CN105821143A - 一种用于检测高血压易感性相关的snp位点的引物及检测方法 - Google Patents

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张蓉
李江林
刘宇
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Abstract

本发明提供了一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物，包括FIGN基因rs16849225位点的引物、ENPEP基因rs6825911位点的引物、NPR3基因rs1173766位点的引物和TBX3基因rs35444位点的引物。采用该引物检测高血压易感性相关SNP位点的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取其基因组DNA；(2)采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；(3)对胶回收产物进行浓度测定，再PCR扩增并纯化；(4)对纯化产物测序，并对SNP位点测序结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患高血压几率。

Description

一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物及检测方法。
背景技术
高血压是指以体循环动脉压升高为主要表现的临床综合征，长期患高血压是心血管疾病死亡的重要原因，高血压发病是遗传因素与环境因素共同作用的结果。过去采用候选基因关联研究方法，根据已有高血压机制研究的结果，对肾脏钠转运及肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAS)相关蛋白编码基因进行基因关联研究。尽管大量的候选基因关联研究发现一些可疑的致病基因，但是这些研究结果常常无法重复。随着分子生物技术的发展及研究资金的投入使得研究者能够对高血压这一多基因疾病进行全基因组关联研究(Genome-WideAssociationStudies，GWAS)，克服候选基因关联研究的缺陷，在全基因组水平获得了一系列与高血压密切相关的基因和遗传高危区段，使得高血压遗传研究步入新的时代，同时也为高血压的治疗学提供新的研究靶点，为早期的预测预防及早期诊断高血压有着重要意义。
疾病的遗传易感基因检测是近年来国内外研究的热点，而在遗传因素的易感基因检测中，采用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphsm,SNP)作为基因组标志的关联分析方法较为有效和常用。SNP遗传稳定性强，易于检测，位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。但到目前为止，未发现为高血压易感风险检测提供一组密切相关的易感基因及引物。
发明内容
针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，能够实现高血压易感基因相关位点基因多态性检测及高血压易感风险预测，为高血压的预测、预防和早期诊断提供依据和指导，对加强高血压的防治具有重大意义。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物，包括FIGN基因rs16849225位点的引物、ENPEP基因rs6825911位点的引物、NPR3基因rs1173766位点的引物和TBX3基因rs35444位点的引物；
其中，FIGN基因rs16849225位点的上下游引物序列分别为5′-ATGTGGTGAGGTGAAGTAGA-3′(SEQIDNo：1)和5′-CTAGTTAATCCGACATGGAA-3′(SEQIDNo：2)；
ENPEP基因rs6825911位点的上下游引物序列分别为5′-TAACACCCTAAAAAGAGACC-3′(SEQIDNo：3)和5′-TACACAGACATACGCATACA-3′(SEQIDNo：4)；
NPR3基因rs1173766位点的上下游引物序列分别为
5′-CCAGAAACTCAATAGACTGG-3′(SEQIDNo：5)和5′-
GTGTGCCTCAGTGTCTTT-3′(SEQIDNo：6)；
TBX3基因rs35444位点的上下游引物序列分别为
5′-ACAGACTTTTGTTTGAGTCC-3′(SEQIDNo：7)和5′-
GACACTTGCTTTCTTCATC-3′(SEQIDNo：8)。
采用上述引物检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行目的片段PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，再采用所述四种引物的单向引物进行PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在贝克曼GeXP测序仪上测序，并对SNP位点的测序结果进行分析。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：PrimerSTARMax25μL、PrimerF3μL、PrimerR3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCSMasterMix2.5μL，浓度为5pmol/μL的PrimerR1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明提供的一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，具有以下几种有意效果：
(1)本发明提供了一组高血压易感基因和引物，设计的引物具有特异性好、准确性高等优点，根据设计的引物进行目的基因的PCR扩增，然后直接测序可准确的测定人高血压易感基因中的多态性位点基因型，根据基因型结果预测受检者患高血压的风险几率，并针对性地采取有效预防措施进行预防，尽可能规避或者延迟疾病的发生，这对高血压的预测和预防具有重大意义。
(2)本发明还提供了一种检测高血压易感性相关SNP位点的方法，该检测方法简单，通过使用特异性的引物，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点。
附图说明
图1为不同受检者血液DNA样品在4种不同引物下的PCR扩增电泳图；其中，1、5、9孔为FIGN基因rs16849225位点的引物扩增出的条带；2、6、10孔为ENPEP基因rs6825911位点的引物扩增出的条带；3、7、11孔为NPR3基因rs1173766位点的引物扩增出的条带；4、8、12孔为TBX3基因rs35444位点的引物扩增出的条带。
图2为FIGN基因rs16849225位点的测序峰图；
图3为ENPEP基因rs6825911位点的测序峰图；
图4为NPR3基因rs1173766位点的测序峰图；
图5为TBX3基因rs35444位点的测序峰图；
图6为FIGN基因rs16849225位点的测序峰图；
图7为ENPEP基因rs6825911位点的测序峰图；
图8为NPR3基因rs1173766位点的测序峰图；
图9为TBX3基因rs35444位点的测序峰图。
具体实施方式
实施例1
1、样品的采集及其全基因组DNA的提取
用EDTA-K2抗凝管随机采集健康人的外周血3.0mL(随机选择3个受检者为A、B和C)，采用天根血液基因组提取试剂盒提取受检者全基因组DNA，操作过程按试剂盒说明书进行操作，获得的全基因组DNA使用超微量蛋白核酸分析仪(柏精BioDropμLite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的DNA置于-20℃冰箱保存备用。
2、目的基因的PCR扩增、胶回收、纯化和测序
用FIGN基因rs16849225位点的引物、ENPEP基因rs6825911位点的引物、NPR3基因rs1173766位点的引物和TBX3基因rs35444位点的引物分别对所提取的DNA进行PCR扩增，反应体系为50μL，具体如表1所示；
表1PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA a(100-150ng)
ddH2O 19-a
Primer F 3.0
Primer R 3.0
Primer STAR MAX 25.0
total 50.0
PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻；
PCR扩增结束后，取50μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中拍照，电泳图如图1所示；电泳完成后在凝胶成像仪下切取含有目的片段的凝胶装入EP管中，用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒进行胶回收，得到目的片段的DNA，测定其浓度后进行记录，取一只干净的0.2mLPCR管，依次加入：PCRMix、测序引物、灭菌超纯水、模板DNA，其中模板DNA和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的DNA浓度决定，所添加的模板DNA量为20ng，反应体系为10μL，具体如表2所示，然后进行PCR，扩增程序见表3；
表2PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DTCS Master Mix 2.5
Primer R 1.0
ddH2O 6.5-b
模板DNA b(20ng)
总计 10.0
表3PCR扩增程序
PCR程序结束后对产物进行纯化：将浓度为3mol/L，pH值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/L，pH值为8.0的Na2EDTA缓冲液和Glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，然后取5μL终止液加入PCR产物中充分混匀，离心，将液体转移至一只新的1.5mLEP管中，然后加入50μL预冷无水乙醇，充分混匀，放入冰箱-20℃冷冻10min后于12000r/min离心5min，弃去上清，再向EP管中加入150μL预冷70％乙醇，放入高速离心机离心，12000r/min离心2min，弃去上清，稍离心，用移液器吸干EP管内剩余的液体，打开EP管盖，室温晾干至白色沉淀变透明，再向EP管中加入25μLSLS(SampleLoadingSolution)溶解DNA；
上样测序：将溶解的DNA加入96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，然后再加入适量矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液，最后将96孔样品板和96孔缓冲液装入GeXP测序仪进行测序。
通过序列分析软件(GenomeLabTMGeXP(GeneticAnalysisSystem))，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型，SNP分型结果如图2、图3、图4、图5所示，然后再将其中一份受检者的血液DNA使用本发明提供的引物扩增后送到深圳华大基因科技有限公司进行测序，得到的测序结果为图6-图9，其结果与图2-图5结果相同，说明准确性、重复性好。图2和图6显示的均是FIGN基因rs16849225位点的测序峰图；图3和图7显示的均是ENPEP基因rs6825911位点的测序峰图；图4和图8显示的均是NPR3基因rs1173766位点的测序峰图；图5和图9显示的均是TBX3基因rs35444位点的测序峰图。
结果分析：
图1中1、2、3、4孔为样品A扩增出的条带；5、6、7、8孔为样品B扩增出的条带；9、10、11、12孔为样品C扩增出的条带；1、5、9孔为FIGN基因rs16849225位点的引物扩增出的条带，大小为474bp；2、6、10孔为ENPEP基因rs6825911位点的引物扩增出的条带，大小为428bp；3、7、11孔为NPR3基因rs1173766位点的引物扩增出的条带，大小为795bp；4、8、12孔为TBX3基因rs35444位点的引物扩增出的条带，大小为431bp。由图1可知，每个基因的引物扩增的条件相同，即它们的TM值(DNA的解链温度)是固定的，不会随目的基因的序列不同而导致TM值不同，且电泳图无非特异性条带。
图2和图6显示的均是FIGN基因rs16849225位点的测序峰图，FIGN基因rs16849225位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，图2和图6中所测定的SNP分型均为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型；
图3和图7显示的均是ENPEP基因rs6825911位点的测序峰图，ENPEP基因rs6825911位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，图3和图7所测定的SNP分型均为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型；
图4和图8显示的均是NPR3基因rs1173766位点的测序峰图，NPR3基因rs1173766位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，图4和图8测定的SNP分型均为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型；
图5和图9显示的均是TBX3基因rs35444位点的测序峰图，TBX3基因rs35444位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，图5和图9测定的SNP分型均为TT，说明该样品的该位点基因型为非易感基因型。

