CN114929893A - 差异定量核酸的方法 - Google Patents

差异定量核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114929893A
CN114929893A CN202080059783.4A CN202080059783A CN114929893A CN 114929893 A CN114929893 A CN 114929893A CN 202080059783 A CN202080059783 A CN 202080059783A CN 114929893 A CN114929893 A CN 114929893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acids
nucleic acid
detection probes
signal
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080059783.4A
Other languages
English (en)
Inventor
C·麦克唐纳
L·杰基
A·拉贾戈帕尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ziromacode Ltd
Original Assignee
Ziromacode Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ziromacode Ltd filed Critical Ziromacode Ltd
Publication of CN114929893A publication Critical patent/CN114929893A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的核酸的方法包括在甲基化敏感限制酶的溶液中形成消化的生物样品以切割一组未甲基化的核酸，形成反应混合物，扩增反应混合物以产生来自一组检测探针的第一信号和来自第二组检测探针的第二信号，确定包括源自第一信号的第一值与源自第二信号的第二值的比率，和鉴定生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例。

Description

差异定量核酸的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月24日提交的美国临时专利申请号62/865,832；2019年8月19日提交的美国临时专利申请号62/888,964；以及于2019年8月19日提交的美国临时专利申请号62/888,966的优先权，出于所有目的，通过引用将其全部内容并入本文。
背景技术
基因内特定核酸靶标(一个或多个)的检测和分析可揭示关于该基因的受试者供体的重要信息，比如受试者可能患有特定遗传疾病的可能性，或患有特定遗传疾病的易感性。通常，聚合酶链式反应(PCR)可用于扩增核酸以进行分析。数字PCR(dPCR)是一种可用于检测和定量核酸的PCR。当基于dPCR的扩增中存在两个或多个靶标时，使用比较片段大小、甲基化状态和/或SNP检测对两个或多个靶标进行定量区分，可以提供有关样品中靶标相对丰度的重要见解。传统的PCR方法在有效区分和定量这些多个靶标的能力方面受到限制。
发明内容
本文公开的技术涉及用于差异定量生物样品中的核酸的方法和系统。在实施方式中，差异定量核酸可以包括使用差异甲基化基因座。例如，在实施方式中，使用差异甲基化基因座差异定量核酸的方法可以包括提供甲基化敏感限制酶的溶液，提供具有第一多个核酸和第二多个核酸的生物样品，和通过将生物样品和溶液结合形成消化的生物样品。第一多个核酸和第二多个核酸可以各自包括一组甲基化的核酸和一组未甲基化的核酸。形成消化的生物样品可能涉及用甲基化敏感限制酶切割所述一组未甲基化的核酸。该方法还可以包括通过将消化的生物样品与例如下述物质结合形成反应混合物：配置为扩增第一多个核酸和第二多个核酸的一组扩增寡聚物，配置为与第一多个核酸的区域退火的第一组检测探针，和配置为与第二多个核酸的区域退火的第二组检测探针。
在一些实例中，该方法包括扩增反应混合物以产生来自第一组检测探针的第一信号和来自第二组检测探针的第二信号；确定包括源自第一信号的第一值与源自第二信号的第二值的比率，和鉴定生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例。在一些实施方式中，鉴定生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例进一步包括确定生物样品中甲基化核酸的分数。在一些实施方式中，确定生物样品中甲基化核酸的分数包括将该比率与参考值进行比较。在一些实施方式中，甲基化敏感限制酶可以包括HpaII。在一些实施方式中，甲基化敏感限制酶可以包括HpaII、AatII、AccII、Aor13HI、Aor51HI、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HhaI、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI和SnaBI中的一种或多种。
在一些实施方式中，该方法可以包括将反应混合物分配到反应体积中。在一些实施方式中，将反应混合物分配到反应体积中在扩增之前进行。在一些实施方式中，第一信号和第二信号各自可以包括从包含来自第一多个核酸和第二多个核酸中的每一个的扩增子的扩增反应体积的总数产生的累积信号测量值。在一些实施方式中，第一信号和第二信号各自可以包括从第一多个核酸和第二多个核酸中的每一个产生的累积信号测量值，其中反应体积未被定量。在一些实施方式中，第一信号和第二信号是从包含来自第一多个核酸和第二多个核酸中的每一个的一个阳性扩增子的扩增反应体积的总数产生的累积信号测量值。在实施方式中，第一信号和第二信号可以在单个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一信号和第二信号可以在多于一个荧光通道中产生。在一些实施方式中，反应混合物还可以包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和/或三磷酸脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方式中，该组扩增寡聚物可以包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物。在一些实施方式中，该组扩增寡聚物可以结合并扩增第一多个核酸的区域和第二多个核酸的区域。在一些实施方式中，可以同时使用多于一组的扩增寡聚物。例如，第一组扩增寡聚物可用于扩增第一多个核酸。类似地，在一些实施方式中，第二组扩增寡聚物可用于扩增第二多个核酸。
在实施方式中，生物样品可以包括来自一种或多种生物体的基因组DNA。例如，生物样品可以包括来自孕妇的全血。在一些实施方式中，全血可以包括母体核酸和胎儿核酸两种。第一多个核酸可以包括胎儿核酸序列和第二多个核酸可以包括母体核酸序列。
在实施方式中，第一组检测探针和第二组检测探针各自可以进一步包括选自化学发光标记、荧光标记或其任意组合的可检测标记。在一些实施方式中，第一组检测探针和第二组检测探针可以各自包括猝灭剂。该比率可以包括含有第一多个核酸和第二多个核酸二者的多个核酸。该比率可以在不定量第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定。在一些实施方式中，可以将该比率与预定参考值进行比较以便产生数量。
在实施方式中，第一组检测探针可以配置为检测与胎儿非整倍性相关的核酸区域。例如，该区域可以包括22号染色体、21号染色体、18号染色体、13号染色体、9号染色体、8号染色体和/或X染色体的区域。
本公开内容的一些实施方式提供了使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的核酸的试剂盒。试剂盒可以包括甲基化敏感限制酶、配置为扩增第一多个核酸和第二多个核酸的一组扩增寡聚物、配置为与第一多个核酸退火的第一组检测探针和配置为与第二多个核酸退火的第二组检测探针。在一些实例中，该组扩增寡聚物可以包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物。第一组检测探针和第二组检测探针可各自含有可检测标记。在一些实施方式中，试剂盒可以包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和/或三磷酸脱氧核糖核苷酸。可检测标记可选自化学发光标记、荧光标记或其任意组合。在一些实例中，第一组检测探针和第二组检测探针可以各自包括猝灭剂。
