KR101087613B1 - 벤젠에 의해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 및 이를이용한 간독성 진단 방법 - Google Patents

벤젠에 의해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 및 이를이용한 간독성 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벤젠(benzene)에 의해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 간독성 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벤젠이 투여되어 간독성이 유도된 동물모델에서 마이크로어레이 칩을 이용하여 벤젠에 의해 특이적으로 시간 의존적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 간독성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 벤젠 및 여러 다른 화합물의 노출에 의해 유발되는 간독성(hepatotoxicity) 및 백혈병의 작용 기작을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다.
벤젠, 바이오마커, 마이크로어레이, 간독성

Description

벤젠에 의해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 간독성 진단 방법{The biomarkers for diagnosis of hepatotoxicity induced by benzene and the method of diagnosis for hepatotoxicity thereof}
본 발명은 벤젠(benzene)에 의해 유발된 간독성 관련 바이오마커 및 이를 이용한 간독성 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벤젠에 의해 특이적으로 시간 의존적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 간독성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
벤젠(benzene)은 휘발성 유기 화합물류 중의 하나로서, 일반적으로 산업용 용매로 다양하게 사용되고 있다. 현재는 주로 다른 화합물의 합성에 사용되고 있다. 벤젠의 독성은 혈액 및 골수에 대하여 백혈구 감소증(leucopenia), 범혈구 감소증(pancytopenia), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia) 및 백혈병(leukemia)을 야기한다(Snyder, R., Crit . Rev . Toxicol ., 32:155-210, 2002). 벤젠에 대한 여러 연구들은 간독성 및 백혈병 유발을 결정하는 대사경로에 집중되었다(Henderson, R.F., Environ . Health Perspect ., 104(suppl 6):1173-1175, 1996; Snyder, R. and Hedli, C.C., Environ . Health Perspect ., 104(suppl 6):1165-1171, 1996). 주요 간 효소인 사이토크롬(cytochrome) P4502E1(CYP2E1)에 의한 반응성 대사에 비해 상대적으로 벤젠의 대사는 세포독성 및 유전자 독성을 야기한다(Gut, I., et al., Arch. Toxicol ., 71:45-56, 1996; Valentine, J.L., et al. Appl . Pharmacol ., 141:205-213, 1996). 1차 벤젠 대사 산물로는 페놀(phenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 카테콜(catechol) 및 트랜스 트랜스 뮤콘산(trans trans muconic acid)을 포함한다(Ross, D., J. Toxicol Environ . Health, A, 61:357-372, 2000). 이들은 상호작용하여 보다 크고 악화된 벤젠의 독성을 야기한다(Chen, H. and Eastmond, D.A., Carcinogenesis, 16:1963-1969, 1995). 다중 대사 유전자 독성의 기작은 독성 기작의 관점에서 다른 화합물과는 구별하는 벤젠의 특성이다. 골수에 존재하는 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO)에 의한 연속적인 2차 대사 활성은 유전자 독성 퀴닌(quinine) 및 활성산화종(reactive oxygen species)의 생산을 야기한다. 이들은 골수 기질세포(stromal cell)의 조혈세포의 손상 및 기능 장애를 유발한다(Farris, G.M., et al., Fundam Appl . Toxicol ., 36:119-129, 1997). 수십 년에 걸친 연구에도 불구하고 독성 및 백혈병 유발을 유도하는 벤젠의 기작은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 이들 기작은 대사(Snyder, R. and Hedli, C.C., Environ . Health Perspect ., 104(suppl 6):1165-1171, 1996), 성장인자 조절(Niculescu, R., Chem . Biol . Interact ., 98:211-222, 1995), 산화적 스트레스(Laskin, D.L., Environ . Health Perspect ., 104(suppl 6):1283-1287, 1996), DNA 손상(Lee, E.W. and Garner, C.D., Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108:497-508, 1991), 세포주기조절(Yoon, B.I., et al., Exp . Hematol ., 29:278-285, 2001b) 및 프로그램된 세포죽음을 포함하는 다양한 경로에 의해 복합되어 있다.
