KR101644682B1 - 전사체학과 단백질체학을 이용한 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커는 약물에 의한 간 손상에 민감하게 반응하는 유전자를 전사체학 및 단백질체학을 통하여 선별한 것으로, 본 발명의 바이오마커는 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단의 용도로 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 간 손상의 유형을 분석함에 있어서도 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 의한 바이오 마커는 약물에 의한 독성을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 장점이 있으므로 약물에 의한 독성으로 야기되는 부작용을 조기에 차단할 수 있을 것이다.

Description

전사체학과 단백질체학을 이용한 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커{Biomarker for predicting and diagnosing drug-induced liver injury using transcriptomics and proteomics}
본 발명은 전사체학과 단백질체학을 이용한 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커에 관한 것으로, 더 상세하게는 약물에 노출되어 발생하는 간 손상 유형을 예측 및 진단하기 위하여 전사체학과 단백질체학을 이용하여 동정한 바이오마커에 관한 것이다.
간 독성은 약물이나 기타 비감염성 물질에 대한 노출로 발생하는 간 기능 장애 등의 간 손상으로 정의된다. 또한, 간 독성은 약물에 의해 유발되는 간염으로도 정의될 수 있는데, 약물 또는 다른 화학물질에 의해 유발되는 간 손상 뿐만 아니라 기타 약물에 의해 유도되는 특별한 유형의 부작용도 포함하는 개념이다. 이와 같은 간 독성을 지칭하는 용어는 다양하지만, 가장 일반적으로 사용되는 용어 중 하나가 DILI(drug-induced liver injury)이다. DILI는 간 이식 환자에서 급성 간 기능 부전을 발생시키는 주요한 원인으로 알려져 있어 임상의나 제약사의 주요 관심사이고, 약물에 의한 간 손상을 이유로 이미 승인된 약물이 시장에서 다시 철수되는 예가 매우 빈번하다. 미국 급성 간 기능 장애 연구 그룹에 따르면, 아세트아미노펜(acetaminophen)과 같은 약물들이 급성 간 부전을 야기하는 주원인의 50% 이상을 차지한다고 한다. 아세트아미노펜 또는 사염화탄소와 같은 간 독성 물질에 노출된 랫트(rat)에서는 다양한 mRNA의 발현 양상에 변화가 일어나는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 아직까지 DILI의 진단은 매우 어려운 일이며, 그 정확한 기전 또한 제대로 알려져 있지 않은 실정이다.
DILI는 임상적 특성에 따라 몇 가지 유형으로 분류할 수 있는데, 간 손상 병변에 따라, 간세포형(주로 알라닌 아미노전이효소인 ALT의 상승), 담즙형(주로 알칼린 포스파타아제인 ALP의 상승) 또는 이들의 혼합형으로 구분할 수 있다. DILI에 있어서 많은 경우 상기 유형 중 하나의 유형이 우세하게 나타나기는 하지만 이들 유형이 복합적으로 나타나는 경우도 많다. 한편, 간에서의 이상 반응은 본질적으로 간 독성을 유발하는 경우와 체질 특이적으로 간 독성을 유발하는 경우로 분류될 수 있는데, 본질적으로 간 독성을 유발하는 경우는 원래의 화합물 자체 또는 이의 대사물질에 의해 간 손상이 발생하는 경우에 해당하여, 당해 약물과 이로 인해 유발되는 이상 반응과의 상관관계를 찾을 수 있고, 종 특이성이 없으며, 이러한 상관관계를 통하여 간 독성이 예측 가능하고, 약물의 투여를 중단함으로써 간 독성을 회복시킬 수 있다는 특징을 갖는다. 그러나, 체질 특이적으로 간 독성을 유발하는 경우에는 약물과 이로 인해 유발되는 반응과의 상관관계가 나타나는 경우가 매우 드물고, 그 기전을 설명할 수 있는 실험 동물 모델도 아직 구축되지 않은 상태이다. 또한, 체질 특이적 간 독성은 약물을 투여한 환자 1000 내지 100000명 중 1명에서 발생하기 때문에, 약물을 시판하기 전 미리 간 독성을 예측하는 것도 용이하지 않다. 그러나, 이러한 간 독성은 때때로 환자에게 매우 심각한 증상을 야기시키나 환자의 생명까지 위협할 수도 있으므로, 체질 특이적 간 독성을 미리 예측하는 것 또한 임상의와 제약사의 중요한 도전과제 중 하나로 여겨지고 있다.
DILI는 일반적으로 몇 천명의 참가자로 구성된 임상시험 단계에서는 쉽게 관찰되지 않고, 약물의 시판이 승인되어 수많은 환자들에게 약물을 투여한 후에야 희귀한 독성 효과가 관찰되는 경우가 빈번하므로, 가능한 약물 투여의 조기 단계에서 신속하고 민감하게 간 독성을 유발할 수 있는 가능성을 미리 감지하고 판단할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다. DILI를 유발하는 유전적 소인은 약동학 및 약역학적 경로에서의 차이에 기인할 수 있다. 약물을 투여한 많은 환자군에서 ALT의 상승이 관찰되는 경우 이러한 약물이 DILI를 유발할 수 있는 약물임을 예측할 수 있으나, 일반적으로 간 기능 검사는 간 손상을 예측하기보다는 진단하기 위해 수행되고 있다. 반면, 유전자 바이오마커는 개인에 있어서 간 손상을 예측하기 위하여 사용될 수 있으며, 최근 게놈 수준의 연합 연구에서 특정 약물에 노출되었을 때 간 손상을 예측할 수 있는 강력한 유전적 요인으로 인간 백혈구 항원 대립 유전자를 동정한 바 있다. 그러나, 이들 연합 연구가 간 독성 기전에 대한 이해를 위한 근간을 제공하고 있기는 하지만, 아직까지 이를 간 독성 예측 테스트의 용도로 발전시키지는 못하고 있는 실정이다.