在实施方式中，提供了使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的胎儿分数的试剂盒。试剂盒可以包括甲基化敏感限制酶、配置为扩增多个胎儿核酸和多个母体核酸的一组扩增寡聚物、配置为与第一多个胎儿核酸退火的第一组检测探针和配置为与第二多个母体核酸退火的第二组检测探针。在一些实例中，该组扩增寡聚物可以包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物，其中该组扩增寡聚物可以扩增第一多个核酸和第二多个核酸的区域。该试剂盒也可包含多于一组的扩增寡聚物，其可以扩增第一多个核酸和第二多个核酸的其他区域。第一组检测探针和第二组检测探针可以各自包括可检测标记。在一些实施方式中，可检测标记可以是化学发光标记、荧光标记或其任意组合。在一些实施方式中，第一组检测探针和第二组检测探针可以各自包括猝灭剂。在一些实例中，试剂盒可以包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和/或三磷酸脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，甲基化敏感限制酶可以包括HpaII、AatII、AccII、Aor13HI、Aor51HI、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HhaI、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI或SnaBI。
附图说明
根据一个或多个不同的实施方式，参考以下附图详细描述了本文公开的技术。提供附图仅用于说明的目的并且仅描绘所公开技术的典型或示例实施方式。提供这些附图是为了便于读者理解所公开的技术，并不应被视为对其广度、范围或适用性的限制。应当注意，为了清楚和便于说明，这些图不一定按比率绘制。
图1通过举例图解了根据本文公开的各种实施方式的差异甲基化敏感限制酶消化和随后的扩增。
图2是图解根据本公开内容的实施的使用甲基化敏感限制酶差异定量核酸的示例方法的操作流程图。
图3是图解根据本公开内容的实施方式的使用片段大小分布差异定量核酸的示例方法的操作流程图。
图4A通过举例图解了根据本文公开的各种实施方式经由片段大小分布的差异定量。
图4B通过举例图解了根据本文公开的各种实施方式经由片段大小分布的差异定量。
图5是图解根据本公开内容的实施的用于差异定量核酸单核苷酸多态性的示例方法的操作流程图。
图6图解了根据本公开内容的各种实施方式的可用于实施架构和方法的计算机部件。
图7通过举例图解了根据本公开内容的各种实施方式的使用片段大小分布的模拟。
图8通过举例图解了根据本公开内容的各种实施方式的使用片段大小分布的模拟。
图9通过举例图解了根据本公开内容的各种实施方式，将片段大小分布用于非侵入性产前测试应用。
图10通过举例图解了根据本公开内容的各种实施方式的使用单核苷酸多态性的模拟。
附图并非旨在穷举或将本发明限制为所公开的确切形式。应当理解，本发明可以有各种修改和变化来实施，并且所公开的技术仅受权利要求及其等同物的限制。
具体实施方式
以下描述提供了用于全面理解和实现对技术的各种实施方式的描述的具体细节。所使用的术语旨在以其最广泛合理的方式进行解释，即使在其与某些实施方式的详细描述结合使用时也是如此。
本文公开的技术涉及使用聚合酶链式反应(PCR)技术并通过使用核酸之间存在的固有差异(包括它们的比较片段大小、甲基化状态和/或单核苷酸多态性(SNP))差异定量生物样品中的核酸的方法和系统。PCR是一种在反应混合物中使用核酸聚合酶和引物对特定核酸靶标进行指数扩增的方法。引物是与靶标序列的正链和负链的3'序列互补的短单链寡核苷酸。反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链核酸靶标变性或分裂成单链模板。在冷却循环中，引物与模板上的互补序列结合。模板引发后，核酸聚合酶会创建原始模板的拷贝。重复循环使靶标序列指数扩增2倍，每个循环导致靶标序列在30个循环中增加约十亿倍。
数字PCR(dPCR)是将含有一个或多个靶标的样品分成多个分区(例如孔、液滴等)，在每个分区中进行PCR反应，并记录由例如靶标特异性报告探针产生的发光(例如，荧光)的过程。使用标记的寡核苷酸探针能够进行特异性检测。数字PCR通常在数字PCR仪器上进行，该仪器通过一个或多个激发/发射滤光片组测量来自光通道中每个分区的荧光。数字PCR不限于荧光，并且可用于多种核酸检测方法。
引物或“扩增寡聚物”在本文中可互换使用，是指被配置为结合另一核酸并促进一种或多种反应，例如转录、核酸合成和核酸扩增的寡核苷酸或核酸。引物可以是单链的。引物可以是正向引物或反向引物。正向引物和反向引物可以是与双链核酸的相反链结合的引物。例如，正向引物可结合源自核酸的第一链(例如，沃森链(Watson strand))的区域，而反向引物可结合源自核酸的第二链(例如，克里克链(Crick strand))的区域。正向引物可以结合相对于反向引物更接近基因起始位点的区域，或者可以结合相对于反向引物更接近基因的末端位点。正向引物可结合核酸的编码链或可结合核酸的非编码链。反向引物可结合核酸的编码链或可结合核酸的非编码链。
靶标特异性寡核苷酸探针(一种或多种)，在本文中也称为“检测探针”，是展现与扩增的靶标的一条链互补的短的寡核苷酸。探针缺乏3'羟基，并且因此不能被DNA聚合酶延伸。
Figure BDA0003516399940000041
(ThermoFisher Scientific)化学是用于多重实时PCR的常见报告探针方法。TaqMan寡核苷酸探针可以用荧光团和猝灭标签(即猝灭剂)共价修饰。在这种配置中，荧光团产生的荧光可能会被猝灭，并且可能无法被实时PCR仪器检测到。当存在感兴趣的靶标时，探针寡核苷酸可以与扩增的靶标碱基配对。当结合时，它可能会被Taq聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性消化，从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号供实时PCR仪器检测。
可以通过将每个核酸靶标编码为独特的强度值或值范围来进行单次测量中多个核酸靶标的多重分析。例如，当使用单次测量检测样品中的多个核酸靶时，可以提供不同浓度的寡核苷酸探针，使得由探针产生的每个信号的强度，无论是单独的还是组合的，都是独特的。该信号也可能类似于反应中的其他扩增子的信号，其中多个靶标设置为相同的强度水平。
如本文所使用的，术语“通道”、“颜色通道”或“光通道”是指波长范围。波长范围可以基于去除或“过滤掉”特定波长的特定滤光器来设置或确定。术语“通道”、“颜色通道”和“光通道”可以互换使用。
本文提供了用于差异定量生物样品中的核酸的方法。在实施方式中，本公开内容提供了用于明确检测样品中核酸靶标的存在或缺失的方法，该样品可以包括多种核酸。例如，在实施方式中，差异定量核酸可以包括使用差异甲基化基因座。在一些实施方式中，用于富集和定量生物样品中的核酸靶标的方法可以包括使用与甲基化敏感限制酶(MSRE)偶联的dPCR反应差异地切割核酸上的高甲基化位点，然后扩增。例如，可能包括未甲基化的无细胞DNA(即，cfDNA)的特定多个核酸可以与未知量的高甲基化DNA混合。在实施方式中，也可以使用其他PCR应用，包括例如qPCR。
在一些实施方式中，差异定量生物样品中的核酸可以包括使用比较片段大小分布。例如，本公开内容提供了通过构建由多个探针组成的测定来提高在PCR反应中包括多个核酸的样品中多个核酸靶标的比较定量的准确度的方法，在一些实施方式中，这些探针可以是连续的，其中短片段大小的中心探针可以配置为与第一核酸靶标退火，并且其中中心探针在配置为与第二核酸靶标退火的两个附加探针侧翼，其中所述第二核酸靶标可以或可以不包括第一核酸靶标的特定核苷酸序列，从而提供第一和第二核酸靶标的相对丰度的荧光比。
本公开内容的一些实施方式提供了通过使用混合DNA样品中表现出与核酸靶标的核酸靶标区域侧翼的多核苷酸区域互补性的捕获寡核苷酸的选择性富集来提高PCR反应中样品中的多个核酸靶标的比较定量的准确度的方法。
在一些实例中，差异定量生物样品中的核酸可以包括使用单核苷酸多态性(SNP)。例如，使用dPCR(和/或qPCR)估计核酸样品中核酸靶标片段大小的方法可以包括在每个检测通道中编码多个SNP并基于理想化的SNP分布定量相对比率。本文描述的各种方法也可以通过使用试剂盒来实施。
本文描述的各种方法和系统可用于多种应用，包括例如非侵入性产前测试(NIPT)，其中检查胎儿出生时具有某些遗传异常的风险。怀孕女性的血液含有母体DNA和一定水平的无细胞胎儿DNA，或已进入母亲的血液的来自胎盘的DNA。本文描述的方法和系统可用于检测和测量循环胎儿DNA，以确定胎儿是否会在出生时具有遗传异常。例如，本文公开的方法和系统可用于确定胎儿是否显示出大量的21、13或18号染色体，这可能表明胎儿在胎儿的每个细胞中可能具有这些染色体之一的额外拷贝，而不是通常的两个拷贝。例如，具有额外的21号染色体会导致唐氏综合症，这是一种以智力和身体残疾为特征的疾病，包括认知延迟、心脏缺陷以及患阿尔茨海默病的风险增加。
使用差异甲基化基因座的差异定量
甲基化敏感限制酶(MSRE)可用于区分生物样品中的一种或多种核酸靶标。MSRE是对识别基序中碱基的甲基化状态敏感并基于该甲基化状态差异切割位点的限制性核酸内切酶。可用于本文描述的方法和系统的MSRE的实例包括但不限于HpaII、AatII、AccII、Aor13HI、Aor51HI、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HhaI、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI和SnaBI等。
DNA甲基化是重要的表观遗传过程。在DNA复制过程期间，在甲基化(CpG胞嘧啶)中在5位胞嘧啶的嘧啶环上添加了一个甲基(5-甲基胞嘧啶)。MSRE是对识别基序中碱基的甲基化状态敏感并基于CpG序列中胞嘧啶残基的甲基化状态差异地切割位点的限制性核酸内切酶。因为这些限制性内切酶不能切割甲基化胞嘧啶残基，所以消化后甲基化DNA保持完整，而未甲基化胞嘧啶DNA片段被消化。因此，可以富集和选择甲基化DNA以进行后面的MSRE消化以及随后的扩增和检测。
