JP2017514499A - 特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法 - Google Patents

特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、所定の細胞タイプに由来するＤＮＡの量を、その細胞に由来しないＤＮＡとの混合物中にそのＤＮＡを含むサンプルにおいて検出する方法に関する。この方法は、所定の細胞タイプに由来するＤＮＡの特定の領域における、混合したＤＮＡと比べて特異的なメチル化に基づく。この方法は、妊娠女性の生物学的液体からの胎児もしくは胎児の胎盤に由来する無細胞ＤＮＡの検出、または、個体の生物学的液体からの腫瘍細胞に由来する無細胞ＤＮＡの検出において特別な応用性を有する。したがって、この方法は、個体の子癇前症もしくは癌などの疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇を検出するための、および／または、双胎妊娠を含む胎児の染色体のトリソミーの検出等の（その後の）診断的、予測的および／または予知的方法を補助するための、診断的、予測的および／または予知的有用性を有する。また本発明は、この方法の実施に有用であるか関連する組成物、キット、コンピュータプログラム製品および他の態様に関する。

Description

本発明は、所定の細胞タイプに由来するＤＮＡの量を、その細胞に由来しないＤＮＡとの混合物中にそのＤＮＡを含むサンプルにおいて検出する方法に関する。この方法は、所定の細胞タイプに由来するＤＮＡの特定の領域における、混合したＤＮＡと比べて特異的なメチル化に基づく。この方法は、妊娠女性の体液からの胎児もしくは胎児の胎盤に由来する無細胞ＤＮＡの検出、または、個体の体液からの腫瘍細胞に由来する無細胞ＤＮＡの検出において特別な応用性を有する。したがって、この方法は、個体の子癇前症もしくは癌などの疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇を検出するための、および／または、双胎妊娠を含む胎児の染色体のトリソミーの検出等の（その後の）診断的、予測的および／または予知的方法を補助するための、診断的、予測的および／または予知的有用性を有する。また本発明は、この方法の実施に有用であるか関連する組成物、キット、コンピュータプログラム製品および他の態様に関する。
特に血漿または血清中でみられる、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、過去１０年間でかなり研究の対象となっている。早くも１９４８年には、ＭａｎｄｅｌとＭｅｔａｉｓによって記載された血流中の無細胞核酸の循環が最初に発見されたにもかかわらず（非特許文献１）、腫瘍が循環器系へＤＮＡを流すことを証明するのには１９９０年代半ばまでかかり（非特許文献２、非特許文献３）、母親の循環器系中の胎児由来のｃｆＤＮＡの発見には１９９７年までかかった（非特許文献４）。
循環ｃｆＤＮＡによって示される特徴の他の形態の中で、多くの研究は、様々なタイプの悪性腫瘍の患者の血漿／血清および他の体液中のメチル化循環ｃｆＤＮＡの存在と、正常対照である患者中のメチル化ＤＮＡの非存在を記載している（概説については、非特許文献５参照）。循環ｃｆＤＮＡの他の特徴が存在し、診断、予測または予知の研究のために重要であるが（例えば、配列の変異および僅かな複製／欠失）、そのメチル化に基づくエピジェネティックな特徴は、ますます、診断、リスク評価および癌患者の観察期間の治療モニタリングのための血清学的マーカーの重要な源になっている。
同様に、母体循環中に存在する胎児ｃｆＤＮＡの違いを用いることは、非侵襲的な出生前検査（ＮＩＰＴ）の開発のための主要な目的となる。胎児ｃｆＤＮＡは母体の末梢血中の胚細胞分解（非特許文献６）またはアポトーシス胎盤細胞（非特許文献７）に由来する。母体の血漿からの胎児ｃｆＤＮＡは、妊娠後、直ぐに除かれる（数時間以内）ことが立証されている（非特許文献８）。そうしないと、前回の妊娠からの胎児ｃｆＤＮＡの存在が、次の妊娠の正しい判断を妨げるので、この発見は非常に重要である。
組織特異的に特異的なメチル化領域の６０％が、胚細胞においてメチル化されており、一方、成体組織への胚組織の分化の間に、それらは脱メチル化されると考えられている（非特許文献９）。母体の血漿中の胎児ｃｆＤＮＡは、胎盤由来であることの証拠に基づいて、母体の末梢（全）血と胎盤ＤＮＡとの間のエピジェネティックな違いが、胎児に由来する母体の血漿中の低メチル化遺伝子配列（ｍａｓｐｉｎ／ＳＥＲＰＩＮＢ５）の検出に使用されている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。その後、さらなる多数の様々な胎児のメチル化に基づくエピジェネティックな分子マーカーが述べられ、それには、第２１染色体上のマーカーと第３染色体上のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）、およびＴ−ｂｏｘ ３（ＴＢＸ３）を含むその他のもの（非特許文献１６、特許文献１、特許文献２）が含まれる。
種々の方法論は、胎児ｃｆＤＮＡの分析に基づくＮＩＰＴのために存在する。例えば、母親がＲｈｅｓｕｓ Ｄ陰性である妊婦の母体循環に見られる胎児Ｒｈｅｓｕｓ Ｄだけでなく（非特許文献１７）、例えば、ＤＹＳ１４（非特許文献４）を用いた胎児の性別決定である。また、特に関連するのは、商業的に利用可能な検査として最も一般的な染色体異数性を検出することを第一の目的とした、母体の血漿から単離されたｃｆＤＮＡの次世代配列決定（ＮＧＳ）技術を用いたものである（例えば、ランダムな超並列配列決定法を用いたものである：ｗｗｗ．ｌｉｆｅｃｏｄｅｘｘ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｖｅｒｉｎａｔａ．ｃｏｍ）。他の技術には、信頼できる統計解析（例えば、ｗｗｗ．ａｒｉｏｓａｄｘ．ｃｏｍ、もしくは、ｗｗｗ．ｎａｔｅｒａ．ｃｏｍ）、多型解析またはデジタルＰＣＲ（概説については、非特許文献１８参照）を実施するために必要な配列タグの数を減らすために、配列決定の前に重要な特定のゲノム領域を増やすことを目的とするターゲット方法が含まれる。しかし、使用される特定の技術に関係なく、ＮＩＰＴの現在の応用は、胎児の遺伝子構造を決定する胎児ｃｆＤＮＡの定性的な検出に依存している。十分な胎児のＤＮＡを含んでいなかったり、母体の細胞のＤＮＡが混入しているサンプルの検査結果は、間違った結果を招く可能性があるため、このような方法が解析のジレンマにつながる。類似の問題は、循環器系からの腫瘍由来ｃｆＤＮＡの診断、予測または予知検査で発生する。検査結果の質は、しばしば、サンプルからの全ＤＮＡ中の腫瘍由来ｃｆＤＮＡが十分に存在することまたは十分な純度であることに依存する。
そのような細胞タイプに由来するＤＮＡ量の定量的な測定は、それ自体が診断、予測または予知検査の重要な部分を形成しうる。例えば、研究が、母体の循環中に放出される胎児ＤＮＡの量が妊娠の進行につれて増加することを立証しているのにもかかわらず（非特許文献１９）、異常な栄養膜浸潤から生じる子癇前症は、母体の循環中の胎児ｃｆＤＮＡレベルのさらなる上昇にも関係している。Ｌｏら（非特許文献２０）は、対照の妊娠被験者と比較して、症候性子癇前症女性の血漿中の胎児の循環ｃｆＤＮＡ濃度が５倍以上増加することを示し、さらなる研究は、上昇した胎児の血清ｃｆＤＮＡが早期発症子癇前症を発症するかどうかを調べ（非特許文献２１）、子癇前症のマーカーとしてのｃｆＤＮＡの可能性がますます研究されている（概説については、非特許文献２２参照）。循環ｃｆＤＮＡのレベルの上昇および／または特定の領域でのそのＤＮＡのメチル化レベルも、他の疾患と関連している。例えば、食道扁平上皮癌の患者では血清ｃｆＤＮＡの高度なメチル化がよく見られることが判明し、複数の遺伝子（ＲＡＲ−ｂｅｔａ，ＤＡＰＫ，ＣＤＨ１，ｐ１６およびＲＡＳＳＦ１Ａ）を組み合わせてメチル化を解析した場合に診断精度が向上した（非特許文献２３）。急性デングウイルス感染の患者（非特許文献２４）および急性プーマラハンタウイルス感染（非特許文献２５）において、循環ｃｆＤＮＡレベルの上昇が報告されており、高いｃｆＤＮＡレベルは、集中治療室の治療を行っている黄色ブドウ球菌菌血症の患者では致命的な結果が予測されることが報告されている（非特許文献２６）。
母体の循環系に存在する胎児ｃｆＤＮＡおよび腫瘍由来の循環ｃｆＤＮＡは、分解されることが知られている。例えば、母体血漿中のｃｆＤＮＡの特徴を調べる研究から、胎児のＤＮＡ断片のサイズは０．３ｋｂ未満であり、一方、母体のＤＮＡのサイズは１ｋｂを超えると推察されることが判明した（非特許文献２７）。補足研究では、胎児ＤＮＡの遊離は３つ以下のヌクレオソーム複合体のアポトーシスに起因することが立証され、胎児の断片のサイズの平均は２８６±２８ｂｐであり、胎児ｃｆＤＮＡ断片の最大サイズは２１９〜３１３ｂｐの範囲であることが示されている（非特許文献２８）。また別の研究では、胎児ＤＮＡと全ＤＮＡのサイズ分布の最も大きな違いは、胎児ＤＮＡは１６６ｂｐのサイズをピークに減少し、１４３ｂｐのピークの相対的な隆起を示すことが報告されており、後者は、ヌクレオソームから約１４６ｂｐのそのコア粒子への約２０ｂｐのリンカー断片のトリミングに対応しているようである（非特許文献２９）。
癌患者では、血漿中の循環ｃｆＤＮＡは、タンパク結合（ヌクレオソーム）ＤＮＡであり、主に肝臓で排出され、半減期が短い（１０〜１５分）（非特許文献３０）。癌患者の循環器中のｃｆＤＮＡの蓄積は、大量の細胞死、死細胞の非効率的な除去またはその両方の組み合わせによって引き起こされるＤＮＡの過剰放出の結果であろう（非特許文献３１）。腎臓のサポートを必要とする癌患者は循環ｃｆＤＮＡの値が高いが、腎排泄はその除去の主なメカニズムではないことに留意すべきである。循環ｃｆＤＮＡの血漿レベルは、慢性腎疾患、腹膜透析または血液透析において劇的には変わらないようである（非特許文献３２）。
ヌクレオソームは、非常に安定なタンパク−ＤＮＡ複合体であるが、これは静的なものではなく、ヌクレオソームスライディング及びＤＮＡ部位の曝露を含む多くの様々な構造の再構築を受けることが示されている。文脈によっては、ヌクレオソームは、転写因子の結合を阻害または促進できる。また、ヌクレオソームへのＤＮＡのパッケージングは、細胞周期の段階および特定のＤＮＡ領域によって異なる（非特許文献３３）。クロマチンが凝縮される程度は特定の転写状態に関係する。転写機構によりアクセス可能であるため、パッケージングされていないまたは緩んだクロマチンは、しっかりとパッケージングされたクロマチンに比べて転写活性が高い。クロマチン構造の再構成およびＤＮＡパッケージングの密度を変えることにより、遺伝子発現を調節することができる。したがって理論に縛られることなく、ｃｆＤＮＡの所定の領域のクロマチンパッキングの定性的および／または定量的なレベルは、その安定性およびそれ故に任意の時点で循環系中に検出される量に影響を与えるであろう。それに対応して、異なるＤＮＡ領域間のクロマチンパッキングのレベルの違い（例えば、各領域の転写状態の相違に起因する）は、ｃｆＤＮＡとして検出されたときに、これらの領域のそれぞれに由来するＤＮＡの相対量に影響を与えるであろう。特に２つの研究は、より詳しいキネティクスを検討し、循環系からのｃｆＤＮＡの迅速な除去を報告している（非特許文献３４、非特許文献８）。
特定の細胞タイプからのｃｆＤＮＡを検出し、定量する様々な先行技術の方法が述べられている。異常なｐ１６のメチル化の定量分析は、プローブに基づいたリアルタイム定量ＰＣＲを用いて説明されている（非特許文献３５）。同様に、血漿中に見出される胎盤マスピン遺伝子のメチル化の違いが記載されており、さらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて解析したメチル化サインが記載されている（非特許文献１２）。５〜４１週の妊娠期間の母体の血漿中の全ｃｆＤＮＡおよび男性胎児（のみ）のｃｆＤＮＡは、Ｙ染色体特異的マーカー（ＳＲＹ）を用いて正確かつ確実に定量された（非特許文献３６）。ＲＡＳＳＦ１Ａの高度なメチル化は、ＮＩＰＴの信頼性を向上させる汎用性のある胎児ＤＮＡマーカーとして提案されており、βアクチン遺伝子上の非特異的なメチル化領域と比較した二本鎖プローブをベースにしたリアルタイムＰＣＲで研究された（非特許文献３７）。複合的な定量方法が述べられている（非特許文献３８、特許文献１、特許文献２）：１３−ｐｌｅｘの競合的ＰＣＲ反応（ＴＢＸ３を含む５つの特異的メチル化領域（ＤＭＲ）、全ＤＮＡ定量のための異なる遺伝子上の３つの領域、染色体Ｙの定量のための３つ、および、制限酵素の対照のための２つ）から開始し、続いて一塩基伸長反応のためにその複合的な反応が行われ、その後、最終的に質量分析が、一つの対立遺伝子の質量の相違を定量して、各々を同定するために実行される。また、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法から始まる複合的なプロセスを使用して、複数のＤＭＲのサイバーグリーンベースの定量的ＰＣＲに基づいて、正確に胎児ｃｆＤＮＡを定量し、例えば第２１染色体のＤＭＲからの定量法を用いて出生前にトリソミーを診断できることが主張されている（非特許文献３９、特許文献３）；とはいえ、トリソミーを診断するためのこのような方法についての技術的な懸念が提起されている（非特許文献４０）。正常および腫瘍性乳房組織からのＤＮＡコピー数、並びに、ＲＡＳＳＦ１／ＲＮアーゼＰおよびＲＡＳＳＦ１／βアクチンの二重プローブベースの定量的ＰＣＲを使用した母体血漿中の全ｃｆＤＮＡおよび胎児ｃｆＤＮＡの絶対定量のためのハイスループットな液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が述べられている（非特許文献４１）。ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＳＲＹおよびＤＹＳ１４の別個のサイバーグリーン定量ＰＣＲ反応は、ＮＩＰＴの診断信頼性の改善を促進するＲＡＳＳｆ１Ａを検出するアッセイとして評価されている（非特許文献４２）。しかしながら、他のアッセイとしばしば比較して胎児ｃｆＤＮＡの定量的測定のための「ゴールドスタンダード」と一般的に考えられているが、依然として、早発性の子癇前症を発症した母体の血清中の胎児ｃｆＤＮＡのレベルが増加したかを判断するための、例えばＹｕおよび共同研究者によって使用されるような男性胎児のＹ染色体特異的遺伝子（例えばＳＦＹ）の定量法のままである（非特許文献４３）。
他の常染色体または性染色体に由来する基準配列と比べて、エピジェネティックバイオマーカーはエピジェネティックに同定された胎児ｃｆＤＮＡ中の第２１染色体由来の配列を定量することなどにより、トリソミー２１のＮＩＰＴに利用できることを他の者は示唆している（非特許文献４４）；ここで、比較する基準配列は、ＳＮＰ対立遺伝子−特異的領域であってもよく、基準染色体上の胎児特異的または胎盤特異的メチル化マーカーとの直接的比較によるものであってもよい（非特許文献４５、特許文献４、特許文献５、非特許文献１５、非特許文献４６）。
したがって、上記または１つ以上の観点から、腫瘍細胞、胎児細胞または胎盤細胞等の特定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を好ましくは定量的に検出する、特に例えば個体の循環系からｃｆＤＮＡを検出する改善された方法が必要である。特に、上記または１つ以上の観点から、そのようなＤＮＡ種における異常の存在、例えば胎児の染色体異数性等の染色体異常の存在を検出、指摘または診断する改善された方法もまた必要である。
国際公開第２０１０／０３３６３９号 国際公開第２０１１／０３４６３１号 国際公開第２０１２／０９２５９２号 国際公開第２００７／１３２１６６号 国際公開第２００７／１３２１６７号
Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｉｓ １９４８，ＣＲ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｐａｒｉｓ １４２：２４１ Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ３：６７ Ｖａｓｓｉｏｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ １９９４，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ８６：７７４ Ｌｏ ｅｔ ａｌ １９９７，Ｌａｎｃｅｔ ３５０：４８５ Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒ ２００３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ３：４４３ Ｌｏ ｅｔ ａｌ ２０００，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４６：１３０１ Ｓｍｉｄ ｅｔ ａｌ ２００６，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２６：７８５ Ｌｏ ｅｔ ａｌ １９９９，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６４：２１８ Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：５６０４ Ｍａｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：２８９ Ｆｉｏｒｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９：７２３ Ｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ ２００５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１４７５３ Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ ２００７，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７０：９４１ Ｏｌｄ ｅｔ ａｌ ２００７，Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ １５：２２ Ｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ ２００８，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５４：５００ Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６５：１０ Ｌｏ １９９８，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３３９：１７３４ Ｇｏ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ Ｕｐｄａｔｅ １７：３７２ Ｌｏ ｅｔ ａｌ １９９８，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６２：７６８ Ｌｏ ｅｔ ａｌ １９９９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４５：１８４ Ｙｕ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １４：７５７１ １９９９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４５：１８４ Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｐｌａｃｅｎｔａ ３２（Ｓｕｐｌ）：Ｓ１７ Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３０７ Ｈａ ｅｔ ａｌ ２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２５９６９ Ｏｕｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（２）：ｅ３１４５５ Ｆｏｒｓｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ ２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０；９（２）：ｅ８７７４１ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５０：８８ Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｎａｇｏｙａ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ７３：１２９ Ｌｏ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：６１ Ｅｌｓｈｉｍａｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １４：１８９２５ Ｚｅｅｒｌｅｄｅｒ ２００６，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ １０：１４２ Ｋｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ ２００８，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１３７：１３５ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２０１０，’ｉＧｅｎｅｔｉｃｓ’’．３ｒｄ ｅｄ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｐｅａｒｓｏｎ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ｐｐ ２４−２７ Ｇａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ １９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：１１５１ Ｌｏ ｅｔ ａｌ １９９９，Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ ５９：３８９９ Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ ２００５，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５１：２ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ ２００６，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２：１２ Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１０；Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：１０ Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｎａｔ Ｍｅｄ ４：５１０ Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｎａｔ Ｍｅｄ １８：１３２７ Ｈｉｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８３：８６０４ Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１２；ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７（９）：ｅ４５０７３ Ｙｕ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １４：７５７１ Ｏｌｄ ｅｔ ａｌ ２００７；ＲＢＭＯｎｌｉｎｅ １５：２２７ Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２００６；ＣｌｉｎＣｈｅｍ ５２：２１９４ Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ ２００９；ＡｍＪＰａｔｈ １７４：１６０９
したがって本発明の目的は、これらの問題または他の問題の１つ以上に対処する、代替の、改良された、より簡単で安価なおよび／または統合された手段または方法を提供することである。本発明の根本であるその目的は、本明細書のあらゆる箇所で開示または定義される構成要件によって、例えば添付の特許請求の範囲の構成要件によって解決される。
一般的に、そして簡単な説明を経て、本発明の主な態様は、以下のように記載することができる：
第１の態様では、本明細書においてさらに記載、定義、クレームまたは他の方法で開示され得るように、本発明は、個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている１つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
（ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
前記他の領域が前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する方法である。
第２の態様では、本明細書においてさらに記載、定義、クレームまたは他の方法で開示され得るように、本発明は、個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記１つ以上のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
（ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施される方法である。
さらなる態様では、本明細書においてさらに記載、定義、クレームまたは他の方法で開示され得るように、本発明は、妊娠女性が宿す胎児の染色体異数性を検出する方法であって、前記方法は下記工程を含む：
（Ａ）本発明の第１または第２の態様の方法を用いて、前記妊娠女性から採取したサンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第１のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第１のＤＮＡ種が染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第１のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｂ）本発明の第１または第２の態様の方法を用いて、前記サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第２のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第２のＤＮＡ種が基準染色体上に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第２のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の量の相対量、好ましくはその比を決定する工程；および、
（Ｄ）前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、胎児の染色体異数性の存在を示す工程。
別の態様では、また本発明は、個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を検出する方法であって、前記方法は下記工程を含み：
（ｉ）本発明の第１または第２の態様の方法を実施する工程であって、各検出工程が定量的検出を含む工程；および、
（ｉｉ）検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程；
前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、前記個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を示す方法である。
別の態様では、また本発明は、本明細書においてさらに記載、定義、クレームまたは他の方法で開示され得るように、本発明の方法の範囲内で、または、本発明の方法と関連して使用する組成物、キットおよびコンピュータプログラム製品に関する。
図１は、（ａ）本発明の第１の態様の方法で使用される特異的メチル化領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図である。（ｂ）本発明の第２の態様の方法で使用される特異的メチル化領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図である。 図２は、実施例１で使用された特異的メチル化領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図である。 図３は、性別が既知の胎児の双子症の研究のために、本発明の方法（実施例１）によって測定された胎児ｃｆＤＮＡの割合に対する雄性特異的ＤＮＡ（Ｙ染色体表現型）の量の相関を示す。 図４は、本発明の方法の改善された感度を、単一のＤＭＲの別々の反応を用いて検出された胎児ｃｆＤＮＡの割合と比較して示す。単一のＤＭＲとしてＲＡＳＳＦ１ＡまたはＴＢＸ３のみを使用するサンプル、または複合的にＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３（同じ標識を用いる）を使用するサンプルにおいて、胎児ｃｆＤＮＡの検出（実施例２）に必要とされるＰＣＲサイクル数（Ｃｐ）。 図５は、本発明のコンピュータプログラム製品によって実行される動作の概略図である。 図６は、実施例５で使用された特異的メチル化領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図であり、本発明の第１の態様の方法に基づく。 図７は、本発明の第２の態様の方法に基づく特異的メチル化領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図である。 図８は、妊娠女性から採取した１３８のｃｆＤＮＡサンプルについて、胎児第２１染色体の胎児第１２染色体に対する比率のｚスコア分析の結果を示す。第２１染色体トリソミーを有する胎児を宿す妊娠女性由来のそのサンプルが８つ含まれる。
本発明、特にその非限定的な態様および／または実施形態は、さらに詳細に以下のように説明することができる：
第１の態様では、本発明は、個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている１つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
（ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
前記他の領域が前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する方法である。
第２の態様では、本発明は、個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記１つ以上のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
（ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施される方法である。
本明細書に記載される用語は、別段の指示がない限り、通常その一般的な意味によって理解されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」が本明細書中で使用される場合、他の要素を排除するものではない。本発明の目的では、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の具体的な実施形態であると考えられる。本明細書の以下に、１つの群が特定の数以上の実施形態を含むと定義される場合、またこれは、これらの実施形態の全ておよび／または実施形態のみからなる群を開示するものと理解されるべきである。「および／または」が本明細書で使用される場合、２つの具体的な特徴または構成要素のそれぞれが、もう１つの具体的な特徴または構成要素を伴う場合と伴わない場合の具体的な開示であると解釈されるべきである。
例えば「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが個別に本明細書に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。本発明の文脈において、「約」および「およそ」という用語は、問題となっている特徴の技術的効果をさらに確実にするために、当業者が理解する精度の幅を示す。この用語は、典型的には、示された数値から±２０％、±１５％、±１０％、および、例えば±５％外れることを示す。当業者に理解されるように、所定の技術的効果の数値についての具体的なこのような誤差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然または生物学的な技術的効果は、人工的または工学的な技術的効果の場合よりも、一般的に、このような誤差が大きい場合がある。単数名詞に言及するときに不定冠詞または定冠詞が使用される場合、例えば、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、他に明記のない限り、その名詞の複数形を含む。
