CN111100907A - 定量检测gna15基因表达量的引物探针组、试剂盒和方法 - Google Patents

定量检测gna15基因表达量的引物探针组、试剂盒和方法 Download PDF

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姜中兴
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Abstract

本发明公开了一种定量检测GNA15基因表达量的引物探针组、试剂盒和方法，引物探针组包括包括组分A、组分B，组分A包括上游引物GNA15‑FP、下游引物GNA15‑RP和探针GNA15‑probe，组分B包括上游引物ABL1‑FP、下游引物ABL1‑RP和探针ABL1‑probe。本发明优点在于能够定量检测细胞中的GNA15基因的相对表达量，GNA15的灵敏度和ABL1的灵敏度均高达100拷贝，灵敏度高，结果精准、可靠性高，为血液肿瘤细胞（尤其是急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病）提供了一种新的辅助诊断方法或辅助鉴定方法，具有较大的应用前景。

Description

定量检测GNA15基因表达量的引物探针组、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种用于定量检测GNA15基因表达量的引物探针组，还涉及一种包含该引物探针组的试剂盒，还涉及一种定量检测GNA15基因表达量的方法。
背景技术
GNA15是GNA基因家族（包括GNAQ、GNA11、GNA14和GNA15）的一个成员。GNA15表达的蛋白为GNA15蛋白（即Gα15）属于Gα q亚科，在高度特异性细胞类型中表达，如在特定分化阶段的造血干细胞和上皮细胞，能够参与调控细胞的凋亡或增殖，如Gα15通过偶联广泛的GPCR促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡。人类GNA15基因定位于19p13.3，GNA15基因在多种实体肿瘤如胃肠胰神经内分泌肿瘤、肝癌、卵巢癌中可能发挥癌基因作用，在胃肠胰神经内分泌肿瘤中，其可能通过影响ERK、NFκB和Akt信号通路发挥作用。但是，目前尚未出现检测GNA15基因表达量的相关报道，即用GNA15基因表达量辅助鉴定肿瘤细胞仍处于空白阶段。
发明内容
本发明目的在于提供一种定量检测GNA15基因表达量的引物探针组，还涉及一种包含该引物探针组的试剂盒，还涉及一种利用该试剂盒定量检测GNA15基因表达量的方法。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明所述的定量检测GNA15基因表达量的引物探针组，包括组分A、组分B，所述组分A包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物GNA15-FP，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物GNA15-RP，
和含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针GNA15-probe，所述探针GNA15-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ；
所述组分B包括：
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的上游引物ABL1-FP，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的下游引物ABL1-RP，
以及含有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针ABL1-probe，所述探针ABL1-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有TAMRA。
本发明还提供了一种定量检测GNA15基因表达量的试剂盒，包括本发明所述的引物探针组，含有SEQ ID NO.7所示GNA15基因片段的阳性对照质粒以及含有SEQ ID NO.8所示ABL1基因片段的内参对照质粒。
更进一步地，所述组分A中上游引物GNA15-FP、下游引物GNA15-RP与探针GNA15-probe的摩尔比为3:3:2，所述组分B中上游引物ABL1-FP、下游引物ABL1-RP与探针ABL1-probe的摩尔比为3:3:2。
更进一步地，所述阳性对照质粒为在GV219质粒的XhoI/ KpnI酶切位点插入SEQID NO.7所示GNA15基因片段的阳性质粒，所述内参对照质粒为在GV219质粒的XhoI/ KpnI酶切位点插入SEQ ID NO.8所示ABL1基因片段的内参质粒。
本发明还提供了一种利用本发明所述试剂盒定量检测GNA15基因表达量的方法，包括以下步骤：
第一步，配制不同浓度的阳性对照质粒并加入组分A进行PCR反应并检测GNA15基因拷贝数量，配制不同浓度的内参对照质粒并加入组分B进行PCR反应并检测ABL1基因拷贝数量，分别绘制内参对照质粒和阳性对照质粒的荧光标准曲线；
第二步，提取待测样本的RNA，反转录成cDNA，
第三步，以第二步得到的cDNA为模板，分别加入组分A和组分B进行扩增反应，分别检测组分A扩增后cDNA中GNA15基因的拷贝数和组分B扩增后cDNA中ABL1基因的拷贝数，计算GNA15基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值，得到GNA15基因相对表达量。
