KR101186699B1 - 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 휘발성 유기화합물의 투여를 통해 동정한 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커는 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자로 휘발성 유기화합물에 노출 시 혈액으로부터 특이적으로 검출되는 표지자이므로, 이러한 바이오마커를 휘발성 유기화합물, 특히 디클로로메탄, 에질벤젠, 트리클로로에틸렌의 노출에 대한 모니터링 및 위해성 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 이로 인해 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 휘발성 유기화합물에의 노출에 따른 위해성을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 휘발성 유기화합물에 대한 위해성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs)은 증기압이 높아 대기 중으로 쉽게 증발되는 액체 또는 기체상 유기화합물의 총칭으로, 대기 중에서 질소산화물과 공존하면 햇빛의 작용으로 광화학반응을 일으켜 오존 및 팬(PAN:퍼옥시아세틸 나이트레이트) 등 광화학 산화성물질을 생성시켜 광화학스모그를 유발하는 물질을 통틀어 일컫는다. 대기오염물질이며 발암성을 지닌 독성 화학물질로서 광화학산화물의 전구물질이기도 하다. 또한 지구온난화의 원인물질이며 악취를 일으키기도 한다. 따라서, 국가마다 배출을 줄이기 위해 정책적으로 관리하고 있다.
또한, 휘발성 유기화합물은 피부접촉이나 호흡기 흡입을 통해 신경계에 장애를 일으키는 발암물질이다. 이들 휘발성 유기화합물은 대개의 경우 저농도에서도 악취를 유발하며, 화합물 자체로서도 환경 및 인체에 직접적으로 유해하거나 대기 중에서 광화학반응에 참여하여 광화학산화물 등 2차 오염물질을 생성하기도 한다.
최근에는 빠른 산업화에 따른 환경오염이 심각해짐에 따라 극미량의 환경유해 물질의 위험성을 조기에 확인하고 분석할 수 있는 효과적인 분석 시스템이 필요하며, 특히 저 농도로 장기간 축적되는 형태의 환경유해물질노출에 의한 인간의 건강 피해 평가는 매우 중요한 환경기술로 대두되고 있다. 최근의 유해성 평가기술은 과거의 고용량으로 실험된 독성실험결과에 의존하기보다는 현실적인 생활환경에서의 인체노출 수준을 반영할 수 있는 저용량 노출영향규명에 초점을 두고, 저용량 노출에서의 유해 영향이 나타나지 않는 수준을 고려하여 관리기준을 설정하는 방법으로 발전하고 있다.
한편, 고전적으로, 환경유해 물질들을 평가하기 위해서는 생체 외에서(in vitro), 즉 96 웰 플레이트와 같은 세포배양 플레이트에서 세포를 배양한 후 독성물질을 처리하고 MTT 분석을 통해 살아있는 세포의 수를 흡광도를 통하여 검출하거나 직접 생체 내(in vivo), 즉 동물실험을 수행하여 생화학적, 혈액학적, 병리학적 소견을 보는 방법이 주로 사용되었다. 이러한 방법은 많은 시료와 시간이 소모되고 동물실험에서 오는 윤리적 문제가 존재한다.
세계적으로 이러한 환경 위해성 물질들의 위해성을 예측하기 위한 많은 연구가 진행되고 있는데, 독성이 알려진 물질 및 미지의 물질에 대한 위해성을 평가하는데 마이크로어레이 기술을 이용한 DNA 칩(chip) 등 대량으로 스크린 할 수 있는 기술은 매우 유용한 것으로 판단되어 미국 등 선진국에서는 국가적으로 관련 기술 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 이러한 관련 기술 개발의 일환으로 현재 위해성 예측을 위한 기술로 DNA 칩 기술과 단백질 대량 스크린 기술분야에 많은 발전이 있는 실정이다. DNA 칩의 경우 그 종에서 알려진 거의 모든 유전자들에 대한 발현 스크린이 가능할 정도로 기술이 발전하였다.
이러한 기술 발전과 현재까지 DNA 칩과 같은 기술들을 이용한 독성예측기술을 개발코자 하는 많은 노력에 비해 독성예측을 위한 명확한 분석방법이 개발되지 않았기 때문에 위해성 예측을 위해서 다양한 분석적 접근이 이루어지고 있다. DNA 칩의 경우 알려진 전 유전자의 발현을 스크린 할 수 있는 기술임에도 불구하고 분석시 유전자 발현 비교분석하는 이론에 따라서 분석 결과에 차이가 있는 문제점이 보고되고 있으며, 또한 전체의 유전자를 이용한 분석보다 전체 유전자를 이용한 분석을 통해 특정 유전자를 선별하여, 선별된 소수의 특정 유전자를 이용한 분석 방법의 정확도가 오히려 높다는 연구 결과가 보고되어 있다(Russel S. Thomas 2001).