图1通过举例图解了根据本文公开的各种实施方式的差异MSRE消化和随后的扩增。切割的DNA 101包括在扩增前已通过MSRE消化的未甲基化DNA。由于胞嘧啶残基的甲基化状态，未切割的DNA 102在用MSRE消化后保持完整。消化后，未切割的DNA 102可被扩增和富集以用于例如dPCR应用。在一些实施方式中，也可以使用其他PCR应用(例如qPCR)。
图2是图解使用甲基化敏感限制酶差异定量核酸的示例方法的流程图。根据本公开内容的各种实施方式，概括地讲，可以执行方法200以差异定量核酸。在实施方式中，方法200提供了使用MSRE由第二多个核酸中差异定量第一多个核酸的手段。本文描述的各种方法的操作不一定限于图中描述或示出的顺序，并且本领域技术人员在研究本公开内容后将理解，在本公开内容的精神和范围内的本文描述的操作顺序的变化。应当理解，方法200的操作可以执行多次。
在操作210，生物样品中的第一多个核酸和第二多个核酸被MSRE消化。在实施方式中，第一多个核酸和第二多个核酸可以源自多于一种生物体，其中每个生物体贡献多个核酸。在一些实施方式中，第一多个核酸和第二多个核酸可以源自多于一个来源。在一些实施方式中，第一多个核酸和第二多个核酸可以源自单一来源。例如，在一些实例中，生物样品可以包括怀孕女性的全血。在一些实施方式中，第一多个核酸可以包括胎儿核酸，包括例如无细胞胎儿DNA。在一些实施方式中，第二多个核酸可以包括母体核酸，包括例如无细胞母体DNA。在一些实施方式中，方法200可用于对生物样品中的胎儿核酸靶标和母体核酸靶标进行差异定量。在实施方式中，第一多个核酸可以源自胎儿核酸靶标，并且第二多个核酸可以源自母体核酸靶标。
在操作210，可以消化第一多个核酸和第二多个核酸。在一些实例中，操作210期间的消化可以包括包含甲基化敏感限制酶(MSRE)例如HpaII的溶液，其中该溶液与包括第一多个核酸和第二多个核酸的生物样品组合。在一些实施方式中，可以在PCR扩增之前将溶液和生物样品组合以切割未甲基化DNA，同时保留甲基化DNA完整。
例如，操作210可以包括在PCR扩增之前用甲基化敏感限制酶比如HpaII预处理无细胞DNA以切割未甲基化DNA，同时保持甲基化的无细胞DNA完整。在实施方式中，MSRE可以在消化后失活和/或变性。例如，MSRE可以通过加热(即，热杀死)而失活或变性。在一些实施方式中，MSRE的失活发生在PCR扩增之前。在一些实例中，MSRE的失活发生在形成反应混合物之前。应当理解，生物样品可以包括DNA和/或cDNA。生物样品可以源自多于一种生物体。在一些实施方式中，生物样品可以源自血液、汗液、尿液、眼泪或任何其他身体分泌物。此外，在一些实施方式中，生物样品可以从人或一些其他动物获得。
在消化生物样品之后，在一些实施方式中，可以用以下形成反应混合物：配置为扩增第一多个核酸和第二多个核酸的一组扩增寡聚物(跨越第一和第二核酸靶标二者的MSRE识别基序)；配置为与第一多个核酸的区域退火的第一组检测探针；和配置为与第二多个核酸的区域退火的第二组检测探针。在一些实施方式中，第一多个核酸可以包括胎儿核酸序列，其中多个核酸包括胎儿的遗传物质。在一些实施方式中，第二多个核酸可以包括母体核酸序列，其中多个核酸包括怀孕女性的遗传物质。在一些实施方式中，核酸序列扩增可以包括与胎儿非整倍性相关的核酸区域。例如，在实施方式中，区域可以包括22号染色体、21号染色体、18号染色体、13号染色体、9号染色体、8号染色体或X染色体的区域。在一些实施方式中，反应混合物可以进一步包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸中的一种或多种。
在实施方式中，一旦生物样品被消化并且反应混合物形成，反应混合物可以被分配到反应体积(例如，孔、微孔、液滴等)中。例如，在一些实施方式中，扩增可以在乳液中的液滴中进行。扩增可以在微孔中进行。在一些实施方式中，样品可以被分配到多个反应体积中。
在操作220，包括消化的核酸的反应混合物被扩增。在一些实施方式中，反应混合物可被分配到反应体积中并被扩增。在一些实施方式中，可以同时扩增多于一个的反应体积。在实施方式中，一旦反应混合物被分配到反应体积中，反应体积然后可以进行PCR扩增，由此该组扩增寡聚物(跨越MSRE识别基序)将扩增甲基化DNA链而不是未甲基化DNA链。在实施方式中，该方法可用于数字PCR和/或qPCR测定以富集与低甲基化DNA相比高度甲基化DNA的分数。
在一些实施方式中，操作220可以包括配置为扩增具有给定长度的第一多个核酸和第二多个核酸二者(例如，可以与相距一定距离的核酸序列的区域杂交)的一组扩增寡聚物(即，正向引物和反向引物)。例如，一组扩增寡聚物可以配置为扩增长度为50至300个碱基对或更多的第一多个核酸。在一些实例中，一组扩增寡聚物可以配置为扩增长度约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个碱基对的第一多个核酸。
在一些实例中，操作220可以包括可以配置为扩增长度可以长于或不长于第一多个核酸的第二多个核酸的一组扩增寡聚物。在一些实施方式中，一组扩增寡聚物可以配置为扩增长度长于第一多个核酸的第二多个核酸(即，包含更多数量的核酸碱基)(例如，可以与相距给定距离的核酸序列的区域杂交)。在一些实施方式中，一组扩增寡聚物可以配置为扩增长度为300至750个碱基对或更多的第二多个核酸。在一些实施方式中，该组扩增寡聚物可以配置为扩增长度约300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、750个碱基对的第二多个核酸。
在实施方式中，可以存在多于一组的扩增寡聚物，其可以差异地检测和扩增多于一种的多个核酸。
在实施方式中，操作220可以包括可以配置为与给定长度的第一多个核酸的区域退火的第一组检测探针。在一些实施方式中，第一组检测探针可以包括非靶标杂交序列。在一些实施方式中，第一组检测探针可以包括分子信标、分子炬和/或可检测标记。在一些实施方式中，可检测标记可以包括化学发光标记。在一些实施方式中，可检测标记可以包括荧光标记。在一些实施方式中，第一组检测探针可以包括猝灭剂。
在实施方式中，操作220可以包括可以配置为与第二多个核酸(其长度可以长于或不长于第一核酸序列)退火的第二组检测探针。在一些实施方式中，第二组检测探针可以包括非靶标杂交序列。在一些实施方式中，第二组检测探针可以包括分子信标、分子炬和/或可检测标记。在一些实施方式中，可检测标记可以包括化学发光标记。在一些实施方式中，可检测标记可以包括荧光标记。在一些实施方式中，第二组检测探针可以包括猝灭剂。
在实施方式中，第一组检测探针可以配置为与第一多个核酸退火，其在一些实施方式中可以包括胎儿核酸序列。在一些实施方式中，第一组检测探针可以配置为与胎儿核酸序列的区域退火并检测胎儿核酸序列的区域。在一些实施方式中，第一组检测探针可以配置为与胎儿核酸序列的区域退火并检测胎儿核酸序列的区域，其中该区域与胎儿非整倍性相关。
在实施方式中，第二组检测探针可以配置为与第二多个核酸退火，其在一些实施方式中可以包括母体核酸序列。在一些实施方式中，第二组检测探针可以配置为与母体核酸序列的区域退火并检测母体核酸序列的区域。在一些实施方式中，第二组检测探针可以配置为与母体核酸序列的区域退火并检测母体核酸序列的区域，其中该区域与胎儿非整倍性相关。
在扩增之后，可以在操作230鉴定核酸靶标。在实施方式中，操作230可以涉及使用信号。在实施方式中，反应体积的扩增导致来自第一组检测探针的第一信号和来自第二组检测探针的第二信号的产生。在一些实施方式中，第一信号和第二信号各自可以包括从包含来自第一多个核酸和第二多个核酸中的每一个的扩增子的扩增反应体积的总数产生的累积信号测量值。在一些实施方式中，第一信号和第二信号各自可以包括从第一多个核酸和第二多个核酸中的每一个产生的累积信号测量值，其中反应体积未被定量。在一些实施方式中，来自各个检测探针的信号可用于确定比率。在实施方式中，比率可以包括源自第一信号的第一值比源自第二信号的第二值。在一些实施方式中，该比率可以包括来自第一信号的第一值比来自第二信号的第二值，其中来自各个信号的值不包括从扩增反应体积的总数产生的定量总和。
在一些实施方式中，第一信号可以在单个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一信号可以在多于一个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第二信号可以在单个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第二信号可以在多于一个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一信号和第二信号可以在单个荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一信号和第二信号可以在多于一个荧光通道中产生。
