CN102899322A

CN102899322A - 一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用

Info

Publication number: CN102899322A
Application number: CN2012104325427A
Authority: CN
Inventors: 徐剑锋; 孙颖浩; 莫曾南; 许传亮; 任善成; 高旭
Original assignee: Fudan University; Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: Fudan University; Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明属于生物技术的基因领域，具体涉及一个与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用。本发明提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的部分基因序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；还提供遗传区域19q13.4上的单核苷多态性位点rs103294；rs103294碱基为C的个体为前列腺癌易感人群，rs103294碱基为Ｔ的个体为前列腺癌非易感人群；rs103294的SNP序列如SEQ.ID.NO.2所示。还提供检测单核苷酸多态性位点的特异性核酸引物：SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5，其特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。

Description

一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用

技术领域

本发明属于生物技术的基因领域，具体涉及一个与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用。

背景技术

前列腺癌（Prostate cancer, PCa）是男性中第二大常见肿瘤，在癌症相关死因中位于第六位，全球每年预计新发病例91.4万人，病死例数约25.8万人(Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011 ;61, 69-90 .)。前列腺癌的病因大多不是很清楚，目前的研究结果表明，除了年龄和种族，家族史是前列腺癌发病另一主要的高危险因素(Gronberg H. Prostate cancer epidemiology. Lancet. 2003 ;361(9360):859-64.)。这种家族聚集性在很大程度上提示了遗传因素对前列腺癌发生风险的影响。在一项双胞胎研究中发现，遗传因素能解释42%前列腺癌的发病风险(Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M et al. Environmental and heritable factors in the causation of cancer--analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med. 2000 ;343, 78-85.)。造成差异的遗传物质基础之一就包括SNP（单核苷酸多态性）。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多(Collins F.S., Brooks L.D., Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 1998,8(12) ,1229-31.)。目前，SNP是研究人类常见疾病遗传变异的重要依据。而全基因组关联研究是系统找出疾病SNP遗传变异的、具有良好前景的分子遗传学研究方法。

本发明通过全基因组关联研究，选择19q13.4区域作为所研究的基因，同时选择19q13.4区域上的SNP位点作为所研究的方向。经对国内外文献检索，至今未见有19q13.4遗传区域与前列腺癌相关联的报道，也没有19q13.4区域上多态性位点与前列腺癌的相关性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4部分基因序列，通过rs103294单核苷酸多态性位点的遗传研究，提出一个可作为判定前列腺癌高危人群的易感SNP位点，以利于前列腺癌高危人群的筛查，以利于预防和治疗。

本发明研究表明，遗传区域19q13.4与前列腺癌的易感性相关。本发明首先提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的部分基因序列，该基因序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其第501位为T/C。

本发明还提供与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的一单核苷多态性位点，rs103294：rs103294位于基因LILRA3附近；rs103294碱基为T/C；rs103294的SNP序列通过 http://genome.uscs.edu/ 数据库获得，其序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还提供检测一单核苷酸多态性位点的特异性核酸引物：SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5，且特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。

本发明关于与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4基因序列，其获得rs103294序列的具体步骤如下：

通过http://genome.uscs.edu/ 数据库，在遗传区域19q13.4上选择单核苷酸多态性位点rs103294；依据相应的碱基序列合成引物：ACGTTGGATGAGCATTGGCCCTAAATTGTC （SEQ.ID.NO.3），ACGTTGGATGGAGGACAATGCATCTCTCAG（SEQ.ID.NO.4）以及UEP引物：cgagCACCATATCTATTCCCAAGGTT（SEQ.ID.NO.5）；进行PCR扩增，获取SNP rs103294分型数据。

PCR扩增中，其PCR反应体系5ul：0.625ul 10×TaqBuffer,0.1 25mM dNTP,0.12ul 10nM PCR引物Mix，0.325 25nM MgCl₂,0.1ul 5U/ML Hotstar酶, 用ddH₂O补足5ul；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 0.5min，96℃ 0.5min，72℃ 1min，45个循环；72℃ 5min，25℃ ∞min；SAP纯化反应体系2ul：0.17ul 10×SAPBuffer,0.3 1U/ul SAP酶, 用ddH₂O补足2ul；SAP纯化反应条件：37℃ 40min，85℃ 5min，25℃∞min；单碱基延伸反应体系2ul:0.2 10×iPlexBuffer,0.2 iPlex Termination,0.33 100uM 终止引物Mix，0.041 iPlex Enzyme, 用ddH₂O补足2ul；单碱基延伸反应条件：94℃ 30s；94℃ 5s，92℃ 5s-80℃ 5s，内部循环5次，外部循环40次；72℃ 180s；25℃ ∞s；将反应产物共15nL，经树脂纯化后，SpectroCHIP芯片上样；通过MassARRAY® MALDI-TOF Mass Spectrometry 进行质谱检测，并获取SNP rs103294分型数据。

