KR101735415B1 - 헥산알 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 확인 방법 - Google Patents

헥산알 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경 중에서 노출되는 휘발성 유기 화합물류 중의 하나인 헥산알(Hexanal)의 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로 헥산알에 의해 특정 유전자의 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되는 헥산알 노출 특이적 마커 유전자 및 이를 이용한 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 메틸화 마커는 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자의 메틸화된 프로모터 부위를 바이오마커로 이용하여 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 헥산알의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 헥산알에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

헥산알 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 확인 방법{Methylation marker for identification of exposure to hexanal and the method of identification using thereof}
본 발명은 헥산알 노출 여부 확인용 메틸화 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헥산알 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
후성유전학은 DNA염기서열의 변화를 초래하지 않고 유전자 발현의 조절에 변화가 일어나는 현상으로 DNA 메틸화는 DNA 메틸 전이 효소에 의해 DNA의 cytosine 염기에 메틸기가 전이되는 증상이며, microRNA, histone 단백질의 변형(메틸화, 아세틸화), nucleosome positioning과 함께 후성유전학의 중요한 요인으로 알려져 있다. DNA 메틸화는 특정 유전자의 프로모터 부위가 과메틸화(하이퍼메틸레이션)되면 상기 유전자의 발현이 억제되고 반대로 저메틸화(하이포메틸레이션)되면 유전자의 발현이 증가한다. DNA 메틸화는 원핵생물에서는 외부 유전자의 침입으로부터 보호해 주는 역할을 하며, 진핵생물에서는 발달과정에서 유전자의 발현을 조절해 주는 중요한 역할을 한다. 이를 포함하여 DNA 메틸화는 발생과 발달, 염색체의 안정성, X 염색체의 불활성화, 외부 기생 유전체의 발현 억제, 유전자 각인 등 정상 세포의 기능에 중요하게 관여하며, 조직 특이적 유전자 활성, 질병과 연관된 유전자들의 발현 증가 또는 억제에도 영향을 미친다는 것이 밝혀지고 있다. 메틸화의 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 메틸화 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 메틸화 마커의 발굴은 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단, 예후 예측 모니터링, 치료 및 사후 관리 등에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.
최근의 급격한 기술 발달에 따라, 유전체 전반에 걸친 메틸화 분석이 시도되고 있으며, 이를 통해 이제까지 알려지지 않은 새로운 것을 포함하여 전반적인 메틸화의 기능에 대한 연구가 가능해 질 것으로 여겨지고 있다. 특히 고분해능의 마이크로어레이와 초고속 차세대 염기서열분석 등의 기술들은 보다 많은 질병에 있어서 메틸화 전반에 걸친 연구를 가능하게 하여 질병 유발 과정에 대한 새로운 지식을 제공하고 이를 통한 새로운 진단 마커 및 치료 표적의 발굴을 가능하게 할 것이다. 뿐만 아니라 메틸화 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되어지고 있다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 DNA 메틸화와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 몇몇 연구에서 benzene(벤젠), arsenic(비소) 또는 RDX와 같은 유해물질과 실외 및 실내 공기오염원 노출에 따른 메틸화 변화를 관찰하였으며 특이적인 변화를 보이는 메틸화 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli A. and Bollati V., Current Opinion in Pediatrics, 21, 243-251, 2009; Carmen J. Marsit, The journal of experimental biology, 218, 71-79, 2015; Hyang-Min Byun et al., Methods in molecular biology, 1265, 271-283, 2015).
또한 발굴된 메틸화 유전자는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 메틸화 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 DNA 메틸화 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 매우 큰 휘발성 유기 화합물류와 같은 유해물질 노출에 의한 유전자 메틸화 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 DNA 메틸화나 마이크로 RNA와 같은 후성유전체 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다.
실내 공기오염은 실제 실내에서의 생활시간이 하루 중 90% 이상을 차지하고 있으며, 오염원의 유입에 의해 오염될 경우 쉽게 정화되지 않아 인체 건강에 더 치명적인 요인으로 알려져 있다. 실내 오염의 주된 원인 물질로는 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2), 이산화질소(NO2), 오존(O3), 미세먼지(PM), 휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds : VOCs) 등이 있다.
헥산알(Hexanal)은 휘발성 유기화합물(VOCs)의 대표적인 물질인 알데하이드류 중의 하나로서 실내 공기 오염원의 주된 물질로 알려져 있으며(Nigel Bruce et al., Indoor Air Pollution in Developing Countries: A Major Environmental and Public Health Challenge, Bulletin of the World Health Organization, 78:9 ,2000), 실생활에서 이용하는 가구, 직물, 페인트, 카페트를 비롯하여 음식 조리 과정에서 발생하는 연기에도 다양하게 포함되어있다. 체내의 노출은 대부분 호흡을 통하여 이루어지며, 호흡을 통한 노출은 혈관을 통해 빠른 속도로 온몸에 전해지게 된다. 체내에 노출되었을 경우, 두통, 어지러움, 발작, 혼수상태 등의 신경질환을 초래할 뿐만 아니라, 메스꺼움, 복통, 구토 및 설사 등의 위장관계의 기능 장애를 일으킨다고 보고되어있다. 또한, 호흡기의 상부기도 및 점막은 물론 눈과 피부 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 및 폐암 환자의 진단용 마커로 사용될 만큼 폐질환과 밀접한 관련이 있는 물질로 보고되어 있다(Massimo Corradi et al., Aldehydes in exhaled breath condensate of patients with chronic obstructive pulmonary disease, American journal of respiratory and critical care medicine, Vol 167. pp 1380-1386, 2003; Patricia Fuchs et al., Breath gas aldehydes as biomarkers of lung cancer, International Journal of Cancer, 126: 2663-2670, 2010). 알데하이드류 중에서도 포름알데하이드와 아세트알데하이드에 대한 연구 보고는 많이 진행되어있으나, 헥산알을 포함한 그 외의 저급 지방족 포화 알데하이드의 연구는 미비한 상황이며, 헥산알에 대한 오염도 및 위해도 자료 또한 미흡한 실정이다. 헥산알의 인간에 대한 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간 PCR(Real-time polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 헥산알의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
DNA chip 기술의 발달로 인해 최근 연구들은 암이나 기타 질병 또는 특정 자극에 따른 DNA 메틸화 양상 변화의 특징을 분석하는 쪽으로 이루어지고 있다. 이러한 분석 방법에는 메틸화(methylation)된 서열(sequence)과 그렇지 않은 서열(sequence)의 차이를 이용, 제한효소를 사용하는 방법(HELP)과 항 5-methylcytosine 항체를 이용한 면역침강 방법(MIRA, MeDIP) 그리고 sodium bisulfite를 이용한 서열 분석 방법 등 다양한 방법이 최근 들어 개발 및 사용되고 있다. 이들 중 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자 메틸화 양상을 확인하고 이들의 기능을 연구하기 위한 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구, 즉 마이크로어레이(microarray) 분석이 주로 이루어지고 있다.
