CN117604105A - 基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法 - Google Patents
基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及融合基因检测溯源技术领域，建立了一种基于内参基因的BCR‑ABL1 p190融合基因检测溯源方法，溯源方法包括内参基因ABL1检测方法的溯源；可溯源至参考质粒的p190质粒的制备；p190融合基因检测方法的溯源；建立的溯源方法可以将内参基因ABL1与p190融合基因检测的具体拷贝数以及p190融合基因/内参基因ABL1检测的比例都溯源至有证参考质粒，溯源过程中的线性关系曲线良好，R2与斜率都接近1。该溯源方法对于促进p190型融合基因检测的标准化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及融合基因检测溯源技术领域，更具体地说是一种基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法。
背景技术
慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）和急性淋巴细胞白血病（Acute lymphocytic leukemia，ALL）是白血病中比较常见的两种类型的白血病。95%以上的CML患者，20%的成人以及5%的儿童ALL患者都以出现费城染色体（Philadelphiachromosome，Ph）为主要特征。Ph染色体是22号染色体长臂和9号染色体发生易位形成的一种染色体，易位导致基因BCR（breakpoint cluster region）和ABL1（Abelson）发生融合，根据基因断裂位点的不同，BCR-ABL1融合基因可以分成多种亚型。其中，e13a2或e14a2，e1a2，e19a2是比较常见的亚型，分别编码p210、p190、p230癌蛋白。这些癌蛋白具有酪氨酸激酶活性，可影响信号传导通路中多个靶点，导致细胞有丝分裂信号异常，改变细胞粘附性，抑制细胞凋亡通路等，最终导致白血病的发生。
目前基于染色体水平的检测主要有骨髓细胞遗传学分析和荧光原位杂交技术等。随着靶向BCR-ABL1融合基因的酪氨酸抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）的应用，越来越多的患者可以达到深层的分子反应。因此染色体水平的检测无法满足对低水平疾病的持续监测。而实时逆转录定量PCR（Real-time quantitative reverse transcriptionPCR，RT-qPCR）可以在105到106个正常细胞中检测到一个白血病细胞，所以适合监测不同治疗阶段的分子反应，欧洲白血病网（European LeukemiaNet, ELN）推荐CML患者在治疗期间每3个月进行一次BCR-ABL1的RT-qPCR检测以监测白血病细胞的残留情况。当治疗12个月后，患者的融合基因水平能≤0.1%且能一直维持该水平，其生存率可以达到100%。
但是由于RT-qPCR实验步骤较多，不同的参考基因、RNA提取方法、逆转录体系、荧光定量体系等均可影响检测结果，从而导致实验室之间的检测结果差异大，不具有可比性，给临床医生对CML和Ph+ ALL的诊断、疗效评估和预后带来很大的困扰，所以各个实验室之间的结果需要统一溯源至国际标准以实现检测结果的可比性。
目前BCR-ABL1 p210型融合基因主要通过与参考实验室进行样本交换以及检测国际参考物质获取实验室特异的转换因子（Conversion factor, CF），从而将检测结果溯源至国际标准，实现检测的标准化。但是对于p190型融合基因的检测，目前还没有对应的参考实验室以及国际参考物质，所以不同实验室之间p190型融合基因的检测结果无法溯源至同一标准，结果之间也没有可比性，导致其分子检测标准化进展缓慢。
因此，在没有BCR-ABL1 p190国际参考物质的情况下，如何实现其分子检测的溯源标准化已成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是建立一种基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，由于目前只有p210定量参考质粒，所以本发明构建了p190质粒，其p190融合基因与内参基因为1:1，通过共同的内参基因将p190融合基因的定量检测溯源至p210参考物质，从而实现p190检测的溯源标准化，进而解决背景技术中提出的问题。
本发明具体的技术方案如下：
一种基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，所述检测溯源方法的步骤包括：
S1：自建内参基因ABL1方法进行检测，通过使用自建的内参基因ABL1方法对有证p210参考质粒ERM-AD623进行内参基因ABL1检测，建立参考质粒定值浓度与检测浓度的线性关系曲线；
其中线性关系曲线近似于y＝x，R2接近于1，获得的转换因子接近1；
