CN103476949A - 与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂相关的标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）治疗的患者中监测药效（PD）标志物的差别基因表达的方法、通过测量PD标志物测定细胞对CDKI的敏感性的方法，以及筛选候选CKDI的方法。
Description
技术领域
本发明涉及药物基因组学领域，以及药效标志物的用途，所述药效标志物用于以下患者对治疗的应答、癌症敏感性和化合物筛选。
背景技术
蛋白激酶构成了在结构上相关的负责控制细胞内多种信号转导过程的酶的大家族。（Hardie，G.和Hanks，S.The Protein Kinase Facts Book，I和II，Academic Press，San Diego，CA：1995）。可以通过激酶磷酸化的底物，将它们分类至家族（例如，蛋白-酪氨酸、蛋白丝氨酸/苏氨酸、脂类等）。
许多疾病都与蛋白激酶介导的上述事件所引发的异常细胞应答相关。这些疾病包括但不限于，自身免疫疾病、炎性疾病、骨病、代谢疾病、神经系统疾病和神经变性疾病、癌症、心血管疾病、过敏反应和哮喘、阿尔茨海默病、病毒性疾病和激素相关的疾病。例如，已经成功地将Gleevec（酪氨酸激酶抑制剂）用于慢性髓性白血病和胃肠间质瘤的治疗。
细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）复合体是一类目标靶激酶。CDK参与细胞周期进程和细胞转录，并且生长控制的丧失与疾病中异常的细胞增殖相联系（Malumbres和Barbacid，Nat.Rev.Cancer2001，1：222）。已经显示，细胞周期蛋白依赖性激酶的活性的增加或者暂时地异常激活会导致人类肿瘤的发展（Sherr C.J.，Science1996，274：1672-1677）。事实上，人类肿瘤的发展通常与CDK蛋白自身或其调节子的改变相关（Cordon-Cardo C.，Am.J.Pathol.1995；147（3）：545-560；Karp J.E.和Broder S.，Nat.Med.1995；1：309-320；Hall M.，Adv.Cancer Res.1996；68：67-108）。
CDK7和CDK9分别在转录起始和延伸中发挥关键作用（参见例如，Peterlin和Price2006，Cell23：297-305，Shapiro.J.，Clin.Oncol.2006；24：1770-83）。通过下调抗凋亡蛋白如MCL1的转录，CDK9的抑制与直接诱导造血谱系的肿瘤细胞的凋亡相联系（Chao S.-H.，J.Biol.Chem.2000；275：28345-28348；Chao，S.-H.，J.Biol.Chem.2001；276:31793-31799；Lam，Genome Biology20012：1-11；Chen，Blood2005；106：2513；MacCallum，Cancer Res.2005；65:5399；和Alvi，Blood2005；105：4484）。在实体瘤细胞中，通过CDK9活性的下调导致的转录抑制与细胞周期CDK如CDK1和2的抑制的协同作用来诱导凋亡（Cai,D.-P.,Cancer Res.2006,66：9270）。通过CDK9或CDK7抑制的转录对肿瘤细胞类型具有选择性非增殖作用，其取决于具有短半寿期的mRNA，例如套细胞淋巴瘤中细胞周期蛋白D1的转录。一些转录因子如Myc和NF-κB选择性招募CDK9到其启动子，并且依赖于这些信号途径活化的肿瘤可能对CDK9抑制是敏感的。
某些CDK抑制剂通过抑制正常未转化细胞的细胞周期进程的能力，而用作化疗保护剂（chemoprotective agent）（Chen,J.,Natl.Cancer Instit.,2000；92：1999-2008）。在使用细胞毒性剂之前用CDK抑制剂预处理癌症患者可以降低通常与化疗相关的副作用。通过选择性CDK抑制剂的作用，可保护正常增殖的组织免于细胞毒效应。
发现指示治疗是有效的药效（PD）标志物可以是有价值的。可以将此类标志物用于监测正在接受治疗的那些患者的应答。如果PD标志物指示患者没有对治疗适当地应答，那么可以增加、减少或者完全中断施用的剂量。因此，存在研发与CDK抑制剂相关的PD标志物的需求。该方法确保患者接受最适当的治疗。
在研发CDK抑制剂中，PD标志物可以帮助了解施用后作用的机制。作用机制可能涉及细胞周期中调节机制的复杂级联，并且可以在药物研发的临床前的阶段进行这种分析，以测定候选CDK抑制剂的特定活性。在药效研究中特别感兴趣的是鉴定有活性的特定标志物，例如本文中所公开的标志物。
发明概述
本发明涉及分析表2中所鉴定的若干基因，所述基因作为CDK抑制剂（下文中称为“CDKI”）活性的特定药效（PD）标志物。特别地，本发明涉及在CDKI治疗后上调或下调所鉴定的基因的表达。可将PD标志物用于确定患者接受了正确的疗程。本发明是“个体化医疗”的实例，其中基于对患者特异的功能基因组标记来治疗患者。
本发明包含监测患者对治疗应答的方法。该方法包括以下步骤：将任意（any与any one不同）CDKI施用给患者，并测量从患者获得的生物样品的基因表达。基于检测来自表2的至少一种生物标志物的基因表达，来评价患者的应答。与基线比较，至少一种PD标志物的表达水平的检测和/或改变，可以指示患者对治疗的应答。表达水平的模式的改变可以指示有利的应答或者不利的应答。
附图简述
图1显示用CDKI(7)或CDKI(8)处理的细胞的IC50值。
图2显示了用CDKI(7)处理后，两种不同细胞系中的差别基因表达。
图3显示了当用CDKI(8)、CDKI(11)或放线菌素D处理细胞时，MEPCE表达的降低。
图4显示了用CDKI(7)处理后，MEPCE和LARP7蛋白水平的差异表达。
图5显示了用CDKI(7)处理的肺癌细胞系中，参与凋亡调节的基因的差别基因表达。
图6显示了当用CDKI(7)处理时，狗白细胞中MEPCE表达的降低。
图7显示了当用CDKI(7)处理时，狗白细胞中MYC表达的降低。
图8显示了当用CDKI(7)处理时，狗白细胞中MCL1表达的降低。
图9显示了当用CDKI(12)处理时，狗白细胞中MEPCE表达的降低。
图10显示了当用CDKI(12)处理时，狗白细胞中MYC的表达未降低。
图11显示了当用CDKI(12)处理时，狗白细胞中MCL1的表达未降低。
发明详述
在一个方面，本公开涉及分析表2中所鉴定的若干基因，所述基因可作为药效（PD）标志物。CDKI治疗后PD标志物表达的增加或减少指示抑制剂是有效的。基于检测来自表2的至少一种PD标志物的差别基因表达，来评价患者的应答。与基线相比，至少一种PD标志物的表达水平的检测和/或改变，指示了CDKI活性，并且这与患者对治疗的应答相关。表达水平的模式的改变可以指示有利的患者应答或者不利的患者应答。
因此，本公开提供了监测患者对用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）进行的治疗的应答的方法，该方法包括：
a)施用至少一种CDKI；
b)在生物样品中测量选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达，所述生物样品从已经施用CDKI的患者获得；和
c)将至少一种PD标志物的差别基因表达与对照样品中至少一种PD标志物的基因表达比较。
在本方法中，PD标志物选自：MEPCE（SEQ ID NO:1）、MCL1（SEQID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
在本方法中，PD标志物是MEPCE（SEQ ID NO:1）。
在本方法中，测量至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