本発明の特定の実施形態では、個体はヒトまたは非ヒト動物であり、その非ヒト動物は、特定の実施形態では、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ニワトリ、マウスおよびラットからなる群より選択できる。より具体的な実施形態では、その個体は、本明細書に開示された疾患の１つ以上等の疾患を罹患する（または患う）または発症するリスクが高いと疑われる妊娠女性であるヒトまたはヒトの個体である。本発明のこの方法は、ヒトまたは動物の生体上で実施されることを意図しない。例えば、ｉｎ−ｖｉｔｒｏの方法で実施されることが意図される。
本発明のすべての態様において、所定の細胞タイプは、同じ個体の特定の器官または組織の細胞であってもよい。例えば、その細胞は個体の腫瘍細胞であってもよい。あるいは、その細胞は、異なる個体または生物に由来してもよい。例えば、個体が妊娠女性である場合、所定の細胞タイプは、その胎児の胎盤を含む胎児の細胞であってもよく、別の実施形態では、細胞タイプは、細菌または原生動物等の病原体でであってもよい。
本発明の特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種および／または前記の異なるメチル化のＤＮＡは無細胞ＤＮＡであり、この実施形態では特に循環無細胞ＤＮＡである。１つの特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種およびそれと混合される異なるメチル化のＤＮＡは、両者とも循環無細胞ＤＮＡである。用語「無細胞ＤＮＡ」（または「ｃｆＤＮＡ」）は当該分野で認識されており、個体の生物学的液体（例えば、血液または血液画分）中などの細胞外でみられるＤＮＡも意味する。また「循環（する）」は技術的に認識された用語であり、実体または物質（例えば、ｃｆＤＮＡ）が、血液系やリンパ系等の個体の循環系に存在し、検出もしくは同定され、または、単離されることを意味する。特に、ｃｆＤＮＡが「循環する」とき、それは細胞内には位置しないで、血液の血漿もしくは血清中に存在するか、またはリンパ液のリンパ液中に存在し得る。
用語「特異的メチル化領域」または「ＤＭＲ」は当業者に認識され、サンプル中で、前記ＤＮＡ種とそれが混合される他のＤＮＡとの間に存在する、特異的にメチル化された（例えば、ＣｐＧモチーフで）染色体ＤＮＡ内の領域をいうことも意図される。例えば、１つの実施形態では、本発明で使用されるＤＭＲは、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間で異なるメチル化がされるか、または、同じ個体の腫瘍由来ＤＮＡと非腫瘍由来ＤＮＡとの間で異なるメチル化がされる。本発明の特定の実施形態では、ＤＭＲは、胎児ＤＮＡにおいて高度にメチル化され、母体ＤＮＡにおいて低メチル化される。または、個体の腫瘍由来ＤＮＡにおいて高度にメチル化され、非腫瘍組織に由来するＤＮＡにおいて低メチル化される。すなわち、この領域では、前記ＤＮＡ種（例えば、胎児または腫瘍のｃｆＤＮＡ）が、他のＤＮＡ（例えば、母体または非腫瘍ＤＮＡ）と比較して、より大きな程度（すなわち、より多く）のメチル化を示す。例えば、他のＤＮＡの同じ部位と違って、前記ＤＮＡ種の所定のＤＭＲにおけるメチル化可能な部位では、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％またはそれ以上がメチル化される。
メチル化されていないＤＮＡと比較して、特異的に（例えば、選択的に）メチル化されたものを修飾をする試薬が本発明で使用される。例えば、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ）［亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）］を含む試薬を用いたＤＮＡの処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響を受けない。したがって、亜硫酸水素塩の処理は、各々のシトシン残基のメチル化状態によってＤＮＡ配列の特異的変化を導入するので、ＤＮＡセグメントのメチル化状態について、単一のヌクレオチドの分析情報をもたらす。変化した配列について様々な分析を行うことで、この単一のヌクレオチドの変化を識別することができるＰＣＲプライマーおよび／またはプローブの使用などの情報を得ることができる。
このような試薬の代わりとしては（またはそれに加えて）ＤＮＡのメチル化状態に感受性である制限酵素を含むことができる。その制限酵素による認識配列の切断は、その酵素の認識部位の特定の塩基が例えばメチル化などで修飾された場合、阻害されるか障害されうる。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、試薬には本明細書に開示されるメチル化感受性制限酵素等のメチル化感受性制限酵素を含むことができ、そのメチル化感受性制限酵素を２，３，４，５またはそれ以上含むそのような実施形態が含まれる。
工程（ａ）の前に、サンプルを処理して、その中に存在するＤＮＡを単離、濃縮および／または精製することができる。例えば、ｃｆＤＮＡ単離の方法またはキットを用いて血漿サンプルを処理し、細胞型に由来しない異なるメチル化がされたＤＮＡと前記ＤＮＡ種との混合物を含む次の（非天然）溶液を準備することができる。工程（ａ）の処理工程は、前記試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素）を含む別の溶液を、サンプルの混合ＤＮＡ（例えば、その混合ＤＮＡを含む非天然溶液）に添加する工程を含むことができる；および／または特定の状態を維持する（または変化させる）ことを含むことができる。特に、前記試薬が１つ以上のメチル化感受性制限酵素を含む場合、工程（ａ）の処理工程は、ＤＮＡと酵素を共に約３７℃で約５分〜３００分、例えば約３０分〜９０分または約６０分の間、インキュベートすることを含み、また酵素を失活させるために、この混合物をより高温（例えば約５０℃〜９０℃、例えば約８０℃）でインキュベートする工程を任意に含むこともできる。
特定の実施形態において、工程（ａ）の処理工程のために形成される組成物は、天然に存在しないものでもよい。例えば、成分が特定の塩である溶液（または緩衝液）；および／または（例えば、ヒトの）ｃｆＤＮＡと１つ以上の細菌由来の制限酵素（またはその非天然変異体）との混合物は、非天然の組成物または混合物であってもよい。さらに、本発明のいずれの方法も、（すなわち本発明の組成物が含むことができる）ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生した核酸分子、例えばＰＣＲ反応のＤＮＡ産物（例えば、「ＰＣＲ産物」）を産生することができる。
このｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された核酸分子の１つ以上は非天然である。なぜなら、これらは、少なくとも１つの検出可能な標識を含むヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを含み、この核酸分子は、その標識されたプライマーおよび／またはプローブのポリメラーゼ伸長（または部分的ヌクレアーゼ消化）によって生成さるので、この核酸分子の核酸配列が天然に存在する配列（またはその断片）を含む場合もあるが、提供されるこの核酸分子の少なくとも一部が検出可能な標識を含む。そのｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された核酸分子は、（少なくとも）それが含む非天然の検出可能な標識のために非天然である。
対照的に、本発明で使用される「他の領域」（「ＯＲ」）は、前記ＤＮＡ種とそれがサンプル中で混合される他のＤＮＡとの間では、（有意に）異なるメチル化はされない。例えば、使用される試薬の条件と性質の下では、混合されるＤＮＡ（例えば、母体ＤＮＡ）の他の領域と比較して、前記ＤＮＡ種（例えば、胎児ＤＮＡ）の他の領域では、その試薬による修飾の間に検出できる差異はない。この差異のないことは、他の領域がメチル化される部位を含まない場合、そのような部位が存在するときにはメチル化の程度に差がない場合、または他の領域に存在するメチル化される部位を認識しない試薬を使用することによって成されうる。したがって、本発明の別の実施形態では、工程（ｃ）で使用される少なくとも１つの他の領域では、前記ＤＮＡ種と他のＤＮＡとの間のメチル化の（有意な）差異は、前記試薬を用いて認識もしくは検出されない（または、できない）（または認識可能もしくは検出可能ではない）。
本発明で使用される（それほど特異的にメチル化されない）他の領域は、（特に、本発明の第１の態様に照らして）本発明で使用されるＤＭＲと重複すべきではなく、または、（特に、本発明の第２の態様に照らして）本発明で使用されるＤＭＲと重複しない場合がある。例えば、他の領域は、特に、本発明の第１の態様に照らして使用される場合、ＤＭＲから離れて、約１０ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐまたは１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂもしくは１０ｋｂを超えて、それよりも遠くに位置する。例えば、前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する（同じ遺伝子内に位置する実施形態を含む）。特に、本発明の第１の態様で使用される他の領域のゲノム位置は、通常、ゲノムの同じ部分、例えば、本明細書で使用される少なくとも１つのＤＭＲのゲノム位置の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する（同じ遺伝子内に位置する実施形態を含む）。
本発明者らは、特に本発明の第１の態様の状況で、他の領域がＤＭＲの１つと同じゲノム部分に位置している場合に、ＤＮＡ種の検出（および特に定量）が改善されたことを見出した（例えば、感度、精度および／または正確さに関して）。理論に拘束されるものではないが、このように同様に位置するＤＭＲおよび他の領域を用いると、特に本発明の第１の態様の状況で使用する場合、ゲノムを渡るクロマチン／ヌクレオソームパッキングの変化の影響、すなわち異なる領域のゲノムＤＮＡの安定性／劣化が緩和されると考えられる。例えば、他の領域（全ＤＮＡの検出）と比較したＤＭＲ（すなわち、ＤＮＡ種の検出）の安定性／劣化の違いは、より小さくなる。そして、ＤＭＲと他の領域との間のゲノムに渡る（大きく）異なるクロマチン／ヌクレオソームパッキングによりもたらされる量的な相違によって、（有意に）誤ることなく、相対的（および絶対的）に定量することができる。
本発明の１つの実施形態では、様々なＤＮＡ領域、すなわちＤＭＲおよび他の領域の検出は、簡易化された工程で行うことができる。同様に、本発明の１つの特徴は、様々なＤＮＡ領域、すなわちＤＭＲおよび他の領域の検出が、簡易化された工程で行われることである。例えば、サンプルのＤＮＡの単一のアリコートを使用して、そのＤＮＡ領域を単一の容器内で検出することができる。この特徴は、方法を簡略化することができ、（特に検出が量的である実施形態において）より効率的で正確な検出を提供することができる。用語「容器」は、当該技術分野で認識されており、当該方法に含まれるプロセスまたは手順、例えば本発明の方法の反応および/または検出プロセスまたは工程が行われる容器の実施形態（チューブ、マイクロタイター法のプレートのウェル、ナノウェル、キャピラリー反応容器等）を含む。他のそのような容器としては、使用する検出技術に応じて適切に、油／水エマルションの液滴、ナノ粒子またはハイブリダイゼーションチャンバを挙げることができる。本発明の第１の態様の特定の実施形態において使用される検出可能な標識は、各々のＤＭＲについて同じであってもよく、および／または、各々の他の領域について同じであってもよいが、ただし実質的に同時に検出する場合、他の領域に使用する標識は、ＤＭＲに使用する標識と異なる（すなわち、別々に検出できる）という条件となる。またあるいは、本発明の第１の態様の特定の実施形態において、使用される検出可能な標識は、各々のＤＭＲについて異なっていてもよく（例えば、同じではない）（または、本発明の第２の態様の特定の実施形態については、２つ以上のＤＭＲの各々のセットについて同じであってもよい）、および／または、各々の他の領域について異なっていてもよい（例えば、同じではない）。
第２の態様の方法で使用される検出可能な標識は、各々のＤＭＲについて同じであり、特定の実施形態では、他の領域に使用される標識がＤＭＲに使用される標識と異なる（すなわち、別々に検出できる）という条件において、各々の他の領域について同じである。また「同じ」である検出可能な標識には、構造的には異なるが、採用された検出技術によっては有意には区別されないために機能的に（本質的に）類似する標識を含むことができる。例えば、構造的に異なる蛍光色素は、それらの励起および発光スペクトルが（実質的もしくは本質的に）類似するか、または、同じ波長を用いて同時に励起および検出できる程度に重複する場合、「同じ」とみなすことができる。さらに、適切な標識（および検出方法）については、本明細書の別の箇所に記載する。好ましくは、ＤＭＲおよび他の領域の検出は、実質的に同時に行うことができる。例えば、同じ（反応／検出）容器内において、全てのこの領域（すなわち、前記ＤＮＡ種および全ＤＮＡ）は、例えば、容器もしくは反応物／混合物を次の容器、アッセイもしくは機器に移動させることなく、または、例えば、（いかなる／いずれかの）ＤＭＲもしくは他の領域の検出プロセスを別々に適合もしくは再調整することなく、互いに、約５ｓ、１ｓ、０．５ｓ、１００ｍｓ、１０ｍｓ、１ｍｓ、１００ｕｓ、１０ｕｓまたは１ｕｓ未満で検出することができる。
（少なくとも）２つの検出可能な標識（１つは前記ＤＭＲ用であり、もう１つは他の領域用である）の使用は、非天然の成分、プロセスおよび／または工程を利用する。例えば、特定の２つの標識と特定のＤＮＡ領域との組成物は（通常）天然には見られない。特に、プローブベースの定量ＰＣＲで使用される短いプローブは、天然ゲノムでみられるフラグメントであるＤＮＡ配列を含み得るが、１つ以上の標識（例えば、蛍光色素）に結合すると、非天然の特異的に標識されたフラグメントを形成する。
まとめると、本発明の特徴は、従来技術の方法に対して明白な優位性を提供する。これらには、メチル化（すなわち、検出すべきＤＮＡ種）の高感度な検出、および／または、検出された全ＤＮＡ量に照らした前記ＤＮＡ種の量の定量の精密なおよび／または改善された正確さを含むことができる：（１）本発明の第１の態様においては、場合により同一のアッセイ内で、混合ＤＮＡの同一のアリコートから、一緒に位置する他の領域を使用し、実質的に同時に２つ以上のＤＭＲを検出する；および／または（２）本発明の第２の態様においては、同一のアッセイ内で、混合ＤＮＡの同一のアリコートから、実質的に同時に２つ以上のＤＭＲを検出し、同じ場所に位置する他の領域を場合により使用する。
図示的説明として、本発明の第１の態様に使用される、ＤＭＲ、他の領域および検出可能な標識の一般的な配置の概略図を図１（ａ）に示す。（１）ＤＭＲ１のＤＮＡにおけるメチル化の存在は、他の領域（「ＯＲ１」）がＤＭＲ１のゲノムの同じ部分（例えば、約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）に位置することで検出される。（２）別のＤＭＲおよび／またはＯＲ（ＤＭＲ２および／またはＯＲ２、ならびに、ＤＭＲｎおよびＯＲｎまで）を任意に検出することができ、このような別のＤＭＲおよびＯＲの対は、互いにゲノムの同じ部分（例えば、約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）において、各々、一緒に位置しうる。場合により（３）ＤＮＡ中のメチル化の存在は、同一の検出可能な標識を用いて複数のＤＭＲで検出される、および／または、（４）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１および任意にＯＲ２またはＯＲｎまで）を用いて検出された全ＤＮＡ量は、ＤＭＲでメチル化の検出に用いられるものとは異なる検出可能な標識を用いて検出される（場合により、使用される検出可能な標識は全てのＯＲについて同一である）。
本発明の第１の態様の特定の実施形態では、工程（ｂ）における前記検出は、２つ以上の前記ＤＭＲの使用を含み、この２つ以上のＤＭＲは、前記ＤＭＲの各々と同じ検出可能な標識を用いて、または、前記ＤＭＲの各々と同じではない検出可能な標識を用いて、この工程で検出することができる。本発明の第１の態様の特徴（同様に位置するＤＭＲおよび他の領域）と、１つ以上の本発明の別の特徴との組み合わせ［例えば、少なくとも２つのＤＭＲの使用、および／または、工程（ｂ）における検出および工程（ｃ）における検出は、サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、および／または（ｘ）前記ＤＭＲの各々と同じ検出可能な標識、および／または、（ｙ）前記他の領域と異なる検出可能な標識を用いて行われる］は、各々、本発明の好ましい実施形態である。本発明におけるその特徴の組み合わせの使用は、効率の改善および／または結果の相乗的魅力の機会を提供する。例えば、この組み合わせの使用により、検出の改善された感度および／または精度および／または正確さ（例えば、定量的な量の検出）または前記ＤＮＡ種を得ることができる。改善の度合いは、各特徴の単独の利用と比較して相乗的であろう。例えば、組み合わせた特徴の使用によって得られる改善は、個別に各々の特徴を利用することによって得られる各々の改善の合計よりも大きい。
図示的説明として、本発明の第２の態様に使用されるＤＭＲ、他の領域および検出可能な標識の一般的な配置の概略図を図１（ｂ）に示す。（１）２つ以上のＤＭＲ、ＤＭＲ１およびＤＭＲ２（および任意にＤＭＲｎまで）におけるＤＮＡのメチル化の存在は、いずれの場合にも、同じ検出可能な標識を用いて検出される。（２）場合により、他の領域（「ＯＲ」）は、ゲノムの同じ部分（例えば、１つのＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）に位置する。（３）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１および任意にＯＲ２またはＯＲｎまで）を用いて検出された全ＤＮＡ量は、ＤＭＲでメチル化の検出に使用するものとは異なる検出可能な標識を用いて検出される（場合により、使用する検出可能な標識はすべてのＯＲで同じである）。（４）場合により、２つ以上のＤＭＲでメチル化が検出され、および／または、２つ以上のＯＲで全ＤＮＡ量が検出される。
特定の実施形態では、本発明のいずれかの方法の工程（ｂ）および／または工程（ｃ）の一部として行われる検出の前にまたはその一部として、前記ＤＭＲおよび／または前記他の領域をそれぞれ含む各ＤＮＡ領域は増幅される。ＤＮＡの増幅は、任意の適切な複製プロセスを用いて実施することができ、特にこの実施形態では、ＤＭＲおよび／または他の領域のそれぞれは、ＤＭＲおよび／または他の領域ごとに適切に設計されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。当業者は、例えば、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ９（Ｓｃｉ−Ｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／もしくはｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌｓ．ｃａ／ＰＣＲ．ｈｔｍから入手できるものなどのウェブベースのツール等のプライマー設計のアルゴリズムおよびプログラムを用いて、本発明の方法で使用するこのＰＣＲプライマーを容易に設計することができる。ＰＣＲの増幅を含む本発明のこれらの実施形態は、本明細書に記載のいずれか等のＰＣＲの実施に関連する特定の工程、または、特に下記工程をさらに含むことができる：（Ａ）二本鎖標的ＤＮＡ、そのＤＮＡの領域（本明細書に記載のＤＭＲまたは他の領域等）の増幅のために設計されたプライマー対（例えば、本明細書に開示されたプライマー対）を含む反応混合物を準備する工程（第１のプライマーは標的ＤＮＡの第１鎖の配列に相補的であり、第２のプライマーは、標的ＤＮＡの第２鎖の配列、Ｔａｑポリメラーゼならびにアデニン、チミン、シトシンおよびグアニンを含む複数の遊離ヌクレオチドに相補的である）；（Ｂ）標的ＤＮＡの鎖を互いに分離させるために、反応混合物を第１の規定温度で第１の規定時間加熱する工程；（Ｃ）第１および第２のプライマーが標的ＤＮＡの第１および第２の鎖上のそれらの相補的配列とハイブリダイズでき、Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長できる条件下で、反応混合物を第２の規定温度まで第２の規定時間冷却する工程；および（Ｄ）工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を２０回以上繰り返す工程。
別の実施形態では、本発明の方法の工程（ｂ）および／または工程（ｃ）で使用される検出可能な標識は、蛍光、タンパク質、低分子または放射性標識からなる群から独立して選択される。例えば、ＤＭＲには、同じ（同様のまたは重複する励起および／または発光スペクトルを有することを含む）蛍光標識を用いることができ、励起および／または発光スペクトル（特に、異なる発光スペクトル）を有する蛍光標識は、他の領域の検出に使用することができる。当業者は、本発明で使用する適切なその蛍光標識を、例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ Ｑｕａｓａｒ（商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）からなる群から選択することができる。別の実施形態では、検出可能な標識は、例えば特異的抗体およびＥＬＩＳＡ型検出方法を使用して検出できるタンパク質または小分子タグであってもよい。各々のＤＭＲについて同じタンパク質または小分子を使用すること、および、他の領域について異なるタンパク質または小分子を検出可能に使用することは、本発明で使用される検出可能な標識に利用することができる。異なる放射性標識は、それらの発光エネルギー、透過／励起特性および粒子タイプ（例えば、α粒子とβ粒子との区別による）によって区別することができる。他の検出可能な標識（例えば、核酸コード化タグ）も本発明で採用することができる。
本発明の特定の実施形態では、実施形態の方法の工程（ｂ）における検出は、例えばＤＭＲの１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いることによって、プローブベースの定量リアルタイムＰＣＲを含む。複数のＤＭＲのＰＣＲ増幅が同じ反応で行われる実施形態では、このＰＣＲは「多重」（または、２つのＤＭＲのみが増幅される場合は「二重」）と考えることができる。同様に、本発明の方法における工程（ｃ）の検出は、追加的または代替的に、例えば前記他の領域の１つに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いることによって、プローブベースの定量リアルタイムＰＣＲを含むことができる。本発明の第２の態様の特定の実施形態では、実施形態の方法の工程（ｂ）における検出は、例えばそれぞれが前記ＤＭＲの１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いることによって、プローブベースの定量リアルタイムＰＣＲを含む。
用語「プローブベースの」定量ＰＣＲは、当該技術分野で認識されており、様々な商標名（Ｒｏｃｈｅの「ＴａｑＭａｎ」ＰＣＲなど）で表示され販売される様々な態様を包含し、所定の単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）（例えば、ＤＭＲまたは他の領域）の検出に特異的な（例えば蛍光）レポータープローブを使用する。プローブベースの定量ＰＣＲは、レポーターとして二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標））を用いる定量ＰＣＲとは異なる。その二本鎖ＤＮＡ結合色素は、任意の二本鎖の単位複製配列に非特異的に結合するので、例えば、他の領域の検出（すなわち全ＤＮＡの検出）からＤＭＲ（すなわち前記ＤＮＡ種）の検出を区別するためには使用できないからである。当業者が理解するように、ＰＣＲの特異的単位複製配列は、単一のプローブを用いて、または単位複製配列に対する複数のプローブ（例えば、２つもしくは３つのプローブ）を用いて、検出することができる。特に、プローブベースの定量ＰＣＲは、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を検出する方法が組み込まれた増幅反応を含み、核酸ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性を用いて、アニールした標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）をハイブリダイズした二本鎖から切断し、検出するために標識されたオリゴヌクレオチド断片を放出する。このような方法およびプロセスは当該技術分野で公知であり、Ｇｅｌｆａｎｄら（米国特許第５８０４３７５号、欧州特許第０５４３９４２号および関連ファミリー）および／またはＬｉｖａｋら（米国特許第６２５８５６９号、欧州特許第０７９２３７４号および関連ファミリー）によってより一般的な言葉で説明されており、それは、プローブが、結合すると標識の検出可能性を消失させるクエンチャー分子と共に検出可能な標識を含む場合に、検出可能な標識が反応混合物（クエンチャーからの）中に放出される前に、５’から３’へのヌクレアーゼ（すなわち増幅）が働き、検出できることが必要であることを含む。さらに、「プローブベースの」定量ＰＣＲの方法は、Ｒｅｅｄら（米国特許第６７２７３５６号、欧州特許第１２３５９３８号および関連ファミリー）に記載されているオリゴヌクレオチド‐蛍光色体‐クエンチャー‐マイナー・グルーブバインダー複合体を含むプローブの使用によって、代替的または追加的に改善されうる。
このプローブベースの定量ＰＣＲは、信号の強度（例えば、経時の）を測定し、定量的に検出を測定するために使用するＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ等の機械を用いてアナログの方法で行うことができる。このような検出のためのシステムや方法は、Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら（米国特許第６９２９９０７号、欧州特許第０７０６６４９号および関連ファミリー）および／またはＨｉｇｕｃｈｉ（米国特許第５９９４０５６号、欧州特許第０５１２３３４号および関連ファミリー）により記載されている。あるいは、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、すなわち、検出されたＤＮＡの量を定量する方法として増幅事象の数を測定するために、複数の事象で実施されるＰＣＲ。例えば、ナノウェルまたは液滴（ｄｄＰＣＲ）中で実施されるｄＰＣＲ。
当業者は、ＤＭＲおよび／または他の領域のプローブベースの定量ＰＣＲ検出の用の適切なプライマーおよびプローブ（および適切な標識、例えば色素）を設計することができる。例えば、本明細書の別の箇所に記載されているプライマー／プローブ設計ソフトウェアを用いることによって設計することができる。公知のように、ＰＣＲプライマーは、この方法で使用されるメチル化特異的修飾試薬に特異的なメチル化部位と重複することができる（特に、試薬が、本明細書中に開示されるもの（またはその組み合わせ）などの１つ以上のメチル化感受性制限酵素を含む場合）。特にその実施形態では、所定のＤＭＲ用のＰＣＲプライマーの一方または他方は（または両方を考慮すると）、２つまたは３つのそのメチル化部位（例えば、各々がメチル化部位を含みうるメチル化感受性制限酵素のための２または３つの制限部位）と重複しうる。あるいはまたはさらに、ＤＭＲ用のプライマーは、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のそのメチル化部位（例えば、１０，１５，２０，２５または５０までのそのメチル化部位）に隣接するように設計することができる（特に、例えば、各々がメチル化部位を含みうる１０、１５、２０、２５または５０のメチル化感受性制限酵素等の１つ、２つ、３つまたはそれ以上のそのメチル化部位のための制限部位に隣接する。）
本発明の第２の態様の特定の実施形態では、他の領域のゲノム位置は、そのような態様で使用される場合、通常、ゲノムの同じ部分、例えば、本明細書で使用される少なくとも１つのＤＭＲのゲノム位置の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する（同じ遺伝子内の実施形態を含む）。この態様の特定の実施形態では、他の領域は、本発明の第２の態様で使用される場合、ＤＭＲと重複しない。本発明者らは、本発明の第２の態様において、他の領域がＤＭＲの１つと同じゲノム部分に位置している場合に、ＤＮＡ種の検出（および特に定量）が改善されたことを見出した（例えば、感度、精度および／または正確さに関して）。理論に拘束されるものではないが、本発明の第２の態様において使用される場合、このように同様に位置するＤＭＲおよび他の領域を用いると、ゲノムを渡るクロマチン／ヌクレオソームパッキングの変化の影響、すなわち異なる領域のゲノムＤＮＡの安定性／劣化が緩和されると考えられる。例えば、他の領域（全ＤＮＡの検出）と比較したＤＭＲ（すなわち、ＤＮＡ種の検出）の安定性／劣化の違いは、より小さくなる。そして、ＤＭＲと他の領域との間のゲノムに渡る（大きく）異なるクロマチン／ヌクレオソームパッキングによりもたらされる量的な相違によって、（有意に）誤ることなく、相対的（および絶対的）に定量することができる。この特徴（同様に位置するＤＭＲおよび他の領域）と、本発明の別の特徴との組み合わせ［少なくとも２つのＤＭＲの使用、および、工程（ｂ）における検出および工程（ｃ）における検出は、サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、および（ｘ）前記ＤＭＲの各々と同じ検出可能な標識、および、（ｙ）前記他の領域と異なる検出可能な標識を用いて行われる］は、本発明の好ましい実施形態である。本発明におけるその特徴の組み合わせの使用は、効率の改善および／または結果の相乗的魅力の機会を提供する。例えば、この組み合わせの使用により、検出の改善された感度および／または精度および／または正確さ（例えば、定量的な量の検出）または前記ＤＮＡ種を得ることができる。改善の度合いは、各特徴の単独の利用と比較して相乗的であろう。例えば、組み合わせた特徴の使用によって得られる改善は、個別に各々の特徴を利用することによって得られる各々の改善の合計よりも大きい。
本発明は、混合物中の全ＤＮＡ量の検出を提供するための１つの他の領域の使用を含む。しかし、本発明は、２つ以上の他の領域を使用する実施形態をも包含する。例えば、本発明は、工程（ｃ）における前記検出が、前記他の領域の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つまたは４つの他の領域）を使用することを含む、その実施形態を含む。本発明のすべての態様の特定の実施形態では、前記他の領域の数は、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの数と同じである。例えば、２つのＤＭＲが使用される場合、その実施形態では２つの他の領域が使用され、３つのＤＭＲが使用される場合、３つの他の領域が使用される（図１に示すように）。
本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明の第１の態様は、他の領域が通常ゲノムの同じ部分に位置する場合、例えば、本明細書で使用される少なくとも１つのＤＭＲのゲノム位置の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する場合を含む（同じ遺伝子内の実施形態を含む）。また、本明細書の他の箇所に記載されているように、本発明の第２の態様の特定の実施形態は、他の領域が通常ゲノムの同じ部分に位置する場合、例えば、本明細書で使用される少なくとも１つのＤＭＲのゲノム位置の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する場合を含む（同じ遺伝子内の実施形態を含む）。この第２の態様の特定の実施形態では、他の領域はＤＭＲと重複しない。したがって、本発明において複数の他の領域が使用される場合、その２つ以上の他の領域が２つ以上のＤＭＲと同様にゲノムに位置する実施形態が含まれる。例えば、前記他の領域の１つは、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置し（同じ遺伝子内の実施形態を含む）、前記他の領域の別の領域（例えば、第２の他の領域）は、それぞれ、別の前記（例えば、重複していない）ＤＭＲ（例えば、第２のＤＭＲ）の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する（同じ遺伝子内の実施形態を含む）。特定の実施形態では、さらなる他の領域は、ＤＭＲと重複してもよい。
