CN108866186B - 29种egfr基因突变的检测引物、方法及试剂盒 - Google Patents

29种egfr基因突变的检测引物、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了29种EGFR基因突变检测引物、方法及试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID NO:1～38所述的引物和检测探针。本发明采用更优的引物和探针，对样本gDNA仅需少量，灵敏度高达0.5％～1％，特异性高。根据突变扩增曲线直接判断有无突变，无需计算ΔCt，结果判读简单直接，具有很好的临床应用前景。

Description

29种EGFR基因突变的检测引物、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及29种EGFR基因突变的检测引物、方法及试剂盒。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)表达产物，是一种跨膜酪氨酸激酶受体。该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前已发现30多种突变；其中缺失突变主要发生在外显子19上，以E746-A750del最为常见，替换突变最常见的是在外显子21上的L858R，插入突变主要发生在外显子20上。
肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居恶性肿瘤第一位，其中约80％～85％肺癌患者是非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)。在我国,肺癌也是第一大肿瘤,占全部恶性肿瘤死亡的25.0％。且发病率和死亡率仍在陆续上升,据统计,每年新增肺癌病例达50万～60万。世界卫生组织(WHO)预测,到2025年,中国每年新增肺癌病例将超过100万,成为世界第一肺癌大国。多年来我国肺癌患者的5年生存率无明显提高。然而，近年美国FDA和中国CFDA批准的用于NSCLC靶向治疗的表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI，如吉非替尼、埃克替尼和奥西替尼等)、ALK激酶抑制剂和ROS1激酶抑制剂(如克唑替尼、艾乐替尼等)能显著改善患者的生存。中国晚期原发性肺癌诊治专家共识、美国国立综合癌症网络(NCCN)临床实践指南以及欧洲肿瘤内科学会(ESMO)肺癌共识均明确建议：晚期NSCLC患者在接受治疗之前应先检测EGFR、ALK和ROS1基因，根据基因状态决定相应的治疗策略。
qPCR检测基因点突变最常用的方法是突变扩增系统(amplification refractorymutation system,ARMS)PCR。Arms-PCR是一种用来检测已知突变的方法。其基本原理是如果引物3’末端碱基不与模板完全匹配，引物延伸就会受阻。根据已知点突变设计引物，引物3’端碱基与突变型模板碱基互补，PCR只扩增突变型模板，从而达到检测点突变的目的。
目前临床上肿瘤患者穿刺组织经常出现组织肿瘤细胞过少或穿刺组织样本基因组量少的情况，而对此类样本点突变的检测则要求更高灵敏度的技术。一方面能检测低肿瘤细胞比例(小于20％)的样本，降低假阴性风险；另一方面检测所需组织样本基因组更少。
然而现在市面上针对EGFR突变检测的Arms-PCR产品灵敏度约为5％，且不能完全抑制野生型样本的扩增，结果判读需计算delta Ct较复杂，不能满足临床要求。
发明内容
本发明的目的在于提供29种EGFR基因突变检测引物和试剂盒。
本发明的另一目的在于提供检测29种EGFR基因突变的方法。
本发明所采取的技术方案是：
29种EGFR基因突变检测引物组，引物的核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0001692629560000021
Figure BDA0001692629560000032
29种EGFR基因突变检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。
进一步的，上述试剂盒还含有检测探针组，其核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0001692629560000033
或者为该些序列的核苷酸反向互补序列。
进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
进一步的，上述试剂盒还含有荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，DNA polymerase，阴性对照品，阳性对照品，外标引物F19(SEQ ID NO：33)、R8(SEQ ID NO:34)以及探针P8(SEQ ID NO:35)，内标引物F20(SEQ ID NO:36)、R9(SEQ ID NO:37)以及内村探针P9(SEQID NO:38)。
29种EGFR基因突变的检测方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取gDNA；
2)以提取的gDNA为模板，利用SEQ ID NO:1～38所示的引物和探针组进行荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；
3)结果分析：根据荧光信号判定样品是否存在相应的EGFR基因突变；
