JP2013517789A - 胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
出生前診断は現在、従来の細胞遺伝学的解析(核型分類等)またはDNA解析(QF−PCR等)を使って行われているが、これらは、羊水穿刺、絨毛採取または臍帯穿刺により採取する胎児の遺伝物質を必要とする。しかし、これらは侵襲性手順であり、胎児喪失という重大なリスクと関連する(絨毛採取および羊水穿刺の0.5〜1%)(Hulten,M.A.ら(2003)Reproduction126:279−297(非特許文献1))。有効な出生前診断検査の必要性は、特に、21トリソミー症候群としても知られているダウン症候群の場合は緊急性を擁する。ダウン症候群は精神遅滞の最多発な形式と考えられており、世界の全人口の700人に1人の割合で発生する。しかし、現在の出生前検査に伴うリスクのため、出生前診断は高リスク妊娠(全妊娠の6〜8%)にのみ行われており、母体の漿液スクリーニングおよび胎児の超音波検査法に基づき評価されている。よって、非侵襲性診断と一般に称されている、胎児を危険にさらさない診断手順の開発が緊急に必要とされている。
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化DNAおよび低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程;
b)高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定する工程;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を、前記複数のDMRの標準参照高メチル化値(例えば、妊娠月齢が符合する正常な母体の参照高メチル化値)と比較する工程;および
d)前記比較に基づく胎児異数性の診断を行う工程。
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体の末梢血試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程;
b)高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定する工程であって、
21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004 (SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のDMRのレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムQPCR)により決定される、工程;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を、21番染色体上の前記複数のDMRの、標準正常参照高メチル化値と比較する工程;および
d)前記比較に基づき21トリソミーを診断する工程。
21トリソミー診断に使用される21番染色体上の好ましいDMRは、SEQ ID NOs:36、37、38、39、40、42、43および44である。高メチル化DNAは、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)により低メチル化DNAから物理的に分離されることが好ましい。高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離された後、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)等により高メチル化DNAを増幅することが好ましい。
a)以下:
(i)正常な成人女性の末梢血DNA試料(PB試料)、および
(ii)正常な胎盤DNA試料(PL試料)
を提供する工程;
b)以下:
(i)分離したPB試料、および
(iii)分離したPL試料
を得るために、a)の各試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程;
c)b)の各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程;および
d)分離されたPB試料では低メチル化され、分離されたPL試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域(DMR)を同定する、工程。
a) 21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定するための、1種または複数種の核酸組成物;および
b) 21トリソミーの出生前診断のための核酸組成物のための利用ガイド。
本発明は、胎児DNAでは高メチル化、母体DNAでは低メチル化を示す、特異的メチル化領域(DMR)の大きなパネルを発明者が同定したことに、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明は、化学的に変性させることなく、または酵素的に高メチル化DNAまたは低メチル化DNA試料を消化することなく、2つのDNA群を物理的に分離することにより、高メチル化胎児DNAを低メチル化母体DNAから精製することができ、よって高メチル化胎児DNAが濃縮した試料となることを、本発明者が示したことに基づき、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明者は、本明細書で開示されるDMRの代表的実施例を用いて、母体の末梢血試料のパネルで、21トリソミーを正確に診断し、よって、同定されたDMRと開示された胎児異数性の診断法の有効性を提示した。
1つの態様では、本発明は、母体の血液試料を用いて、胎児異数性の出生前診断を行う方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる。
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体の血試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し;
b)高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定し;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を、前記複数のDMRの標準参照高メチル化値(例えば、後述する、標準正常参照高メチル化値)と比較し;および
d)前記比較に基づき胎児異数性を診断する。
母体の血液試料は、針および注射器を用いる等の標準的技法により得られる。好ましい実施形態では、母体の血液試料は母体の末梢血試料である。代わりに、母体の血液試料は、母体の血漿試料等の末梢血の切片部分であり得る。いったん血液試料が得られると、標準的技法を用いて試料からDNA全体を抽出することができる。標準的技法の非限定的例の1つが、QIAmp DNA Blood Midi Kit (Qiagen社)である。一般には、DNA全体はその後断片化し、好ましくは、約300bp〜800bpの大きさに断片化する。例えば、DNA全体は高周波により分解され得る。
本方法において、高メチル化DNAは、高メチル化DNA試料を得るために、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、低メチル化DNAから物理的に分離される。この物理的分離は、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)により行われることが好ましく、この技法は当業者の間ですでに詳細が記されている(例えば、Weber,M.ら(2005)Nat.Genet.37:853−862;およびRakyan,ら(2008)Genome Res.18:1518−1529を参照のこと)。これらは共に、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする。
診断法では、通常は、母体の血液試料における高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離した後に、高メチル化DNAを増幅する。本明細書で使用する「増幅」という用語は、DNAのコピーが追加され、よって、DNAのコピー数が増加するという意味であることを意図している。DNAのコピーは、通常は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて達成される。高メチル化DNA増幅の好ましい方法は、当業者によりすでに詳述されている、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)である(例えば、Ren,B.ら(2000)Science22:2306−2309;およびOberley,M.J.ら(2004)Methods Enzymol.376:315−334を参照のこと;双方の内容は、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする)。LM−PCRでは、平滑末端ライゲーションを通じてリンカー末端が試料のDNA断片に連結し、その後、リンカー末端のヌクレオチド配列を認識したオリゴヌクレオチドプライマーがPCRで使用され、よって、リンカーが連結したDNA断片が増幅される。よって、即時診断方法の好ましい実施形態では、母体の血液試料由来のDNAが断片化した後(例えば、約300〜800bpの断片になる)、および高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離される前に(例えば、MeDiPにより)、リンカーアームは、平滑末端ライゲーションにより断片化されたDNAに連結する。その後、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離した後、回収した高メチル化DNAに対し、DNAにすでに連結しているリンカー末端を認識したヌクレオチドプライマーを使ってPCR処理を行う。これにより、高メチル化DNA試料が増幅される。
本発明の診断法として、複数の特異的メチル化領域(DMR)が使われる。本明細書で使用する「特異的メチル化領域」または「DMR」という用語は、胎児DNAと母体DNAの間で特異的にメチル化された染色体DNAの領域を指していることを意図しており、本発明の目的から、好ましい選択DMRは、胎児DNAでは高メチル化され、母体では低メチル化されている領域である。すなわち、これらの領域(選択されたDMR)では、母体DNAに比べて、胎児DNAメチル化の度合いが高い(すなわち、数が多い)。
即時診断法において、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し、好ましくは、回収した高メチル化DNAを増幅した後、複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルが高メチル化DNA試料において決定され、よって、高メチル化DNA試料の高メチル化値が得られる。
いったん、母体の末梢血に存在する高メチル化された胎児DNAの高メチル化値(「検査DNA」とも称される)が決定すると、この値を検査DNAで調べた同じ複数のDMRの標準参照高メチル化値と比較し、これに基づき胎児異数性の診断(または、当該胎児異数性の非存在)が行われる。
別の態様では、本発明は、21トリソミー(本明細書では「NID21検査」とも称される)の非侵襲性出生前診断検査を提供する。実施例3において詳細を記述するが、NID21検査は、実施例1および2の記載に従って同定されたDMRを使って開発し、有効化した。検査の開発において、正常20および異常20(すなわち、21トリソミーを有する胎児を妊娠したことが判明した妊婦)から成る40の事例から採取した母体の血液試料を使って、(本明細書に開示の)21番染色体上の12個のDMRを調べた。結果の統計解析(実施例3において詳細を記述)により、最も情報量が豊富な染色体領域が明らかにされ、正常および異常事例全ての診断において100%感受性および正確性に到達するのに、(当初試験した全部で12個のDMRのうち)8個の特定DMRのみで十分であった。