在本方法中，至少一种PD标志物的基因表达是降低的。
在本方法中，测量至少两种PD标志物的基因表达。
本方法还包括在施用CDKI之前，从患者获得生物样品。
在本方法中，生物样品获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
在本方法中，CDKI抑制CDK9。
在本方法中，CDKI选自表1。
在本方法中，CDKI以治疗有效量施用。
在本方法中，调整后续施用给患者的CDKI的治疗有效量。
在本方法中，在至少两个不同的时间点测量PD标志物的差异表达。
在本方法中，在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
在本方法中，在步骤a)施用两种不同的CDKI。
在本方法中，同时施用两种不同的CDKI。
在本方法中，在不同的时间点施用两种不同的CDKI。
测定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）的敏感性的方法，该方法包括：
a)将细胞与至少一种CDKI接触；
b)测量与CDKI接触的细胞中的选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达；和
c)将差别基因表达与来自未处理的或经安慰剂处理的对照细胞的基因表达比较。
在本方法中，PD标志物选自：MEPCE（SEQ ID NO:1）、MCL1（SEQID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
在本方法中，PD标志物是MEPCE（SEQ ID NO:1）。
在本方法中，测量至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
在本方法中，至少一种PD标志物的基因表达是降低的。
在本方法中，测量至少两种PD标志物的基因表达。
在本方法中，所述细胞获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
在本方法中，CDKI抑制CDK9。
在本方法中，CDKI选自表1。
在本方法中，在至少两个不同的时间点测量PD标志物的差异表达。
在本方法中，在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
在本方法中，在步骤a)所述细胞接触两种不同的CDKI。
在本方法中，所述细胞同时接触两种不同的CDKI。
在本方法中，所述细胞在不同的时间点接触两种不同的CDKI。
筛选CDKI候选物的方法，该方法包括：
a)将细胞与CDKI候选物接触；
b)在与CDKI候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达；和
c)将用CDKI候选物接触的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达与用取自表1的CDKI接触的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达以及未处理的或经安慰剂处理的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达比较。
在本方法中，PD标志物选自：MEPCE（SEQ ID NO:1）、MCL1（SEQID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
在本方法中，PD标志物是MEPCE（SEQ ID NO:1）。
在本方法中，测量至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
在本方法中，至少一种PD标志物的基因表达是降低的，指示CDKI候选物是CDK抑制剂。
在本方法中，筛选是针对CDK9抑制剂的。
在本方法中，将CDKI候选物的差别基因表达与选自表1的CDKI的差别基因表达比较。
在本方法中，细胞获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
在本方法中，在至少两个不同的时间点测量PD标志物的差异表达。
在本方法中，在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
可以将本文中提及的PD标志物用于监测患者对治疗的应答。例如，取决于如通过表2中公开的PD标志物的差异表达所测量的患者对CDKI的应答，可以调整剂量、引入其他治疗、预示和防止毒性反应或其他不利事件、或者中断治疗。
定义
如在说明书和权利要求中所用，除非上下文明确指出，单数形式“一个”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
全部数字指定，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其通过0.1的增量（＋）或（－）而改变。应当理解，尽管并不总是明确指明，但术语“约”处于全部数值指定的前面。也应当理解，尽管并不总是明确指明，但本文中所述的试剂仅仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。
术语“药效标志物”或“PD标志物”在本文中可互换使用。药效标志物是基因，并且核酸或多肽水平的存在、不存在或差异表达用于测定施用的CDKI是否有效。例如，细胞与任一种CDKI接触后，当与接触CDKI抑制剂前或者经安慰剂处理/未处理对照的MEPCE表达相比时，MEPCE基因的mRNA表达是降低的。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指任意长度的核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物）的多聚形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段（例如，探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组的多核苷酸、分枝的多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
“基因”指含至少一个可读框（ORF）的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的多肽或蛋白质。可以将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
“基因产物”或备选地“基因表达产物”指基因转录和翻译时产生的氨基酸（例如，肽或多肽）。
术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸（subunit amino acid）的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
如本文中所用，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链很长，那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
术语“分离”意为与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常与其相关的组分、细胞组分及其他分离。在本发明的一个方面，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例如在染色体上通常与其相关的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要“分离”，以将其与其天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“经稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一体积的浓缩物或者分子数在“浓缩的”形式中更多或者在“分离的”形式中更少。在一级序列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，在天然状态下所述真核细胞产生所述蛋白质。