미국, 일본, EU 등 선진국에서는 환경 유해물질에 대한 환경 중 분포, 인체 노출량에 대한 조사와 함께 독성영향평가를 위한 새로운 독성유전체 기술을 이용한 시험법 개발, 작용기전 연구 등을 장기적인 전략을 수립하여 단계적으로 실시하고 있다. 그러나, 현재까지 국제적으로 통용되는 검출 및 시험 방법이 없어 연구 기관간에 시험데이터의 비교평가가 곤란한 상황이므로 국립기관 및 관련물질 생산기관에서도 공통적으로 받아들여질 수 있는 환경 유해물질 검색 시험법이 요구된다. 환경 유해물질에 대한 접근은 단순히 그 물질이 "있다" "없다"의 개념이 아닌 첨단 기술력을 바탕으로 정확한 환경 유해물질의 위해성 기작(mechanism) 분석을 통해 물질의 노출로부터 사전 예방할 수 있는 방안이 필요하며 그 연구에 독성 유전체 기술의 도입이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 랫트 동물 모델을 대상으로 휘발성 유기화합물(DCM, EB 및 TCE)을 처리하고 발현 유전체 분석을 통하여 전혈에서 유전자 발현 프로파일의 변화를 확인하고, 휘발성 유기화합물에 노출될 경우 위해성을 조기에 진단 및 예측할 수 있는 신규한 바이오마커들을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 휘발성 유기화합물에의 노출에 따른 위해성을 진단 또는 예측할 수 있는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커를 이용한 휘발성 유기화합물에 대한 위해성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 337개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 휘발성 유기화합물은 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸벤젠(ethylbenzene) 및 트리클로로에틸렌(trichloroethylene)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 혈액에서 휘발성 유기화합물에 의해 발현이 증가 또는 감소할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 휘발성 유기화합물에 노출되었을 것으로 의심되는 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 337개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택된 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 하나 이상의 휘발성 유기화합물을 처리한 후, 혈액을 채취하여 각각의 유전자 프로파일을 검출하는 단계; (b) 휘발성 유기화합물을 처리하지 않고 나머지는 단계 (a)와 동일한 조건을 유지한 경우의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 유전자 발현 프로파일을 비교하여 상기 두 가지 이상의 휘발성 유기화합물 모두에서 동일한 발현 프로파일 상의 유의한 변화를 나타내는 유전자를 선별하여 휘발성 유기화합물 위해성 평가용 바이오마커 유전자로 판단하는 단계를 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 제1항의 표에 기재된 337개의 유전자 중 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커는 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자로 휘발성 유기화합물에 노출 시 혈액으로부터 특이적으로 검출되는 표지자이므로, 이러한 바이오마커를 휘발성 유기화합물, 특히 디클로로메탄, 에질벤젠, 트리클로로에틸렌의 노출에 대한 모니터링 및 위해성 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 이로 인해 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다. 또한, 혈액만을 사용하여 간단하게 휘발성 유기화합물의 노출에 대한 위해성 평가를 할 수 있으며, 이러한 휘발성 유기화합물에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 휘발성 유기화합물을 투여한 랫트의 전혈에서 발현 프로파일에 대해 자율 계층적 군집 분석(unsupervised hierarchical clustering analysis)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. (A) 최소의 필터링 기준을 사용하여 선별된 8,093개 유전자의 2차원 클러스터그램(clustergram)으로, 각 줄(row)은 휘발성 유기화합물의 처리 후에 나타나는 전혈 유전자 발현 프로파일을 나타내고, 각 컬럼(column)은 프로브 측정을 나타낸다. 또한, 색의 채도(saturation)는 샘플 혈액 RNA와 일반적 표준 RNA 사이의 발현 차이를 반영한다. (B) 8,093개의 유전자 세트를 사용하여 클러스터링한 계통수(dendrogram)를 나타낸다(L: 낮은-복용량 그룹, H: 높은-복용량 그룹).
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 휘발성 유기화합물을 투여한 랫트의 혈액 세포에서 정확도가 높은 유전자를 분류한 결과를 나타낸 것으로, 휘발성 유기화합물을 처리한 그룹과 대조군의 분류된 유전자를 확인하기 위하여 총 51종의 발현 데이터를 Welch's T-test를 사용하여 확인하였고, 그 결과 정확도가 높은 1,217개의 유전자를 분류해내었다. (A) 1,217개의 유전자의 발현 프로파일 특성, (B) 1,217개의 유전자의 발현 프로파일에 따라 2개의 군집으로 나누어진 대조군과 VOCs 처리군의 계통수 군집, (C) LOOCV 방법을 사용한 정확도 테스트의 결과 대조군과 VOCs 처리군이 2개의 다른 분류로 분류됨을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 각 휘발성 유기화합물에 따른 유전자 발현 표지의 특성을 나타낸 것으로, 랫트에 3개의 다른 독성물질을 처리한 후에 현저하게 변화된 유전자 발현 차이를 선택한 것이다. (A) Volcano plot 방법과 multi-classification 분석을 이용한 최소의 아웃라이어 유전자의 동정을 위한 분석 방법, (B) 337개의 아웃라이어 유전자의 특이적 발현 프로파일에 따른 계통수 군집, (C) LOOCV 방법을 사용한 정확도 테스트의 결과 모든 VOCs 처리군은 4개의 다른 분류로 분류됨을 나타낸다.
도 4는 KEGG 경로 데이터베이스를 사용하여 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 차별 발현되는 337개의 아웃라이어 유전자들의 기능적 분류를 통한 분자적 기능 카테고리를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 휘발성 유기화합물을 투여한 랫트의 혈액 세포에서 정확도가 높은 유전자를 분류한 결과를 나타낸 것으로, 휘발성 유기화합물을 처리한 그룹과 대조군의 분류된 유전자를 확인하기 위하여 총 51종의 발현 데이터를 Welch's T-test를 사용하여 확인하였고, 그 결과 정확도가 높은 1,217개의 유전자를 분류해내었다. (A) 1,217개의 유전자의 발현 프로파일 특성, (B) 1,217개의 유전자의 발현 프로파일에 따라 2개의 군집으로 나누어진 대조군과 VOCs 처리군의 계통수 군집, (C) LOOCV 방법을 사용한 정확도 테스트의 결과 대조군과 VOCs 처리군이 2개의 다른 분류로 분류됨을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 각 휘발성 유기화합물에 따른 유전자 발현 표지의 특성을 나타낸 것으로, 랫트에 3개의 다른 독성물질을 처리한 후에 현저하게 변화된 유전자 발현 차이를 선택한 것이다. (A) Volcano plot 방법과 multi-classification 분석을 이용한 최소의 아웃라이어 유전자의 동정을 위한 분석 방법, (B) 337개의 아웃라이어 유전자의 특이적 발현 프로파일에 따른 계통수 군집, (C) LOOCV 방법을 사용한 정확도 테스트의 결과 모든 VOCs 처리군은 4개의 다른 분류로 분류됨을 나타낸다.
