CN105821146A - 一种用于检测前列腺癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法 - Google Patents

一种用于检测前列腺癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，包括RAD23B‑KLF4基因rs817826位点的引物、LILRA3基因rs103294位点的引物、CTD‑2194D22.4基因rs12653946位点的引物和KLF5基因rs9600079位点的引物。采用该引物检测前列腺癌易感性相关SNP位点的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取DNA；(2)采用四种引物分别进行目的基因的PCR扩增、胶回收；(3)对胶回收产物进行浓度测定，PCR扩增并纯化；(4)将纯化产物上样，并对SNP检测结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患前列腺癌的风险。

Description

一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法。
背景技术
前列腺癌(prostatecancer)是男性泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，发生于前列腺组织，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。在欧美发达国家中发病率很高，居男性恶性肿瘤的第二位。在我国前列腺癌的发病率虽然远低于欧美国家，但随着人均寿命的增长、饮食方式的西化，前列腺癌的发病率和死亡率均呈现明显上升趋势，但早期对前列腺癌进行根治性治疗能达到治愈的效果。因此，早期的预测预防和早期诊断对前列腺癌的防治有着重大意义。
疾病的遗传易感基因的检测是国内外对疾病早期诊断的热点，在遗传因素的易感基因检测中，采用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphsm，SNP)作为基因组标志的关联分析方法较为有效和常用。SNP是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1％。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。
中国专利申请号为201210432615.2，专利名称为《一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用》中公开了与前列腺癌易感性相关的遗传区域9q31.2上的部分基因序列，还提供了遗传区域9q31.2上的单核苷多态性位点rs817826；中国专利申请号为201210432542.7，专利名称为《一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用》中公开了与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的部分基因序列，还提供了遗传区域19q13.4上的单核苷多态性位点rs103294。但CTD-2194D22.4基因的rs12653946位点，KLF5基因的rs9600079位点及其该位点的引物均未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，本发明提供了多个位点及各位点的引物和使用该引物来对前列腺癌高危人群进行筛选，有利于预防。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，该引物包括RAD23B-KLF4基因rs817826位点的引物、LILRA3基因rs103294位点的引物、CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的引物和KLF5基因rs9600079位点的引物。
进一步地，RAD23B-KLF4基因rs817826位点的上下游引物序列分别为5′-TCTGCTTACCCTTTTGA-3′(SEQIDNo：1)和5′-GGATTGTGAGGTAGAAAGA-3′(SEQIDNo：2)。
进一步地，LILRA3基因rs103294位点的上下游引物序列分别为5′-TAGAGAGGAAAGGTATCACA-3′(SEQIDNo：3)和5′-TGCTACAGAGGAAGAGTTTA-3′(SEQIDNo：4)。
进一步地，CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的上下游引物序列分别为5′-CCTGCTTGGCTTGTGT-3′(SEQIDNo：5)和5′-GGAACAAGAAACAGAGAGAA-3′(SEQIDNo：6)。
进一步地，KLF5基因rs9600079位点的上下游引物序列分别为5′-GAGATCCAAGACAACCATAA-3′(SEQIDNo：7)和5′-GGAAAACTAAGAATGGTAGG-3′(SEQIDNo：8)。
采用上述引物检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用上述四种引物分别对基因组DNA进行目的片段PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，采用所述四种引物的单向引物进行PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在贝克曼GeXP测序仪上样，并对SNP检测结果进行分析。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：PrimerSTARMax25μL、PrimerF3μL、PrimerR3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，于4℃保存。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCSMasterMix2.5μL，浓度为5pmol/μL的PrimerR1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明提供的一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种用于检测前列腺癌易感基因相关位点的引物，该引物具有特异性高、准确性好的优点，根据该引物对目的基因进行PCR扩增，通过直接测序可准确的测定人前列腺癌易感基因中的多态性位点基因型，可根据基因型结果预测受检者患前列腺癌的风险几率，并针对性的采取有效预防措施进行预防，尽可能规避或者延迟该病的发生，这对前列腺癌的预测和预防具有重大的意义。
(2)本发明还提供了一种使用特异性的引物检测前列腺癌易感性相关SNP位点的方法，该检测方法简单，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点。
附图说明
图1为不同受检者血液DNA样品在4种不同引物下的PCR扩增电泳图；其中1、4、7、10孔为样品A的条带；2、5、8、11孔为样品B的条带；3、6、9、12孔为样品C的条带；1、2、3孔所用引物为RAD23B-KLF4基因的引物；4、5、6孔所用引物为LILRA3基因的引物；7、8、9孔所用引物为CTD-2194D22.4基因的引物；10、11、12孔所用引物为KLF5基因的引物；
图2为RAD23B-KLF4基因rs817826位点的测序峰图；
图3为LILRA3基因rs103294位点的测序峰图；
图4为CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的测序峰图；
图5为KLF5基因rs9600079位点的测序峰图；
图6为RAD23B-KLF4基因rs817826位点的测序峰图；
图7为LILRA3基因rs103294位点的测序峰图；
图8为CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的测序峰图；
图9为KLF5基因rs9600079位点的测序峰图。
具体实施方式
实施例1
1、样品的采集及其全基因组DNA的提取
用EDTA抗凝管采集健康人的外周血3.0mL，采用天根血液基因组提取试剂盒提取受检者全基因组DNA，操作过程按试剂盒说明书进行操作，获得的全基因组DNA使用超微量蛋白核酸分析仪(柏精BioDropμLite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的DNA置于-20℃冰箱保存备用。
2、目的基因的PCR扩增、胶回收、纯化和测序
用RAD23B-KLF4基因rs817826位点的引物、LILRA3基因rs103294位点的引物、CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的引物和KLF5基因rs9600079位点的引物分别对所提取的DNA进行PCR扩增，反应体系为50μL，具体如表1所示；
表1PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA a(100-150ng)
ddH2O 19-a
Primer F 3.0
Primer R 3.0
Primer STAR MAX 25.0
total 50.0
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻。
PCR扩增结束后，取50μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图1所示；电泳完成后在凝胶成像仪下切取含有目的片段的凝胶装入EP管中，用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒进行胶回收，得到目的片段的DNA，测定其浓度后进行记录，取一只干净的0.2mLPCR管，依次加入：PCRMix、测序引物、灭菌超纯水、模板DNA，其中模板DNA和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的DNA浓度决定，所添加的模板DNA量为20ng，反应体系为10μL，具体如表2所示，然后进行PCR，扩增程序见表3；
表2PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DTCS Master Mix 2.5
Primer R 1.0
ddH2O 6.5-b
模板DNA b(20ng)
总计 10.0
表3PCR扩增程序
PCR程序结束后对产物进行纯化：将浓度为3mol/L，pH值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/L，pH值为8.0的Na2EDTA缓冲液和Glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，然后取5μL终止液加入PCR产物中充分混匀，离心，将液体转移至一只新的1.5mLEP管中，然后加入50μL预冷无水乙醇，充分混匀，放入冰箱-20℃冷冻10min后于12000r/min离心5min，弃去上清，再向EP管中加入150μL预冷70％乙醇，放入高速离心机离心，12000r/min离心2min，弃去上清，稍离心，用移液器吸干EP管内剩余的液体，打开EP管盖，室温晾干至白色沉淀变透明，再向EP管中加入25μLSLS(SampleLoadingSolution)溶解DNA；
上样测序：将溶解的DNA加入96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，然后再加入适量矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液，最后将96孔样品板和96孔缓冲液装入GeXP测序仪进行测序。
通过序列分析软件(GenomeLabTMGeXP(GeneticAnalysisSystem))，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型，样本的检测结果如图2、图3、图4、图5所示，然后再将其中一份受检者的血液DNA使用本发明提供的引物扩增后送到深圳华大基因科技有限公司进行测序，测序仪为ABI公司型号为3730，进行测序，得到的测序结果为图6～图9，其结果与图2～图5结果相同，说明准确性、重复性好。图2和图6显示的均是RAD23B-KLF4基因rs817826位点的测序峰图；图3和图7显示的均是LILRA3基因rs103294位点的测序峰图；图4和图8显示的均是CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的测序峰图；图5和图9显示的均是KLF5基因rs9600079位点的测序峰图。
结果分析：
图1中，1、4、7、10孔为样品A的条带；2、5、8、11孔为样品B的条带；3、6、9、12孔为样品C的条带；样品A、B和C代表随机选取的3个受检者的血液DNA，利用设计好的引物分别对3份血液DNA进行统一程序的PCR扩增，虽然每个引物重复扩增了3次，但是所用的模板是不同的；其中，1、2、3孔为RAD23B-KLF4基因rs817826位点的引物扩增出的条带，4、5、6孔为LILRA3基因rs103294位点的引物扩增出的条带，7、8、9孔为CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的引物扩增出的条带，10、11、12孔为KLF5基因rs9600079位点的引物扩增出的条带。由图1可知，每个基因的引物扩增的条件相同，即它们的TM值(DNA的解链温度)是固定的，不会随目的基因的序列不同而导致TM值不同，且电泳图无非特异性条带。
图2和图6为RAD23B-KLF4基因rs817826位点的测序峰图，RAD23B-KLF4基因rs817826位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图2和图6可知，基因型为TT，说明该样品的该位点基因型为非易感基因型。
图3和图7为LILRA3基因rs103294位点的测序峰图，LILRA3基因rs103294位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图3和图7可知，基因型为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
图4和图8为CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的测序峰图，CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的非易感基因型为CC，易感基因型为TC和TT，由图4和图8可知，基因型为TT，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
图5和图9为KLF5基因rs9600079位点的测序峰图，KLF5基因rs9600079位点的非易感基因型为GG，易感基因型为TG和TT，由图5和图9可知，基因型为GG，说明该样品的该位点基因型为非易感基因型。
。

