CN107674914A - 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量 - Google Patents

一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量 Download PDF

Info

Publication number
CN107674914A
CN107674914A CN201610624292.5A CN201610624292A CN107674914A CN 107674914 A CN107674914 A CN 107674914A CN 201610624292 A CN201610624292 A CN 201610624292A CN 107674914 A CN107674914 A CN 107674914A
Authority
CN
China
Prior art keywords
abl1
bcr
pcr
myelogenous leukemia
chronic myelogenous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610624292.5A
Other languages
English (en)
Inventor
熊术道
胡林辉
丁洋洋
李曼曼
蒲莲芳
翟志敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201610624292.5A priority Critical patent/CN107674914A/zh
Publication of CN107674914A publication Critical patent/CN107674914A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物工程领域的检测方法，具体利用实时荧光定量RT‑PCR技术对慢性髓系白血病中的目的基因BCR‑ABL1mRNA和内参基因ABL1mRNA拷贝数进行快速、准确、定量检测。本发明包括如下步骤：BCR‑ABL1特异性的引物和探针的设计；标准品的设计与制备；样本RNA的提取；实时定量PCR检测方法的建立；利用该方法可以简化传统的检测方法，一步单管法快实时荧光定量RT‑PCR速检测慢性髓系白血病骨髓或外周血标本中的目的基因BCR‑ABL1mRNA和内参基因ABL1mRNA拷贝数，从而用校正比值(NQ)表示，即NQ＝BCR‑ABL1拷贝数mRNA/ABL1mRNA拷贝数×100％，进而对慢性髓系白血病临床诊断、疗效检测及预后判定具有重要的指导作用。

Description

一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的 表达量
技术领域
本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于单一体系同时定量检测临床标本中目的基因BCR-ABL1 mRNA和内参基因ABL1 mRNA拷贝数的荧光定量RT-PCR检测方法。
背景技术
慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia, CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。受累的细胞中可发现Ph染色体或BCA-ABL1融合基因。90%以上的CML患者血细胞中出现Ph染色体，核型为t(9；22)(q34；q11），即9号染色体长臂上C-ABL原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区BCR，形成BCR-ABL1融合基因。人ABL1基因位于9号染色体长臂，BCR基因位于22号染色体长臂，ABL1基因断裂位于第1或第2外显子；BCR基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr, M-bcr）、次要（minor bcr, m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。因断裂点不一，BCA-ABL1融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。CML的BCR基因断裂点常位于M-BCR，产生的转录本主要有e13a2、e13a3、e14a2、e14a3，编码蛋白分子量为210kb。P210具有增强酪氨酸激酶的活性，通过影响细胞内信号传导途径，从而促进细胞增殖、粘附以及抑制细胞凋亡。其临床和实验室检查主要表现为脾大，外周血象白细胞升高，骨髓检查粒细胞极度增生为主。目前对BCR-ABL1基因的检测方法有Southern Blot、RT-PCR、传统实时定量PCR。 Southern Blot、RT-PCR检测方法为定性的方法，且灵敏度低、漏诊率高，只能为临床的大体诊断提供一种方法，无法对疗效和预后做到定量检测实时监控。传统的实时定量PCR的方法，操作过程较为繁琐，对样本的要求较高，高RNA含量的样本尚可，低RNA含量的样本就无法做出灵敏检测；同时由于引物的限制，特殊类型的突变类型也无法检测；此外，现有的荧光定量RT-CR要么为一步法分2管检测（分别检查BCR-ABL1 基因和内参ABL1基因），要么先进行RT反应，再进行单管或2管PCR检测，检测结果受不同反应体系和步骤繁多等因素干扰，造成系统误差，难能及时为临床诊断以及实时监控提供精确、可信、有效的表达水平的数据。现在我们发明的一步单管法快速实时定量PCR的方法，较传统的实时定量PCR方法不仅敏感性高，而且可以减少实验误差，快速同时检测出两种基因的表达。此外，本发明检测方法不仅省时、省力、节约成本、减轻病人负担，同时对一般突变和特殊突变类型的BCR-ABL1融合基因均有良好的灵敏性。这对于临床的诊断、治疗以及预后具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种快速，准确的实时定量PCR方法，一步单管法同时检测CML白血病细胞中目的基因BCR-ABL1 mRNA和内参基因ABL1mRNA拷贝数。该方法的检测灵敏度可达1000数量级，较传统的RT-PCR方法具有更高的灵敏度；
单管同时检测靶基因和内参基因，减少不同PCR反应管间的实验误差，也符合和反应机体基因的真实表达水平。本发明操作简便、省时、节约成本。此外，由于引物及探针设计合成的原因，本发明不仅可以检测到一般的突变类型，而且可以检测出特殊的突变类型，同时可进行大批量的样本分析，从而为CML白血病细胞中目的基因BCR-ABL1 mRNA和内参基因ABL1mRNA拷贝数的检测和监控提供了更宽泛、精确、可信和有效方法。
本发明通过对BCR-ABL1融合基因的全序列的分析，选取e13a2、e13a3、e14a2、e14a3片段，设计并合成两对PCR引物和相应两条MGB探针，分别检测目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1。BCR-ABL1引物和MGB 1号探针分别位于BCR-ABL1序列的上下游区域；ABL1引物和MGB 2号探针分别位于ABL1序列的上下游区域。
检测BCR-ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：BF: TCCGCTGACCATCAATAAGGA.
