CN102533740A - 人白血病融合基因bcr-abl的rt-pcr引物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：BCR_exF：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3’；ABL_exR：5’-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3’；ABL_inF：5’-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3’；ABL_inR：5’-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3’。本发明还公开了使用上述引物对人白血病融合基因BCR-ABL进行RT-PCR的方法，根据该方法可以获得纯净单一的反转录产物，并利用巢式PCR达到定性检测BCR-ABL的存在与否和扩增出可供测序的包含14个常见ABL激酶区点突变位点的片段，该方法可显著提高人白血病融合基因RT-PCR的扩增成功率。

Description

人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物及其使用方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种临床检验技术的方法学改进，采用特异性反转录(reverse transcription，RT)引物，反转录人白血病融合基因BCR-ABL编码的p210蛋白的mRNA，包括ABL激酶区序列在内的长度1.5kb的片段。可以显著提高了RT-PCR的扩增成功率。

背景技术

慢性粒细胞白血病CML是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。95％的CML患者异常白细胞中含有一段染色体易位形成的被命名为“费城”的异常染色体。其形成机理为9号染色体的一段拼接到了22号染色体上，这种拼接形成了一个新的异常的具有致癌效果的基因BCR-ABL。BCR-ABL基因的编码蛋白具有异常的酪氨酸酶活性，使调控细胞复制的信号传导途径一直处於活跃状态，从而源源不断地产生更多的异常白血细胞，骨髓正常控制的白血细胞的生成被破坏，形成CML病症。

各国CML的发病率相对一致，约为1-2人/10万。在儿童中，CML的发病率极低，所占比例不超过儿童白血病的5％，成人中，CML占所有成人白血病的15％。CML病人在诊断后两年内的死亡率为20％到30％，而后每年25％的病人死亡，他们在确诊后的平均存活年数只有三到五年。CML大致可分为三个阶段：慢性期，加速期和暴发期。从初发阶段到暴发期，骨髓内异常细胞数目一直上升，而且扩散至骨髓外。慢性期可潜伏4到5年，在这一阶段，患者症状很轻，往往只在例常的血检时才被检测发现。加速期在6到18个月之间，这时白血球的扩增往往已难用常规疗法控制。而在最后的暴发期，患者只能存活1到6个月。

格列卫是一种新型的治疗CML的小分子化学药物，活性成份为甲磺酸伊马替尼，广泛用于治疗慢性髓性白血病(CML)急变期、加速期或α-干扰素治疗失败后的慢性期患者。它直接定靶于导致CML的异常酪氨酸激酶BCR-ABL，通过抑制这个酶的活性从而抑制更多的癌细胞的产生，同时它能诱导已生成的癌细胞的凋亡。这种定靶的专一性使它的治疗效率提高和副作用大大减小，95％的病人在服药一到三个月之后就可见到药效，癌细胞减少，血细胞数目可回到正常值。

研究发现对处于CML暴发期的病人，格列卫先有作用，而后疾病可能复发。据估计，大约有5％至10％的处在慢性阶段的病人会对格列卫产生抗性，并且如果在较晚阶段才开始治疗CML，这个百分比则更高。其原因可能是因为BCR-ABL融合基因ABL激酶区序列发生突变，导致BCR-ABL蛋白发生变异，构象变化，格列卫不再能与变异的蛋白结合来抑制其活性。约80％的耐药是由于BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的，已报道的突变超过50种。

目前发现的ABL激酶区突变主要集中于ATP结合区(P环，第244～255氨基酸)、T315、M351及活化区(A环)四个区，不同突变位点引起的耐药程度不同。部分突变患者可以对新型的激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib，BMS-354825)或尼罗替尼(Nilotinib，AMN 107)有治疗反应，可作为格列卫的替代用药。发生于P环的突变耐药性强，如G250E、Y253H及E255K等突变耐药程度都很高。目前报道的突变中，尤以T315I耐药程度最高，是惟一报道对所有激酶抑制剂都耐药的突变。这些高度耐药的突变预后差，需尽早改用其他治疗方案。而M351T、E355G、M244V等耐药程度不高，可以通过提高剂量来抵抗耐药。因此，在用格列卫化疗前对患者的融合基因ABL激酶区进行测序，可以有效地为综合定量监测和格列卫耐药突变等情况做一个评估，根据每位患者的病情和疾病的发展，进行精确的个体化治疗。