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agilent사 등에서는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et al., Journal of the American Academy of Dermatology, 51, 681-692, 2004). 유전자의 메틸화 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 메틸화된 DNA만을 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 DNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서의 DNA 메틸화 변화 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 메틸화 양상을 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 랫트 유전자 프로모터 부위 39만 여개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 헥산알의 DNA 메틸화 프로파일을 실제 헥산알을 노출시킨 Fischer 344(SD계통) 랫트 폐 조직에서 관찰 및 분석하여 환경 중 헥산알의 노출에 의해서 농도 의존적으로 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하고 헥산알 노출 시 메틸화 변화 여부를 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 헥산알의 노출에 의해 농도 의존적으로 변화하는 메틸화 유전자 및 상기 바이오마커를 이용한 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헥산알의 노출에 의해 농도 의존적으로 메틸화 정도 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 총 36종 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 프로모터 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 헥산알에 대한 DNA 메틸화 변화 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 헥산알에 대한 DNA 메틸화 패턴 변화 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.
본 발명은 헥산알 노출 특이 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 바이오마커를 제공함으로써, 헥산알 노출 모니터링 및 위해성 판정을 위한 정보를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 헥산알 노출 특이적 바이오마커와 마이크로어레이 칩, 검색 키트 및 바이오마커의 메틸화 검출방법을 이용하면, 헥산알의 노출을 조기에 모니터링 및 판정이 가능하고 통상적인 방법에 비해 정확하게 노출을 모니터링 할 수 있어 유용하며 헥산알에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
도 1은 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 이용하여 헥산알(Hexanal)을 노출한 Fischer 344(SD 계통) 랫트 폐 조직의 전체 DNA 메틸화 변화 양상을 클러스터링 분석 방법으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 헥산알(Hexanal)의 세 가지 노출 농도에 의해 공통적으로 메틸화 발현 변화를 보이는 유전자를 클러스터링 분석 방법으로 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 헥산알(Hexanal) 노출에 의해 농도 의존적으로 메틸화 양상이 변화하는 36종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 클러스터링 분석 방법으로 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 헥산알(Hexanal) 노출에 의해 농도 의존적 메틸화 양상이 변화하는 36종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 라인-플롯 분석 방법으로 분석한 결과를 나타내는 도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 헥산알의 노출에 의해 농도 의존적으로 특이적 메틸화 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 총 36종 유전자(PRKCSH, PCCA, OLR5. KLK1C9, TMEM174, RGD1306227, PRUNE, ADH4, SDCCAG3, OLR407, OLR500, PRAMEL6, HGF, RGD1564345, SLCO1A2, PLAG1, CCNC, NACA, SLC39A5, OLR1084, OLR1085, JRK, MYO5A, TRAIP, CRYGB, OLR1389, CCZ1, PLA2G1B, USF1, INPP5J, DDX41, PSMA2, FUNDC2, DTWD2, SLC12A2, OLR1696)의 프로모터 부위를 포함하는 헥산알에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 바이오마커 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 p- value < 0.05로 유의성 있게 변화를 보인 메틸화 DNA로써, 헥산알 노출에 의해 농도 의존적으로 메틸화 변화가 3.0배 이상 증가 또는 감소된 프로모터 부위를 포함하는 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:
유전자 등록번호(GenBank) NM_001106806 (PRKCSH, protein kinase C substrate 80K-H), 유전자 등록번호(GenBank) NM_019330 (PCCA, propionyl-coenzyme A carboxylase, alpha polypeptide), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000112 (OLR5, olfactory receptor 5), 유전자 등록번호(GenBank) NM_175759 (KLK1C9, kallikrein 1-related peptidase C9), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001024298 (TMEM174, transmembrane protein 174), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001014037 (RGD1306227, similar to 4833420G17Rik protein), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001007697 (PRUNE, prune homolog (Drosophila)), 유전자 등록번호(GenBank) NM_017270 (ADH4,alcohol dehydrogenase 4 (class II), pi polypeptide), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001013135 (SDCCAG3, serologically defined colon cancer antigen 3), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000828 (OLR407, olfactory receptor 407), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000680 (OLR500, olfactory receptor 500), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001109342 (PRAMEL6, preferentially expressed antigen in melanoma-like 6), 유전자 등록번호(GenBank) NM_017017 (HGF, hepatocyte growth factor), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001077681 (RGD1564345, similar to RIKEN cDNA 4921511H03), 유전자 등록번호(GenBank) NM_131906 (SLCO1A2, solute carrier organic anion transporter family, member 1A2), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001008316 (PLAG1, pleiomorphic adenoma gene 1), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001100472 (CCNC,cyclin C), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001198580 (NACA, nascent polypeptide-associated complex alpha subunit), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001108728 (SLC39A5,solute carrier family 39 (metal ion transporter), member 5), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000709 (OLR1084, olfactory receptor 1084), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000420 (OLR1085, olfactory receptor 1085), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001104612 (JRK, jerky homolog (mouse)), 유전자 등록번호(GenBank) NM_022178 (MYO5A, myosin VA), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001109004 (TRAIP, TRAF-interacting protein), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001109875 (CRYGB, crystallin, gamma B), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001000000 (OLR1389, olfactory receptor 1389), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001014126 (CCZ1, CCZ1 vacuolar protein trafficking and biogenesis associated homolog (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(GenBank) NM_031585 (PLA2G1B, phospholipase A2, group IB, pancreas), 유전자 등록번호(GenBank) NM_031777 (USF1, upstream transcription factor 1), 유전자 등록번호(GenBank) NM_133562 (INPP5J, inositol polyphosphate-5-phosphatase J), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001108046 (DDX41, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41), 유전자 등록번호(GenBank) NM_017279 (PSMA2, proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 2), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001135757 (FUNDC2, FUN14 domain containing 2), 유전자 등록번호(GenBank) NM_001108431 (DTWD2, DTW domain containing 2), 유전자 등록번호(GenBank) NM_031798 (SLC12A2, solute carrier family 12 (sodium/potassium/chloride transporters), member 2), 유전자 등록번호(GenBank) NM_206850 (OLR1696, olfactory receptor 1696).
