CN107586776A - 适用于h7n9禽流感病毒实时荧光定量pcr检测的质粒标准物质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，所述质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。该质粒DNA标准物质具有均匀性强，稳定性高的优点，同时解决了H7N9禽流感病毒实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测提供质量控制。

Description

适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒标准 物质

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质及其构建方法、定量方法和应用。

背景技术

H7N9禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)首先于2013年3月在我国上海、安徽发现3例，经国家卫生和计划生育委员会确认通报为全球首次发现的感染人的新型禽流感病毒株。随后在我国上海、安徽、江苏、浙江、北京、河南、山东、江西、福建和台湾等地区均出现散发的确诊病例。H7N9病毒感染者常出现严重的肺炎和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，甚至多器官功能障碍，病死率高。目前确诊的人数已经达到200多例，其中死亡超过60人。以现有病例数和死亡数字计算，H7N9的病死率达到20％至30％。人感染H7N9禽流感病例的出现受到了世界许多国家以及世界卫生组织(WHO)的关注。因此，H7N9禽流感病毒检测方法及抗病毒药物的研究是当前各国科学家和医药工作者研究的一个关注的重点。

当前针对H7N9禽流感等动物传染病的诊断方法主要有病原学方法、血清学方法和分子生物学方法。病原学诊断方法准确但诊断时间较长，达不到快速检测的需求，同时要求被检测样品有较好的新鲜度；血清学诊断方法的特异性和准确度存在一定的局限性；实时荧光反转录PCR方法(real-time reverse-transcription PCR,real-time RT-PCR)是分子生物学检测方法之一，直接检测病原体RNA，具有快速、特异性强且不受样品新鲜度限制的优点，且较常规PCR灵敏度更高、少污染、操作更便捷、反应更快速，可以为疾病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间，因此已经成为H7N9禽流感病毒检测的重要方法。目前已有较多文献报道使用实时荧光RT-PCR方法检测H7N9病毒，也有相应的试剂盒研制成功并投放市场。

然而在实际的实时荧光RT-PCR方法检测过程中，RNA抽提失败、反转录效率低、PCR体系中存在抑制剂等因素容易造成假阴性结果，因此有必要研究具有明确量值溯源性的标准物质，形成完善的参考系统，开展试验室间质评，提高检测水平。目前针对H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法，仍然没有有证标准物质(Certified Reference Material,CRM)，各检测单位在检测时常采用病毒阳性样本、提取的病毒RNA、非感染性体外转录RNA、自行研制的质粒DNA分子或试剂盒自带的阳性标准品作为质控品，稳定性差、存在安全隐患、阳性样品难以获取且缺乏统一的定值方法，造成各实验室之间的检测结果差异大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

目前针对H7N9禽流感病毒，WHO采用由英国国家生物标准与检定所(NationalInstitute for Biological Standards and Control，NIBSC)研制的一种重组禽流感毒株标准品。这类标准品接近于禽流感病毒，但是存在溯源性限制，价格昂贵，数量较少，并且由于其是病毒，稳定性差，存在一定风险，对运输条件要求较高，较难运输。因此这类标准品不能完全满足各国禽流感病毒临床检验实验室质量控制的需求，也不能满足H7N9检测试剂方法标准化、性能评价的需求，急需研制新型H7N9禽流感病毒检测标准物质。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。质粒DNA标准物质的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限量稳定的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。但是目前质粒DNA标准物质尤其是有证标准物质还是很少，这也是全世界生物计量领域研究的热点，如美国的国家标准技术研究院(NIST)、英国政府化学家实验室(LGC)和欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)等研究机构都投入了很大科研力量进行相关标准物质的研发，成果主要集中于转基因检测领域质粒DNA分子标准物质，但是针对病毒检测用的质粒DNA标准物质还是空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的重组禽流感毒株标准品价格昂贵、数量少、不能满足禽流感病毒临床检验实验室质量控制的需求，也不能满足H7N9检测试剂方法标准化、性能评价的需求的问题，提供了一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒标准物质及其构建方法、定量方法和应用。

本发明的技术方案之一为：一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，该质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明中，所述的检测序列由H7N9禽流感病毒的H7基因、N9基因以及M基因和人的RnaseP基因的核苷酸序列组成，其中，H7基因和N9基因作为H7N9禽流感病毒的靶基因，M基因和RnaseP基因作为内参基因。

本发明中，较佳地，所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。其中，所述检测序列为所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列中的第2260位至第7238位。