本发明优点在于首次提出了一种细胞中GNA15相对表达量的定量检测方法，GNA15基因的相对表达量等于细胞中GNA15基因的拷贝数量与细胞中ABL1拷贝数量的比值，并且GNA15的灵敏度和ABL1的灵敏度均高达100拷贝，灵敏度高，结果精准、可靠性高，为血液肿瘤细胞（尤其是急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病）提供了一种新的辅助诊断方法或辅助鉴定方法，具有较大的应用前景。
附图说明
图1是内参对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线
图2是本发明阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线图。
图3是本发明实施例4中各细胞的GNA15基因表达量柱状图。
图4是本发明实施例5中各患者和健康样本中GNA15基因表达量的统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作更加详细的说明。
实施例1 本发明所述的定量检测GNA15基因表达量的引物探针组
本发明的引物探针组包括组分A、组分B，所述组分A包括：上游引物GNA15-FP：5’-GAGAGCCTCGCATTGTTTGG-3’（即SEQ ID NO.1所示核苷酸序列），下游引物GNA15-RP：5’-GGATGTCGGTTTTGTTGAGAAAG-3’（即SEQ ID NO.2所示核苷酸序列），探针GNA15-probe：FAM-TACCCTGGTTCAAAAGCACATCCGTCAT-BHQ（即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列），探针GNA15-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ；
所述组分B包括：上游引物ABL1-FP：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’（即SEQID NO.4所示核苷酸序列），下游引物ABL1-RP：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’（即SEQ IDNO.5所示核苷酸序列），和探针ABL1- probe：FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT–TAMRA（即SEQ ID NO.6所示核苷酸序列），探针ABL1-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
实施例2 本发明所述的定量检测GNA15基因表达量的试剂盒
本发明的试剂盒包括实施例1中的组分A、组分B，阳性对照质粒和内参对照质粒；组分A中：上游引物GNA15-FP:下游引物GNA15-RP:探针GNA15-probe的摩尔比为3:3:2；组分B中：上游引物ABL1-FP、下游引物ABL1-RP和探针ABL1-probe的摩尔比为3:3:2；
阳性对照质粒为在GV219质粒的XhoI/ KpnI酶切位点插入SEQ ID NO.7所示GNA15基因片段的阳性质粒；
内参对照质粒为在GV219质粒的XhoI/ KpnI酶切位点插入SEQ ID NO.8所示ABL1基因片段的内参质粒。
实施例3 本发明所述阳性对照质粒和内参对照质粒的灵敏度检测及荧光标准曲线的绘制，具体包括以下内容：
第一步，用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释实施例2中的阳性对照质粒，得到含有不同GNA15基因片段拷贝数量的阳性对照质粒溶液：106、105、104、103、102拷贝/μL；
用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释实施例2中的内参对照质粒，得到含有不同ABL1基因片段拷贝数量的内参对照质粒溶液：106、105、104、103、102拷贝/微升；
第二步，分别对第一步得到的不同浓度阳性对照质粒溶液和内参对照质粒溶液进行PCR反应：
其中阳性对照质粒的PCR反应体系（10μL）：1μL阳性对照质粒、0.3μL10μM上游引物GNA15-FP、0.3μL10μM下游引物GNA15-RP、0.2μL10μM探针GNA15-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系（购于美国ABI公司），其余为水；
内参对照质粒的PCR反应体系（10μL）：1μL内参对照质粒、0.3μL10μM上游引物ABL1-FP、0.3μL10μM下游引物ABL1-RP、0.2μL10μM探针ABL1-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系，其余为水；
阳性对照质粒和内参对照质粒的PCR反应条件均为：50℃ 2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，50个循环；
第三步，PCR反应后，用荧光实时定量PCR仪（美国ABI公司Quant Studio 5型）分别对扩增后的阳性对照质粒溶液和内参对照质粒溶液进行RQ-PCR检测，得到内参对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线如图1所示，其函数式如下：