본 발명자들은 헥산알의 노출에 대한 DNA 메틸화 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 기존에 확보한 in vivo 실험 기법을 기반으로 헥산알 흡입 노출 실험을 수행하였다. 헥산알 노출 농도는 기존 문헌에서 보고된 알데하이드를 이용한 랫트 모델 노출 실험 결과와 헥산알의 물리화학적 특성에 의한 포화농도, 가스 발생기의 특징 등을 고려하여 선정하였으며(표 1 참조), 노출 방법은 비부노출 흡입 장치(Nose-only inhalation chamber)를 사용하여 Fisher 344(SD계통) 랫트에 1일 1회, 회당 약 4시간, 5주 동안 흡입시켰다. 대조군 물질은 filtered clean air를 사용하였다.
이후 상기 농도로 헥산알을 노출시켜 대조군과 실험군 랫트의 폐 조직으로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 분리하여 whole genome amplification를 하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며 input DNA의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광 표지된 DNA를 Agilent customized rat methylation microarray(400K)(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 DNA 메틸화 양상의 차이를 분석하였다. 분석 시 비노출군에 비해 유의하게 메틸화 변화를 나타낸 DNA에 대해 unpaired Welch’s t-test를 통해서 메틸화 변화가 3.0배 이상 증가 또는 감소한(p- value < 0.05) 프로모터 부위 16,586개를 선별하였다(도 1 참조). 저농도 처리군에서는 661개(과메틸화: 537개, 저메틸화: 124개), 중농도 처리군에서는 4,181개(과메틸화: 3,306개, 저메틸화: 875개), 고농도 처리군에서는 11,744개(과메틸화: 8,153개, 저메틸화: 3,591개)의 부위가 헥산알 노출에 의해서 메틸화하는 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조). 세 가지 노출 농도에서 공통적으로 발현이 변화한 메틸화 유전자 프로모터 부위 79개(과메틸화: 75개, 저메틸화: 4개)와 이에 해당하는 메틸화 유전자 73종을 선별하였으며(도 2, 표 3 참조), 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 36종 또한 선별하였다(도 3 및 도 4 참조). 이들 메틸화 유전자들은 헥산알의 노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 DNA 프로모터 부위 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 헥산알 특이적 노출 여부 확인용 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명에 있어서, 세 가지 농도의 헥산알 노출에 의해 농도 의존적인 메틸화 발현 변화를 보이는 36종 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 영역은 하기와 같이 서열번호 1 내지 서열번호 36으로 구성되는 것이 바람직하다:
유전자 등록번호(GenBank) NM_001106806 (PRKCSH, protein kinase C substrate 80K-H)의 프로모터 부위는 서열번호 1의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_019330 (PCCA, propionyl-coenzyme A carboxylase, alpha polypeptide)의 프로모터 부위는 서열번호 2의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000112 (OLR5, olfactory receptor 5)의 프로모터 부위는 서열번호 3의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_175759 (KLK1C9, kallikrein 1-related peptidase C9)의 프로모터 부위는 서열번호 4의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001024298 (TMEM174, transmembrane protein 174)의 프로모터 부위는 서열번호 5의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001014037 (RGD1306227, similar to 4833420G17Rik protein)의 프로모터 부위는 서열번호 6의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001007697 (PRUNE, prune homolog (Drosophila))의 프로모터 부위는 서열번호 7의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_017270 (ADH4,alcohol dehydrogenase 4 (class II), pi polypeptide)의 프로모터 부위는 서열번호 8의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001013135 (SDCCAG3, serologically defined colon cancer antigen 3)의 프로모터 부위는 서열번호 9의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000828 (OLR407, olfactory receptor 407)의 프로모터 부위는 서열번호 10의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000680 (OLR500, olfactory receptor 500)의 프로모터 부위는 서열번호 11의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001109342 (PRAMEL6, preferentially expressed antigen in melanoma-like 6)의 프로모터 부위는 서열번호 12의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_017017 (HGF, hepatocyte growth factor)의 프로모터 부위는 서열번호 13의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001077681 (RGD1564345, similar to RIKEN cDNA 4921511H03)의 프로모터 부위는 서열번호 14의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_131906 (SLCO1A2, solute carrier organic anion transporter family, member 1A2)의 프로모터 부위는 서열번호 15의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001008316 (PLAG1, pleiomorphic adenoma gene 1)의 프로모터 부위는 서열번호 16의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001100472 (CCNC,cyclin C)의 프로모터 부위는 서열번호 17의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001198580 (NACA, nascent polypeptide-associated complex alpha subunit)의 프로모터 부위는 서열번호 18의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001108728 (SLC39A5,solute carrier family 39 (metal ion transporter), member 5)의 프로모터 부위는 서열번호 19의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000709 (OLR1084, olfactory receptor 1084)의 프로모터 부위는 서열번호 20의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000420 (OLR1085, olfactory receptor 1085)의 프로모터 부위는 서열번호 21의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001104612 (JRK, jerky homolog (mouse))의 프로모터 부위는 서열번호 22의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_022178 (MYO5A, myosin VA)의 프로모터 부위는 서열번호 23의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001109004 (TRAIP, TRAF-interacting protein)의 프로모터 부위는 서열번호 24의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001109875 (CRYGB, crystallin, gamma B)의 프로모터 부위는 서열번호 25의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001000000 (OLR1389, olfactory receptor 1389)의 프로모터 부위는 서열번호 26의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001014126 (CCZ1, CCZ1 vacuolar protein trafficking and biogenesis associated homolog (S. cerevisiae))의 프로모터 부위는 서열번호 27의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_031585 (PLA2G1B, phospholipase A2, group IB, pancreas)의 프로모터 부위는 서열번호 28의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_031777 (USF1, upstream transcription factor 1)의 프로모터 부위는 서열번호 29의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_133562 (INPP5J, inositol polyphosphate-5-phosphatase J)의 프로모터 부위는 서열번호 30의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001108046 (DDX41, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41)의 프로모터 부위는 서열번호 31의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_017279 (PSMA2, proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 2)의 프로모터 부위는 서열번호 32의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001135757 (FUNDC2, FUN14 domain containing 2)의 프로모터 부위는 서열번호 33의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_001108431 (DTWD2, DTW domain containing 2)의 프로모터 부위는 서열번호 34의 염기서열;
유전자 등록번호(GenBank) NM_031798 (SLC12A2, solute carrier family 12 (sodium/potassium/chloride transporters), member 2)의 프로모터 부위는 서열번호 35의 염기서열; 및
유전자 등록번호(GenBank) NM_206850 (OLR1696, olfactory receptor 1696)의 프로모터 부위는 서열번호 36의 염기서열.