本发明还提供所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4的应用，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性位点rs103294的基因分型，其中rs103294碱基为C的个体为前列腺癌易感人群。rs103294碱基为Ｔ的个体为前列腺癌非易感人群。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs103294的基因分型，其中rs103294碱基为C的个体为前列腺癌的易感人群。具体做法是：

1、基因组DNA的提取

受试者均由外周静脉血抽取2-3ml，采用QIAamp Blood Mini Kit250（QIAGEN，德国）试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存。

2、ＳＮＰ基因分型

根据SNP的序列信息，运用Sequenom公司的引物设计软件MassARRAY Assay Design 3.1（Sequenom，Inc.，San Diego，CA）设计PCR反应和单碱基扩展引物，并在生物工程（上海）有限公司合成。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应，混合后的反应产物在Sequenom iPLEX仪器上进行SNP基因分型。具体实验流程如下：

（1）引物设计：运用Sequenom公司的引物设计软件MassARRAY Assay Design 3.1（Sequenom，Inc.，San Diego，CA）为多重反应自动设计PCR引物（SEQ.ID.NO.3；SEQ.ID.NO.4）和iPLEX® Gold 单碱基延伸引物(SEQ.ID.NO.5)；

（2）PCR反应：

（A）PCR反应液（Mix）：按照下表中的顺序从上到下依次加入，单位：ul

（B）5ulPCR反应体系：取3ulPCR反应液Mix加入到384孔板的每个well中，按照96孔板至384孔板加样表的顺序用8道排枪将96孔板DNA样品转移至384孔板中，每孔2ul，配成5ul的反应体系，2000转离心1min后放入ABI9700 PCR仪中进行PCR扩增。

（C）循环参数

（3）SAP纯化反应

（A）反应体系，用1.5ml EP管中按照下述顺序配制SAP酶Mix：（单位：ul）

	单管体积	384板总体积（×460）
			H₂O	1.53	703.8
10×SAP Buffer	0.17	78.2
			SAP酶(1U/ul)	0.3	138
总计	2	920

（B）将Mix平均分布于8孔连排管，轻轻揭开384孔板封口膜，用8道排枪取2ul的Mix加入到每个孔中。取新的封口膜用刮板将侧边和四个角封紧。2000转离心1min后，在PCR仪中进行SAP酶消化。

（C）循环参数

温度（°C）	时间（min）	周期
			37	40	1
85	5	1
			25	∞	1

（4）单碱基延伸反应

（A）反应体系，在1.5mlEP管中按照下述顺序配制单碱基延伸反应Mix：（单位：ul）

（B）将Mix平均分布于8孔连排管中，轻轻揭开封口膜，用8道排枪取2ul的Mix加入到每个孔中。取新的封口膜将384孔板的侧边和四个角封紧，2000转离心1min后，在ABI9700 PCR仪中进行单碱基延伸反应。

（C）循环参数

（5）将反应产物共15nL，经树脂纯化后，SpectroCHIP芯片上样；

（6）通过MassARRAY® MALDI-TOF Mass Spectrometry 进行质谱检测，并获取SNP分型数据。

3、结果判定

Rs103294碱基为Ｃ的个体为前列腺癌易感人群，rs103294碱基为Ｔ的个体为前列腺癌非易感人群。

　　实施例２.

19q13.4遗传区域ＳＮＰ与前列腺癌的相关性

本研究通过多阶段的病例－对照研究，说明19q13.4遗传区域ＳＮＰ与前列腺癌相关联。研究以４４８４例前列腺癌患者为研究组，以８９３４例非肿瘤患者为对照组。所有受试者均提取基因组ＤＮＡ，－２０℃保存。

多阶段病例－对照研究结果显示，rs103294碱基为Ｃ的患前列腺癌的风险高，如下表：

^a TT/TC/CC

本发明关于实用性的例证：

（１）根据本发明由多态性位点rs103294判定前列腺癌易感人群的方法，可对

未表现出肿瘤临床症状的人群进行筛查，来应用于对前列腺癌辅助诊断和对个体是否具有前列腺癌易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。