한국 공개특허 제10-2009-7007160호
이에 본 발명자들은 랫트 동물 모델을 대상으로 피라지나마이드(PZA), 라니티딘(RAN), 에날라프릴(ENA), 카르바마제핀(CBZ) 및 클로르프로마진(CPZ)의 총 5 가지 약물을 처리하고 랫트 간 조직에서 전사체 및 단백질 발현 변화를 확인하여, 약물의 간 독성을 조기에 진단 및 예측할 수 있는 신규한 바이오마커들을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 약물의 노출에 따른 간 독성을 진단 또는 예측할 수 있는 간 손상 예측 및 진단용 바이오마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 바이오 마커를 이용하여 약물의 노출에 따른 간 손상을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 표에 기재된 60개의 유전자, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 및 상기 유전자로부터 발현된 단백질으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물을 제공한다.
Figure 112014001128146-pat00001
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오 마커는 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 수치가 증가하는 간세포형; 알칼리성 인산분해효소(ALP)의 수치가 증가하는 담즙형; 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)와 알칼리성 인산분해효소(ALP)의 수치가 모두 증가하는 혼합형의 간 손상 유형을 구별하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간세포형 간 손상은 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA)에 의해 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙형 간 손상은 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ)에 의해 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혼합형 간 손상은 라니티딘(ranitidine, RAN), 에날라프릴(enalapril, ENA) 및 카르바마제핀(carbamazepine, CBZ)으로 이루어진 군에서 선택되는 약물에 의해 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오 마커는 상기 표에 기재된 유전자의 간 조직에서의 발현양 변화를 통하여 간 손상을 예측 또는 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간 손상 유형이 간세포형 간 손상인 경우, 상기 표에 기재된 유전자들 중 1~4, 7~12, 14, 16, 18~23, 26~32, 35, 37~41, 44, 47, 48, 50~52, 54, 55 및 58~60번 유전자들의 mRNA 또는 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 5, 6 13, 15, 17, 24, 25, 33, 34, 36, 42, 43, 45, 46, 49, 53, 56 및 57번 유전자들의 mRNA 또는 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간 손상 유형이 담즙형 간 손상인 경우, 상기 표에 기재된 유전자들 중 1, 2, 4, 7~12, 16~18, 20~27, 29~32, 35, 38~41, 43, 44, 46~48, 50~52, 54, 55 및 57~59 번 유전자들의 mRNA 또는 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 3, 5, 6, 13~15, 19, 28, 33, 34, 36, 37, 42, 45, 49, 53, 56 및 60번 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간 손상 유형이 혼합형 간 손상인 경우, 제1항의 표에 기재된 유전자들 중 1~4, 6~10, 12, 15~17, 19, 20, 22, 23, 25~32, 35, 36, 38~41, 44, 47, 48, 50, 52, 54 및 57~60번 유전자들의 mRNA 또는 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 5, 11, 13, 14, 18, 21, 24, 33, 34, 37, 42, 43, 45, 46, 49, 51, 53, 55 및 56번 유전자들의 mRNA 또는 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 약물에 의한 간 손상(DILI)이 의심되는 생물학적 시료로부터 상기 표에 기재된 60개 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 간 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커는 약물에 의한 간 손상에 민감하게 반응하는 유전자를 전사체학 및 단백질체학을 통하여 선별한 것으로, 약물에 노출되어 간 손상이 유도되었을 때 간 조직에서 특이적으로 검출되는 표지자인바, 이러한 바이오 마커는 약물에 의한 간손상의 예측 및 진단의 용도로 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 간 손상의 유형을 분석함에 있어서도 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 의한 바이오 마커는 약물에 의한 독성을 조기에 신속하게 진단 및 예측할 수 있는 장점이 있으므로 약물에 의한 독성으로 야기되는 부작용을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 DILI-유발 약물의 투여에 따른 랫트 간 조직의 자율 계층적 군집 분석을 나타낸다. 가로는 약물 투여 후 간 조직 프로파일을 나타내고, 세로는 프로브 측정을 나타낸다. (A) 약물 투여 2일에 최소 기준을 통과한 7,725개 유전자의 2차 다이아그램을 통해 3가지 간독성 유형을 구별할 수 있다. (B) 약물 투여 3일 후, 약물 처리군과 대조군과의 차이를 나타내는 7,769 유전자는 특정 간독성 유형으로 구별되지 않는다. (C) 약물 처리 10일 후, 약물 처리군에 의해 발현이 변화되는 7,161 유전자는 특정 간독성 유형으로 구별되지 않는다.
도 2는 DILI-유발 약물의 투여 2일 후 랫트 간 조직에서 세 가지 간독성 유형을 분별할 수 있는 31개의 고 정확성 유전자 분류자를 Prototype Matching 분류 알고리즘을 이용하여 동정한 결과이다. (A) DILI-유발 약물에 의한 덴드로그램 클러스터는 31개 유전자의 발현 양상에 따라 4개의 다른 부류를 보여준다.(B) 차등 발현되는 유전자의 주성분 분석(PCA)에 따른 결과로, 대조군은 녹색, 간세포형은 노란색, 혼합형은 파란색, 담즙형은 빨간색으로 표시되어 있다. (C) LOOCV 방식에 따라 정확도를 실험한 결과, 106개 조직 샘플에서 모두 4개의 다른 부류로 분류되었다. 발현 양상 변화에서 총 2311개의 유전적 요소를 분자적 분류자로 예측하였으나 이 중 31개 유전자가 100% 정확도를 나타내는 최소의 분자 마커로 선정되었다.