下游引物：BR: CACTCAGACCCTGAGGCTCAA.
MGB 1号探针BP-MGB:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGT-MGBNFQ-3，.
检测ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：AF: TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT.
下游引物：AR: GATGTAGTTGCTTGGGACCCA.
MGB 2号探针AP-MGB: 5，-HEX-CATTTTTGGTTTGGGCTTC-MGBNFQ-3，.
本发明包括以下步骤：
1、通过生物信息学分析，选择BCR-ABL1融合基因转录本（e13a2、e13a3、e14a2、e14a3）为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：
e13a2:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTG
e13a3:TCCGCTGACCATCAACAAGGAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATC
e14a2:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTG
e14a3:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATC
2.设计和合成两对PCR引物和两条MGB探针，1号探针5'端的荧光报告基因是FAM，2号探针5'端的荧光报告基因是HEX。检测目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：BF: TCCGCtGACCATCAACAAGGA .
下游引物：BR: CACtCAGACCCtGAGGCtCAA.
MGB 1号探针BP-MGB:5，-FAM-CCCtTCAGCGGCCAGT-MGBNFQ-3，.
检测ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：AF: TGGAGATAACACtCtAAGCATAACtAAAGGT.
下游引物：AR: GATGTAGTTGCtTGGGACCCA.
MGB 2号探针AP-MGB: 5，-HEX-CATTTTTGGTTTGGGCtTC-MGBNFQ-3，.
3.构建和制备质粒PUC57-e14a2定量标准品
根据BCR-ABL1序列，设计和合成含上述BCR-ABL1目的基因及ABL1内参基因的基因片段e14a2，将基因片段克隆到质粒载体PUC57，构建标准品质粒PUC57-e14a2（图1），经酶切（图2）及测序鉴定（图3）(上海生工公司)，成功构建质粒标准品。同时，根据此构建成功的重组质粒的浓度和克隆序列长度，计算作为检测慢性髓系白血病细胞中BCR-ABL1和ABL1基因的拷贝数，并以此作为本申请专利的定量标准品。
4.慢性髓系白血病患者骨髓或外周血样本有核细胞细胞总RNA的提取。
5.特异性定量检测方法的建立
经过大量的对比实验和验证实验，并经过临床样品的检测应用进行评估，对建立的方法进行灵敏度、特异性以及对临床标本的有效性进行综合评价。
（1）灵敏度：用灭菌双蒸水分别将质粒PUC57-e14a2定量标准品稀释至5×107、5×106、5×105、5×104、5×103copies/ul，采用优化后的体系进行检测，验证所建立方法的灵敏度。本检测方法在107-103数量级范围内具有良好的线性关系，相关系数0.997，其检测范围可达5个数量级，其灵敏度可到1000个基因拷贝数以下。
（2）稳定性：我们从批间重复和批内重复两个方面进行评价。批内重复性选取同一份标本,设8个平行反应管同时进行RT-PCR反应，检验其Ct值的变异系数。批间重复性选取2个不同浓度的重组质粒标准品，一周内重复检测4次，检测其Ct值的变异系数。