Sanger测序法是目前公认的，运用于大多数临床分子诊断项目的金标准，其特异性达到100％，是分子准段赖以开展的经典技术平台。因此用采用Sanger测序法对BCR-ABL融合基因编码产物的激酶区序列进行突变检测，具有稳定可靠，特异性好的优点，可有效避免假阳性的发生。

为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目特点，建立一个稳定可靠的RT-PCR体系。该项目的RT-PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液白细胞中的mRNA，由于临床标本物流运输中存在着众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血样本，因此获得的mRNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于融合基因拼接点离需要检测的ABL激酶区较远，因此RT-PCR需要扩增的片段较大，约有1.5kb，故对反转录的过程要求较高。

目前众多的反转录试剂盒都推荐采用随机引物对mRNA进行反转录。随机引物又称随机扩增多态性DNA，一般是长度为六到九个碱基的核苷酸序列，每个碱基随机选取四种碱基中的一种。用随机引物对mRNA进行扩增可得到大量的非特异性cDNA片段，为之后的目的基因扩增提供模板。虽然随机引物所得cDNA产物包含大量的片段信息，可供克隆各种基因组序列，但是随机引物的特异性不佳，对于mRNA拷贝数低的一些基因，其反转录的效果不理想，很可能导致之后的PCR扩增失败，或产生非特异性的产物。而针对目的基因mRNA序列设计特异性的反转录引物，则可获得更加纯净单一的反转录产物，因此比较适合用于一些的拷贝数目的mRNA的反转录。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明针对人白血病融合基因BCR-ABL设计出RT-PCR引物，根据该引物可以获得纯净单一的反转录产物，显著提高人白血病融合基因RT-PCR的扩增成功率。

一种人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

BCR_ex F：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3’

ABL_ex R：5’-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3’

ABL_in F：5’-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3’

ABL_in R：5’-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3’。

本发明还提供了一种使用上述引物对人白血病融合基因BCR-ABL进行RT-PCR的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取人血中白细胞mRNA；

2)用ABL_ex R进行RT反应，得反转录反应产物；

3)以步骤2的反转录反应产物为PCR反应模板，以BCR_ex F和ABL_ex R为上下游引物进行第一轮PCR扩增，得扩增产物；

4)取步骤3的扩增产物，以ABL_in F和ABL_in R为引物进行第二轮PCR扩增，得到扩增产物，用于测序检测。

进一步地，步骤3的PCR反应优选按以下条件进行扩增：94℃ 2min；98℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 110s、35个循环；68℃ 5min。

步骤4的PCR反应优选按以下条件进行扩增：94℃ 2min；98℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 50s、35个循环；68℃ 5min。

现有技术中，用随机引物进行RT-PCR，扩增包含ABL激酶区序列的BCR-ABL cDNA片段序列(全长1.5kb)效果较差，容易导致PCR失败或者产生非特异性扩增。为提高RT-PCR的灵敏度，有效得到所需长度的片段，本发明设计了针对BCR-ABL基因序列(参考序列：NM_004327.3和NM_005157.4)的特异性引物序列来替代原来的随机引物反转录法。

本发明根据BCR-ABL的常见断裂点，在融合基因ABL片段第8外显子序列上设计一反向引物作为特异性的反转录引物。反转录后再设计两对引物作巢式PCR(nested-PCR)，其中外侧引物扩增片段长1.5kb，扩增片段范围从BCR第13外显子3’端至ABL的第8外显子3’端，包含拼接点。内侧引物以外侧引物1.5kb扩增产物为模板，扩增出一段包含14个常见ABL激酶区点突变位点的长约0.7kb的片段，并用于测序检测。RT-PCR扩增引物设计构思图详见附图1。

本发明对人白血病融合基因BCR-ABL进行RT-PCR的方法具体如下：取一份人类白细胞RNA提取物(1-3μg)，采用ABL特异性反转录引物ABL_ex R进行RT反应，反应后的产物取1μl，以BCR_ex F和ABL_ex R为上下游引物进行第一轮PCR扩增，其产物再取1μl并作100倍稀释后用ABL_in F和ABL_in R为引物作第二轮PCR，产物用于测序。

本发明针对人白血病融合基因BCR-ABL设计出RT-PCR引物，根据该引物使用本发明的RT-PCR方法可以获得纯净单一的反转录产物，可显著提高人白血病融合基因RT-PCR的扩增成功率。