当在多核苷酸操作的上下文中使用时，“探针”指寡核苷酸，其提供为通过与靶标杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质包括酶。
“引物”是通常具有游离的3'-OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的样品中可能存在的靶标或“模板”结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链反应”（“PCR”）是这样的反应：使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或“一套引物”，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR：A Practical Approach，M.MacPherson等人，IRL Press at Oxford University Press（1991）中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为“复制”。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA或RNA印迹分析中的探针（Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版（1989））。
如本文中所用，“表达”指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
当将“差异表达”应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基因编码的蛋白质产物的差异产生。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以是过量表达或者低表达（underexpress）。然而，如本文中所述，过量表达是增加的基因表达，并且通常比在正常或对照对应细胞或组织中检测到的基因表达高至少1.25倍，或备选地至少1.5倍，或备选地至少2倍，或备选地至少4倍。如本文中所用，低表达是降低的基因表达，并且通常比在正常或对照对应细胞或组织中检测到的基因表达低至少1.25倍，或备选地至少1.5倍，或备选地至少2倍，或备选地至少4倍。术语“差异表达”还指在细胞或组织中可以检测到表达，而在对照细胞或组织中不能检测到表达。
由于基因的过量表达或者基因拷贝数的增加，可以存在基因的高表达水平。由于负调节子的下调或缺失，基因还可以翻译成更多的蛋白质。
“基因表达谱”指多个样品中出现的至少一种PD标志物的表达的模式，并且反映了这些样品例如组织型样品对特定处理、或者细胞中特定生物学过程或途径的激活应答所共有的性质。此外，基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通过将样品随机分配成两组实现的准确性更高。可以将基因表达谱用于预测未知状态的样品是否共有这样的共同性质。期望的是在至少一种PD标志物的水平与典型谱之间有一些变化，但在统计学上，表达水平与典型谱在整体上相似是不可能的，因为在不共有表达谱所反映的共同性质的样品中，只能偶然观察到相似性。
术语“cDNA”指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制备成cDNA。“cDNA”文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述mRNA全部转变成cDNA分子，然后插入到“载体”（在添加外源DNA后可以继续复制的其他DNA分子）中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可以针对特定的目的cDNA（和由此得到的mRNA）探测文库。
如本文中所用，可互换使用的“固相支持物”或“固相支持体”并不限于特定类型的支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉纱、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，“固相支持体”还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚苯乙烯（例如，获自Bachem Inc.，PeninsulaLaboratories的PAM-r树脂）、polyHIPE(R)TM树脂（获自Aminotech，加拿大）、聚酰胺树脂（获自Peninsula Laboratories）、用聚乙二醇嫁接（graft）的聚苯乙烯树脂（TentaGelRTM，Rapp Polymere，Tubingen，德国）或者聚二甲基丙烯酰胺树脂（获自Milligen/Biosearch，California）。
还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCT WO97/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利No.5,405,783；5,412,087和5,445,934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
作为实例，通过使用基于芯片如Affymetrix HG-U133-Plus-2GeneChipsTM来测量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的系统中，有可能高通量、实时定量大量目的基因的RNA。
术语“严格杂交条件”指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括：温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是：65℃-68℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者42℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺（参见Sambrook，上文)。“中等严格”杂交的实例是条件：50℃-65℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者37℃-50℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和20%甲酰胺。当期望适量的核酸错配时，使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以包括02.X-0.1X SSC/0.1%SDS和42℃-68℃的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格性。
当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为“退火”，并且将这些多核苷酸描述为“互补”。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是“互补的”或者“同源的”。根据通常公认的碱基配对规则，按照相对链中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化“互补性”或“同源性”（一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度）。