上述方法不用于疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2)中，荧光定量PCR扩增反应体系分为8个反应体系进行，分别记为体系A～H，具体信息如下：
A体系：
Figure BDA0001692629560000031
Figure BDA0001692629560000041
B体系：
Figure BDA0001692629560000042
Figure BDA0001692629560000051
C体系：
Figure BDA0001692629560000052
D体系：
Figure BDA0001692629560000053
E体系：
Figure BDA0001692629560000061
F体系：
Figure BDA0001692629560000062
G体系：
Figure BDA0001692629560000063
Figure BDA0001692629560000071
H外标体系：
Figure BDA0001692629560000072
进一步的，步骤2)中荧光定量PCR扩增反应程序为：94～96℃、4～7min；94～96℃、13～17s，58～62℃、28～32s，71～73℃、8～13s，循环38～45次，同时收集荧光信号。
进一步的，步骤3)中结果分析的具体过程如下：
①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明该样品存在相应基因突变类型；
②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本无Ct值且曲线无明显的指数增长期，说明该样品不存在相应基因突变类型或该突变率低于所述方法最低检测限或为所述方法检测范围外的突变类型。
本发明的有益效果是：
本发明采用更优的引物，对样本gDNA仅需80ng，灵敏度高达0.5％～1％，特异性高，根据突变扩增曲线直接判断有无突变，无需计算ΔCt，结果判读简单直接。
附图说明
图1是本发明方法对29种EGFR基因突变的阳性突变质粒与野生型293T细胞gDNA按比例混合配制突变梯度样本的检测结果。
图2是与F16仅1个碱基不同的引物F16检测EGFR基因突变质粒与293T细胞gDNA比例混合配制突变梯度样本的检测结果。
图3是本发明方法对临床FFPE样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 29种EGFR基因突变的检测引物及探针
本发明通过研究设计大量引物和探针，通过对大量引物和探针进行优化和筛选，且对体系、成分经过相应的优化，最终获得了显著提高检测灵敏度和特异性引物组和探针组(见表2)；该引物组和探针组能够检测EGFR的29种主要突变类型(见表1)。内外标引物和探针(见表2)用于体系扩增监控，保证检测正常进行。
表1 29种EGFR基因突变类型及本发明引物和探针的检测灵敏度
Figure BDA0001692629560000081
Figure BDA0001692629560000091
表2检测29种EGFR基因突变类型的PCR引物和探针序列
Figure BDA0001692629560000092
Figure BDA0001692629560000101
实施例2 29种EGFR基因突变的检测试剂盒
本实施例检测试剂盒包括：
1)29种EGFR基因突变的检测引物以及探针(具体序列见表2)；
2)外标引物F19、R8以及探针P8(具体序列见表2)；
3)内标引物F20、R9以及探针P9(具体序列见表2)；
4)试剂盒还包含阴性对照品(阴性对照为2个，分别是ddH2O和野生型293T细胞基因组)和阳性对照品(含有29种各EGFR基因突变类型的阳性质粒混合液)多重质控避免检测结果的假阳性和假阴性。
5)DNA polymerase、dNTP以及荧光定量PCR反应缓冲液。
实施例3 29种EGFR基因突变的检测方法
1)从样品中提取gDNA；
2)以提取的gDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应获并收集荧光信号；
其中，29种EGFR基因突变的PCR扩增反应体系为(试剂采购自南京诺唯赞生物科技有限公司)分8管体系进行检测：
A体系：
Figure BDA0001692629560000111
Figure BDA0001692629560000121
B体系：
Figure BDA0001692629560000122
C体系：
Figure BDA0001692629560000123
Figure BDA0001692629560000131
D体系：
Figure BDA0001692629560000132
E体系：
Figure BDA0001692629560000133
F体系：
Figure BDA0001692629560000134
Figure BDA0001692629560000141
G体系：
Figure BDA0001692629560000142
H外标体系：
Figure BDA0001692629560000143
Figure BDA0001692629560000151
PCR扩增反应程序如下：利实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)进行PCR扩增，PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火30s(收集荧光信号)，72℃、10s，循环45次，同时收集荧光信号。
3)结果分析：
①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明该样品存在相应基因突变类型；