본 발명의 헥산알 검색용 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 inkjet 방식 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint inkjet micro dropping 마이크로어레이를 이용하였다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 헥산알의 노출에 대한 DNA 메틸화 양상 변화 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 헥산알의 노출에 대한 DNA 메틸화 양상 변화 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 폐 조직에서 메틸화 DNA만을 특이적으로 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 DNA를 상기 DNA 메틸화 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 메틸화 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 상기 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 헥산알 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부를 확인하는 방법.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 폐조직은 Fischer 344(SD계통) 랫트를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 랫트 페 조직이라면 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP 및 dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 Agilent사의 customized rat methylation microarray(400K) (Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 랫트 게놈 중 본 발명에서 상기 메틸화 양상이 변화된 DNA가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 단계 4)의 분석 방법은 Agilent Feature Extraction software (Agilent Technology, USA), Agilent GeneSpring GX 12.6.1(Agilent technology, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 헥산알 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 포함하는 헥산알 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트는 추가적으로 랫트 폐 조직을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
랫트 폐 조직은 Fischer 344(SD계통)인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 랫트의 폐 조직이라면 모두 사용 가능하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 동물 모델 선정, 화학물질 노출 및 폐 조직 시료 수득
<1-1> 랫트 모델 선정
본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 헥산알 노출 실험을 위한 적정 동물 모델로 Fischer 344(SD계통) 랫트를 선정하였다.
<1-2> 노출 농도 선정 및 화학 물질 처리
기존 문헌에서 보고된 알데하이드를 이용한 랫트 모델 노출 실험 결과와 헥산알의 물리화학적 특성에 의한 포화농도, 가스 발생기의 특징을 고려하여 노출 농도를 600 ppm, 1000 ppm, 1,500 ppm으로 선정하였다(표 1). 노출 방법은 비부노출 흡입 장치(Nose-only inhalation chamber)를 사용한 반복 흡입 방식을 선택하여 5주 동안 흡입시켰다. 대조물질은 filtered clean air를 사용하여 1일 1회, 회당 약 4시간 노출하였으며, 시험 물질인 hexanal 또한 1일 1회, 회당 약 4시간, 총 20회 노출시켰다.
헥산알(Hexanal)흡입 노출 농도
그룹명 노출농도(ppm)

헥산알(Hexanal)		 대조군 0
실험군(저농도) 600
실험군(중농도) 1,000
실험군(고농도) 1,500
<1-3> 폐 조직 시료 수득
랫트에서 적출한 폐 조직을 중량 측정한 후, DNA 추출에 적당한 양으로 잘라 cryotube에 수득하였다. 수득한 폐 조직은 액체 질소를 이용하여 snap frozen한 후 -80℃에서 보관하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> Genomic DNA 의 분리
헥산알 노출군과 비노출군의 폐 조직으로부터의 DNA 분리는 Qiagen사의 QIAamp DNA Mini kit를 사용하여 정제하였다. 각 전체 DNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며 순도는 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> Genomic DNA 의 단편화
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 헥산알 노출군과 비노출군 전체 DNA로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하여야 한다. 이때, genomic DNA의 크기가 200bp에서 1000bp 정도가 적당하므로 Sonic Dismembrator를 이용하여 20sec 'ON' 20sec 'OFF' 4회를 1 cycle로, 3 cycle을 수행하여 DNA를 200 bp ~ 1,000 bp로 잘라 주었다. DNA의 크기를 확인하기 위해 아가로스젤 전기영동을 수행하였다.
<2-3> 메틸화 DNA 면역침강법
메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하기 위하여 면역침강법을 이용하였으며 Invitrogen사의 MethylMiner™ Methylated DNA Enrichment Kit를 사용하며 제조사의 지시방법에 따라 실험을 진행하였다. 면역침강법은 beads의 원리에 의해 진행되며 실시예 <2-2>에서 수득한 단편화 DNA를 beads와 mix하여 실온에서 1시간 동안 반응시키거나 4℃에서 overnight시켰다. 반응되지 않은 non-captured DNA는 세척과정을 반복하여 제거시키고 NaCl로 methylated DNA를 용리(elution)시킨 후 최종적으로 phenol-chloroform으로 DNA만을 추출하였다. 이렇게 추출된 메틸화 DNA를 메틸화 특이 프라이머를 이용하여 PCR 한 후 아가로스젤 전기영동을 통해 최적의 상태임을 확인하였다.
<2-4> 표지된 DNA 제조
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification(WGA) Kit(Sigma, USA)을 이용하여 제조사의 방법대로 증폭하여 사용하였다. 증폭한 DNA와 메틸화 DNA 4 ug를 Invitrogen사의 Bioprime labeling kit을 사용하여 제조사의 방법대로 표지화하였다. 메틸화 DNA는 Cy5-dUTP로, DNA 샘플은 Cy3-dUTP로 표지화하였으며, 50 μl의 master mix(dNTPs-dATP, dGTP, dCTP; 120 μM, dTTP; 60 μM, Cy5-dUTP or Cy3-dUTP; 60 μM)를 사용하여 표지화하였다. 표지화한 샘플은 정제한 후, ND-1000 spectrometer(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE)를 사용하여 농도를 측정하였다.
<2-5> 혼성화 반응
표지된 DNA와 메틸화 DNA를 purification 과정을 거쳐 2.5~5 ug 정도 사용하여 Agilent 10 x blocking와 Agilent 2 x hyb buffer넣고 잘 섞은 뒤 95℃에서 3분간 denature한 뒤 37℃에서 30분간 반응시킨다. chip에 잘 넣고 65℃에서 40시간(2 x formats) 동안 Agilent Hybridization 오븐에서 혼성화 반응을 하였다. 40시간 뒤 Agilent Technology 사의 방법대로 세척과정을 진행하였다. 메틸화 DNA 마이크로어레이 칩으로는 customized rat methylation microarray(400K)(Agilent, USA)를 이용하였다.