本発明で使用される他の領域は、通常、ＤＭＲと同じゲノム部分に位置する場合、１つの前記ＤＭＲの上流または下流に、下記群から選択される距離内で位置することができる：約１６ｋｂ〜約２０ｂｐ，約１４ｋｂ〜約２０ｂｐ，約１２ｋｂ〜約２０ｂｐ，約１０ｋｂ〜約２０ｂｐ，約８ｋｂ〜約２０ｂｐ，約６ｋｂ〜約２０ｂｐ，約５ｋｂ〜約２０ｂｐ，約４ｋｂ〜約２０ｂｐ，約３ｋｂ〜約２ｂｐ，約１６ｋｂ〜約２０ｂｐ，約１ｋｂ〜約２０ｂｐ，約５００ｂｐ〜約２０ｂｐ，約２００ｂｐ〜約２０ｂｐ，約２０ｋｂ〜約１５ｋｂ，約１５ｋｂ〜約１０ｋｂ，約１２ｋｂ〜約８ｋｂ，約１０ｋｂ〜約８ｋｂ，約１１ｋｂ〜約７ｋｂ，約１１ｋｂ〜約１０ｋｂ，約９ｋｂ〜約８ｋｂ，約８ｋｂ〜約６ｋｂ，約６ｋｂ〜約４ｋｂ，約４ｋｂ〜約２ｋｂ，約２ｋｂ〜約５００ｂｐ，約１ｋｂ〜約１００ｂｐ，約５００ｂｐ〜約５０ｂｐ，約４００ｂｐ〜約２００ｂｐおよび約５００ｂｐ〜約１００ｂｐならびに約５００ｂｐ〜約３００ｂｐ。特定の実施形態では、通常、本発明で使用される他の領域のそれぞれは、異なった、使用されるＤＭＲに位置する。
複数の他の領域が使用される場合、本発明は、工程（ｃ）における検出が、前記他の領域の各々について同じ検出可能な標識を使用して行われる、および／または、それぞれが前記他の領域の１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いた多重リアルタイム定量ＰＣＲを含む、実施形態を包含する。
特定の実施形態では、全ての検出工程（すなわち、全てのＤＭＲおよび全ての他の領域に必要なもの）は、プローブベースの多重定量ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ）を使用して、効率的かつ効果的な方法で、１つのプロセス工程または反応で実施される。例えば、工程（ｃ）における検出および工程（ｂ）における検出は、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、互いに実質的に同時に、そして、多重リアルタイム定量ＰＣＲにより、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用して行われる。特にこの実施形態では、試薬は、本明細書に開示されるひとつ（またはその組み合わせ）等の１つ以上のメチル化感受性制限酵素を含む。
本発明は、１つ以上の制御手順等のさらなる手順を含むこともできる。例えば、本発明は、修飾工程の制御（例えば、制限酵素消化の制御）の役割を果たすＤＮＡ領域の第３のクラスの検出を対象とする１つ以上の工程を含むことができる。この実施形態は、例えば、その制御領域が増幅され、その領域のクラスに使用される第３の検出可能な標識を有する第３のプライマー／プローブによって検出されるプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲを用いて実施することもできる。
特定の関連性を有する本発明の一実施形態では、前記ＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来である。その実施形態では、サンプルは非侵襲的方法で得ることができる。例えば、前記ＤＮＡ種は、採血管などの従来法によって妊娠女性から得られた血液または血液画分（例えば、血漿または血清）のサンプルから検出された循環無細胞ＤＮＡである。この実施形態では、サンプルは、母体起源のＤＮＡ（例えば、前記他のＤＮＡ）を含むであろう。それは妊娠女性の細胞（すなわちゲノム）に由来する。
本発明は、ＤＭＲが胎児ＤＮＡでは高度にメチル化され、母体ＤＮＡでは低メチル化されている態様を含む。特定の実施形態では、そのＤＭＲは、本明細書に開示される遺伝子等の遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域またはエクソンに位置しうる。あるいは、ＤＭＲは、その遺伝子のイントロンまたはゲノムの非コード領域に位置しうる。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、そのゲノムおよび／または遺伝子は、ヒトゲノムまたは遺伝子である。特に本発明は、前記ＤＭＲが、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの前記試薬に特異的なメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａおよび／またはＴＢＸ３である、または、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮおよびＤＳＣＡＭからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子（例えば、ヒトゲノムまたは遺伝子）の一部に位置する実施形態を含む。また、前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、ＥＲＧ、ＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩ、国際公開第２０１１／０３４６３１号に開示されている母体ＤＮＡに比べて胎児ＤＮＡで高度にメチル化されているもの（例えば、国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜５９、９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および／または２６１）ならびに国際公開第２０１１／０９２５９２号に開示されているもの（例えば、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ ２０１４，ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７：１においてさらに研究されている国際公開第２０１１／０９２５９２号のＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３，ＥＰ４，ＥＰ５，ＥＰ６，ＥＰ７，ＥＰ８，ＥＰ９，ＥＰ１０，ＥＰ１１および／またはＥＰ１２（国際公開第２０１１／０９２５９２号の配列番号３３〜４４））からなる群から選択される領域および／または遺伝子に位置する実施形態も含まれる。表Ａは、国際公開第２０１１／０３４６３１号および国際公開第２０１１／０９２５９２号で使用される配列識別子の、本発明で使用される配列識別子への変換を示す。
Figure 2017514499
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本発明の別の態様において、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなるリストから選択されるヒト染色体上に位置し、好ましくは、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体に位置し、より好ましくは、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、第２１染色体に位置する。本発明の別のまたはさらなる実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲは、マスピン（および好ましくは、胎児とその母親の間で異なるメチル化がされていることが欧州特許第１７５１３０７号に記載されたマスピン（別名「ＳＥＲＰＩＮＢ５」）遺伝子の一部）、ＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、Ｆｅｍ１Ａ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と類似するもの、ＣＧＩ００９、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１またはｆ２９およびＣＧＩ１３（または、例えば、国際公開第２００７／１３２１６７号の表１またはＣｈｉｍら（２００８）に開示されている遺伝子および／または領域（母体の血液細胞ではメチル化されず、胎盤ではメチル化されている））からなるリストから選択される領域および／または領域に位置する。
ヒトの第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体およびＸ染色体は、染色体異数性（特に胎児の）に関連すると一般的に考えられており、その染色体の遺伝子または領域に位置する少なくとも１つのＤＭＲを用いることは、第２１染色体のトリソミー（ダウン症候群としても知られる）を含む染色体トリソミー等の染色体異数性に関連する、および／または、染色体異数性の（特に胎児の）診断のための、ＤＮＡ種の検出、同定または定量のための本発明の方法に特に好ましい。したがって、本発明の特定の実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、以下からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜３９、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および／または２６１；好ましくは以下からなるリストから選択される：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号３３〜３９、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および／または２６１；より好ましくは以下からなるリストから選択される：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１８４、１９１、２０１、２０２、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１４、２３５、２４１および２５８。本発明の別のまたはさらなる実施形態において、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ７、ＥＰ８、ＥＰ９、ＥＰ１０、ＥＰ１１およびＥＰ１２（国際公開第２０１１／０９２５９２号の配列番号３３〜４４）からなるリストから選択されるものを含む、国際公開第２０１１／０９２５９２号に開示された領域および／または遺伝子に位置する。本発明のさらに別のまたはさらなる実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つは、ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、ＥＲＧおよびＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩからなるリストから選択されるかＨＬＣＳである領域および／または遺伝子に位置する。
本発明の特定の実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、染色体異数性に関連しない（または、ほとんど関連しない）ヒト染色体上に位置する。その実施形態では、その染色体は、母体ＤＮＡと比較して、例えば、胎児の二倍体ＤＮＡ全ての推定値を反映するＤＮＡ種を検出、同定または定量できる「基準染色体」（二倍体）と考えることができる。その検出、同定または定量されたＤＮＡ種（その「基準」染色体由来の）のパラメータ（例えば、相対量または絶対量）は、検出、同定、または定量された染色体異数性（例えば、トリソミー）に関連する染色体またはその一部に由来するＤＮＡ種の対応するパラメータと比較することができる；その比較されたパラメーターの有意差（例えば、１つの染色体量がもう１つの染色体量に対して過剰である）が、染色体異数性が存在する可能性があることを示す。したがって、本発明の特定の実施形態において、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、第１染色体〜第１２染色体、第１４染色体〜第１７染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２２染色体および第２３染色体からなるリストから選択されるヒト染色体上に位置し、好ましくは前記ＤＭＲは、ヒトの第２染色体、第３染色体または第１２染色体上に位置する。本発明の別のまたはさらなる実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲは、以下からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：ＣＤ４８、ＦＡＩＭ３、ＡＲＨＧＡＰ２５、ＳＥＬＰＬＧ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２およびＰＹＣＡＲＤ。本発明の代替的または追加的な別の実施形態では、前記ＤＭＲの少なくとも１つは、以下からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮ；および／または前記ＤＭＲは、以下からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号４０〜５９および９０〜１６３。
２つのＤＭＲが使用される場合、本発明の全ての態様の特定の実施形態では、これらは、ゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分に位置しない。例えば、このＤＭＲは、別々の染色体上に位置してもよいし、約２０ｋｂ以上または約１５ｋｂ、１０ｋｂ、８ｋｂ、６ｋｂ、４ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐもしくは２００ｂｐ以上離れていてもよい。あるいは、２つ（またはそれ以上）のＤＭＲが本発明で使用される場合、特定の実施形態において、それらは同じ領域または遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）に位置することができ、さらに、互いに重複することができることが想定される。
本発明の特定の実施形態では、複数のＤＮＡ種が前記サンプル中で検出される。例えば、本発明の方法を用いた前記サンプル中では、２種（またはそれ以上）のＤＮＡ種を検出（同定または定量）することができる。各々のＤＮＡ種は、別々の染色体上に存在（または由来）していてもよい。例えば、染色体異数性に関連する染色体（例えば、ヒトの第２１染色体，第１８染色体，第１３染色体またはＸ染色体）上の（または、由来の）第１のＤＮＡ種や、基準染色体（例えば、ヒトの第１染色体〜第１２染色体、第１４染色体〜第１７染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２２染色体または第２３染色体）上の（または、由来の）第２のＤＮＡ種である。染色体異数性に関連する染色体上の（または、由来の）第１のＤＮＡ種、および、基準染色体上の（または、由来の）第２のＤＮＡ種の検出、同定または定量は、この検出、同定または定量のそれぞれによる各パラメータ（例えば、相対量または絶対量）の（例えば、相対量または比率による）比較を可能とするので、したがって、特に胎児における染色体異数性の検出、同定または診断に有用である。
本発明の特定の実施形態では、２つの前記ＤＭＲが使用される場合（または２つ以上のＤＭＲが使用される場合）、それぞれが、ＲＡＳＳＦ１Ａおよび／またはＴＢＸ３であるゲノムおよび／または遺伝子の一部（好ましくはヒトの）に位置するか、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮならびにＤＳＣＡＭからなる群より選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部（好ましくはヒトの）に位置する；および／または前記ＤＭＲの少なくとも１つは、ＲＡＳＳＦ１Ａ（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＧ＿０２３２７０．１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）、第３染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号：１３）の約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間、もしくは、ＴＢＸ３（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＧ＿００８３１５．１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔ−ｂｏｘ ３（ＴＢＸ３）、第１２染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号：１４）の約１，６６０ｂｐおよび２，４００ｂｐの位置の間に位置するか、または、ＤＳＣＡＭ（ダウン症候群細胞接着分子；ＮＣＢＩ基準配列Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ第２１染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＮＣ＿００００２１．９ ＧＩ：５６８８１５５７７、領域４０，０１０，９９９〜４０，８４７，１１３；配列番号２００）の約４０，８４１，５８４および４０，８４２，０２０の位置の間に位置する。さらに特定の実施形態では、２つ（またはそれ以上）のＤＭＲが使用され、第１のＤＭＲはＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置するものを含み、第２のＤＭＲはＴＢＸ３の約１，６６０ｂｐと２，４００ｂｐの位置の間に位置するものを含む。
特定の実施形態では、ＤＭＲは、ＲＡＳＳＦ１Ａの約４，９００ｂｐ〜５，５００ｂｐ、５，０００ｂｐ〜５，４００ｂｐまたは５，１００ｂｐ〜５，３００ｂｐの位置の間のＲＡＳＳＦ１Ａに位置し、および／または、ＴＢＸ３（例えば、配列番号２０３）の約１，８００ｂｐ〜２，２６０ｂｐ、１，９２０ｂｐ〜２，１６０ｂｐまたは１，９２０ｂｐ〜２，０８０ｂｐの位置の間のＴＢＸ３に位置する；および／または、配列番号２０１等のＤＳＣＡＭ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 第２１染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＮＣ＿００００２１．９ ＧＩ：５６８８１５５７７の領域に関連する）の約４０，８４１，６００ｂｐ〜４０，８４１，９００ｂｐ、４０，８４１，６２５ｂｐ〜４０，８４１，８４０ｂｐまたは４０，８４１，６５０ｂｐ〜４０，８４１，７９０ｂｐの位置の間のＤＳＣＡＭに位置する。
本発明の一実施形態で使用されるＤＭＲおよび他の領域（「ＯＲ」）の一般的な配置を図２に図式的に示す：（１ａ）ＲＡＳＳ１Ａゲノム配列（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０００００３．１２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 第３染色体、ＧＲＣｈ３８ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）の５０，３４０，６７２ｂｐ〜５０，３４０，７８４ｂｐの位置の間に位置するＤＭＲ１と、５０，３３１，６０４ｂｐ〜５０，３３１，７０２ｂｐの位置の間に位置するＯＲ１と共に（ＤＭＲ１とＯＲ１は８，９６９ｂｐ離れている）、ＤＭＲ１はＲＡＳＳＦ１Ａのエクソン２内に存在し、ＯＲ１はＲＡＳＳＦ１Ａのエクソン４内に位置する。（１ｂ）ＴＢＸ３ゲノム配列（ＮＣＢＩ 基準配列：ＮＣ＿００００１２．１２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 第１２染色体、ＧＲＣｈ３８ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）の１１４，６８７，０９５ｂｐ〜１１４，６８７，１８９ｂｐの位置の間に位置するＤＭＲ２と、１１４，６７６，３８４ｂｐ〜１１４，６７６，４５４ｂｐの位置の間に位置するＯＲ２と共に（ＤＭＲ２とＯＲ２は１０，６４０ｂｐ離れている）、ＤＭＲ２はＴＢＸ３のプロモーター領域に存在する。（２）２つのＤＭＲにおけるＤＮＡのメチル化は、それぞれのフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）ＰＣＲプライマーおよび各々が同じ標識（Ｐ＊）で標識された領域特異的プローブを使用したプローブベースの定量ＰＣＲを用いて検出される。（３）全ＤＮＡは、各々のフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）ＰＣＲプライマーおよび領域特異的プローブを用いたプローブベースの定量的ＰＣＲを用いて２つのＯＲで検出される。各プローブは、２つのＤＭＲに使用する標識（Ｐ＊＊）とは異なるＯＲ用の同じラベルで標識される。プライマーおよびプローブの配列ならびにプローブ標識の詳細を表１に示す。
本発明の別の実施形態で使用されるＤＭＲおよび他の領域（「ＯＲ」）の一般的な配置を図６に図式的に示す。（１）ＤＳＣＡＭゲノム配列（ダウン症候群細胞接着分子；ＮＣＢＩ基準配列Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 第２１染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２、Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＮＣ＿００００２１．９ ＧＩ：５６８８１５５７７，領域４００１０９９９〜４０８４７１１３；配列番号２００）の４０，８４１，６９１ｂｐ〜４０，８４１，７８１ｂｐの位置の間に位置するＤＭＲ１と、４０，８４１，２８６ｂｐ〜４０，８４１，７７２ｂｐの位置の間に位置するＯＲ１と共に（ＤＭＲ１とＯＲ１は約３００ｂｐ〜５００ｂｐ離れている）、ＤＭＲ１は例えばＤＳＣＡＭに存在し、ＯＲ１は例えばＤＳＣＡＭに位置する。（１’）ＴＢＸ３ゲノム配列（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿００００１２．１２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ第１２染色体，ＧＲＣｈ３８ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）の１１４，６８７，０９３ｂｐ〜１１４，６８７，１９１ｂｐの位置の間に位置するＤＭＲ１’と、１１４，６７６，３８４ｂｐ〜１１４，６７６，４５４の位置の間に位置するＯＲ１’と共に（ＤＭＲ１’とＯＲ１’は約１０，６００ｂｐ〜１０，８１０ｂｐ離れている）、ＤＭＲ１’はＴＢＸ３に存在し、ＯＲ１’はＴＢＸ３に位置する。
本発明の特定の実施形態は、その方法、組成物、キットおよび／またはコンピュータプログラム製品に関して、前述のＤＭＲ、ＯＲ、プライマーおよび／またはプローブの配列、特に表１または表８に記載されたもの１つ以上の使用を含む。その特定の実施形態では、所定のプローブは、表１または表８に記載の配列および表１または表８に記載の標識とクエンチャーの対（場合により、マイナー結合グルーブ部を有する）のいずれか１つを含む。特にプローブは、そのプローブについて表１または表８に示すように、配列および標識とクエンチャーの対（場合により、マイナー結合グルーブ部を有する）の組み合わせを含むことができる。本発明の別の実施形態は、特に、その方法、組成物、キットおよび／またはコンピュータプログラム製品に関して、２つ以上の（例えば、全ての）前述のＤＭＲ、ＯＲ、プライマーおよび／またはプローブの配列の特定の組合せの使用を含み、特に、表１に示すプライマー／プローブの組み合わせ、または、表８に示すプライマー／プローブの組み合わせの使用を含む。
用語「メチル化部位」は、当該技術分野で認識されており、例えば、好ましくは例えば本明細書の他の場所に開示されているメチル化感受性制限酵素によって認識される短いヌクレオチド配列（例えば、４，６，８，１０または１２ｂｐの長さのもの）内のＣｐＧモチーフを包含する意味を有する。
同様に、特に本発明の第１の態様に関して、他の領域は、ゲノムの特定の部分および／または遺伝子に位置するとき、遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域またはエキソンに位置することができ、あるいは、その遺伝子のイントロンもしくはゲノムの非コード領域に位置することができる。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、そのゲノムおよび／または遺伝子は、ヒトのゲノムまたは遺伝子である。特定の実施形態では、本発明で使用される他の領域が、１つ以上のＤＭＲを特徴とするゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分（好ましくは、本発明で使用するＤＭＲと重複しない部分）に位置する場合、ＲＡＳＳＦ１Ａおよび／またはＴＢＸ３である遺伝子（例えば、ヒトおよび／または特に前記ＤＮＡ種が胎児ｃｆＤＮＡである場合）またはＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮならびにＤＳＣＡＭからなる群から選択される遺伝子等のゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置する。ＤＭＲと一緒に位置していない場合（例えば、第２の領域または複数の他の領域が使用される場合）、当該他の領域は、特定の実施形態では、（例えば、ヒトの）ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、βアクチン、ＡＬＢ、ＡＰＯＥまたはＲＮＡＳＥＰ）に位置する。同様に、特に本発明の第２の態様に関しては、他の領域は、ゲノムの特定の部分および／または遺伝子に位置することができ、また遺伝子のプロモーター、エンハンサー領域またはエクソンに位置することができ、あるいは、その遺伝子のイントロン内またはゲノムの非コード領域に位置することができる。本発明の全ての態様の特定の実施形態において、そのゲノムおよび／または遺伝子は、ヒトゲノムまたは遺伝子である。特定の実施形態では、本発明で使用される他の領域は、（例えば、ヒトの）ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、βアクチン、ＡＬＢ、ＡＰＯＥまたはＲＮＡＳＥＰ）に位置する。あるいは（および特に前記ＤＮＡ種が胎児ｃｆＤＮＡである場合）、前記他の領域は、１つ以上のＤＭＲ（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４もしくはＳＰＮまたはＤＳＣＡＭ）を特徴とするゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分に位置することができ、また好ましくは本発明で使用されるＤＭＲと重複しない。
本発明の全ての態様の特定の実施形態において、前記他の領域は、前記試薬に特異的なメチル化部位を有さないゲノムの一部を含み、また前記他の領域は（例えば、ヒトの）遺伝子ＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＴＢＸ３（例えば、配列番号：それぞれ１３および１４）またはＤＳＣＡＭ（配列番号：２００）に位置する。また、２つ以上の前記他の領域が検出工程（ｃ）で使用され、第１の他の領域がそのＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置し、第２の他の領域がそのＴＢＸ３の約１２，４００ｂｐ〜１３，０００ｂｐの位置の間に位置する、さらなる特定の実施形態を含む。特定の実施形態では、他の領域は、そのＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２３０ｂｐ〜１４，３４０ｂｐ、１４，２３０ｂｐ〜１４，３３０ｂｐ、１４，２３０ｂｐ〜１４，３２０ｂｐまたは１４，２３０ｂｐ〜１４，３１０ｂｐの位置の間のＲＡＳＳＦ１Ａに位置し；および／またはそのＴＢＸ３（例えば、配列番号２０４）の約１２，４００ｂｐ〜１２，９４０ｂｐ、１２，７００ｂｐ〜１２，８５０ｂｐまたは１２，７１０ｂｐ〜１２，７９０ｂｐの位置の間のＴＢＸ３に位置し；および／または例えば、配列番号２０２のＤＳＣＡＭ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ第２１染色体、ＧＲＣｈ３８．ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＮＣ＿００００２１．９ ＧＩ：５６８８１５５７７の領域に関連する）の約４０，８４１，１５０ｂｐ〜４０，８４１，５２５ｂｐ、４０，８４１，２００ｂｐ〜４０，８４１，４７５ｂｐまたは４０，８４１，２５０ｂｐ〜４０，８４１，４２５ｂｐの位置の間のＤＳＣＡＭに位置する。あるいは、他の領域は、そのＲＡＳＳＦ１Ａの約１３，７９０ｂｐ〜１３，８８０ｂｐもしくは１４，４９０ｂｐ〜１４，６００ｂｐの位置の間、または、そのＴＢＸ３の約８，０４０ｂｐ〜８，１８０ｂｐもしくは６，２３０ｂｐ〜６，３５０ｂｐの位置の間等のエクソンに位置することができる。または他の領域は、そのＲＡＳＳＦ１Ａの約１０，５００ｂｐ〜１１，９０ｂｐの位置の間、もしくは、そのＴＢＸ３の約１０，０００ｂｐ〜１１，０００ｂｐの位置の間等のイントロンに位置することができる。
妊娠女性の循環系（例えば、血漿中）に存在する胎児ｃｆＤＮＡ（および／または全ｃｆＤＮＡ）のレベルは、早発性子癇前症、軽度および／または重度の子癇前症等の１つ以上の子癇前症のタイプのマーカーであるという強力な証拠が存在する（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｐｌａｃｅｎｔａ ３２（Ｓｕｐｌ）：Ｓ１７参照）。本発明は、妊娠女性の血漿中に存在する胎児ｃｆＤＮＡの、効率の高い、効果的な、精度が高いおよび／または変動性の低い検出／定量における特定の有用性を示し、また本発明はその中の特定の有用性を有する。したがって、本発明の特定の実施形態では、個体は妊娠女性であり、妊娠に関連する疾患の罹患または発症に感受性がある；特に前記妊娠関連の疾患は子癇前症である。また本明細書中で使用される、疾患に「感受性がある（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ）」個体は、疾患の罹患または発症の「疑いがある（ｉｓ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｏ）」または「感受性のリスクがあるとみられる（ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｔ ｒｉｓｋ ｏｆ ｂｅｉｎｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ）」と記載することもできる。また特定の実施形態では、本発明は、疾患の罹患もしくは発症のリスクまたは罹患もしくは発症の感受性について個体をスクリーニングおよび／または診断するために使用される。
別の実施形態では、個体は妊娠女性であり、早期陣痛、子宮内発育遅延およびバニシングツインからなる群から選択される妊娠関連の疾患に罹患または発症しやすい（または、しやすいリスクがあると考えられる）。特に、本発明者らは、本発明の方法で測定したｃｆＤＮＡレベルと、大規模並列配列決定法で決定したＹ染色体配列の数で測定したｃｆＤＮＡレベルとの間の相違が、それまでは単胎妊娠と思われた（男女の）双胎妊娠におけるバニシングツインの１つ以上の症例の同定、および／または、その（男女の）双胎妊娠のどちらかの相対的な発達および健康の観察に有用であったという本願発明の感度に驚いた。また本発明は、ｃｆＤＮＡから決定したＹ染色体配列の数（例えば、並列配列決定法を用いる）と比較した胎児ｃｆＤＮＡの相対値を考慮することにより、双胎妊娠の性別判定に利用することもできる。これらの点において、母体血液中のランダムなｃｆＤＮＡで大規模並列配列決定法を用いる手法は、特定のＹ染色体の短い配列が他の染色体と相同性を有するために、すべての妊娠女性において、通常、常に「Ｙ染色体」配列の非常に低い頻度（例えば、全配列の約０．００３％〜０．００４％または全配列の約０．００１５％〜０．０１％もしくは０．００２％〜０．００５％）をカウントしていることに留意する必要がある。したがって、「Ｙ染色体」配列数の約０．００５％または約０．００３％、０．００４％、０．００６％もしくは０．００７％の間のカットオフ値を雌性サンプルに用いることができる。
本明細書の他の箇所に記載されるように、特定のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在および量が、妊娠に関連しない特定の疾患の指標または兆候であるという証拠が増加している。したがって、本発明の別の特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種は、その疾患に関連する細胞タイプ由来であり、特にその実施形態では、前記ＤＮＡ種は循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルは血漿または血清等の血液画分である。例えば、その疾患は、腫瘍または癌等の細胞増殖性障害であってもよい。特定の実施形態では、その疾患は、肝臓、肺、乳房、結腸、食道、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、脳、骨髄および血液からなるリストから選択される組織の腫瘍または癌である。および／または、前記ＤＮＡ種は、腫瘍細胞に由来してもよい。特に、腫瘍は、肝臓、肺、乳房、結腸、食道、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、脳、骨髄および血液からなる群から選択される組織の癌腫または癌である。