지금까지 벤젠 독성의 분자적 기작을 밝혀내기 위해 cDNA 마이크로어레이 분석을 이용한 다양한 연구가 수행되었다. 마우스의 골수에서 간독성을 유발하는 벤젠의 기작을 연구하기 위해 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행되었다(Yoon, B.I., et al., Environ . Health Perspect ., 111:1411-1420, 2003). 또한 랫트(rat)의 간 내 유전자 발현에 있어서 벤젠의 경구 노출의 효과가 보고되었다(Heijne, W.H., et. al., Mutat. Res ., 575:85-101, 2005). 상기 보고에서 유전자 발현 변화는 생체 내 변화, 글루타치온(glutathione) 합성, 지방산 및 콜레스테롤 대사와 관련된 경로에 의한 것이었다. 또한 하이드로퀴논(hydroquinone)이 대식세포(Macrophage)에서 IL-12의 생산을 억제함으로써 벤젠의 알레르기성 면역반응을 증가할 수 있음이 보고되었다(Kim, E., et al., Immunol . Lett, 99:24-29, 2005). 또한 벤젠이 노출된 작업자의 말초혈액의 마이크로어레이 분석이 보고되었다(Forrest, M.S., et.al., Environmental Health Perspectives, 113:801-807, 2005). 상기 보고에서 벤젠 노출의 잠재적인 바이오마커로서 CXCL16, ZNF331, JUN 및 PF4의 발현 변화를 보였다. 또한, 종양 관련 유전자(Xia, Y., et. al., Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi 23:256-259, 2005) 및 면역 반응성 유전자(Wang, H., et.al., Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi 23:252-255, 2005)가 벤젠의 독성에 의해 고통받는 환자들에서 발현 변화를 나타내었다. 그러나 벤젠 노출에 의 한 간독성(hepatotoxicity)과 관련된 유전자 발현의 개요 및 경로는 보고되지 않았다.
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 애질런트(Agilent), 지노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진식각공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, 애질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며, 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색이 가능하게 될 것이다.
다양한 외래 물질들(xenobiotics)은 표적 기관에서 특정 유전자의 발현 변화를 나타낸다. Minami 등(2005)은 아세타미노펜(acetaminophen; APAP), 브로모벤젠(bromobenzene), 카본테트라클로라이드(carbontetrachloride), 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine) 및 티오아세타마이드(thioacetamide)가 간독성의 잠재적인 바이오마커임을 확인하였다(Minami, K., et al ., Toxicol . Sci ., 87:296-305, 2005). Smith 등(2005)은 독성유전체학이 벤젠 독성의 바이오마커를 만드는데 있어서 상당한 잠재성이 있음을 보여주었다(Smith, M.T., et al ., Chem . Biol . Interact., 30:153-154, 2005). 그들은 100개 이상의 다양하게 발현된 유전자들을 확인하였고, 이들 세포자살 및 면역 기능과 관련된 유전자들이 직업상 벤젠에 노출된 사람들에서 상당히 영향을 받았음을 확인하였다. 윤 등(2003)은 마우스 골수, 및 C57BL/6, 야생형(WT) 및 p53-녹아웃(KO) 마우스에서 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 벤젠 유발 간독성 및 백혈병을 조사하였다(Yoon, B.I., et al ., Environ . Health Perspect., 111:1411-1420, 2003). 그들은 p53 유전자의 기능장애가 조혈모세포의 종양을 가져오는 치명적인 문제를 유발하는 것을 제시하였다. Heijne 등(2005)은 28일간 벤젠에 경구 노출시킨 랫트(rat)의 간에서 벤젠 유발 유전자 발현의 변화가 생체 내 변환(biotransformation), 글루타치온 합성, 지방산 및 콜레스테롤 대사의 경로를 방해하는 것임을 확인하였다(Heijne, W.H., et al ., Mutat . Res., 575:85-101, 2005). Wang 등(2005)은 벤젠에 노출된 환자의 백혈구 유전자 발현 경향에 관한 연구에서 벤젠 독성과 관련된 38개의 유전자들을 확인하였다(Wang, H., et al ., Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi 23:252-255, 2005). Chen 등(2005)은 벤젠에 노출된 환자들에서 백혈구의 cDNA 마이크로어레이 분석을 통하여 발현이 변화된 25개의 유전자들을 확인하였다(Chen, L., et al., Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi 23:248-251, 2005). Rana 등(2007)은 생체리듬이 벤젠에 의해 유도된 지질과산화물에 영향을 받는 것을 확인하였다(Rana, S.V.S., et al ., Indian J. Exp . Biol ., 45:253-257, 2007). Leung와 Harrison(1998), 및 Starek 등(1990)은 벤젠에 대한 인간과 쥐의 민감성을 조사하였다(Leung, P.L. et al ., Occup . Env . Med ., 55:249-255, 1998; Starek, A., et al., Folia Med . Cracov ., 31:279-284, 1990). Rana 및 Verma(2007)은 벤젠의 생화학적 독성을 조사하였다(Rana, S.V.S., et al ., Indian J. Exp . Biol ., 45:253-257, 2007). 그러나 간에서 벤젠에 의해 유도되는 유전자 발현 변화에 대한 보고 는 전무하다.