<2-6> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent DNA microarray scanner(Agilent technology, USA)로 스캔하였으며 추출된 데이터는 Agilent Feature Extraction software(Agilent technology, USA)와 GeneSpring GX 12(Agilent technology, USA)를 이용하여 normalization을 거쳐 각 DNA의 메틸화 변화 양상을 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 39만여 개의 유전자 프로모터 부위를 포함하는 프로브 중에서 비노출군에 비해 헥산알 노출군 그룹에서 유의하게 메틸화 양상 변이를 나타낸 유전자 프로브들에 대해 unpaired Welch’s t-test를 통해서 유의성 있게 메틸화 변화가 3.0배 이상 증가 또는 감소한(p-value < 0.05) 프로모터 부위 16,586개를 선별하였다(도 1).
이들 중, 노출 농도별 발현 변화한 메틸화 유전자 프로모터 부위는 아래 표 2와 같다. 저농도 처리군에서는 661개(과메틸화: 537개, 저메틸화: 124개), 중농도 처리군에서는 4,181개(과메틸화: 3,306개, 저메틸화: 875개), 고농도 처리군에서는 11,744개(과메틸화: 8,153개, 저메틸화: 3,591개)의 부위가 헥산알 노출에 의해서 메틸화하는 것을 확인할 수 있었다(표 2).
또한, 도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 세 가지 노출 농도에서 공통적으로 발현이 변화한 메틸화 유전자 프로모터 부위 79개(과메틸화: 75개, 저메틸화: 4개)와 이에 해당하는 메틸화 유전자 73종을 선별하였으며(도 2 및 표 3), 표 4에 나타낸 바와 같이 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 36종 또한 선별하였다(도 3, 도 4 및 표 4).
이들 메틸화 유전자들은 헥산알의 노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.
헥산알 노출에 의해 메틸화 정도가 변화하는 유전자 프로모터 부위
Hyper methylated sites Hypo methylated sites Total
저농도 537 124 661
중농도 3,306 875 4,181
고농도 8,153 3,591 11,744
세 가지 농도의 헥산알 노출에 의해 공통적인 메틸화 발현 변화를 보이는 유전자
등록번호
유전자 약어
대조군 대비 메틸화 발현 변화값 메틸화 정도
저농도 중농도 고농도
NM_001106545 KCNG1 0.31 0.27 0.33 저메틸화
NM_019330 PCCA 0.28 0.28 0.23 저메틸화
NM_001106806 PRKCSH 0.3 0.29 0.24 저메틸화
NM_012882 SSTR5 0.27 0.29 0.18 저메틸화
NM_017270 ADH4 3.69 5.67 6.99 과메틸화
NM_001109174 ANKRD34B 3.34 5.67 3.86 과메틸화
NM_001106130 ATP9B 3.82 5.05 3.7 과메틸화
NM_145670 BCAS1 4.1 3.07 6.1 과메틸화
NM_001109625 CAPZA1 4.21 3.73 5.01 과메틸화
NM_001013045 CCL24 3.38 3.97 3.64 과메틸화
NM_001100472 CCNC 3.17 4.21 9.26 과메틸화
NM_001014126 CCZ1 3.69 3.98 5.1 과메틸화
NM_001025410 CHMP5 3.55 3.3 3.65 과메틸화
NM_001109875 CRYGB 3.8 5.65 6.5 과메틸화
NM_013105 CYP3A23/3A1 3.04 4.79 4.29 과메틸화
NM_001108046 DDX41 3.38 6.09 6.58 과메틸화
NM_199388 DPAGT1 3.15 3.1 4.53 과메틸화
NM_001108431 DTWD2 3.03 6.6 10.47 과메틸화
NM_001106867 EIF1B 4.11 4.07 12.6.37 과메틸화
NM_001014074 FAM228A 3.13 4.24 3.59 과메틸화
NM_130814 FGF12 4.25 3.27 3.56 과메틸화
NM_001135757 FUNDC2 4.84 8.01 10.45 과메틸화
NM_176077 G6PC3 4.79 3.86 3.74 과메틸화
NM_207591 GLTSCR2 3.38 4.32 4.3 과메틸화
NM_017017 HGF 3.15 3.74 6.07 과메틸화
NM_001107946 HOOK1 4.25 3.5 5.47 과메틸화
NM_133562 INPP5J 3.49 7.37 8.39 과메틸화
NM_001104612 JRK 3.15 4.97 7.04 과메틸화
NM_181635 KIF15 3.23 4.71 4.62 과메틸화
NM_175759 KLK1C9 3.21 3.21 4.89 과메틸화
NM_001037190 LOC303448 3.74 5.28 4.63 과메틸화
NM_001047892 LOC317165 3.44 4.13 3.41 과메틸화
NM_001011911 LYAR 3.51 4.27 3.36 과메틸화
NM_001108774 MRAP2 3.18 5.16 4.73 과메틸화
NM_022178 MYO5A 3.37 4.16 4.77 과메틸화
NM_001198580 NACA 4.46 5.24 6.78 과메틸화
NM_001008339 NELFA 4.68 3.28 4.22 과메틸화
NM_001001365 OLR1049 3.31 3.21 4.3 과메틸화
NM_001000709 OLR1084 3.14 3.22 3.42 과메틸화
NM_001000420 OLR1085 3.97 4.65 4.98 과메틸화
NM_001000599 OLR1328 3.99 3.65 5.69 과메틸화
NM_001000000 OLR1389 3.38 3.57 5.12 과메틸화
NM_001000089 OLR1624 9.62 24.83 12.97 과메틸화
NM_206850 OLR1696 3.46 5.37 6.49 과메틸화
NM_001001114 OLR1701 4.19 3.05 5.11 과메틸화
NM_001000828 OLR407 3.43 3.79 4.18 과메틸화
NM_001000287 OLR448 3.37 4.72 4.11 과메틸화
NM_001000112 OLR5 3.17 3.51 6.25 과메틸화
NM_001000680 OLR500 3.9 8.02 9.1 과메틸화
NM_173099 PCDHB12 3.26 3.18 3.44 과메틸화
NM_053742 PITPNB 3.81 5.59 4.57 과메틸화
NM_031585 PLA2G1B 3.73 4.07 4.56 과메틸화
NM_001008316 PLAG1 3.24 3.72 4.16 과메틸화
NM_001109342 PRAMEL6 3.75 4.52 5.44 과메틸화
NM_001007697 PRUNE 3.03 4.54 7.46 과메틸화
NM_017279 PSMA2 3.35 3.78 3.78 과메틸화
NM_001014037 RGD1306227 3.18 4.06 4.69 과메틸화
NM_001077681 RGD1564345 3.18 6.32 8.11 과메틸화
NM_001135607 RHOX3 3.24 4.87 3.71 과메틸화
NM_001001800 RNF141 3.05 8.04 5.87 과메틸화
NM_001108190 RTP3 3.35 6.35 5.19 과메틸화
NM_001013135 SDCCAG3 3.69 4.58 5.01 과메틸화
NM_031798 SLC12A2 3.32 4.88 6.02 과메틸화
NM_001108728 SLC39A5 5.49 6.28 7.65 과메틸화
NM_131906 SLCO1A2 3.2 3.4 3.96 과메틸화
NM_001109507 SLIRP 3.82 4.6 4.47 과메틸화
NM_001106365 TAF5 3.19 4.32 3.27 과메틸화
NM_001024298 TMEM174 5.15 4.73 4.69 과메틸화
NM_001109004 TRAIP 3.45 5.65 6.02 과메틸화
NM_001107779 TRMT6 4.06 3.93 5.93 과메틸화
NM_212525 TYROBP 3.6 4.79 3.66 과메틸화
NM_031777 USF1 3.09 3.16 3.85 과메틸화
NM_001007669 ZFP672 3.69 5.22 4.65 과메틸화
세 가지 농도의 헥산알 노출에 의해 농도 의존적인 메틸화 발현 변화를 보이는 유전자
유전자 프로브 서열
PRKCSH ACGGAAGTGACGTACCCTAGAGCGTTCCGTTCTCTTTCTGCTGCAGGAAC 서열번호 1
PCCA CATCTCTTGAATGCTCATACCCACGGGCACAGGCTTAAGCGGGCCGAGCA 서열번호 2
OLR5 AGTCACACTGAGAAAAGAGAGGTTTTTGGATGAAAACAGTTTCATTCTGTATTTGTA 서열번호 3
KLK1C9 CCGTAGTCCAAGTCAAAGAAGGCAAGATTTTTGGCATTCTCAAAAAAAGAAAA 서열번호 4
TMEM174 GGGTGTCTCTGTTTTACGAAACAATAGTAAGCTGTCCTTCTATTTTAAGTTCATC 서열번호 5
RGD1306227 GCGTACATTGCTGACGTAATAGGCATGTCTAATGGCAATAAATTAAGAATTAGAAAATAT 서열번호 6
PRUNE CACGCTAGGAAAAGATTACCATAATCTTTGACTTGTCTTCTTAAAACCTACAGTC 서열번호 7
ADH4 ATGAATTATGGTGGGTTCATACAGTAGAGAGTTCGACGGTAAGAAAATAAACTACA 서열번호 8
SDCCAG3 TCCCTTGTAAGTTAAAGGGCCCAAAAGTTTTAATGCCTTGTCTGAAGATTTG 서열번호 9
OLR407 GAACCTCTGTGTTCTTCTAGTAGTAGTTTCCTGGGCCTTATCTACTGCCA 서열번호 10
OLR500 CCCCAACCCCAATTCTATTTCTTATATGAATAGAATTATAATTTGGCATAATTATA 서열번호 11
PRAMEL6 TAGCTCTAGTGTTTTACCATCCTATTCTGCTCTGTAGCTTGAAGAGGACCT 서열번호 12
HGF AGATCTAGGACTAAACTCCCTCTTACGGTAAGAAACTGTTTAACAACAGCCC 서열번호 13