本发明的技术方案之二为：一种利用上述质粒DNA标准物质的定量方法，其包括以下步骤：

①提取上述的质粒DNA标准物质；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

本发明中，较佳地，步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气16L/min；辅助气1.8L/min；载气1.05L/min；透镜电压2200v；点火功率1000w；工作功率1300w；雾化室、雾化器为PFA材质；进样锥、取样锥为铂金材质；矩管为蓝宝石材质；和/或，Z点为3。

本发明中，定量所述质粒标准分子的方法为本领域常规的方法，较佳地为紫外分光光度法或高分辨电感耦合等离子体质谱法(HR-ICP-MS)。

其中，所述紫外分光光度法为本领域常规的紫外分光光度法，较佳地包括以下步骤：

①提取上述的质粒DNA标准物质；

②将紫外分光光度计校正为零点；

③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区域)，记录仪器读数。若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为ng/μL。

其中，所述HR-ICP-MS为本领域常规的HR-ICP-MS，较佳地包括以下步骤：

①提取上述的质粒DNA标准物质；

②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；

④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子的磷含量；

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出步骤①中质粒标准分子的浓度。

本发明的技术方案之三为：一种H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR的检测方法，其所采用的标准物质是上述的质粒DNA标准物质。

本发明中，较佳地，所述的检测方法为将上述的质粒DNA标准物质作为阳性标准物质，建立标准曲线后，进行H7N9禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测。其中，上述的质粒DNA标准物质能够替换H7N9禽流感病毒cDNA，发挥更为安全稳定、更为可靠准确的阳性对照的作用。所述H7N9禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测的体系和条件为本领域常规的体系和条件，能够扩增出H7和/或N9基因即可。较佳地，使用上海之江生物科技股份有限公司生产的人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(货号Z-RR-0309-02)进行操作。

本发明的技术方案之四为：一种上述的质粒DNA标准物质的制备方法，包括以下步骤：

①人工合成检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

②将步骤①所得的检测序列克隆至载体上，得到H7N9禽流感病毒的质粒DNA标准物质。

本发明中，步骤①所述的人工合成的方法为本领域常规的人工合成的方法。较佳地为全基因合成或者PCR引物扩增的方法。

本发明中，所述的载体是本领域常规的载体，较佳地是克隆载体，更佳地是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体。所述克隆载体较佳地为pMD19-T、pUC19、pUC18、pUC118、pUC119、pBlueScript II SK或pGEM系列载体，更佳地为pMD19-T。

较佳地，所述的制备方法包括以下的步骤：

①在GISAID中查询H7N9禽流感病毒的H7基因、N9基因、M基因的序列和人的RnaseP基因的序列；

②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位点加至所选择序列的5’端和3’端。

③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒DNA标准物质。

④测序验证质粒DNA标准物质的序列。

⑤质粒DNA标准物质的实时荧光PCR检测方法验证。

所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒DNA标准物质在进行实时荧光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒DNA标准物质作为实时荧光PCR方法检测H7N9禽流感病毒的标准物质的能力。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明利用全基因人工合成的方法构建了含有H7N9禽流感病毒的H7基因、N9基因、M基因和RnaseP基因的检测序列的适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，并利用紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体发射质谱(HR-ICP-MS)对其进行定量，保证了其良好的溯源性。本发明的质粒DNA标准物质具有均匀性强，稳定性高的优点，同时解决了H7N9禽流感病毒实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，克服了现有检测方法采用H7N9禽流感病毒阳性血清等作为标准物质所产生的安全性低、威胁检测人员健康等不足，保证H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测提供质量控制。

附图说明

图1是质粒DNA标准物质pXL12的图谱。

图2是质粒DNA标准物质pXL12电泳分析结果。其中，M为DNA marker DL5000；1为质粒DNA标准物质pXL12；2为质粒DNA标准物质pXL12经SalI酶切后的产物。

图3是P元素HR-ICP-MS图谱。

图4是HR-ICP-MS检测方法建立的标准曲线。其中：Y为质谱信号丰度，X为磷元素的质量体积浓度。标准工作溶液的质量体积浓度分别1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L和5μg/L。

图5是实际HR-ICP-MS检测时的标准曲线。其中：Y为质谱信号丰度，X为磷元素的质量体积浓度。标准工作溶液的质量体积浓度分别1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L和5μg/L。

图6A～图6D是利用WHO推荐PCR方法对质粒DNA标准物质pXL12的实时荧光PCR标准曲线。

图7-1和图7-2是使用试剂盒扩增质粒DNA标准物质pXL12建立的实时荧光PCR标准曲线。

图8为与H7N9禽流感病毒cDNA进行扩增比较进行实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1质粒DNA标准物质的构建