附图说明

图1是本发明RT-PCR扩增引物设计构思图。其中，实线箭头表示RT引物及RT进行的方向，虚线箭头和半箭头分别表示外侧和内侧上下游引物。

图2是本发明采用特异性反转录引物与现有技术采用随机引物相比较，外侧引物PCR结果图。

图3是外侧引物PCR产物用内侧引物作第二轮PCR的结果图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物如下表所示：

使用上述引物对人白血病融合基因BCR-ABL进行RT-PCR：

1.RNA的提取：采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)提取全血中白细胞的mRNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。

2.取白细胞RNA提取物10ul(浓度100-200ng/ul)，与1μl(10pmol)反转录引物(ABL_exR)相混合，65℃5分钟，立即转移至冰上放置1分钟。

3.在上述反应体系中，加入反转录酶(Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit)1μl，反应缓冲液(Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit)4μl和DEPC水4μl，总体积为20μl，然后37℃水浴60分钟，随后转至98℃，5分钟。

4.取反转录反应产物1μl，作为PCR反应模板。以BCR_ex F和ABL_ex R为上下游引物进行第一轮PCR扩增。PCR反应体系为20μl，具体配方如下：

首轮PCR反应的条件如下：

Stage1：94℃ 2min

Stage2：98℃ 10s

55℃ 30s

68℃ 110s

35个循环

Stage3：68℃ 5min。

PCR产物取3ul用于琼脂糖电泳鉴定。结果如图2所示。从图二中可以看出采用特异性引物反转录后首轮PCR的成功率(8/8)明显优于随机引物组(3/8)。

5.将首轮PCR产物作100倍稀释后取1-2μl用于第二轮PCR，ABL_in F和ABL_in R为引物，体系配置同首轮。

第二轮PCR反应条件设定如下：

Stage1：94℃ 2min

Stage2：98℃ 10s

55℃ 30s

68℃ 50s

35个循环

Stage3：68℃ 5min

PCR产物取3ul用于琼脂糖电泳鉴定。结果如图3所示。根据图三可知，本发明特异性反转录方案的第二轮PCR的产物特异性也好于随机引物组，后者多个样本存在着大小异常的非特异性扩增产物(随机引物组第1、6、8泳道)。

实施例2

临床样本验证：收集50例CML病人的全血标本进行实验，使用本发明的引物进行RT-PCR，结果如下表所示。

从上表结果可知，有44例样本在第一轮(外侧)PCR后经电泳检测呈阳性，第二轮(内侧)PCR后经电泳检测也呈阳性，成功扩增出一段包含ABL激酶区序列在内的长约0.7kb的片段。有3例样本在第一轮(外侧)PCR后经电泳检测呈弱阳性，第二轮(内侧)PCR后经电泳检测呈阳性，仅有3例样本在第一轮和第二轮PCR后经电泳检测呈阴性。成功率为94％。

序列表

 

<110>  杭州艾迪康医学检验中心有限公司

 

<120>  人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物及其使用方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ttccgctgac catcaataag                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cgcatgagtt catagacctt                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cgagttggtt catcatcatt ca                                              22

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ccttctctag cagctcatac a                                               21

 

Claims (4)

1.一种人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

BCR_ex F：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3’

ABL_ex R：5’-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3’

ABL_in F：5’-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3’

ABL_in R：5’-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3’。

2.一种使用权利要求1所述引物对人白血病融合基因BCR-ABL进行RT-PCR的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取人血中白细胞mRNA；

2）用ABL_ex R进行RT反应，得反转录反应产物；

3）以步骤2的反转录反应产物为PCR反应模板，以BCR_ex F和ABL_ex R为上下游引物进行第一轮PCR扩增，得扩增产物；

4）取步骤3的扩增产物，以ABL_in F和ABL_in R为引物进行第二轮PCR扩增，得到扩增产物，用于测序检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3的PCR反应按以下条件进行扩增：94 ℃  2 min；98 ℃  10s、55 ℃  30s、68 ℃  110 s、35 个循环；68 ℃  5 min。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4的PCR反应按以下条件进行扩增：94 ℃  2 min；98 ℃  10s、55 ℃  30s、68 ℃  50s、35 个循环；68 ℃  5 min。

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