多核苷酸或多核苷酸区（多肽或多肽区）与另一序列具有“序列同一性”的确定百分比（例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%）指的是，当比对时，在比较的两个序列中，碱基（或氨基酸）的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等人,eds.,(1987)Supplement30,section7.7.18,Table7.7.1中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数：遗传密码=标准；过滤=无；链=两条；截断=60；期望值=10；Matrix=BLOSUM62；描述=50个序列；排序=高得分；数据库=非冗余的。
术语“细胞增殖性病症”应当包括表征为异常细胞生长和/或分裂或者功能丧失的正常生理功能的调节异常。“细胞增殖性病症”的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
如本文中所用，术语“赘生性细胞”、“肿瘤性疾病”、“瘤形成”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”、“癌细胞”（可互换使用）指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增殖控制（即，下调细胞分裂）的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或者良性的。转移的细胞或组织指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。
术语“癌症”指癌症疾病，其包括例如癌（例如，肺癌、黑素瘤、骨髓病症（例如，髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和红白血病）、淋巴细胞白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌和肉瘤（例如，骨肉瘤）。术语“PBMC”指外周血单核细胞，并包括“PBL”-外周血淋巴细胞。
“抑制”肿瘤生长表示当与未与CDKI化合物接触的肿瘤生长相比，肿瘤细胞生长的减慢。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞生长，其包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增殖、通过FDG-PET（氟代脱氧葡萄糖正电子成像术）成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部：减缓、延迟和终止肿瘤生长，以及肿瘤缩小。
“组合物”是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的（例如，可检测的试剂或标记）或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99.99%的药物赋形剂和添加剂，例如：可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖（例如，糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物）。糖赋形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA）、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
术语“载体”还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐（tromethamine hydrochloride）或磷酸盐缓冲液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖（聚合的糖）、葡聚糖结合剂（例如，环糊精，如2-羟丙基-正交（quadrature）-环糊精）、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂（例如，聚山梨醇酯如TWEEN20TM和TWEEN80TM）、脂（例如，磷脂、脂肪酸）、类固醇（例如，胆固醇）和螯合剂（例如，EDTA）。
如本文中所用，术语“可药用载体”包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见Remington’s PharmaceuticalScience.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1975)和the Physician’s DeskReference,52nd ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)中。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药时施用有效量。
“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
如本文中所用，细胞周期蛋白D激酶的“抑制剂”降低了细胞周期蛋白D激酶的效应。这种抑制可以包括例如，激酶活性的降低或者转录延伸的减少。
目前，已经将许多基因鉴定为CDKI的PD标志物。可以将本文中所鉴定的一种或多种PD标志物的基因表达的减少或增加用于确定CDKI是否具有期望的作用，例如，施用CDKI后基因表达的降低或低表达。作为实例，用CDKI处理2小时后，MEPCE的基因表达的降低可以提供CDKI是否有效的信息。CDKI PD标志物的列表见于表2中。
CDK抑制剂（CDKI）是化合物，其是CDK9的抑制剂，并且可将其与本发明方法结合。由于CDK9是转录延伸的下游效应子，所以可以将CDKI用于在人类或动物（其中显示了CDK9的抑制）中使用的药物组合物中，例如用于治疗肿瘤和/或癌细胞生长。特别地，可将此类化合物用于治疗人类癌症，因为这些癌症的进程至少部分依赖于转录延伸，因此对于通过干扰CDK9活性来进行治疗是敏感的。可将CDKI化合物用于治疗例如癌（例如，肺癌、黑素瘤、骨髓病症（例如，髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和红白血病）、淋巴细胞白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌和肉瘤（例如，骨肉瘤）。CDKI化合物的列表见于表1中。
表1-CDKI化合物
基因表达的测量
可以通过任何合适的方法检测基因表达，其包括例如检测由基因转录的mRNA的量或者由基因转录出的mRNA逆转录产生的cDNA的量或者由基因编码的多肽或蛋白质的量。基于样品或者改良的高通量分析，可以在样品上进行这些方法。例如，使用AffymetrixTMU133微阵列芯片。
在一个方面，通过与探针杂交来检测和定量基因表达，所述探针与该PD标志物的合适探针特异地杂交。使用本领域已知的方法，还可以将探针与用于高通量筛选测定的固相支持体连接。例如，WO97/10365和美国专利No.5,405,783、5,412,087和5,445,934公开了可以含有本文中所公开的一个或多个序列的高密度寡核苷酸芯片的构建。使用美国专利No.5,405,783、,412,087和5,445,934中公开的方法，在衍生的玻璃表面合成本发明探针。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性地去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