S2：制备参考质粒，制备可溯源至参考质粒的p190质粒，其p190融合基因和S1中的内参基因ABL1为1:1，根据S1中建立的线性关系曲线将p190质粒的定值结果溯源至参考质粒；
S3：p190质粒检测，使用自建的内参基因ABL1方法和p190融合基因方法对梯度稀释的p190质粒进行检测，建立内参基因ABL1和p190融合基因检测结果的线性关系曲线。
其中线性关系曲线近似于y＝x，R2接近于1，获得的转换因子接近1。
优选的，步骤S1中，通过建立参考质粒定值浓度与检测浓度的线性关系曲线，获取自建内参基因ABL1检测方法的转换因子CF。
优选的，步骤S1和S3中，所述自建的内参基因ABL1方法和p190融合基因方法包括引物对、荧光探针和预混液；
所述引物对在反应体系中的终浓度为600-1200nM，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80-400nM。
所述荧光探针的5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光发生基团包括FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX、Cy3或Cy5中的任意一种；
所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种；
所述预混液包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs。
其中扩增所述的内参基因ABL1的引物对序列如序列表中“序列1和序列2”所示，检测所述内参基因ABL1的荧光探针序列如序列表中“序列3”所示。
其中扩增所述的p190融合基因的引物对序列如序列表中“序列5和序列6”所示，检测所述p190融合基因的荧光探针序列如序列表中“序列7”所示。
优选的，所述自建内参基因ABL1方法和p190融合基因方法的反应程序包括：
（1）预变性：94～98℃，8～12min；
（2）循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次；
（3）延伸：94～98℃，8～12min；
扩增完成后根据伯乐数字PCR的定量结果计算待测物的检测浓度。
优选的，步骤S2中，所述p190质粒的制备还包括环形质粒的线性化以及溯源定值，制备方法包括：
S2.1：配制酶切反应体系对p190质粒进行单酶切；
S2.2：酶切完成后，进行电泳，切下目的条带进行胶回收并使用保护稀释液进行洗脱；
S2.3：使用自建内参基因ABL1方法对线性化p190质粒进行检测，根据S1中建立的线性关系曲线将p190质粒的定值结果溯源至参考质粒。其中p190质粒插入的核苷酸序列如序列表中“序列4”所示。
优选的，所述酶切反应体系包括pac I限制性内切酶、缓冲液；所述保护稀释液包括Tris- EDTA缓冲液，其pH为8.0。
优选的，步骤S3中，根据S2中的定值结果，使用保护稀释液将p190质粒稀释一系列浓度梯度，所述梯度稀释后，p190质粒的终浓度依次为（1-5）ⅹ106拷贝/uL、（1-5）ⅹ105拷贝/uL、（1-5）ⅹ104拷贝/uL、（1-5）ⅹ103拷贝/uL、（1-5）ⅹ102拷贝/uL、（1-5）ⅹ101拷贝/uL。
优选的，步骤S3中，使用内参基因ABL1方法和p190融合基因方法对梯度稀释后的p190质粒进行检测，通过建立内参基因ABL1和p190融合基因检测结果的线性关系曲线，获取自建p190融合基因检测方法的转换因子CF。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过建立溯源方法可以将p190融合基因和内参基因ABL1的定量检测结果都溯源至有证参考质粒ERM-AD623，因此不论是内参基因ABL1与p190融合基因的具体拷贝数还是p190融合基因/内参基因ABL1的比例都具备溯源性，对于p190型融合基因检测的标准化具有重要意义。
2、本发明制备的p190质粒其定值结果可溯源至有证参考质粒，因此可以作为定量参考品为RT-qPCR检测方法进行溯源定值，对于各个实验室检测方法的标准化具有重要意义。
附图说明
图1是本发明ERM-AD623参考质粒的定值浓度与检测浓度的线性关系曲线；
图2是本发明p190质粒的内参基因ABL1与融合基因p190检测浓度的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明提供一种内参基因ABL1检测的溯源方法，其具体步骤如下：
（1）使用的自建内参基因ABL1方法对有证p210参考质粒ERM-AD623进行检测。
其中自建内参基因ABL1检测方法包括终浓度为900nM的引物对、250nM荧光探针和预混液；
扩增的内参基因ABL1的引物对序列如序列表中“序列1和序列2”所示，检测内参基因ABL1的荧光探针序列如序列表中“序列3”所示，其中荧光探针的荧光发生基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；