在实施方式中，操作230可以涉及鉴定生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例。在一些实施方式中，鉴定生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例可以包括确定生物样品中甲基化核酸的分数。在一些实例中，确定生物样品中甲基化核酸的分数可以包括将该比率与参考值进行比较。在实施方式中，参考值可以在执行本方法之前预先确定。例如，参考值可以代表已知的值或数量(例如，标准)，可以将其与该比率进行比较。参考值可以从不同的DNA定量方法或机器例如分光光度计获得。将比率与参考值进行比较本身可以经由机器(例如，计算机实施)来执行。在实施方式中，操作230可涉及将甲基化核酸的比例与未甲基化核酸的比例进行比较。在一些实施方式中，操作230可以包括鉴定差异甲基化核酸序列的特定区域与同质甲基化的其他特定区域。
本文公开的方法和系统可用于各种系统，包括例如非侵入性产前测试(NIPT)。NIPT是确定胎儿出生时患有某些遗传异常的风险的重要方法。然而，由于NIPT测量对循环胎儿DNA的片段进行计数，因此无法捕获足够的循环胎儿DNA进行检查常常会阻碍测试。然而，通过鉴定胎盘DNA中高度甲基化的位点，本文公开的方法和系统可用于差异地检测胎儿cfDNA。因此，本文公开的技术可用于富集胎儿分数以减少母体背景中高置信度三体型调用所需的染色体计数总数。
本文公开的各种方法和系统也可以通过使用试剂盒来实施。例如，在实施方式中，使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的核酸的试剂盒可以包括甲基化敏感限制酶，例如HpaII。在一些实施方式中，试剂盒还可以包括配置为扩增第一多个核酸和第二多个核酸的一组扩增寡聚物。试剂盒还可以包括配置为与第一多个核酸退火的第一组检测探针和配置为与第二多个核酸退火的第二组检测探针。在一些实施方式中，该组扩增寡聚物可以包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物。在一些实施方式中，可以存在多于一组的扩增寡聚物，其可以配置为在多于一种的多个(即，多个)核酸之间进行差异检测。在一些实施方式中，第一组检测探针可以包括可检测标记。在一些实施方式中，第二组检测探针可以包括可检测标记。在实施方式中，该试剂盒可用于使用本文公开的各种方法来选择和富集某些核酸靶标。
使用片段大小分布的差异定量
在实施方式中，片段大小分布可用于区分生物样品内的一种或多种核酸靶标。事实上，基于核苷酸长度的核酸靶向扩增(以及随后的分化)是分子诊断中的有用工具。本公开内容还提供了基于核苷酸长度检测和定量生物样品中的核酸靶标的方法和系统。本文描述的方法可用于确定核酸靶序列是源自单一来源还是源自两种或更多种来源。例如，在实施方式中，本文公开的使用片段大小分布差异定量核酸的方法可用于某些应用，包括非侵入性产前测试。胎儿DNA的长度明显短于背景母体DNA。因此，本文描述的方法和系统允许仅分析胎儿DNA或至少分析DNA的增强分数是有利的。此外，测量不同大小片段的相对丰度实现估计样品中胎儿DNA的百分比的能力。
图3是图解使用片段大小分布差异定量核酸的示例方法的流程图。概括地讲，可以执行方法300以差异定量核酸，以提高PCR反应中两种或更多种多个核酸(例如具有未知胎儿分数的母体cfDNA)的比较定量的准确性。在一些实施方式中，该方法可以包括多个检测探针，在一些实施方式中它们可以是连续的，其中短片段大小的中心检测探针被配置为与第一核酸靶标退火，并且其中中心检测探针在配置为与第二核酸靶标退火的两个附加检测探针侧翼。在实施方式中，第二核酸靶标可以包括第一核酸靶标的特定核苷酸序列，从而提供第一和第二核酸靶标的相对丰度的荧光比。应当理解，方法300的操作可以执行多次。
在操作310，形成反应混合物。操作310的反应混合物可以包括包含第一多个核酸和第二多个核酸的生物样品。第一多个核酸可以包括第一核酸序列并且第二多个核酸可以包括长于第一核酸序列的第二核酸序列。第一多个核酸和第二多个核酸可以是连续或非连续序列的混合物，这些序列可能来自一种或多种单独的生物体，但也可能来自单一来源。操作310还可以包括通过将生物样品与配置为与第一和第二核酸序列上的第一区域退火的第一组检测探针和配置为与第二核酸序列上的第二区域退火的第二组检测探针组合来形成反应混合物。在一些实施方式中，操作310的反应混合物可以包括配置为扩增第一和第二核酸序列上的第一区域的第一对扩增寡聚物，和配置为扩增第二核酸序列上的第二区域的第二对扩增寡聚物。
在实施方式中，操作310可以包括形成包括生物样品的反应混合物，其中第一多个核酸可以包括第一胎儿核酸序列。第二多个核酸可以包括长于第一胎儿核酸序列的第二母体核酸序列。第一多个胎儿核酸和第二多个母体核酸可以是连续或非连续序列的混合物。在一些实施方式中，方法300的操作310可以包括通过将生物样品与下列组合形成反应混合物：配置为与胎儿和母体核酸序列上的第一区域退火的第一组检测探针、配置为与母体核酸序列上的第二区域退火的第二组检测探针、配置为扩增胎儿和母体核酸序列上的第一区域的第一对扩增寡聚物和配置为扩增母体核酸序列上的第二区域核酸序列的第二对扩增寡聚物。
在实施方式中，操作310的反应混合物可以包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和/或三磷酸脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第一对扩增寡聚物可以包括第一正向扩增寡聚物和第一反向扩增寡聚物。在一些实施方式中，第二对扩增寡聚物可以包括第二正向扩增寡聚物和第二反向扩增寡聚物。
在一些实施方式中，生物样品可以包括来自怀孕女性的全血。在一些实施方式中，全血可以包括母体核酸和胎儿核酸。在一些实施方式中，母体核酸可以与胎儿核酸共享序列。在一些实施方式中，第一多个核酸可以包括与胎儿非整倍性相关的核酸区域。在一些实施方式中，区域可以包括22号染色体、21号染色体、18号染色体、13号染色体、9号染色体、8号染色体或X染色体的区域。
第一组检测探针可以配置为与第一和第二核酸序列上的第一区域退火，并且第二组检测探针可以配置为与第二核酸序列上的第二区域退火，其是连续的。第一组和第二组检测探针可以是连续的或不连续的。在一些实施方式中，第一组和第二组检测探针可以重叠。
在操作320，方法300可以包括将反应混合物分配到反应体积中。例如，操作320可以包括将反应混合物分配到一个或多个反应体积中。在实施方式中，操作320可以包括将反应混合物分配到多个反应体积中。反应体积可以包括例如乳液中的液滴或反应孔。在一些实例中，方法300可以在不将反应混合物分配到反应体积中的情况下进行。
在操作330，方法300可以包括对第一核酸序列进行扩增反应以从第一检测探针产生第一信号，和对第二核酸序列进行扩增反应以从第二检测探针产生第二信号。该方法还可以包括确定源自第一信号的第一值与源自第二信号的第二值的比率，并通过将该比率与参考值进行比较来鉴定大小分布。
在操作340，可以鉴定生物样品中的核酸靶标。例如，操作340可以包括确定来自第一组检测探针的第一信号和来自第二组检测探针的第二信号，从而形成源自第一信号的第一值与源自第二信号的第二值的比率。该比率然后可用于通过将其与已知参考值进行比较来鉴定胎儿分数。
本公开内容提供了用于对生物样品中的多个核酸靶标进行比较定量的方法。生物样品可以包括第一多个核酸和第二多个核酸(例如，具有未知胎儿分数的母体cfDNA)。该方法可以包括使用多个检测探针(例如，多于一组检测探针)的PCR反应。检测探针可以是连续的，其中短片段大小的第一检测探针可以配置为与第一核酸靶标退火。例如，第一检测探针可以在配置为与第二核酸靶标退火的两个或更多个附加检测探针(即，第二组检测探针和/或第三组检测探针等)的侧翼。第二核酸靶标可以包括第一核酸靶标的特定核苷酸序列，从而提供第一和第二核酸靶标的相对丰度的荧光比。
在一些实施方式中，本文公开的方法可用于数字PCR(或具有多个PCR子反应的其他基于分区的测定)应用中。
图4A和图4B通过举例图解了根据本文公开的各种实施方式用于经由片段大小分布进行差异定量的多组扩增寡聚物/多组检测探针。例如，在图4A中，第一组扩增寡聚物401和402可以结合并扩增某个区域，从而产生具有特定大小和/或长度的片段420。在一些实施方式中，第二组扩增寡聚物403和404可以结合并扩增某个区域，从而产生与片段420的大小可以相似或可以不相似的片段422。在一些实施方式中，第三组扩增寡聚物405和406可以结合并扩增某个区域，从而产生与片段420和422大小可以相似或可以不相似的片段424。在一些实施方式中，一组或多组检测探针(例如，检测探针408、410和412)可用于生成信号。图4B举例说明了根据本文公开的各种实施的可用于获得不同大小的片段450、452和454的扩增寡聚物(例如，431和432；433和434)和检测探针(例如，440和444)的不同配置。本文公开的实施方式也可以没有检测探针，而是通过使用例如嵌入染料来代替。
在一些实例中，本文公开的方法和系统可以采用如图4A-4B中所显示的一组多个扩增寡聚物/检测探针组的构造，其中短片段大小的中心检测探针和侧翼探针组在附近。在一些实施方式中，扩增寡聚物/检测探针组可以是连续的，并且不需要都具有独立的正向或反向扩增寡聚物或检测探针。
使用单核苷酸多态性的差异定量
在实施方式中，单核苷酸多态性(SNP)可用于区分生物样品中的一种或多种核酸靶标。SNP涉及DNA分子区段中单个核苷酸(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C))的变异，并且可能随机出现在整个基因组中。SNP可以作为多核苷酸序列内单个核苷酸碱基的转换(即取代)、去除(即缺失)或添加(即插入)的结果而发生。