도 4는 KEGG 경로 데이터베이스를 사용하여 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 차별 발현되는 337개의 아웃라이어 유전자들의 기능적 분류를 통한 분자적 기능 카테고리를 나타낸 것이다.
본 발명은 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 위해성을 조기에 진단 및 예측할 수 있는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 노출 평가용 바이오마커를 제공함에 특징이 있다.
일반적으로 휘발성 유기화합물에 노출되었을 경우, 휘발성 유기화합물의 독성으로 인해 피부접촉이나 호흡기 흡입을 통해 신체내로 유입되어 신경계에 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 하지만, 각종 휘발성 유기화합물에 대한 세포내 전사체적 반응(transcriptomic response)에 대한 정보는 아직까지 그 연구가 미비한 실정이며, 대부분의 선행연구들은 세포 조직을 이용하여 휘발성 유기화합물의 위해성을 평가하는 것에 대해서만 집중되었고, 혈액을 이용하여 휘발성 유기화합물의 위해성을 평가하는 것은 시도되지 않았다.
이전의 보고에서, 간 조직에서 독성물질의 특이적 분자 표지(molecular signature)가 72시간의 조기 노출에서 간독성의 분자 기준을 감별할 수 있음을 제시한 바 있다(Eun, Ryu, Noh, Lee, Jang, Ryu, Jung, Kim, Bae, Xie, Kim, Lee, Park, Yoo, Lee and Nam, 2008). 이는 화학적 노출에 대한 전사체적 반응이 독성 물질에 특이적이고, 특이적 분자 표지는 예측 바이오마커로 이용될 수 있음을 제안한다. 이러한 발현 독성유전체학(toxicogenomic)은 이른 노출 지점에서 간독성을 예측하는데 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다. 그러나 이러한 전략은 간 조직으로 제한되고, 검출하고 예측 환경 독성학에 유용하게 이용하는데 한계가 있다. 예측 환경 독성학의 궁극적인 목표는 인체에서 환경 독성물질의 농도와 관련된 아주 이른 노출 시점에서 환경 독성물질의 노출을 정확하게 예측하는 것이다. 따라서 인체 시스템에 적용될 수 없기 때문에 어떤 기관 조직으로부터 독성물질의 전사체적 반응을 검출하는 것은 적절하지 않다. 말초혈액(peripheral blood)은 비공격적(non-aggressive) 방법으로 회복될 수 있기 때문에 추천되는 인간 자원 중의 하나이다.
이에 본 발명자들은 랫트 동물모델을 이용하여 환경 독성물질의 초기 예측을 위한 특이적 분자 표지를 확인하고자, 혈액에서 각종 휘발성 유기화합물의 노출에 따라 유전자의 발현 프로파일에 변화가 보이는 유전자들을 스크리닝 하였다.
따라서 본 발명에서는 휘발성 유기화합물에 노출될 때 전사체적(transcriptomic) 변화를 이끌어내고, 조기에 혈액에서 글로벌(global) 유전자 발현의 변화를 검출하고자 한다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 랫트의 전혈에서 휘발성 유기화합물의 처리에 따른 특이적 분자 표지를 확인하기 위하여 마이크로어레이 기술을 적용하였는데, 11주령 SD 수컷 랫트에 낮은-복용량 및 높은-복용량으로 3종류의 휘발성 유기화합물(DCM, EB 및 TCE)을 처리하고 발현 유전체 분석을 통하여 랫트의 전혈에서 글로벌 유전자 발현 프로파일의 변화를 확인함으로써 예측 마커 유전자를 동정하였다.
그 결과, 혈액에서의 전사체적 반응은 휘발성 유기화합물에 특이적으로 나타나고, 전사체적 반응 내에서 특이한 분자 표지(molecular signature)를 갖고 있는 것으로 나타났으며, 이러한 구별되는 분자적 변화의 표지들을 계통수(dendrogram)로 나타내었다(도 1 참조).
이러한 사실은 생화학 및 병리학적인 검사에서 전통적인 독성 분석이 어떠한 의미있는 변화를 찾아내지 못한다고 하더라도 적용될 수 있으며, 전사체적 조절과 같은 후생유전자 조절(Epigenetic regulation)이 순환하는(circulating) 백혈구에서 발생하고, 체내에서 화학적 스트레스를 반영한다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 간단한 논-파라메트릭(non-parametric) 분석을 통해 각각의 독성물질에 상관없이 휘발성 유기화합물을 식별할 수 있는 1,217개의 아웃라이어(outlier) 유전자를 선별하였다(도 2 참조).
많은 종류의 휘발성 유기화합물을 일반적인 메카니즘으로 활동할 수 있으며, 예를 들면, 휘발성 유기화합물은 시토크롬 P4502E1 물질대사 활성화와 같은 일반적인 독성 경로를 공유할지 모른다. 그러므로, 각각의 물질에 독립적으로 노출될 때 부작용을 일으키지 못하는 수준에 있을지라도, 몇몇의 휘발성 유기화합물들이 조합되면 해독 효소를 억제하거나, 효소 시스템의 활성을 유도 및 증가시킬 수 있다.