（3）特异性：本研究选择了7个标本进行检测，使用Trizol处理CML及非CML阴性对照常规血液标本、提取总RNA，3份样本经传统实时定量PCR方法（某公司BCR-ABL1检测试剂盒）检测呈阳性，其余4份标本均为阴性结果。同时应用本发明之实时定量PCR方法进行定量检测。定量结果显示4份阳性标本，其余3份标本均为阴性结果。对于本发明之单管一步法实时定量PCR检测是阳性，而传统实时定量PCR方法（对照试剂）检测呈阴性的标本进行了进一步相关实验研究及分析，包括染色体、FISH以、定性RT-PCR及测序鉴定，相关实验结果证实该样本确实是阳性（突变类型为e14a3），从而得出本发明一步单管法实时定量RT-PCR不仅对于一般BCR-ABL1基因突变类型（e13a2、e14a2）有良好的特异性，对特殊突变类型（e13a3、e14a3）也具有良好的特异性。
本发明使用MGB探针对CML细胞中目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1拷贝数进行特异性定量检测，具有以下优点和效果：
1.与现有传统的定量方法相比，此实时荧光定量RT-PCR具有高灵敏度、高特异性等特点。靶序列由引物和探针双重控制，具有特异性好、假阳性及假阴性率低，不仅可以检测出BCR-ABL1一般突变类型（e13a2，e14a2），而且可以检测出特殊突变类型(e13a3，e14a3)等特点。
2.发明建立的基于MGB探针的荧光定量PCR方法具有灵敏度高，检测范围广的特点。在107-103拷贝范围内有极好的线性关系(相关系数R=0.997，检测范围可以达到5个数量级，达到国际先进水平。其检测灵敏度可到1000个拷贝以下，具有极高的灵敏度，可用于检测低RNA含量的实验标本。
3.操作简单，自动化程度高，该方法与传统的一管只能检测一个基因的方法相比，可同时对目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1于一个PCR管中使用不同的引物和探针同时进行多重基因实时定量荧光PCR并检测，大大的节约时间和成本，也降低了实验误差，相对提高实验检测的准确度。
附图说明
图1为质粒PUC57-e14a2结构示意图
图2为质粒PUC57-e14a2酶切鉴定及电泳图谱
图3为e14a2序列鉴定图
图4为一步单管法荧光定量RT-PCR敏感度检测的荧光信号图
图5为一步单管法荧光定量RT-PCR检测目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1绝对定量的标准曲线
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。
实例1：
BCR-ABL1定量PCR引物和探针设计及合成，包含两对特异性引物和两条特异性MGB荧光探针，在pubmed检索出BCR-ABL1融合基因的全序列，选取e13a2、e13a3、e14a2、e14a3片段，设计并合成两对PCR引物和两条MGB探针，以分别检测BCR-ABL1和ABL1，1号探针5'端的荧光报告基因是FAM，2号探针5'端的荧光报告基因是HEX，BCR-ABL1引物和MGB 1号探针分别位于BCR-ABL1序列的上下游区域；ABL1引物和MGB 2号探针分别位于ABL1序列的上下游区域
上游引物：BF: TCCGCTGACCATCAACAAGGA .
下游引物：BR: CACTCAGACCCTGAGGCTCAA.
MGB 1号探针BP-MGB:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGT-MGBNFQ-3，.
检测ABL引物和探针序列分别为：
上游引物：AF: TGGAGATAACACtCtAAGCATAACtAAAGGT.
下游引物：AR: GATGTAGTTGCtTGGGACCCA.
MGB 2号探针AP-MGB: 5，-HEX-CATTTTTGGTTTGGGCtTC-MGBNFQ-3，.