腫瘍または癌である疾患で使用される場合、本発明は、前記ＤＭＲが前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含む実施形態を含み、また前記ＤＭＲの少なくとも１つは、下記からなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子（特に、そのゲノムおよび／または遺伝子がヒトのゲノムまたは遺伝子である場合）の部分に位置する：腫瘍抑制遺伝子、ｐ１６、ＳＥＰＴ９、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＣ、ＨＳＤ１７Ｂ４およびＨ１Ｃ１。特に、前記ＤＭＲの１つ、または２つ以上のＤＭＲは、ＲＡＳＳＦ１Ａ（例えば、配列番号１３）に位置してもよい。例えば、そのＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐ〜５，６００ｂｐの位置の間に位置し；および／または、前記他の領域は、そのＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置する。この実施形態で使用するＲＡＳＳＦ１Ａ内のＤＭＲおよび／または他の領域の別の特定の位置は、本明細書の別の箇所に開示されている。さらに当業者は、別の遺伝子のゲノムの他の部分に位置する別のＤＭＲおよび／または他の領域は、関連する科学文献で確認できることを認識するであろう（例えば、検討のためにＥｌｓｈｉｍａｌｉ ２０１３参照）。特に、疾患が腫瘍または癌である状況で使用する場合、本発明は、少なくとも１つ以上の（さらなる）他の領域（好ましくは２つ以上）が（例えばヒトの）ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、βアクチン、ＡＬＢ、ＡＰＯＥまたはＲＮＡＳＥＰ）に位置する実施形態を含む。あるいは、その状況のために、前記（さらなる）他の領域は、１つ以上のＤＭＲ（例えば、ｐ１６、ＳＥＰＴ９、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＣ、ＨＳＤ１７Ｂ４およびＨ１Ｃ１）を特徴とするゲノムおよび／または遺伝子の同じ部分に位置することができる。
本発明のさらに別の特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種は、下記からなる群から選択される疾患と関連する細胞タイプに由来する：感染／感染性疾患、消耗性疾患、変性疾患、（自己）免疫不全症、腎疾患、肝疾患、炎症性疾患、急性毒性、慢性毒性、心筋梗塞およびこれらの任意の組み合わせ（例えば、敗血症）および／または細胞増殖性疾患との組み合わせ；特にこれらの実施形態では、前記ＤＮＡ種は循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルは血漿または血清等の血液画分である。例えば、疾患は、細菌性、ウイルス性または原生動物病原体によって引き起こされる感染／感染症であってもよく、含まれる病原体は下記からなる群から選択される：レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶまたはＶＳＶ）、デングウイルス、マイコバクテリア（例えば、結核菌）およびハンタウイルス。特定の実施形態では、疾患は敗血症であり、および／または、腎臓疾患を除外する。
本発明の全ての態様において、サンプルが組織サンプルまたは体液のサンプルである実施形態が存在する。特に、サンプルは、全血または血液画分（例えば、血漿または血清）である。代替的な実施形態では、サンプルは、尿、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択される生物学的液体である。さらに特定の実施形態では、サンプルは個体由来の血漿または血清サンプルであり、または、個体由来の尿である。別の実施形態では、サンプルは、ほとんど（または本質的に）細胞を含まず、および／または、全血および／または精液サンプルではない。特定の実施形態では、個体が女性の場合はサンプルは精液ではなく、個体が男性の場合はサンプルは膣洗浄液ではない。
本発明の全ての態様において、メチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬は、亜硫酸水素塩および／またはメチル化ＤＮＡと比較して非メチル化ＤＮＡを選択的に消化する薬剤（例えば、非メチル化ＤＮＡを消化できるがメチル化ＤＮＡを消化できない薬剤）を含むことができる。特定の実施形態では、試薬試薬は下記を含む：少なくとも１つのメチル化感受性酵素；少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素；および／またはＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される薬剤。特定の実施形態では、前記試薬は、ＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩからなる群から選択される試薬である。
関連する実施形態では、その試薬は、本明細書に開示される試薬の２つ以上を含むことができる。例えば、１，２，３、４、５またはそれ以上（例えば、７，８または１０まで）のメチル化感受性制限酵素を含むことができ、本質的に２または３の、ＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩからなる群から選択されるメチル化感受性制限酵素からなる試薬を含む。
重亜硫酸塩またはメチル化感受性制限酵素を使用して特異的メチル化を研究することは当業者に周知であり、標準的なテキストの教示や、Ｐｏｏｎら（２００２）、Ｎｙｇｒｅｎら（２０１０）またはＹｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（２００６，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３４：ｅ１９）等の開示された方法の応用を適用することができる。実例として、本発明者らは、メチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬としてメチル化感受性制限酵素の使用する実施例を本明細書に示す。試薬として重亜硫酸塩を使用するさらなる実例として、重亜硫酸塩修飾ＤＮＡメチル化部位が、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、重亜硫酸塩修飾配列に選択的に結合するプライマーおよび／またはプローブを使用する）を用いて、および／または、続いてその重亜硫酸塩修飾がされた認識部位に制限酵素を使用して検出できることは、当業者には明らかである。メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）は、Ｈｅｒｍａｎら（米国特許第６２００７５６号、欧州特許第０９５４６０８号および関連ファミリー）に記載されている。また、プローブベースのＰＣＲ（「ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ」として知られる）を使用するＭＳＰのさらなる開発品は、Ｌａｉｒｄら（米国特許第６３３１３９３号、欧州特許第１１８５６９５号および関連ファミリー）に記載されている。
本発明の全ての態様の特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種（および／または前記全ＤＮＡ）の定量的な量は、検出および／または測定される。したがって、その実施形態では、前記検出工程の１つ以上（例えば、各々）が定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量は、前記サンプル中に存在する全ＤＮＡに対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される。
全ＤＮＡの絶対量が既知の場合、それに応じて、相対濃度からＤＮＡ種の絶対量（例えば、μｇ／ｍＬまたはＥｇ／ｍＬ等のゲノム当量などの濃度で表す）を算定できる。特定の実施形態では、サンプルの全ＤＮＡの絶対量は、下記のさらなる工程を含むことで決定できる：工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを工程（ｃ）で検出したシグナルと比較する工程。このＤＮＡの標準サンプル（既知の量／既知の濃度）は、商業的供給源から容易に入手できる。また特に希釈系列を用いて準備、分析する場合、容易かつ効率的に使用して、サンプル中に存在する全ＤＮＡの絶対量を（検量線の補間／推定により）算定することができる。実際には、この検量線は、実質的に他の領域において説明したように（但し、標準の容器／反応は別のセットで）、好ましくはＤＭＲ／他の領域の検出と同じ操作で、準備、分析することができる。さらに、同じ反応のマスターミックスを使用することもできる。したがって、対照ＤＮＡである「ＤＭＲ」はその標準ＤＮＡについて検出できるが、そのシグナルは検量線の作成に必要ではない。したがって、前記検出工程の各々が定量的検出を含む特定の実施形態では、その標準ＤＮＡサンプルのシグナルを用いて比較する場合、前記ＤＮＡ種の前記検出量は、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表すことができる。
測定した前記ＤＮＡ種の定量的な量は、特定の疾患に対する個体のリスクの評価に有用であり、および／または、サンプル中にこのＤＮＡ種が十分に存在する場合、このＤＮＡ種のさらなる分析を効率的に、正確におよび／または費用効果の高い方法で行うことができる。
したがって、本発明の特定の実施形態は、検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程をさらに含む。前記ＤＮＡ種の（または異常な）量の増加は、個体が疾患に罹患または発症するリスクが上昇していることを示す。基準分布を作成するための量の閾値および／または一連の量は、公開された文献および／または実験的研究から得ることができる。例えば、公表された閾値（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇ ３３：６８２）を使用すると、全ｃｆＤＮＡが約７，５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合、または、胎児ｃｆＤＮＡの割合が約５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合、この女性はこのリスクが上昇していると判断できる。このリスクは、代替的または追加的に下記を考慮して評価できる：（ｉ）胎児ｃｆＤＮＡの倍増率（例えば１．５、３、３．５または４倍の増加）（その女性について量の閾値と比較して算出する）。後期妊娠では、胎児ｃｆＤＮＡのより高い倍増率が使用されうるという判断を考慮する（Ｚｅｙｂｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｒｅｓ ３９：６３２）；（ｉｉ）低リスクの女性または子癇前症の罹患もしくは発症がない女性から得られた量などの量の基準分布を考慮して、その女性で決定したｃｆＤＮＡの量をパーセンタイル値にする。例えば、胎児ｃｆＤＮＡの割合がこの分布の９０パーセンタイル以内の場合、その女性は、軽度または重度の子癇前症に罹患するリスクが高いと考えられる（Ｊａｋｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１３， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ５３：１９５６）。適切な閾値量の決定において他の関連する要因を考慮できる。例えば、乳癌に罹患している妊娠女性もまた、両方の要因のために、血漿中に存在するＲＡＳＳＦ１Ａのメチル化の偏りが高くなりうる。
同様に、本発明の特定の実施形態は、さらに下記工程を含む：検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程。前記閾値（または前記集団と比較して異常値ではない値）を超える前記ＤＮＡ種の量は、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常の診断が、好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別々のアリコートで行うことができることを示す。例えば、胎児ｃｆＤＮＡの割合が、母体血漿中に存在する全ｃｆＤＮＡの約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％よりも大きい場合、胎児ｃｆＤＮＡの１つ以上の特性を調査する、例えば、その胎児ｃｆＤＮＡ内に含まれる突然変異の染色体異常の可能性または存在を調査するその後の検査を（例えば、大規模並列配列ベースのＮＩＰＴを用いて）効果的に行うための十分な割合の胎児ｃｆＤＮＡが存在しているであろう。双胎妊娠の場合、双胎妊娠のＮＩＰＴ用の胎児ｃｆＤＮＡの最小割合は、８％または約５％、６％、７％、９％もしくは１０％であると考えることができ、適合した遺伝子型を有する単一絨毛膜性の双胎妊娠では（まれな例外を除いて、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ，１６１Ａ：１８１７）、十分な胎児ｃｆＤＮＡの割合は、４％または約２％、３％もしくは５％であろうと本発明者らは判断した。特定の実施形態では、量の閾値は、標準対照によって確立することができる：例えば、１つの既知のサンプル（または複数の既知のサンプル）から一度にまたは別々に実験的に確立する。および／または、１つの検査サンプル（または複数の検査サンプル）とほぼ同時に（例えば、１つのまたは複数の既知のサンプルから）、例えば同じ操作で、量の閾値を確立する。特に、１つ以上の既知のサンプルが１つ以上の（別々の）ウェルにセットされ、１つ以上の検査サンプルが他のウェルにセットされているマイクロタイター法のプレートのウェルに含まれるサンプルについて本発明の方法を実施することによって量の閾値を確立する。本発明の別の実施形態では、量の閾値および／または量の基準分布との比較は、第２のＤＮＡ種の量に対する第１のＤＮＡ種の量の相対量（例えば、その比）である。例えば、ヒトの第２１染色体の正常な２本組に由来する第１のＤＮＡ種の量は、例えば、第２染色体である基準（２本組）に由来する第２のＤＮＡ種の量に対して、約２：２（すなわち１：１）の比を示すことが期待される。しかし、トリソミー２１の場合、その比率は約３：２であると予想される。当業者に理解されるように、別の染色体（または部分的染色体）異数性は別の比を示すことが期待される。例えば、完全な染色体の欠失の場合または部分的欠失の場合（例えば、第２のＤＮＡ種のその部位を含む基準染色体と比較した第１のＤＮＡ種のその部位の部分的な欠失）は、１：２である。特定の実施形態では、例えばメチル化の差異などによる区別ができない場合、他のＤＮＡの存在（すなわち、当該他のＤＮＡとの混合物中）により、例えば、異数性胎児ｃｆＤＮＡと混合した正倍数性母体ｃｆＤＮＡは、母体ｃｆＤＮＡ（正倍数性）および胎児ｃｆＤＮＡ（異数性）の相対量に依存して、その比が改変されうる。当業者に理解されるように、当該比の改変は、それぞれの単位複製配列の相対的反応（例えば、ＰＣＲ反応）効率などの他の要因から生じうる。したがって、その実施形態の特定のものでは、量の閾値は（検出可能に、および／または、有意に）２：２（１００％）より大きいかまたは小さい比である。例えば、約３：２（１５０％）、約２：３（６６％）、約１：２（５０％）または約２：１（２００％）である。例えば、量および／または比の閾値は、約２００％より大きく、約５０％未満よりも小さい。または、約１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１０５％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％および５５％からなるリストから選択される。あるいは、特定の実施形態では、量の閾値は、例えばターナー症候群（完全な正倍数「４６、ＸＸ」核型ではなく「４５、Ｘ」核型を有するヒト雌型）等、第１のＤＮＡ種（または第２のＤＮＡ種）の検出可能量が存在しないことによってのみ決定することができる。
サンプルの分布と基準の分布との間の差異、または、基準の分布からのサンプルの異常値を比較し検出することは、当業者には公知であり、パラメトリックおよびノンパラメトリック統計検定の使用（例えば、（片側または両側）ｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ検定およびその他の使用）や、ｚスコア（例えば、Ｍｅｄｉａｎ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎを基準としたｚスコア（例えば、Ｓｔｕｍｍ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ３４：１８５において使用））の使用が含まれる。本発明の特定の実施形態では、基準分布と分布（または、基準分布からの異常値）を比較する場合、平均値、中央値または各々のサンプルの解離が、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、１．９５、１．９７、２．０より大きい場合、または、基準分布の標準分布（「ＳＤ」）が約２．０より大きい場合、および／または、各々のサンプルの基準分布からの解離が、ｚスコアで約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．７５、４．０、４．５、５．０よりも大きいか、約５．０よりも大きい場合、比較は区別される（および／または有意に異なると確認される）。
特定の実施形態では、各々の操作、プレートまたは検出／分析データセット内のサンプルのセットに関して、パラメータ（例えば、平均値、中央値、標準偏差、中央絶対偏差またはｚスコア）が計算される。その実施形態の特定のものでは、この計算されたパラメータは、その操作、プレートまたはデータセット（例えば、「操作個別の」分析）において検出／分析された検査サンプルからの異常値（例えば、トリソミーのサンプル）の同定に使用される。特定の実施形態では、そのパラメータは、全ての異常値の確認の認識なしに（例えば、「マスクされた」分析）、すべての検査サンプルから計算される。別の特定の実施形態では、このパラメータは、（異常値ではない）標準（例えば、正倍数性胎児由来のｃｆＤＮＡを含むことが既知のサンプル）であると認識されている基準サンプルのセット、または、その標準であると思われる（または、その見込みのない）検査サンプルから計算される。
特定の実施形態では、データセットに関して、ｚスコア（またはパラメータの反復の分布パターンに基づく同等の統計値）を計算して、異常値のデータポイントを識別することができる（例えば、子癇前症の罹患または発症のリスク上昇が予測される妊娠女性を識別する検査等におけるＤＮＡ種の過剰量を示す、または、染色体の異数性を有する胎児を識別する検査等における基準染色体に対する１つの染色体の過剰量を示す）。そのデータポイントを表すデータはデータセットから削除され、次いで、該データセットに対してｚスコア分析が行われ、さらに異常値が識別される。この反復的なｚスコア分析は、本発明の方法を用いた胎児の染色体異数性の検出において特に有用であろう。１回の実行では、時々、２つ以上の異数性サンプルが単一のｚスコア分析を歪曲する可能性があり、および／または、フォローアップ検査を利用して偽陽性を確認できるので、（初期の）偽陽性の識別よりも偽陰性の回避が潜在的により重要である。
したがって、本発明の１つの別の態様は、個体からのサンプルのセットから異常値として少なくとも１つのサンプルを同定する方法であって、前記方法は下記工程を含む：（ｉ）本発明の方法（例えば、第１の態様、第２の態様またはさらなる態様）を用いて、前記セットの各サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量または相対量を計算する工程；（ｉｉ）該セット中のすべてのサンプルに関して、前記量の平均量（または中央値）および標準偏差（または中央絶対偏差）を計算する工程；（ｉｉｉ）該セット中のすべてのサンプルについてｚスコア分析を行う工程；（ｉｖ）約１．７より大きいｚスコアを有する全てのサンプルを同定する工程；（ｖ）工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）を１回以上繰り返し、毎回、工程（ｉｉ）の計算から、約１．７０を超えるｚスコアを有する追加のサンプルに関する全てのデータを削除する工程。その態様の特定の実施形態では、ｚスコアは、約１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、２．００、２．０５、２．１０、２．１５、２．２０、２．２５、２．３０、２．３５、２．４０、２．４５または２．５０よりも大きい；および／または、工程（ｉｉ）〜工程（ｉｖ）は、２回、３回、４回、５回または５回〜約８回繰り返される。特定の実施形態では、工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）は、追加のサンプルが異常値として識別されなくなるまで繰り返される。その態様の一実施形態では、ｚスコアのカットオフ値は、各々の反復工程のセットにおいて引き上げられる（例えば、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５または０．５０）。その態様の特定の実施形態において、前記ＤＮＡ種の量は、全胎児ｃｆＤＮＡの相対量であり、異常値のサンプルは、子癇前症、早期陣痛、子宮内発育遅延およびバニシングツイン等の疾患（特に、子癇前症）を発症するリスクが高い妊娠女性を示す。その態様の特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種の量は、染色体異数性に関連する染色体上に位置する、または、染色体異数性に関連する染色体のセクション内に位置する第１の胎児ｃｆＤＮＡ種の基準染色体上に位置する第２の胎児ｃｆＤＮＡに対する相対量である。また異常値のサンプルは、異数性胎児（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３を有する胎児）を宿しているリスクの高い妊娠女性を示す。当業者が理解するように、対応するその態様には、ｚスコアが負のカットオフ値よりも小さい場合（例えば約−１．７より小さい場合）に異常値が特定される場合が含まれる。本発明の関連する他の態様は、上記態様の少なくとも工程（ｉｉ）〜（ｖ）を実施するための動作を実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する複数の命令でコード化されたコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品である。特定の実施形態では、そのプログラム製品は、工程（ｉ）を実施するための動作を実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する命令をさらに含む。
したがって、また本発明は下記工程をさらに含む実施形態を含む：好ましくは、ＤＮＡの別々のアリコートを用いて、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常について、前記サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断を行う工程；好ましくは、前記ＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来であり、そして前記診断は出生前診断である。存在する前記ＤＮＡ種に対するその診断は、下記からなる群から選択される検出技術を使用する工程を含むことができる：ＤＮＡ配列決定、ＳＮＰ分析、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーション。また特定の実施形態では、前記検出技術は、ＤＮＡの大規模並列配列決定法である（例えば、ランダムおよび／または（エキソン）富化ＤＮＡの大規模並列配列決定法）。本発明の特定の実施形態では、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断が同じアリコートのＤＮＡに対して行われる。例えば、本発明の方法は、さらなる検出技術を必要としないその方法の実施によってその診断が可能となるように、実施（または、そのように実施するように改変）することができる。この方法は、その診断検査を提供する必要性、または、より迅速で簡単で安価な方法を解決する特に有利な解決方法を提供する。この有利な解決方法を提供する本発明の特定の態様および／または実施形態は、本明細書に記載される。
このような診断または検査は、胎児ＤＮＡの遺伝子変異または染色体異常を同定するために胎児ＤＮＡに向けられてもよい。したがって、特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種は胎児の細胞および／または胎児の胎盤由来であり、前記サンプルは妊娠女性由来であり、前記異常は遺伝子変異または染色体異常（例えば、胎児の異常および／または先天性障害に関連する染色体トリソミー）である。特に、この実施形態では、遺伝子変異は、以下からなる群から選択される：色盲、嚢胞性線維症、ヘモクロマトーシス、血友病、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎、鎌状赤血球病、テイ・サックス病。および／または染色体異常は、以下からなる群から選択される：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症。他の実施形態では、遺伝子変異または染色体異常は、ＥｕｒｏＧｅｎｔｅｓｔ２イニシアチブ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｓｔ．ｏｒｇ）の臨床的有用性遺伝子カード（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｃａｒｄ／ＣＵＧＣ）を有するものから選択される１つ以上であってもよい。特定の実施形態では、染色体異常は、トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８もしくはトリソミー１３）、性染色体異常または染色体欠失である。
このような診断または検査は、疾患に関連する細胞または細胞タイプに由来するそのＤＮＡの遺伝子変異または染色体異常を同定するために、ＤＮＡ種を対象とすることができる。したがって、その実施形態の１つでは、前記ＤＮＡ種は腫瘍の細胞に由来し、前記異常は、癌腫または癌の診断、予後診断または予測的治療に関連する遺伝的変異または染色体異常である。特定のこの実施形態では、遺伝子変異は、下記からなる群から選択される：腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＴＰ５３（ｐ５３）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣまたはＲＢ１）の変異、癌原遺伝子（例えば、ＲＡＳ、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫまたはＴＲＫ）およびＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＭＧＭＴまたはＰＭＳ２）の変異；および／または染色体異常は転座である（例えば、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）［すなわち，フィラデルフィア染色体もしくはＢＣＬ−ＡＢＬ］、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）、ｔ（１０；（多種））（ｑ１１；（多種））、ｔ（２；３）（ｑ１３；ｐ２５）、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ｔ（９；１２）（ｐ２４；ｐ１３）、ｔ（１２；２１）（ｐ１２；ｑ２２）、ｔ（１１；１８）（ｑ２１；ｑ２１）、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１１．２−１２）、ｔ（１７；２２）、ｔ（１；１２）（ｑ２１；ｐ１３）、ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２）、ｔ（１；１９）（ｑ１０；ｐ１０）、ｔ（７，１６）（ｑ３２−３４；ｐ１１）、ｔ（１１，１６）（ｐ１１；ｐ１１）、ｔ（８，２２）（ｑ２４；ｑ１１）もしくはｔ（２；８）（ｐ１１；ｑ２４））。
本発明の特定の実施形態は下記である：
・例えば本発明の方法の検出工程（ｂ）で検出された第１のＤＭＲ（または２つ以上のＤＭＲの第１のセット）におけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第１のＤＭＲ（または第１のＤＭＲセット）におけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の非存在を示すことに使用される；好ましくは、前記第１のＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し（例えば、ヒト第２１染色体等の染色体異数性に関連する染色体由来）、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第１のＤＭＲ（第１のＤＭＲセット）の少なくとも１つは、本明細書に記載される；そして、
・例えば本発明の方法の同一のまたは異なる検出工程（ｂ）で検出された第２のＤＭＲ（または２つ以上のＤＭＲの第２のセット）におけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第２のＤＭＲ（または第２のＤＭＲセット）におけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の非存在を示すことに使用される；好ましくは、前記第２のＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し（例えば、ヒト第２１染色体等の染色体異数性に関連する染色体由来）、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第２のＤＭＲ（第２のＤＭＲセット）の少なくとも１つは、本明細書に記載される；そして、
・例えば、本発明の方法の検出工程（ｃ）において、前記第１のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第１の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第１の全ＤＮＡ量を検出する；前記試薬による第１の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第１の他の領域は、前記第１のＤＭＲ（または１つ以上のＤＭＲの第１のセット）の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する；そして、
・例えば、本発明の方法の同一のまたは異なる検出工程（ｃ）において、前記第２のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第２の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第２の全ＤＮＡ量を検出する；前記試薬による第２の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第２の他の領域は、前記第２のＤＭＲ（または１つ以上のＤＭＲの第２のセット）の約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する。
図示的説明として、本発明の第１の態様のその実施形態に使用される、ＤＭＲ、他の領域および検出可能な標識の一般的な配置の概略図を図６に示す。（１）ＤＭＲ１の第１のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２１染色体等の特定の染色体）におけるメチル化の存在は、ＤＭＲ１のゲノムの同じ部分（例えば、約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）に位置する他の領域（「ＯＲ１」）との関係で検出される。（２）別のＤＭＲおよび／またはＯＲ（例えば、ＤＭＲ２および／またはＯＲ２、ならびに、ＤＭＲｎおよびＯＲｎまで）を任意に検出することができ、このような別のＤＭＲおよびＯＲの対は、互いにゲノムの同じ部分（例えば、約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）において、各々、一緒に位置しうる。いずれの場合も、全て同じ第１のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２１染色体等の同じ染色体）を検出する。場合により（３）その第１のＤＮＡ種の中のメチル化の存在は、同一の検出可能な標識を用いて複数のＤＭＲで検出される、および／または、（４）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１および任意にＯＲ２またはＯＲｎまで）を用いて検出された第１の全ＤＮＡ量は、第１のＤＮＡ種を示すＤＭＲでメチル化の検出に用いられるものとは異なる検出可能な標識を用いて検出される（場合により、使用される検出可能な標識は全てのＯＲについて同一である）。（１’）この実施形態では、第１のＤＮＡ種は、第２のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２染色体等の基準染色体）のものと比較して検出、同定および／または定量される。この第２のＤＮＡ種は、第１のＤＮＡ種に関して記載するように、但し、異なるＤＭＲおよびＯＲ（それぞれの図の後に「プライム（ｐｒｉｍｅ）」と示される）を説明ラベルを参照して使用し、検出される。このような実施形態のものでは、ＤＭＲ、ＯＲ、ＤＭＲ’およびＯＲ’の検出は、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および／または、互いに実質的に同時に（例えば、本明細書に記載されるプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲにより、例えば、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用して）行われ、そして、その実施形態は、検出可能な標識（３）、（４）、（３）’および（４）’が異なり、および／または、検出および／または定量を別々に行うことが可能なものを含む。