质粒DNA标准物质的构建过程如下：

1、在数据库GISAID EpiFlu(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend#4c6137)中查询已经报道的H7N9禽流感病毒基因组序列，并通过序列比对、分析，选取H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测的靶基因(H7基因、N9基因)以及内参基因(M基因、RnaseP基因)，保证选取基因具有明确的代表性和通用性；

2、选取适当的序列[H7基因(1683bp)、N9基因(1398bp)]以及内参基因[M基因(982bp)、RnaseP基因(916bp)]，通过全基因人工合成的方法(由宝生物工程有限公司负责进行)将这些序列依次克隆至质粒载体pMD19-T(购自宝生物工程有限公司)上，完成质粒DNA标准物质的构建，命名为pXL12(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示)，构建所得质粒DNA标准物质pXL12的质粒图谱如图1所示。

3、质粒DNA标准物质的大量提取

大量培养含有包含质粒DNA标准物质pXL12的重组大肠杆菌，利用质粒大量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒DNA标准物质。经过紫外分光光度计以及电泳进行纯度分析，将质粒标准分子置于-20℃保存。抽提质粒的方法包括以下步骤：

a、将100～200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上清；

b、加入12mL SolutionⅠ(含有RNase A)，振荡充分混匀；

c、加入12mL SolutionⅡ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体充分裂解；

d、加入16mL Solution Ⅲ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的白色沉淀；

e、≥12000×g，4℃离心10分钟；

f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL收集管中)，5000×g室温离心5分钟；

g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室温离心5分钟；

h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释)清洗吸附柱；

i、重复上述清洗步骤；

j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；

k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3mL TE缓冲液，室温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的质粒DNA标准物质溶液，保存在-20℃。

4、质粒DNA标准物质pXL12的序列验证

将提取的质粒DNA标准物质pXL12送至九家测序公司进行序列验证，九家测序公司分别为上海百力格生物技术有限公司、铂尚生物技术(上海)有限公司、北京六合华大基因科技股份有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、上海立菲生物技术有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物医药科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

序列考察公式：序列正确率＝正确碱基数目/碱基总数。

经九家测序技术公司联合验证，质粒DNA标准物质pXL12的插入序列与设计克隆的H7基因、N9基因、M基因、RnaseP基因序列完全相符，准确率为100％。

由此，获得了高纯度的质粒DNA标准物质pXL12，经测序验证，该质粒DNA标准物质的插入片段序列与设计完全相符。

实施例2质粒DNA标准物质pXL12的纯度验证

1、琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA标准物质pXL12的纯度

将实施例1获得的质粒DNA标准物质pXL12用限制性内切酶SalI消化成线性片段后，进行琼脂糖凝胶电泳分析(参见《分子克隆实验指南》第4版第5章，萨姆布鲁克，2013，科学出版社)。取10μL酶切液上样，用1％(w/w)琼脂糖胶电泳，电压80～100V，30min，电泳后凝胶成像分析DNA条带。结果参见图2。图2说明，限制性内切酶SalI酶切后的质粒DNA标准物质pXL12的条带清晰，无RNA、蛋白质污染，证明质粒DNA标准物质pXL12纯度优良。

2、紫外分光光度法鉴别质粒DNA标准物质纯度

按照国家标准GB/T 24310-2009规定，以及《分子克隆》有关实验要求，采用紫外分光光度法对质粒的纯度进行考察。

将实施例1获得的质粒DNA标准物质pXL12进行紫外光谱扫描，结果如表1所示。表1中A260/A280均大于1.8，A260/A230均大于2.0，证明质粒DNA标准物质pXL12纯度良好，满足实际使用要求。

表1质粒DNA标准物质pXL12的紫外光谱扫描数据

A260/A280	A260/A230
		1.85	2.06

实施例3质粒DNA标准物质pXL12的均匀性检验

均匀性是表征物质中一种或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通过测量取自不同包装单元(如瓶、包等)或取自同一包装单元不同位置(如一瓶内)的规定大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒DNA标准物质，其量值不会受到分装等因素的影响，一瓶内、各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

(1)、瓶内均匀性实验

1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，任意抽取分装好的一瓶实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12，约100μL。

2、将步骤1抽取的一瓶按取样位置分上层、中层和下层3个子样，每个子样各抽取3个样本，每个1μL，共9个样本。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值。

3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为：抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著性差异，则应满足下式的统计要求。

其中组间差方和计算公式为：

组内差方和计算见公式为：

ν₁＝m-1(组间自由度)

ν₂＝N-m(组内自由度)。

结果分别见表2～3。结果说明，在95％置信水平下，F值均小于F_0.05(2，6)，证明质粒DNA标准物质pXL12的瓶内均匀性良好，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》瓶内均匀性检验合格要求。