实例2：
定量标准品的构建与制备
实验步骤
1.定量标准品的构建
根据BCR-ABL1序列，设计和合成含上述BCR-ABL1目的基因及ABL1内参基因的基因片段e14a2，将基因片段克隆到质粒载体PUC57，构建标准品质粒PUC57-e14a2，经酶切及测序鉴定(上海生工公司)，成功构建质粒标准品。同时，根据此构建成功的重组质粒的浓度和克隆序列长度，计算作为检测慢性髓系白血病细胞中BCR-ABL1和ABL1基因的拷贝数，并以此作为本申请专利的定量标准品。
实例3：
CML病人骨髓或外周血样本细胞总RNA的提取
（1）取CML病人样本骨髓或外周血标本0.5ml于去酶EP管中，12,000rpm离心5分钟；
（2）去除血浆，加Trizol 1ml充分振荡混匀至呈水滴样，室温放置5-10分钟；
（3）加氯仿0.2ml，剧烈振荡30秒，室温放置3分钟，12,000rpm ，4℃离心10分钟；
（4）取上层水相移至干净的去酶EP管中，加入1/2倍体积的无水乙醇，混匀；移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置2分钟，12,000rpm离心3分钟；
（5）去除废液，将吸附柱放回收集管中，加RPE Solution 0.5ml，静置2分钟，10,000rpm离心30秒，倒掉收集管中废液；
（6）重复以上步骤一次；
（7）将吸附柱放回收集管中，10,000rpm离心2分钟；
（8）将吸附柱放入干净的去酶1.5ml EP管中，在吸附膜中央加入30ul的DEPC处理的去离子双蒸水，静置5分钟，12,000rpm离心2分钟；得到细胞总RNA；
实例4：
实时定量RT-PCR方法的优化和建立
实验步骤
1.绝对定量标准曲线的建立
(1).定量PCR反应体系
反应试剂 体积（ul）
Multiplex RT-PCR Buffer 10
Multiplex Enzyme Mix 2
Probe BP（20UM） 0.1
Probe AP（20UM） 0.2
primers(BF+BR)（10UM） 0.6
primers (AF+AR)（10UM） 0.3
RNA模板 1
Nuclease-free Water 补水至20ul
（2）绝对定量的扩增标准曲线建立
用灭菌双蒸水10倍梯度稀释质粒PUC57-e14a2定量标准品，稀释后质粒浓度分别为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103copies/ul。反应条件为逆转录：48oC 10分钟，预变性95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 45s共60个循环。检测结束后利用荧光定量PCR仪自带软件，根据噪声情况自动设定和调整基线和阂值，绘制标准曲线（图5）
本检测方法在107-103有良好的线性关系，相关系数R=0.997，其检测范围可达5个数量级，其灵敏度可到1000个拷贝数以下(图4-5)
Y1(Ct)=-3.361X1+41.781( X1:代表样品稀释度，Y1代表该样本BCR-ABL1 Ct值)
检测反应管中基因拷贝数的计算公式：Conc=10（Y-41.781）/-3.361
Y2(Ct)=-3.322X2+42.007( X2:代表样品稀释度，Y2代表该样本ABL1 Ct值)
检测反应管中基因拷贝数的计算公式：conc=10(Y-42.007)/-3.322
表达量校正比值（NQ）= BCR-ABL1 mRNA拷贝数/ABL1 mRNA拷贝数×100%
2．稳定性分析
从批间重复性和批内重复性两个方面进行评价建立的荧光定量RT-PCR反应体系的稳定性。
（1）批内重复性检验
选取同一份标本，按照实例2所述的方法提取总RNA。采用经优化的反应体系和反应条件设置8个平行反应管同时进行反应，利用统计学方法检验其Ct值的变异系数。批内重复性检测的BCR-ABL1Ct值变异系数(CV)为：0.22% ；ABL1Ct值变异系数(CV)为：0.24%。
（2）批间重复性检验
选取2个不同浓度的质粒标准品，采用实施4例所述的反应体系和条件，一周内重复检测4次，利用统计学方法检验其Ct值的变异系数。批间重复性BCR-ABL1 Ct值的变异系数分别为 1.46% 和1.04%；ABL1Ct值的变异系数分别为1.24%和1.04%。表明本发明建立的检测方法具有良好的稳定性和重复性。
3. 特异性分析
为检验建立的一步单管法实时定量RT-PCR方法的适用性，本研究选择了7个标本进行检测，按照实施例3的方法提取细胞总RNA，3份样本经传统实时定量PCR方法（某公司BCR-ABL检测试剂盒）检测呈阳性，其余4份标本均为阴性结果。同时应用本发明之实时定量PCR方法进行定量检测。定量结果显示4份阳性标本，其余3份标本均为阴性结果。对于本发明之单管一步法实时定量PCR检测是阳性，而传统实时定量PCR方法（对照试剂）检测呈阴性的标本进行了进一步相关实验研究及分析，包括染色体、FISH以、定性RT-PCR及测序鉴定，相关实验结果证实该样本确实是阳性（突变类型为e14a3），从而得出本发明一步单管法实时定量RT-PCR不仅对于一般BCR-ABL1基因突变类型（e13a2、e14a2）有良好的特异性，对特殊突变类型（e13a3、e14a3）也具有良好的特异性。

Claims (9)

1.一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征步骤在于:
(1).根据BCR-ABL1融合基因序列，设计和合成荧光定量PCR引物和探针，包含两对特异性引物和两条特异性荧光探针，在pubmed检索出BCR-ABL1融合基因的全序列，选取e13a2、e13a3、e14a2、e14a3转录本碱基序列，设计和合成两对PCR引物和两条MGB探针，以分别检测BCR-ABL1目的基因和参照基因ABL1，1号探针5'端的荧光报告基因是FAM，2号探针5'端的荧光报告基因是HEX，BCR-ABL1引物和MGB 1号探针分别位于BCR-ABL1序列的上下游区域；ABL1引物和MGB 2号探针分别位于ABL1序列的上下游区域，目的扩增片段为e13a2、e13a3、e14a2、e14a3，扩增序列为：
e13a2:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTG
e13a3:TCCGCTGACCATCAACAAGGAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATC
e14a2:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTG
e14a3:TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATC
检测BCR-ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：BF: TCCGCTGACCATCAATAAGGA
下游引物：BR: CACTCAGACCCTGAGGCTCAA.