Claims (10)

1.一种用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括RAD23B-KLF4基因rs817826位点的引物、LILRA3基因rs103294位点的引物、CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的引物和KLF5基因rs9600079位点的引物。
2.根据权利要求1所述的用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述RAD23B-KLF4基因rs817826位点的上下游引物序列分别为5′-TCTGCTTACCCTTTTGA-3′和5′-GGATTGTGAGGTAGAAAGA-3′。
3.根据权利要求1所述的用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述LILRA3基因rs103294位点的上下游引物序列分别为5′-TAGAGAGGAAAGGTATCACA-3′和5′-TGCTACAGAGGAAGAGTTTA-3′。
4.根据权利要求1所述的用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述CTD-2194D22.4基因rs12653946位点的上下游引物序列分别为5′-CCTGCTTGGCTTGTGT-3′和5′-GGAACAAGAAACAGAGAGAA-3′。
5.根据权利要求1所述的用于检测前列腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述KLF5基因rs9600079位点的上下游引物序列分别为5′-GAGATCCAAGACAACCATAA-3′和5′-GGAAAACTAAGAATGGTAGG-3′。
6.采用权利要求1-5任一项所述的引物检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行目的基因的PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，采用所述四种引物的单向引物进行PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在测序仪上样，并对SNP检测结果进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：PrimerSTARMax25μL、PrimerF3μL、PrimerR3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。
8.根据权利要求6所述的检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，于4℃保存。
9.根据权利要求6所述的检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCSMasterMix2.5μL，浓度为5pmol/μL的PrimerR1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
10.根据权利要求6所述的检测前列腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
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