CN104846087A - 一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示无精症。本发明发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机构与医院检验科，男科实验室等推广。

Description

一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。

背景技术

多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。

传统的男性不育的诊断方法是利用精子的活力分析，精子计数等方法，而这类方法具有如下的特点：

1、精子计数受到外界的影响因素较多，如吸烟、饮酒等都会造成结果的波动较大；

2、精子的活力分析需要昂贵的仪器分析，且与受试者是否近期有同房等因素有显著相关；

3、目前的方法都是基于精液的检测方法，收集样本的过程较为繁琐。

而采用血浆的分子标记物的检测方法具有采样简单、直接，可以直接反映病人的生育水平的特点。如201310112391.1，名称为“男性不育的生物标志物及其应用”的发明专利申请，检测受试者体液中至少一种指示男性不育生物标志物的水平，其中至少一种指示男性不育生物标志物选自乙酰肉碱、天冬氨酸、肉碱 C3：1、酮肉碱、亮氨酰脯氨酸、肉碱C8、甲基黄嘌呤、肉碱C10：2、肉碱C10：1、腺嘌呤；所述体液选自受试者尿液、血清、血浆、血液、精液、精子、精浆、唾液。该检测方法需要高效液相层析分析仪等昂贵的仪器，另一方面，需要同时检测多个生物标记物，且通过受试者操作曲线（ROC），这一反映生物标记物的经典方法发现，即使采用多个标记物组合其曲线下面积（AUC）最高为0.73，对应的敏感性与特异性仅为65％与71%。

201310722584.9，名称为“一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法”的发明专利申请，通过抽提口腔上皮细胞样本的基因组DNA，再经荧光定量PCR反应检测分析个体的NOS3基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型，为所有的受检者提供精子细胞凋亡相关基因检测，并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。该检测方法是从基因多态的层面提取口腔上皮细胞的DNA，进行基因扩增后观察基因多态性与无精子的相关情况，从DNA的水平观察其与无精症的相关情况，其DNA变异与无精症仅为相关性研究，没有对检测方法与精子产生等参数关联的具体相关性的资料，敏感性与特异性低，不具有实用性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。本发明发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA（miRNA）基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过度表达提示男性无精症。

本发明所述miR-15b的基因序列为：5’-TAGCAGCACA TCATGGTTTA C。

本发明所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。

所述的正常生精者的血浆中miR-15b含量大于2000万/毫升。

优选地，所述的miR-15b特异性引物探针为Taqman探针，具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。

本发明所述的男性不育诊断的试剂盒的使用方法，步骤如下：

A、RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA；

B、 荧光定量PCR：对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值；

C、结果判定：将检测值采用2-∆∆Ct 方法换算成相对表达量，以相对表达值4.2为临界值，超过4.2即推测为无精症。

本发明的试剂盒可用于诊断男性无精症，推断男性不育，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，其预测男性不育的敏感性与特异性分别为71.4%与100%，特异性好，定量结果准确性高，具有良好的检测效能，是测定的金标准。

相对于传统的精子活力与计数的方法相比，有如下优点：

1、检测所需的样本量少，速度快，时间短，可用于评估精子质量与功能的实验室检测，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。

2、试剂盒的检测对象为血浆样本，而非从精液中分离精子样本，是一种快速与准确的筛选男性精子发生障碍的新的方法。

3、本试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机构与医院检验科，男科实验室等推广。

附图说明

图1为动物模型的结果分析。

（a）构建通过PGK2启动子在生精细胞特异的过表达miR-15b的转基因小鼠。

（b）PCR鉴定出阳性的转基因小鼠模型。

（c）miR-15b转基因小鼠的睾丸H＆E染色显示出现精子发生缺陷，未成熟精子细胞脱落。左边为正常对照小鼠睾丸切片。

（d）附睾中收集的精子计数结果。

（e）miR-15b转基因小鼠的曲精小管的直径。

（f） miR-15b转基因小鼠血浆的miR-15b表达。

（g）Western blot结果显示miR-15b调控的下游基因Cdc25a的表达。

图2为男性无精症与正常受试者经试剂盒检测得到的miR-15b相对表达量的分布图。

图3为本发明试剂盒对无精症诊断的特异性和敏感性分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。

实施例2

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。

所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

实施例3

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。

所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

所述的质控品为正常受试者的血浆miR-15b表达水平。

实施例4

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。

所述的男性无精症诊断的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。

所述的miR-15b特异性引物探针为Taqman探针。

实施例5

一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。

所述的男性无精症诊断的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平，血浆中精子含量大于2000万/毫升。