也可以使用SNP来进行本文描述的用于差异定量核酸的方法和系统。类似于基于甲基化状态和片段大小分布的差异定量，使用SNP的差异定量也可用于多种应用，包括NIPT应用。例如，某些SNP可能仅存在于胎儿基因组中，并且因此可用于区分胎儿核酸与母体核酸。在实施方式中，胎儿分数可以通过检查胎儿片段与母体片段的比率来确定。在一些实施方式中，SNP可以被编码到每个通道中，其中所得比率可以用于更准确地估计生物样品中胎儿DNA的相对丰度。
图5是图解使用单核苷酸多态性(SNP)差异定量核酸的示例方法的流程图。概括地讲，可以执行方法500以差异定量核酸，以提高PCR反应中两种或更多种核酸(比如具有未知胎儿分数的母体cfDNA)的比较定量的准确性。应当理解，方法500可以执行不止一次。
在操作510，可以通过将生物样品与配置为扩增第一多个核酸的第一组扩增寡聚物和配置为扩增第二多个核酸的第二组扩增寡聚物组合来形成反应混合物。反应混合物还可以包括配置为与对第一多个核酸特异的单核苷酸多态性退火的第一组检测探针，和配置为与对第二多个核酸特异的单核苷酸多态性退火的第二组检测探针。在一些实施方式中，操作510可以包括为第一多个核酸和第二多个核酸生成编码方案。
在实施方式中，第一组和第二组检测探针可以各自包括不同的可检测标记。例如，第一组检测探针可以包括第一颜色的荧光团，而第二组检测探针可以包括第二颜色的荧光团。在一些实施方式中，第一组和第二组检测探针可以各自包括相同的可检测标记。类似地，在一些实施方式中，第一组和第二组检测探针可以各自包括猝灭剂。在一些实施方式中，第一组和第二组检测探针可以各自包括
Figure BDA0003516399940000121
检测探针。
在操作520，可以将反应混合物分配到反应体积中。在实施方式中，可以将反应混合物分配到反应体积中。在一些实施方式中，反应体积可以包括乳液中的液滴。在一些实例中，可以将反应体积分配到微孔中，其中扩增发生在微孔中。在一些实施方式中，可以将反应混合物分配到多个反应体积中。在一些实施方式中，方法500可以在不将反应混合物分配到反应体积中的情况下进行。
在操作530，反应体积可以被扩增。在一些实施方式中，扩增反应体积可产生来自第一组检测探针的第一和信号和来自第二组检测探针的第二和信号。在某些情况下，将扩增仅存在于胎儿基因组中的某些SNP，允许对孔中的平均胎儿计数进行定量，和将扩增仅源自母体的其他SNP，允许对孔中的平均母体计数进行定量。在一些实例中，这些计数的比率可用于计算以估计胎儿分数。
在操作540，可以使用SNP来鉴定核酸靶标。在一些实施方式中，该方法可以包括鉴定生物样品中遗传异常的存在或缺失。在一些实施方式中，鉴定生物样品中遗传异常的存在或缺失可以包括将该比率与参考值进行比较。在一些实施方式中，在操作530扩增反应体积产生来自第一组检测探针的第一和信号和来自第二组检测探针的第二和信号。
在实施方式中，操作540可以包括，定量第一和第二SNP靶标可以包括确定样品中第一多个核酸靶标与第二多个核酸靶标的比率(例如，生物样品中第一核酸靶标相对于第二核酸靶标的数量和丰度)。定量SNP靶标可以包括确定样品中第一和第二靶标的绝对数量。定量SNP靶标可以包括确定样品中第一和第二SNP靶标的相对数量(即，相对比率)。在一些实施方式中，这些计数的所得比率可用于计算以估计胎儿分数。确定第一和值与第二和值的比率可以提供可用于计算胎儿分数的见解。在一些实施方式中，该比率可以与参考值进行比较。将该比率与参考值进行比较可以确定样品中估计的胎儿分数。还可以通过试剂盒实施使用本文公开的SNP定量核酸的各种方法。
应当理解，对于本文公开的各种方法和系统，核酸靶标检测和差异定量可以通过使用两个或更多个反应来完成。例如，用于测量多个核酸靶标的测定可以包括第一反应和第二反应。第一和第二反应的结果可以一起明确地检测每个核酸靶标的存在或缺失。测定可以包括任意数量的反应，其中反应的结果一起鉴定存在或缺失多个核酸靶标的任何组合。测定可以包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个反应或更多个。
在一些实施方式中，本公开内容提供了用于同时扩增、检测和/或定量样品中分析物的多重测定。在一些实施方式中，本公开内容的方法可用于检测和/或定量样品体积中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个分析物。在一些实施方式中，本公开内容提供了用于执行数字测定的方法。用于执行数字测定的方法可以包括将多个核酸靶标和多个寡核苷酸探针分配到多个反应体积中。在一些情况下，可以将2、3、4、5或更多个核酸靶标与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个寡核苷酸探针一起分配到多个分区中。在一些方面，所公开的方法利用嵌入染料，从而消除对探针的需要。
在一些情况下，多种信号可由来自混合物的多个探针中的一个或多个产生。多个信号可以通过多个核酸分子的核酸扩增产生。核酸扩增可降解多个寡核苷酸探针(例如，通过核酸酶的活性)，从而生成多个信号。多个信号可以是多个荧光信号、多个化学发光信号或其组合。
在一些方面，可以对信号的检测进行处理，以便将信号和数据用于后续步骤或下游方法。处理可以使用数学算法来分析或处理信号数据。在某些情况下，用于数据处理的数学算法可以包括期望最大化、最近邻分析、基本模型参数化、贝叶斯估计或其组合。数学算法可以使用过程参数。过程参数的实例包括阈值周期、振幅或斜率的参数。在某些情况下，处理过程可使用从仪器或检测器获得的数据。基于检测，可以定量样品中的核酸靶标。
在一些方面，参考条件可用于定量包括多种核酸的样品中多种核酸靶标的相对比率。如本文所公开，参考条件可以包括但不限于：a)引物浓度，b)聚合酶浓度，c)聚合酶类型，d)参考核酸浓度，e)多个热循环，f)热循环速率，g)热循环时间长度，h)探针序列；i)引物序列或其组合。具有已知参数的参考条件可用于外推、内插或以其他方式计算单独样品中另一种核酸的浓度、数量或量。参考定量条件的生成可用于直接与数据集的生成的定量参数进行比较，或者可用于基于例如数据集的参数化、拟合、外推、内插或估计或数据集的参数来计算定量参数。
可以在不使用固定化、分离、质谱或熔解曲线分析的情况下进行如本文描述的方法。例如，可以在不经由质谱法或任何类似技术获得分析物质量的情况下进行分析物的鉴定。此外，可以在不观察熔解反应和针对温度绘制信号的情况下使用这些方法。例如，可以在不使分析物经受温度梯度的情况下鉴定分析物以分析分析物在其中经历物理或化学变化的特定温度。本文描述的方法可以经由使用固定化、分离、质谱或熔解曲线分析的技术来证实。例如，熔解曲线可用于验证多个不同的扩增子或检测扩增子的存在。
数字测定
在实施方式中，本公开内容提供了用于执行数字测定的方法。用于执行数字测定的方法可以包括将多个核酸靶标和多个寡核苷酸探针(即检测探针)分配到多个反应体积中。在一些情况下，可以将2、3、4、5或更多个核酸靶标与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个寡核苷酸探针一起分配到多个反应体积中。分配后，核酸靶标可例如通过聚合酶链式反应(PCR)在反应体积中扩增。接下来，可以由寡核苷酸探针产生N个信号。N个信号中的每个信号可对应于反应体积中核酸靶标的独特组合的存在。在信号生成之后，可以在单个光通道中检测到N个信号。可以使用例如单色通道中的荧光检测来检测信号。
分配
本公开内容的方法可以包括将一个或多个样品分配到多个反应体积中。样品可以包括进入多个反应体积的核酸、寡核苷酸引物、检测探针和/或附加试剂。在一些实施方式中，本公开内容通过使用数字PCR(或具有多个PCR子反应的其他基于分区的测定)实现。在dPCR的一个实例中，包含核酸靶序列、扩增寡聚物、检测寡核苷酸、dNTP、热稳定DNA聚合酶和其他PCR试剂的单个样品可以被分配到大约20,000个大小均匀的反应体积中。
反应体积可以是液滴(例如，乳液中的液滴)。反应体积可以是微滴。反应体积可以是孔。反应体积可以是微孔。可以使用微流体装置进行分配。在某些情况下，分配是使用液滴发生器进行的。分配可以包括将一个或多个样品分到油包水液滴中。
通常，每个反应体积可以接收核酸靶序列的单个模板。然而，统计上，一些反应体积可能接收多于一份的核酸靶标模板，而其他反应体积可能不接收任何靶标模板。因此，液滴可以包括单个核酸。液滴可以包括一种或多种核酸。液滴可以不包括核酸。多个液滴中的每个液滴可以生成信号。多个信号可以包括从包括样品子集的多个液滴中的每一个产生的信号(一个或多个)。
在一些方面，在分配之后，每个反应体积可以进行终端PCR。在实施方式中，发射荧光信号的反应体积被标记为“阳性”并被评分为“1”，而没有可检测荧光的分区被认为是“阴性”并被评分为“0”。dPCR的基本理论是阳性反应的数量与样品中存在的模板核酸总数成正比，从而实现绝对定量。
在一些实施方式中，本公开内容提供了使用数字测定进行多重定量的方法、系统和组合物，其中不需要对个别反应体积进行分类以定量反应中存在的靶标。所公开的方法可用于鉴定或检测受试者的遗传异常，例如胎儿非整倍性(例如，21三体、18三体等)。
扩增