이에, 본 발명자들은 DNA 마이크로어레이를 이용하여 벤젠 노출에 의한 유전자 발현의 변화를 확인하여 벤젠에 의해 시간 의존적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자를 발굴하여 벤젠 노출에 의한 간독성의 초기 효과를 검출할 수 있는 분자적 마커를 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간독성 유발 물질인 벤젠(benzene)에 의해 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 간독성을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간독성 유발 물질인 벤젠(benzene)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 간독성 유발 여부 진단용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 간독성 유발 여부 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 간독성 유발 여부 진단 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 간독성 유발 여부 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 벤젠(benzene)에 의해 유도된 간독성 유발 여부 진단용 바이오마 커 및 이를 이용한 간독성 진단 방법은 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 벤젠의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 벤젠 노출에 의해 유발되는 간독성(hepatotoxicity) 및 백혈병의 작용 기작을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 간독성 유발 물질인 벤젠(benzene)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 간독성 유발 여부 진단용 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 벤젠에 의해 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 생체내 변환(biotransformation), 해독(detoxification), 세포자살(apoptosis), 산화적 스트레스(oxidative stress) 및 세포주기(cell cycle)의 경로에 관련되는 것으로 밝혀졌다. 이는 생체리듬(circadian rhythms)에 관련된 유전자들이 벤젠에 의해 유도된 간독성과 관련이 있음을 의미한다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1).
1) 상기 바이오마커 중에서 벤젠의 노출에 의해 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전 자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14).
2) 상기 바이오마커 중에서 벤젠의 노출에 의해 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번 호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번 호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1).
본 발명자들은 벤젠의 의한 간독성 유발 기작을 알아보기 위하여, 생화학 및 조직병리학적 관찰을 수행하였다. 우선, 동물 모델인 BALB/C 마우스에 벤젠을 투여한 후 24시간 및 6일 후 희생된 각 마우스로부터 혈청을 수득하여 자동 임상 화학 분석기를 이용하여 알라닌 아미노트랜스페라아제(Alanine aminotransferase, ALT), 아스파르트산 아미노트랜스페라아제(aspartate aminotransferase, AST), 알칼라인 포스파테아제(alkaline phosphatease, ALP)을 분석하였다. 그 결과, AST, ALT 및 ALP 값의 경우, 벤젠 처리 24시간 후 희생된 마우스에서 상당히 증가하였으나 벤젠 처리 6일 후 희생된 군은 이들의 활성이 상당히 감소하였다(도 1 참조). 또한, 상기 각 시간대에 희생된 마우스로부터 수득된 간의 일부를 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군 마우스의 간은 비대성 장애(hypertrophic lesion)가 관찰되지 않았고(도 2 참조), 벤젠 처리 24시간 후 희생된 마우스의 간은 미세한 비대(micro balooning)가 있지만 큰 괴저성 부위는 관찰되지 않았으나(도 3 참조), 벤젠 처리 6일 후 마우스의 간은 일부 부위에 비대성 장애가 관찰되었다(도 4 참조). 따라서, 생체 내에서 벤젠은 노출 6일 후에 간에서 작용 기작이 촉진되는 것을 확인함으로써, 벤젠 처리 6일 후에 발현이 변화하는 유전자를 이용하면 간의 초기 작용 효과를 검출할 수 있는 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 간독성 유발 여부 진단용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 벤젠을 동물 모델인 BALB/C 마우스에 투여하여 24시간 및 6일 후 마우스를 희생하여 수득한 간에서 전체 RNA를 추출하여, cDNA를 합성하고 이를 이용하여 cRNA를 합성한 후, 단편화 과정을 거쳐 마우스 올리고 칩과 혼성화하고 데이터를 분석하였다. 그 결과, 벤젠 처리 6일 후 44개의 유전자들이 영향을 받았음을 확인하였다. 상기 유전자들 중 25개의 유전자들은 발현이 감소하였고, 19개의 유전자들은 발현이 증가하였다. 상기 유전자들을 분석한 결과, 생체이물의 대사(Cyp2b10), 전사인자(Gtf2ird1), 세포부착(Cldn15 및 Cldn1), 생체리듬(Per3 및 Arnt1), 사이토카인(Pdgfc), 및 글리신, 세린 및 트레오닌 대사(Gldc)에 관련된 유전자들의 발현은 감소하였고(표 1 참조), 스테로이드의 생합성(Hmger), 세포주기(Mcm5 및 Mee), 지방산 생합성(Fasn), 글루타치온 대사(Gstm3), 글리세롤리피드 대사(Lipg), 해당(Pklr), 당신생, MAPK 신호경로(Hspa1a) 및 퓨린 대사(Ecgf1)에 관련된 유전자들의 발현은 증가하였음을 확인하였다(표 2 참조).
상기 경로 분석은 벤젠 독성이 칼슘 신호(calcium signaling), 트랜스퍼라아제(transferase) 및 열충격 단백질(heat shock protein)과 관련성이 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 간독성 유발 여부 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 유전자의 20 내지 50개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 25개의 핵산을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 간독성 유발 여부를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은
1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하는 단게;
3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 cDNA를 cRNA로 합성하는 단계;
4) 단계 3)의 실험군과 대조군의 cRNA를 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 마이크로어레이를 이용하여 혼성화하는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 간독성 유발 여부 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2) 및 단계 3)의 cDNA 및 cRNA의 합성은 Affymetrix사의 키트를 이용하여, 상기 제조사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 혼성화는 40 내지 50℃에서 10 내지 20시간 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 5)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이를 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 통계적 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 염색 및 세척은 uidics Station 450을 이용하고, 스캔은 GeneChip scanner® 3000을 이용하며, 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip® Operating System(GCOS)을 이용하며, 모든 절차는 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 통계학적 분석은 GenPlex software version 2.3을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 간독성 유발 여부 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 마이크로어레이는 칩을 제작하여 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩은 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 1 및 표 2 참조)가 탑재된 것이라면 모두 사용 가능하다. 또한, 단계 4)의 분석은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 본 발명의 바이오마커 유전자에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 간독성 유발 여부 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.