MGB 1号探针BP-MGB:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGT-MGBNFQ-3，.
检测ABL1引物和探针序列分别为：
上游引物：AF: TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAA AGGT.
下游引物：AR: GATGTAGTTGCTTGGGACCCA.
MGB 2号探针AP-MGB: 5，-HEX-CATTTTTGGTTTGGGCTTC-MGBNFQ-3，.
（2）定量标准品的构建
根据BCR-ABL1序列，设计和合成含上述BCR-ABL1目的基因及ABL1内参基因的基因片段e14a2，将基因片段克隆到质粒载体PUC57，形成标准品PUC57-e14a2，经酶切及测序鉴定(上海生工公司)正确无误，表明定量质粒标准品构建获得成功，同时，根据此构建成功的重组质粒的浓度和克隆序列长度，计算作为检测慢性髓系白血病细胞中BCR-ABL1和ABL1基因的拷贝数，并以此作为本申请专利的的定量标准品；
（3）对患有慢性髓系白血病患者骨髓或外周血标本提取细胞总RNA；
（4）对提取的样本RNA于一个PCR管中进行实时荧光定量RT-PCR，同时检测出目的基因BCR-ABL1 mRNA和内参基因ABL1 mRNA拷贝数，计算出校对比值。
2.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是所述的标准品质粒载体，指的是长度为3048bp的PUC57-e14a2载体。
3.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是所述的所有探针均为MGB探针，1号探针5'端的荧光报告基因是FAM，2号探针5'端的荧光报告基因是HEX。
4.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是所述的3'端标记的荧光淬灭基团为MGBNFQ。
5.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1于一个PCR管中使用不同的引物和探针同时进行实时定量荧光RT-PCR扩增，而不是分两管单独扩增。
6.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是目的基因BCR-ABL1和内参基因ABL1于一个试管中使用不同的引物和探针同时进行实时定量荧光RT-PCR扩增，而不是先进行RT，而后行PCR两步法单管扩增。
7.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是还包括根据如下公式计算目的基因校对比值：
NQ= BCR-ABL1 mRNA拷贝数/ABL1 mRNA拷贝数×100%。
8.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是相对于其他方法，该法可以检测出拷贝数更低的RNA，同时减少实验误差，使得结果更加可信。
9.根据权利要求1所述的一步单管法定量RT-PCR检测慢性髓系白血病BCR-ABL1基因的表达量，其特征是该法不仅可以检测出BCR-ABL1一般突变类型（e13a2、e14a2），而且可以检测出特殊突变类型(e13a3、e14a3)。
CN201610624292.5A 2016-08-02 2016-08-02 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量 Pending CN107674914A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610624292.5A CN107674914A (zh) 2016-08-02 2016-08-02 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610624292.5A CN107674914A (zh) 2016-08-02 2016-08-02 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107674914A true CN107674914A (zh) 2018-02-09

Family

ID=61133461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610624292.5A Pending CN107674914A (zh) 2016-08-02 2016-08-02 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107674914A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531605A (zh) * 2018-06-11 2018-09-14 北京大学人民医院 定量检测rasd1基因表达的引物和探针及其应用
CN112501301A (zh) * 2020-12-08 2021-03-16 凯杰生物工程（深圳）有限公司 一种用于定量检测bcr-abl融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
CN116837142A (zh) * 2023-07-25 2023-10-03 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种断裂点簇集区艾贝乐逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004078020A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Universite De La Mediterranee Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of mrd in leukemia
CN101701253A (zh) * 2009-11-26 2010-05-05 南方医科大学 一种用于检测基因表达的双重荧光定量pcr试剂盒
CN102094074A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 定量检测白血病融合基因tel-aml1荧光rt-pcr试剂盒
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN103571945A (zh) * 2013-09-27 2014-02-12 沈阳艾迪康医学检验所有限公司 筛查和鉴定bcr-abl非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒
EP2914250B1 (en) * 2012-11-05 2018-04-04 Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives Combination of an anti-cancer agent such as a tyrosinekinase inhibitor and a stat5 antagonist, preferably a thiazolidinedione, for eliminating hematologic cancer stem cells in vivo and for preventing hematologic cancer relapse