도 3은 DILI의 유형(간세포형(A), 혼합형(B), 담즙형(C))에 따른 발현량이 변화된 유전자를 DAVID를 이용하여 기능별로 분류한 결과이다. 막대 그래프는 대략적 p-value를 나타낸다.
도 4는 DILI의 유형(간세포형(A), 혼합형(B), 담즙형(C))에 따른 발현량이 변화된 유전자를 GSEA로 분석하여 KEGG PATHWAY IN CANCER에서 유전자 세트가 공통된 반응 경로임을 확인한 결과이다.
도 5는 DILI의 유형에 따라 발현량이 변화는 유전자들이 관여하는 분자 기전을 분석한 GSEA 결과이다. (A) 간세포형에서는 REACTOME SLC-MEDIATED TRANSMEMBRANE TRANSPORT와 관련된 유전자들이 가장 많이 발현량이 증가하였고, KEGG MAPK SIGNALING PATHWAY와 관련된 유전자들이 가장 많이 발현량이 감소하였다. (B) 혼합형에서는 REACTOME SIGNALLING BY NGF와 관련된 유전자들이 가장 많이 발현량이 증가하였고, REACTOME CLASS I MHC MEDIATED ANTIGEN PROCESSING PRESENTATION와 관련된 유전자들이 가장 많이 발현량이 감소하였다. (C) 담즙형에서는 REACTOME CLASS I MHC MEDIATED ANTIGEN PROCESSING PRESENTATION와 관련된 유전자들이 가장 많이 발현량이 감소하였다.
도 6은 DILI의 유형에 따라 특징적으로 나타나는 분자적 네트워크 분석 결과이다. 각 DILI 유형에 따른 ConceptGen Network Graph는 대사, 염증, 세포 접합, 액틴 세포골격, MAPK 신호전달, 번역과 관련하여 분자적 네트워크 변화가 있음을 나타낸다. (A) 간세포형은 대사, 염증, 세포 접합 (B) 혼합형은 대사, 염증, 액틴 세포골격, MAPK 신호전달 (C) 담즙형은 대사, 염증, 번역 관련 네트워크와 관련이 있는 것으로 나타났다.
도 7은 랫트 간 조직에서의 DILI 유발 약물을 처리에 따른 유전자와 단백질의 발현 양상을 통합 분석한 것이다. (A) 프로테오믹스 분석을 통해 랫트 간 조직에 DILI 유발 약물을 투여한 지 2일 경과 후 상향 또는 하향 조절되는 205개의 마커를 선별하였다. 행은 제시된 독성 물질을 처리한 후 간 조직의 프로파일을 나타내고, 열은 프로브 측정을 나타내며, 채도는 발현양 차이를 나타낸다. (B) 205개의 아웃라이어 단백질 중, 135개 단백질이 트랜스크립토믹 데이터 세트의 유전적 요소와 일치하였다. 총 계산 시험에서 115개의 단백질 데이터 세트와 100개의 유전자 발현 데이터 세트가 각 유효성 분석에서 고정확도로 3가지 DILI 유형을 구별할 수 있었다. 이들 중 84개 유전자와 단백질은 벤 다이어그램에 표시된 것과 같이 단백질 및 유전자 수준에서 모두 공통적으로 하향 조절되었다. (C) 이들 84 마커의 유형 분류 가능성을 평가하기 위한 단백질 데이터 세트 유효성 분석에서는 94.12% 정확도를 나타내었다. (D) 유전자 발현 데이터 세트 유효성 분석에서는 99.06%의 정확도를 나타내었다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 약물에 의해 유도되는 간 손상을 조기에 예측 및 진단할 수 있는 바이오마커를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 본 발명자들은 랫트(rat) 모델을 이용하여 DILI(drug-induced liver injury)와 관련 있는 특정 유전자 발현을 평가하였다. 이를 위하여 랫트에 인간에서 DILI를 유발하는 것으로 알려진 대표적인 약물을 투여한 후, 랫트 간 조직에서 전사체 변화를 분석하였다. 세 가지 유형(간세포형, 혼합형, 담즙형)의 DILI를 유발하는 대표적 약물로써 본 발명에서는 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA, 150~1500 mg/kg), 라니티딘(ranitidine, RAN, 209.5~2095 mg/kg), 에날라프릴(enalapril, ENA, 148.65~1486.5 mg/kg), 카르바마제핀(carbamazepine, CBZ, 97.85~978.5 mg/kg), 및 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ, 7.1~71 mg/kg)의 총 5 가지 약물을 사용하였다. 이들 약물 중, 결핵 균의 제균 및 살균 작용을 하여 결핵 환자의 치료 용도로 사용되는 피라지나마이드를 간세포형의 DILI를 유도하는데 사용하였다. 한편, 히스타민 H2-수용체 길항제로 위산 생성을 억제하여 소화성 궤양 질환 및 위식도 역류 질환의 치료에 사용되는 라니티딘은 혼합형의 DILI를 유도하는데 사용하였다. 또한, 안지오텐신 전환효소(ACE) 억제제로 고혈압과 만성 심부전에 사용되는 에날라프릴, 간질 및 양극성 장애 치료에 사용되는 카르바마제핀도 혼합형의 DILI를 유도하는데 사용하였다. 한편, 딸꾹질과 구토 등의 치료와 정신 분열증 치료에 사용되는 클로르프로마진은 담즙형의 DILI를 유도하는데 사용하였다.