아울러, 본 발명은 간독성 유발 여부 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 간독성 유발 여부 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에 추가적으로 간세포를 포함할 수 있다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼린 포스파타제 접합물질(streptavidin-alkaline phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemiflurorenscent) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
상기 키트에 추가적으로 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전 자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함시킬 수 있다. 상기 프라이머는 상기 바이오마커 유전자에 상보적이며, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 벤젠에 의한 간 내 변화 관찰
<1-1> 벤젠을 마우스에 적용
대략 9주령의 BALB/c 수컷 마우스(SLC, Inc., Japan)들은 실험하기 2주 전부터 12시간 명/암 주기로, 온도 및 습도 조절 하에 사육실에서 사육하였다. 상기 마우스들은 표준 식품 사료 및 물을 임의로 제공받았다. 상기 마우스들의 체중은 24 ~ 27 g(mean±SD, 25.75±0.97)이었다. 순수한 벤젠(99%)(Sigma-Aldrich, U.S.A)은 2%(v/v)의 벤젠/옥수수유 용액을 만들기 위해 옥수수유로 희석하였다. 상기 희석된 벤젠은 마우스들에게 복막 내로 투여(0.05 ml의 희석된 벤젠/100 g 체중)하였다. 대조군 마우스는 동일한 양의 식염수가 처리하였다. 상기 벤젠이 처리된 마우스들은 처리 후 24시간 및 6일에 각각 5마리씩 희생하였다. 또한, 대조군을 동시에 희생하였다.
<1-2> 생화학적 분석
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 실험군 및 대조군 마우스들의 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 혈액을 채취하여 원심분리를 이용하여 혈청을 분리하였다. 상기 혈청에서 알라닌 아미노트랜스페라아제(Alanine aminotransferase, ALT), 아스파르트산 아미노트랜스페라아제(aspartate aminotransferase, AST), 알칼라인 포스파테아제(alkaline phosphatease, ALP)의 활성을 자동 임상 화학 분석기(Fuji Dri-Chem 3500s; Fujifilm, Japan)를 이용하여 각 시간대에서 검출하였다. 데이터는 통계학적으로 계산하였고, 실험군 및 대조군 간의 유의성 차이는 Dunnett 시험에 따른 one-way ANOVA(analysis of variance)을 이용하여 시험하였다. 0.05 이하의 P값은 유의성이 있는 것이다.
그 결과, AST 및 ALT 값의 경우, 벤젠 처리 24시간 후 희생된 군은 대조군에 비해 상당히 증가하였으나 벤젠 처리 6일 후 희생된 군은 이들의 활성이 상당히 감소하였다(도 1). 또한, ALP 값의 경우, 벤젠 처리 24시간 후 희생된 군은 대조군에 비해 상당히 증가하였으나 벤젠 처리 6일 후 희생된 군은 이의 활성이 상당히 감소하였다.
<1-3> 조직병리학적 관찰
상기 실시예 <1-1>에서 수득된 실험군 또는 대조군 마우스들의 간의 중간엽(mid liver lobe)으로부터 수집된 간의 일부들을 10% 중성 완충포르말린(neutral buffered formalin)으로 고정하고, 알코올로 탈수한 후, 자일렌(xylene)으로 세척한 다음 파라핀(paraffin)에 방치하였다. 절단(4 ㎛ 두께)은 RM2165 마이크로톰(Lerica, Germany)를 이용하여 수행되었으며, 헤마토자일린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색한 후 광학 현미경(Nikon E400, Japan)으로 관찰하였다. 이때 소엽(lobule)의 중심소엽성 부위(centrilobular region)의 간세포가 비교되었다.
그 결과, 벤젠 처리 6일 후 희생된 마우스의 간은 유의적인 조직병리학적 변화가 없었으나, 일부 부위에 비대성 장애(hypertrophic lesion)가 관찰되었다(도 4). 그러나, 벤젠 처리 24시간 후 희생된 마우스의 간세포는 미세한 비대(micro balooning)가 있으나, 큰 괴저성 부위는 관찰되지 않았다(도 3). 대조군 마우스들의 간에서는 비대성 장애가 관찰되지 않았다(도 2).
< 실시예 2> 벤젠에 의한 간 내 유전자 변화 측정
벤젠 및 담체(옥수수유)를 처리한 마우스의 간 유전자 발현의 차이를 결정하기 위해 마이크로어레이 분석이 수행되었다.