在一个方面，通过将核酸样品暴露于经探针修饰的芯片，来测定基因的表达水平。例如用荧光标记，优选地在扩增步骤期间标记提取的核酸。在合适的严格水平进行经标记的样品的杂交。使用检测设备定量测量探针-核酸杂交的程度。参见美国专利No.5,578,832和5,631,734。
备选地，使用已知技术可以测定基因拷贝数、转录或翻译中的任一种。例如，可以使用扩增方法如PCR。PCR的一般步骤教导于MacPherson等人，PCR：A Practical Approach,（IRL Press at Oxford University Press（1991））中。然而，用于每一应用反应的PCR条件是由经验确定的。许多参数都影响反应的成功。尤其是退火温度和时间、延伸时间、Mg2+和/或ATP浓度、pH和引物的相对浓度、模板，以及脱氧核糖核苷酸。扩增后，可以通过琼脂糖凝胶电泳，之后用溴化乙锭染色和紫外照明来显示，检测得到的DNA片段。
在一个实施方案中，通过检测与样品核酸连接的一个或多个标记，来检测杂交的核酸。可以通过本领域技术人员熟知的任意的多种方法掺入标记。然而，在一个方面，在制备样品核酸的扩增步骤期间，同时掺入标记。因此，例如使用经标记的引物或经标记的核苷酸进行的聚合酶链反应（PCR）可以提供经标记的扩增产物。在分离的实施方案中，使用经标记的核苷酸（例如，荧光素标记的UTP和/或CTP）进行如上所述的转录扩增，将标记掺入到转录的核酸中。
备选地，可以将标记直接加入到最初的核酸样品（例如，mRNA、多聚A、mRNA、cDNA等）中或者在扩增完成后直接加入到扩增产物中。将标记与核酸连接的方法是本领域技术人员熟知的，并包括例如，通过核酸的激酶的作用进行切口平移或末端标记（例如，使用经标记的RNA），随后将结合了样品核酸的核酸接头与标记（例如，荧光团）结合（连接）。
适用于本发明的可检测标记包括可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。用于本发明的标记包括用经标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠（例如，DynabeadsTM）、荧光染料（例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等）、放射性标记（例如，3H、125I、35S、14C或32P）、酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其他酶），以及热量标记如胶体金或有色玻璃或塑料（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等）珠。教导此类标记的用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
标记的检测是本领域技术人员熟知的。因此，例如可以使用胶片或者闪烁计数器检测放射性标记、可以使用检测发射光的光检测器检测荧光标记。通常通过提供酶和底物，并检测由于酶对底物作用而产生的反应产物来检测酶标记，以及通过简单的可视化颜色标记来检测热量标记。
如在WO97/10365中所述，可以在杂交之前或之后，将可检测标记加入到靶（样品）核酸中。这些可检测标记在杂交之前直接与靶（样品）核酸连接或者掺入到靶（样品）核酸中。相反，“间接标记”是在杂交后与杂种双链体结合。通常，在杂交后间接标记与结合部分连接，所述结合部分已经与靶核酸连接。例如，可以在杂交之前生物素化靶核酸。杂交后，亲和素缀合的荧光团会结合携带生物素的杂种双链体，其提供的标记是容易检测的。标记核酸和检测经标记的杂交核酸方法的详细综述参见Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第24卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，P.Tijssened，Elsevier，N.Y.（1993）。
多肽的检测
还可以通过检查蛋白质产物来测定PD标志物的表达水平。检测蛋白质水平涉及(a)施用至少一种CDKI；和(b)在从已经施用CDKI的患者获得的样品中测量选择性识别并结合PD标志物的多肽的抗体与PD标志物之间发生的免疫特异性结合的量；和(c)将至少一种PD标志物的免疫特异性结合的量与对照样品比较。
在蛋白质分析领域中可利用多种技术。它们包括但不限于，放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“夹层”免疫测定法、免疫放射分析、原位免疫测定法（使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记）、蛋白印迹分析、免疫沉淀测定法、免疫荧光测定法、流式细胞术、免疫组织化学、共聚焦显微镜、酶测定法、表面等离质子共振和PAGE-SDS。
PD标志物和CDKI治疗的测定
可以在疗程期间连续地或间歇地将一个剂量的CDKI施用给患者。测定施用的最有效的方法和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并可以根据用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的靶细胞，以及治疗的受试者而变化。使用治疗医师选定的剂量水平和模式，可以实施单次或多次施用。可以通过经验调整合适的剂量制剂和施用试剂的方法。
在CDKI施用后测定PD标志物，以确定CDKI是否有效。此外，可以在CDKI单次施用后在多个时间点测定PD标志物。例如，施用最初的CDKI丸剂，并在第一次治疗后的第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时测定PD标志物。
可以在每次施用CDKI后测定PD标志物，如果存在多次CDKI施用，那么可以在每次施用后测定PD标志物。患者可以进行多次CDKI施用，然后在不同时间点测定PD标志物。例如，疗程可能需要施用起始剂量的CDKI、特定的时间段后施用第二剂量的CDKI，以及在第二剂量后数小时施用第三剂量的CDKI。可以在施用每一剂量的CDKI后第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时测定PD标志物。
在不同时间点测定不同的PD标志物也在本公开的范围内。不受任何一个理论的束缚，由于CDKI和PD标志物的作用机制，延迟了对CDKI的应答，在施用后的任何时间测定PD标志物。例如，第一PD标志物是早期应答CDKI的标志物，在施用后0-4小时内的任何时间测定所述第一PD标志物。然后，在施用CDKI后4-8小时内的任何时间测定第二PD标志物。在每次施用CDKI后至少一种PD标志物的测定可以为治疗方法、剂量和疗程提供指导。
最后，在测定至少一种PD标志物后施用不同的CDKI。在这种实施方案中，从表1中选择一种以上的CDKI，并施用给患者。在施用每一不同的CDKI后，可以测定至少一种PD标志物。该测定法还可以在施用不同的CDKI后的多个时间点进行。例如，可以将第一CDKI施用给患者，并在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时测定PD标志物。然后施用第二CDKI，并在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时再次测定PD标志物。
本公开的另一方面提供了评估CDKI的合适剂量水平的方法，其包括施用CDKI后，监测表2中所鉴定的基因中的至少1种的差异表达。例如，施用第一CDKI丸剂后，分析PD标志物，并基于该结果，推荐CDKI剂量的增加。施用更高剂量的CDKI后，PD标志物的分析将确定更高剂量是否提供了期望的益处，例如抑制肿瘤生长。