RGD1564345 TTAACTGGCCTGCAAAGATAAAAATAAATCAGGTGTACTAAAGGCTATTATTAGT 서열번호 14
SLCO1A2 CTTTGTATATGTGTAAACCCAAAAGGAGCTTGAAGCGAGACGACACCAAG 서열번호 15
PLAG1 AAAATTGGCTTTGTAAATACTTACTTGCCCAGGACATACACTGAATGTTTGATATGG 서열번호 16
CCNC ACCATACTGAGGATGCTCTAGAAATTAACTAGCAGGAAACCTCCTCAGAG 서열번호 17
NACA CAGTGCGAAGTCAGCTATCTGCTAAGTGAAACCGCTCCGTGAGGTCAGAT 서열번호 18
SLC39A5 CTACTAACCTCTTTCCTATGAGAGAAACAGAGAATCCAGAACAAGTGGGAATGTTTA 서열번호 19
OLR1084 TCTCACCTGCATTCACCCATGTACTTCTTCCTTGCTAACCTATCCTTTGT 서열번호 20
OLR1085 AGTATCTCTCTACGTATTATGTGTGCATCCTTGCTCAAAAATTGTGTATGAAATGCTCCA 서열번호 21
JRK GAGGCTTCTAATCTTGGGACTTCCAAAGGAACAATGATAACCAAGGACCA 서열번호 22
MYO5A TTCTCAAAACTCCTTATCCGGCTTAGTTCCAGAGAACTAGTTGAGATTATAGTTT 서열번호 23
TRAIP AAGAGTTAGGTGCTAAGAAATGTGCCTTTAAAATTATTAGTCTGAGCGAAGATGAAC 서열번호 24
CRYGB GTTTTTGTCAGGAGCTATCATCAAAATAGTAATAAGGATCCAGACAGAAACTTTCCTA 서열번호 25
OLR1389 GATAAAAAGGTAAAAGCATGGTGTATCTTAAATGCCAACTATTAGACTGAGAACAGG 서열번호 26
CCZ1 CGCCTTTAGCCATGACAGTCAACCAAGAGTTAATAAAATAAAAAACACCACAGCC 서열번호 27
PLA2G1B AGAGGAAGGAAAATAACATCACAGATCTGTGCCTGGAACTTCCTTCCCAA 서열번호 28
USF1 CACTATTCCAAAATCATTCTGGGTATACACCCAGGAAAATGGTAATCAAAATAGTCA 서열번호 29
INPP5J CCTCTAACACTCACTCACTGGTGATGGTTCTGAAAGGCACTTGTCAAGGT 서열번호 30
DDX41 TATGCCCTAAGGAATTTGTGTATTTACTGTCTACCCTAAGCCCCTTTCCG 서열번호 31
PSMA2 TTTTCCTGTTATTTGCAACGTATCCCAGAAGTGATAATGCCCAGACAGTCTGAA 서열번호 32
FUNDC2 CTCGTGTTAAAAGATAACGTATATAAAACCGACCTCATGTTAAAAATAACG 서열번호 33
DTWD2 TCCCCAACCCCAAAAGTTATAACTTTTAAGAGAAGTAGAAATGTTAATTA 서열번호 34
SLC12A2 AACTGCGTTTCCTAACACTGAAGTTAAAAATGTCATCAAACGTCGAAATGAGGT 서열번호 35
OLR1696 GACACTCATCTCCTGAAAGAAAGGACAAAATTATTACAAAAATTCTTGCAGATTAGG 서열번호 36
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Methylation marker for identification of exposure to hexanal and the method of identification using thereof <130> 2015P-06-007 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> PRKCSH <400> 1 acggaagtga cgtaccctag agcgttccgt tctctttctg ctgcaggaac 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> PCCA <400> 2 catctcttga atgctcatac ccacgggcac aggcttaagc gggccgagca 50 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> OLR5 <400> 3 agtcacactg agaaaagaga ggtttttgga tgaaaacagt ttcattctgt atttgta 57 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> KLK1C9 <400> 4 ccgtagtcca agtcaaagaa ggcaagattt ttggcattct caaaaaaaga aaa 53 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> TMEM174 <400> 5 gggtgtctct gttttacgaa acaatagtaa gctgtccttc tattttaagt tcatc 55 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> RGD1306227 <400> 6 gcgtacattg ctgacgtaat aggcatgtct aatggcaata aattaagaat tagaaaatat 60 60 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> PRUNE <400> 7 cacgctagga aaagattacc ataatctttg acttgtcttc ttaaaaccta cagtc 55 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> ADH4 <400> 8 atgaattatg gtgggttcat acagtagaga gttcgacggt aagaaaataa actaca 56 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> SDCCAG3 <400> 9 tcccttgtaa gttaaagggc ccaaaagttt taatgccttg tctgaagatt tg 52 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> OLR407 <400> 10 gaacctctgt gttcttctag tagtagtttc ctgggcctta tctactgcca 50 <210> 11 <211> 56 <212> DNA <213> OLR500 <400> 11 ccccaacccc aattctattt cttatatgaa tagaattata atttggcata attata 56 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> PRAMEL6 <400> 12 tagctctagt gttttaccat cctattctgc tctgtagctt gaagaggacc t 51 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> HGF <400> 13 agatctagga ctaaactccc tcttacggta agaaactgtt taacaacagc cc 52 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> RGD1564345 <400> 14 ttaactggcc tgcaaagata aaaataaatc aggtgtacta aaggctatta ttagt 55 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> SLCO1A2 <400> 15 ctttgtatat gtgtaaaccc aaaaggagct tgaagcgaga cgacaccaag 50 <210> 16 <211> 57 <212> DNA <213> PLAG1 <400> 16 aaaattggct ttgtaaatac ttacttgccc aggacataca ctgaatgttt gatatgg 57 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> CCNC <400> 17 accatactga ggatgctcta gaaattaact agcaggaaac ctcctcagag 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> NACA <400> 18 cagtgcgaag tcagctatct gctaagtgaa accgctccgt gaggtcagat 50 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> SLC39A5 <400> 19 ctactaacct ctttcctatg agagaaacag agaatccaga acaagtggga atgttta 57 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> OLR1084 <400> 20 tctcacctgc attcacccat gtacttcttc cttgctaacc tatcctttgt 50 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> OLR1085 <400> 21 agtatctctc tacgtattat gtgtgcatcc ttgctcaaaa attgtgtatg aaatgctcca 60 60 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> JRK <400> 22 gaggcttcta atcttgggac ttccaaagga acaatgataa ccaaggacca 50 <210> 23 <211> 55 <212> DNA <213> MYO5A <400> 23 ttctcaaaac tccttatccg gcttagttcc agagaactag ttgagattat agttt 55 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> TRAIP <400> 24 aagagttagg tgctaagaaa tgtgccttta aaattattag tctgagcgaa gatgaac 57 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> CRYGB <400> 25 gtttttgtca ggagctatca tcaaaatagt aataaggatc cagacagaaa ctttccta 58 <210> 26 <211> 57 <212> DNA <213> OLR1389 <400> 26 