<2-1> RNA 의 분리
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 벤젠 처리 24시간 및 6일 후 시험군들의 간을 Trizol® 시약(Invitrogen, USA)으로 균질화한 후 0.4 ml 클로로포름을 혼합하였다. 상기 혼합물을 원심분리한 후, 수상(aqueous phase)을 수집하여 침전용 이소프로판올(isopropanol)과 혼합하였다. RNA 침전물은 에탄올로 세척하였다. 분리된 전체 RNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하여 정제하였다. 전체 RNA는 NanoDrop® ND-1000(NanoDrop, USA)을 이용하여 정량되었고, RNA의 순도는 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technology, Germany)를 이용하여 평가되었다.
<2-2> 마이크로어레이 분석
22,600개 이상의 프로브(probe) 세트들 포함하는 Affymetrix GeneChip® 마우스 430A 2.0을 이용하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 이중-가닥 cDNA는 One Cycle cDNA Synthesis kit(Affymetrix, U.S.A.)을 이용하여 5 ug의 주형 전체 RNA로부터 합성하였고, 비오틴(biotin)으로 표지된 cRNA는 IVT Labeling kit(Affymetrix, U.S.A.)을 이용하여 합성하였다. 상기 형광 표지된 cRNA는 GeneChip® Sample Cleanup Module(Affymetrix, U.S.A.)로 정제되었다. 상기 cRNA의 특성 및 양은 각각 겔 전기영동 및 NanoDrop® ND-1000(NanoDrop, U.S.A.)을 수행하여 확인하였다. 각 시료의 정제된 15 마이크로그램(microgram)의 cRNA는 45℃에서 16시간 동안 어레이(array)에 단편화 및 혼성화하였다. 모든 어레이들은 fluidics Station 450(Affymetrix, U.S.A.)을 이용하여 자동으로 세척 및 염색하였 고, GeneChip scanner® 3000(Affymetrix, U.S.A.)으로 스캔하였다. 모든 절차는 제조사의 프로토콜(Affymetrix, U.S.A.)에 따라 수행하였다. 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip® Operating System(GCOS)을 이용하여 수행하였다.
<2-3> 유전자 발현 분석
상기 실시예 <2-2>의 프로세싱 절차의 결과물인 세포 농도 파일(CEL) 및 하기의 통계학적 분석은 GenPlex software version 2.3(ISTECH Inc., Korea)을 이용하여 수행하였다. 마이크로어레이 데이타는 전체적으로 표준화하였고, 추가적인 분석을 위해 사용하였다. 14,000개 이상의 마우스 유전자들을 나타내는 전체 22,600개의 프로브는 계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 및 유전자 발현분석에 적용하였다. 상기 차별적으로 발현된 유전자는 대조군과 비교하여 벤젠 처리 1일 및 6일 후 희생된 실험군에서 최소 2배의 발현 변화를 가지는 유전자들을 선별하였다. 데이타는 Student's t test에 의해 통계학적으로 분석되었고, 통계적 유의성은 P값이 <0.01이었다. 상기 선별된 유전자들은 extension GCOS filtering에 의해 여과되었다. 또한, 벤젠 처리 6일 후 희생된 실험군은 벤젠 처리 후 1일 후 희생된 실험군에 비교하여 상기와 동일한 기준(최소 2배의 발현 변화 및 P값 <0.01)으로 선별하였다. 모든 선별된 유전자들은 피어슨 상관분석 및 완전연결법(Pearson correlation and Complete Linkage)(Eisen, 1998)을 기초로 2차원 계층적 클러스터링에 의해 분석되었다. 벤젠 처리 1일 및 6일 후 희생된 실험군은 대 조군과의 차이를 주성분분석(Principal Component Analysis, PCA)에 의해 나타내었다. 원하는 유전자들에 대한 경로의 분류는 KEGG pathway database를 이용하여 수행하였다. 상기 선별된 유전자들의 정보는 http://www.affymetrix.com에 연결된, NetAffx를 근거로 작성되었다.
그 결과, 스팟(spot) 및 칩(chip) 마다 표준화한 후 대조군의 정도에 대한 표준 편차를 통해서, 22,600개의 프로브 세트들로부터 전체 136개의 확정된 유전자가 검출되었다. 상기 유전자들은 Student's t test(P값은 0에서 0.05)에 따라 분류되었다. 44개의 유전자가 ANOVA를 이용한 9개의 조건 중에서 적어도 3개에서 2배 이상의 변화를 근거로 선별되었다. 상기 분석 결과는 하기 표 1 및 표 2에 기재된 바와 같다(표 1 및 표 2). 6일 동안 벤젠이 처리된 마우스 간에서 유의적 변화(P값<0.05 → 0.01)를 나타내는 유전자들은 하기 표 3에 기재된 바와 같다(표 3). 도 5에서 보는 바와 같이, 대조군 마우스들의 대응하는 유전자들에 비해 실험군들의 유전자 발현에 있어서 시간 의존적인 변화를 나타내었다. 또한, 벤젠 처리에 대한 상기 유전자들의 계층적인 클러스터링 및 내성이 유전자 발현에 있어서 시간 의존적인 변화를 나타내었다(도 5). 아울러, 유전자 발현 변화를 보여주는 주요성분분석(principal component analysis)의 결과는 도 6에 나타낸 바와 같다(도 6).