log 10 ABL1＝(Ct-41.65)/-3.52
式中ABL1为样本中ABL1基因的拷贝数，Ct为扩增曲线达到阈值所需的循环数；该标准曲线函数的相关系数为1，阈值为0.082，内参ABL1基因的灵敏度达100个拷贝；
阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线如图2所示，其函数式如下：
log 10 GNA15＝(Ct-39.57)/-3.49
式中GNA15为样本中GNA15基因的拷贝数，Ct为扩增曲线达到阈值所需的循环数；该标准曲线函数的相关系数为0.998，阈值为0.082，GNA15基因片段的灵敏度达100个拷贝。
实施例4 将实施例2中的试剂盒用于定量检测Kasumi-1、HEL、SKNO-1、HL-60、BV173、NALM-6、SUPB15、BALL-1、K562、RPMI8226、KM3、MOLP-2、SKO-007和RAMOS十四种肿瘤细胞系（均由郑州大学第一附属医院提供）中GNA15基因的表达量，每个细胞系平行三次检测，具体包括以下步骤：
第一步，参照TRIzol试剂盒（购自美国Invitrogen公司）说明书，用TRIzol试剂盒并提取各个细胞中的RNA，应用ND-1000分光光度计检测RNA的浓度和纯度，所有用于RQ-PCR的RNA 样本的A260：A280在1.8~2.0之间；应用逆转录试剂盒（美国ABI公司）将RNA反转录为cDNA；
第二步，分别以提纯后各细胞的cDNA为模板，加入组分A对cDNA模板进行PCR反应，其中PCR体系（10μL）：1μL cDNA、0.3μL10μM上游引物GNA15-FP、0.3μL10μM下游引物GNA15-RP、0.2μL10μM探针GNA15-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系，其余为水；
分别以提纯后各细胞的cDNA为模板，加入组分B对cDNA模板进行PCR反应，其PCR体系（10μL）：1μL cDNA、0.3μL10μM上游引物ABL1-FP、0.3μL10μM下游引物ABL1-RP、0.2μL10μM探针ABL1-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系，其余为水；
上各细胞的PCR反应条件均为：50℃ 2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，50个循环；
第三步，PCR反应结束后，用荧光实时定量PCR仪分别对各细胞加入组分A进行PCR反应后的扩增液进行RQ-PCR，根据实施例3得到的阳性对照质粒荧光标准曲线计算得到每种细胞中GNA15基因的拷贝数量；
用荧光实时定量PCR仪分别对各细胞加入组分B进行PCR反应后的扩增液进行RQ-PCR，根据实施例3得到的内参对照质粒荧光标准曲线计算得到每种细胞中ABL1基因的拷贝数量；
每种细胞中GNA15基因的拷贝数量与ABL1基因的拷贝数量的比值即为每种细胞中GNA15基因的相对表达量，以百分比表示，结果见表1和图3。
表1 各肿瘤细胞中GNA15基因的相对表达量
细胞名称 细胞类型 GNA15基因相对表达量
Kasumi-1 急性髓系白血病细胞系 90.14%
SKNO-1 急性髓系白血病细胞系 127.96%
HL-60 急性早幼粒白血病细胞系 93.47%
HEL 红白细胞白血病细胞系 61.49%
SUPB15 急性B淋巴细胞白血病细胞系 145.96%
NALM6 急性B淋巴细胞白血病细胞系 58.71%
BALL-1 急性B淋巴细胞白血病细胞系 0.22%
BV173 急性B淋巴细胞白血病细胞系 50.66%
K562 慢性粒细胞白血病急变细胞系 0.06%
KM3 骨髓瘤细胞系 0.10%
MOLP2 骨髓瘤细胞系 0.30%
RPMI8226 骨髓瘤细胞系 0.21%
SKO007 骨髓瘤细胞系 0.10%
RAMOS Burkitt淋巴瘤细胞系 0.71%
结果表明，GNA15在上述14种血液肿瘤细胞系中均表达，在急性髓系白血病细胞系（Kasumi-1、SKNO-1、HL-60）的表达量高达90%以上，在急性淋巴细胞白血病细胞系（BV173、NALM-6、SUPB15）中相对中表达，而在慢粒细胞系（K562）、骨髓瘤细胞系（RPMI8226、KM3、MOLP-2、SKO-007）和淋巴瘤细胞系（RAMOS）中相对低表达。
实施例5 将实施例2中的试剂盒用于定量检测急性白血病患者（其中包括244例AML初诊者、86例ALL初诊者，均由郑州大学第一附属医院提供）骨髓样本中的GNA15基因表达量，并以26例健康骨髓样本中的GNA15基因表达量为对照，具体包括以下步骤：
第一步，参照TRIzol试剂盒（购自美国Invitrogen公司）说明书，用TRIzol试剂盒并提取各个骨髓样本中的RNA，应用逆转录试剂盒（美国ABI公司）将RNA反转录为cDNA；
第二步，分别以提纯后各样本的cDNA为模板，加入组分A对cDNA模板进行PCR反应，其中PCR体系（10μL）：1μL cDNA、0.3μL10μM上游引物GNA15-FP、0.3μL10μM下游引物GNA15-RP、0.2μL10μM探针GNA15-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系，其余为水；