상기와 같은 약물을 투여한 랫트 간 조직에서의 단백질 발현 변화 양상은 약물을 투여한 랫트 간 조직에서 단백질을 추출한 후 2D 겔 전기영동하고 실버 염색을 통하여 관찰하였다. 즉, 약물을 투여하지 않은 대조군 샘플에 비하여 단백질 스팟의 정량을 통해 발현양이 2배 이상 변화한 경우 발현이 유의하게 변화한 것으로 선별하였다. 이 중에서 전사체학을 통하여 mRNA의 발현도 확연히 변화하는 유전자를 추가적으로 확인하였는데,그 결과, DILI 유형에 따라 간 조직에서 특징적인 분자 발현 양상을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 대규모의 유전자 발현 변화를 관찰함으로써 약물에 노출된 초기에 DILI의 유형을 민감하게 구별해 낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 DILI에 있어서 유전자 발현 양상에 따른 다중 분류 알고리즘을 통한 복합 분석으로부터 세 가지 다른 유형의 DILI를 구별할 수 있는 분자적 마커를 동정하였으며, 이들 마커는 랫트 간 조직에서 약물에 대한 노출의 초기 단계(2일 후)에 DILI의 세 가지 유형을 높은 정확도로 구별해 낼 수 있음을 확인하였다.
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Figure 112014001128146-pat00003
상기 표 1은 간 손상 유형에 따라 발현 양상의 차이를 나타내는 60개의 유전자의 단백질 발현량 변화를 나타낸 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 표 1에 기재된 60개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 간 손상 예측 및 진단용 바이오마커를 제공할 수 있다.
생물학적 시료 중의 바이오마커 유전자 발현량의 증대 또는 감소는 mRNA 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 바이오마커 유전자로부터 발현된 단백질 발현량의 증대 또는 감소는 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있다. 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 그 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 약물에 의해 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 바람직하게는 간 조직을 포함한다.
본 발명에서 상기 “바이오마커(biomarker)”란 약물 투여시 간 조직에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 바이오마커는 정상 간 조직에 비해 약물을 투여한 객체의 간 조직에서 발현양이 감소하거나 증가하는 상기 60개의 유전자 또는 상기 유전자들이 발현된 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 바이오마커로 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단할 수 있는 약물로는 이에 한정되지는 않으나, 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA,), 라니티딘(ranitidine, RAN), 에날라프릴(enalapril, ENA), 카르바마제핀(carbamazepine, CBZ), 및 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ) 등이 있다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 마커 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 약물에 의한 간 손상(DILI) 예측 및 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 “유전자의 발현 수준”은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 60개의 각각의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 “프라이머”는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages) 의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 “단백질의 수준 측정”이란 생물학적 시료에서 약물 노출에 의해 발현이 증가 또는 감소한 바이오마커 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 바람직하게는 상기 바이오마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.
상기 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 60개의 마커 유전자들로부터 발현된 단백질들에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함한다. 이러한 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 바이오마커 또는 상기 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 조성물을 포함하는 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 키트는 상기 마커 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 마커를 포함하는 약물에 의한 간 손상 예측 및 진단용 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 약물에 의한 간 손상(DILI)이 의심되는 생물학적 시료로부터 상기 60개 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하여 구성될 수 있다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준의 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응(reversetranscriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chainreaction), 노던 블럿, RNase 보호 분석법, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 약물에 노출된 경우의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
동물모델 및 약물 처리
DILI를 유발하는 5 가지 대표적 약물로, 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA, CAS number, 98-96-4; Sigma P7136),), 라니티딘(ranitidine, RAN, CAS number, 66357-35-5; Sigma R101), 에날라프릴(enalapril, ENA, CAS number, 75847-73-3; Sigma E6888), 카르바마제핀(carbamazepine, CBZ, CAS number, 298-46-4; Sigma C4024), 및 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ, CAS number, 50-53-3; Sigma C8138)을 선정하였고 이들 약물은 시크마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 제조자의 방식에 따라 실험을 준비하였다.
실험동물로는 오리엔트사(한국, 서울)에서 구입한 7주령 Sprague-Dawley 수컷 랫트를 사용하였고, 모든 실험동물은 23℃, 습도 60±10%인 조건의 사육실에서 낮 12시간/밤 12시간을 주기로 사육하였으며, 물과 사료에는 자유로운 접근이 가능하도록 하였다. 실험기간 동안, 모든 동물은 적어도 하루 한 번 이상 명백한 독성의 징후나 임상 증상을 나타내는지 관찰하였다. 동물실험은 IACIC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인을 준수하여 실시하였으며, 동물은 무작위적으로 처리군과 대조군으로 구분하여 실험에 사용하였다.
각 약물의 투여량은 각 약물의 공개된 LD50를 참고하여 이의 5%(소량), 10%(중량), 50%(과량)을 투여하는 것으로 결정하였고, 각각 3마리의 동물에, 옥수수 오일(corn oil)에 녹인 PZA (150, 300, 1500 mg/kg), RAN (209.5, 419, 2095 mg/kg), ENA (148.65, 297.3, 1486.5 mg/kg), CBZ (97.85, 195.7, 978.5 mg/kg), CPZ (7.1, 14.2, 71 mg/kg)를 1회 경구 투여하였다. 투여 후 2일, 3일, 10일에 각각 랫트를 희생시키고, 간 조직과 혈청 샘플을 수집하였으며, 이로부터 RNA와 단백질을 추출하여 추가 실험을 진행하였다.
< 실시예 2>
약물 투여에 의한 동물 모델의 일반 독성 평가
<2-1> 체중 및 기관 무게 변화 관찰
본 발명자들은 약물에 노출된 상기 실시예 1의 동물 모델에서 일반적인 독성 판단의 지표인 체중 및 간에서 무게 변화가 관찰되는지 확인해 보았다.
