JP2008502332A - メチル化核酸の分析 - Google Patents
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract
Description
(a)核酸フラグメントのサンプルとメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体を、該抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件下接触させ;
(b)メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に結合した核酸フラグメントを選択する
工程を含む、方法を提供する。
(c)1個以上のメチル化核酸フラグメントを特徴付けする
工程をさらに含む。
上記の方法は、全てのタイプの核酸のサンプルに適用できるが、好ましくは本核酸はDNAである。
サンプルは分析を望む全てのものであり得る。
ヌクレオチド修飾に対する抗体の特異性は、核酸が一本鎖であるとき、高い。故に、メチル化ヌクレオチドの富化および検出の能力は、サンプル中の核酸分子が一本鎖であるとき、高くなる。故に、サンプル鎖中に存在する全ての二本鎖核酸分子の鎖を分離することが望まれる。
多くのメチル化塩基に特異的な抗体は市販されている。例えばm5Cに対するマウスモノクローナル抗体はEurogentec S.A. (Belgium)から入手可能であり、ウサギポリクローナル血清はMegabase Research Products(USA)から入手可能である。他のメチル化塩基(6−メチルアデノシンおよび7−メチルグアノシン)に対するポリクローナルウサギ抗血清は入手可能である(Megabase Research Products, USA)。
当業者は、液相中での第一抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件を容易に決定できる。特に、抗体がメチル化ヌクレオシドに効果的に結合できるように、サンプル中の適当なイオンバランスを維持することが重要である。例えば、サンプルのpHは、リン酸ナトリウムのような適当な緩衝剤の添加により制御でき、これは、pHを約7.0に維持する。塩化ナトリウムのような塩もまた緩衝液および/またはサンプルに添加できる。
好ましくは、選択工程前に、メチル化および非メチル化核酸フラグメントを、第一抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に基づき分離する。これは、当業者に既知の任意の方法で行い得る。
メチル化核酸フラグメントの特徴付け前に、メチル化核酸を第一抗体(および使用しているならば固体支持体)から脱離させることが望まれる。当業者は、核酸が脱離工程中に変性しない、このような脱離法を容易に決定できる。
上記の本方法に使用する核酸フラグメント単離を、標準PCRまたはスロット・ブロットハイブリダイゼーションのいずれかにより分析できるため、この方法はマイクロアレイを使用した大規模(ゲノム全体)分析に適用できる。
(i)ゲノムをフラグメント化し、
(ii)上記の通りの本発明の方法を行う
工程を含む、方法を提供する。
上記の通り、本発明の方法において、富化は用量依存的である(すなわち富化はメチル化ヌクレオシドの数に比例する)(実施例2および図2B参照)。これは、本発明が、遺伝子がメチル化されているか否かの決定に使用できるだけでなく、それらの遺伝子のメチル化の程度の定量または比較にも使用できることを意味する。
(i)各核酸またはサンプルに対して上記の通りの本発明の方法を行い、
(ii)工程(d)の結果を比較する
工程を含む方法を提供する。
上記の通り、異常DNAメチル化は疾患をもたらし得る。特に、異常DNAメチル化はプロトオンコジーンの増加した発現または腫瘍抑制遺伝子の減少した発現をもたらし、多くのヒト癌腫と関連する。
(i)該個体由来の核酸サンプルに対して上記の通りの本発明の方法を行い、特異的核酸配列がメチル化されているか否かを特徴付けし、そして
(ii)その結果と個体の疾患状態を相関させる
工程を含む方法を提供する。
(i)患者から核酸フラグメントのサンプルを少なくとも2回の時点で得て、
(ii)本発明の方法を、各時点の各核酸フラグメントのサンプルに対して行い、核酸配列がメチル化されているかいないか、および/またはどの程度されているかの特徴付けをする
工程を含み得る。
(a)患者から組織標本を得て;
(b)核酸を各組織標本から抽出して核酸サンプルを提供し;
(c)核酸サンプルをフラグメント化して、核酸フラグメントのサンプルを得る。
(iii)各時点で患者において観察された疾患の臨床症状を記録し、そして
(iv)各時点で記録された臨床症状と、各時点の目的の核酸配列のメチル化状態を比較する
工程をさらに含み得る。