分别以提纯后各样本的cDNA为模板，加入组分B对cDNA模板进行PCR反应，其PCR体系（10μL）：1μL cDNA、0.3μL10μM上游引物ABL1-FP、0.3μL10μM下游引物ABL1-RP、0.2μL10μM探针ABL1-probe、5μL 2×TaqMan通用PCR公共体系，其余为水；
上各样本的PCR反应条件均为：50℃ 2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，50个循环；
第三步，PCR反应结束后，用荧光实时定量PCR仪分别向各样本加入组分A进行PCR反应后的扩增液进行RQ-PCR，根据实施例3得到的阳性对照质粒荧光标准曲线计算得到每个骨髓样本中GNA15基因的拷贝数量；
用荧光实时定量PCR仪分别对各样本加入组分B进行PCR反应后的扩增液进行RQ-PCR，根据实施例3得到的内参对照质粒荧光标准曲线计算得到每个骨髓样本中ABL1基因的拷贝数量；
每个样本中GNA15基因的拷贝数量与ABL1基因的拷贝数量的比值即为每个样本中GNA15基因的相对表达量，结果见图4。
结果表明，正常组（26例健康人）的骨髓样本中GNA15基因低表达，初诊AML组（244例AML初诊者）的骨髓样本中GNA15基因相对高表达，86例初诊ALL患者组成的初诊ALL组中GNA15基因也相对高表达。同时统计结果显示，初诊AML组的GNA15水平显著高于正常组（P＜0.0001），初诊ALL组的GNA15水平显著高于正常组 (P＜0.0001)，初诊AML组的GNA15水平显著高于初诊ALL组（P＜0.0001）。结果表明，GNA15基因的表达量可用于急性白血病的辅助诊断。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 定量检测GNA15基因表达量的引物探针组、试剂盒和方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagagcctcg cattgtttgg 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatgtcggt tttgttgaga aag 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccctggtt caaaagcaca tccgtcat 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210> 7
<211> 2273
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaaggagga agaagggccc tgctggtcac acaggaccca gtctgcggtg ggggttttcc 60
cgccaccgcc ccgccctccc tggggccccc acctcaccct ctcctggcac ccttcaccgt 120
caacctgtcg ggccgggtct gagcaggtct ggaggtgggc ggggagccct ggcctcccca 180
cctcctcccg tccccaccct gttcccagca ctcaagcctt gccaccgccg agccgggctt 240
cctgggtgtt tcaggcaagg aagtctaggt ccctgggggg tgacccccaa ggaaaaggca 300
gcctccctgc gcacccggtt gcccggagcc ctctccaggg ccggctgggc tgggggttgc 360
cctggccagc aggggcccgg gggcgatgcc acccggtgcc gactgaggcc accgcaccat 420
ggcccgctcg ctgacctggc gctgctgccc ctggtgcctg acggaggatg agaaggccgc 480
cgcccgggtg gaccaggaga tcaacaggat cctcttggag cagaagaagc aggaccgcgg 540
ggagctgaag ctgctgcttt tgggcccagg cgagagcggg aagagcacct tcatcaagca 600
gatgcggatc atccacggcg ccggctactc ggaggaggag cgcaagggct tccggcccct 660
ggtctaccag aacatcttcg tgtccatgcg ggccatgatc gaggccatgg agcggctgca 720
gattccattc agcaggcccg agagcaagca ccacgctagc ctggtcatga gccaggaccc 780
ctataaagtg accacgtttg agaagcgcta cgctgcggcc atgcagtggc tgtggaggga 840
tgccggcatc cgggcctgct atgagcgtcg gcgggaattc cacctgctcg attcagccgt 900
gtactacctg tcccacctgg agcgcatcac cgaggagggc tacgtcccca cagctcagga 960
cgtgctccgc agccgcatgc ccaccactgg catcaacgag tactgcttct ccgtgcagaa 1020
aaccaacctg cggatcgtgg acgtcggggg ccagaagtca gagcgtaaga aatggatcca 1080