그 결과, 하기 표2에 나타난 바와 같이, 약물을 투여 후 2일, 3일, 10일 된 동물 모델에서 정상 대조군과 비교하여 체중 및 기관(간)의 무게 변화가 감지되지 않는 것으로 나타났다.
Figure 112014001128146-pat00004
<2-2> 혈액의 생화학적 분석
한편, 약물에 노출된 동물 모델의 혈액을 임상 생화학적으로 분석하기 위하여 랫트의 전혈을 약물 투여 후 2일, 3일, 10일이 경과하여 채취하였다. 약물에 의해 유발된 AST, ALT, TBIL(total bilirubin) 및 ALB의 혈청 내 수준을 표준 혈액 생화학 기술을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 2일째 알부민의 양이 다소 감소하는 듯한 경향을 보였으나 전반적으로 대조군과 큰 차이는 없는 것으로 확인되었다.
Figure 112014001128146-pat00005
상기와 같은 결과는 일반적인 독성 평가를 통해 DILI를 조기에 진단 및 예측하는 것이 용이하지 않음을 나타내는바, 본 발명자들은 약물에 의해 세포 내 수준의 민감한 변화를 감지함으로써 간 손상을 조기에 진단할 수 있는 분자적 수준의 진단 방법을 연구하기로 하였다.
< 실시예 3>
마이크로어레이를 통한 분자 표지 확인
본 발명자들은 랫트 모델을 이용하여 DILI를 조기에 진단 및 예측할 수 있는 특이적 발현 양상을 나타내는 분자 표지를 확인하고자 마이크로어레이 분석을 실시하였다.
<3-1> 전체 RNA 추출
약물을 투여한지 2일이 경과한 후, 랫트 간 조직 샘플로부터 TRI 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)을 사용하여 제조자 방식에 따라 총 RNA를 분리하였다. 이 과정을 간단히 설명하면, 조직을 액체 질소로 냉동시켜 분쇄한 후 1ml의 TRI 시약으로 균질화 하였다. 이를 상온에서 5분간 배양하고, 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하여 격렬히 혼합한 뒤 상온에서 3시간 추가 배양하였다. 이후 샘플을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 수성층을 새로운 튜브로 옮겨 동일 부피의 이소프로판올을 첨가한 후 얼음에서 30분간 방치하였다. 이후 상기 샘플을 14,000 rpm에서 15분간 원심분리하고, RNA 침전물을 75% 에탄올로 세척한 후, RNA-무첨가 증류수에 용해하였다. 추출된 RNA의 품질 검사는 RNA StdSens Chips을 이용하여 Experion bioanalyzer(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 실시하였고, RNA 농도는 ND-1000™ spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)로 결정하였다. 최소한 28S/18S ratio of > 1.6인 샘플만을 선별하여 추가 실험에 사용하였다.
<3-2> 표지된 전체 cRNA 제조와 혼성화
상기 실시예 <3-1>에서 추출된 총 RNA 1.5 ㎍을 이용하여 biotin-labelled cRNA를 제조하였다. 이중 가닥 cDNA는 Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion)을 이용하여 합성하였으며, biotin-UTP-labelled antisense RNA는 시험관 내에서 Ambion's Kit를 이용하여 전사하였다. 모든 labelling 절차는 Ambion에서 제시한 표준 실험방법으로 수행하였으며, cRNA 정제 전후의 생성물의 크기 및 정량은 ExperionTM StdSens RNA Analysis Kit(Bio- Rad, Hercules, CA)로 검증하였다. 정제 후, 생성물을 혼성화 버퍼를 이용하여 240 ng/㎕의 농도로 희석하고, 58℃에서 18시간 동안 혼성화 반응하였다. 랫트의 간 전사체 프로파일을 위하여 Illumina Sentrix RatRef-12 24K Expression Array BeadChip(Illumina, San Diego, CA)을 사용하였으며, 표지된 cRNA를 BeadChip에 혼성화, 세척, 스캐닝하는 실험은 Illumina BeadStation 500×manual에서 제시하는 방법대로 진행하였다. 어레이 신호는 streptavidin-Cy3으로 10분간 반응하여 현상하고, 상기 BeadChip을 세척한 ㅎ후 275 ×g로 4분간 원심분리하여 건조하였다. 어레이는 532 (Cy3) nm laser illumination을 갖는 공초점 유형 이미지 시스템인 Illumina BeadArray reader를 이용하여 스캔하였다. 각 샘플로부터의 데이터는 디폴트 매개변수(default parameters)를 이용하여 Genome Studio software (Illumina)로 추출하였다.
<3-3> 데이터 분석
Illumina Sentrix RatRef-12 24K Expression Array Bead Chip 발현 데이타는 GenPlex software 3.0 (Istech Inc., Korea)를 이용하여 분석하였다. 초기 데이타 필터링을 위하여 P-call(Detection P value < 0.1)을 나타내는 스팟을 제거하였고, 필터링된 데이터만 추가 분석을 위해 사용하였다. 데이터 표준화를 위해 변위치 표준화(quntile normalization)를 사용하였고, 로그 비(log ratio) 상의 계층적 군집은 Cluster TreeView 2.3(Stanford Univ, USA)을 이용하여 분석하였다.