实施例6

本发明所述的男性无精症诊断试剂盒的使用方法，步骤如下：

A、RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA；

B、 荧光定量PCR：对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值；

C、结果判定：将检测值采用2-∆∆Ct 方法换算成相对表达量。

具体实验操作如下：

1、RNA提取：用含EDTA抗凝剂的采血管收集3ml全血，3000g，4℃离心10min，收集上层黄色半透明液体就是血浆，大约有500ul血浆，用mirVana™ PARIS™ Kit (Life technologies，AM1556）血浆提取试剂盒提取RNA。具体操作为：

a. 使用前将2X 变性缓冲液37℃放置。

b. 500ul血浆样本加入等体积的2X变性缓冲液，在加入1ml氯仿涡旋60s，10000g，5min，室温放置。

c. 将上清转移到新的EP管中，加入1.25倍体积的100%乙醇，加入过滤芯离心，弃溶液。

d. 洗液1，洗涤一次，10000g，30s。

e. 洗液2/3，洗涤两次，10000g，30s。

f. 空气分离。

g. 加入100ul 95℃预热的洗脱液溶解收集RNA。

2、反转录：反转录体系采用的引物来自于反转录试剂盒 P/N 4366596 (Life公司，美国）。

1）按表1顺序配制反转录反应体系

表1

85℃反应5min，60℃反应5min，4℃ 保存，冰上放置2min。

2）加入表2的7ul 混合液

表2

16℃反应30min，42℃反应5min，85℃反应5min，4℃ 保存。

3、荧光定量PCR：用Taqman探针法检测受试样本与正常血浆样本中miR-15b的表达，PCR扩增反应体系的引物为Life technologies公司提供，货号为Assay ID000390。

按表3配制PCR反应体系

表3

50℃反应2min，（95℃反应10min，95℃反应15s，60℃反应60s）40cycles。检测受试样本与质控品的Ct值，并采用2-∆∆Ct 方法换算成相对表达量。

动物实验

本发明通过动物模型，构建过表达miR-15b的转基因小鼠，发现在生精细胞特异的过表达miR-15b能通过抑制精子细胞生成过程中的关键蛋白Cdc25a，从而抑制精子细胞的产生。动物实验证明了miR-15b可以用做反映精子产生的生物标记物。

图1（a）构建通过PGK2启动子在生精细胞特异的过表达miR-15b的转基因小鼠。图1（b）PCR鉴定出阳性的转基因小鼠模型。图1（c）miR-15b转基因小鼠的睾丸H＆E染色显示出现精子发生缺陷，未成熟精子细胞脱落。左边为正常对照小鼠睾丸切片。图1（d）附睾中收集的精子计数结果显示精子数显著降低 (n=3-6 ; P<0.05,)；图1（e）miR-15b转基因小鼠的曲精小管的直径出现显著降低；图1（f） miR-15b转基因小鼠的血浆的miR-15b表达显著升高 (n=3; p=0.05)；图1（g）Western blot结果显示miR-15b调控的下游基因Cdc25a的表达显著下降 （n=9; P<0.05)。

临床实验

对12例正常生育的男性与14例男性无精症的病人，分别抽取受试者的外周血，提取血浆中的RNA分子，采用本发明试剂盒对循环的微小RNA分子，miR-15b的表达丰度进行了检测，并采用2-∆∆Ct 方法换算成相对表达量。∆Ct= Ct目的基因（miR-15b）－Ct内参基因(β-actin)。

结果分析：正常受试者的相对表达量平均值为1.42+/-0.28（均值+/-标准差），无精症病人的相对表达量为23.16+/-7.51（均值+/-标准差）。图2为检测得到的miR-15b相对表达量的分布图，男性无精症病人的血浆miR-15b的表达量相对于正常受试者的表达量明显上升。这一结果显示miR-15b是一个很好的预测男性精子发生状况的分子标记物。

利用Graphpad Prism 5统计软件进行生存曲线分析，以相对表达值4.2为临界值，超过4.2即推测为无精症，采用临界值绘制生存曲线。图3为本试剂盒对男性不育诊断的特异性和敏感性分布图，预测男性不育的敏感性与特异性分别为71.4%与100%，具有良好的检测效能。（敏感性是指无精症的受试者的miR-15b相对表达量低于临界值的比例；特异性是指正常受试者miR-15b相对表达量高于临界值的比例。）

序列表

<110> 四川大学华西第二医院

<120> 一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> miR-15b

<400> 1

tagcagcaca tcatggttta c 21

Claims (5)

1.一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过度表达提示无精症。

2.根据权利要求1所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。

3.根据权利要求2所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。

4.根据权利要求2所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的miR-15b特异性引物探针为Taqman探针。

5.根据权利要求1所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下：

A、RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA；

B、荧光定量PCR：对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值；

C、结果判定：将检测值采用2-∆∆Ct 方法换算成相对表达量。