図示的説明として、本発明の第２の態様のその実施形態に使用される、ＤＭＲ、他の領域および検出可能な標識の一般的な配置の概略図を図７に示す。（１）２つ以上のＤＭＲ、ＤＭＲ１およびＤＭＲ２（および場合によってはＤＭＲｎまで）の第１のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２１染色体等の特定の染色体）におけるメチル化の存在は、それぞれの場合において同じ検出可能な標識を用いて検出される。（２）場合により、１つのＤＭＲのゲノムの同じ部分（例えば、約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流）に位置する他の領域（「ＯＲ」）。（３）少なくとも１つのＯＲ（ＯＲ１および任意にＯＲ２またはＯＲｎまで）を用いて検出された第１の全ＤＮＡ量は、ＤＭＲでメチル化の検出に用いられるものとは異なる検出可能な標識を用いて検出される（場合により、使用される検出可能な標識は全てのＯＲについて同一である）。（４）場合により、２つ以上のＤＭＲのメチル化が検出され、および／または、１つ以上のＯＲで第１の量の全ＤＮＡが検出される。（１’）この実施形態では、第１のＤＮＡ種は、第２のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２染色体等の基準染色体）のものと比較して検出、同定および／または定量される。この第２のＤＮＡ種は、第１のＤＮＡ種に関して記載するように、但し、異なるＤＭＲ、および、場合によりＯＲ（それぞれの図の後に「プライム（ｐｒｉｍｅ）」と示される）を説明ラベルを参照して使用し、検出される。このような実施形態のものでは、ＤＭＲ、ＯＲ、ＤＭＲ’およびＯＲ’の検出は、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および／または、互いに実質的に同時に（例えば、本明細書に記載されるプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲにより、例えば、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用して）行われ、そして、その実施形態は、検出可能な標識（３）、（４）、（３）’および（４）’が異なり、および／または、検出および／または定量を別々に行うことが可能なものを含む。
前の段落に記載した方法の実施は、第１のＤＮＡ種（例えば、ヒト第２１染色体等の染色体異数性に関連する染色体またはその一部由来）と第２のＤＮＡ種（例えば、基準染色体（例えば第２染色体）またはその一部由来）の相対的な検出（または量）を可能にすることができる。したがって、胎児の染色体異数性などの染色体異常についての迅速で安易で費用効果の高い検出、同定または診断の助けとなる。この方法は、例えば、比較的簡単で信頼性あり費用効果の高い定量的ＰＣＲ装置を必要とする多くの研究所で、より容易に確立し実行することができる。そして、高価で特殊な高処理の次世代配列決定装置を必要としない。実際に、本発明のその特定の実施形態では、前記第１および第２のＤＭＲ（またはＤＭＲのセット）の工程（ｂ）における検出および前記第１および第２の他の領域の工程（ｃ）における検出は、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、そして（ｘ）前記第１および第２のＤＭＲ（またはＤＭＲのセット）の各々について異なる検出可能な標識；および（ｙ）さらに前記第１および第２の他の領域の各々について異なる検出可能な標識を用いて実施する。第１および第２のＤＮＡ種の（第１のＤＭＲ（のセット）および第２のＤＭＲ（のセット）を介した）相対的な検出、同定または定量は、同じ反応／検出容器内で実質的に同時に実施されるこれらの実施形態では、第１および第２のＤＭＲ（のセット）の間とそれらの対応する第１および第２の他の領域の間を区別することができる検出可能な標識を使用することによって有利に行われる。さらなる特定のその実施形態では、検出（ｂ）および（ｃ）が同じ反応／検出容器内で実質的に同時に実施され、工程（ｂ）における前記検出および工程（ｃ）における前記検出を、プローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲにより、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用して行う工程を含む。
本発明の全ての実施形態において、特に、サンプル中の複数の（例えば２つ以上の）ＤＮＡ種を検出するものでは、試薬は、メチル化感受性制限酵素を少なくとも１つ（例えば、本明細書の他の箇所に記載されたものの１つ以上）含むことができる。代替的にまたは追加的に、この実施形態において、特に本明細書に記載のＭＳＰまたはＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ検出法を利用する方法ついて、当該試薬は、特に本明細書に記載のＭＳＰまたはＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ検出法を利用するそれらの方法ついて重亜硫酸塩を含むことができる。
本発明のすべての実施形態において、特にサンプル中の複数の（例えば２つ以上の）ＤＮＡ種を検出するものでは、前記検出工程の１つ以上（好ましくは各々）が定量的検出を含む。例えば、特定の実施形態では、前記ＤＮＡ種それぞれの前記検出された量は、それぞれの他の領域からの前記サンプル中で検出された全ＤＮＡのそれぞれの量に対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される。この実施形態のさらに別のものでは、本発明の方法は、工程（ｃ）で使用した同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを、他の領域のそれぞれについて工程（ｃ）で検出した各々のシグナルと比較する工程をさらに含むことができる。別の特定の実施形態では、前記検出工程の１つ以上（好ましくはそれぞれ）が定量的検出を含み、そして、前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種のそれぞれの絶対量として表される。
サンプル中の複数の（例えば、２つ以上の）ＤＮＡ種を定量的に検出する本発明の実施形態では、その方法は、下記工程をさらに含むことができる：
・（ｘ）第１のＤＭＲ（または２つ以上のＤＭＲの第１のセット）で検出された前記第１のＤＮＡ種；および（ｙ）第２のＤＭＲ（または２つ以上のＤＭＲの第１のセット）で検出された前記第２のＤＮＡ種の相対量、好ましくは比を決定する工程；および、
・前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、前記サンプル中に存在する前記第１のＤＮＡ種および／または第２のＤＮＡ種に異常が存在することを示す工程。
この態様は、本方法によって示される異常の存在が、染色体異常である場合（例えば、染色体異常が胎児の異常および／または先天性障害に関連する）が、特に好ましい。例えば、その染色体異常は、以下からなる群から選択される：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症。患者数の点で最も関連性があり、したがって医学的および社会的に重要なものは、染色体異常が、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミーの場合である。
本発明の別の態様は、妊娠女性が宿す胎児の染色体異数性を検出する方法であって、前記方法は下記工程を含む：
（Ａ）本明細書に（または他に）記載された実施形態のいずれかにおける本発明の方法（例えば、本発明の第１および／または第２の態様の方法）を用いて、前記妊娠女性から採取したサンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第１のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第１のＤＮＡ種が染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第１のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｂ）本明細書に（または他に）記載された実施形態のいずれかにおける本発明の方法（例えば、本発明の第１および／または第２の態様の方法）を用いて、前記サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第２のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第２のＤＮＡ種が基準染色体上に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第２のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の量の相対量、好ましくはその比を決定する工程；および、
（Ｄ）前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、胎児の染色体異数性の存在を示す工程。
この別の態様において、前記第１のＤＮＡ種の量および前記第１のＤＮＡ種の量は、本発明の第１および／または第２の態様の方法（またはその任意の実施形態）を用いて測定される。したがって、本発明の第１の態様の方法を用いる場合、第１のＤＮＡ種の量は、少なくとも１つのＤＭＲの使用（その方法の工程（ｂ）において）および少なくとも１つのＯＲの使用（その方法の工程（ｃ）において）により、測定することができる；そのＯＲは、前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する；そして、この別の態様では、他の領域およびＤＭＲが、染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置する。あるいは、本発明の第２の態様の方法を用いる場合、第１のＤＮＡ種の量は、２つ以上のＤＭＲの使用（その方法の工程（ｂ）において）および少なくとも１つのＯＲの使用（その方法の工程（ｃ）において）により、測定することができ；工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出は、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施され；そして、少なくとも２つのＤＭＲが、染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置する。その各々の別の態様に関して、適切なＤＭＲおよびその染色体または染色体の領域に位置する他の領域の例は、本明細書の他の箇所に記載されており、その例は、このさらなる態様の実施形態に具体的に包含される。ここで、当業者に理解されるように、第２のＤＮＡ種の量は、本発明の第１または第２の態様の方法を用いて測定することができる。それと同様に、ＤＭＲ（および、本発明の第１の態様の方法がその測定に使用される場合、少なくとも１つのＯＲ）が基準染色体上に位置することを除いて、第１のＤＮＡ種の量の測定について記載されている。したがって、このさらなる態様には、その基準染色体上に位置するものとして本明細書の他の箇所に記載されるＤＭＲおよび／またはＯＲを使用する実施形態も含まれる。本発明の第１または第２の態様のいずれかの方法を使用し、このさらなる態様の工程（Ａ）において第１のＤＮＡ種の量を測定すること、および／または、このさらなる態様の工程（Ｂ）において第２のＤＮＡ種の量を測定することによって、そのＤＮＡ種の量は、従来技術の方法（例えば、ＤＭＲがひとつ）のみに基づく量の測定に比べてより適切に（例えば、より正確におよび／または精密に）測定される。
このさらなる態様のために、本発明の第１の態様の方法に基づいて使用することができる特異的にメチル化された領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の概略図を、上述の通り、図６に示す。これに対して、このさらなる態様のために、本発明の第２の態様の方法に基づいて使用することができる特異的にメチル化された領域（「ＤＭＲ」）および他の領域（「ＯＲ」）の別の概略図を、上述の通り、図７に示す。
本発明の第２の態様に関する別の態様は、個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する別の方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；および、
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上のＤＭＲで前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記１つ以上のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；
工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、それらのＤＭＲについて実質的に同時に、（ｘ）多重リアルタイム定量ＰＣＲ；および（ｙ）それぞれが前記ＤＭＲの１つに特異的であり、前記ＤＭＲの各々について同じ検出可能な標識で標識された少なくとも２つの標識プローブを用いて実施される方法である。本発明のこの別の方法は、ヒトまたは動物の生体上で実施されることを意図しない。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で実施されることが意図される。本発明のこの別の方法の特徴のいずれか（またはその特徴の任意の組み合わせ）のさらなる特徴は、本発明の第１の態様に関して本明細書の別の箇所に記載された特徴（およびそれらの組み合わせ）を含むことができる。本発明のこの別の方法の特定の実施形態では、試薬は、本明細書に開示するひとつ（またはその組み合わせ）である１つ以上のメチル化感受性制限酵素を含む。
別の態様では、本発明は、個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を検出する方法であって、前記方法は下記工程を含み：
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ種（および／または全ＤＮＡ）の定量的な量を測定する本発明の方法を実施する工程；および、
（ｉｉ）検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程；
前記ＤＮＡ種（および／または全ＤＮＡ）の量の増加（または異常値）が、個体の前記疾患の罹患または発症のリスク上昇を示す方法である。
本発明のさらなる別の態様は、組成物（例えば、本発明の方法に有用であるか、または本発明の方法において使用される組成物）であって、前記本発明の組成物は、下記の（１）または（２）を含む：
（１）
・本明細書に記載されている、前記ＤＭＲの１つを増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
・本明細書に記載されている、前記他の領域を増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
・プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記ＤＭＲに特異的な、１つの標識プローブ；および、
・プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記他の領域に特異的であり、前記ＤＭＲ用のプローブとは異なる検出可能な標識で標識された、１つの標識プローブ。
（２）
・本明細書に記載されている、前記２つ以上のＤＭＲの１つをそれぞれの対が増幅する、２対のＰＣＲプライマー；
・本明細書に記載されている、前記他の領域を増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
・プローブベースの定量ＰＣＲ用の、それぞれが前記ＤＭＲの１つに特異的であり、各々について同じ検出可能な標識で標識されている、２つの標識プローブ；および、
・プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記他の領域に特異的であり、前記ＤＭＲ用のプローブとは異なる検出可能な標識で標識された、１つの標識プローブ。
この本発明の組成物は、さらに下記の（１）または（２）を含むことができる：
（１）
・本明細書に記載されている、第２のＤＭＲを増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記ＤＭＲに特異的な、検出可能な標識で標識された、追加の標識プローブ（場合により、前記第１の他の領域に特異的なプローブに使用されるものと同じである）；および／または、
・本明細書に記載されている、第２の他の領域を増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記他の領域に特異的な、前記ＤＭＲ用のプローブとは異なる検出可能な標識で標識された、追加の標識プローブ（場合により、前記第１の他の領域に特異的なプローブに使用されるものと同じである）。
（２）
・本明細書に記載されている、第２の他の領域を増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、
・プローブベースの定量ＰＣＲ用の、前記他の領域に特異的な、前記ＤＭＲ用のプローブとは異なる検出可能な標識で標識された、追加の標識プローブ（場合により、第１の他の領域に特異的なプローブに使用されるものと同じである）。
また本発明のさらなる別の態様は、キット（例えば、別々の構成要素のキット；例えば、キットの異なる構成要素をそれぞれ保持するホルダーまたは容器のキット）であって、そのキットは、１組のプライマーおよび本発明の組成物に含まれるプローブを含む。本発明のキットは、追加の要素を含むことができる。例えば、キットは、（ｉ）本発明の方法の実施および／または本発明の組成物の製造もしくは使用を含む、前記プライマーおよびプローブを使用するための説明書を含む印刷されたマニュアルまたはコンピュータ読み取り可能なメモリ、および／または、（ｉｉ）本発明の方法の実施および／または本発明の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他の品物、要素または試薬；例えば、本明細書に開示された全てのその品物、要素または試薬（例えば、本明細書に記載されている、メチル化および非メチル化ＤＮＡを異なる形で修飾する試薬）。
組成物またはキットの特定の実施形態では、それに含まれるプライマーまたはプローブの１つ以上は、表１および／または表８に記載のものから選択されるプライマーまたはプローブ配列を含む（または、それらからなる）。この特定の実施形態では、組成物またはキットは、（ｘ）ＤＭＲの１つおよび（ｙ）ＯＲの１つの各々について、表１に示すプライマーの対とプローブを含む。さらにこの実施形態では、（ｘ）２つのＤＭＲおよび（ｙ）２つのＯＲの全てについて、表１に示すプライマーの対とプローブを含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、（ｘ）２つのＤＭＲおよび（ｙ）２つのＯＲの全てについて、表８に示すプライマーの対とプローブを含む。この実施形態のいずれにおいても、プローブは、そのプローブについて各々の表に記載されるように、標識／クエンチャー（および場合によりマイナーグルーブ結合部分）で標識できる。
本発明のさらなる別の態様は、下記［（ｘ）疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種における異常の診断を実施する場合、前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種を含む個体由来の各々のサンプルにおいて、本明細書に記載のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを異なって修飾する試薬で処理される該サンプル中に存在するＤＮＡ］を診断するための動作を、実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する複数の命令でコード化されたコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記動作が下記工程を含むコンピュータプログラム製品である。
・（ｉ）本明細書に記載の工程（ｂ）における１つ以上の（または２つ以上の）ＤＭＲのメチル化の（実質的に同時の）定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）本明細書に記載の工程（ｃ）における少なくとも１つの他の領域を用いた全ＤＮＡの（実質的に同時の）定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルからパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記ＤＮＡ種（および／または前記全ＤＮＡ）の定量的な量を表す工程；
・前記パラメータを量の閾値及び／又は量の基準分布と比較する工程；および、
・その比較に基づいて、（ｘ）個体における疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇が存在するか否か；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の異常が診断できるか否かの分類を決定する工程。
本発明のコンピュータプログラム製品の特定の実施形態では、さらに前記動作は下記工程を含む：本明細書に記載されるＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡの定量的検出を表す追加のシグナルを受信する工程；および、前記ＤＮＡ種の絶対量を表す前記パラメーターを決定するために、前記シグナルと、少なくとも１つの他の領域を用いた全ＤＮＡの実質的に同時の定量的検出を表すシグナルとを比較する工程。
本発明のコンピュータプログラム製品の特定の実施形態では、動作は、前記ＤＮＡ種における異常の診断が行われうるか否かを決定するものであり、さらに前記動作は、前記パラメータから、前記診断の一部として、前記サンプル（好ましくは、ＤＮＡの別々のアリコート）から配列が決定される多量のランダムおよび／または富化されたＤＮＡ分子を決定する工程を含む。
本発明のコンピュータプログラム製品の別の特定の実施形態では、動作は、下記工程をさらに含む：
・（ｉ）上記工程（ｂ）における１つの（または２つ以上のセットの）第２のＤＭＲのメチル化の定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）上記工程（ｃ）における１つの第２の他の領域を用いた全ＤＮＡの定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルから第２のパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記第２のＤＮＡ種の定量的な量を表す工程；
・前記パラメータと前記第２のパラメータの相対量、好ましくは比を決定する工程；
・前記相対量または比を、量もしくは比の閾値及び／又は基準分布と比較する工程；および、
・その比較に基づいて、前記ＤＮＡ種の異常または前記サンプル中に存在する第２のＤＮＡ種の異常の分類を決定する工程。
このコンピュータプログラム製品のこの実施形態では、特に好ましくは、本方法によって示される異常の存在が、染色体異常（例えば、染色体異常が、胎児の異常および／または先天性障害に関連する）である。例えば、その染色体異常は、染色体異常は、以下からなる群から選択することができる：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症。
患者数の点で最も関連性があり、したがって医学的および社会的に重要なものは、染色体異常が、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミー、特にトリソミー２１の場合である。
本発明のコンピュータプログラム製品によって実行および／または制御される動作の一実施形態を図５に示す。動作（Ａ）は、ＤＭＲおよび全ＤＮＡにおけるメチル化をそれぞれ表すシグナル（１）および（２）を受信し、場合により、シグナル（３）は、標準サンプルからの全ＤＮＡ量を表す。動作（Ａ）は、ＤＮＡの相対量または絶対量（例えば、胎児ＤＮＡ対全ＤＮＡ）を表す、シグナル（１）、（２）および任意の（３）からのパラメータ（４）を決定する。このパラメータ（４）は、動作（Ｂ）によって、量の閾値（５）および／または量の基準集団（６）と比較され、疾患に罹患する個体のリスク、および／または、サンプル中のいずれかのＤＮＡにおいて異常の診断を行うことができるかどうかが分類（７）される。
本発明の教示の特定の問題または環境への応用、ならびに、本発明のバリエーションまたは追加的特徴（さらなる態様および実施形態）の包含は、本明細書に含まれる教示を考慮して当業者の能力の範囲内にあることが理解されるべきである。
他に記載のない限り、上に記載した特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。
本明細書で引用した全ての参考文献、特許および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ここで、本発明の特定の態様および実施形態を、実施例として、本明細書に記載された説明、図および表を参照して説明する。本発明の方法、使用および他の態様のその実施例は、単なる代表例であり、本発明の範囲をその代表的実施例に限定するものではない。
実施例１：多胎妊娠におけるＮＩＰＴでの本発明の方法の使用（バニシングツインの場合を含む）
サンプル採取、処理およびＤＮＡ抽出：
２０１２年１１月６日から２０１３年１１月１６日の間に、研究開発（Ｒ＆Ｄ）目的で、通常の非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）の研究手技の一部として、多胎妊娠（一絨毛膜，二絨毛膜，三絨毛膜双胎および三胎）の妊娠女性から３６の血液サンプルを採取した。１つの血液サンプルは、三胎を妊娠した女性から得られ、残りの３５サンプルは、双胎を妊娠した女性から採取した。多胎妊娠の各妊娠女性から、７〜１０ｍｌの静脈血の２つのサンプルを、Ｓｔｒｅｃｋ社の無細胞ＤＮＡ採血管（Ｓｔｒｅｃｋ）を用いて採集した。血液サンプルは、最大４日間の輸送時間で診断検査室に送られた。本明細書で分析された妊娠女性からの他の血液サンプルも同様に収集した。
血漿の調製は、遠心分離（４℃で１６００ｇ、１０分間）によって行い、続いて第２の遠心分離ステップ（４℃で１０分間、１６０００ｇ）によって血漿を分離した。ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、６０μｌのＡＶＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）の最終溶出体積で、３．０〜４．０ｍｌの血漿を用いる製造業者のプロトコルに従って全無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の抽出を実施した。
ＤＮＡ定量：
本発明の方法を用いて、胎児ｃｆＤＮＡの割合の相対濃度および絶対量の両方を調べるために、胎児無細胞ＤＮＡ（胎児ｃｆＤＮＡ）を検出し、全無細胞ＤＮＡ（全ｃｆＤＮＡ）に関して定量した。溶出された無細胞ＤＮＡから１１μｌを、ＣｐＧ−メチル化感受性酵素ＨｈａＩ（０．４Ｕ／μｌ）、ＨｐａＩＩ（０．３Ｕ／μｌ）およびＢｓｔＵＩ（０．３Ｕ／μｌ）で、ＣｕｔＳｍａｒｔＴＭ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた２２μｌの反応液中で切断した。その反応は、３７℃で６０分間および６０℃で６０分間インキュベートした。切断反応液からの１０μｌをプローブベースの定量ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した（反応は２連で行った）。以下に簡単に記載する。
２倍に濃縮したＰＣＲマスターミックス（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２５μｌのＰＣＲ反応を行った。胎児と母親のＤＮＡの間で特異的にメチル化されたそれぞれの領域（ＤＭＲ）のＣｐＧメチル化感受性制限酵素部位にまたがるプライマーを、そのＤＭＲのＦＡＭ標識プローブとの組み合わせで使用し、制限酵素部位にまたがらないプライマー、胎児と母体ＤＮＡとの間で特異的にメチル化されていない他の領域（ＯＲ）を、そのようなＯＲのためのＶＩＣ標識プローブと組み合わせて使用する。この実施例で使用されるプライマーおよび標識プローブの配列は表１に記載されており、プローブベースの定量（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ）に使用されるサーモサイクラープロファイルは表２に記載される。本実施例で、２つのＤＭＲの存在を検出するために使用されるプローブは、それぞれ同じ検出可能なフルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）蛍光部分で標識され、それぞれ同じマイナー結合グローブ（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）部分を有し、２つのＯＲの存在を検出するために使用されるプローブは、それぞれ、同じ検出可能なＶＩＣ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）蛍光部分で標識され、それぞれ同じＭＧＢＮＦＱ部分で標識される。
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この実施例で使用されるアッセイデザインは、母体ＤＮＡでは低メチル化され、胎児ＤＮＡでは過剰メチル化されることが記載されている２つのマーカーＤＭＲ（Ｎｙｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ，２０１０：Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６，１６２７；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ，２００６：Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４２，２２１１；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ，２００７：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７０，９４１）および、それぞれ約２０ｂｐ〜２０ｋｂのＤＭＲの間に位置する母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間で特異的にメチル化されない２つの他の領域（ＯＲ）に基づいた。特に、ＲＡＳＳＦ１Ａに位置するメチル化非感受性遺伝子座は、ＲＡＳＳＦ１Ａに位置するメチル化感受性遺伝子座の８ｋｂ〜９ｋｂ（８．９７ｋｂ）の間の下流に位置し、ＴＢＸ３に位置するメチル化非感受性遺伝子座は、ＴＢＸ３に位置するメチル化感受性遺伝子座の１０ｋｂ〜１１ｋｐ（１０．６４ｋｂ）の間の下流に位置する。図２は、本実施例で使用される２つのＤＭＲおよび２つの他の領域のそれぞれの配置および検出様式を示す。
標準品として既知の濃度の雄性ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の連続希釈液を鋳型に用いて、平行プローブベースの定量ＰＣＲ反応を行った（同じＰＣＲ操作内で別々に反応）。ＦＡＭチャネル（ＤＭＲ；すなわち胎児ｃｆＤＮＡの検出）とＶＩＣチャネル（ＯＲ；すなわち全ｃｆＤＮＡの検出）のシグナルの相対的な定量によって胎児ｃｆＤＮＡの割合を算出し、既知の濃度の標準ＤＮＡの希釈系列から得られたＶＩＣチャネルと比較したサンプルから得られたＶＩＣチャネルの絶対的定量シグナルによって、絶対的な全ｃｆＤＮＡ量を算出した。この相対的および絶対的定量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ソフトウェアリリース１．５．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