可以制备评估CDKI的活性的试剂盒。例如，可以将包含用于表2中所列基因的PCR或微阵列杂交的核酸引物的试剂盒用于评估CDKI活性。备选地，可以将提供了表2中所列的至少一种基因的抗体的试剂盒用于测定CDKI活性或者抗性。
本领域熟知尤其是治疗延长的时候，癌症可以对化学治疗产生抗性。在用任何化学治疗延长治疗后，可以进行PD标志物的差异表达的测定，以确定癌症是否对CDKI敏感。例如，激酶抑制物如Gleevec可以强烈抑制特定的激酶，但也会微弱地抑制其他激酶。也存在不同于本文中所述的CDKI的其他CDK抑制剂。如果患者以前已经用另一种激酶抑制剂或另一类型的CDK抑制剂治疗，那么测定表2中PD标志物可为患者提供有用的信息以确定肿瘤是否对CDKI敏感。该测定法对癌症曾经缓解然后再生长或者已经转移到不同部位的患者是特别有益的。
筛选CDK抑制剂
有可能将本发明CDKI和PD标志物用于筛选其他CDK抑制剂。该方法包括，将细胞与CDK抑制剂候选物接触，测量表2中所列的至少一种PD标志物的差别基因表达，并将结果与接触了表1的CDKI的细胞的差异表达以及对照细胞中至少一种PD标志物的表达比较。例如，候选CDK抑制剂可以与表1中所列的CDKI一样强烈地降低PD标志物的表达。可以通过前述方法，例如PCR或微阵列分析进行PD标志物表达的测量。
表2
实施例
实施例1
分析了5种细胞系：NCI-H929，多发性骨髓瘤细胞系（ATCC Cat.#CRL-9068）；NCI-H441，肺乳头状腺癌细胞系（ATCC Cat.#HTB-174）；A375，黑素瘤细胞系（ATCC Cat.#CRL-1619）；A2058，黑素瘤细胞系（ATCC Cat.#CRL-1147）和U-87-MG，成胶质细胞瘤细胞系（ATCC Cat.#HTB-14）。细胞系在ATCC推荐的培养基中生长，并且进行如下处理：
NCI-H929：2小时：DMSO、200nM CKDI(8)或500nM CKDI(8)。
NCI-H441和A375：0时间点：未处理，当将化合物加入到其他平板时收获细胞。
2小时：DMSO、200nM CKDI(8)或500nM CKDI(8)或500nMCKDI(7)（每一处理用3个平板，总共12个平板）。
8小时：DMSO、200nM CKDI(8)或500nM CKDI(8)或500nMCKDI(7)（每一处理用3个平板，总共12个平板）。
16小时：DMSO、200nM CKDI(8)或500nM CKDI(8)或500nMCKDI(7)（每一处理用3个平板，总共12个平板）。
A2058，U-87-MG
0时间点：未处理，当将化合物加入到其他平板时收获细胞（3个平板）。
2小时：DMSO、500nM CKDI(8)（每一处理用3个平板，总共6个平板）。
8小时：DMSO、500nM CKDI(8)（每一处理用3个平板，总共6个平板）。
16小时：DMSO、500nM CKDI(8)（每一处理用3个平板，总共6个平板）。
图1中显示了该分析的IC50结果。根据厂商推荐的方案，使用Affymetrix GeneChip ArrayStationTM（Affymetrix，Santa Clara，美国），制备用于微阵列谱的RNA。将靶产物与AffymetrixTMU133-Plus-2全基因组微阵列杂交，并用Affymetrix GeneChip Scanner3000TM扫描。在原始数据上进行生物信息学分析，以提供结果。在实验室处理和数据分析期间检查厂商推荐的质量控制标准，以确保高质量的结果。
通过计算复制肿瘤中的几何平均（geomean）表达水平，测定在每一时间点和治疗条件下每一探针集的平均表达水平。就该实验而言，如果在至少一个时间点，经CDKI处理的/仅运载体对照的比例大于2倍左右且具有低于0.001的p值，那么将探针集鉴定为显著差异。通过假定不等方差（Satterwaithe's近似法）的双尾t-检验，确定p值。通过针对GenBankTM检索由Affymetrix提供的靶探针序列，将探针集对基因作图。
在微阵列探测的基因中，PD标志物MEPCE、MCL、MYC、HEXIM、LARP7和WHSC2的表达降低表明CDKI是有效的。这显示于图2中，其中用CDKI(7)处理对CDKI敏感的A375细胞，并在处理的第2小时、第8小时和第16小时测定基因表达的降低。如在图2中所示，某些基因如MEPCE的表达在第8小时的时间点下降得最多。
图3显示了用CDKI(8)（特异的CDK9抑制剂）处理后MEPCE表达的降低，并且将这种降低与CDKI(11)（强烈抑制全部CDK的pan-CDK抑制剂）的作用比较。CDKI(11)也已知为SCH727965或
（Mol.Cancer Ther.2010，9（8）：2344-2353）。如在图3中所示，CDKI(8)和CDKI(11)均降低MEPCE的表达，表明MEPCE是任一种CDK9抑制剂的PD标志物。还使用了放线菌素D，其也减少转录延伸，图3显示用该化合物处理也降低了MEPCE的表达。
实施例2
用CDKI处理后，在含50mM TRIS pH7.4、150mM NaCl、1mMEDTA、1%Brij-35、0.1%脱氧胆酸盐、蛋白酶抑制剂（Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，德国）的改良的RIPA缓冲液中裂解细胞。将SDS-PAGE（4-12%凝胶）用于分辨裂解物中的蛋白质。电泳后，将蛋白质电转移到聚偏氟乙烯微孔膜上，并使用标准方案免疫检测。图4是用CDKI(7)或DMSO处理的多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929的蛋白质印迹，并且在处理期间的某些时间点分析了基因表达。如印迹中所示，MEPCE的表达随时间降低，在第16小时的时间点显示出蛋白质的表达低至不可检测的水平。因此，通过蛋白质印迹在蛋白质水平证实了通过微阵列在mRNA水平观察到的应答CDKI的基因的表达的降低。
图5是用CDKI(8)处理后，比较抗凋亡和促凋亡家族成员的表达降低的蛋白质印迹。例如，MCL1蛋白的表达在处理后2小时降低，并且在暴露于CDKI(8)16小时后进一步降低。
实施例3
作为狗毒理学研究的一部分，将CDKI(7)施用给狗。收获白细胞，并将MEPCE、MYC和MCL1基因表达评估为PD标志物。在CDKI(7)处理后，通过
在不同时间点测量这些PD标志物的mRNA水平。
该研究为三组，每组三只狗。用0.5mg/kg的CDKI(7)处理组1的狗（#101、#102和#103），用1mg/kg CDKI(7)处理组2的狗（#104、#105和#106），并且用2mg/kg CDKI(7)处理组3的狗（#107、#108和#109）。在处理前（0小时）、处理每组总计12个样品后3小时、7小时和24小时收集样品。在QIAGEN
Animal Blood tube（Cat.#76554QIAGEN-Valencia，CA，美国）中冰冻保持血清样品。使用QIAGEN
Protect动物血液试剂盒（Cat.#73224）提取RNA样品。使用来自Invitrogen（Cat.#Q32852Invitrogen–格兰德艾兰，NY，美国）的RNAQuant-iT
测定法定量RNA样品，并在Invitrogen Qubit（Cat.#Q32857）上读数。使用来自Applied Biosystems（Cat.#4368814Applied Biosystems，Carlsbad，CA，美国）的高容量cDNA反转录试剂盒
在20μl的反应体积中，在500ng的RNA上进行第一链cDNA合成。然后稀释cDNA样品，以获得用于
反应的10ngcDNA。在
装置上，使用来自Applied Biosystems（Cat.#4369016）的Gene Expression Master Mix，一式三份地进行