본 발명자들은 t-test 및 배(fold) 차이 필터링된 44개의 유전자가 벤젠 처리에 의해 발현수준이 증가 또는 감소하였다. 차별적으로 조절된 유전자는 벤젠 독성에서 칼슘 신호경로(calcium signaling pathway), 세포부착 분자 경로(cell adhesion molecules pathway), 생체리듬(circadian rhythms), 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferases) 및 열충격 단백질(heat shock proteins)에 관련된 것들이었다.
6일간 벤젠 처리에 의해 마우스의 간에서 발현이 감소하는 유전자
유전자 약어 유전자 명 평균 배 변화 P-값 mRNA 등록번호
Cyp2b10 cytochrome P450,
family 2, subfamily b,polypeptide 10		 0.281536405 0.001011593 NM_009998;
NM_009999
Gtf2ird1 general transcription
factor III repeat domaincontaining 1		 0.413325939 0.004871763 NM_020331
Avpr1a arginine vasopressin
receptor 1A		 0.324488832 0.004461284 NM_016847
Avpr1a arginine vasopressin
receptor 1A		 0.36705761 0.001599135 NM_016847
H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha 0.306047979 0.004596735 NM_010378
Cldn15 claudin 15 0.48776276 2.72E-04 NM_021719
Cldn1 claudin 1 0.260820687 5.28E-04 NM_016674
Cldn1 claudin 1 0.229626388 0.002089479 NM_016674
Clock circadian locomoter output cycles kaput 0.377440404 5.77E-05 NM_007715
Clock circadian locomoter output cycles kaput 0.424112305 0.004717732 NM_007715
Arntl aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 0.173296253 0.001789661 NM_007489
Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide 0.344610509 9.98E-04 NM_019971
Cyp4a10;
BC013476		 cytochrome P450,
family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476		 0.065019519 5.66E-04 NM_010011;
NM_201640
Pla2g7 phospholipase A2, group VII (platelet-activating
factor acetylhydrolase,
plasma)		 0.453285144 5.67E-04 NM_013737
Gldc glycine decarboxylase 0.422548113 0.001410781 NM_138595
Chka Choline kinase alpha 0.313032262 0.001080842 NM_001025566;
NM_013490
Cd24a CD24a antigen 0.395079154 0.003244021 NM_009846
Ddc dopa decarboxylase 0.403510366 0.001461128 NM_016672
Psen2 presenilin 2 0.480851803 0.001028252 NM_011183
Mthfr 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 0.312663634 6.40E-04 NM_010840
Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1 0.442942648 0.008907761 NM_010442
Ecgf1 endothelial cell growth factor 1(platelet-derived) 0.45767403 0.001281208 NM_138302
Sphk2 sphingosine kinase 2 0.449968706 5.78E-04 NM_020011;
NM_203280
Tjp3 tight junction protein 3 0.328536042 0.003973921 NM_013769
Tjp2 tight junction protein 2 0.494447722 0.001988285 NM_011597
표 1에서 보는 바와 같이, 벤젠 처리 6일 후 발현이 감소한 유전자들은 생체이물의 대사(metabolism of xenobiotics)(Cyp2b10), 전사인자(transcription factor)(Gtf2ird1), 세포부착(cell adhesion)(Cldn15 및 Cldn1), 생체리듬(circadian rhythm)(Per3 및 Arnt1), 사이토카인(cytokines)(Pdgfc), 및 글리신, 세린 및 트레오닌 대사(glycine, serine and thireonine metabolism)(Gldc)에 관련된 유전자들이었다.