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体末梢血試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し;
b)高メチル化DNAの高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定し、
ここで、21番染色体上の複数のDMRは、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323 (SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371 (SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含み、
ここで、複数のDMRのレベルは、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムQPCR)により決定され;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を、21番染色体上の前記複数のDMRの標準正常参照高メチル化値と比較し;および
d)当該比較に基づき21トリソミーを診断する。
すなわち、21トリソミー胎児DNA(すなわち、21トリソミーを有する胎児のDNA)から取得されたデータに基づき、21番染色体上の複数のDMRの「異常な」高メチル化値を設定することができ、検査DNAの高メチル化値が「異常」値と同程度(類似、または同じ範囲)であれば、21トリソミーの診断を下すことができる。
別の態様では、本発明は、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離することに基づき、胎児DNAの高メチル化された、および母体DNAの低メチル化された、特異的メチル化領域(DMR)の同定法を提供する。実施例1および2において記載されるように、本明細書に記載の手法は、胎児DNAにおいて、成人女性の末梢血DNAと比較して高メチル化レベルを呈する、21番、13番、18番、XおよびY染色体上の特異的メチル化領域(高メチル化)の大きなパネルを同定するために、染色体全体に適用された。されに、これら同じ手法が、これら同じ染色体上の追加DMRを同定するために、およびその他の染色体上の新たなDMRを同定するために、適用され得る。
a)以下を提供すること
(i)正常な成人女性の末梢血DNA試料(PB試料);および
(ii)正常な胎盤DNA試料(PL試料);
b)a)の各サンプルにおいて、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し、
(i)分離したPB試料;および
(iii)分離したPL試料;
を得;および
c)b)の分離した試料それぞれにおいて、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定し;および
d)分離したPB試料では低メチル化され、分離したPL試料では高メチル化されている領域を選択し、よって、本明細書に記載の診断法で利用するのに適している、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域(DMR)を同定する。
別の態様において、本発明では、本発明の診断法で利用され得るキットをも提供する。当該キットには、通常は、少なくとも1つの試薬およびキットの使用ガイドが含まれる。好ましい実施形態では、本発明は、21トリソミーの出生前診断のキットを提供する。当該キットには、以下が含まれる。
a)21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)レベルを決定するための、1種または複数種の核酸組成物;および
b)21トリソミーの非侵襲性出生前診断のための核酸組成物の使用ガイド。
別の実施形態では、本発明では、本発明の方法およびキットで使用され得る核酸組成物を提供する。これら核酸組成物は、DMRを検知するのに有効である。例えば、好ましい実施形態では、核酸組成物には、添付Aに示されるリストから選択された、1個または複数のDMR等、本発明の1個または複数のDMRを増幅するのに有効である1種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。オリゴヌクレオチドプライマーは「単離されている」、すなわち、異なる(望ましくない)特異性を有しないその他のプライマーから精製されている、または分離されていることが好ましい。さらに、「単離された」オリゴヌクレオチドプライマーは、染色体DNAまたはその他自然または天然由来の核酸等、自然または天然に存在する場所にプライマー配列を並べることができる、その他の核酸から精製され、または分離される。
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものと解釈するべきではない。すべての参照、添付、遺伝子バンクエントリー、本願で引用されている特許および公開特許出願は、その全体を、本明細書に引用により明示的に含めるものとする。
本実施例では、高スループット方式でDNAメチル化パターンの全染色体同定を可能とするよう、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)と高解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析を組み合わせたシステムを利用して、13番、18番、21番、XおよびY染色体の特異的メチル化領域(DMR)が同定された。
ヒトの試料
本研究で使用された試料は、AMS Biotechnology(Europe)Ltd(Oxon、イギリス)より取得された。これらの試料は、元々はBiochain社(Hayward、カリフォルニア)から取得されたものであるが、組織内倫理審査委員会(IRB)承認のプロトコルによる同意を得た。
MeDiPアッセイ(Weber,M.ら(2005)Nat.Genet.37:853−862)に続いて、Ren、B.ら(2000)(Science22:2306−2309)およびOberley、M.J.ら(2005)(Methods Enzymol.376:315−334)に記載の通りに、だが修正を加えて、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)を行った。手短には、全体で100μlの量のうち2.5μgのDNAを、まず、Virsonic300超音波発生装置(Virtis;Gardiner、ニューヨーク)を使って超音波により約300bp〜1000bpの断片に分断した。最終量が最大120μlとなるように、1XNEB buffer2(New England BioLabs;Ipswich、イギリス)、10XBSA(New England BioLabs;Ipswich、イギリス)、100mMのdNTPミックス、T4 DNAポリメラーゼ(3U/μl)(New England BioLabs;Ipswich、イギリス)および蒸留水と組み合わせた後、DNA断片を平滑末端にした。12℃で20分間インキュベートした後、DNA Clean and Concentrator−5TM(Zymo Research Corp;Glasgow、スコットランド)を用いて、製造者のプロトコルに従って反応のクリーンアップを行った。しかし、最後の溶出ステップは、QiAquick PCR精製キット(Qiagen;West Sussex、イギリス)により提供される30μlのEBバッファで行った。クリーンアップされた試料は、その後、先にRen,Bら(2000)supra、Oberley,M.J.ら(2004)supraにより記載されたように、40μlのアニールしたリンカー(50μM)(SIGMA Genosys;Gillingham、イギリス)、T4 DNAリガーゼ10Xバッファ(Roche;Mannheim、ドイツ)、6μlのT4 DNAリガーゼ(5U/μl)(Roche;Mannheim、ドイツ)および蒸留水と混合し、最終量が最大101μlとなるようにした。その後、試料を一晩、16℃でインキュベートし、アダプターがライゲーションするようにした。上記のDNA Clean and Concentrator−5TM(Zymo Research Corp;Glasgow、スコットランド)を用いて試料を精製した。その後、溶出された試料を、100mMのdNTPミックス、1xPCR Gold Buffer(Roche;Mannheim、ドイツ)、1.5mMのMgCl2(Roche;Mannheim、ドイツ)、および5UのAmpliTaqポリメラーゼと合わせた。その後、70℃で10分間インキュベートし、DNAオーバーハングを充填し、上記のDNA Clean and Concentrator−5TM(Zymo Research Corp;Glasgow、スコットランド)を用いて試料を精製した。50ngのDNAを取り除き、遺伝子コントロールDNAとして利用するために保有した。反応を適宜スケールダウンした後に、先に記述されているように(Weber,M.ら(2005)supra)、残りのライゲーションしたDNA試料(700ng〜1.2μg)をMeDiP処理した。その後、免疫沈降したDNAを、DNA Clean and Concentrator−5TM(700μlのライゲーションバッファを使用して)を用いて、製造者の指示書に従ってクリーンアップした。
インプットおよび女性の末梢血DNA由来の免疫沈降DNA断片、妊娠第3トリメスター中の胎盤DNA試料および妊娠第1トリメスターDNA胎盤試料(胎盤試料は共に男の胎児から採取された)を、ハイブリダイゼーションのためにRoche NimbleGen Inc(Reykjsvik、アイスランド)に送った。使用されたアレイプラットフォームは、13番、18番、21番、XおよびY染色体に特化された解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析法であり、プローブ間隔の中央値は、13番染色体で225bp、18番染色体で170bp、21番染色体で70bp、X染色体で340bpおよびY染色体で20bpであった。
胎盤と末梢血との間のメチル化の相対的差分を計算するために、末梢血DNAから得られたオリゴヌクレオチドアレイ正規化log2比値(免疫沈降物対インプット断片)を、R statistical computing environment(http://www.r−project.org)を使って、胎盤DNAから採取したlog2比値(免疫沈降物対インプット断片)から差し引いた。正の差分は胎盤DNAにおける相対的高メチル化を表し、負の差分は、相対的低メチル化を表す。その後、差し引いたlog2比率データの一般的な特徴の形式(GFF)ファイルを作成し、その結果を、SignalMap viewer(NimbleGen system;Reykjsvik、アイスランド)を使って、遺伝子、CpGアイランドおよび13番、18番、21番、XおよびY染色体全てのCG内容と共に閲覧した。遺伝子データは、Ensembl genome browser、(NCBI build36)(http://www.ensembl.org.)からダウンロードし、CpGアイランドとCG内容は、UCSCゲノムブラウザ(NCBI build36)(http://genome.ucsc.edu.)からダウンロードした。末梢血と胎盤の間の重要な特異的メチル化の豊富な領域を自動的に選択するために、先に、Copy Number Variation(CNV)コーリング(Price,T.S.ら(2005)Nucleic Acids Res.16:3455−3464)に用いられてきたArray−CGH(SW−ARRAY)に適合させたSmith−Watermanダイナミックプログラミングアルゴリズムを応用した。本アルゴリズムは、末梢血DNAと比較して胎盤DNAではメチル化濃縮またはメチル化枯渇のいずれかを示す連続的オリゴヌクレオチド類の「セグメント」または「アイランド」を同定するのに用いられた。各オリゴヌクレオチドアレイデータを染色体アームにより分析した。0.2と1との間のSW−ARRAYの閾値(t0)は、同じメチル化状態を有し、異なる閾値(t0)で得られたスコアのうち最も高いスコアを示す、少なくとも2つの連続的オリゴヌクレオチドの同定に基づき、相対的にスコアの高いセグメントまたは「アイランド」をコーリングするのに最適な値を同定するために検査された。SW−ARRAYにより同定された特異的メチル化領域と、遺伝子の位置、プロモーター領域(各遺伝子の5'末端の2kb上流までさかのぼる領域として定義した)およびCpGアイランドとの間を直接比較が行われた。