反应。如表3中所示，将探针集用于测定MEPCE、MYC和MCL1的表达。将18S rRNA水平用作cDNA输入中差异的内源对照。将相对定量方法用于分析数据：该方法将一个样品用作校准样品，并相对于该样品表示mRNA水平。结果表示为具有RQ最小值和RQ最大值的RQ值（相对定量），测定实际RQ值具有95%的置信区间。根据剂量分组样品，并将每一组作为单独的实验处理，将一个前剂量样品用作校准样品。将RQ值的对数作图，以便可以更容易地表示起始值的增加或降低；在对数标度上：RQ值的10倍增加或10倍减少分别表示为+1和-1。应当注意，由于极大地降低了RNA产量，去除了狗#108的最后数据点。
表3使用的
基因表达测定法
前面的实施例显示，MEPCE mRNA对由任一种CDKI导致的CDK9的抑制是特别敏感的（参见图2）。此外，MEPCE是结合P-TEFb（结合CDK9的正转录延伸因子）的7SK snRNA复合体的一部分，以使P-TEFb保持失活形式。使用相对定量方法，通过
测定mRNA水平。校准样品为：0.5mg/kg CDKI(7)剂量，0小时时间点的狗#101、1mg/kg剂量，0小时时间点的狗#104和CDKI(7)2mg/kg剂量，0小时时间点的狗#107。用RQ值的对数（基数10）作图，用误差棒表示95%置信区间。MEPCE mRNA的结果显示于图6中。在CDKI的全部三种剂量中，存在MEPCE的明显下调。下调的幅度和持续时间是剂量依赖的；0.5mg/kgCDKI(7)时，在第3小时最大下调为3.2倍，1mg/kg CDKI(7)时，在第7小时最大下调为5.2倍，且2mg/kg时，在第7小时最大下调为14倍。除2mg/kg剂量（其中一只狗（#109）仍表现出一些程度的下调）外，在第24小时，MEPCE mRNA水平回到处理前水平。
MYC转录因子是已知的癌基因，并且前面的实施例显示，MYC的mRNA半寿期短，并且对CDK9抑制敏感（参见图2）。使用相对定量方法，通过
测定MYC mRNA水平。校准样品为，0.5mg/kg剂量CDKI(7)，0小时时间点的狗#101、1mg/kg剂量，0小时时间点的狗#104和2mg/kg CDKI(7)剂量，0小时时间点的狗#107。用RQ值的对数（基数10）作图，用误差棒表示95%置信区间。在仅2mg/kg剂量，MYC mRNA（参见图7）显示出恒定的下调。在第3小时全部三只狗的MYC表达都显示出下调（最大3.8倍），并且在第7小时，三只中的两只显示出下调。在较低剂量（0.5mg/kg）没有明显的下调或者在1mg/kg，在第3或第7小时时间点存在少量增加（2倍）。经过24个小时，在全部情况下，mRNA水平都倾向于回到处理前水平。
MCL1基因编码促存活因子，其通常在癌症中扩增，并且我们前面已经显示，MCL1的mRNA半寿期短并对CDK9的抑制敏感（参见图2）。使用相对定量方法，通过测定mRNA水平。校准样品为，0.5mg/kg剂量CDKI(7)，0小时时间点的狗#101、1mg/kg剂量，0小时时间点的狗#104和2mg/kg剂量，0小时时间点的狗#107。用RQ值的对数作图（基数10），用误差棒表示95%置信区间。在仅2mg/kg剂量，MCL1mRNA（参见图8）显示出恒定的下调。在第3小时全部三只狗的MCL1表达都显示出下调（最大2.7倍），但在第7小时没有显示出下调。在较低剂量（0.5mg/kg）没有明显的下调或者在1mg/kg，第7小时时间点，在三只狗中的两只中存在少量增加（2倍）。
测量了用作CDKI(7)的效应的PD标志物的三种mRNA。MEPCEmRNA是三种标志物中最敏感的，在全部三种剂量都显示出明显的可测量的下调。应答的强度和持续时间都是与剂量成比例的，在第7小时达到14倍的最大下调。基于如上所讨论的在细胞中的实验，明确的是，MEPCE是用于抑制CDK9的任何分子或化合物的PD标志物。在该研究中，用CDKI(7)显示了MEPCE下调，并且如下所示，以上实验用CDKI(8)、CDKI(11)和CDKI(12)均显示了MEPCE的降低。MYC mRNA是第二敏感的标志物；MYC在0.5或1mg/kg时并没有显著下调，但2mg/kg剂量的CDKI(7)降低了MYC的表达。第3小时的下调比第7小时更多并且更恒定。MYC下调的幅度比MEPCE小，相对于MEPCE的14倍，MYC的下调最大为3.8倍。最后，MCL1mRNA在三种标志物中是最不敏感的。MCL1mRNA仅在2mg/kg且仅在第3小时的时间点下调，并且比MYCmRNA下调的幅度低（最大2.7倍比3.8倍）。
本实验还表明，如果将CDKI作为治疗剂施用给患者，那么可以测定非癌组织以测定CDKI是否有效。例如，如果为减少黑素瘤为目的，给患黑素瘤的患者施用CDKI，那么可以如在狗研究中进行的那样，测定来自患者的外周血（PBMC）的白细胞的MEPCE。这意味着，对于测定CDKI是否有效，并不严格需要癌组织和正常组织的组织活检。一系列的采血和
测定法就可以提供该信息。
实施例4
作为狗毒理学研究的一部分，CDKI(12)处理后，在不同时间点，通过
测量白细胞中的药效标志物MEPCE、MYC和MCL1。以前已经显示，在异种移植中和白细胞中，这些mRNA在小鼠和大鼠中都受CDK9抑制剂和CDKI的调节。
该研究为三组，每组三只狗。用运载体处理组1的狗（#1001、#1002和#1003），用0.1mg/kg CDKI(12)处理组3的狗(#3001、#3002和#3003)，并且用0.15mg/kg CDKI(7)处理组5的狗(#5001、#5002和#5003)。在处理前的时间点（0小时），处理每组总计12个样品后4小时、8小时和24小时收集样品。在QIAGEN
Animal Blood tube（Cat.#76554）中冰冻保持血清样品。使用QIAGEN
Protect动物血液试剂盒（Cat.#73224）提取RNA样品。使用来自Invitrogen（Cat.#Q32852）的RNA Quant-iT RNA测定法
定量RNA样品，并在Invitrogen Qubit
（Cat.#Q32857）上读数。使用来自Applied Biosystems（Cat.#4368814）的高容量cDNA反转录试剂盒，在20μl的反应体积中，在500ng的RNA上进行第一链cDNA合成。然后将cDNA样品稀释至2ng cDNA（每一反应中的5μl中有10ng）。每一
反应包含：5μl的cDNA、1.25μl的每种探针（18S rRNA和目的基因）、5μl的水和12.5μl来自Applied Biosystems（Cat.#4369016）的
Gene Expression MasterMix，总体积25μl。在ABI
仪器上，一式三份地运行反应。表3中显示了所使用的探针（参见上文实施例3）。将18S rRNA水平用作cDNA输入中校正差异的内源对照。将相对定量方法用于分析数据：该方法将一个样品用作校准样品，并相对于该样品表示mRNA水平。结果表示为具有RQ最小值和RQ最大值的RQ值（相对定量），测定RQ值具有95%的置信区间。根据处理和时间点以及来自三只狗的数据分组样品，平均一式三份地测量每一样品。将0小时的时间点的运载体组用作校准样品，因此允许我们测量在不同时间点mRNA水平应答测试物质的改变。将RQ值的对数作图，以便可以更容易地表示起始值的增加或降低；在对数标度上，RQ值的10倍增加或10倍减少分别表示为+1和-1。
我们前面已经显示，MEPCE mRNA对CDK9抑制和任一种CDKI是特别敏感的（参见上文实施例）。此外，MEPCE是结合P-TEFb（结合CDK9的正转录延伸因子）的7SK snRNA复合体的一部分，以使P-TEFb保持失活形式。使用相对定量方法，通过测定mRNA水平。校准样品为0小时时间点的运载体。用RQ值的对数作图（基数10），用误差棒表示95%置信区间。MEPCE mRNA的结果显示于图9中。在CDKI(12)的最高剂量（0.15mg/kg），存在MEPCE的明显下调。在第4和第8小时，mRNA水平是降低的，并经过24小时回到处理前水平。0.1mg/kg的CDKI(12)存在较小的下调，但曲线与0.15mg/kg组的曲线平行。