6일간 벤젠 처리에 의해 마우스의 간에서 발현이 증가하는 유전자
유전자 약어 유전자 명 평균 배 변화 P-값 mRNA 등록번호
Hmgcr 3-hydroxy-3-methylglutaryl-
Coenzyme A reductase		 2.891840187 0.001640616 NM_008255
Aacs acetoacetyl-CoA synthetase 2.563580176 0.003499423 NM_030210
Mcm5 minichromosome
maintenance defi cient 5,
cell division cycle 46
(S. cerevisiae)		 2.300496316 0.003483556 NM_008566
Wee1 wee 1 homolog (S. pombe) 7.053930707 0.001572758 NM_009516
Per2 period homolog 2 (Drosophila) 3.369578754 0.008408468 NM_011066
Bhlhb2 basic helix-loop-helix
domain containing, class B2		 3.728728789 0.001394815 NM_011498
Per3 period homolog 3 (Drosophila) 3.854051492 0.008180266 NM_011067
Fasn fatty acid synthase 2.499244207 0.001200169 NM_007988
Gstm3 glutathione S-transferase,
mu 3		 3.142999858 0.00703031 NM_010359
Lipg lipase, endothelial 2.670982122 5.59E-04 NM_010720
Pklr pyruvate kinase liver
and red blood cell		 2.80962902 0.001207647 NM_013631
Pkl pyruvate kinase liver
and red blood cell		 2.946723297 0.006457597 NM_013631
Pkl pyruvate kinase liver
and red blood cell		 2.922004272 3.51E-04 NM_013631
Hspa1a heat shock protein 1A 8.965401248 0.00735716 NM_010479
Egfr epidermal growth factor
receptor		 2.884090081 0.005691373 NM_007912;
NM_207655
Gadd45a growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha 2.007231563 0.008967359 NM_007836
Ppat phosphoribosyl
pyrophosphate
amidotransferase		 2.204661449 0.001375383 XM_001002879;
XM_001002886;
XM_896000;
XM_924520;
XM_973896;
XM_973937;
XM_973938;
XM_973973
Gbe1 glucan (1,4-alpha-),
branching enzyme 1		 2.143906958 0.002461176 NM_028803
Gys2 glycogen synthase 2 2.108060527 0.002009201 NM_145572
표 2에서 보는 바와 같이, 벤젠 처리 6일 후 발현이 증가한 유전자들은 스테로이드의 생합성(biosynthesis of steroids)(Hmger), 세포주기(cell cycle)(Mcm5 및 Mee), 지방산 생합성(fatty acid biosynthesis)(Fasn), 글루타치온 대사(glutathione metabolism)(Gstm3), 글리세롤리피드 대사(glycerolipid metabolism)(Lipg), 해당(glycolysis)(Pklr), 당신생(gluconeogenesis), MAPK 신호경로(MAPK signaling pathways)(Hspa1a) 및 퓨린 대사(purine metabolism)(Ecgf1)에 관련된 유전자들이었다.
두 시간대(벤젠 처리 1일 및 6일) 사이 마우스의 간에서 유전자 발현의 비교
유전자 약어 유전자 명 평균 배 변화 P-값 mRNA 등록번호
P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline
4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide		 2.591853506 0.004172616 NM_011030
P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate
4-dioxygenase (proline
4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide		 2.104156061 0.006374143 NM_011030
Ifitm1 interferon induced
transmembrane protein 1		 2.049667285 1.57E-04 NM_026820
Ccnd2 cyclin D2 2.296233152 0.005968229 NM_009829
Clock circadian locomoter
output cycles kaput		 0.395914404 8.26E-04 NM_007715
Cry1 cryptochrome 1(photolyase-like) 2.016943891 0.005553137 NM_007771
Acly ATP citrate lyase 2.0650066 0.001685516 NM_134037
Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5 0.448882656 0.007355149 NM_009917
Fasn fatty acid synthase 2.612494125 4.47E-04 NM_007988
Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14 0.041921708 0.004694101 NM_007822
Cyp4a10;
BC013476		 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence
BC013476		 0.064562689 0.001113474 NM_010011;
NM_201640
Gstm3 glutathione S-transferase, mu 3 3.251600332 0.005704424 NM_010359
Pla2g7 phospholipase A2, group VII
(platelet-activating factor
acetylhydrolase, plasma)		 0.451785594 0.001250882 NM_013737
Pklr pyruvate kinase liver
and red blood cell		 2.600750828 0.001583053 NM_013631
Pklr pyruvate kinase liver
and red blood cell		 3.252169263 0.00849695 NM_013631
Pklr pyruvate kinase liver
and red blood cell		 2.753805631 0.003288804 NM_013631
Cd24a CD24a antigen 0.444671589 0.003072713 NM_009846
Hspa1a heat shock protein 1A 8.966809881 0.006796064 NM_010479
Hspb1 heat shock protein 1 2.349998728 0.008158746 NM_013560
Id3 inhibitor of DNA binding 3 2.42776977 2.65E-04 NM_008321
Id1 inhibitor of DNA binding 1 2.226588424 1.97E-04 NM_010495
표 3에서 보는 바와 같이, 벤젠 처리 24시간 후 발현 변화에 영향을 받은 유전자들은 β-세포 수용체 신호경로(Ifitm1), 세포주기; 신호경로; 국소부착; Jak-STAT 신호경로, 생체리듬(Cry1), 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용(Ccr5), 글루타치온 대사(Gstm3), 조혈세포계(Cd24a) 및 TGF-β 신호경로(Id3 및 Id1)에 관련된 유전자들이었다.
도 1은 벤젠 처리 후 두 시간대(1일 및 6일)의 마우스 혈청을 자동임상분석기를 이용하여 측정한 알라닌 아미노트랜스페라아제(Alanine aminotransferase, ALT), 아스파르트산 아미노트랜스페라아제(aspartate aminotransferase, AST), 알칼라인 포스파테아제(alkaline phosphatease, ALP)의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2는 대조군 마우스의 간세포(hepatocyte; HC)가 정상적임을 나타내는 형광현미경(x400)을 통해 관찰한 그림이다.