gataaaaagg taaaagcatg gtgtatctta aatgccaact attagactga gaacagg 57 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> CCZ1 <400> 27 cgcctttagc catgacagtc aaccaagagt taataaaata aaaaacacca cagcc 55 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> PLA2G1B <400> 28 agaggaagga aaataacatc acagatctgt gcctggaact tccttcccaa 50 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> USF1 <400> 29 cactattcca aaatcattct gggtatacac ccaggaaaat ggtaatcaaa atagtca 57 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> INPP5J <400> 30 cctctaacac tcactcactg gtgatggttc tgaaaggcac ttgtcaaggt 50 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> DDX41 <400> 31 tatgccctaa ggaatttgtg tatttactgt ctaccctaag cccctttccg 50 <210> 32 <211> 54 <212> DNA <213> PSMA2 <400> 32 ttttcctgtt atttgcaacg tatcccagaa gtgataatgc ccagacagtc tgaa 54 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> FUNDC2 <400> 33 ctcgtgttaa aagataacgt atataaaacc gacctcatgt taaaaataac g 51 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> DTWD2 <400> 34 tccccaaccc caaaagttat aacttttaag agaagtagaa atgttaatta 50 <210> 35 <211> 54 <212> DNA <213> SLC12A2 <400> 35 aactgcgttt cctaacactg aagttaaaaa tgtcatcaaa cgtcgaaatg aggt 54 <210> 36 <211> 57 <212> DNA <213> OLR1696 <400> 36 gacactcatc tcctgaaaga aaggacaaaa ttattacaaa aattcttgca gattagg 57

Claims (9)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 유전자 프로모터 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001106806 (PRKCSH, protein kinase C substrate 80K-H);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_019330 (PCCA, propionyl-coenzyme A carboxylase, alpha polypeptide);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000112 (OLR5, olfactory receptor 5);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_175759 (KLK1C9, kallikrein 1-related peptidase C9);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001024298 (TMEM174, transmembrane protein 174);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001014037 (RGD1306227, similar to 4833420G17Rik protein);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001007697 (PRUNE, prune homolog (Drosophila));
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017270 (ADH4,alcohol dehydrogenase 4 (class II), pi polypeptide);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001013135 (SDCCAG3, serologically defined colon cancer antigen 3);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000828 (OLR407, olfactory receptor 407);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000680 (OLR500, olfactory receptor 500);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109342 (PRAMEL6, preferentially expressed antigen in melanoma-like 6);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017017 (HGF, hepatocyte growth factor);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001077681 (RGD1564345, similar to RIKEN cDNA 4921511H03);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_131906 (SLCO1A2, solute carrier organic anion transporter family, member 1A2);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001008316 (PLAG1, pleiomorphic adenoma gene 1);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001100472 (CCNC,cyclin C);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001198580 (NACA, nascent polypeptide-associated complex alpha subunit);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108728 (SLC39A5,solute carrier family 39 (metal ion transporter), member 5);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000709 (OLR1084, olfactory receptor 1084);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000420 (OLR1085, olfactory receptor 1085);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001104612 (JRK, jerky homolog (mouse));
    유전자 등록번호(GenBank) NM_022178 (MYO5A, myosin VA);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109004 (TRAIP, TRAF-interacting protein);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109875 (CRYGB, crystallin, gamma B);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000000 (OLR1389, olfactory receptor 1389);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001014126 (CCZ1, CCZ1 vacuolar protein trafficking and biogenesis associated homolog (S. cerevisiae));
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031585 (PLA2G1B, phospholipase A2, group IB, pancreas);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031777 (USF1, upstream transcription factor 1)
    유전자 등록번호(GenBank) NM_133562 (INPP5J, inositol polyphosphate-5-phosphatase J);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108046 (DDX41, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017279 (PSMA2, proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 2);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001135757 (FUNDC2, FUN14 domain containing 2);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108431 (DTWD2, DTW domain containing 2);
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031798 (SLC12A2, solute carrier family 12 (sodium/potassium/chloride transporters), member 2); 및
    유전자 등록번호(GenBank) NM_206850 (OLR1696, olfactory receptor 1696).