表2质粒DNA标准物质pXL12的瓶内均匀性检验数据(单位：ng/μL)

样品	重复1	重复2	重复3	平均值
					1	101.6	102.5	102.1	102.1
2	100.6	101.8	100.7	101.0
					3	101.2	101.5	101.1	101.3

表3质粒DNA标准物质pXL12的瓶内均匀性统计结果

Q1	Q2	F值	F0.05(2，6
				0.249	1.393	0.536	5.14

(2)、瓶间均匀性实验

1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，从各瓶实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12中随机抽取15瓶。

2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值。

其他步骤和(1)、瓶内均匀性实验完全相同。

结果分别见表4～5。结果说明，在95％置信水平下，F值均小于F0.05(14，30)，证明质粒DNA标准物质pXL12的瓶间均匀性良好，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》瓶间均匀性检验合格要求。

表4质粒DNA标准物质pXL12的瓶间均匀性检验数据(单位：ng/μL)

样品	重复1	重复2	重复3	平均值
					1	101.80	101.90	101.40	101.70
2	100.60	101.40	101.70	101.23
					4	100.90	102.50	100.80	101.40
5	100.70	101.30	101.90	101.30
					6	101.30	101.10	101.10	101.17
7	101.40	101.30	101.80	101.50
					8	101.50	101.20	100.80	101.17
9	102.20	102.00	101.30	101.83
					10	101.10	101.20	103.00	101.77
11	101.90	101.60	102.50	102.00
					12	102.60	101.30	102.10	102.00
13	101.40	101.30	102.70	101.80
					14	102.00	102.40	102.50	102.30
15	101.40	102.10	101.70	101.73
					16	101.30	101.80	102.40	101.83

表5质粒DNA标准物质pXL12的瓶间均匀性统计结果

Q1	Q2	F值	F0.05(2，6
				4.89	9.97	1.05	2.04

实施例4质粒DNA标准物质pXL12的稳定性检验

(1)、短期稳定性考察

根据ISO指南35:2006的要求，在指定的运输条件下，运输期间标准物质的稳定性需要经过考察。核酸类产品一般的运输条件为内含冰袋的保温盒；分别考察质粒DNA标准物质pXL12在20℃、4℃下的10天之内的短期稳定性。

实验采用同步稳定性研究，利用紫外分光光度法对质粒标准物质进行短期稳定性进行了跟踪考察，采用线性模型为该标准物质进行短期稳定性评价。数据见表6～表9。结果说明，质粒DNA标准物质pXL12在20℃下保存十天是稳定的；在4℃下保存十天也是稳定的。

具体考察方法如下：

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

1、在实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12制备完成后的第0天、第1天、第3天、第6天和第10天对制备的质粒DNA标准物质pXL12(分别在20℃和4℃下保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行短期稳定性考察。

2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如下：

直线斜率可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；-所有时间点的平均值；-所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

式中：X_i-第i个时间点；Y_i-第i个时间点的观测值；β₁，β₀-回归系数；n-测量系数。

β₁的标准偏差由下式给出：

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β₁|<t_0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

表6质粒DNA标准物质pXL12在20℃保存短期稳定性检测数据(单位：ng/μL)

时间(天)	样品1	样品2	样品3	平均值	SD
						0	101.3	102.1	103.3	102.2	1.0
1	103.2	101.1	102.1	102.1	1.1
						3	102.7	100.6	101.2	101.5	1.1
6	103.3	102.3	101.1	102.2	1.1
						10	101.6	101.8	103.6	102.3	1.1

表7质粒DNA标准物质pXL12在20℃下短期稳定性统计结果

表8质粒DNA标准物质pXL12在4℃保存短期稳定性检测数据(单位：ng/μL)

时间(天)	样品1	样品2	样品3	平均值	SD
						0	103.4	102.1	100.4	102.0	1.5
1	102.2	104.1	100.1	102.1	2.0
						3	100.2	101.4	102.5	101.4	1.2
6	103.2	101.1	102.1	102.1	1.1
						10	102.5	102.8	101.7	102.3	0.6

表9质粒DNA标准物质pXL12在4℃下短期稳定性统计结果

参数	结果
		斜率β1	-0.05
截距β0	51.97
		s(β1)	0.06
t0.95,3·s(β1)	0.19
		结论	稳定

(2)、长期稳定性考察

1、在实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、8个月和10个月对制备的质粒DNA标准物质pXL12(在-20℃下保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。