ttgtttcgag aacgtgatcg ccctcatcta cctggcctca ctgagtgaat acgaccagtg 1140
cctggaggag aacaaccagg agaaccgcat gaaggagagc ctcgcattgt ttgggactat 1200
cctggaacta ccctggttca aaagcacatc cgtcatcctc tttctcaaca aaaccgacat 1260
cctggaggag aaaatcccca cctcccacct ggctacctat ttccccagtt tccagggccc 1320
taagcaggat gctgaggcag ccaagaggtt catcctggac atgtacacga ggatgtacac 1380
cgggtgcgtg gacggccccg agggcagcaa gaagggcgca cgatcccgac gcctcttcag 1440
ccactacaca tgtgccacag acacacagaa catccgcaag gtcttcaagg acgtgcggga 1500
ctcggtgctc gcccgctacc tggacgagat caacctgctg tgacccaggc cccacctggg 1560
gcaggcggca ccggcgggcg ggtgggaggt gggagtggct gcagggaccc ctagtgtccc 1620
tggtctatct ctccagcctc ggcccacacg caagggagtc gggggacgga cggcccgctg 1680
ctggccgctc tcttctctgc ctctcaccag gacagccgcc ccccagggta ctcctgccct 1740
tgcttgactc agtttccctc ctttgaaagg gaaggagcaa aacggccatt tgggatgcca 1800
gggtggatga aaaggtgaag aaatcagggg attgaggact tgggtgggtg ggcatctctc 1860
aggagcccca tctccgggcg tgtcacctcc tgggcagggt tctgggaccc tctgtgggtg 1920
acgcacaccc tgggatgggg ctagtagagc cttcaggcgc cttcgggcgt ggactctggc 1980
gcactctagt ggacaggaga aggaacgcct tccaggaacc tgtggactag gggtgcaggg 2040
acttcccttt gcaaggggta acagaccgct ggaaaacact gtcactttca gagctcggtg 2100
gctcacagcg tgtcctgccc cggtttgcgg acgagagaaa tcgcggccca caagcatccc 2160
cccatccctt gcaggctggg ggctgggcat gctgcatctt aaccttttgt atttattccc 2220
tcaccttctg cagggctccg tgcgggctga aattaaagat ttcttagagg ctg 2273
<210> 8
<211> 5578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttaacaggc gcgtcccggc caggcggaga cgcggccgcg gccatgggcg ggcgcgggcg 60
cgcggggcgg cggtgagggc ggctggcggg gccgggggcg ccgggggggc gcgcgggccg 120
agccgggcct gagccgggcc cgcggaccga gctgggagag gggttccggc ccccgacgtg 180
ctggcgcggg aaaatgttgg agatctgcct gaagctggtg ggctgcaaat ccaagaaggg 240
gctgtcctcg tcctccagct gttatctgga agaagccctt cagcggccag tagcatctga 300
ctttgagcct cagggtctga gtgaagccgc tcgttggaac tccaaggaaa accttctcgc 360
tggacccagt gaaaatgacc ccaacctttt cgttgcactg tatgattttg tggccagtgg 420
agataacact ctaagcataa ctaaaggtga aaagctccgg gtcttaggct ataatcacaa 480
tggggaatgg tgtgaagccc aaaccaaaaa tggccaaggc tgggtcccaa gcaactacat 540
cacgccagtc aacagtctgg agaaacactc ctggtaccat gggcctgtgt cccgcaatgc 600
cgctgagtat ctgctgagca gcgggatcaa tggcagcttc ttggtgcgtg agagtgagag 660
cagtcctggc cagaggtcca tctcgctgag atacgaaggg agggtgtacc attacaggat 720
caacactgct tctgatggca agctctacgt ctcctccgag agccgcttca acaccctggc 780