標的遺伝子が同定されたら、それを可能性のある抗癌剤を同定するための調査目的の薬剤スクリーニングに使用できる。このようなスクリーニングは、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現、および化学薬品とそのタンパク質の、該化学薬品が該タンパク質活性に対して何か効果を有するか否かを各員するための接触を含み得る。
図1:本発明の好ましい態様および続く特徴付け工程の模式図である。望む平均長のゲノムDNA(制限酵素での消化または剪断のいずれかにより産生)を変性させ、メチル化DNAを5−メチルシチジンに対する抗体とのインキュベートにより単離する。5−メチルシチジンに対する抗体はメチル化配列に結合する。これらを非メチル化配列から分離し、次いでPCRまたはマイクロアレイのような標準DNA検出法で検出できる。
サンプル調製
雄マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムDNAを、Bransonデジタルソニファイアーを使用した音波処理によりフラグメント化し、雌マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムDNAを、製造者が推薦する条件を使用したAluI(NEW ENGLAND BIOLABS, USA)での消化によりフラグメント化。
4μg AluI消化または音波処理マウスゲノムDNAを450μL TE(10mM Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA)で希釈してDNA懸濁液を製造し、95℃で10分加熱してDNAを変性させた。
1. 1容量のフェノールでの抽出。
2. 1容量のクロロホルムでの抽出。
3. 残りの水相を300mM NaClに調整し、2容量のエタノールを添加した。
4. 沈殿を室温で14.000rpmの遠心分離により行った。
5. 得られたDNAペレットを200μlの70%エタノールで洗浄し、その後50μL TEに溶解した。
非メチル化CpG島(ActinbおよびAPRTプロモーター)およびCpG(CpGaおよびCpGb)を含まないコントロール配列に対するメチル化配列の発生量(IAP Long Terminal Repeat, Xist promoter, H19 ICR)を、実時間PCRを使用して分析した。
マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムDNAを、AluIでの消化によりフラグメント化した。4μgの本フラグメント化DNAを、実施例1に記載の通りの富化に付した。
ハイブリッドマウス(Mus musculus domesticus×Mus spretus)ゲノムDNAを、音波処理によりフラグメント化した。
INおよびIPサンプルの両方を、H19 ICR対立遺伝子のプライマーを使用したPCRで増幅させ、これは200bp PCR産物をもたらした。Mus spretus由来のH19 ICR対立遺伝子は、Mus musculus domesticus H19 ICR対立遺伝子には存在しない多型SacI制限部位を含む。domesticus対立遺伝子からのPCR産物のSacIでの処理は200bpフラグメントを未切断のまま残すが、spretus対立遺伝子からのPCR産物のSacIでの処理は、2個の100bpフラグメントをもたらした。
結腸癌における異常メチル化の新規標的の同定
結腸癌細胞系SW48(ATTC, Rockville, MD)を、上記の通りのメチル化DNAの富化に付し、得られたサンプルを、製造者が記載の通り約12000個のCpG島プローブ(UHN Microarray Centre, Ontario)を表すマイクロアレイに、ハイブリダイゼーションし、ヒト肺線維芽細胞HFL−1(ATTC, Rockville, MD)およびWI−38(ATTC, Rockville, MD)と比較した。CpG島アレイハイブリダイゼーションのために、2μgの音波処理インプットDNAをCy5−dCTPで標識し、1回の富化アッセイの産物をCy3−dCTPで標識した。標識は、Bioprime標識化キット(Invitrogen)、120μMの各dATP、dGTP、dTTP、60μM dCTPおよび60μM Cy5−dCTPまたはCy3−dCTPを使用した無作為プライミングにより行った。この方法により、本発明者らは、結腸癌細胞に排他的なDNA過剰メチル化領域を同定した。この193クローンの群のうち、108個は、配列アノテーションに基づき不明瞭ではないと同定できた。この中で、31個のみが独特の配列に対応し、一方77個はリボソームDNAを示した。このようなリボソームDNAの過剰メチル化は加齢および腫瘍形成と関連して以前に記載報告されているが、その生理学的役割はまだ不明なままである。独特な配列のうち、3個のクローンが遺伝子間CpG島を示すが、残りの28個は、26種の異なる遺伝子に位置づけされた。2個の遺伝子以外、全てプロモーター領域に位置する。