  2. 제 1항에 있어서, 유전자 등록번호(GenBank) NM_001106806 (PRKCSH, protein kinase C substrate 80K-H)의 프로모터 부위는 서열번호 1의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_019330 (PCCA, propionyl-coenzyme A carboxylase, alpha polypeptide)의 프로모터 부위는 서열번호 2의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000112 (OLR5, olfactory receptor 5)의 프로모터 부위는 서열번호 3의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_175759 (KLK1C9, kallikrein 1-related peptidase C9)의 프로모터 부위는 서열번호 4의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001024298 (TMEM174, transmembrane protein 174)의 프로모터 부위는 서열번호 5의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001014037 (RGD1306227, similar to 4833420G17Rik protein)의 프로모터 부위는 서열번호 6의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001007697 (PRUNE, prune homolog (Drosophila))의 프로모터 부위는 서열번호 7의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017270 (ADH4,alcohol dehydrogenase 4 (class II), pi polypeptide)의 프로모터 부위는 서열번호 8의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001013135 (SDCCAG3, serologically defined colon cancer antigen 3)의 프로모터 부위는 서열번호 9의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000828 (OLR407, olfactory receptor 407)의 프로모터 부위는 서열번호 10의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000680 (OLR500, olfactory receptor 500)의 프로모터 부위는 서열번호 11의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109342 (PRAMEL6, preferentially expressed antigen in melanoma-like 6)의 프로모터 부위는 서열번호 12의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017017 (HGF, hepatocyte growth factor)의 프로모터 부위는 서열번호 13의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001077681 (RGD1564345, similar to RIKEN cDNA 4921511H03)의 프로모터 부위는 서열번호 14의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_131906 (SLCO1A2, solute carrier organic anion transporter family, member 1A2)의 프로모터 부위는 서열번호 15의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001008316 (PLAG1, pleiomorphic adenoma gene 1)의 프로모터 부위는 서열번호 16의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001100472 (CCNC,cyclin C)의 프로모터 부위는 서열번호 17의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001198580 (NACA, nascent polypeptide-associated complex alpha subunit)의 프로모터 부위는 서열번호 18의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108728 (SLC39A5,solute carrier family 39 (metal ion transporter), member 5)의 프로모터 부위는 서열번호 19의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000709 (OLR1084, olfactory receptor 1084)의 프로모터 부위는 서열번호 20의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000420 (OLR1085, olfactory receptor 1085)의 프로모터 부위는 서열번호 21의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001104612 (JRK, jerky homolog (mouse))의 프로모터 부위는 서열번호 22의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_022178 (MYO5A, myosin VA)의 프로모터 부위는 서열번호 23의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109004 (TRAIP, TRAF-interacting protein)의 프로모터 부위는 서열번호 24의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001109875 (CRYGB, crystallin, gamma B)의 프로모터 부위는 서열번호 25의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001000000 (OLR1389, olfactory receptor 1389)의 프로모터 부위는 서열번호 26의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001014126 (CCZ1, CCZ1 vacuolar protein trafficking and biogenesis associated homolog (S. cerevisiae))의 프로모터 부위는 서열번호 27의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031585 (PLA2G1B, phospholipase A2, group IB, pancreas)의 프로모터 부위는 서열번호 28의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031777 (USF1, upstream transcription factor 1)의 프로모터 부위는 서열번호 29의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_133562 (INPP5J, inositol polyphosphate-5-phosphatase J)의 프로모터 부위는 서열번호 30의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108046 (DDX41, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41)의 프로모터 부위는 서열번호 31의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_017279 (PSMA2, proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 2)의 프로모터 부위는 서열번호 32의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001135757 (FUNDC2, FUN14 domain containing 2)의 프로모터 부위는 서열번호 33의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_001108431 (DTWD2, DTW domain containing 2)의 프로모터 부위는 서열번호 34의 염기서열;
    유전자 등록번호(GenBank) NM_031798 (SLC12A2, solute carrier family 12 (sodium/potassium/chloride transporters), member 2)의 프로모터 부위는 서열번호 35의 염기서열; 및
    유전자 등록번호(GenBank) NM_206850 (OLR1696, olfactory receptor 1696)의 프로모터 부위는 서열번호 36의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  3. 1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 폐 조직에서 메틸화 DNA만을 특이적으로 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군으로부터 분리된 DNA를 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 DNA를 제 1항의 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 폐 조직은 랫트의 폐 조직인 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 랫트의 폐 조직은 Fischer 344(SD계통) 랫트의 폐조직인 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP 및 dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인 방법.
  7. 제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 랫트의 폐 조직을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 랫트의 폐 조직은 Fischer 344(SD계통) 랫트의 폐 조직인 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.

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