胎児異数性を同定するための母体血漿ＤＮＡ配列決定およびデータ分析：
ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ（商標）ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用してＤＮＡ配列決定ライブラリを調製した。ライブラリは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓロボットで自動化された製造業者のプロトコルに従って調製した。ライブラリーの質および量は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＱｂｉｔ蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。ライブラリに基づいて、１プールあたり１２サンプルの定量希釈および等モルプールを調製した。プールしたサンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００シーケンサーのＩｌｌｕｍｉｎａ ｖ３フローセルの１レーンで配列決定した。クローン集団は、製造元のプロトコルに従ってｃＢｏｔ Ｃｌｕｓｔｅｒ生成システムのＴｒｕＳｅｑ ＳＲ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｋｉｔ ｖ３−ｃＢｏｔ−ＨＳを使用して生成した。胎児染色体の異数性を同定するためのバイオインフォマティクス解析は、前述のように、胎児トリソミー２１の存在を示すｚスコア＞３を用いて実施した（Ｓｔｕｍｍ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇ ３４：１８５）。この方法による胎児異数性の検査結果が陽性の場合、結果は侵襲的な診断法によって確認された。
結果：
血液サンプルの特性、胎児ｃｆＤＮＡの割合％、および、異数性試験の結果を表３に示す。胎児トリソミー２１を示す２つの陽性の試験結果があった。両方とも羊水穿刺後の染色体分析によって確認した。したがって、この試験の偽陽性率は０％であった。１つの血液サンプルは、一致する核型［４７、ＸＹ、＋２１］を持つ一絨毛膜双胎を示し、もう１つは、不一致の核型［４７，ＸＹ，＋２１および４６，ＸＸ］を持つ二絨毛膜双胎を示した。両方のサンプルにおいて、胎児の割合はそれぞれ１８．０％および２４．８％と高かった。他の全てのＮＩＰＴの結果は、トリソミー２１，１８及び１３に関しては陰性であった。本試験に含まれる妊娠において偽陰性のＮＩＰＴの結果に関する証拠はない。それでもなお、多くの妊娠が継続中であり（患者の最後の出産は２０１４年５月中旬に予定されている）、したがって、最終的な検出率はまだ不確実である。
Figure 2017514499
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ＮＩＰＴによる双胎中の胎児異数性の信頼性のある検出は、母体の血液中の各胎児からの胎児ｃｆＤＮＡ量が十分に高いことに依存する。各双胎児の寄与が検出閾値を上回ることを確実にするために、胎児ｃｆＤＮＡの割合の下限値をどう定義するかについて、様々なデータおよび考察が公表されている（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇ ３３：６７５；Ｑｕ ｅｔ ａｌ ２００７，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７０：９４１；Ｓｔｒｕｂｌｅ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ Ｄｅｃ ７ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。これは、不一致の核型を有する二絨毛膜双胎妊娠において特に重要である。上記研究では、２つの胎児のひとつのみが雄性である場合のＹ染色体表現型に由来する双胎妊娠ための最小の胎児ｃｆＤＮＡの割合を定義するために、サポート情報が使用された。本発明の方法を用いて、両方の胎児に由来する胎児ｃｆＤＮＡの合計を反映する全胎児ｃｆＤＮＡの割合を決定することができる。次世代配列決定法によるＹ染色体表現型を用いて、雄性胎児の胎児ｃｆＤＮＡ量を測定することができる（Ｓｔｕｍｍ ｅｔ ａｌ ２０１４に記載のように）。すなわち、胎児の性別が男女の場合、各胎児の寄与量は、本発明の方法によって測定された胎児ｃｆＤＮＡの割合から、Ｙ染色体表現型によって決定された胎児ｃｆＤＮＡ量を減算することによって算出できる。本発明の方法によって決定された胎児ｃｆＤＮＡの割合を、既知の性別を有する場合について、次世代配列決定法によるＹ染色体の読み取りから得られた値と比較した（図３参照）。雄性特異的ｃｆＤＮＡ量（ｙ軸）は、本発明の方法によって測定された胎児ｃｆＤＮＡの割合（ｘ軸）に対して相関がある。すなわち、男性／男性の性別が恐らく正しい双胎妊娠の場合：［ｙ＝ｘ］、女性／男性の性別の場合：［ｙ＝０．５ｘ］、および、女性／女性の場合：［ｙ＝１］である。類似の値の場合の性別は男性／男性であり、Ｙ染色体表現型が低い異なる値の場合、性別は女性／女性である。Ｙ染色体表現型の胎児割合のパーセンテージが約半分を示す中間の場合は男女である。図３に示されるデータは、双胎妊娠のＮＩＰＴ結果を用いて胎児性別を判定することが可能であることを示すだけではなく、本発明の方法によって決定されるｃｆＤＮＡの胎児の割合量の測定が、Ｙ染色体配列の頻度数と比較すると驚くほど正確であることを示す。一方、これらのデータは、双胎妊娠の各胎児が、概ね、全胎児ｃｆＤＮＡの割合の約半分に寄与するという仮説を裏付ける。このことは、双胎妊娠では胎児ｃｆＤＮＡの２倍量が必要であるという結論を導く。したがって、双胎妊娠のＮＩＰＴ用のｃｆＤＮＡの胎児の割合の望ましい最小値は８％であると考えられる。
一致した遺伝子型を有する一絨毛膜双胎妊娠では（まれな例外を除き、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ １６１Ａ：１８１７）、ひとつの妊娠につき胎児の異数性の検出には４％の胎児ｃｆＤＮＡの割合で十分である。しかしながら、ルーチンのＮＩＰＴ検査サービスでは、一絨毛膜妊娠と二絨毛膜妊娠に対するその様々な質的基準が暗示することに対して、ひとつの重要な問題が示される：絨毛性の判定は、妊娠期間と超音波検査を行う医師の実務経験に依存する。絨毛性は、多胎妊娠の最初の3カ月間に明らかな検出が可能であるが、後期には検出がより困難になる（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００１，Ａｃｔａ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｓｃａｎｄ ８０：２８７）。したがって、双胎妊娠の胎児ｃｆＤＮＡの割合の最小値を一般的に定義することは、より安全な戦略であり、一絨毛膜および二絨毛膜の多胎妊娠に適用することができる。
バニシングツインの同定：
本発明の方法を用いて胎児ｃｆＤＮＡの割合を測定したＮＩＰＴ異数性検査の２つのケースでは、トリソミー２１（それぞれｚスコア１３．５および３．４）を同定したが、本発明の方法で測定した全胎児ｃｆＤＮＡの割合とＹ染色体表現型で測定されたｃｆ−胎児−ＤＮＡ量の間に、著しい矛盾が観察された。
症例Ａでは、本発明の方法で測定した全胎児ｃｆＤＮＡの割合を評価した血液サンプル（第１のサンプルおよびバックアップサンプル）の２つの分析は、それぞれ２０．７％及び２４．８％であった。一方、次世代配列決定法のＹ染色体表現型によると、胎児ｃｆＤＮＡはそれぞれ９．２％および９．３％であった。それは、妊娠が男女双胎妊娠であり、１０週目の超音波検査で、死亡した双子の片方を観察したことが確認された可能性が推測され、医師に報告された。妊娠の第３期に採取した追加の血液サンプル（３８＋２）は、トリソミー２１について陰性となり、Ｙ染色体発現によって測定された胎児ｃｆＤＮＡ量は、ＱｕａｎｔＹｆｅＸによって測定された胎児量と相関し（２１．７％および２１．４）、これは生存している胎児の染色体分析によって決定された男性の性別と一致した。出生時に、細胞培養およびその後のＧＴＧ結合のために、十分な量の細胞が単離できる胎盤組織に紙様児がみられ、トリソミー２１陽性、雌性核型が確認された（４７、ＸＸ、＋２１）。
症例Ｂでは、わずかに増加したＹ染色体表現型がモニターされ、雄性特異的ｃｆ−胎児−ＤＮＡがそれぞれ３．０％および２．７％であることが示された。本発明の方法によって測定された胎児ｃｆＤＮＡの割合の推定値は、測定された胎児の割合の当該矛盾から仮定したそれをはるかに上回るので（１３．４％および１０．０％）、性別が一致しない２つの胎児は、胎児の割合に寄与し、その男性胎児はトリソミー２１に影響される。この示唆は、３．０のカットオフ値付近で上昇したｚスコアと約３％のＹ染色体特異的胎児ｃｆＤＮＡ量の相関に由来した。その検査は明らかに単胎妊娠に求められたので、雄性特異的な胎児ｃｆＤＮＡは、バニシングツイン（おそらく、２１トリソミーのキャリア）に起因すると疑われ、ＮＩＰＴの同意書では、認識されなかったか、または示されなかった。したがって、その結果は、第２１染色体について明らかではないと報告され、矛盾するデータは、超音波を用いたさらなる解明に向けて、バニシングツインの可能性に関する知見を含めて担当医師に報告された。続いて、担当医師は、双胎としてが妊娠が始まり、その後、単胎妊娠として継続したことを確認した。生存している明らかに健康な胎児の性別は女性であることが確認された。したがって、トリソミー２１のためにｚスコアの増加の原因となった胎児ｃｆＤＮＡは、疑いなく、死亡した男性胎児に割り当てることができる。今もなお妊娠は持続しており、まだ生存胎児の胎盤組織および血液のさらなる分析は可能ではない。
実施例２：特異的にメチル化される各領域の同じ検出可能部位を用いて、２つの特異的にメチル化された領域を用いる改良された検出感度。
本発明者らは、驚くべきことに、前記ＤＭＲのそれぞれについて同じ検出可能部位を用いた２つのＤＭＲ（および特異的にメチル化されていない２つの他の領域（ＯＲ））を検出する複合および多重反応が、単一のＤＭＲ（および単一のＯＲ）をそれぞれ検出した従前の検出反応（別々のＰＣＲ反応）よりもｃｆＤＮＡの割合の検出に対してより感受性が高いことを観察した（図４）。
本発明の方法では、（４倍以上の希釈の）同じＤＮＡのアリコートを用いて、２つのＤＭＲ（実施例１に記載のＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３にみられたもの）を検出した。また反応は、２つのＯＲ（実施例１に記載のＲＡＳＳＦ１ＡおよびＴＢＸ３にみられたもの）と実質的に同時に（プローブベースの定量ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ）を用いて）、（ｘ）それぞれの前記ＤＭＲについて同じ検出可能部位、および、（ｙ）前記ＤＭＲに用いられる検出可能部位とは異なる、少なくとも１つの前記ＯＲについて検出可能部位を用いて、行った。一方、各ＤＭＲ（および対応するＯＲ）が別々の反応で独立して検出された場合、胎児ｃｆＤＮＡの割合の検出は、より高いサイクル数（Ｃｐ）での検出に示されるように、比較的感度が低かった。単一の遺伝子座反応のものを除いて、領域／マーカー、プライマー／プローブおよび検出方法は実質的に実施例１に記載されている。所定の遺伝子（ＲＡＳＳＦ１ＡまたはＴＢＸ３）由来のＤＭＲおよびＯＲのみが、単一の反応で、同時に検出された。
反対に、異なる検出可能部位（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子座のＦＡＭ、ＴＢＸ３遺伝子座のＶＩＣ）を用いる２つのＤＭＲの多重反応を用いた胎児ｃｆＤＮＡの割合の検出は、より感度が低く、さらに、ＯＲと同時に検出することが困難であると判断される。理論に拘束されるものではないが、色の補正の比較的高い複雑性のために、別々に検出できる蛍光マーカーの数の制限および／または非常に多くの蛍光マーカーからの「退色」の影響が、同じ反応に存在すると考えられる。
定量的ＰＣＲ検出の指数関数性を考慮すると、また、より高い検出感度（すなわち、より小さいサイクル数）は、標準曲線に対する補正で、より正確性が高い定量と等しく、そして、データのポイントの間の補間は、より高いサイクル数における検出に対応するＤＮＡ量について生じるものよりもより少ない誤差となる。
実施例３：妊娠女性の子癇前症の罹患または発症リスク上昇の検出（理論上の実施例）
本実施例の方法を用いて、以下のように、妊娠女性の子癇前症の罹患または発症のリスクを評価する。第一に、このリスクを評価される女性の血液サンプルを収集し、実施例１に記載した手順に実質的に従い、その血漿サンプルから全ｃｆＤＮＡを抽出する。第二に、実施例１に記載された実質的な方法を用いて、血漿中に存在する胎児ｃｆＤＮＡおよび全ｃｆＤＮＡの相対量および／または絶対量を測定する。胎児および／または全ｃｆＤＮＡの絶対量は、ゲノム当量（「Ｅｑ」）として表すことができる。第三に、その測定されたｃｆＤＮＡおよび／または全ｃｆＤＮＡ量を、閾値量または基準分布量と比較し、胎児ｃｆＤＮＡまたは全ｃｆＤＮＡ量が、そのな閾値を超えているか、および／または、その分布の異常値である場合、当該女性は子癇前症の罹患および／または発症のリスクが上昇していると判定される。
例えば、公表された閾値（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇ ３３：６８２）を用いて、全ｃｆＤＮＡが約７，５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合、または、胎児ｃｆＤＮＡの割合が約５００Ｅｇ／ｍＬ血漿の量を超える場合、当該女性はこのリスクが高いと判断される。このリスクは、下記を考慮することで代替的にまたは付加的に評価される：（ｉ）胎児ｃｆＤＮＡの増加倍率（例えば、１．５倍、３倍、３．５倍または４倍の増加）（当該女性について、閾値と比較して算出する）後期妊娠では、胎児ｃｆＤＮＡの高い増加倍率が使用されることを算定に組み入れる（Ｚｅｙｂｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１３， Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｒｅｓ ３９：６３２）；および／または（ｉｉ）当該女性から算出した胎児ｃｆＤＮＡ量のパーセンタイルは、リスクの低い女性または子癇前症に罹患または発症していない女性で測定された基準分布量の検討から、例えば、胎児ｃｆＤＮＡの割合がその分布の９０パーセンタイルの範囲に含まれる場合、当該女性は軽度または重度の子癇前症に罹患するリスクが高いとみなされる（Ｊａｋｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ５３：１９５６）。
この実施例では、リスクの検出は、図５に示す動作を行うコンピュータプログラム製品を用いて実施される。動作（Ａ）は、胎児ｃｆＤＮＡおよび全ｃｆＤＮＡをそれぞれ表すシグナル（１）および（２）を受信し、当該女性の血漿中に存在する胎児（または全）ｃｆＤＮＡの相対量および／または絶対量を表すパラメータ（４）を決定するためにコンピュータプログラム製品によって使用される。この動作は、任意に、標準ＤＮＡの絶対量を表すシグナル（３）を受信することができる。第２の動作（Ｂ）は、この決定されたパラメータ（４）を閾値量（５）および／または量の基準集団（６）と比較し、その比較に基づいて、当該女性が子癇前症の罹患または発症のリスクが高いと判断されるか否かを判定および報告する（７）。
実施例４：癌患者由来のサンプル中の腫瘍関連ＤＮＡの検出（理論上の実施例）。
ＲＡＳＳＦ１Ａのメチル化およびＥＲ−β（エストロゲンレセプターβ）、ＲＡＲ−β２（レチノイン酸レセプターβ２）および／またはサイクリンＤ２などの少なくとも１つの他のＤＭＲが、腫瘍に由来するｃｆＤＮＡの検出、および、女性が乳癌に罹患するリスクの評価に用いられる。そのＤＭＲの特異的メチル化は、腫瘍由来のｃｆＤＮＡの特徴であり、また本発明の方法は、女性の血漿中の腫瘍由来のｃｆＤＮＡ量の検出および定量に用いられ、そして上昇した（または異常値値の）腫瘍由来ｃｆＤＮＡ量は、乳癌の罹患または発症のリスクが高いと判定される。本質的に、ＤＭＲ２およびＯＲ２がＴＢＸ３ではなく、ＥＲ−β、ＲＡＲ−β２またはサイクリンＤ２の１つに位置することを除いて、実施例３に記載されたプロセスに従う。本発明のこの実施形態で使用される、そのＤＭＲ２およびＯＲ２を検出するプライマーおよびプローブは、当業者によって設計可能である。
この実施例では、実施例３に記載されたものと同じコンピュータプログラム製品を、女性の血液中に存在する腫瘍由来のｃｆＤＮＡ量に基づいて、所定の女性のリスクを評価するために用いることができる。しかし、この実施例では、このパラメータは、対照および乳癌患者に存在する腫瘍由来のｃｆＤＮＡ量の研究に由来する閾値量または分布量と比較する。そして、腫瘍由来のｃｆＤＮＡの量が増加している（または異常値の）女性は、乳癌に罹患または発症するリスクが高いと考えられる。
実施例５：トリソミー２１を検出するＮＩＰＴにおける本発明の方法の使用
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法のさらなる応用が、トリソミー２１の胎児を宿す妊娠女性から得られるｃｆＤＮＡサンプルの同定に使用できることを見出した。
ひとつの多重ＰＣＲ反応において、１３８名の妊娠女性（ヒト）から得られたｃｆＤＮＡサンプル中に存在する胎児の第２１染色体ＤＮＡ種の量を本発明の方法を用いて測定し、そして、ｃｆＤＮＡサンプル中に存在する胎児の第１２染色体ＤＮＡ種の量（基準染色体として）も、本発明の方法を用いて、各妊娠女性に関して測定した。その胎児第２１染色体種およびその胎児第１２染色体種の相対量を比として算出し、正倍数体サンプルの内部標準セットを用いて、操作特異的ｚスコア（ｒｕｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｚ−ｓｃｏｒｅ）分析を実施した。約３より大きいｚスコアを示すサンプルを「陽性」と判定した。図８の第２の散布図は、異常値の陽性サンプルは、１３８のセットのうち、トリソミー２１（「Ｔ２１」）を有する胎児を宿していることが既知の８名の妊娠女性から得たものであることを示す。すべての８つのサンプルは、偽陰性または偽陽性ではないように、うまく分類された。
本実施例の方法では、ヒト第２１染色体上に位置するＤＳＣＡＭ遺伝子（ダウン症の細胞接着分子：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２１，ＧＲＣｈ３８．ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＮＣ＿００００２１．９ ＧＩ：５６８８１５５７７，ｒｅｇｉｏｎ ４００１０９９９ ｔｏ ４０８４７１１３；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２００）に存在するＤＭＲおよびＤＭＲの約３００ｂｐ〜５００ｂｐの間に位置する他の領域を用いて、胎児の第２１染色体ＤＮＡ種の量を決定した。本実施例の方法において、胎児の第１２染色体ＤＮＡ種の量は、ヒト第１２染色体上に位置する（上記の）ＴＢＸ３遺伝子に存在するＤＭＲおよび約１０ＫｂのＤＭＲの間に位置する他の領域を用いて決定した。使用した各ＤＭＲおよびＯＲの配列を表７に記載する。
Figure 2017514499
実施例１に記載のように、１３８名の妊娠女性（Ｔ２１を有する胎児を宿すことが既知である８名を含む）のｃｆＤＮＡサンプルを収集、調製し、ＣｐＧ−メチル化感受性酵素であるＨｈａＩ、ＨｐａＩおよびＢｓｔＵＩを用いて切断した。使用するＰＣＲ緩衝液がＰｅｒｆｅＣＴａ ＭｕｌｔｉＰｌｅｘ ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）であったことを除いて実施例１に記載したように、表８に示すＰＣＲプライマーおよび標識プローブ（クエンチャーを含む）を用いて、各サンプルの複製（ｎ＝６）を、表７に記載の４つの別々の遺伝子座のプローブベースの多重定量ＰＣＲ反応で行った。
Figure 2017514499
このアッセイの構成を図６に概略的に示す。この図のＤＭＲ１およびＯＲ１は、ヒト第２１染色体のＤＳＣＡＭ遺伝子内に位置し、また、この図のＤＭＲ１’およびＯＲ１’は、ヒト第１２染色体のＴＢＸ３遺伝子内に位置している（この実施例では、各染色体は１つのＤＭＲ／ＯＲ対のみで検出される。したがって、この図の（２）および（２’）によって表されるどのような２番目の対も本実施例には含まれない）。表８から分かるように、第２１染色体のＤＭＲのプローブは、第１２染色体のＤＭＲのプローブとは異なり、標識されている（また、各ＯＲは異なって標識される）。これにより、各染色体特異的ＯＲに対する染色体特異的ＤＭＲの相対的定量によって、各染色体特異的ＤＮＡ種に対するｃｆＤＮＡの胎児の割合を別々に計算することができる。そして、各染色体の全ｃｆＤＮＡの絶対量を、試験サンプルとして各ｑＰＣＲプレート（操作）に準備した既知の濃度の標準ＤＮＡの希釈系列（実施例１に記載）から得た各ＯＲのシグナルと比較したサンプルの各ＯＲの絶対量の定量シグナルによって算出した。この相対的および絶対的定量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ソフトウェアリリース１．５．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。胎児ｃｆＤＮＡの第２１染色体ＤＮＡ種の％と胎児ｃｆＤＮＡの第１２染色体ＤＮＡ種の％のサンプル特異的割合の平均［ｎ＝６の複製］を各サンプルについて計算し、そして、各プレートについて、既知の正倍数体サンプルのその割合の全体平均および標準偏差を計算した。そのパラメータから、そのｑＰＣＲプレート（操作）上の全ての試験サンプルを別々に分析し、各試験サンプル（トリソミー２１であることが既知の試験サンプルを含む）の（プレートごとの）Ｚスコアを得た。図８の第２の散布図は、正倍数体サンプルからの全てのトリソミーサンプルの分離を示す各試験サンプルの（プレートごとに計算した）ｚスコアを示す。
実施例６：既知の内部正倍数体標準を参照しないＮＩＰＴにおけるトリソミー２１を検出するための反復ｚスコア分析
本発明者らは、反復ｚスコア法の適用によって、ｚスコア分析の平均と標準偏差の推定について、既知の正倍数体サンプルの参照なく、試験サンプルから全ての既知のトリソミー２１サンプルを同定できた。
実施例５で分析したサンプルの各操作（ｑＰＣＲプレート）のデータを以下のように再解析した。第１に、各サンプルの複製産物（ｎ＝６）の基準染色体に対する第２１染色体の比の平均を計算し、その操作（プレート）に存在するすべてのサンプルについて、全体の平均および標準偏差を、正倍数体であるかトリソミーであるかが既知のサンプルの参照なく算出した。全ての操作にわたる全てのサンプルについて、各サンプルの第１の平均割合を図８の第１の散布図に示した（正倍数体およびＴ２１サンプルを異なる記号でプロットする）。第２に、この操作に特異的な平均値および標準偏差に基づき、操作内に存在する各サンプルの（操作特異的）ｚスコアを算出した。図８の第３の散布図は、全ての実験にわたる全てのサンプルについて、そのマスクされたｚスコアを示す。第３に、約１．９を超えるｚスコアを示すサンプルをデータセットから除外し、データセットの残りのサンプルに関するデータについて、第２の平均値および標準偏差を算出し、そのセットのすべてのサンプルの第２のｚスコア分析の実施に使用した。図８の第４の散布図は、その第１の反復的な除外に続くすべての操作にわたる全サンプルのｚスコアを示す。第４に、第１の反復的な除外の約１．９を超えるｚスコアを示すこれらのサンプルもデータセットから除外し、データセットの残りのサンプルに関するデータについて、第３の平均値および標準偏差を算出し、そのセットのすべてのサンプルの第３のｚスコア分析の実施に使用した。図８の第５の散布図は、その第２の反復的な除外に続くすべての操作にわたる全サンプルのｚスコアを示し、正倍数体であることが事前に既知のあらゆるサンプルを参照することのない、正倍数体とＴ２１サンプルの完全な分離（約３．０より大きいｚスコアで表される）を示す。
上記観点において、本発明はまた、以下の項目に関することが理解される。
１．個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、１つ以上の前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
（ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施される方法。
２．工程（ｂ）および／または工程（ｃ）の前記検出の前にまたはその一部として、前記ＤＭＲおよび／または前記他の領域をそれぞれ含む各ＤＮＡ領域が増幅される、項目１に記載の方法。
３．工程（ｂ）および／または工程（ｃ）で使用される各検出可能な標識が、蛍光、タンパク質、低分子または放射性標識からなる群から独立して選択される、項目１または２に記載の方法。
４．工程（ｂ）の前記検出が、前記ＤＭＲの１つにそれぞれ特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いたプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲを含む、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の１つに特異的である少なくとも１つの標識プローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲを含む、項目１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記他の領域が、少なくとも１つの前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に、および／または、少なくとも１つの前記ＤＭＲと同じ遺伝子内に位置する、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の少なくとも２つを使用することを含み、好ましくは前記他の領域の数は、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの数と同じであり、より好ましくは前記他の領域の１つは、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置し、そして、別の前記他の領域はそれぞれ別の前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する、項目１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．工程（ｃ）の前記検出が、（ｘ）前記他の領域の各々について同一の検出可能な標識、または、（ｙ）前記他の領域の各々について異なる検出可能な標識を用いて実施される、項目７に記載の方法。
９．工程（ｃ）の前記検出が、それぞれが前記他の領域の１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いたプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲを含む、項目７または８に記載の方法。
１０．工程（ｃ）の前記検出および工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、互いに実質的に同時に、そして、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用するプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲによって行われる、項目１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記ＤＮＡ種が、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルが妊娠女性由来であり、好ましくは、前記ＤＮＡ種が循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルが血漿または血清等の血液画分である、項目１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記ＤＭＲが、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの前記試薬に特異的なメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し；好ましくは、
・前記ＤＭＲのそれぞれが、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し；および／または、
・少なくとも１つの前記ＤＭＲが、ＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置するか、もしくは、ＴＢＸ３の約１，６６０ｂｐと２，４００ｂｐの位置の間に位置し；より好ましくは、
・２つ以上の前記ＤＭＲが、ＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置するもの、および、ＴＢＸ３の約１，６６０ｂｐと２，４００ｂｐの位置の間に位置するものを含む；項目１１に記載の方法。
１３．前記他の領域が、ＧＡＰＤＨ，βアクチン，ＡＬＢ，ＡＰＯＥ，ＲＮＡＳＥＰ，ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＴＢＸ３，ＨＬＣＳ，ＺＦＹ，ＣＤＣ４２ＥＰ１，ＭＧＣ１５５２３，ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し；好ましくは、
・前記他の領域が、前記試薬に特異的なメチル化部位を有さない領域を含み、また前記遺伝子座が遺伝子ＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＴＢＸ３に位置し；より好ましくは、
・２つ以上の前記他の領域が検出工程（ｃ）で使用され、そして、ＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置するもの、および、ＴＢＸ３の約１２，４００ｂｐ〜１３，０００ｂｐの位置の間に位置するものを含む；項目１１または１２に記載の方法。
１４．前記妊娠女性が、妊娠関連の疾患に感染しやすく、好ましくは前記妊娠関連の疾患が、子癇前症、早期陣痛、子宮内発育遅延およびバニシングツインからなる群から選択される、項目１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記ＤＮＡ種が、疾患に関連する細胞タイプ由来であり、好ましくはその疾患が、細胞増殖性障害、感染／感染性疾患、消耗性疾患、変性疾患、（自己）免疫不全症、腎疾患、肝疾患、炎症性疾患、急性毒性、慢性毒性、心筋梗塞およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるひとつであり、より好ましくは、前記ＤＮＡ種は循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルは血漿または血清等の血液画分である、項目１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記ＤＮＡ種が、腫瘍細胞由来であり、好ましくはその腫瘍は、肝臓、肺、乳房、結腸、食道、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、脳、骨髄および血液からなる群から選択される組織の癌腫または癌である、項目１５に記載の方法。
１７．前記ＤＭＲが前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、前記ＤＭＲの少なくとも１つが、下記からなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の部分に位置し：腫瘍抑制遺伝子、ｐ１６、ＳＥＰＴ９、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＣ、ＨＳＤ１７Ｂ４およびＨ１Ｃ１；好ましくは、前記２つ以上のＤＭＲの１つがＲＡＳＳＦ１Ａ内に位置し；より好ましくは、前記２つ以上のＤＭＲの１つがＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置し；および／または、より好ましくは、前記他の領域がＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置する、項目１６に記載の方法。
１８．前記サンプルが組織サンプルまたは生物学的液体のサンプルであり、好ましくは、前記サンプルが、全血、血液画分、尿、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択される生物学的液体のサンプルであり；より好ましくは、前記サンプルは血漿または血清サンプルである、項目１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記試薬が、メチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾し、亜硫酸水素塩を含む、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記試薬が、メチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾し、メチル化ＤＮＡと比較して非メチル化ＤＮＡを選択的に消化する薬剤を含み；好ましくは、前記試薬が下記を含む、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法：