SW48細胞(1×106)を培養培地に播き、24時間維持して、その後処理した。細胞を次いで5μM 5−アザ−dC(Sigma)で4日間処置した。5−アザ−dC含有培地を処置開始24時間後に交換した。コントロール細胞を、5−アザ−dC添加無しで同じ方法で処理した。総RNAを、RNeasyミニ・キット(Quiagen)を使用して調製し、cDNA合成を2μgの総RNA上で、Superscipt第一鎖合成系(Invitrogen)およびオリゴ−dTプライマーを使用して行った。PCR反応を、cDNA調製物の1/20で行った。RT酵素なしのコントロールは全て陰性であった。
KIAA0789 s ATTCAAGGCGCACACTATCCC
KIAA0789 as TGCTGCAGTGGCTTTAAGGAA
FOXF1 s TGCATTTCGGAAGCCACTGT
FOXF1 as AAGAGGCTGAAGCGAAGGAAG
ADAM12 s TGGATCCATTTCACAGGCCT
ADAM12 as AAAAGTTTCCCCCCGTGTGT
MGC48625 s CCTTTCCCATCTTAAGCTCCG
MGC48625 as GCGTCCCAGCGACTTTTTT
SHH s TACCTTTGAGGCCACAGAGCC
SHH as GCGGTTGGTTCTTAAGCCCTA
PAX6 s AACAATTCGGCGCTTTTCGT
PAX6 as TTCTTAAATTCTCCCCGGCC
FLJ25439 s GCTTACAGACTTGCCGCAGAA
FLJ25439 as TCTGATCTCTCAAACTCCCGGA
TAZ s CAAGCCCCGAGTGCAGTTATT
TAZ as ATAATTGCCCGCCTGGAGA
2μgのゲノムDNAをXbaIとHpaIIまたはXbaIのみのいずれかで消化した。PCR反応を、数個のHpaII制限部位を含むフラグメントにわたるプライマーを使用して、25ngの消化したDNA上で行った。プライマー配列およびPCR条件は請求に応じて入手可能である。
CpG島アレイを使用して同定した標的遺伝子の中で、ホメオボックス遺伝子PAX6−受託番号NM_000280−のみが、SW48細胞においてメチル化されると既に報告されている。GATA3遺伝子は、以前は結腸癌では試験されていないが、乳癌細胞において異常にメチル化されると報告されていた。残りの遺伝子は、癌における異常過剰メチル化の新規標的を示す。
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Claims (27)
- 核酸フラグメントのサンプル中のメチル化核酸フラグメントを富化する方法であって:
(a)核酸フラグメントのサンプルとメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体を、該抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件下接触させ;
(b)メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に結合した核酸フラグメントを選択する
工程を含む、方法。 - 工程(a)の前に:
サンプル中の二本鎖核酸フラグメントの鎖を分ける
工程をさらに含む、請求項1記載の方法。 - (c)1個以上のメチル化核酸フラグメントを特徴付けするさらなる工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- 核酸フラグメントのサンプル中の異なってメチル化された対立遺伝子の検出のための、請求項1から3のいずれかに記載の方法の使用。
- 核酸フラグメントのサンプル中のまたはそこから取り出したときのメチル化核酸フラグメントの割合が、工程(a)と(b)の間で少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍増加する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 核酸フラグメントがDNAフラグメントである、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- メチル化ヌクレオシドがメチルシチジンである、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- メチル化ヌクレオシドが5−メチルシチジンである、請求項8記載の方法。
- 抗体に結合する核酸フラグメントの選択が、抗体の固体支持体への接着または結合、そしてこの固体支持体のサンプル液相からの分離により行う、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体がメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に特異的に結合する、請求項9記載の方法。
- 固体支持体がメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に特異的な第二抗体を含む、請求項10記載の方法。