상기와 같은 실험 결과, 22,517 유전적 요소 가운데, 최소 필터링 기준(Detection P value < 0.1)을 통과한 유전적 요소는 랫트 간의 전체 전사체인 것으로 나타났다. 한편, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 계층적 군집 분석은 시간이 경과하면서 다른 발현 양상을 나타내었는데, 투여 2일째에는, 최소 필터링 기준으로부터 선정된 7,725개의 유전자 요소가 계층적 군집 분석을 통해 4개의 특징적인 군집으로 구별될 수 있었다(대조군, PZA(간세포형), CPZ(담즙형), CBZ, RAN, ENA(혼합형)). 그러나, 투여 3일과 10일째에는 계층적 군집 분석을 통해 특징적 군집을 구별할 수 없었기 때문에, 본 발명자들은 투여 2일째 약물 투여에 의한 유전자 발현 양상을 통해 간 독성을 예측 및 진단하는 것이 적합한 것으로 판단하였다.
< 실시예 4>
약물에 의해 특징적 발현 양상을 나타내는 분자 표지의 확인
자율 계층적 군집을 통해 약물 투여 2일째, 간세포형, 혼합형, 담즙형을 구분할 수 있는 가장 명확한 분자적 특징이 나타난바, 본 발명자들은 이 시점에서 이들 간세포형, 혼합형, 담즙형을 구분할 수 있는 유전자 세트를 확인해 보고자 하였다. 이들 유형을 구분할 수 있는 최대한 많은 유전자를 검색하기 위하여, Bonferroni 다중 테스트 보정 방식과 결합된 다-분류 알고리즘으로 One Way ANOVA (P <0.0001)를 사용하였다. 그 결과, 발현 프로파일에 따라 대조군과, 3개의 다른 DILI 유형을 나타내는 총 4개의 부류로 분류되는 2,311개의 아웃라이어 유전자를 선별할 수 있었다. 100% 정확도로 이들 DILI 유형을 정확하게 구분할 수 있는 최소한의 유전자를 결정하기 위하여 2,311개의 유전적 요소에 전체 계산 테스트(whole computation test)[유전자 선별 알고리즘, BSS/WSS(the ratio of between group to within-group sums of squares)와 원형 대응 분류 알고리즘(Prototype Matching classification algorithm)]를 적용하였고, 최소한의 아룻라이어 유전자를 Leave-One-Out Cross Validation (LOOCV)을 이용하여 확인하였다.이와 같은 다중-분류 분석을 통하여 31개의 유전자가 DILI 유발 유전자 중 다른 유형의 DILI를 구별할 수 있는 최소한의 유전자로 선별되었다.
상기 31개의 유전자는 하기 표 4에 기재된 바와 같으며, 이들 31개 유전자 발현의 계층적 군집은 그들의 발현 프로파일에 의하여 덴드로그램 상에서 세 가지 DILI 유형을 정확히 구별하는 것으로 확인되었다(도 2A). 또한, 데이타 세트를 분석하는 또 다른 기술인 principal component analysis(PCA)을 통해 공간 배열 상에서도 4개의 분류가 명확하게 구별되는 것으로 나타났다(도 2B 참조). 이들 31개의 아웃라이어 유전자는 예측 신뢰도 분석에 의해 추가 검증되었고, LOOCV에 의해 100개의 임의 분할로 분류되었다. 고정확도 분류법을 이용하여 각 분류 할당 빈도를 요약한 결과 각 분류는 100% 예측도를 나타내었다(도 2C 참조).
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한편, 투여 3일 및 10일 실험군에서는 상기와 같은 정확도를 갖는 아웃라이어 유전자를 선별할 수 없었다(데이터 미도시).
< 실시예 5>
약물에 의해 특징적 발현 양상을 나타내는 분자경로 분석
DILI의 유형에 따라 구별되는 분자적 특징 간의 생물학적 관련성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Welch's T-test (P < 0.05)와 1.5-fold change cut-off를 조합하여 각 DILI 유형에 따른 대규모 특징적 발현 양상을 확인해 보았다. 본 발명자들은 DILI 유형에 따른 발현 양상과 관련된 분자적 경로를 검색하기 위하여 DAVID web-based bioinformatics platform(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)에 본 발명에 따른 특징적인 발현 양상을 업로드하였다. Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) 6.7 Bioinformatics Resources 는 KEGG 및 Biocarta pathway 데이터 베이스와 같이 다양한 분자적 기전을 수집해 놓은 데이터 베이스이다. 상기 데이터 베이스를 이용하면 기능적으로 연관된 유전자들의 부류를 결정하고 동일 기전에 관련된 유전자들을 결정할 수 있다. 즉, DAVID는 본 발명에서 약물 처리에 따라 차등 발현된 유전자들이 어떠한 경로에 관여하는지를 확인해 줄 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 세 가지 유형의 간 독성 유발 약물에 노출된 랫트 간에서 차등 발현되는 유전자들과 연관된 생물학적 기전을 연구하기 위하여 DAVID Functional Annotation Chart and Functional Annotation clustering tools를 사용하였고, fild enrichment, p-value, Bonferroni corrected p-value를 계산하기 위하여 0.1의 용이성 점수를 사용하였다. 본 발명자들이 Welch's T-test (P < 0.05)와 a 1.5-fold change cut-off의 조합을 사용하여 각 DILI 유형에 따른 특징적인 발현 양상을 확인해 본 결과, 간세포형에서 발현 양상이 변화된 1,145개의 아웃라이어 유전자는 gene count = 10, ease score = 0.1의 임계값으로 관찰하였을 때, 11 개의 주요 경로와 연관되어 있음을 확인할 수 있었고, 주요 신호전달 경로는 폐쇄 접합(Tight junction), PPAR 신호전달 경로, 백혈구 내피 이동(Leukocyte transendothelial migration), 부정맥 우심실 심근증(Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC)), 접착 접합(Adherens junction), MAPK 신호전달 경로, Neurotrophin 신호전달 경로, 대장암,초점접착역(Focal adhesion), 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 신호전달 경로, 리소좀과 관계되어 있음을 알 수 있었다(도 3A 참조). 또한, 혼합형에서 발현 양상이 변화된 1,439개의 아웃라이어 유전자는 약물 대사, 스테로이드 호르몬 생한성, 시토크롬 P450에 의한 이물질 대사, 레티놀 대사, PPAR 신호전달 경로, 스플라이시오좀(Spliceosome), 접착 접합(Adherens junction), 폐쇄 접합(Tight junction), 리보솜(Ribosome), 백혈구 내피 이동(Leukocyte transendothelial migration), 엔도시토시스(endocytosis), Adipocytokine 신호전달 경로, MAPK 신호전달 경로, Neurotrophin 신호전달 경로, 리소좀, 암 관련 경로, 전립선 암, 췌장암, 아라키돈산 대사, 대장암, 비소세포 폐암, 만성 골수성 백혈병 등의 분자기전과 연관되어 있는 것으로 나타났다(도 3B 참조). 한편, 담즙형에서 발현 양상이 변화된 1,130개의 아웃라이어 유전자의 경우 리보솜, 스플라이시오좀, 약물 대사, 소세포 폐암, 암 관련 경로, 엔도시토시스의 6개 경로와 관련된 것으로 나타났다(도 3C 참조).