따라서, 상기 1,217개의 아웃라이어 유전자는 휘발성 유기화합물에 특이적인 스트레스와 관련이 있는 일반적인 후생유전자 반응을 대표할 수 있으며, 수많은 휘발성 유기화합물이 존재하는 환경에서 이러한 유전자들은 다른 환경 화학적 스트레스로부터 휘발성 유기화합물을 구별할 수 있는 잠재적인 분자 표지를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 다중 분류(multi-classification)의 2개의 다른 연속되는 분석(일방향 ANOVA 및 Volcano plot)을 디자인하고, 각 VOCs의 예상 가능성을 확실히 하기 위하여 이들을 결합하였다. Volcano plot 분석 결과 297개의 유전자를, 일방향 ANOVA 분석 결과 73개의 유전자를 선별하였고, 이들을 조합한 결과 총 337개의 유전자가 선별되었고, 이들은 100% 정확도로 대조군을 포함하는 4개의 다른 분류로 분류되었다(도 3 참조). 이러한 결과는 순환하는 혈액에서 백혈구의 전사체적 반응이 각각의 휘발성 유기화합물에 매우 특이적이며, 휘발성 유기화합물에 특이적인 각각의 분자 표지는 전혈에서 노출에 따른 위해성을 조기에 검출하는데 기여할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 337개의 예측 마커에서 근본적인 분자 경로를 예측할 수 있으며, 이러한 분자 경로는 혈액 단핵구에서 매우 잘 알려진 세포 내의 신호 경로인 조혈세포 계통 경로(the hematopoietic cell lineage pathway), 세포부착분자 경로(the cell adhesion molecules (CAMs) pathway), the antigen processing and presentation pathway, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용 경로(the cytokine-cytokine receptor interaction pathways), T세포 수용체 신호 경로(T cell receptor signaling pathway), Jak-STAT 신호 경로(the Jak-STAT signaling pathway), 및 유비퀴틴 매개 단백질 분해 경로(the ubiquitin-mediated proteolysis pathway)를 포함한다(도 4 참조).
이러한 결과는 혈액 내에 존재하는 휘발성 유기화합물에 대한 특이적 분자 표지와 이러한 VOCs-특이적 표지의 다중-분류를 이용하여 초기 노출 시간에 각각의 독성물질을 감별할 수 있음을 설명하며, 이러한 혈액 발현 특성은 환경에서 휘발성 유기화합물에 노출 시 발생하는 생물학적 반응을 검출하기 위한 예측 및 인식 마커로 이용될 수 있다.
따라서 본 발명자들은 발현 프로파일에 변화를 보인 특이적 분자 표지를 갖는 상기 유전자들을 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 위해성을 조기에 진단 또는 예측할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 본 발명의 일실시예를 통해 확인된 337개의 유전자 목록을 하기 표에 나타내었다.
또한, 상기 표의 유전자들 중에서 유전자 명이 확정되지 않은 61개의 신규한 유전자들에 대해서는 상기 유전자들의 염기서열을 본 명세서와 함께 첨부된 서열목록에 기재하였다.
본 발명에 따른 상기 표에 기재된 337개의 유전자들은 혈액에서 휘발성 유기화합물에 의해 발현 즉, 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가 또는 감소한다. 따라서, 이들 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 사용하여 휘발성 유기화합물에 노출되었을 때 위해성 여부를 평가할 수 있으며, 바람직하게는 337개의 유전자 모두를 사용하여 휘발성 유기화합물에 노출되었을 때 위해성 여부를 평가할 수 있다.
본 발명에서는 휘발성 유기화합물(VOCs) 처리에 대한 유전자 발현 변화는 폴드 변화 분석(fold change analysis) 방법을 이용하여, 대조군에 비해 각 유해화학물질 처리군에서 2배 이상 유전자발현 변화를 보인 유전자들을 분류하여 그룹화 하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 휘발성 유기화합물로 디클로로메탄(DCM)을 처리한 경우 39개의 유전자들의 발현이 증가(up)하였고, 42개의 유전자들의 발현이 감소(down)한 것으로 나타났으며, 에틸벤젠(EB)을 처리한 경우 118개의 유전자들의 발현이 증가하였고, 68개의 유전자들의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 트리클로로벤젠(TCE)을 처리하였을 때 가장 많은 유전자가 발현의 변화를 나타내었는데, 143개의 유전자들은 발현이 증가하고, 67개의 유전자들은 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다(실시예 3의 <3-5> 참조).
따라서, 본 발명은 상기 표에 기재된 337개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 “평가”는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 평가는 상기 바이오마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 휘발성 유기화합물의 노출 여부 및 위해성을 확인하는 것을 의미한다.
생물학적 시료 중의 바이오마커 유전자 발현량의 증대 또는 감소는 mRNA 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 바이오마커 유전자로부터 발현된 단백질 발현량의 증대 또는 감소는 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있다. 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 그 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함한다.
본 발명에서 상기 “바이오마커(biomarker)”란 휘발성 유기화합물에 노출 시 혈액에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 바이오마커는 정상 혈액에 비해 휘발성 유기화합물에 노출된 혈액에서 발현양이 감소하거나 증가하는 상기 377개의 유전자 또는 상기 유전자들이 발현된 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 바이오마커로 위해성을 평가할 수 있는 휘발성 유기화합물로는 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸벤젠(ethylbenzene), 트리클로로에틸렌(trichloroethylene) 등이 있다.
