0.006
MRD(≥vs.＜0.1％) 4.58(1.89～11.11) 0.001
移植vs.化疗 0.11(0.04～0.29) 0.000
序列表
<110>郑州大学第一附属医院
<120>RASD1作为标志物在制备B-ALL诊断和预后评估试剂盒中的应用
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
cgactcggag ctgagtatcc 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
ggtggaagtc ctcgatggta 20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
caagaactgc tatcgcatgg tcatcct 27
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
ccgctgacca tcaataagga a 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210>7
<211>1087
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
ctaaattctg gccgtttttg gcttttttgt tagacgaagc ttgggctgca ggtcgactct 60
agaggatccc cgggtaccgg tcgccaccat gaaactggcc gcgatgatca agaagatgtg 120
cccgagcgac tcggagctga gtatcccggc caagaactgc tatcgcatgg tcatcctcgg 180
ctcgtccaag gtgggcaaga cggccatcgt gtcgcgcttc ctcaccggcc gcttcgagga 240
cgcctacacg cctaccatcg aggacttcca ccgcaagttc tactccatcc gcggcgaggt 300
ctaccagctc gacatcctcg acacgtccgg caaccacccg ttccccgcca tgcggcgcct 360
ctccatcctc acaggagacg ttttcatcct ggtgttcagt ctggacaacc gcgactcctt 420
cgaggaggtg cagcggctca ggcagcagat cctcgacacc aagtcttgcc tcaagaacaa 480
aaccaaggag aacgtggacg tgcccctggt catctgcggc aacaagggtg accgcgactt 540
ctaccgcgag gtggaccagc gcgagatcga gcagctggtg ggcgacgacc cccagcgctg 600
cgcctacttc gagatctcgg ccaagaagaa cagcagcctg gaccagatgt tccgcgcgct 660
cttcgccatg gccaagctgc ccagcgagat gagcccagac ctgcaccgca aggtctcggt 720
gcagtactgc gacgtgctgc acaagaaggc gctgcggaac aagaagctgc tgcgggccgg 780
cagcggcggc ggcggcggcg acccgggcga cgcctttggc atcgtggcac ccttcgcgcg 840
ccggcccagc gtacacagcg acctcatgta catccgcgag aaggccagcg ccggcagcca 900
ggccaaggac aaggagcgct gcgtcatcag cggtatggac tacaaggatg acgatgacaa 960
ggattacaaa gacgacgatg ataaggacta taaggatgat gacgacaaat gagctagcct 1020
gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 1080
gcaaagc 1087
<210>8
<211>124
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
tggagataac actctaagca taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca 60
caatggggaa tggtgtgaag cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta 120
catc 124

Claims (10)

1.检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质在如下1)或4)中任一种中的应用：
1)制备诊断或辅助诊断B系急性淋巴细胞白血病的产品：
2)制备预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品；
3)制备评估或辅助评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后效果的产品；
4)制备评估或辅助评估B系急性淋巴细胞白血病患者死亡风险的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白所需的试剂和/或仪器。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
4.一种预测或辅助预测待测者是否为B系急性淋巴细胞白血病患者的产品，其包含检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于：所述产品还包括记载有如下标准的可读载体：若待测者的RASD1基因编码的mRNA的相对表达量≥0.065％，则待测者为或候选为B系急性淋巴细胞白血病患者；若待测者的RASD1基因的相对表达量＜＜0.065％，则待测者不为或候选不为B系急性淋巴细胞白血病患者。
7.一种评估或辅助评估待测B系急性淋巴细胞白血病患者群体预后效果的产品，其包含检测RASD1基因或RASD1基因编码的mRNA或RASD1基因编码的蛋白的物质。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述物质为检测RASD1基因编码的mRNA的相对表达量所需的试剂和/或仪器。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于：所述产品还包括记载有如下标准的可读载体：RASD1高表达患者的死亡风险高于或候选高于RASD1低表达患者。
10.根据权利要求4-9中任一所述的产品，其特征在于：所述产品为试剂盒。
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