MYC转录因子是已知的癌基因，并且我们前面已经显示，MYC的mRNA半寿期短，并且对CDK9抑制敏感。使用相对定量方法，通过
测定MYC mRNA水平。校准样品为时间0的运载体。用RQ值的对数（基数10）作图，用误差棒表示95%置信区间。
MYC mRNA（参见图10）在任何测试的剂量都不会显示出任何明显的下调。
MCL1基因编码促存活因子，其通常在癌症中扩增，并且我们前面已经显示，MCL1的mRNA半寿期短并对CDK9的抑制和CDKI敏感。将两种探针（探针Cf02713468_m1（MCL1-1）和探针Cf02622286_m1（MCL1-2））用于MCL1mRNA（参见上文的表3）。两种探针显示出非常相似的结果。使用相对定量方法，通过
测定mRNA水平。校准样品为0小时时间点的运载体。用RQ值的对数（基数10）作图，用误差棒表示95%置信区间。在任何测试的剂量处，MCL1mRNA（参见图11）都没有显示出任何明显的下调。
总之，施用CDKI(12)后测定了三种不同的PD标志物。MEPCE是三种标志物中最敏感的；MEPCE分别在0.15mg/kg和0.1mg/kg的CDKI(12)处显示出明显的下调。mRNA水平在第4和第8小时降低，并经过24小时后回到处理前水平。在测试的剂量处，MYC和MCL1mRNA都没有明显的下调。如在用CDKI(7)的实施例3中所示，MYC和MCL1的调节需要较高剂量，并且在用CDKI(12)的情况下也是这样。
Claims (40)
1.监测患者对用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）进行治疗的应答的方法，所述方法包括：
a)施用至少一种CDKI；
b)在生物样品中测量选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达，所述生物样品从已经施用CDKI的患者获得；和
c)将至少一种PD标志物的差别基因表达与对照样品中至少一种PD标志物的基因表达比较。
2.权利要求1的方法，其中所述PD标志物选自：MEPCE（SEQ IDNO:1）、MCL1（SEQ ID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
3.权利要求1的方法，其中所述PD标志物是MEPCE（SEQ IDNO:1）。
4.权利要求1的方法，其中测量所述至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种PD标志物的基因表达是降低的。
6.权利要求1的方法，其中测量至少两种PD标志物的基因表达。
7.权利要求1的方法，其进一步包括在施用所述CDKI之前从所述患者获得生物样品。
8.权利要求1的方法，其中所述生物样品从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
9.权利要求1的方法，其中所述CDKI抑制CDK9。
10.权利要求1的方法，其中所述CDKI选自表1。
11.权利要求1的方法，其中以治疗有效量施用所述CDKI。
12.权利要求10的方法，其中调整后续施用于患者的CDKI的所述治疗有效量。
13.权利要求1的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述PD标志物的差异表达。
14.权利要求1的方法，其中在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
15.权利要求1的方法，其中在步骤a)施用两种不同的CDKI。
16.权利要求14的方法，其中同时施用两种不同的CDKI。
17.权利要求14的方法，其中在不同的时间点施用两种不同的CDKI。
18.测定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）的敏感性的方法，所述方法包括：
a)将细胞与至少一种CDKI接触；
b)在与所述CDKI接触的所述细胞中测量选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达；和
c)将所述差别基因表达与来自未处理的或经安慰剂处理的对照细胞的基因表达比较。
19.权利要求18的方法，其中所述PD标志物选自MEPCE（SEQ IDNO:1）、MCL1（SEQ ID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
20.权利要求18的方法，其中所述PD标志物是MEPCE（SEQ IDNO:1）。
21.权利要求18的方法，其中测量所述至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
22.权利要求18的方法，其中所述至少一种PD标志物的基因表达是降低的。
23.权利要求18的方法，其中测量至少两种PD标志物的基因表达。
24.权利要求18的方法，其中所述细胞从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
25.权利要求18的方法，其中所述CDKI选自表1。
26.权利要求18的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述PD标志物的差异表达。
27.权利要求18的方法，其中在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
28.权利要求18的方法，其中在步骤a)所述细胞与两种不同的CDKI接触。
29.权利要求18的方法，其中所述细胞同时与两种不同的CDKI接触。
30.权利要求18的方法，其中所述细胞在不同的时间点与两种不同的CDKI接触。
31.筛选CDKI候选物的方法，所述方法包括：
a)将细胞与CDKI候选物接触；
b)在与CDKI候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种药效（PD）标志物的差别基因表达；和
c)将用CDKI候选物接触的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达与用取自表1的CDKI接触的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达以及未处理的或经安慰剂处理的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达比较。
32.权利要求31的方法，其中所述PD标志物选自：MEPCE（SEQ IDNO:1）、MCL1（SEQ ID NO:3）、MYC（SEQ ID NO:5）、HEXIM1（SEQ ID NO:7）、LARP7（SEQ ID NO:9）或WHSC2（SEQ ID NO:11）。
33.权利要求31的方法，其中所述PD标志物是MEPCE（SEQ IDNO:1）。
34.权利要求31的方法，其中测量所述至少一种PD标志物的核酸或蛋白质。
35.权利要求31的方法，其中所述至少一种PD标志物的基因表达降低，指示所述CDKI候选物是CDK抑制剂。
36.权利要求31的方法，其中所述筛选针对CDK9抑制剂。
37.权利要求31的方法，其中将所述CDKI候选物的差别基因表达与选自表1的CDKI的差别基因表达比较。
38.权利要求31的方法，其中所述生物样品从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
39.权利要求31的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述PD标志物的差异表达。
40.权利要求31的方法，其中在第1小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131225 |