또한, 본 발명은 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 유전자의 스크리닝 방법을 제공할 수 있는데, 상기 스크리닝 방법은 (a) 하나 이상의 휘발성 유기화합물을 처리한 후, 혈액을 채취하여 각각의 유전자 프로파일을 검출하는 단계; (b) 휘발성 유기화합물을 처리하지 않고 나머지는 단계 (a)와 동일한 조건을 유지한 경우의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 유전자 발현 프로파일을 비교하여 상기 두 가지 이상의 휘발성 유기화합물 모두에서 동일한 발현 프로파일 상의 유의한 변화를 나타내는 유전자를 선별하여 휘발성 유기화합물 위해성 평가용 바이오마커 유전자로 판단하는 단계를 포함한다.
이러한 스크리닝 방법을 통하여 상기 표에 기재된 337개의 마커유전자를 선별할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 마커 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 “유전자의 발현 수준”은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 377개의 각각의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 “프라이머”는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 “단백질의 수준 측정”이란 생물학적 시료에서 휘발성 유기화합물의 노출에 의해 발현이 증가 또는 감소한 바이오마커 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 바람직하게는 상기 바이오마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.
상기 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 337개의 마커 유전자들로부터 발현된 단백질들에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함한다. 이러한 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 또는 상기 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 조성물을 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 키트를 제공한다.
본 발명의 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 키트는 상기 마커 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 뇌손상 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 휘발성 유기화합물 위해성 평가용 마커를 포함하는 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 휘발성 유기화합물에 대한 위해성을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 휘발성 유기화합물에 노출되었을 것으로 의심되는 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 337개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함한다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준의 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 노던 블럿, RNase 보호 분석법, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 휘발성 유기화합물이 노출된 경우의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 휘발성 유기화합물의 노출에 따른 위해성을 예측 및 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
동물모델 및 화학물질 처리
실험동물로는 11주령 Sprague-Dawley 수컷 랫트를 사용하였으며, 3종류의 휘발성 유기화합물을 높은-복용량 및 낮은-복용량으로 랫트에 투여하였다. 모든 실험동물은 상온, 습도 55±10%인 조건의 사육실에서 낮 12시간/밤 12시간을 주기로 사육하였다.
휘발성 유기화합물(VOCs)로는 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸벤젠(ethylbenzene) 및 트리클로로에틸렌(trichloroethylene)을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
디클로로메탄(CAS 수, 75-09-2; Sigma), 트리클로로에틸렌(CAS 수, 75-01-6; Sigma), 에틸벤젠(CAS 수, 100-41-4; Sigma)은 다음의 방법에 따라 준비되었다. 각각의 화합물마다 높은-복용량은 알려진 LD50의 50%로 하고, 낮은-복용량은 알려진 LD50의 10%로 사용하였다. 디클로로메탄(800, 160 mg/kg), 트리클로로에틸렌(1750, 350 mg/kg) 및 에틸벤젠(2825, 565 mg/kg)은 각각 전색제(옥수수유)와 함께 독립적으로 각 농도(높은-복용량, 낮은-복용량) 별로 SD-랫트에 경구 투여하였으며, 48시간 후 SD-랫트를 희생하고 전혈(whole blood)을 추출하였다. 혈청 샘플은 혈액학적 매개변수를 측정하기 위해 보존하였으며, 전혈은 RNA 추출을 위해 사용되었다. 실험동물은 명확한 독성 및 임상 증상을 관찰하기 위해 적어도 한 번씩 매일 관찰하였다. 모든 경우에서, 실험동물은 IACUC 지침서에 따라 처리되었다.
<
실시예
2>
혈액의 생화학 및 조직학적 분석
본 발명자들은 처음으로 각각의 VOCs의 특이적 발현 표지(signature)가 인간에서 예측하지 못한 유독한 화합물의 프로파일을 예측하기 위한 기초를 제공하였다. 이를 위해 임상 생화학 분석 및 조직병리학적 검사를 수행하였다.
<2-1> 생화학 분석
먼저, 임상 생화학 분석(clinical biochemical analysis)을 위하여, 상기 실시예 1에서와 같이 3종류의 휘발성 유기화합물(DCM, TCE 및 EB)을 SD 랫트에 투여하고, 2일(48시간) 후에 랫트의 전혈을 모았다. 간 효소 마커로써 VOCs에 의해 유발된 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase), 및 TBIL(total bilirubin)의 혈청 수준을 표준 혈액 생화학 기술을 사용하여 측정하였다. 또한, 랫트의 몸과 기관의 무게를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 높은-복용량 및 낮은-복용량의 VOCs를 랫트에 48시간 동안 노출시킨 경우 정상 대조군과 비교하여 몸 및 기관(간, 신장 및 폐)의 무게에서 변화를 나타내지 않았다.
| 48h | 대조군 (n=12) |
DCM(n=14) | EB(n=14) | TCE(n=14) | |||
| Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | ||
| 몸(g) | 340.9±14.3 | 327.3±10.1 | 334.6±21.1 | 333.6±15.2 | 325±15.2 | 336.9±8.8 | 327.7±14.9 |
| 간(g) | 10.8±1.47 | 10.9±1.1 | 10.7±1.5 | 10.9±0.9 | 14.3±1.4 | 10.7±0.5 | 10.3±0.8 |
| 신장(g) | 2.5±0.52 | 2.5±0.5 | 2.6±0.5 | 2.1±0.4 | 2.7±0.5 | 2.7±0.5 | 2.6±0.5 |
| 폐(g) | 1.3±0.65 | 1.0±0 | 1.1±0.4 | 1.4±0.5 | 1.1±0.4 | 1.0±0 | 1.0±0 |
* DCM : 디클로로메탄, EB : 에틸벤젠, TCE : 트리클로로에틸렌
또한, 혈청의 생화학적 분석 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 48시간 동안 랫트에 높은-복용량 및 낮은-복용량으로 VOCs를 노출시킨 경우에 간 기능 손상을 일으키지 않았음을 확인하였다(표 2 참조).