（２）根据本发明提供的引物序列可以特异、高效检测出rs103294多态性位

点。

（３）位于rs103294多态性位点附近的ＤＮＡ序列还有不少ＳＮＰ位点和基因，这些遗传信息可能对前列腺癌的发生发展起到一定作用。

<110> 复旦大学上海长海医院

<120> 一种与前列腺癌易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213>

<400> 1

tagcatctga gaaggaggga agggcttgta gggtttggag agggtgtcag ggcatcaggg 60

tggatttatc ttttcctggt tgaaatctga tactctccca ttgatttagt tactgaagca 120

cgtttggaac tctgaactga agagatggag gctcaataaa gcacaccagg gagtatggca 180

atgaggaata aagaagactg tgttacacac catggaccag agcacacaga tgtgcagagg 240

tgtggatcca gccctgccat gtgggatgta gcctcatgtc taggggtggg aaaagaaggg 300

gatccaacca agggaagtca acattaatag agaggaaagg tatcacatgt taatggtcct 360

ccatggatca ccctgcaaaa tatctctgca atccaacact gattcctcct tctagaaatt 420

atcagcagac agtccagata gcattggccc taaattgtct cccggaacct cctgggatca 480

ccatatctat tcccaaggtt ycaccactct gagagatgca ttgtcctctc tgctgttcac 540

ctcctagctg catcttaggg gcttctctgg ctgtgctgag cctcaaataa cagaatcctg 600

aggaccacca ggatcaagcc agccttgccc atgtggatga gattctccac tgtgtaatcc 660

tgggggtgtg aggttgggga tggtgggcaa agagaccaca gaggtcaggg cagatcaaca 720

tcacccagga cctctggatg tccacccagg gcacccacct ccccttcaca ggacctgacc 780

ctctgtgcca gccccataac tgaaagcatc tcctcacgca ccagtcttgg ggtctgaatt 840

gttttgtgat gggctgaggg tatcagctgc tcctgagaat caaagcaaag gagaagtacc 900

ctgagccagc ctctcccatg ggctcggcat tcttatcttc ccctgtctcc tgacatgagt 960

tctaaggagt tccttagtaa actcttcctc tgtagcagtg t 1001

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213>

<400> 2

ggatcaccat atctattccc aaggttctca ccactctgag agatgcattg tcc 53

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213>

<400> 3

acgttggatg agcattggcc ctaaattgtc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213>

<400> 4

acgttggatg gaggacaatg catctctcag 30

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213>

<400> 5

cgagcaccat atctattccc aaggtt 26

Claims

1.一种与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的基因序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其第501位为T/C。

2.根据权利要求1所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上的基因序列，其特征在于，所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4上具有一单核苷多态性位点rs103294，rs103294位于LILRA3基因附近；rs103294碱基为T/C；rs103294的SNP序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种检测一单核苷酸多态性位点rs103294的特异性核酸引物，其特征在于序列为：SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，其特异性地扩增出单核苷酸多态性位点的扩增产物。

4.从权利要求2所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4基因序列，获得rs103294序列的方法，其特征在于具体步骤如下：

在遗传区域19q13.4上选择单核苷酸多态性位点rs103294；依据相应的碱基序列合成引物SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4以及UEP引物SEQ.ID.NO.5；进行PCR扩增，获取SNP rs103294分型数据。

5.从权利要求4所述的方法，其特征在于PCR反应体系5ul：0.625ul 10×TaqBuffer,0.1 25mM dNTP,0.12ul 10nM PCR引物Mix，0.325 25nM MgCl₂,0.1ul 5U/ML Hotstar酶, 用ddH₂O补足5ul；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 0.5min，96℃ 0.5min，72℃ 1min，45个循环；72℃ 5min，25℃ ∞min；SAP纯化反应体系2ul：0.17ul 10×SAPBuffer,0.3 1U/ul SAP酶, 用ddH₂O补足2ul；SAP纯化反应条件：37℃ 40min，85℃ 5min，25℃∞min；单碱基延伸反应体系2ul:0.2 10×iPlexBuffer,0.2 iPlex Termination,0.33 100uM 终止引物Mix，0.041 iPlex Enzyme, 用ddH₂O补足2ul；单碱基延伸反应条件：94℃ 30s；94℃ 5s，92℃ 5s-80℃ 5s，内部循环5次，外部循环40次；72℃ 180s；25℃ ∞s；将反应产物共15nL，经树脂纯化后，SpectroCHIP芯片上样；通过MassARRAY® MALDI-TOF Mass Spectrometry 进行质谱检测，并获取SNP rs103294分型数据。

6.一种权利要求1所述的与前列腺癌易感性相关的遗传区域19q13.4基因序列的应用，其特征在于，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性位点rs103294的基因分型，其中rs103294碱基为C的个体为前列腺癌易感人群，rs103294碱基为Ｔ的个体为前列腺癌非易感人群。