도 3은 벤젠 처리 24시간 후 희생된 마우스의 간세포에서 미세한 비대가 있음을 나타내는 형광현미경(x400)을 통해 관찰한 그림이다.
도 4는 벤젠 처리 6일 후 희생된 마우스의 간세포에서 비대성 장애가 있음을 나타내는 형광현미경(x400)을 통해 관찰한 그림이다.
도 5는 벤젠 처리 후 두 시간대(1일 및 6일)의 마우스 간세포의 유전자 발현 양상을 마이크로어레이 칩을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 벤젠 처리 후 두 시간대(1일 및 6일)의 마우스 간세포의 유전자 발현 양상을 주요성분분석기(Principal component analysis)를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그림이다:
C: 대조군;
1: 벤젠 처리 후 1일 군; 및
6: 벤젠 처리 후 6일 군.

Claims (12)

  1. 하기의 모든 유전자 서열의 전부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 벤젠 노출 여부 확인용 마이크로어레이:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1).
  2. 제 1항에 있어서, 하기 유전자는 간독성 유발 물질의 노출에 의해 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 벤젠 노출 여부 확인용 마이크로어레이:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14).
  3. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 간독성 유발 물질에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 벤젠 노출 여부 확인용 마이크로어레이:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1).
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하는 단게;
    3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 cDNA를 cRNA로 합성하는 단계;
    4) 단계 3)의 실험군과 대조군의 cRNA를 제 1항의 마이크로어레이를 이용하여 혼성화하는 단계;
    5) 단계 4)의 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤젠 노출 여부 확인 방법.
  7. 1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤젠 노출 여부 확인 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 벤젠 노출 여부 확인 방법.
  9. 1) 실험군인 피검체 유래 간세포와 대조군 간세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를, 하기의 각각의 유전자에 상보적이고 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 모두 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1); 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 벤젠 노출 여부 확인 방법.
  10. 제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 것을 특징으로 하는 벤젠 노출 여부 확인용 키트.
  11. 제 10항에 있어서, 간세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벤젠 노출 여부 확인용 키트.
  12. 하기의 각각의 유전자에 상보적이고 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 모두 포함하는 벤젠 노출 여부 확인용 키트:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_009998 및 NM_009999(Cyp2b10, cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020331(Gtf2ird1, general transcription factor III repeat domaincontaining 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016847(Avpr1a, arginine vasopressin receptor 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010378(H2-Aa histocompatibility 2, class II antigen A, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_021719(Cldn15, claudin 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016674(Cldn1, claudin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007715(Clock, circadian locomoter output cycles kaput), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007489(Arntl, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), 유전자 등록번호(Genebank) NM_019971(Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010011(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201640(Cyp4a10; BC013476 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 10; cDNA sequence BC013476), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013737[Pla2g7, phospholipase A2, group VII(platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138595(Gldc, glycine decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001025566(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013490(Chka, Choline kinase alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009846(Cd24a, CD24a antigen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016672(Ddc, dopa decarboxylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011183(Psen2, presenilin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010840(Mthfr, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010442[Hmox1 heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_138302[Ecgf1, endothelial cell growth factor 1(platelet-derived)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_020011 및 NM_203280(Sphk2, sphingosine kinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013769(Tjp3, tight junction protein 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011597(Tjp2, tight junction protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009917[Ccr5 chemokine(C-C motif) receptor 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007822(Cyp4a14 cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008255(Hmgcr, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_030210(Aacs, acetoacetyl-CoA synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008566[Mcm5 minichromosome maintenance defi cient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_009516[Wee1, wee 1 homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011066[Per2 period homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_011498(Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011067[Per3 period homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_007988(Fasn, fatty acid synthase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010359(Gstm3, glutathione S-transferase, mu 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010720(Lipg, lipase, endothelial), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013631(Pklr, pyruvate kinase liver and red blood cell), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010479(Hspa1a, heat shock protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007912 및 NM_207655(Egfr, epidermal growth factor receptor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007836(Gadd45a, growth arrest and DNA-damageinducible 45 alpha), 유전자 등록번호(Genebank) XM_001002879, XM_001002886, XM_896000, XM_924520, XM_973896, XM_973937, XM_973938 및 XM_973973(Ppat, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_028803[Gbe1 glucan(1,4-alpha-), branching enzyme 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_145572(Gys2 glycogen synthase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_011030[P4ha1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase(proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide], 유전자 등록번호(Genebank) NM_026820(Ifitm1, interferon induced transmembrane protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_009829(Ccnd2, cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007771[Cry1, cryptochrome 1(photolyase-like)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_134037(Acly, ATP citrate lyase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_013560(Hspb1, heat shock protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_008321(Id3, inhibitor of DNA binding 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_010495(Id1, inhibitor of DNA binding 1).
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