预混液使用伯乐的supermix，包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs；
反应体系具体如下：
| 组分 | 添加量（uL） |
| 模板 | 1 |
| 正向引物（终浓度900nM） | 1.6 |
| 反向引物（终浓度900nM） | 1.6 |
| 荧光探针（终浓度250nM） | 0.4 |
| 预混液 | 10 |
| 去离子水 | 5.4 |
| 总体积 | 20 |
自建内参基因ABL1检测方法的反应程序包括：
预变性：95℃，10min；
循环扩增：94℃，15s；57℃，60s；循环40次；
延伸：98℃，10min。
扩增完成后根据伯乐数字PCR的定量结果计算参考质粒的实际检测浓度。
（2）建立参考质粒定值浓度与检测浓度的线性关系曲线，对内参基因ABL1检测方法进行溯源，获取自建内参基因ABL1检测方法的转换因子CF。
本实施例中，参考质粒的定值浓度与检测浓度的线性关系曲线如图1所示，由图可以看出R2=0.9978（接近1），斜率=1.0263（接近1），截距=-0.1077，线性关系良好，转换因子CF=10-（-0.1077）=1.2814（转换因子为截距逆对数的倒数）。
实施例2
本实施例提供一种可溯源至参考质粒的p190质粒的制备方法，具体步骤如下：
（1）合成p190融合基因和内参基因ABL1为1:1的p190质粒；其中p190质粒插入的核苷酸序列如序列表中“序列4”所示。
（2）配制酶切反应体系对环形p190质粒进行单酶切使其线性化；限制性内切酶为pac I限制性内切酶，终浓度为10 units/uL；
其中反应体系具体如下：
| 组分 | 添加量 |
| 10 ⅹ buffer | 5 uL |
| pac I限制性内切酶（终浓度为10 units/uL） | 2.5 uL |
| 去离子水 | 2.5 uL |
| 质粒 | 5 ug (40 uL) |
| 总体积 | 50 |
上述反应条件：37℃，2个小时。
酶切完成后，将酶切产物上样于1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件140 V，30分钟。电泳结束后使用凝胶成像系统拍照并切下目的条带进行胶回收，使用pH为8的Tris-EDTA保护稀释液进行洗脱。
（3）p190质粒溯源定值
使用的内参基因ABL1的方法对线性化的质粒进行检测，根据实际检测结果以及上述建立的线性关系曲线，将p190质粒的浓度溯源至参考质粒。
本发明中，线性化p190质粒的实际定量结果为5.92ⅹ107拷贝/uL，根据线性关系公式：y=1.0263x – 0.1077，R2=0.9978，溯源后的p190浓度为4.8ⅹ107拷贝/uL。
实施例3
本实施例提供一种基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测的溯源方法：
（1）根据p190线性化质粒溯源后的定值结果，使用pH为8的Tris- EDTA保护稀释液将p190质粒稀释一系列浓度梯度，梯度稀释后，p190质粒的终浓度依次为1ⅹ106拷贝/uL、1ⅹ105拷贝/uL、1ⅹ104拷贝/uL、1ⅹ103拷贝/uL、1ⅹ102拷贝/uL、1ⅹ101拷贝/uL。
（2）使用的自建内参基因ABL1方法和p190融合基因方法对梯度稀释的p190质粒进行检测。
自建内参基因ABL1检测方法同实施例1，此处不再赘述；p190融合基因检测方法包括终浓度为900nM的引物对、250nM荧光探针和预混液；
扩增的p190融合基因的引物对序列如序列表中“序列5和序列6”所示，检测p190融合基因的荧光探针序列如序列表中“序列7”所示，荧光探针的荧光发生基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；
其中预混液使用伯乐supermix,包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs；
反应体系具体如下：
| 组分 | 添加量（uL） |
| 模板 | 1 |
| 正向引物（终浓度900nM） | 1.6 |
| 反向引物（终浓度900nM） | 1.6 |
| 荧光探针（终浓度250nM） | 0.4 |
| 预混液 | 10 |
| 去离子水 | 5.4 |
| 总体积 | 20 |
自建p190融合基因方法的反应程序包括：
预变性：95℃，10min；
循环扩增：94℃，15s；57℃，60s；循环40次；
延伸：98℃，10min。
扩增完成后根据伯乐数字PCR的定量结果计算p190融合基因的检测浓度。
（3）建立内参基因ABL1和p190融合基因检测结果的线性关系曲线，获取自建p190融合基因检测方法的转换因子CF。
本发明中，内参基因ABL1检测结果和p190融合基因检测结果的线性关系曲线如图2所示，由图可以看出R2=0.9998，斜率=0.9866（接近1），截距=0.0646，线性关系良好，转换因子CF=10-（0.0646）=0.8617（转换因子为截距逆对数的倒数）。将p190融合基因定量检测方法溯源至参考质粒时，转换因子CF=0.8617ⅹ1.2814 =1.1042。