在实施方式中，所公开的方法可以包括核酸扩增。扩增条件可以包括热循环条件，包括每个热循环的温度和时间长度。特定扩增条件的使用可用于改变每个信号的信号强度，从而使每个信号能够对应于核酸靶标的独特组合。扩增可以包括使用酶来产生额外的核酸拷贝。扩增反应可以包括使用寡核苷酸引物(如本文其他地方所述的“引物”或“扩增寡聚物”)。寡核苷酸引物可以使用特定序列来扩增特定序列。寡核苷酸引物可以通过与引物上游和下游的序列杂交来扩增特定序列，并导致包括在上游和下游引物之间的序列扩增。扩增反应可以包括使用三磷酸核苷酸试剂。三磷酸核苷酸试剂可以包括使用三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)。三磷酸核苷酸试剂可用作扩增核酸的前体。扩增反应可以包括使用如本文其他地方所述的寡核苷酸探针。扩增反应可以包括使用酶。酶的非限制性实例包括热稳定酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。扩增反应可以包括产生不同核苷酸类型的核酸分子。例如，核酸靶标可以包括DNA并且可以产生RNA分子。在另一个实例中，可以对RNA分子进行扩增反应并且可以产生cDNA分子。
热循环
本公开内容的方法可以包括热循环。热循环可以包括一个或多个热循环。热循环可以在适合用PCR扩增模板核酸的反应条件下进行。模板核酸的扩增可能需要寡核苷酸引物(一种或多种)与模板核酸的结合或退火。合适的反应条件可以包括合适的温度条件、合适的缓冲条件和合适试剂的存在。在一些情况下，合适的温度条件可以使得每个热循环在期望的退火温度下进行。期望的退火温度足以使寡核苷酸探针(一个或多个)与核酸靶标退火。在某些情况下，合适的缓冲条件可以是在热循环期间使用的缓冲液中存在合适的盐。合适的盐可以包括镁盐、钾盐、铵盐。合适的缓冲条件可以使得合适的盐以合适的浓度存在。用PCR扩增多个核酸靶标的每个成员的合适试剂可以包括三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)。dNTP可以包括天然或非天然dNTP，包括例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其变体。
在各个方面，引物延伸反应可用于产生扩增产物。引物延伸反应通常包括在变性温度下温育反应混合物持续变性时间段和在延伸温度下温育反应混合物持续延伸时间段的循环。在各个方面的任一个中，可以进行引物延伸反应的多个循环。可以进行任何合适数量的循环。例如，进行的循环数可以在大约5个循环到大约100个循环之间。进行的循环数可取决于例如用于获得可检测的扩增产物(例如，指示核酸样品中存在的靶标DNA的扩增DNA产物的可检测量)的循环数(例如，循环阈值(Ct))。
扩增反应产生可检测量的扩增核酸的时间可根据核酸样品、核酸靶标的序列、引物的序列、进行的特定核酸扩增反应，以及扩增的特定循环数、反应温度、反应物的pH而变化。例如，在约5分钟至约120分钟之间的时间段内，核酸靶标的扩增可产生指示核酸靶标存在的可检测量的产物。
核酸靶标
在实施方式中，本公开内容的核酸靶标可以源自生物样品。生物样品可以是源自受试者的样品。生物样品可以包括任意数量的大分子，例如细胞大分子。生物样品可能源自另一个样品。生物样品可以是组织样品，比如活组织切片、核心活组织切片、针抽吸物或细针抽吸物。生物样品可以是流体样品，比如血液样品、尿样品或唾液样品。生物样品可以是皮肤样品。生物样品可以是脸颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可以包括一个或多个细胞。生物样品可以是例如血液、血浆、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便或眼泪。
在一些实施方式中，核酸靶标可以源自一个或多个细胞。核酸靶标可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任意种类的DNA，包括基因组DNA。核酸靶标可以是病毒DNA。核酸靶标可以包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任意种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。
在实施方式中，核酸靶标可以包括一个或多个成员。成员可以是核酸靶标的任何区域。成员可以是任意长度。成员可以是，例如，多达约1至约100000个核苷酸，或更多。在某些情况下，成员可以是基因。核酸靶标可以包括其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于鉴定受试者中病原体的存在或缺失的病毒基因或细菌基因。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测受试者中一种或多种传染原(例如，病毒、细菌、真菌)的存在或缺失。核酸靶标可以是人类基因。在一些情况下，本公开内容的方法可用于鉴定或检测受试者的遗传异常，例如胎儿非整倍性(例如，21三体、18三体等)。
在实施方式中，核酸靶标可以是无细胞核酸。无细胞核酸可以是例如无细胞肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA、无细胞RNA等。在一些情况下，源自无细胞样品的核酸可以源自受试者的血浆。例如，核酸(例如，母体核酸和胎儿核酸)可以源自怀孕女性的血浆样品。核酸可以是胎儿核酸。核酸可以是母体核酸。核酸序列可以对应于可能与非整倍体相关的核酸区域(例如，胎儿核酸的核酸序列可能与胎儿非整倍体相关)。在一些情况下，本公开内容的方法可用于鉴定和估计样品中的胎儿分数。在一些情况下，本公开内容的方法可用于鉴定样品中胎儿非整倍性的存在或缺失。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中胎儿核酸的相对量，从而诊断胎儿的一种或多种遗传异常(例如，胎儿非整倍性)。
在一些方面，通过本公开内容的方法分析的一种或多种核酸分子可以对应于染色体。核酸序列可以是与胎儿非整倍体相关的染色体区域。与胎儿非整倍体相关的染色体可以包括例如21号染色体(例如，与21三体相关)、18号染色体(例如，与18三体相关)、13号染色体(例如，与13三体相关)和X染色体(例如，与性染色体非整倍体有关)。
在一些实施方式中，核酸靶标可以是人类基因组中指示特定疾病易感性的区域。可以通过与较高感染相关的特定突变或SNP来检测特定疾病易感性的标志物。例如，受试者的特定突变或SNP可能与感染特定病原体的风险增加有关。病原核酸序列的检测和受试者基因组中SNP的存在都可能表明受试者处于高风险中。
核酸靶标在反应中可以具有各种浓度。核酸样品可以被稀释或浓缩以获得不同的核酸浓度。核酸样品中核酸的浓度可以介于0.1纳克/微升(ng/μL)至约10000ng/μL之间。
样品
如上所述，本公开内容的核酸靶标可以源自生物样品。生物样品可以是源自生物体的样品。生物样品可以包括任意数量的大分子，例如，细胞大分子。生物样品可以是例如血液、血浆、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便或眼泪。生物样品可以是流体样品。流体样品可以是血液或血浆。核酸靶标可以是来自病原体(例如，病毒、细菌等)的核酸。核酸靶标可以是怀疑具有一个或多个突变的核酸。生物样品可以源自另一个样品。生物样品可以是组织样品，比如活组织切片、核心活组织切片、针抽吸物或细针抽吸物。生物样品可以是流体样品，比如血液样品、尿样品或唾液样品。生物样品可以是皮肤样品。生物样品可以是脸颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可以包括一个或多个细胞。生物样品可以是无细胞样品(例如，无细胞RNA、无细胞DNA等)。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从可选自血液、血浆、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和眼泪的身体样品分离。
样品处理
在实施方式中，可以与本公开内容的方法同时、之前或之后处理样品。可以处理样品以纯化或富集核酸(例如，从血浆样品中纯化核酸)。可以处理核酸样品以纯化或富集感兴趣的核酸。可以处理核酸样品以富集胎儿核酸。可以处理核酸样品以富集小于给定大小的核酸片段。
在一些实施方式中，可以通过各种方法，包括例如通过尺寸排阻过滤、序列特异性富集(例如，经由使用捕获序列)、表观遗传特异性富集(例如，通过使用甲基化敏感限制酶(MSRE))来富集样品的感兴趣的核酸(例如，胎儿核酸)。富集可以包括分离感兴趣的核酸和/或去除不感兴趣的核酸。
在一些实施方式中，在执行本公开内容的方法(例如，从样品扩增核酸)之前，不处理样品以纯化或富集感兴趣的核酸。在一些实例中，如本文其他地方所述，在将样品与寡核苷酸引物和寡核苷酸探针混合之前，不处理样品以富集胎儿核酸。无论样品是否已经纯化或富集胎儿核酸，所公开的方法能够例如鉴定胎儿分数和/或鉴定胎儿非整倍性。
核酸酶
在实施方式中，本公开内容的混合物和组合物可以包括一种或多种核酸酶。核酸酶可具有核酸外切酶活性。核酸酶可具有核酸内切酶活性。核酸酶可具有核糖核酸酶活性。核酸酶能够降解包括一个或多个核糖核苷酸碱基的核酸。核酸酶可以是例如核糖核酸酶H或核糖核酸酶III。核糖核酸酶III可以是例如切酶。核酸可以是核酸内切酶I，诸如例如T7核酸内切酶I。核酸酶能够降解包括非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是核酸内切酶V诸如例如大肠杆菌核酸内切酶V。