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004078020A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Universite De La Mediterranee Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of mrd in leukemia
CN101701253A (zh) * 2009-11-26 2010-05-05 南方医科大学 一种用于检测基因表达的双重荧光定量pcr试剂盒
CN102094074A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 定量检测白血病融合基因tel-aml1荧光rt-pcr试剂盒
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
EP2914250B1 (en) * 2012-11-05 2018-04-04 Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives Combination of an anti-cancer agent such as a tyrosinekinase inhibitor and a stat5 antagonist, preferably a thiazolidinedione, for eliminating hematologic cancer stem cells in vivo and for preventing hematologic cancer relapse
CN103571945A (zh) * 2013-09-27 2014-02-12 沈阳艾迪康医学检验所有限公司 筛查和鉴定bcr-abl非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARETH GERRARD 等: "Fast-mode duplex qPCR for BCR-ABL1 molecular monitoring: innovation, automation, and harmonization", 《AM J HEMATOL 》 *
程凌利 等: "白血病融合基因BCR-ABL和PML-RARα多重实时定量检测方法的建立", 《临床军医杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531605A (zh) * 2018-06-11 2018-09-14 北京大学人民医院 定量检测rasd1基因表达的引物和探针及其应用
CN112501301A (zh) * 2020-12-08 2021-03-16 凯杰生物工程（深圳）有限公司 一种用于定量检测bcr-abl融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
CN112501301B (zh) * 2020-12-08 2023-07-18 凯杰生物工程（深圳）有限公司 一种用于定量检测bcr-abl融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
CN116837142A (zh) * 2023-07-25 2023-10-03 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种断裂点簇集区艾贝乐逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用
CN116837142B (zh) * 2023-07-25 2024-05-17 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种断裂点簇集区艾贝尔逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105483218B (zh) 检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用
CN104450901B (zh) 快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒
CN109811055A (zh) 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
CN106399462A (zh) 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒
CN102146487B (zh) 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针
CN102304581A (zh) 用于检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法
CN108559776A (zh) 一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用
CN107586776A (zh) 适用于h7n9禽流感病毒实时荧光定量pcr检测的质粒标准物质
CN107674914A (zh) 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量
WO2022068079A1 (zh) 一种基于微滴式数字pcr技术的乙型肝炎病毒t216c突变检测方法
CN103614477A (zh) 一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量pcr试剂盒
CN102634572B (zh) 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒
CN104846087A (zh) 一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法
CN107164508A (zh) 用于检测肝癌的基因标志物及其用途
WO2018120484A1 (zh) 用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒
CN110408612A (zh) 一种低浓度dna标准物质的保护剂、保存方法及应用
CN110241264A (zh) 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒
CN109735612A (zh) 川崎病冠状动脉瘤并发症的生物分子标志物及其试剂盒
CN111793675B (zh) 一种用于egfr基因18外显子g719x突变检测的核酸序列、试剂盒及其应用
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
CN106755392B (zh) 藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法
CN104498616A (zh) 一种人egfr基因突变荧光pcr检测试剂盒
TWI727486B (zh) 檢測乳癌的發生、復發或轉移風險的方法及檢驗套組
CN107190073A (zh) hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用
CN102002524B (zh) 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180209