其余步骤和(1)、短期稳定性考察完全相同。

结果如表10～11所示。结果显示斜率不显著，表明质粒DNA标准物质pXL12在规定时间内无明显的上升或下降趋势，且变化范围均在特性量值及其不确定度的范围内。并且测序结果证明，质粒DNA标准物质pXL12的序列在保存期间没有发生变化，序列正确率仍为100％。因此，质粒DNA标准物质pXL12在-20℃条件下保存，可以判定其在12个月内是稳定的。

表10质粒DNA标准物质pXL12在-20℃保存长期稳定性检测数据(单位：ng/μL)

时间(月)	重复1	重复2	重复3	平均值	SD
						0	102.4	103.5	101.6	102.5	0.95
0.5	103.5	104.5	102.1	103.4	1.21
						1	101.5	102.5	103.4	102.5	0.95
2	102.1	101.7	101.9	101.9	0.20
						4	103.4	102.1	100.4	102.0	1.50
6	102.4	102.1	101.9	102.1	0.25
						8	100.9	101.8	102.8	101.8	0.95
10	102.5	103.8	100.4	102.2	1.72
						12	102.4	102.8	101.9	102.4	0.45

表11质粒DNA标准物质pXL12在-20℃下长期稳定性统计结果

参数	结果
		斜率β1	-0.04
截距β0	102.5
		s(β1)	0.037
t0.95,7·s(β1)	0.09
		结论	稳定

实施例5质粒DNA标准物质pXL12的定量方法的考察

(1)、用紫外分光光度法进行定量

检测原理：根据Beer-Lamber定律，样品浓度和吸光值之间有如下关系：A＝ε×b×c，其中A是吸光值(A)；ε是波长依赖的摩尔消光系数(单位：L/mol*cm)；b是光程(单位：cm)；c是样品浓度(单位：mol/L)。当样品的摩尔消光系数和光程一定时，样品浓度和吸光值正相关。紫外分光光度法的吸光值溯源至重铬酸钾溶液标准物质[GBW(E)081609]的标准值。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

1、参考中国机械行业标准《JBT 6778-1993紫外可见近红外分光光度计》中标准附录B要求，采用重铬酸钾溶液标准物质[GBW(E)081609]，配制质量分数为0.06/1000重铬酸钾溶液，用紫外分光光度计进行分析，考察紫外分光光度计的吸光值准确性。在全波长范围内扫描6次，吸光值结果见表12。表12说明该紫外分光光度计的误差范围和重复性均符合标准要求。

表12吸光值准确性考察

编号	235nm	257nm	313nm	350nm
					1	0.072	0.086	0.032	0.064
2	0.073	0.085	0.031	0.064
					3	0.07	0.084	0.032	0.064
4	0.071	0.085	0.033	0.066
					5	0.073	0.088	0.035	0.068
6	0.071	0.084	0.034	0.067
					平均值	0.072	0.085	0.033	0.066
标准值	0.0742	0.0863	0.0289	0.0642
					误差	-0.0025	-0.0010	0.0039	0.0013
重复性(％)	0.12	0.15	0.15	0.18

2、用紫外分光光度法进行定量的实验方法包括以下步骤：

a、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

b、取实施例1制备所得质粒DNA标准物质pXL12的DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；

c、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。

d、每个样品测试八次，取平均值。

结果如表13所示，结果说明，采用紫外分光光度法检测质粒DNA标准物质pXL12的定量结果是可靠的。

表13紫外分光光度法检测质粒DNA标准物质pXL12(单位：ng/μL)

(2)、用高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)方法进行定量

实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12中磷元素的含量和质粒分子的浓度有固定线性关系，这是由DNA分子结构决定的[参考《基因Ⅷ》第一章]，在DNA中，每个碱基对应一个磷原子，分子中磷元素含量(质量分数)可由下式计算：含磷量(P％)＝碱基数×磷的原子量÷DNA分子量。HR-ICP-MS实现了高灵敏度的检测元素，可以对DNA分子内的P元素直接进行定量测量。

根据图2所示的P元素HR-ICP-MS图谱和图3所示的、由P元素浓度分别为1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L或5μg/L制得的标准曲线，平行检测TE缓冲溶液(保存有实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12)6次，检测结果参见表14，结果说明，

该

该HR-ICP-MS方法检测质粒DNA标准物质的精密度良好，可用于该标准物质研制过程中的均匀性检验和稳定性监测。

表14HR-ICP-MS检测质粒DNA标准物质pXL12(用质粒DNA标准物质稀释2500倍后的P含量表示，单位：ng/mL)