이후 본 발명자들은 DILI의 각 유형이 작용하는 기전을 조사하기 위하여, MsigDB (The Molecular Signatures Database)에서 DILI의 다른 유형들과 연관된 DILI에 의해 하향 조절되는 특정 유전자 세트에 대한 Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)을 실시하였다. 또한, 이러한 분자 기전의 상호작용을 확인하기 위하여 ConceptGen(http://conceptgen.ncibi.org)을 이용하여 네트워크 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 5와 같은 4 가지 경로를 확인할 수 있었으며, 이 중에서도 특히 KEGG PATHWAYS IN CANCER와 관련된 경로와 특히 상관관계가 높은 것으로 나타났다(도 4 참조). 한편, KEGG PATHWAYS IN CANCER와 관련된 경로에서 하향 조절된 유전자들은 각 DILI 유형별로 차이가 있어 각 유형에 따른 별개의 분자적 변화가 나타나는 것을 알 수 있었다.
Figure 112014001128146-pat00007
이와 함께, 본 발명자들은 MsigDB를 통하여 각 DILI의 유형에 따라 상향 또는 하향 조절되는 유전자들이 관여하는 신호전달 경로를 조사해 본 결과 하기 표 6 및 도 5와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
Figure 112014001128146-pat00008
본 발명자들은 DILI와 연관된 분자적 기전을 좀 더 면밀히 관찰하고자, ConceptGen mapping tool을 이용하여 각 DILI를 유발하는 약물의 특징적인 분자적 프로파일과 함께 다양한 분자적 경로의 상관관계를 연구하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이 각 DILI 유형에 따른 ConceptGenNetwork Graph는 대사, 염증, 세포 접합, 액틴 세포골격, MAPK 신호전달 및 번역 과정을 DILI에 의한 특징적인 분자적 기전으로 나타내었다.
이 중에서도 간세포형 손상을 유발하는 약물(PZA)은 대사, 염증, 세포 접합 경로와(도 6A 참조), 혼합형 손상을 유발하는 약물(CBZ, RAN, ENA) 은 대사, 염증, 액틴 세포골격, MAPK 신호전달 경로와(도 6B 참조), 담즙형 손상을 유발하는 약물(CPZ)은 대사 염증, 번역 경로와 밀접한 연관이 있는 것으로 나타났다(도 6C 참조). 이러한 네트워크 분석은 상기 GSEA를 통한 분석 결과와 일치하는 것으로, 대사, 염증과 관련된 신호전달 경로는 DILI와 관련된 분자기전와 공통적으로 관여하는 기전임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6>
트랜스크립토믹스와 프로테오믹스를 이용한 바이오 마커 동정
<6-1> 랫트 간 조직으로부터의 단백질 추출
랫트 간 조직을 7 M urea , 2 M thiourea containing 4% (w/v) 3-[ (3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 1% (w/v) dithiothreitol (DTT) 및 2% (v/v) pharmalyte and 1 mM benzamidine으로 이루어진 용해용 용액에 넣고 motor-driven homogenizer (PowerGen125, Fisher Scientific)을 이용하여 균질화하였다. 단백질은 상온에서 1시간 동안 보텍싱하여 추출하였다. 15℃에서 15,000×g로 1시간 동안 원심분리한 후, 불용해성 물질은 제거하고, 용해성 부분만 2D 겔 전기영동을 위해 사용하였다. 단백질 로딩 양은 Bradford assay로 정상화하였다.