- 固体支持体がビーズの形である、請求項9から11のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が磁性物質である、請求項9から12のいずれかに記載の方法。
- さらにメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体からメチル化核酸フラグメントを脱離させる工程を含む、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体からメチル化核酸フラグメントを脱離させる工程が、第一抗体に結合した核酸フラグメントとプロテイナーゼのインキュベーションを含む、請求項14記載の方法。
- ゲノムDNAサンプルのメチル化状態を特徴付けする方法であって:
(i)ゲノムDNAサンプルをフラグメント化して、核酸フラグメントのサンプルを得て、そして
(ii)(i)で得た核酸フラグメントのサンプルに対して請求項3から15のいずれかに記載の方法を行う
工程を含む、方法。 - 少なくとも2個の核酸フラグメントのサンプルのメチル化状態を比較する方法であって:
(i)各核酸フラグメントのサンプルに対して請求項3から15のいずれかに記載の方法を行い、そして
(ii)一個の核酸サンプルと少なくとも1個の他の核酸サンプルから(i)で得た結果を比較する
工程を含む、方法。 - 個体における特異的核酸フラグメントのメチル化と関連する疾患を診断または予後診断する方法であって:
(i)個体からの核酸フラグメントのサンプルに対して請求項3から15のいずれかに記載の方法を行い;
(ii)(i)で得た結果と、個体の疾患状態を相関させる
工程を含む、方法。 - 患者における核酸メチル化の経時的変化を検出する方法であって:
(i)患者から組織標本をある時点に得て;
(ii)工程(i)を少なくとも1回別の時点で繰り返し;
(iii)各時点の核酸サンプルを得るために各組織標本から核酸を抽出し、そして
(iv)核酸配列がメチル化されているかいないか、および/またはどの程度されているかを特徴付けするために、各時点の各核酸サンプルに対して請求項3から15のいずれかに記載の方法を行う
工程を含む、方法。 - 核酸メチル化の変化と疾患の臨床症状を相関させる方法であって、請求項19に記載の工程と:
(a)各時点で患者において観察された疾患の臨床症状を記録し、そして
(b)各時点で記録された臨床症状と工程(iv)において観察された結果を相関させる
工程をさらに含む、方法。 - 各組織標本を貯蔵し、そして工程(ii)を複数の標本で同時に行う工程をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。
- 疾患が癌である、請求項18から21のいずれかに記載の方法。
- KIAA0789、FOXF1、ADAM12、MGC48625、SHH、PAX6、FLJ25439、TAZ、GATA3、TGFb2、ZNF566、ALX4、LOC283514およびDAPの一種以上の活性または発現の調整を含む、癌の処置法。
- KIAA0789、FOXF1、ADAM12、MGC48625、SHH、PAX6、FLJ25439、TAZ、GATA3、TGFb2、ZNF566、ALX4、LOC283514およびDAPのいずれか1種の、癌の処置のためのそれらのモジュレーターを同定するためのアッセイにおける使用。
- ヒト組織が腫瘍性形質転換する素因があるか否かを決定する方法であって、該組織由来の細胞においてKIAA0789、FOXF1、ADAM12、MGC48625、SHH、PAX6、FLJ25439、TAZ、GATA3、TGFb2、ZNF566、ALX4、LOC283514およびDAPから成る群から選択される核酸分子が存在しないか、変異体で存在するかまたは後成的な機構を介して下方制御されているかどうかの決定を含む、方法。
- 処置を必要とする患者における癌を処置または阻害する方法であって、該患者にKIAA0789受託番号XM_033133−、FOXF1、ADAM12、MGC48625、SHH、PAX6、FLJ25439受託番号NM_144725−、TAZ、GATA3、TGFb2、ZNF566受託番号NM_032838−、ALX4受託番号NM_021926−、LOC283514およびDAPから成る群から選択される遺伝子を発現できるベクターを投与する工程を含む、方法。
- KIAA0789、FOXF1、ADAM12、MGC48625、SHH、PAX6、FLJ25439、TAZ、GATA3、TGFb2、ZNF566、ALX4、LOC283514およびDAP、それらの活性フラグメント、それらの発現産物およびそれらの発現産物に対する抗体から成る群から選択されるいずれか1個またはそれ以上の遺伝子、および不活性担体を含む、医薬組成物。
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