・少なくとも１つのメチル化感受性酵素；
・少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素；および／または、
・ＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される薬剤。
２１．前記検出工程の各々が定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の全ＤＮＡに対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．さらに下記工程を含む、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法：
・工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、
・前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを工程（ｃ）で検出したシグナルと比較する工程。
２３．前記検出工程の各々が定量的検出を含み、前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表される、項目２２に記載の方法。
２４．さらに下記工程を含む、項目２１または２２に記載の方法：
・検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程であって、（ｘ）前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、前記個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を示し；および／または、（ｙ）前記閾値を超える前記ＤＮＡ種の量または前記分布からの異常値が、好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別々のアリコートで、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常の診断を実施できることを示す工程。
２５．さらに下記工程を含む、項目２１〜２４のいずれか１つに記載の方法：
・好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別々のアリコートを用いて、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常について診断を行う工程；好ましくは、前記ＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来であり、そして前記診断は出生前診断である。
２６．前記診断が、下記からなる群から選択される検出技術を使用する工程を含み：ＤＮＡ配列決定、ＳＮＰ分析、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーション；好ましくは、前記検出技術が、ＤＮＡの大規模並列配列決定法であり；より好ましくは、前記検出技術が、ランダムおよび／または富化ＤＮＡの大規模並列配列決定法である、項目２５に記載の方法。
２７．下記である、項目２５または２６に記載の方法：
（ｘ）前記ＤＮＡ種が、胎児の細胞および／または胎児の胎盤由来であり、前記サンプルは妊娠女性由来であり、前記異常が、胎児の異常および／または先天性障害に関連する染色体トリソミー等の遺伝子変異または染色体異常であり、好ましくは、
・前記遺伝子変異は、下記からなる群から選択される：色盲、嚢胞性線維症、ヘモクロマトーシス、血友病、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎、鎌状赤血球病、テイ・サックス病；および／または、
・前記染色体異常は、下記からなる群から選択される：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；または、
（ｙ）前記ＤＮＡ種が腫瘍の細胞に由来し、前記異常は、癌腫または癌の診断、予後診断または予測的治療に関連する遺伝的変異または染色体異常であり；好ましくは、
・前記遺伝子変異が、下記からなる群から選択される：腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＴＰ５３（ｐ５３）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣまたはＲＢ１）の変異、癌原遺伝子（例えば、ＲＡＳ、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫまたはＴＲＫ）およびＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＭＧＭＴまたはＰＭＳ２）の変異；および／または、
・染色体異常が転座である（例えば、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）［すなわち，フィラデルフィア染色体もしくはＢＣＬ−ＡＢＬ］、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）、ｔ（１０；（多種））（ｑ１１；（多種））、ｔ（２；３）（ｑ１３；ｐ２５）、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ｔ（９；１２）（ｐ２４；ｐ１３）、ｔ（１２；２１）（ｐ１２；ｑ２２）、ｔ（１１；１８）（ｑ２１；ｑ２１）、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１１．２−１２）、ｔ（１７；２２）、ｔ（１；１２）（ｑ２１；ｐ１３）、ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２）、ｔ（１；１９）（ｑ１０；ｐ１０）、ｔ（７，１６）（ｑ３２−３４；ｐ１１）、ｔ（１１，１６）（ｐ１１；ｐ１１）、ｔ（８，２２）（ｑ２４；ｑ１１）もしくはｔ（２；８）（ｐ１１；ｑ２４））。
２８．前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡでは高度にメチル化され、母体ＤＮＡでは低メチル化されている、項目１１に記載の方法。
２９．前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、母体ＤＮＡに比べて胎児ＤＮＡで高度にメチル化されているとして国際公開第２０１１／０３４６３１号に開示されているもの（例えば、国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜５９、９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および／または２６１）から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、項目２８に記載の方法。
３０．少なくとも１つの前記ＤＭＲが、下記から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜３９，１７６，１７９，１８０，１８４，１８８，１８９，１９０，１９１，１９３，１９５，１９８，１９９，２００，２０１，２０２，２０３，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２２１，２２３，２２５，２２６，２３１，２３２，２３３，２３５，２３９，２４１，２５７，２５８，２５９および／または２６１；好ましくは、下記から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、項目２９に記載の方法：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号３３〜３９，１７６，１７９，１８０，１８４，１８８，１８９，１９０，１９１，１９３，１９５，１９８，１９９，２００，２０１，２０２，２０３，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２２１，２２３，２２５，２２６，２３１，２３２，２３３，２３５，２３９，２４１，２５７，２５８，２５９および／または２６１。
３１．前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、国際公開第２０１１／０９２５９２号に開示されている領域および／または遺伝子（例えば、国際公開第２０１１／０９２５９２号のＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３，ＥＰ４，ＥＰ５，ＥＰ６，ＥＰ７，ＥＰ８，ＥＰ９，ＥＰ１０，ＥＰ１１およびＥＰ１２（配列番号３３〜４４）から成るリストから選択される）に位置する、項目１１または２８に記載の方法。
３２．前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つは、ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、ＥＲＧおよびＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩからなるリストから選択されるかＨＬＣＳである領域および／または遺伝子に位置する、項目１１または２８に記載の方法。
３３．前記ＤＭＲの少なくとも１つが、
・第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなるリストから選択されるヒト染色体、好ましくは、第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体、より好ましくは、第２１染色体に位置する；および／または、
・前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲが、マスピン（好ましくは、胎児とその母親の間で異なるメチル化がされていることが欧州特許第１７５１３０７号に記載されたマスピン（別名「ＳＥＲＰＩＮＢ５」）遺伝子の一部）、ＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、Ｆｅｍ１Ａ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と類似するもの、ＣＧＩ００９、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１またはｆ２９およびＣＧＩ１３からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する；項目１１または項目２８〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＴＢＸ３，ＺＦＹ，ＣＤＣ４２ＥＰ１，ＭＧＣ１５５２３，ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、項目１１または２８に記載の方法。
３５．前記ＤＭＲの少なくとも１つが、国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号４０〜５９および９０〜１６３からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、項目１１または２８に記載の方法。
３６．前記ＤＭＲの少なくとも１つが、
・第１〜１２染色体、第１４〜１７染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２２染色体および第２３染色体からなるリストから選択されるヒト染色体に位置する；および／または、
・前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲは、ＣＤ４８、ＦＡＩＭ３、ＡＲＨＧＡＰ２５、ＳＥＬＰＬＧ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２およびＰＹＣＡＲＤからなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する；項目１１、２８、２９、３４または３５に記載の方法。
３７．複数のＤＮＡ種が前記サンプル中で検出される；好ましくは、前記サンプル中で２種のＤＮＡ種が検出される、項目１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．項目３７に記載の方法であって、
・少なくとも１つの検出工程（ｂ）において：
・２つ以上のＤＭＲの第１のセットにおけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第１のＤＭＲセットにおけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の非存在を示す；好ましくは、前記第１のＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第１のＤＭＲセットの少なくとも１つは、項目３０〜３３のいずれか１つに記載されたものである；そして、
・２つ以上のＤＭＲの第２のセットにおけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第２のＤＭＲセットにおけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の非存在を示す；好ましくは、前記第２のＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第２のＤＭＲセットの少なくとも１つは、項目３４〜３６のいずれか１つに記載されたものである；そして、
・少なくとも１つの検出工程（ｃ）において：
・前記第１のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第１の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第１の全ＤＮＡ量を検出する；前記試薬による第１の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第１の他の領域は、１つ以上のＤＭＲの前記第１のセットの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する；そして、
・前記第２のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第２の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第２のＤＮＡの全量を検出する；前記試薬による第２の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第２の他の領域は、１つ以上のＤＭＲの前記第２のセットの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する。
３９．前記第１および第２のＤＭＲのセットの工程（ｂ）における検出および前記第１および第２の他の領域の工程（ｃ）における前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、そして（ｘ）前記第１および第２のＤＭＲのセットの各々について異なる検出可能な標識；および（ｙ）さらに前記第１および第２の他の領域の各々について異なる検出可能な標識を用いて実施される、項目３８に記載の方法。
４０．前記工程（ｃ）における検出および前記工程（ｂ）における前記検出が、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いて、プローブベースの多重定量リアルタイムＰＣＲで実施される、項目３９に記載の方法。
４１．前記試薬が、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素を含む、項目３７〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記検出工程の各々が、定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、それぞれの他の領域からの前記サンプル中に検出された全ＤＮＡのそれぞれの量に対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される、項目３８〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．さらに下記工程を含む、項目３８〜４１のいずれか１つに記載の方法：
・工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、
・前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを、それぞれの他の領域について工程（ｃ）で検出した各シグナルと比較する工程。
４４．前記検出工程の各々が、定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種のそれぞれの絶対量として表される、項目４３に記載の方法。
４５．さらに下記工程を含む、項目４２または４４に記載の方法：
・（ｘ）２つ以上のＤＭＲの第１のセットで検出された前記第１のＤＮＡ種；および（ｙ）２つ以上のＤＭＲの第２のセットで検出された前記第２のＤＮＡ種の相対量、好ましくは比を決定する工程；および、
・前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、前記サンプル中に存在する前記第１のＤＮＡ種および／または第２のＤＮＡ種に異常が存在することを示し；好ましくは、前記異常が染色体異常であり；より好ましくは、前記染色体異常は、胎児の異常および／または先天性障害に関連し；さらにより好ましくは、前記染色体異常は、下記からなる群から選択され：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；最も好ましくは、前記染色体異常は、例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミーである。
４６．妊娠女性が宿す胎児の染色体異数性を検出する方法であって、下記工程を含む方法：
（Ａ）上記項目のいずれか１つに記載の方法を用いて、前記妊娠女性から採取したサンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第１のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第１のＤＮＡ種が染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第１のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｂ）上記項目のいずれか１つに記載の方法を用いて、前記サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第２のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第２のＤＮＡ種が基準染色体上に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第２のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の量の相対量、好ましくはその比を決定する工程；および、
（Ｄ）前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、胎児の染色体異数性の存在を示す工程。
４７．個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を検出する方法であって、下記工程を含み：
（ｉ）項目２１または２３に記載の方法を実施する工程；および、
（ｉｉ）検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程；
前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、個体の前記疾患の罹患または発症のリスク上昇を示す方法。
４８．下記を含む組成物：
・項目１〜４７のいずれか１つに記載の前記２つ以上のＤＭＲの１つをそれぞれの対が増幅するための２対のＰＣＲプライマー；
・項目１〜４７のいずれか１つに記載の前記他の領域を増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
・項目４に記載の２つの標識プローブ；および、
・項目５に記載の１つの標識プローブ。
４９．さらに下記を含む、項目４８に記載の組成物：
・項目９〜４７のいずれか１つに記載の第２の他の領域を増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、
・項目９に記載の追加の標識プローブ。
５０．下記を含むキット：
・項目４８または４９に記載のプライマーおよびプローブ；および、
・場合により、（ｉ）前記プライマーおよびプローブの使用、項目１〜４７のいずれか１つに記載の方法の実施および／または項目４８または４９に記載の組成物の製造もしくは使用のための指示を含む印刷されたマニュアルまたはコンピュータ読み取り可能なメモリ、および／または、（ｉｉ）項目１〜４７のいずれか１つに記載の方法の実施および／または項目４８または４９に記載の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他の品物、要素または試薬；例えば、本明細書に開示された全てのその品物、要素または試薬（例えば、項目１〜４７のいずれか１つに記載のメチル化および非メチル化ＤＮＡを異なる形で修飾する試薬）。
５１．下記［（ｘ）疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種における異常の診断を実施する場合、前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種を含む個体由来の各々のサンプルにおいて、項目１〜４７のいずれか１つに記載のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを異なって修飾する試薬で処理される該サンプル中に存在するＤＮＡ］を診断するための動作を、実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する複数の命令でコード化されたコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記動作が下記工程を含むコンピュータプログラム製品：
・（ｉ）項目１〜４７のいずれか１つに記載の工程（ｂ）における２つ以上のＤＭＲのメチル化の実質的に同時の定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）項目１〜４７のいずれか１つに記載の工程（ｃ）における少なくとも１つの他の領域を用いた全ＤＮＡの実質的に同時の定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルからパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記ＤＮＡ種（および／または前記全ＤＮＡ）の定量的な量を表す工程；
・前記パラメータを量の閾値及び／又は量の基準分布と比較する工程；および、
・その比較に基づいて、（ｘ）個体における疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇が存在するか否か；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の異常が診断できるか否かの分類を決定する工程。
５２．さらに前記動作が下記工程を含む、項目５１に記載のコンピュータプログラム製品：
・項目２２に記載のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡの定量的検出を表す追加のシグナルを受信する工程；および、
・前記ＤＮＡ種の絶対量を表す前記パラメーターを決定するために、前記シグナルと、項目５１の（ｉｉ）に記載のシグナルとを比較する工程。
５３．前記動作が、前記ＤＮＡ種における異常の診断が行われうるか否かを決定するためのものであり、さらに、前記パラメータから、前記診断の一部として、前記サンプル、好ましくはＤＮＡの別々のアリコートから配列が決定される多量のランダムおよび／または富化されたＤＮＡ分子を決定する工程を含む、項目５１または５２に記載のコンピュータプログラム製品。
５４．前記動作が、下記工程をさらに含む項目５１または５２に記載のコンピュータプログラム製品：
・（ｉ）項目３８〜４６のいずれか１つに記載の工程（ｂ）における２つ以上のセットの第２のＤＭＲのメチル化の定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）項目３８〜４６のいずれか１つに記載の工程（ｃ）における１つの第２の他の領域を用いた全ＤＮＡの定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルから第２のパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記第２のＤＮＡ種の定量的な量を表す工程；
・前記パラメータと前記第２のパラメータの相対量、好ましくは比を決定する工程；
・前記相対量または比を、量もしくは比の閾値及び／又は基準分布と比較する工程；および、
・その比較に基づいて、前記ＤＮＡ種の異常または前記サンプル中に存在する第２のＤＮＡ種の異常の分類を決定する工程；好ましくは、前記異常が染色体異常であり；より好ましくは、前記染色体異常は、胎児の異常および／または先天性障害に関連し；さらにより好ましくは、前記染色体異常は、下記からなる群から選択され：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；最も好ましくは、前記染色体異常は、例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミーである。
５５．個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；および、
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上のＤＭＲで前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記１つ以上のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；
工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、それらのＤＭＲについて実質的に同時に、（ｘ）多重リアルタイム定量ＰＣＲ；および（ｙ）それぞれが前記ＤＭＲの１つに特異的であり、前記ＤＭＲの各々について同じ検出可能な標識で標識される少なくとも２つの標識プローブを用いて実施され；好ましくは、前記試薬は項目２０に記載の薬剤を含む、方法。

Claims (57)

  1. 個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に含み；前記方法は下記工程を含み：
    （ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程；
    （ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている１つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示す工程；および、
    （ｃ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされていない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を検出する工程であって、前記試薬による領域の修飾がＤＮＡのメチル化に非感受性である工程；
    前記他の領域が前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する方法。
  2. 工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲについて検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ｂ）の前記検出が、２つ以上の前記ＤＭＲの使用を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識が使用され、（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識が使用される、請求項３に記載の方法。
  5. 工程（ｂ）および／または工程（ｃ）の前記検出の前にまたはその一部として、前記ＤＭＲおよび／または前記他の領域をそれぞれ含む各ＤＮＡ領域が増幅される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 工程（ｂ）および／または工程（ｃ）で使用される各検出可能な標識が、蛍光、タンパク質、低分子または放射性標識からなる群から独立して選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程（ｂ）の前記検出が、前記ＤＭＲの１つに特異的である少なくとも１つの標識プローブを用いたプローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の１つに特異的である少なくとも１つの標識プローブを用いたプローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記他の領域が、前記ＤＭＲの上流または下流に、下記からなる群から選択される距離内に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法：約１６ｋｂ〜２０ｂｐ，１４ｋｂ〜２０ｂｐ，１２ｋｂ〜２０ｂｐ，１０ｋｂ〜２０ｂｐ，８ｋｂ〜２０ｂｐ，６ｋｂ〜２０ｂｐ，５ｋｂ〜２０ｂｐ，４ｋｂ〜２０ｂｐ，３ｋｂ〜２ｂｐ，１６ｋｂ〜２０ｂｐ，１ｋｂ〜２０ｂｐ，５００ｂｐ〜２０ｂｐ，２００ｂｐ〜２０ｂｐ，２０ｋｂ〜１５ｋｂ，１５ｋｂ〜１０ｋｂ，１２ｋｂ〜８ｋｂ，１０ｋｂ〜８ｋｂ，１１ｋｂ〜７ｋｂ，１１ｋｂ〜１０ｋｂ，９ｋｂ〜８ｋｂ，８ｋｂ〜６ｋｂ，６ｋｂ〜４ｋｂ，４ｋｂ〜２ｋｂ，２ｋｂ〜５００ｂｐ，１ｋｂ〜１００ｂｐ，５００ｂｐ〜５０ｂｐ，４００ｂｐ〜２００ｂｐおよび５００ｂｐ〜１００ｂｐ。
  10. 工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の少なくとも２つを使用することを含み、好ましくは前記他の領域の数は工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの数と同じであり、より好ましくは前記他の領域の１つは、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置し、そして、別の前記他の領域はそれぞれ別の前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程（ｃ）の前記検出が、（ｘ）前記他の領域の各々について同一の検出可能な標識、または、（ｙ）前記他の領域の各々について異なる検出可能な標識を用いて実施される、請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ｃ）の前記検出が、それぞれが前記他の領域の１つに特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いたプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 工程（ｃ）の前記検出および工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、互いに実質的に同時に、そして、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用するプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲによって行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＤＮＡ種が胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルが妊娠女性由来であり、好ましくは、前記ＤＮＡ種が循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルが血漿または血清等の血液画分である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＤＭＲが、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの前記試薬に特異的なメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し、好ましくは、