21番染色体および18番染色体上の選択された領域のメチル化濃縮は、リアルタイム定量PCRで確認された。この目的のために、5人の女性の末梢血DNA試料、および、妊娠第1トリメスターおよび妊娠第3トリメスターの胎盤のDNA試料5人分を使用した。関心対象の領域に特異なプライマーを、primer3のウェブサイト(http://frodo.wi.mit.edu/.)を使って設計した。プライマー設計は、SYBR Green蛍光融解曲線解析で推奨されているように、長さ80〜150bpの産物を生じるよう最適化された。さらに、全プライマーのTmは、60℃で閉じるよう選択された。プライマー配列とPCR産物配列双方の一意性に関しては、Blatを使ってヒト参照配列上にこれらをマッピングすることにより確認された。プライマーは、Sigma Genosys(Gillingham、イギリス)より購入した。
特異的メチル化マーカー候補の選択
当初、胎盤DNAと末梢血DNAの比率差(相対的メチル化)を計算するために、胎盤DNA試料および末梢血DNA試料双方の13番、18番、21番、XおよびY染色体のオリゴヌクレオチドアレイ正規化log2比値が使われた。本発明では、末梢血と胎盤との間で特異的メチル化領域を同定するためにSW−ARRAYを使用した。領域の同定に最適なSW−ARRAY閾値は、全染色体に対し0.9であることが分かった。第1トリメスターおよび第3トリメスターにおいて、末梢血DNAと比較してSW−ARRAY分析により同定された特異的メチル化領域については、21番、13番、18番、XおよびY染色体のそれぞれに関して、添付A〜Eに示されている。本発明では、高メチル化であると同定した領域の数は、以下の表1に概要を示すように、検査対象となった5つの染色体全てにおいて低メチル化の領域数とほぼ同じであった。さらに、特異的メチル化領域の合計数は、表1に概要を示すように、第1トリメスターおよび第3トリメスターの胎盤に匹敵する。同定された遺伝子座、添付A〜Eに示されるように、遺伝子の位置、プロモーター領域並びにCpGアイランドの位置と直接相関関係にある。
アレイ解析を検証するために、まず、リアルタイム定量PCRによる従来の調査領域のメチル化状態を分析した。本発明では、SERPINB5プロモーター領域は、胎盤では低メチル化状態、末梢血では高メチル化状態であったが、これは、Chim, S.S.ら(2005)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA11:14753−14758)の研究と一致している。さらに、抗画像アレイ解析により同定されたメチル化を検証するために、SERPINB5プロモーター領域を含む追加の9領域(Chim,S.S.ら(2005)supra)について、リアルタイム定量PCRで解析した。各領域を対象とするため、様々なプライマーが設計された。各プライマーは、使用前に検査し、各プライマーに最適な濃度を決定した。
MeDiP手順による実験的再現性を単一の胎盤DNA試料の技術的複製を行うことにより評価し、21番染色体上の2個の領域のメチル化状態をリアルタイム定量PCRにより評価した。再現性の中央値は、98.62%および95.84%であった。
個体間のメチル化状態の正常な変動性を評価するために、本発明者は、前記の9つの選択された領域のリアルタイム定量PCRアッセイを、5つの異なる末梢血および3つの異なる第1トリメスター胎盤に応用した。第3トリメスター胎盤のうち2つのメチル化状態は、選択された領域の4つのみで検査した。妊娠第1トリメスター期間が、非侵襲性出生前診断の開発に最も適しているため、第1トリメスター胎盤を好んで使用した本研究においては、第3トリメスター胎盤の個体間変動性のさらなる調査は必要なかった。CHR21(B4)の結果は図3に示した。表4に概要が示されているように、5つの末梢血試料全てが、個体間でDNAメチル化濃縮の変動性を有する5つの胎盤DNAと比較して低メチル化であることが分かった。第3トリメスター胎盤と比較して、第1トリメスター胎盤ではメチル化濃縮が少なく、オリゴヌクレオチドアレイの結果を確認した(図3参照)。より低い変動性レベルが、同じ妊娠月齢の異なる胎盤間で観察された。
全実験におけるMeDiP効率を評価するために、本発明者は、コントロールとして用いるためのアレイ実験から特異的メチル化が同程度であった、2つの高メチル化領域と2つの低メチル化領域を選択した。これらのコントロール領域を検知するために使われたプライマーについては、以下の表6に概要を示した。その中で、CHR13(HYP1)プライマーおよびCHR13(HYP2)プライマーは、高メチル化コントロール領域を検知し、CHR22(U1)およびCHR22(U2)は低メチル化コントロール領域を検知する。
本実験では、特異的メチル化領域(DMR)がどのように同定されたか、また、これらDMRのうち、母体DNAでは低メチル化であり、胎児DNAでは高メチル化である特異的メチル化領域がどのように優先的に選択されたか、これらに関する追加の詳細な説明を提供する。本方法のフローチャート図は、図5に示されている。当該図では、13番染色体、18番、21番、XおよびY染色体全体のDMR同定に向けたMeDiP LM−PCRおよびオリゴーアレイハイブリダイゼーション手順の適用を示している。
1人の正常な成人女性の末梢血(PB)由来のDNA試料、1つの正常な第1トリメスター胎盤(PL1)および1つの正常な第3トリメスター胎盤(PL3)が非血縁同士の個人から採取された。試料は、元々は、Biochain社(Hayward、カリフォルニア)で採取されたものだが、AMS Biotechnology(ヨーロッパ)Ltd(Oxon、イギリス)を通じて供給された。これら試料に対する同意書は、組織内倫理審査委員会(IRB)により承認されたプロトコルに従って取得された。
最初に、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)およびライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)を、1人の正常な成人女性の末梢血(PB)由来のDNA試料、1つの正常な第1トリメスター胎盤(PL1)および1つの正常な第3トリメスター胎盤(PL3)に適用された。さらに詳細には、MeDiPアッセイ(Weber、M.ら(2005)Nat.Genet.37:853−862に詳細が記載されている)に続き、LM−PCR(Ren,B.ら(2000)Science22:2306−2309;Oberley,M.J.ら(2004)Methods Enzymol.376:315−334に詳細が記載されている)を行った。当該方法論に関しては、先の記述に(Rakyan、K.V.ら(2008)Genome Research 18:1518−1529)に微修正を加えた方法を行った。図5に、当該手順のフローチャート図が提供されている。
手短に、総量100μl中のDNA試料2.5μgを、VirSonic Digital 600超音波発生装置(Virtis;Gardiner、ニューヨーク)(図1)を使って超音波により約300bp〜1000bpの大きさにせん断した。
各試料から合計50ngのライゲーションしたDNAを取り除き、インプットゲノムコントロールDNAとして保有した(図5)。反応を適宜スケールダウンした(Weber,M.ら(2005)supra)後に、残りのライゲーションしたDNA試料(800ng−1.2μg)を、先に記載した通りにMeDiP処理した。その後、免疫沈降したDNAを、前記QIAquick PCR精製キットを使って、製造者のプロトコルに従って精製した(図5)。
ライゲーション仲介PCR増幅(LM−PCR)反応は、Advantage−GCゲノムLAポリメラーゼミックス(Clontech;Saint−Germain−en−Laye、フランス)を用いて、各インプットおよびIPDNA断片10ngとの間で行われた(図5)。適用した温度循環条件は、94℃で1分間、(94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で2分間)を20サイクル、および72℃で5分間であった。PCR増幅後、前記QIAquick PCR精製キットを使って精製し、予め50℃に温めた50μlの蒸留水で溶出した(図5)。
各試料のインプットおよびIPDNAを、13番、18番、21番、XおよびY染色体専用のオリゴアレイと共ハイブリダイズさせた。第1トリメスター胎盤および第3トリメスター胎盤双方の関心対象の染色体(13番、18番、21番、XおよびY染色体)全体のDMRを明らかにするために、PB比値をPL1比値およびPL3比値から差し引いた。さらに、末梢血DNAと比較して胎盤DNAの主要な特異的メチル化を有する領域を自動的に選択するために、Array−CGH (SW−ARRAY)に適合させたダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて応用した(図5)。
本実施例において、実施例1および2に記載の方法に従って同定されたDMRが、21トリソミー(本明細書ではNID21と称する)の非侵襲性診断の開発および検証に使用された。当該方法論のフローチャート図は、図6に示されている。当該図には、NID21検査の開発及び検証に向けて、正常なケース20件および21トリソミーのケース20件を使用した実験手順が示されている。
女性の末梢血試料および胎盤DNA試料(実施例1および2)との間で同定されたDMRをさらに掘り下げて調査し、21番染色体上に位置する12個の領域を選択した。NID21検査開発のために選択された領域と共に、13番染色体および22番染色体上に追加された2つの領域が、それぞれ高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。12個の領域の選択基準は、まず、末梢血DNA試料および胎盤DNA試料における領域のメチル化状態に基づいていた。さらに具体的には、胎盤の選択領域では高メチル化状態を示し、末梢血の選択領域では低メチル化状態を示さなければならない。第二に、選択領域には、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これら領域で観察された特異的なメチル化のレベルは、高バックグラウンドな低メチル化DNAの中に存在する微量の高メチル化DNA試料を検査する時に効率的にメチル化状態を区別するよう、対数目盛で「1」の値より上でなければならない。
NID21検査の開発目的のために、本発明では、正常な胎児を妊娠している女性由来の20の母体末梢血試料と、ダウン症候群(21トリソミー)胎児(T21胎児)を妊娠している女性由来の20の母体末梢血を用いた。母体末梢血DNA試料はすべて、キプロスおよびギリシャの協力を通じて、Cyprus Institute of Neurology and Geneticsにおいて、妊娠第1トリメスターから採取した。Cyprus National Bioethics Committeeにより承認された同意書が、参加者の各試料採取のために回収された。
MeDiPおよびLM−PCR準備