实施例6质粒DNA标准物质pXL12的定量

邀请了8家单位使用紫外分光光度法对实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12进行定值，8家单位分别为上海张江药谷公共服务平台有限公司、上海睿智化学研究有限公司、福州芯创生物科技有限公司、上海市计量测试技术研究院、上海市食品药品检验所、上海市临床检验中心、上海市疾病预防控制中心和中国科学院上海应用物理研究所。每个单位别随机抽取分发1瓶实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12，平行测定8次，进行定值分析。

另外由上海市计量测试技术研究院理化中心使用高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)对实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12进行定值，平行测定8次。

测定后进行定值结果的数据统计，其具体的操作步骤为：

a.汇总全部原始数据，用偏态系数和峰态系数法检验得知全部原始数据符合正态分布；

b.对每一组独立测量结果分别用格拉布斯(Grubbs)和狄克逊(Dixon)法从统计上检验，剔除离群值。其中，各组数据的无离群值如表15所示。

c.对各组数据的标准偏差用科克伦法进行等精度检验，判断确定无可疑数据组；

d.以t-检验法和狄克逊(Dixon)法检验数据，证明每组数据的平均值不存在显著性差异；

e.将8个平均值再次计算平均值，求出质粒DNA标准物质pXL12的总平均值为104.0，即为质粒DNA标准物质pXL12的标准值(单位：ng/μL)。

f.根据各质粒分子的分子量，计算得出质粒DNA标准物质

表15质粒DNA标准物质pXL12定值结果(单位：ng/μL)

实施例7质粒DNA标准物质pXL12的不确定度的评估

质粒DNA标准物质pXL12的不确定度来源由三部分组成。第一部分为质粒DNA标准物质pXL12的不均匀性引起的不确定度；第二部分为质粒DNA标准物质pXL12在有效期内的变动性引起的不确定度；第三部分为质粒DNA标准物质pXL12的定值过程带来的不确定度，包括数据统计引入的不确定度和通过对定值方法中测量影响因素评估不确定度。

(1)、质粒DNA标准物质pXL12的不均匀性引起的不确定度

(2)、质粒DNA标准物质pXL12在有效期内的变动性引起的不确定度

质粒DNA标准物质pXL12在有效期t＝12个月内的长期稳定性引起的不确定度贡献为：u_s＝s(β₁)·X＝0.037×12＝0.4ng/μL

其中s(β₁)为长期稳定性检验部分求出的与斜率相关的不确定度。

相对不确定度为：

(3)、质粒DNA标准物质pXL12的定值过程带来的不确定度

3.1数据统计引入的不确定度(u_char1)

确认的特性值恰好是平均值的平均值(即各组数据不存在平均值和标准偏差的不一致性)，

即如下述公式所示：式中：-总平均值；Y_i-各组数据的平均值；p-实验室数目。

与平均值的平均值相关的合成标准不确定度的基础是标准偏差，可由下述公式获得：

合成标准不确定度为下述公式所示：

质粒DNA标准物质pXL12的数据统计引入的不确定度：

合成标准不确定度为下述公式所示：

相对不确定度为：

3.2紫外分光光度法定值时测量影响因素引入的不确定度(u_char2)

测量影响因素引入的不确定度即为仪器本身引入的不确定度。考察紫外分光光度计在257nm处吸光值的准确性，其相对标准偏差为0.15％，即该相对不确定度为0.15％。

3.3 HR-ICP-MS定值时测量影响因素引入的不确定度(u_char2)

质粒DNA标准物质pXL12的浓度按下式计算：

式中：c-质粒DNA标准物质浓度；c_s-由标准曲线求得样品液中P含量；f-质粒标准物质的稀释倍数；质粒DNA分子中P元素含量百分比为10.20％。

由上式可知，影响质粒DNA标准物质pXL12浓度的不确定度因素有：由标准曲线计算样品液中P含量引入的不确定度和样品溶液制备稀释过程引入的不确定度(将质粒标准物质原液稀释了2500倍)。充分考虑样品检测过程中的各种影响因素，建立不确定评估模型如下：

其中质粒DNA标准物质浓度标准不确定度用u_c(c)表示，由标准曲线计算样品液中P含量标准不确定度用u_c(c_s)表示，样品溶液制备稀释过程引入的不确定度用u_c(f)表示。则由此得到的相对标准不确定度传播率为：

c_s的不确定度由两部分组成，其一是当由5种P标准溶液的质量浓度(1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL)与P标准物质产生的信号强度拟合的直线求得c_s时测量所产生的不确定度；其二是由标准贮备液配制成5种质量浓度标准溶液时所产生的对c_s测量所产生的不确定度。