核酸酶可以是聚合酶(例如，DNA聚合酶)。可以使用DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常是指能够以模板结合方式将核苷酸并入DNA链的酶。聚合酶可以包括Taq聚合酶或其变体。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、扩展聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、铂Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段及其变体、修饰产物和衍生物。对于某些热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下进行2分钟到10分钟的变性步骤，这可能根据不同的聚合酶改变热曲线。
在一些实施方式中，核酸酶能够在合适的条件下降解寡核苷酸探针。例如，核酸酶可以是聚合酶并且包括外切活性并降解探针，产生可检测信号。核酸酶可以能够在合适的条件下从寡核苷酸探针中释放猝灭剂。
反应
在实施方式中，反应可以包括使核酸靶标与一个或多个寡核苷酸探针(本文也称为检测探针)接触。反应可以包括使用嵌入染料，从而消除对探针的需要。反应可以包括使样品溶液体积(例如，液滴、孔、管等)与多个寡核苷酸探针接触，每个寡核苷酸探针对应于多个核酸靶标之一，以产生由该多个寡核苷酸探针生成的多个信号。反应可以包括聚合酶链式反应(PCR)。反应可以是数字PCR(dPCR)反应。
寡核苷酸引物
在本文其他地方公开的各个方面，使用寡核苷酸引物。本公开内容的寡核苷酸引物(或仅“引物”或“扩增寡聚物”)可以是脱氧核糖核酸。寡核苷酸引物可以是核糖核酸。寡核苷酸引物可以包括一种或多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以是例如脱氧肌苷。
寡核苷酸引物可以是正向引物。寡核苷酸引物可以是反向引物。寡核苷酸引物的长度可以在约5和约50个核苷酸之间。寡核苷酸引物的长度范围可以在5到50个碱基对之间。在一些实例中，寡核苷酸引物的长度可超过50个碱基对。在一些实例中，寡核苷酸引物的长度可以在5-50个碱基对之间。在实施方式中，寡核苷酸引物的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或约50个碱基对。
一组寡核苷酸引物可以包括成对的寡核苷酸引物。成对的寡核苷酸引物可以包括正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。正向寡核苷酸引物可以配置为与核酸序列的第一区域(例如，3’末端)杂交，而反向寡核苷酸引物可以配置为与核酸序列的第二区域(例如，5’末端)杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增核酸序列。不同组的寡核苷酸引物可以配置为扩增不同的核酸靶序列。例如，第一组寡核苷酸引物可以配置为扩增给定长度的第一核酸序列，而第二组寡核苷酸引物可以配置为扩增比第一核酸序列长度更短的第二核酸序列。在另一个实例中，第一组寡核苷酸引物可以配置为扩增给定长度的第一核酸序列，而第二组寡核苷酸引物可以配置为扩增比第一核酸序列长度更长的第二核酸序列。
混合物可以包括正向寡核苷酸引物。正向寡核苷酸引物可以包括脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。正向寡核苷酸引物的长度可以在约5和约50个核苷酸之间。在一些实例中，正向寡核苷酸引物的长度可以超过50个核苷酸。在一些实例中，正向寡核苷酸引物的长度可以在5-50个碱基对之间。在一些实施方式中，碱基对的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基对。
一组寡核苷酸引物(例如，正向引物和反向引物)可以配置为扩增给定长度的核酸序列(例如，可以与相距给定距离的核酸序列的区域杂交)。一对寡核苷酸引物可以配置为扩增长度介于50和300个碱基对之间或更多的核酸序列。在一些实例中，寡核苷酸引物对可以配置为将核酸序列扩增50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个碱基对。
在一些实施方式中，混合物可以包括一种或多种合成的(或以与感兴趣的靶标不同的其他方式产生的)用于PCR反应的引物。
在一些实施方式中，混合物可以经受足以使寡核苷酸引物与核酸分子退火的条件。在一些方面，混合物可以经受足以使多个寡核苷酸引物与核酸分子退火的条件。在一些方面，混合物可以经受足以使多个寡核苷酸引物与多个核酸靶标退火的条件。混合物可经受足以使核酸分子变性的条件。使混合物经受足以使寡核苷酸引物与核酸靶标退火的条件可以包括在适合于通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸靶标(一个或多个)的反应条件下热循环混合物。
条件可以是寡核苷酸引物对(例如，正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物)被核酸酶降解。寡核苷酸引物对可被核酸酶的核酸外切酶活性降解。寡核苷酸引物对可被核酸酶的核糖核酸酶活性降解。寡核苷酸引物对的降解可导致寡核苷酸引物的释放。一旦释放，寡核苷酸引物对就可以与模板核酸结合或退火。
检测探针或寡核苷酸探针
在实施方式中，可以使用寡核苷酸探针。在一些方面，寡核苷酸探针在本文中也可称为“检测探针”或“探针”。寡核苷酸探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。寡核苷酸探针可以包括与核酸靶标区域互补的区域。寡核苷酸探针的浓度可以使得它相对于样品中的其他组分过量。
寡核苷酸探针可以包括非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是不与核酸靶序列的任何区域互补的序列。非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是发夹(hairpin)检测探针。非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子信标探针。分子信标探针的实例是本领域公知的。非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子炬。
样品可以包括寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以相同或可以不同。寡核苷酸探针的长度范围可以在5和30个核苷酸之间。在一些实例中，寡核苷酸探针的长度可以超过30个核苷酸。在一些实例中，混合物包括第一寡核苷酸探针和一个或多个附加寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。寡核苷酸探针的长度范围可介于2和50个核苷酸之间，或更多。在一些实例中，寡核苷酸探针的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个核苷酸。
在一些实例中，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多个不同的寡核苷酸探针。每个寡核苷酸探针可以对应于(例如，能够结合到)样品中核酸靶标(例如，染色体)的给定区域。在一个实例中，第一寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第一区域特异，第二寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第二区域特异，和第三寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第三区域特异。每个寡核苷酸探针可以包括具有大约相等的发射波长的信号标签。在一些实例中，每个寡核苷酸探针包括相同的荧光团。在一些实例中，每个寡核苷酸探针包括不同的荧光团。在某些情况下，每个荧光团都能够在单个光通道中被检测到。在一些实例中，荧光团可以在多个通道中被检测。在一些实例中，寡核苷酸探针可具有与样品中的另一寡核苷酸探针相似或相同的可检测试剂或荧光团。在一些实例中，与样品中的另一寡核苷酸探针相比，该寡核苷酸探针可具有不同的可检测试剂或荧光团。在一些情况下，寡核苷酸探针可具有与样品中的另一寡核苷酸探针相似的序列或能够结合相似的序列。在一些实例中，与样品中的另一寡核苷酸探针相比，寡核苷酸探针可具有不同的序列或能够结合不同的序列。
探针可以对应于核酸靶标的区域。例如，探针可以与核酸靶标的区域具有互补性和/或同源性。探针可以包括与核酸靶标的区域互补或同源的区域。对应于核酸靶标区域的探针能够在合适条件(例如温度条件、缓冲条件等)下结合核酸靶标区域。例如，探针能够在适合聚合酶链式反应的条件下结合核酸靶标的区域。探针可以对应于与核酸靶标对应的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是具有与核酸靶标互补的区域和与探针互补的区域的引物。