QIAamp DNA blood Midi Kit(Qiagen;West Sussex、イギリス)を用いて、全試料からDNAを抽出した。正常な胎児を妊娠している女性由来の20の母体末梢血試料およびT21胎児を妊娠している女性由来の20の末梢血試料から単離されたDNAに対し、DNA断片化、リンカーアニーリング、MeDiPおよびLM−PCR処理を施し、その結果、図6に示すように、インプットおよびIP DNA断片を生じさせた。上記の方法論は、実施例1および2に記載されている。
40の母体末梢血試料全てにおいて、予め選択された21番染色体上の12個のDMRおよび13番染色体並びに22番染色体の2つのコントロール領域に関するインプットおよびIP断片全てにリアルタイムqPCRを適用した(図6)。最初に、関心対象の領域に特異的なプライマーを、プライマー3ウェブサイト(http://frodo.wi.mit.edu/.)を使って設計した。リアルタイムqPCRに使用されたプライマーを表7に示す。
ΔCT PB-Normal = CT PB-Normal-Input - CT PB-Normal-IP
ΔCT PB-T21 = CT PB-T21-Input - CT PB-T21-IP
但し、式中PB=末梢血であり、T21=21トリソミーである。
Norm ΔCT valuePB-Normal= E ΔC T PB-Normal
Norm ΔCT value PB-T21 = E ΔC T PB-T21
但し、式中E= 10 [-1/slope] = プライマーの効率
Norm= 正規化
正規化値は、各「検査試料」の各コントロール領域のメチル化濃縮に対応するコントロールプライマーから得た。
Median Norm ΔCT PB-Normal = Median (Norm ΔCT PB-Normal-1、 Norm ΔCT PB-Normal-2、 ... Norm ΔCT PB-Normal-n)
Median Norm ΔCT PB-Normalの計算には、検査対象の各DMRにおける各試料の比値を決定することが求められる。この比値は、以下の数式により決定される。
Ratio ValueSample; DMR = Norm ΔCT PB-Sample (Normal or T21) / Median (Norm ΔCT PB-Normal)
正常なケースから得られた比値は、正常なケースと異常なケースを区別する度合いを評価するために、検査対象の各DMRの21トリソミーから得られた比値と比較した。しかし、上記データの統計解析は、正常なケースと異常なケースを区別する統計的有意性を正確に決定するために重要である。
正常なケースと21トリソミーのケースを区別するにあたり、12個のDMRそれぞれの統計的有意性を、Mann−Whitney U Testを使って評価した。本検査は、2つの独立した観察セット(本発明においては、正常試料および21トリソミー試料を有するセット)が、同じ分布由来であるかどうかを評価するための、ノンパラメトリック検査である。その後、12個の各DMRにつきp値が報告された。p値が<0.05であれば有意とした。
Median ratio valuesPB-Normal = Median (ratio valuePB-Normal-1、 ratio valuePB-Normal-2、 ... ratio valuePB-Normal-n)
Median ratio valuesPB-T21 = Median (ratio valuePB- T21 -1、 ratio valuePB- T21 -2、 ... ratio valuePB- T21 -n)
その後、以下の数式に示すように、21トリソミーのケースの比値の中央値を、正常なケースの比値の中央値で除算した。
Median Ratio ValueDMR = Median ratio valuesPB-T21 / Median ratio valuesPB-Normal
DMRより得た比値の中央値は、降順に並べ、正常なケースと21トリソミーのケースの間の分離の度合いを示した。その後、(ノンパラメトリックの)中央値検査を行った。本検査は、2群が同じ中央値を有するかどうかを決定するためのカイ二乗検査である。その後、12個の各DMRのp値が報告された。p値が<0.05であれば有意とした。さらに、フィッシャーの多重検定が適用された。本検査では、様々なDMRのp値をまとめ、正常なケースと21トリソミーのケースを区別する統計的有意性について全般的評価を行った。
Di=a+b1X1+b2X2+・・・+bPXP, (1)
a=定数、b=非標準化係数、Xp=ratio valueSample; DMR
本実施例では、実施例3に記載の21トリソミーの非侵襲性診断検査について、さらに詳細に記述する。さらに、この胎児特異的メチル化比率方式を用いて、46の正常な妊娠および34の21トリソミー妊娠を100%正確に診断することが示された。
ここで行う診断戦略の目的のために、当初、周知の核型を有する40の母体末梢血試料(正常な妊娠から20、21トリソミー妊娠から20)を用いた。これら40の末梢血試料は、妊娠月齢11.1〜14.4週の間から採取された。さらに、対象のアイデンティティおよび核型結果が、本検査を実行する試験者に分からないようにするために、40の追加試料が無作為に使用された。
本発明者が先に同定したDMRについては、実施例1に記載されているが、それをさらに深く調べていくと、さらなる研究対象として、21番染色体上に位置する12個のDMRの選択という点に導かれた。12個のDMRは、3つの基準に基づき選択された。第一に、12個のDMRは、胎児特異的DMRメチル化濃縮を達成し、よって母体循環におけるffDNA量を増加させるために、胎盤においては高メチル化状態、末梢血においては低メチル化状態を示さなければならない。第二に、12個のDMRは、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これらDMRで観察された特異的なメチル化のレベルが、当該領域に含まれるオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つにおいて、対数目盛で「1」の値より大きくなければならない。12個のDMRと共に、13番染色体(HYP113)および22番染色体(U122)上に位置する2つの追加領域は、実施例3に記載の通り、それぞれ、高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。
MeDiPおよびリアルタイムQPCRの応用
DNAは、QIAamp DNA blood Midi Kit(Qiagen; West Sussex、 イギリス)を用いて、各試料から1mlずつ抽出した。80の試料から単離されたDNAに対し、実施例1〜3に記載の通り、メチル化部位の免疫沈降の処理を行った。簡潔に、2.5μgのDNAを、約300bp〜1000bpの大きさの断片に超音波によりせん断した。DNA断片を平滑末端として、リンカーを作られた両端に追加した。各試料から合計50ngのライゲーションしたDNAを取り除き、インプットゲノムコントロールDNAとして保有した。残りのライゲーションしたDNA試料(800ng〜1.2μg)には、実施例1〜3に記載の通り、MeDiP処理を施した。最後に、DNAの量を増加させるために、インプットおよびIPDNA断片をそれぞれ10ngずつ用いて、ライゲーション仲介PCR(LM−PCR)反応を行った。
12個の選択されたDMRの区別の度合いを評価するために、既知の核型を有する40の試料を使用した。これを達成するために、12個の各DMRに関して、20の正常なケースの胎児特異的メチル化比値を20の21トリソミーケースの比値と比較した。生データを正規化するために、上記のリアルタイムqPCRにより、インプットおよびIP断片すべてにCT値を得た。取得されたCT値に一連の正規化ステップを施した。最初は、三重リアルタイムqPCR反応の平均CT値を、インプットおよびIP試料それぞれのために計算した。その後、MeDiPおよびLM−PCR適用中のPCR反応の効率を、以下の数式を使って正規化した。
ΔCT PB Normal = CT PB Normal Input - CT PB Normal IP
ΔCT PB T21 = CT PB T21 Input - CT PB T21 IP
式中、
PB=末梢血
T21=21トリソミー
IP=免疫沈降
である。
上記正規化は、全ての試料に対し、また、選択されたDMRおよびコントロールのすべてに対し別々に行った。
Norm ΔCT valuePB Normal= E ΔC T PB Normal
Norm ΔCT value PB T21 = E ΔC T PB T21
式中、
E= 10 [-1/slope] = プライマーの効率、
Norm= 正規化
である。
Median Norm ΔCT PB Normal = Median (Norm ΔCT PB Normal-1、 Norm ΔCT PB Normal-2、 ... Norm ΔCT PB Normal-n)
検査対象の各DMRにおける各試料の胎児特異的メチル化比値を決定するために、Median Norm ΔCT PB Normalの計算が必要であった。本比値は、以下の数式を用いて決定した。
Ratio ValueSample; DMR = Norm ΔCT PB Sample (Normal or T21) / Median (Norm ΔCT PB Normal)
MeDiP方法論の効率を評価するために、上記の80の母体末梢血試料を使って、既知の高メチル化(HYP113)領域および低メチル化(U122)領域を検査した。試料P1〜P40は、予測方程式を作るために使用された既知の核型を有する試料であり、一方、試料P41〜P80は、無作為試験に参加した試料である。試料P1〜20およびP41〜P66は、正常な胎児を妊娠した女性から採取した試料であり、一方、P21〜P40およびP67〜P80は、21トリソミーを有する胎児を妊娠した女性から採取した試料である。
本明細書で記載されているように、40の既知の核型試料を用いて(正常が20、21トリソミーが20)、正常および21トリソミーケースのDNAメチル化比率を決定するための方式を開発した。
胎児特異的メチル化比値をさらに評価するために、本研究において、正常なケースを21トリソミーケースから区別するにあたり、12個の各DMRの統計的有意性を明らかにする、詳細な単変量統計解析を行うことが必須であった。これを達成するために、p値について各DMRの有意性を評価するMann−Whitney U Testを使用した。各DMRに対し両側検定により得られたp値を、以下の表10に示す。
D = - 6.331 + 0.959 XEP4 + 1.188 XEP5 + 0.424 XEP6 + 0.621 XEP7 + 0.028 XEP8 + 0.387 XEP10 - 0.683 XEP11 + 0.897 XEP12
式中、XEPi = ratio valueSample; EPi 、 i= 1、...12
である。
予測値、または「D値」がカットポイントを超えるケースは、「21トリソミー」と分類し、カットポイントを下回ると評価したケースは、「正常」と評価する。ケースで構成される2群のサイズは等しく、カットポイントは「0」とする。よって、D>0の場合ケースは「21トリソミー」と分類され、そうでなければ「正常」と分類される。明らかに正常な妊娠から採取した試料は全て、D値が負であったが、明らかに21トリソミー妊娠から採取した試料は全てD値が正であった。正常であるかそれとも21トリソミーであるかかが明らかな40のケースのD値の範囲並びに中央値は、以下の表12に示されている。
方法の特異度および感度は、40のサンプルから成る無作為試験により再評価された。本無作為試験は、予測方程式を構成する8個のDMRのメチル化状態を評価することにより行われた。試料の状態(正常または21トリソミー)を判断するD値を明らかにするために、本無作為試験で40のサンプルの8DMRから得られた比値を予測方程式に当てはめた。合計26のケースのD値は負であり、14のケースのD値は正であった。従って、表13にまとめるように、予測方程式によると26のケースは正常であり、14のケースは21トリソミーである。