| 48h | 대조군 (n=12) |
DCM(n=14) | EB(n=14) | TCE(n=14) | |||
| Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | ||
| GOT (u/l) |
91.2±31.84 | 70±10 | 18.8±10.5 | 77.5±9.8 | 74.3±17.3 | 71.7±3.56 | 75±12.67 |
| GPT (u/l) |
32.9±5.92 | 27.8±1.8 | 27.2±4.96 | 29.8±2.4 | 58.7±15.2 | 26.8±1.5 | 25±3 |
| TBIL_PS (㎎/dl) |
0.48±0.08 | 0.4±0.03 | 0.4±0.07 | 0.51±0.03 | 0.37±0.04 | 0.37±0.04 | 0.5±0.1 |
<2-2> 조직병리학적 검사
조직병리학적 검사는 랫트에 조기 노출된 VOCs의 일반적인 독성 평가를 위해 측정하였으며, 조직병리학적 검사를 위해, 포르말린으로 고정된 조직은 파라핀 블록으로 포매하고, 약 5㎛ 두께로 세절한 후, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 휘발성 유기화합물에 노출된 조직에서 진단적 이상(diagnostic abnormalities)이나 그 어떤 관상 수증상의 변화(tubular hydropic changes)가 발견되지 않았다.
| 48h | 병변 | 대조군 | DCM | EB | TCE | |||
| Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | Low dose |
High dose | |||
| 간 | NDAR | 6/6 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 |
| THC | - | - | - | - | - | - | - | |
| 신장 | NDAR | 6/6 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 |
| THC | - | - | - | - | - | - | - | |
| 폐 | NDAR | 6/6 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 | 7/7 |
| THC | - | - | - | - | - | - | - | |
* NDAR : 진단 이상 없음, THC : 관상 수증상의 변화
이러한 결과들은 휘발성 유기화합물의 일반적인 독성 평가가 렛트 모델에서 조기 예측 또는 진단을 위해 충분한 정보를 제공하지 않는 것을 나타낸다. 따라서, 환경 독성 손상의 조기 검출을 위하여, 이러한 스트레스에 직접 반응하고, 세포내에서 역동적으로 변화하는 분자 물질을 확인하고 찾아내는 것이 필요하다.
<
실시예
3>
마이크로어레이를
통한 분자 표지 확인
본 발명자들은 랫트 모델을 이용하여 환경 독성물질의 조기 예측을 위하여, 휘발성 유기화합물에 대해 대규모의 특이적 발현 프로파일을 제공하는 특이적 분자 표지를 확인하고자, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
3종류의 VOCs를 각각 낮은 복용량(LD50의 1/10)과 높은 복용량(LD50의 1/2)으로 랫트에 경구 투여하고, 48시간 후에 mRNA를 말초 전혈로부터 추출하고, 대략 27,000개의 유전 성분을 포함하는 DNA 마이크로어레이를 수행하였다.
고밀도의 랫트 전-게놈(whole-genome) 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 한국의 가톨릭대학교에 있는 MGRC(Microdissection Genomics Research Center)에서 제조하였다. AROS(Array-Ready Oligo Set) 올리고세트는 Operon(Huntsville, AL, USA)으로부터 구입하여 사용하였으며, 이 세트는 랫트 유전자를 표적으로 하는 26,962개의 프로브를 포함한다.
<3-1> 전체
RNA
추출
적혈구 용해 버퍼로 처리한 랫트 혈액 샘플로부터 Trizol 시약(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였고, 품질은 Agilent 2001 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)에서 RNA 6000 나노칩을 사용하여 확인하였다. 표준 RNA로는 보편적인 랫트 표준 RNA(URR; Stratagene, LaJolla, CA, USA)를 사용하였다.
<3-2>
표지된
전체
cDNA
제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여, 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 총 RNA 20㎍을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 표준 RNA는 Cy3-dUTP(NEN Life Science, Boston, MA, USA)로 레이블 하였으며, 테스트 샘플들은 Cy5-dUTP(NEN Life Science, Boston, MA, USA)로 레이블하였다.
즉, 추출된 총 RNA는 Superscript II(Gibco BRL, Rockville, MD, USA)와 올리고-dT 프라이머(Cosmo, Seoul, Korea)를 각각 사용하여 RNA 또는 UPR 샘플 20㎍을 역전사하는 동안 Cy5-dUTP 또는 Cy3-dUTP를 각각 첨가하여 cDNA 타겟으로 역전사하였으며, 잔존하는 염색물질은 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 제거하였다.
<3-3>
혼성화
반응
다음으로, 각각의 Cy5가 표지된 cDNA는 40㎕ 혼성화용액(50% DIG EasyHyb [Roche, Basel, Switzerland] 및 herring sperm DNA 30㎍)에서 42℃, 18시간 동안 Cy3이 표지된 표준과 혼성화시켰으며, 혼성화는 혼성화 챔버에서 수행되었다. 혼성화가 완료된 후에는 다음과 같은 세척과정을 수행하였다.