cgagttggtt catcatcatt caacggtggc cgacgggctc atcaccacgc tccattatcc 840
agccccaaag cgcaacaagc ccactgtcta tggtgtgtcc cccaactacg acaagtggga 900
gatggaacgc acggacatca ccatgaagca caagctgggc gggggccagt acggggaggt 960
gtacgagggc gtgtggaaga aatacagcct gacggtggcc gtgaagacct tgaaggagga 1020
caccatggag gtggaagagt tcttgaaaga agctgcagtc atgaaagaga tcaaacaccc 1080
taacctggtg cagctccttg gggtctgcac ccgggagccc ccgttctata tcatcactga 1140
gttcatgacc tacgggaacc tcctggacta cctgagggag tgcaaccggc aggaggtgaa 1200
cgccgtggtg ctgctgtaca tggccactca gatctcgtca gccatggagt acctggagaa 1260
gaaaaacttc atccacagag atcttgctgc ccgaaactgc ctggtagggg agaaccactt 1320
ggtgaaggta gctgattttg gcctgagcag gttgatgaca ggggacacct acacagccca 1380
tgctggagcc aagttcccca tcaaatggac tgcacccgag agcctggcct acaacaagtt 1440
ctccatcaag tccgacgtct gggcatttgg agtattgctt tgggaaattg ctacctatgg 1500
catgtcccct tacccgggaa ttgacctgtc ccaggtgtat gagctgctag agaaggacta 1560
ccgcatggag cgcccagaag gctgcccaga gaaggtctat gaactcatgc gagcatgttg 1620
gcagtggaat ccctctgacc ggccctcctt tgctgaaatc caccaagcct ttgaaacaat 1680
gttccaggaa tccagtatct cagacgaagt ggaaaaggag ctggggaaac aaggcgtccg 1740
tggggctgtg agtaccttgc tgcaggcccc agagctgccc accaagacga ggacctccag 1800
gagagctgca gagcacagag acaccactga cgtgcctgag atgcctcact ccaagggcca 1860
gggagagagc gatcctctgg accatgagcc tgccgtgtct ccattgctcc ctcgaaaaga 1920
gcgaggtccc ccggagggcg gcctgaatga agatgagcgc cttctcccca aagacaaaaa 1980
gaccaacttg ttcagcgcct tgatcaagaa gaagaagaag acagccccaa cccctcccaa 2040
acgcagcagc tccttccggg agatggacgg ccagccggag cgcagagggg ccggcgagga 2100
agagggccga gacatcagca acggggcact ggctttcacc cccttggaca cagctgaccc 2160
agccaagtcc ccaaagccca gcaatggggc tggggtcccc aatggagccc tccgggagtc 2220
cgggggctca ggcttccggt ctccccacct gtggaagaag tccagcacgc tgaccagcag 2280
ccgcctagcc accggcgagg aggagggcgg tggcagctcc agcaagcgct tcctgcgctc 2340
ttgctccgcc tcctgcgttc cccatggggc caaggacacg gagtggaggt cagtcacgct 2400
gcctcgggac ttgcagtcca cgggaagaca gtttgactcg tccacatttg gagggcacaa 2460
aagtgagaag ccggctctgc ctcggaagag ggcaggggag aacaggtctg accaggtgac 2520
ccgaggcaca gtaacgcctc cccccaggct ggtgaaaaag aatgaggaag ctgctgatga 2580
ggtcttcaaa gacatcatgg agtccagccc gggctccagc ccgcccaacc tgactccaaa 2640
acccctccgg cggcaggtca ccgtggcccc tgcctcgggc ctcccccaca aggaagaagc 2700
tggaaagggc agtgccttag ggacccctgc tgcagctgag ccagtgaccc ccaccagcaa 2760
agcaggctca ggtgcaccag ggggcaccag caagggcccc gccgaggagt ccagagtgag 2820