    ・２つ以上の前記ＤＭＲが検出工程（ｂ）で使用され、前記ＤＭＲのそれぞれが、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＢＸ３、ＨＬＣＳ、ＺＦＹ、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＭＧＣ１５５２３、ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し；および／または、
    ・前記ＤＭＲが、ＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置するか、もしくは、ＴＢＸ３の約１，６６０ｂｐと２，４００ｂｐの位置の間に位置し；より好ましくは、
    ・２つ以上の前記ＤＭＲが検出工程（ｂ）で使用され、ＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐと５，６００ｂｐの位置の間に位置するもの、および、ＴＢＸ３の約１，６６０ｂｐと２，４００ｂｐの位置の間に位置するものを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記他の領域が、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＴＢＸ３，ＨＬＣＳ，ＺＦＹ，ＣＤＣ４２ＥＰ１，ＭＧＣ１５５２３，ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の一部に位置し；好ましくは、
    ・前記他の領域が、前記試薬に特異的なメチル化部位を有さない領域を含み、また前記遺伝子座が遺伝子ＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＴＢＸ３に位置し、より好ましくは、
    ・２つ以上の前記他の領域が検出工程（ｃ）で使用され、そして、ＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置するもの、および、ＴＢＸ３の約１２，４００ｂｐ〜１３，０００ｂｐの位置の間に位置するものを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記妊娠女性が、妊娠関連の疾患に感染しやすく、好ましくは前記妊娠関連の疾患が、子癇前症、早期陣痛、子宮内発育遅延およびバニシングツインからなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＤＮＡ種が、疾患に関連する細胞タイプ由来であり、好ましくはその疾患が、細胞増殖性障害、感染／感染性疾患、消耗性疾患、変性疾患、（自己）免疫不全症、腎疾患、肝疾患、炎症性疾患、急性毒性、慢性毒性、心筋梗塞およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるひとつであり、より好ましくは、前記ＤＮＡ種は循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルは血漿または血清等の血液画分である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＤＮＡ種が、腫瘍細胞由来であり、好ましくはその腫瘍は、肝臓、肺、乳房、結腸、食道、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、脳、骨髄および血液からなる群から選択される組織の癌腫または癌である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＤＭＲが前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、前記ＤＭＲの少なくとも１つが、下記からなる群から選択されるゲノムおよび／または遺伝子の部分に位置し：腫瘍抑制遺伝子、ｐ１６、ＳＥＰＴ９、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＥＳＲ１、ＡＰＣ、ＨＳＤ１７Ｂ４およびＨ１Ｃ１；好ましくは、前記ＤＭＲがＲＡＳＳＦ１Ａ内に位置し、より好ましくは、前記ＤＭＲがＲＡＳＳＦ１Ａの約４，７００ｂｐ〜５，６００ｂｐの位置の間に位置し、および／または、より好ましくは、前記他の領域がＲＡＳＳＦ１Ａの約１４，２２０ｂｐ〜１３，３５０ｂｐの位置の間に位置する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記サンプルが組織サンプルまたは生物学的液体のサンプルであり、好ましくは、前記サンプルが、全血、血液画分、尿、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択される生物学的液体のサンプルであり；より好ましくは、前記サンプルは血漿または血清サンプルである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記試薬が、メチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾し、亜硫酸水素塩を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記試薬がメチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾し、メチル化ＤＮＡと比較して非メチル化ＤＮＡを選択的に消化する薬剤を含み、好ましくは、前記試薬が下記を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法：
    ・少なくとも１つのメチル化感受性酵素；
    ・少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素；および／または、
    ・ＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される薬剤。
  24. 前記検出工程の各々が定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の全ＤＮＡに対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. さらに下記工程を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法：
    ・工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、
    ・前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを工程（ｃ）で検出したシグナルと比較する工程。
  26. 前記検出工程の各々が定量的検出を含み、前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表される、請求項２５に記載の方法。
  27. さらに下記工程を含む、請求項２４または２６に記載の方法：
    ・検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程であって、（ｘ）前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、前記個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を示し；および／または、（ｙ）前記閾値を超える前記ＤＮＡ種の量または前記分布からの異常値が、好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別々のアリコートで、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常の診断を実施できることを示す工程。
  28. さらに下記工程を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法：
    ・好ましくは前記サンプルのＤＮＡの別々のアリコートを用いて、前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常について診断を行う工程；好ましくは、前記ＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来であり、そして前記診断は出生前診断である。
  29. 前記診断が、下記からなる群から選択される検出技術を使用する工程を含み：ＤＮＡ配列決定、ＳＮＰ分析、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーション；好ましくは、前記検出技術が、ＤＮＡの大規模並列配列決定法であり；より好ましくは、前記検出技術が、ランダムおよび／または富化ＤＮＡの大規模並列配列決定法である、請求項２８に記載の方法。
  30. 請求項２８または２９に記載の方法であって、
    （ｘ）前記ＤＮＡ種が胎児の細胞および／または胎児の胎盤由来であり、前記サンプルが妊娠女性由来であり、前記異常が胎児の異常および／または先天性障害に関連する染色体トリソミー等の遺伝子変異または染色体異常であり、好ましくは、
    ・前記遺伝子変異が、下記からなる群から選択される：色盲、嚢胞性線維症、ヘモクロマトーシス、血友病、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎、鎌状赤血球病、テイ・サックス病；および／または、
    ・前記染色体異常が、下記からなる群から選択される：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；または、
    （ｙ）前記ＤＮＡ種が腫瘍の細胞に由来し、前記異常が癌腫または癌の診断、予後診断または予測的治療に関連する遺伝的変異または染色体異常であり、好ましくは、
    ・前記遺伝子変異が、下記からなる群から選択される：腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＴＰ５３（ｐ５３）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣまたはＲＢ１）の変異、癌原遺伝子（例えば、ＲＡＳ、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫまたはＴＲＫ）およびＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＭＧＭＴまたはＰＭＳ２）の変異；および／または、
    ・染色体異常が転座である（例えば、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）［すなわち，フィラデルフィア染色体もしくはＢＣＬ−ＡＢＬ］、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）、ｔ（１０；（多種））（ｑ１１；（多種））、ｔ（２；３）（ｑ１３；ｐ２５）、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ｔ（９；１２）（ｐ２４；ｐ１３）、ｔ（１２；２１）（ｐ１２；ｑ２２）、ｔ（１１；１８）（ｑ２１；ｑ２１）、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１１．２−１２）、ｔ（１７；２２）、ｔ（１；１２）（ｑ２１；ｐ１３）、ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２）、ｔ（１；１９）（ｑ１０；ｐ１０）、ｔ（７，１６）（ｑ３２−３４；ｐ１１）、ｔ（１１，１６）（ｐ１１；ｐ１１）、ｔ（８，２２）（ｑ２４；ｑ１１）もしくはｔ（２；８）（ｐ１１；ｑ２４））、方法。
  31. 前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡでは高度にメチル化され、母体ＤＮＡでは低メチル化されている、請求項１４に記載の方法。
  32. 前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、母体ＤＮＡに比べて胎児ＤＮＡで高度にメチル化されているとして国際公開第２０１１／０３４６３１号に開示されているもの（例えば、国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜５９、９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および／または２６１）から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項３１に記載の方法。
  33. 少なくとも１つの前記ＤＭＲが、下記から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号１〜３９，１７６，１７９，１８０，１８４，１８８，１８９，１９０，１９１，１９３，１９５，１９８，１９９，２００，２０１，２０２，２０３，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２２１，２２３，２２５，２２６，２３１，２３２，２３３，２３５，２３９，２４１，２５７，２５８，２５９および／または２６１；好ましくは、下記から成るリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項３２に記載の方法：国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号３３〜３９，１７６，１７９，１８０，１８４，１８８，１８９，１９０，１９１，１９３，１９５，１９８，１９９，２００，２０１，２０２，２０３，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２２１，２２３，２２５，２２６，２３１，２３２，２３３，２３５，２３９，２４１，２５７，２５８，２５９および／または２６１。
  34. 前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、国際公開第２０１１／０９２５９２号に開示されている領域および／または遺伝子（例えば、国際公開第２０１１／０９２５９２号のＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３，ＥＰ４，ＥＰ５，ＥＰ６，ＥＰ７，ＥＰ８，ＥＰ９，ＥＰ１０，ＥＰ１１およびＥＰ１２（配列番号３３〜４４）から成るリストから選択される）に位置する、請求項１４または３１に記載の方法。
  35. 前記ＤＭＲが、前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＡＩＲＥ、ＳＩＭ２、ＥＲＧおよびＶＡＰＡ−ＡＰＣＤＤＩからなるリストから選択されるかＨＬＣＳである領域および／または遺伝子に位置する、請求項１４または３１に記載の方法。
  36. 前記ＤＭＲの少なくとも１つが、
    ・第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなるリストから選択されるヒト染色体、好ましくは、第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体、より好ましくは、第２１染色体に位置する；および／または、
    ・前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲが、マスピン（好ましくは、胎児とその母親の間で異なるメチル化がされていることが欧州特許第１７５１３０７号に記載されたマスピン（別名「ＳＥＲＰＩＮＢ５」）遺伝子の一部）、ＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、Ｆｅｍ１Ａ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と類似するもの、ＣＧＩ００９、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１またはｆ２９およびＣＧＩ１３からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する；請求項１４または請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＴＢＸ３，ＺＦＹ，ＣＤＣ４２ＥＰ１，ＭＧＣ１５５２３，ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１４または３１に記載の方法。
  38. 前記ＤＭＲの少なくとも１つが、国際公開第２０１１／０３４６３１号の配列番号４０〜５９および９０〜１６３からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記ＤＭＲの少なくとも１つが、
    ・第１〜１２染色体、第１４〜１７染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２２染色体および第２３染色体からなるリストから選択されるヒト染色体に位置する；および／または、
    ・前記試薬に特異的な少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲは、ＣＤ４８、ＦＡＩＭ３、ＡＲＨＧＡＰ２５、ＳＥＬＰＬＧ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２およびＰＹＣＡＲＤからなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１４、３１、３２、３７または３８に記載の方法。
  40. 複数のＤＮＡ種が前記サンプル中で検出される；好ましくは、前記サンプル中で２種のＤＮＡ種が検出される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 請求項４０に記載の方法であって、
    ・少なくとも１つの検出工程（ｂ）において：
    ・第１のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第１のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第１のＤＮＡ種の非存在を示す；好ましくは、前記第１のＤＮＡ種は胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第１のＤＭＲは、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載されたものである；そして、
    ・第２のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の量の存在を示すことに使用され、また前記第２のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在は、前記サンプル中の第２のＤＮＡ種の非存在を示す；好ましくは、前記第２のＤＮＡ種は、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性に由来し、前記第２のＤＭＲは、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載されたものである；そして、
    ・少なくとも１つの検出工程（ｃ）において：
    ・前記第１のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第１の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第１のＤＮＡの全量を検出する；前記試薬による第１の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第１の他の領域は、第１のＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する；そして、
    ・前記第２のＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされない第２の領域を用いて、前記サンプル中に存在する第２のＤＮＡの全量を検出する；前記試薬による第２の他の領域の修飾は、ＤＮＡのメチル化に非感受性であり、前記第２の他の領域は、前記第２のＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に位置する、方法。
  42. 前記第１および第２のＤＭＲの工程（ｂ）における前記検出および前記第１および第２の他の領域の工程（ｃ）における前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、そして（ｘ）前記第１および第２のＤＭＲの各々について異なる検出可能な標識；および（ｙ）さらに前記第１および第２の他の領域の各々について異なる検出可能な標識を用いて実施される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記工程（ｃ）における前記検出および前記工程（ｂ）における前記検出が、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを用いて、プローブベースの多重定量リアルタイムＰＣＲで実施される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記試薬が、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素を含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記検出工程の各々が、定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、それぞれの他の領域からの前記サンプル中に検出された全ＤＮＡのそれぞれの量に対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. さらに下記工程を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法：
    ・工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、
    ・前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを、それぞれの他の領域について工程（ｃ）で検出した各シグナルと比較する工程。
  47. 前記検出工程の各々が、定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種のそれぞれの絶対量として表される、請求項４６に記載の方法。
  48. さらに下記工程を含む、請求項４５または４７に記載の方法：
    ・（ｘ）第１のＤＭＲで検出された前記第１のＤＮＡ種；および（ｙ）第２のＤＭＲで検出された前記第２のＤＮＡ種の相対量、好ましくは比を決定する工程；および、
    ・前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、前記サンプル中に存在する前記第１のＤＮＡ種および／または第２のＤＮＡ種に異常が存在することを示し；好ましくは、前記異常が染色体異常であり；より好ましくは、前記染色体異常は、胎児の異常および／または先天性障害に関連し；さらにより好ましくは、前記染色体異常は、下記からなる群から選択され：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；最も好ましくは、前記染色体異常は、例えばトリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミーである。
  49. 妊娠女性が宿す胎児の染色体異数性を検出する方法であって、下記工程を含む方法：
    （Ａ）上記請求項のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記妊娠女性から採取したサンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第１のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第１のＤＮＡ種が染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第１のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
    （Ｂ）上記請求項のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第２のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第２のＤＮＡ種が基準染色体上に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第２のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
    （Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の量の相対量、好ましくはその比を決定する工程；および、
    （Ｄ）前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、胎児の染色体異数性の存在を示す工程。
  50. 個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を検出する方法であって、下記工程を含み：
    （ｉ）請求項２４または２６に記載の方法を実施する工程；および、
    （ｉｉ）検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程；
    前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、個体の前記疾患の罹患または発症のリスク上昇を示す方法。
  51. 下記を含む組成物：
    ・請求項１〜５０のいずれか一項に記載の前記ＤＭＲを増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
    ・請求項１〜５０のいずれか一項に記載の前記他の領域を増幅するための１対のＰＣＲプライマー；
    ・請求項７に記載の１つの標識プローブ；および、
    ・請求項８に記載の１つの標識プローブ。
  52. さらに下記を含む、請求項５１に記載の組成物：
    ・請求項３〜５０のいずれか一項に記載の第２のＤＭＲを増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、請求項４を引用する場合の請求項７に記載された追加の標識プローブ；および／または、
    ・請求項１０〜５０のいずれか一項に記載の第２の他の領域を増幅するための追加のＰＣＲプライマー対；および、請求項１２に記載の追加の標識プローブ。
  53. 下記を含むキット：
    ・請求項５１または５２に記載のプライマーおよびプローブ；および、
    ・場合により、（ｉ）前記プライマーおよびプローブの使用、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法の実施および／または請求項５１または５２に記載の組成物の製造もしくは使用のための指示を含む印刷されたマニュアルまたはコンピュータ読み取り可能なメモリ、および／または、（ｉｉ）請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法の実施および／または請求項５１または５２に記載の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他の品物、要素または試薬；例えば、本明細書に開示された全てのその品物、要素または試薬（例えば、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のメチル化および非メチル化ＤＮＡを異なる形で修飾する試薬）。
  54. 下記［（ｘ）疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種における異常の診断を実施する場合、前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種を含む個体由来の各々のサンプルにおいて、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを異なって修飾する試薬で処理される該サンプル中に存在するＤＮＡ］を診断するための動作を、実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する複数の命令でコード化されたコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記動作が下記工程を含むコンピュータプログラム製品：
    ・（ｉ）請求項１〜５０のいずれか一項に記載の工程（ｂ）における１つ以上のＤＭＲのメチル化の定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）請求項１〜５０のいずれか一項に記載の工程（ｃ）における少なくとも１つの他の領域を用いた全ＤＮＡの定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
    ・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルからパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記ＤＮＡ種の定量的な量を表す工程；
    ・前記パラメータを量の閾値及び／又は量の基準分布と比較する工程；および、
    ・その比較に基づいて、（ｘ）個体における疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇が存在するか否か；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の異常が診断できるか否かの分類を決定する工程。
  55. さらに前記動作が下記工程を含む、請求項５４に記載のコンピュータプログラム製品：
    ・請求項２５に記載のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡの定量的検出を表す追加のシグナルを受信する工程；および、
    ・前記ＤＮＡ種の絶対量を表す前記パラメーターを決定するために、前記シグナルと、請求項５４の（ｉｉ）に記載のシグナルとを比較する工程。
  56. 前記動作が、前記ＤＮＡ種における異常の診断が行われうるか否かを決定するためのものであり、さらに、前記パラメータから、前記診断の一部として、前記サンプル、好ましくはＤＮＡの別々のアリコートから配列が決定される多量のランダムおよび／または富化されたＤＮＡ分子を決定する工程を含む、請求項５４または５５に記載のコンピュータプログラム製品。
  57. 前記動作が、下記工程をさらに含む請求項５４または５５に記載のコンピュータプログラム製品：
    ・（ｉ）請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の工程（ｂ）における第２のＤＭＲのメチル化の定量的検出を表す１つのシグナル；および、（ｉｉ）請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の工程（ｃ）における１つの第２の他の領域を用いた全ＤＮＡの定量的検出を表す１つのシグナルを受信する工程；
    ・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルから第２のパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記第２のＤＮＡ種の定量的な量を表す工程；
    ・前記パラメータと前記第２のパラメータの相対量、好ましくは比を決定する工程；
    ・前記相対量または比を、量もしくは比の閾値及び／又は基準分布と比較する工程；および、
    ・その比較に基づいて、前記ＤＮＡ種の異常または前記サンプル中に存在する第２のＤＮＡ種の異常の分類を決定する工程；好ましくは、前記異常が染色体異常であり；より好ましくは、前記染色体異常は、胎児の異常および／または先天性障害に関連し；さらにより好ましくは、前記染色体異常は、下記からなる群から選択され：トリソミー（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３）、性染色体異常（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、［ヌーナン症候群］、トリプルＸ症候群、ＸＸＹ症候群または脆弱性Ｘ症候群またはＸＹＹ症候群またはＸＸＹＹ症候群）、染色体欠失（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、Ｃｒｉｓ−ｄｕ−Ｃｈａｔ症候群、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群または２２ｑ１１欠失症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー）、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｃａｎｖａｎ症候群および神経線維腫症；最も好ましくは、前記染色体異常は、例えば、トリソミー２１、トリソミー１８またはトリソミー１３からなるリストから選択されるトリソミーである。
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