1) 2X SSC, 0.1% SDS로 상온에서 2분, 2) 1X SSC로 상온에서 2분, 3) 0.2X SSC로 상온에서 2분, 4) 0.05X SSC로 상온에서 2분.
<3-4> 스캐닝 및 데이터 분석
세척된 슬라이드 상의 혼성화 이미지는 GenePix 4000B 스캐너(Axon Instruments, Union City, CA, USA)로 스캔하였으며, 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePixPro 5.1 소프트웨어(Axon Instruments)를 사용하여 분석하였다. 시각적인 검사에 의해 결정되는 낮은 해상도의 반점은 분석에서 제외하였으며, 분석에서 크기가 50㎛ 이하인 반점은 특별한 다른 규정이 없는 한 제외하였다. 각 배열 내의 신호 강도는 48핀 그룹에 따라 LOWESS 알고리즘(0.2 of data fraction and iteration No.3)을 사용하여 표준화하고, 배열 사이의 차이는 표준화하였다.
마이크로어레이 발현 데이터는 GenPlex 소프트웨어(Istech Inc., Korea)를 사용하여 분석하였다. 1차적인 데이터 필터링을 위해, 폴드 변화 분석(fold change analysis) 결과 신호 대 잡음 비율(SNR)<1.5인 반점을 제외하였으며, 필터링하고 남은 데이터를 이후의 분석에서 사용하였다. 먼저 데이터의 표준화를 위해 global median normalization을 사용하였고, 유의 유전자 선별을 위하여 대조군보다 각 환경유해물질 처리군에서 2배 이상 발현 정도에 변화를 보인 유전자들과 판별 알고리듬을 통해 선별된 p < 0.0001 값을 가진 유전자들의 합집합을 통하여 이후의 분석을 시행하였다.
계층적 군집(Hierarchical clustering)의 로그 비율(log ratio)은 Cluster와 TreeView 2.3(Stanford University, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 모든 클러스터링을 적용하는 동안 Pearson' s correlation, median centering 및 average linkage가 적용되었다. 이후 상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 휘발성 유기화합물에 대한 마커 유전자를 선별하였다.
<3-5> 휘발성 유기화합물에 대한
마커
유전자 선별 결과
상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 각각의 휘발성 유기화합물(DCM, TCE 및 EB)에 대한 노출로 인해 유전자의 발현 양상에 변화가 일어나는 마커 유전자를 선별하였다. 즉, VOCs 처리에 대한 유전자 발현의 변화는 폴드 변화 분석(fold change analysis) 방법을 이용하여, 기존보다 2배 이상 유전자 발현에 변화를 보인 유전자들을 분류하여 그룹화 하였다.
우선 VOCs 중 디클로로메탄(DCM)을 처리한 경우 유전자 발현에 유의적인 변화를 보인 유전자가 총 81개였는데, 그 중 발현 정도가 증가(up)한 유전자는 39개, 감소(down)한 유전자는 42개로 나타났다. 각각에 해당되는 구체적인 유전자의 종류는 다음과 같다.
에틸벤젠(EB)을 처리한 경우는 유전자 발현에 유의적인 변화를 보인 유전자가 총 186개였으며, 그 중 발현이 증가(up)한 유전자는 총 118개, 발현이 감소(down)한 유전자는 68개로 나타났다. 이에 해당되는 구체적인 유전자의 종류는 다음과 같다.
트리클로로벤젠(TCE)을 처리한 경우는 유전자 발현에 유의적인 변화를 보인 유전자가 총 210개였으며, 그 중 발현이 증가한 유전자는 총 143개, 발현이 감소한 유전자는 67개로 나타났다. 이에 해당되는 구체적인 유전자의 종류는 다음과 같다.
<
실시예
4>
환경 독성물질에 대해 특이적 발현 프로파일을 제공하는 분자 표지
일반적으로 전사체 조절은 생리적 스트레스 또는 병리생리적 스트레스와 같은 생화학적 영향에 대한 동적인 세포내 응답에 의해 발생되며, 특이적 유전자 발현 프로파일은 이러한 자극을 반영한다. 그러므로, 혈액에서 대규모-스케일의 유전자 발현 프로파일이 이소성 스트레스(ectopic stress)를 반영하는지 확인해보기 위하여, 자율 계층적 군집 분석(unsupervised hierarchical clustering analysis)을 수행하였다. 26,962의 DNA 마이크로어레이 프로브 중 랫트 전혈의 전사체에서 최소 필터링 기준(SD<0.3, 현재 데이터의 % ≥75)을 통과하는 유전 성분은 8,093로 나타났다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 이러한 유전자 세트의 계층적 군집 분석 결과 계통수(dendrogram)에 있는 4개의 서브클러스터로 나타났다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, 트리클로로에틸렌(TCE)군과 에틸벤젠(EB)군은 계통수 내에서 발현 프로파일이 확실히 구분되었다. 또한, 디클로로메탄(DCM)군은 계통수에서 몇몇을 제외하고는 아무런 처리를 하지 않은 대조군(C)과 구별되었다. 이러한 결과는 환경 독성물질에 노출될 때 특이적 분자 프로파일이 혈액 전사체(transcriptome) 내에 존재한다는 것을 의미하며, 이러한 특이적 분자 프로파일은 다른 유전자의 발현에 의하여 각각의 특별한 독성물질에 반영된다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 처음으로 정상 대조군으로부터 환경 독성물질의 존재를 식별할 수 있는 아웃라이어 유전자(outlier gene)를 결정하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, Welch's T-test(P<0.05, 1.5-fold-cut-off)의 통제된 분석을 통해 분류된 알고리즘으로 1,217의 아웃라이어 유전자를 선별하였으며(도 2A 참조), 이러한 유전자들은 발현 프로파일에 근거하여 두 개의 그룹(VOCs 및 대조군)으로 정확하게 분리되었다(도 2B 참조). 이러한 VOCs 아웃라이어 유전자는 LOOCV(Leave-one-out cross validation)에 의해 100개의 무작위 분할에서 분류되는 예측 신뢰 분석에 의해 검증되었는데, 고 정확도(high-accuracy) 분류자(1,2717 유전자)를 사용한 분류 배정(class assignment) 빈도의 합계는 두 개의 그룹(VOCs 및 대조군)에서 100%로 예측되었다(도 2C 참조).