gaggcacaag cactcctctg agtcgccagg gagggacaag gggaaattgt ccaggctcaa 2880
acctgccccg ccgcccccac cagcagcctc tgcagggaag gctggaggaa agccctcgca 2940
gagcccgagc caggaggcgg ccggggaggc agtcctgggc gcaaagacaa aagccacgag 3000
tctggttgat gctgtgaaca gtgacgctgc caagcccagc cagccgggag agggcctcaa 3060
aaagcccgtg ctcccggcca ctccaaagcc acagtccgcc aagccgtcgg ggacccccat 3120
cagcccagcc cccgttccct ccacgttgcc atcagcatcc tcggccctgg caggggacca 3180
gccgtcttcc accgccttca tccctctcat atcaacccga gtgtctcttc ggaaaacccg 3240
ccagcctcca gagcggatcg ccagcggcgc catcaccaag ggcgtggtcc tggacagcac 3300
cgaggcgctg tgcctcgcca tctctaggaa ctccgagcag atggccagcc acagcgcagt 3360
gctggaggcc ggcaaaaacc tctacacgtt ctgcgtgagc tatgtggatt ccatccagca 3420
aatgaggaac aagtttgcct tccgagaggc catcaacaaa ctggagaata atctccggga 3480
gcttcagatc tgcccggcga cagcaggcag tggtccagcg gccactcagg acttcagcaa 3540
gctcctcagt tcggtgaagg aaatcagtga catagtgcag aggtagcagc agtcaggggt 3600
caggtgtcag gcccgtcgga gctgcctgca gcacatgcgg gctcgcccat acccgtgaca 3660
gtggctgaca agggactagt gagtcagcac cttggcccag gagctctgcg ccaggcagag 3720
ctgagggccc tgtggagtcc agctctacta cctacgtttg caccgcctgc cctcccgcac 3780
cttcctcctc cccgctccgt ctctgtcctc gaattttatc tgtggagttc ctgctccgtg 3840
gactgcagtc ggcatgccag gacccgccag ccccgctccc acctagtgcc ccagactgag 3900
ctctccaggc caggtgggaa cggctgatgt ggactgtctt tttcattttt ttctctctgg 3960
agcccctcct cccccggctg ggcctccttc ttccacttct ccaagaatgg aagcctgaac 4020
tgaggccttg tgtgtcaggc cctctgcctg cactccctgg ccttgcccgt cgtgtgctga 4080
agacatgttt caagaaccgc atttcgggaa gggcatgcac gggcatgcac acggctggtc 4140
actctgccct ctgctgctgc ccggggtggg gtgcactcgc catttcctca cgtgcaggac 4200
agctcttgat ttgggtggaa aacagggtgc taaagccaac cagcctttgg gtcctgggca 4260
ggtgggagct gaaaaggatc gaggcatggg gcatgtcctt tccatctgtc cacatcccca 4320
gagcccagct cttgctctct tgtgacgtgc actgtgaatc ctggcaagaa agcttgagtc 4380
tcaagggtgg caggtcactg tcactgccga catccctccc ccagcagaat ggaggcaggg 4440
gacaagggag gcagtggcta gtggggtgaa cagctggtgc caaatagccc cagactgggc 4500
ccaggcaggt ctgcaagggc ccagagtgaa ccgtcctttc acacatctgg gtgccctgaa 4560
agggcccttc ccctccccca ctcctctaag acaaagtaga ttcttacaag gccctttcct 4620
ttggaacaag acagccttca cttttctgag ttcttgaagc atttcaaagc cctgcctctg 4680
tgtagccgcc ctgagagaga atagagctgc cactgggcac ctgcgcacag gtgggaggaa 4740
agggcctggc cagtcctggt cctggctgca ctcttgaact gggcgaatgt cttatttaat 4800
taccgtgagt gacatagcct catgttctgt gggggtcatc agggagggtt aggaaaacca 4860