A、由拟合直线求得c_s时所产生的不确定度(u_c,1(c_s))：

用HR-ICP-MS测定质粒标准物质中的P含量，利用P标准物质(NIST，SRM3139a)配制5种标准溶液，P浓度分别为1ng/mL、2ng/mL/mL、3ng/mL、4ng/mL和5ng/mL，用HR-ICP-MS对上述5种P标准溶液进行测定，结果见表16。

表16各浓度下P标准物质质谱信号丰度

据测定结果建立的标准曲线(见图5)，经过线性拟合得出以下方程：

A＝3514.8c_m+245.54；式中：A-质谱信号丰度；c_m-溶液中P元素的含量。

记B1＝3514.8，B0＝245.54。

HR-ICP-MS检测pXL12时由拟合直线求得c_s时所产生的不确定度(u_c,1(c_s))如下：对c_s进行八次测量，通过直线方程求得c_s＝4.09ng/mL，则c_s的标准不确定度为：

式中，B1＝3514.8。

P＝8(对c_s进行八次测量)，n＝5，

将上述各值代入得出

B、配制P标准工作溶液的不确定度u_c,2(c_s)

以5ng/mL标准工作溶液为例阐述不确定度的大小，其配制步骤为：称取0.1g的P标准溶液(10.016±0.033mg/g)，用容量瓶定容至100mL(A级)，配成100ng/mL标准工作溶液，稀释因子f₁＝1000，称取0.5g的100ng/mL标准工作溶液，用容量瓶定容至100mL，配成5ng/mL的工作溶液，f₂＝2000,则：

所以，

i供应商证书上给出P标准溶液浓度是10.016±0.033mg/g，按照均匀分布转化，则

ⅱa根据电子天平检定证书可知，天平称量的扩展不确定度为0.04mg，按均匀分布进行评定，取k＝2，则天平称量的不确定度为0.04/2＝0.02mg，称样量为0.1g，

则称量的相对不确定度

ⅱb 100mL容量瓶引入的不确定度(u_c(V₁₀₀))

A级100mL容量瓶的容积最大允差为±0.1mL，按其服从三角分布，则容量瓶体积的不确定度

实验室温度控制在20℃±3℃(置信水平为95％)，水的体积膨胀系数为2.1×10^-4/℃，因此产生的体积变化为±3×100×2.1×10^-4＝±0.062mL，按照均匀分布转化，

ⅲa根据电子天平检定证书可知，天平称量的扩展不确定度为0.04mg，按均匀分布进行评定，取k＝2，则天平称量的不确定度为0.04/2＝0.02mg，

称样量为0.5g，则称量的相对不确定度

ⅲb 100mL容量瓶引入的不确定度(u_c(V₁₀₀))

A级100mL容量瓶的容积最大允差为±0.1mL，按其服从三角分布，则容量瓶体积的不确定度

实验室温度控制在20℃±3℃(置信水平为95％)，水的体积膨胀系数为2.1×10^-4/℃，因此产生的体积变化为±3×100×2.1×10^-4＝±0.062mL，按照均匀分布转化，

则，即

因此，由标准曲线计算样品液中P含量相对不确定度。

c_s的相对不确定度合成：

C、质粒DNA标准物质pXL12样品溶液制备稀释过程引入的不确定度(u_c(f))

样品溶液制备过程如下：称取40mg质粒标准物质原液，定容至100mL，稀释2500倍。称取40mg原液时产生的不确定度u_c(m_0.05)。

ia根据电子天平检定证书可知，天平称量的扩展不确定度为0.04mg，按均匀分布进行评定，取k＝2，则天平称量的不确定度为0.04/2＝0.02mg，称样量为40mg，

则称量的相对不确定度

ib 100mL容量瓶引入的不确定度(u_c(V₁₀₀))

A级100mL容量瓶的容积最大允差为±0.1mL，按其服从三角分布，则容量瓶体积的不确定度

实验室温度控制在20℃±3℃(置信水平为95％)，水的体积膨胀系数为2.1×10^-4/℃，因此产生的体积变化为±3×100×2.1×10^-4＝±0.062mL，按照均匀分布转化，

所以，样品溶液稀释引入的相对不确定度合成：

因此，HR-ICP-MS检测质粒DNA标准物质的相对标准不确定度传播率为：

将紫外方法和HR-ICP-MS方法测量过程影响因素引入的相对不确定度进行合成：

3.4质粒DNA标准物质的定值过程引入的不确定度(u_char)