39頁中1頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中2頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中3頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中4頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中5頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中6頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中7頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中8頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中9頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中10頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中11頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中12頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中13頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中14頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中15頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中16頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中17頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中18頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中19頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中20頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中21頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中22頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中23頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中24頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中25頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中26頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中27頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中28頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中29頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中30頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中31頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中32頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中33頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中34頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中35頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中36頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中37頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中38頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付A:21番染色体
39頁中39頁目
*染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中1頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中2頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中3頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中4頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中5頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中6頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中7頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中8頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中9頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中10頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中11頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中12頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中13頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中14頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中15頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中16頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中17頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中18頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中19頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中20頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中21頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中22頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中23頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中24頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中25頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中26頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中27頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中28頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中29頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中30頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中31頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中32頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中33頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中34頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中35頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中36頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中37頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中38頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中39頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中40頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中41頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中42頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中43頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中44頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中45頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中46頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中47頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中48頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付B:13番染色体
49頁中49頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中1頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中2頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中3頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中4頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中5頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中6頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中7頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中8頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中9頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中10頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中11頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中12頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中13頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中14頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中15頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中16頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中17頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中18頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中19頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中20頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中21頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中22頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中23頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中24頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中25頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中26頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中27頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中28頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中29頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中30頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中31頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中32頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中33頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中34頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中35頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中36頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中37頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中38頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中39頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中40頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中41頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中42頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中43頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中44頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中45頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中46頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中47頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中48頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
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72頁中49頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中50頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中51頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中52頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中53頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中54頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中55頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中56頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中57頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中58頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中59頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中60頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中61頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中62頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中63頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中64頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中65頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中66頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中67頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中68頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中69頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中70頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中71頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付C:18番染色体
72頁中72頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中1頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中2頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中3頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中4頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中5頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中6頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中7頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中8頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中9頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中10頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中11頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中12頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中13頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中14頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中15頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中16頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中17頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中18頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中19頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中20頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中21頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中22頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中23頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中24頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中25頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中26頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中27頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中28目