<
실시예
5>
환경 독성물질
VOCs
를 위한 예측 분자
마커의
확인
본 발명자들은 휘발성 유기화합물로부터 각각의 독성물질을 결정하고 예측할 수 있는 분자 마커를 확인하였다.
각 독성물질을 정확하게 식별하는 유전자의 최대 숫자를 검색하기 위하여, 분석 프로그램인 GenePlex(Isthech, Seoul, Korea)를 사용하여 2개의 다른 multi-classification algorithms(Volcano plot method and one-way ANOVA Bonferroni multiple test)을 수행하였으며, 이후에 LOOCV(Leave-one-out cross validation)를 이용하여 100%의 정확도로 각각의 독성물질을 분류하는 유전자를 확인하였고, 마지막으로 이러한 두 가지 방법으로부터 아웃라이어 유전자를 조합하였다(도 3 참조).
또한, 독성물질에 대해 각각 특이적인 분자 표지는 Welch's t-test 및 2-fold change cut-off(Volcano plot 방법)를 사용하여 확인하고, 이후 LOOCV(Leave-one-out cross validation)와 Kruskal-Wallis H-test에 의한 100% 정확도로 297개의 아웃라이어 유전자가 분류되었다. 반면, One Way ANOVA(Boneferroni method, p≤0.0001)를 사용한 분석에서는 100% 정확도로 73개의 아웃라이어 유전자가 분류되었다. 이렇게 확인된 유전자를 조합한 결과, 337개의 아웃라이어 유전자는 VOC 노출 그룹에서 각각의 독성물질을 결정하는 유전자로 확인되었다. 예상한 바와 같이, 337개의 유전자 발현의 계층적 군집은 그들 자신의 발현 프로파일에 따라 계통수(dendrogram)에서 3종류의 독성물질을 식별하였다(도 3B 참조). 게다가, 이러한 예측 마커의 분류 배정(class assignment) 가능성을 위한 검증 시험 결과, 정상 대조군을 포함한 모든 4개의 분류에서 정확도가 100%로 나타났다.
<
실시예
6>
휘발성 유기화합물에 의해
랫트
전혈에서
별도로 발현되는 예측 분자
마커의
분자
메카니즘
본 발명자들은 휘발성 유기화합물에 의해 랫트 전혈에서 별도로 발현되는 예측 분자 마커의 분자 메카니즘을 이해하기 위하여, 337개의 유전자가 관여하는 분자 메카니즘을 확인하였다. KEGG 데이터베이스에 있는 pathway mining tool을 사용하였는데, 이러한 tool은 유전자의 알려진 pathway와 영향을 받는 생물학적 과정의 개요를 제공한다. 이러한 데이터베이스 분석을 근거로 하여, 예측 마커의 337개의 유전자에서 적어도 4개의 유전 성분을 포함하는 7개의 경로를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, VOCs에 노출된 랫트의 전혈에서 영향을 받는 주요한 신호 전달 경로는 다음과 같이 확인되었다: 조혈세포 계통 경로(the hematopoietic cell lineage pathway), 세포부착분자 경로(the cell adhesion molecules (CAMs) pathway), the antigen processing and presentation pathway, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용 경로(the cytokine-cytokine receptor interaction pathways), T세포 수용체 신호 경로(T cell receptor signaling pathway), Jak-STAT 신호 경로(the Jak-STAT signaling pathway), 및 유비퀴틴 매개 단백질 분해 경로(the ubiquitin-mediated proteolysis pathway).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 하기 표에 기재된 81개의 유전자 전체 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질 모두를 포함하는 디클로로메탄(dichloromethane)에 대한 위해성 평가용 바이오마커.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 표의 유전자들 중 1번 내지 39번의 유전자들은 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 디클로로메탄에 노출되지 않은 정상 대조군 시료에 비해 증가하며, 40번 내지 81번 유전자들은 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 디클로로메탄에 노출되지 않은 정상 대조군 시료에 비해 감소하는 것을 특징으로 하는 위해성 평가용 바이오마커. - 삭제
- 삭제
- (a) 디클로로메탄(dichloromethane)에 노출되었을 것으로 의심되는 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 81개의 유전자들로 이루어진 유전자 모두의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 디클로로메탄에 노출되지 않은 정상 대조군 시료로부터 제1항의 표에 기재된 81개의 유전자들로 이루어진 유전자 모두의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 디클로로메탄에 대한 위해성을 평가하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 디클로로메탄에 대한 위해성을 평가하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 디클로로메탄에 대한 위해성을 평가하는 방법. - 삭제
- 삭제
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| KR1020100080874A KR101186699B1 (ko) | 2010-08-20 | 2010-08-20 | 휘발성 유기화합물에 대한 위해성 평가용 바이오마커 및 이의 용도 |
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