<6-2> 2D 겔 전기영동을 통한 발현양 변화한 단백질 동정
프로테오믹스 분석을 위하여 본 발명자들은 상기 추출된 단백질 6개를 모아 사용하였다. IPG 건조막은 7M urea와 2% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1% dithiothreitol (DTT), 1% pharmalyte를 포함하는 2M thiourea를 이용하여 12-16시간 동안 평형화하고, 200 ㎍의 샘플을 로딩하였다. Isoelectric focusing (IEF)은 20℃에서 Multiphor II electrophoresis unit와 EPS 3500 XL power supply (Amersham Biosciences, UK)를 이용하여 제조자 방식에 따라 수행하였다. 2차원화에 앞서, 막은 equilibration buffer (50mM Tris-Cl, pH6.8 containing 6M urea, 2% SDS and 30% glycerol)에서 처음에는 1% DTT를 이용하여 다음에는 2.5% iodoacetamide를 이용하여 10분간 반응시켰다. 이후 막을 SDS PAGE gels(20 x 24 cm, 10-16%)에 넣고, Hoefer DALT 2D system (Amersham Biosciences, UK)을 이용하여 제조자 방식에 따라 SDS-PAGE를 진행하였다. 2D 겔은 20℃에서 1,700Vh로 전기영동한 후 실버 염색(silver staining)하였다. 다만, 고정 및 glutaraldehyde를 이용한 민감화 단계는 생략하였다. 디지털 이미지의 정량분석은 PDQuest version 7.0 software (Bio- Rad, Hercules, CA)을 이용하여 제조자 방식에 따라 수행하였고, 각 스팟의 양은 총 유효 스팟의 강도로 표준화하였다. 단백질 스팟은 대조군 샘플에 비하여 발현양에서 2배 이상 변화한 경우 발현이 유의하게 변화한 것으로 선별하였다. 이후, 추가 통합 분석을 위하여 계층적 군집 및 다중-분류 테스트로 분석하였다.
<6-3> 트랜스크립토믹스와 프로테오믹스의 통합 분석
상기 실시예를 통화여 관찰된 트랜스크립토믹스와 프로테오믹스에 공통된 분자적 기능과 생물학적 경로를 동정하기 위하여 PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) Classification System을 사용하였다.
트랜스크립톰과 프로테옴의 통합 분석을 통하여 본 발명자들은 세 가지 DILI 유형을 구별할 수 있는 유전자와 단백질 특성을 동정할 수 있었는데, 우선 본 발명자들은 DILI 유발 약물을 처리한지 2일 경과한 후 간 조직에서 단백질 발현이 크게 변하는 205개의 단백질을 동정하였다. 이러한 발현 양상이 변화된 단백질의 자율 계층적 군집은 식별 가능한 일정한 패턴을 나타내었는데(도 7A 참조), 총 135개의 단백질 요소 중에서 트랜스크립톰 데이터 세트와 매칭되는 유전적 요소로써, 랫트의 간 조직에서 특징적인 프로테옴 발현 양상에 의해 각 DILI 유형을 구별할 수 있는 115개의 단백질 요소를 동정하였다. 또한, 본 발명자들은 135개의 간 DILI 프로테옴 중 100개의 유전자 요소가 99.07%의 정확도로 DILI 유형을 구별할 수 있음을 확인하였다(데이터 미도시). 한편, 본 발명자들은 트랜스크립토믹스와 프로테오믹스 모두에서 공통적으로 발현양이 변화한 것으로 나타난 84개의 유전자와 단백질 요소를 동정하였다. 이들 84개의 유전자와 단백질 요소는 매우 높은 정확도로 DILI 유형을 구별할 수 있으며, 본 발명자들은 중복된 요소를 배재한 후 최종 60개의 유전자 및 단백질 요소를 동정하였으며, 이는 하기 표 7과 같다. 이들, 60개의 요소의 분자적 기능, 생물학적 공정 및 세포 구성요소를 경로 발굴 수단인 PANTHER를 이용하여 분석해 본 결과, 촉매 활성, 대사 과정, 세포내 경로와 밀접한 관련이 있는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112014001128146-pat00009
DILI : 약물에 의해 유도된 간 손상(Drug induced liver injury)

Claims (12)

  1. 하기 표에 기재된 60개의 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
    Figure 112015123208152-pat00010
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 마커는 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 수치가 증가하는 간세포형; 알칼리성 인산분해효소(ALP)의 수치가 증가하는 담즙형; 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)와 알칼리성 인산분해효소(ALP)의 수치가 모두 증가하는 혼합형의 간 손상 유형을 구별하는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 간세포형 간 손상은 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 담즙형 간 손상은 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 혼합형 간 손상은 라니티딘(ranitidine, RAN), 에날라프릴(enalapril, ENA) 및 카르바마제핀(carbamazepine, CBZ)으로 이루어진 군에서 선택되는 약물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 마커는 제1항의 표에 기재된 유전자의 간 조직에서의 발현양 변화를 통하여 간 손상을 예측 또는 진단하는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 간 손상 유형이 간세포형 간 손상인 경우, 제1항의 표에 기재된 유전자들 중 1~4, 7~12, 14, 16, 18~23, 26~32, 35, 37~41, 44, 47, 48, 50~52, 54, 55 및 58~60번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 5, 6 13, 15, 17, 24, 25, 33, 34, 36, 42, 43, 45, 46, 49, 53, 56 및 57번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 간 손상 유형이 담즙형 간 손상인 경우, 제1항의 표에 기재된 유전자들 중 1, 2, 4, 7~12, 16~18, 20~27, 29~32, 35, 38~41, 43, 44, 46~48, 50~52, 54, 55 및 57~59번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 3, 5, 6, 13~15, 19, 28, 33, 34, 36, 37, 42, 45, 49, 53, 56 및 60번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것을 특징으로 하는 약물에 의한 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 간 손상 유형이 혼합형 간 손상인 경우, 제1항의 표에 기재된 유전자들 중 1~4, 6~10, 12, 15~17, 19, 20, 22, 23, 25~32, 35, 36, 38~41, 44, 47, 48, 50, 52, 54 및 57~60번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 5, 11, 13, 14, 18, 21, 24, 33, 34, 37, 42, 43, 45, 46, 49, 51, 53, 55 및 56번 유전자들의 단백질 발현은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것을 특징으로 하는 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
  10. (a) 약물에 의한 간 손상(DILI)이 의심되는 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 60개 유전자의 단백질 발현양을 측정하는 단계; 및
    (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 단백질 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 간 조직인 것을 특징으로 하는 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 간 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
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