本发明中，内参基因ABL1定量检测方法的转换因子CF为1.2814，p190融合基因定量检测方法的转换因子CF为1.1042，p190融合基因/内参基因ABL1的转换因子CF为0.8617。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
Claims (8)
1.一种基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，所述检测溯源方法的步骤包括：
S1：自建内参基因ABL1方法，通过使用自建的内参基因ABL1方法对有证p210参考质粒ERM-AD623进行内参基因ABL1检测，建立参考质粒定值浓度与检测浓度的线性关系曲线；
S2：制备p190质粒，制备可溯源至参考质粒的p190质粒，其p190融合基因和S1中的内参基因ABL1为1:1，根据S1中建立的线性关系曲线将p190质粒的定值结果溯源至参考质粒；
S3：p190质粒检测，使用自建的内参基因ABL1方法和p190融合基因方法对梯度稀释的p190质粒进行检测，建立内参基因ABL1和p190融合基因检测结果的线性关系曲线。
2.根据权利要求1所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，步骤S1中，通过建立参考质粒定值浓度与检测浓度的线性关系曲线，获取自建内参基因ABL1检测方法的转换因子CF。
3.根据权利要求1所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，步骤S1和S3中，所述自建的内参基因ABL1方法和p190融合基因方法包括引物对、荧光探针和预混液；
所述引物对在反应体系中的终浓度为600-1200nM，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80-400nM；
所述荧光探针的5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光发生基团包括FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX、Cy3或Cy5中的任意一种；
所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种；
所述预混液包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs。
4.根据权利要求3所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，所述自建内参基因ABL1方法和p190融合基因方法的反应程序包括：
（1）预变性：94～98℃，8～12min；
（2）循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次；
（3）延伸：94～98℃，8～12min；
扩增完成后根据伯乐数字PCR的定量结果计算待测物的检测浓度。
5.根据权利要求1所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，步骤S2中，所述p190质粒的制备还包括环形质粒的线性化以及溯源定值，制备方法包括：
S2.1：配制酶切反应体系对p190质粒进行单酶切；
S2.2：酶切完成后，进行电泳，切下目的条带进行胶回收并使用保护稀释液进行洗脱；
S2.3：使用自建内参基因ABL1方法对线性化p190质粒进行检测，根据S1中建立的线性关系曲线将p190质粒的定值结果溯源至参考质粒。
6.根据权利要求5所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，所述酶切反应体系包括pac I限制性内切酶、缓冲液；所述保护稀释液包括Tris-EDTA缓冲液，其pH为8.0。
7.根据权利要求1所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，步骤S3中，根据S2中的定值结果，使用保护稀释液将p190质粒稀释一系列浓度梯度，所述梯度稀释后，p190质粒的终浓度依次为（1-5）ⅹ106拷贝/uL、（1-5）ⅹ105拷贝/uL、（1-5）ⅹ104拷贝/uL、（1-5）ⅹ103拷贝/uL、（1-5）ⅹ102拷贝/uL、（1-5）ⅹ101拷贝/uL。
8.根据权利要求7所述的基于内参基因的BCR-ABL1 p190融合基因检测溯源方法，其特征在于，步骤S3中，使用内参基因ABL1方法和p190融合基因方法对梯度稀释后的p190质粒进行检测，通过建立内参基因ABL1和p190融合基因检测结果的线性关系曲线，获取自建p190融合基因检测方法的转换因子CF。
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