②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本无Ct值且曲线无明显的指数增长期，说明该样品不存在相应基因突变类型或该突变率低于本发明方法最低检测限或为本发明方法检测范围外的突变类型。
实施例4灵敏度检测
将上述阳性对照品(含有29种各EGFR基因突变类型的阳性质粒混合液)和野生型293T细胞gDNA按相应比例混合，使阳性质粒(阳性对照品)分别占总DNA量的0.1％、0.5％、1％、5％；根据上述的实施例3的检测方法进行灵敏度检测实验。同时设置NTC非模板对照(ddH2O阴性对照)以及野生型293T细胞gDNA的阴性对照。
检测结果如图1所示，本发明方法对18种EGFR基因突变的检测灵敏度达到0.5％(见表1、图1-A和图1-B)，对另11种EGFR基因突变的检测灵敏度达到1％(见表1和图1-C)，本发明方法对29种EGFR基因突变均具有很好的检测效果，灵敏度高；且对NTC和293gDNA(野生型gDNA)不具有扩增曲线。
对比例：其他引物检测EGFR基因突变的灵敏度
方法同上，只是所用的引物不同，如本对比例不采用引物F16，而是采用与F16仅1个碱基不同的引物F16'：5'-CACCGTGCAGCTCATGAT-3'(SEQ ID NO:39)；同时设置NTC非模板对照(ddH2O阴性对照)以及野生型293T细胞gDNA的阴性对照。
检测结果如图2所示，从中可以看出用引物F16'替换F16后，由于野生型293T细胞gDNA也存在扩增曲线且与1％扩增曲线无法区分，其检测灵敏度只能达到5％。
实施例5临床样品检测
将临床FFPE样本根据上述的实施例3的检测方法进行检测实验。同时设置NTC非模板对照(ddH2O阴性对照)以及野生型293T细胞gDNA的阴性对照。
检测结果如图3所示，本发明方法对临床样本gDNA均具有很好的检测效果，且对NTC和293gDNA(野生型gDNA)不具有扩增曲线。其中图3-A显示了6例临床样本的检测结果，其中2例S768I突变阳性，2例L858R突变阳性，2例L861Q突变阳性；图3-B显示了2例T790M突变阳性临床样本的检测结果；图3-C显示了5例临床样本的检测结果，2例G719A突变阳性，2例G719S突变阳性，1例G719C突变阳性；图3-D显示了6例exon 19del临床样本的检测结果，2例2235-2249del突变阳性，2例2236-2250del突变阳性，2例2237-2255>T突变阳性；图3-E显示了3例exon 20ins临床样本的检测结果，2例insGCCAGCGTG突变阳性，1例insCAC突变阳性。
另外，通过二代测序确认了各临床FFPE样本的EGFR基因突变类型与本发明检测的类型均一致，说明本发明方法具有很好的准确性和适用性，可用于临床样品的快速检测。
综上所述本发明采用更优的引物和探针及PCR体系组分比例，使本发明的灵敏度显著提高，且特异性高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州迈景基因医学科技有限公司
<120> 29种EGFR基因突变的检测引物、方法及试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<400> 32
ccaaaatctg tgatc 15
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gctcacgcag ttgggcactt 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cacctcacag ttattgaaca tcct 24
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
aagatcattt tctcag 16
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtgtcgcaga ggagcccc 18
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ccgctgcgca ctagcatccc 20
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cggcctccgg caccg 15
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
caccgtgcag ctcatgat 18

Claims (3)

1.29种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有引物组和检测探针组，所述引物组的核苷酸序列如下所示：
Figure 37191DEST_PATH_IMAGE001
所述检测探针组的核苷酸序列如下所示：
Figure 494717DEST_PATH_IMAGE002
或者为该些序列的核苷酸反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，DNA polymerase，阴性对照品，阳性对照品，外标引物F19如核苷酸序列SEQ IDNO：33所示、R8如核苷酸序列SEQ ID NO:34所示以及探针P8如核苷酸序列SEQ ID NO:35所示，内标引物F20如核苷酸序列SEQ ID NO:36所示、R9如核苷酸序列SEQ ID NO:37所示，以及内标探针P9如核苷酸序列SEQ ID NO:38所示。
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