Claims (6)

1.一种用于检测高血压易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括FIGN基因rs16849225位点的引物、ENPEP基因rs6825911位点的引物、NPR3基因rs1173766位点的引物和TBX3基因rs35444位点的引物；
其中，FIGN基因rs16849225位点的上下游引物序列分别为5′-ATGTGGTGAGGTGAAGTAGA-3′和5′-CTAGTTAATCCGACATGGAA-3′；
ENPEP基因rs6825911位点的上下游引物序列分别为5′-TAACACCCTAAAAAGAGACC-3′和5′-TACACAGACATACGCATACA-3′；
NPR3基因rs1173766位点的上下游引物序列分别为5′-CCAGAAACTCAATAGACTGG-3′和5′-GTGTGCCTCAGTGTCTTT-3′；
TBX3基因rs35444位点的上下游引物序列分别为5′-ACAGACTTTTGTTTGAGTCC-3′和5′-GACACTTGCTTTCTTCATC-3′。
2.采用权利要求1所述的引物检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行目的片段PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，再采用所述四种引物的单向引物进行PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在测序仪上测序，并对SNP位点的测序结果进行分析。
3.根据权利要求2所述的检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：PrimerSTARMax25μL、PrimerF3μL、PrimerR3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。
4.根据权利要求2所述的检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存。
5.根据权利要求2所述的检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCSMasterMix2.5μL，浓度为5pmol/μL的PrimerR1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
6.根据权利要求2所述的检测高血压易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
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