caaacggagc ccctgaaagc ctcacgtatt tcacagagca cgcctgccat cttctccccg 4920
aggctgcccc aggccggagc ccagatacgg gggctgtgac tctgggcagg gacccggggt 4980
ctcctggacc ttgacagagc agctaactcc gagagcagtg ggcaggtggc cgcccctgag 5040
gcttcacgcc gggagaagcc accttcccac cccttcatac cgcctcgtgc cagcagcctc 5100
gcacaggccc tagctttacg ctcatcacct aaacttgtac tttatttttc tgatagaaat 5160
ggtttcctct ggatcgtttt atgcggttct tacagcacat cacctctttg cccccgacgg 5220
ctgtgacgca gccggaggga ggcactagtc accgacagcg gccttgaaga cagagcaaag 5280
cgcccaccca ggtcccccga ctgcctgtct ccatgaggta ctggtccctt ccttttgtta 5340
acgtgatgtg ccactatatt ttacacgtat ctcttggtat gcatctttta tagacgctct 5400
tttctaagtg gcgtgtgcat agcgtcctgc cctgccccct cgggggcctg tggtggctcc 5460
ccctctgctt ctcggggtcc agtgcatttt gtttctgtat atgattctct gtggtttttt 5520
ttgaatccaa atctgtcctc tgtagtattt tttaaataaa tcagtgttta cattagaa 5578

Claims (5)

1.一种定量检测GNA15基因表达量的引物探针组，其特征在于：包括组分A、组分B，所述组分A包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物GNA15-FP，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物GNA15-RP，
和含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针GNA15-probe，所述探针GNA15-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ；
所述组分B包括：
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的上游引物ABL1-FP，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的下游引物ABL1-RP，
以及含有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针ABL1-probe，所述探针ABL1-probe的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
2.一种定量检测GNA15基因表达量的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组，含有SEQ ID NO.7所示GNA15基因片段的阳性对照质粒以及含有SEQ ID NO.8所示ABL1基因片段的内参对照质粒。
3.根据权利要求2所述的定量检测GNA15基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述组分A中上游引物GNA15-FP、下游引物GNA15-RP与探针GNA15-probe的摩尔比为3:3:2，所述组分B中上游引物ABL1-FP、下游引物ABL1-RP与探针ABL1-probe的摩尔比为3:3:2。
4.根据权利要求2所述的定量检测GNA15基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照质粒为在GV219质粒的XhoI / KpnI酶切位点插入SEQ ID NO.7所示GNA15基因片段的阳性质粒，所述内参对照质粒为在GV219质粒的XhoI/ KpnI酶切位点插入SEQ ID NO.8所示ABL1基因片段的内参质粒。
5.一种定量检测GNA15基因表达量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，配制不同浓度的阳性对照质粒并加入组分A进行PCR反应，并检测GNA15基因拷贝数量；配制不同浓度的内参对照质粒加入组分B进行PCR反应并检测ABL1基因拷贝数量，分别绘制内参对照质粒和阳性对照质粒的荧光标准曲线；
第二步，提取待测样本的RNA，反转录成cDNA，
第三步，以第二步得到的cDNA为模板，分别加入组分A和组分B进行扩增反应，分别检测组分A扩增后cDNA中GNA15基因的拷贝数和组分B扩增后cDNA中ABL1基因的拷贝数，GNA15基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值为GNA15基因相对表达量。
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