质粒DNA标准物质pXL12的定值过程引入的相对不确定度如下：

pXL12数据统计引入的相对不确定度为：

所以定值过程引入的相对不确定度合成：

结果如表17所示。

表17引入的不确定度

3.5合成标准的不确定度

将各均匀性引入的相对不确定度、稳定性引入的相对不确定度、定值过程引入的相对不确定对分量合成，质粒DNA标准物质的合成标准不确定度如下：

质粒DNA标准物质pXL12的合成标准不确定度：

结果如表18所示。

表18不确定度

3.6标准值的扩展不确定度U_CRM

将质粒DNA标准物质特性量值标准值的合成标准不确定度u_c乘以包含因子k(对应置信概率95％，取k＝2)，即为质粒分子标准物质特性量值标准值的扩展不确定度：U_CRM＝k×u_c。

因此质粒DNA标准物质pXL12的扩展不确定度U_CRM＝2.70ng/μL。

质粒DNA标准物质pXL12定值结果的表示——相对扩展不确定度：

结果见表19。标准值为104.0ng/μL，相对扩展不确定度为2.6％(k＝2)。

表19定值结果

实施例8质粒DNA标准物质pXL12在实时荧光RT-PCR检测中的应用

A、使用WHO推荐PCR方法对质粒DNA标准物质进行扩增

世界卫生组织(WHO)在《Real-time RT-PCR Protocol for the Detection ofAvian Influenza A(H7N9)Virus》中共推荐了四套引物探针用于H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测，各引物探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3～14所示。其中检测H7基因的探针CNIC-H7P的序列为：5'FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3'；检测N9基因的探针CNIC-N9P的序列为：5’FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3’；检测M基因的探针InfAP的序列为：5’FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-BHQ1-3’；检测人源RnaseP基因的探针RnaseP P的序列为5’FAM-TTCTGACCTGAA GGCTCTGCGCG-BHQ1-3’。

以实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12为模板进行实时荧光RT-PCR扩增，具体方法如下：以梯度稀释的质粒DNA标准物质(浓度从10⁶拷贝/μL～10¹拷贝/μL)为模板进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线(参见图6)。

结果发现，这些标准曲线的相关系数均达到0.99，线性良好，表明质粒DNA标准物质pXL12适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光RT-PCR扩增H7N9禽流感病毒的阳性标准物质。

B、使用试剂盒方法对质粒DNA标准物质进行扩增

使用上海之江生物科技股份有限公司生产的“人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)”(货号Z-RR-0309-02)，以实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12为模板进行实时荧光RT-PCR扩增，操作步骤参见该试剂盒的说明书。

结果参见图7，图7的结果说明质粒DNA标准物质pXL12可以用于该试剂盒扩增，适用于该试剂盒的检测方法。

C、与H7N9禽流感病毒cDNA进行扩增比较

将H7N9禽流感病毒cDNA(从军事医学科学院微生物流行病研究所处获得)用上述WHO推荐方法中的四套引物探针进行扩增。

扩增的操作步骤参见A、的相关内容。

结果参见图8，图8说明实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12与H7N9禽流感病毒cDNA扩增结果一致，该质粒DNA标准物质可以替代H7N9禽流感病毒cDNA用于实时荧光PCR扩增。

对比实施例1

将转基因大豆GTS40-3-2定量检测质粒DNA标准物质(参见许丽等，转基因大豆GTS40-3-2定量检测质粒DNA标准物质的研制，中国计量，2014.4，第72-75页)按照实施例7中3.6的相关步骤对相对扩增不确定度进行测定。结果发现，该转基因大豆GTS40-3-2定量检测质粒DNA标准物质的相对扩增不确定度U＝8％(k＝2)，远远高于实施例1制备的质粒DNA标准物质pXL12，可见其提供的标准量值区间离散，不准确度大。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，其特征在于，所述质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的质粒DNA标准物质，其特征在于，所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.一种利用如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质的定量方法，其特征在于，其包括以下步骤：

①提取如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

4.一种定量如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质的方法，其特征在于，所述方法紫外分光光度法或高分辨电感耦合等离子体质谱法。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述紫外分光光度法包括以下步骤：

①提取如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质；

②将紫外分光光度计校正为零点；

③取DNA至比色杯中，记录仪器读数。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高分辨电感耦合等离子体质谱法包括以下步骤：

①提取如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质；

②计算步骤①中各质粒标准分子的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测，并根据步骤③所得的标准曲线得出步骤①中质粒标准分子的磷含量；

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。

7.一种H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，其所采用的标准物质是权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质。

8.一种如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质作为阳性标准物质，建立标准曲线后，进行H7N9禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测。

9.一种如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

①人工合成检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示；

②将步骤①所得的检测序列克隆至载体上，即可。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pMD19-T。