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中29目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中30目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中31頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中32頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中33頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中34頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中35頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中36頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中37頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中38頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中39頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中40頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中41頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中42頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中43頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中44頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中45頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中46頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中47頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中48頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中49頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中50頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中51頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中52頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中53頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中54頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中55頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中56頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中57頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中58頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中59頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中60目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中61頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中62頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中63頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中64頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中65頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中66頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中67頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中68頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中69頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中70頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中71頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中72頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付D:X染色体
73頁中73頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中1頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中2頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中3頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中4頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中5頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中6頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中7頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中8頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中9頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中10頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中11頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中12頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中13頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中14頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中15頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中16頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中17頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中18頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中19頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中20頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中21頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中22頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中23頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中24頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中25頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中26頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中27頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中28頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中29頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中30頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中31頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中32頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中33頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中34頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中35頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中36頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中37頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中38頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中39頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中40頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中41頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中42頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中43頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中44頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中45頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中46頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中47頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中48頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中49頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中50頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中51頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中52頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中53頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中54頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中55頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中56頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中57頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
添付E:Y染色体
58頁中58頁目
染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)ビルド36から得た。
Claims (42)
- 母体血液の試料を使用した胎児異数性の出生前診断の方法であって、
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAと物理的に分離する工程;
b)高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定する工程;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を前記複数のDMRの標準参照高メチル化値と比較する工程;および
d)前記比較に基づき、胎児異数性を診断する工程
を含む、前記方法。 - 母体血液試料が母体の末梢血試料である、請求項1に記載の方法。
- 高メチル化DNAが、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)により低メチル化DNAから物理的に分離される、請求項1に記載の方法。
- 高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離された後、該高メチル化DNAが増幅される、請求項1に記載の方法。
- 高メチル化DNAがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)により増幅される、請求項4に記載の方法。
- 複数のDMRが、添付A〜Eに示されたリストから選択される、請求項1に記載の方法。
- 複数のDMRレベルが、少なくとも3個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。
- 複数のDMRレベルが、少なくとも5個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。
- 複数のDMRレベルが、少なくとも8個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。
- 複数のDMRレベルが、少なくとも10個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。
- 複数のDMRが、添付A〜Eに示されるリストから選択される、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 高メチル化DNA試料における複数のDMRレベルが、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムQPCR)により決定される、請求項1に記載の方法。
- LM−PCR効率のコントロールとして、複数のDMRのレベルが未処理の母体血液DNA試料全体においても決定される、請求項5に記載の方法。
- 高メチル化DNA試料の高メチル化値を正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される、請求項1に記載の方法。
- 21トリソミー診断のための複数のDMRが21番染色体上にある、請求項1に記載の方法。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される3個またはそれ以上の領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)および塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項17に記載の方法。
- 複数のDMRが、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択された染色体上にある、請求項1に記載の方法。
- 母体の末梢血試料を使用した21トリソミーの出生前診断の方法であって、
a)高メチル化DNA試料を得るために、母体末梢血の試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAと物理的に分離する工程;
b)高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)レベルを決定する工程であって、
21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のDMRレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムQPCR)により決定される、工程;
c)高メチル化DNA試料の高メチル化値を21番染色体上の前記複数のDMRの標準正常参照高メチル化値と比較する工程;ならびに
d)前記比較に基づき21トリソミーを診断する工程
を含む、前記方法。 - 高メチル化DNAが、メチル化DNA免疫沈降(MeDiP)により低メチル化DNAから物理的に分離される、請求項20に記載の方法。
- 高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離された後、高メチル化DNAが増幅される、請求項20に記載の方法。
- 高メチル化DNAがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)により増幅される、請求項22に記載の方法。
- LM−PCR効率のコントロールとして、複数のDMRレベルが未処理の母体血液DNA試料全体においても決定される、請求項20に記載の方法。
- 高メチル化DNA試料の高メチル化値を正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が、正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ21トリソミーの診断が下される、請求項20に記載の方法。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、および塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項20に記載の方法。
- 胎児異数性の診断に利用するのに適し、関心対象の染色体上にある特異的メチル化領域(DMR)を同定する方法であって、
a)以下:
(i)正常の成人女性の末梢血DNA試料(PB試料);および
(ii)正常な胎盤DNA試料(PL試料)
を提供する工程;
b)以下:
(i)分離されたPB試料;および
(iii)分離されたPL試料
を得るために、a)の各試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程;
c)b)の分離された各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程;および
d)分離されたPB試料では低メチル化され、かつ分離されたPL試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域(DMR)を同定する、工程
を含む、前記方法。 - PL試料が二つの異なる試料、すなわち、第1トリメスターPL試料および第3トリメスターPL試料を含み、前記工程d)が、第1トリメスターの分離PL試料および第3トリメスターの分離PL試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 関心対象の染色体が21番染色体である、請求項27に記載の方法。
- 関心対象の染色体が、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 異数性がトリソミーまたはモノソミーである、請求項27に記載の方法。
- 以下を含む21トリソミーの出生前診断キット:
a)21番染色体上の複数の特異的メチル化領域(DMR)のレベルを決定するための、1種または複数種の核酸組成物;および
b)21トリソミーの出生前診断のための核酸組成物の利用ガイド。 - 21番染色体上の複数のDMRが、添付A〜Eに示されたリストから選択される、請求項32に記載のキット。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される3個またはそれ以上の領域を含む、請求項32に記載のキット。
- 染色体21上の複数のDMRが、塩基対39279856−39280004(SEQ ID NO:33)、塩基対44161178−44161323(SEQ ID NO:34)、塩基対44161239−44161371(SEQ ID NO:35)、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対29136735−29136844(SEQ ID NO:41)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO:43)、塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含む、請求項32に記載のキット。
- 21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735−33320829(SEQ ID NO:36)、塩基対42189557−42189683(SEQ ID NO:37)、塩基対42355712−42355815(SEQ ID NO:38)、塩基対42357215−42357341(SEQ ID NO:39)、塩基対22403649−22403792(SEQ ID NO:40)、塩基対32268843−32268943(SEQ ID NO:42)、塩基対44079235−44079322(SEQ ID NO: 43)、および塩基対37841284−37841411(SEQ ID NO:44)のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項32に記載のキット。
- 血液試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する手段をさらに含む、請求項32に記載のキット。
- 高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する手段が、メチル化DNAを免疫沈降させる抗体を含む、請求項38に記載のキット。
- 高メチル化DNAを増幅する手段をさらに含む、請求項38に記載のキット。
- 高メチル化DNAを増幅する手段が、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応(LM−PCR)を行うためのオリゴヌクレオチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項40に記載のキット。
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