探针可以以特定浓度提供。在一些实例中，第二核酸探针以2X和8X之间的浓度提供。在一些实例中，第二核酸探针以约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X或更高的浓度提供。在一些实例中，以约8X、约7X、约6X、约5X、约4X、约3X或约2X的浓度提供第二核酸探针。在一些情况下，第二核酸探针以约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X或约8X的浓度提供。X可以是所公开的方法中提供的核酸探针的浓度。在一些实例中，X的范围从50nM到500nM，或更大。在一些实例中，X可以是约50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM。X可以是任意浓度的核酸探针。
探针可以包括荧光团。荧光团可以选自任意数量的荧光团。荧光团可以选自3、4、5、6、7、8、9或10，或更多个荧光团。在单一反应中使用的一个或多个寡核苷酸探针可以包括相同的荧光团。在某些情况下，单一反应中使用的所有寡核苷酸探针都包含相同的荧光团。每个探针在被激发并与其对应的核酸靶接触时可以生成信号。信号可以是荧光信号。可以从一个或多个探针生成多个信号。
寡核苷酸探针可与多个核酸靶标的任何成员具有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的互补性。寡核苷酸探针可以与多个核酸靶标的任何成员不具有互补性。
寡核苷酸探针可以包括可检测的标记。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可以包括荧光标记。可检测标记可以包括荧光团。可以使用的荧光分子的非限制性实例包括Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、AlexaFluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素(FITC)、6-FAM、5-FAM、HEX、JOE、TAMRA、ROX、BODIPY FL、太平洋蓝、太平洋绿、香豆素、俄勒冈绿、太平洋橙、三甲基罗丹明(TRITC)、DAPI、APC、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、藻红蛋白(Phycoerythin)(PE)、量子点(例如，Qdot 525、Qdot565、Qdot 605、Qdot 705、Qdot 800)或其衍生物。寡核苷酸探针可以进一步包括一种或多种猝灭剂。猝灭剂可抑制来自荧光团的信号生成。猝灭剂可以是例如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。猝灭剂可以是BHQ-1。猝灭剂可以是BHQ-2。
信号生成
在实施方式中，可以进行热循环，使得一个或多个寡核苷酸探针被核酸酶降解。寡核苷酸探针可被核酸酶的核酸外切酶活性降解。寡核苷酸探针可在降解时生成信号。在一些情况下，仅当样品中存在多个核酸靶标中的至少一个成员时，寡核苷酸探针才可以生成信号。
反应可以生成一个或多个信号。反应可以产生包括多个信号的总和的累积强度信号。信号可以是化学发光信号。信号可以是荧光信号。信号可由寡核苷酸探针产生。和信号可以由至少一种寡核苷酸探针产生。例如，包括发光信号标签的杂交探针的激发可生成信号。信号可由荧光团产生。荧光团可在从杂交探针释放时生成信号。反应可以包括荧光团的激发。反应可以包括信号检测。反应可以包括检测来自荧光团的发射。
信号可以是荧光信号。信号可以对应于荧光强度水平。在本公开内容的方法中测量的每个信号可以具有不同的荧光强度值，从而对应于核酸靶标的独特组合的存在。信号可由一个或多个寡核苷酸探针生成。测定中产生的信号数量可以对应于存在的寡核苷酸探针和核酸靶标的数量。
N可以是在本公开内容的测定中在单个光通道中检测到的信号数量。N的范围可以在2和50之间，或更多。在一些实例中，N可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50。
在一些情况下，可以在单个光通道中检测和信号。在一些情况下，可以在至少一个光通道中检测到和信号，从而显著增加可以在单一反应(例如，数字PCR反应)中测量的核酸靶标的数量。在某些情况下，在一次反应中检测到两组信号。在反应中检测到的每组信号可以包括相同数量的信号，或不同数量的信号。
在一些情况下，可以在寡核苷酸探针与核酸区域杂交的同时生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，分子信标探针或分子炬)可在与核酸杂交后生成信号(例如，荧光信号)。
在寡核苷酸探针包括信号标签的情况下，寡核苷酸探针在与寡核苷酸引物的区域结合时可能被降解，从而生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，
Figure BDA0003516399940000221
探针)可以在寡核苷酸探针与核酸杂交并随后被聚合酶降解(例如，在扩增，比如PCR扩增期间)之后生成信号。寡核苷酸探针可被核酸酶的核酸外切酶活性降解。
寡核苷酸探针可以包括猝灭剂和荧光团，使得在寡核苷酸探针降解时释放猝灭剂，从而产生荧光信号。热循环可用于生成一个或多个信号。热循环可产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个信号或更多。热循环可产生至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个信号。
多个信号可以是相同类型或不同类型。不同类型的信号可以是具有不同荧光波长的荧光信号。不同类型的信号可以由包括不同荧光团的可检测标记生成。相同类型的信号可能具有不同的强度(例如，相同荧光波长的不同强度)。相同类型的信号可以是在相同颜色通道中可检测的信号。相同类型的信号可由可包括相同荧光团的可检测标记生成。可以包括相同荧光团的可检测标记由于浓度不同而可能生成不同的信号，从而产生相同信号类型的不同强度。
尽管已经使用荧光探针来说明该原理，但是所公开的方法同样适用于提供可定量信号的任何其他方法，包括电化学信号、化学发光信号、磁性粒子和展现永久偶极子的驻极体结构。
在本公开内容的某些部分中，信号可以是荧光信号。例如，像荧光信号一样，上述任何电磁信号也可以用波长来表征，由此荧光信号的波长也可以用颜色来描述。颜色可以基于测量特定波长或波长范围内的强度来确定，例如通过确定不同波长下的荧光强度分布和/或通过利用带通滤波器来确定特定波长范围内的荧光强度。
所描述的信号并不意味着是限制性的，并且本领域的普通技术人员将容易地认识到适用于荧光信号测量的原理也适用于其他信号。例如，本公开中呈现的方法还可利用在至少两个维度(例如，颜色和强度)的信号的测量。在某些情况下，可定量的信号具有频率(波长)和振幅(强度)二者。信号可以是电磁信号。电磁信号可以是声音、无线电信号、微波信号、红外信号、可见光信号、紫外光信号、X射线信号或伽马射线信号。荧光信号的波长也可以用颜色来描述。颜色可以基于测量特定波长或波长范围内的强度来确定，例如通过确定不同波长下的荧光强度分布和/或通过利用带通滤波器来确定特定波长范围内的荧光强度。强度可以用光检测器测量。波长范围可称为“通道”、“颜色通道”或“光通道”。
在一些情况下，信号强度随着每个热循环而增加。信号强度可以以S形方式增加。信号的存在可以与多个核酸靶标中的至少一个成员的存在相关。将信号的存在与多个核酸靶标中的至少一个成员的存在相关联可以包括建立信号强度阈值。对于不同的信号，信号强度阈值可能不同。将信号的存在与多个核酸靶标中的至少一个成员的存在相关联可以包括确定信号强度是否增加超过信号强度阈值。在一些实例中，信号的存在可以与多个核酸靶标的所有成员中的至少一个的存在相关。在其他实例中，第一信号的存在可以与多个核酸靶标的第一成员子集中的至少一个的存在相关联，并且第二信号的存在可以与多个核酸靶标的第二成员子集中的至少一个的存在相关联。
信号的存在可以与核酸靶标的存在相关联。1到10个信号的存在可能与1到10个核酸靶标的存在相关联。信号的缺失可能与相应核酸靶标的缺失相关联。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号的缺失可以与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸靶标分子中的每一个的缺失相关联。
检测
在实施方式中，可以检测一个或多个信号的存在或缺失。可以检测一个信号，或者可以检测多个信号。可以同时检测多个信号。可选地，可以依次检测多个信号。信号的存在可以与核酸靶标的存在相关联。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号的存在可能与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸靶标的存在相关。信号的缺失可能与相应的核酸靶标的缺失相关联。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号的缺失可能与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸靶标分子的缺失相关联。
检测多个核酸靶标
本文描述的各种方法可用于对生物样品中的核酸序列进行差异定量并确定核酸序列是源自单一来源还是源自两种或更多种来源。在实施方式中，可以通过使用差异甲基化基因座、片段大小分布和/或单核苷酸多态性(SNP)来进行差异定量。
技术
图6图解了示例计算部件600。计算部件600可以用于实现本文公开的系统、装置和方法的实施方式的各种特征和/或功能。关于本文在参考图1至图5描述的方法和系统的上下文中阐述的上述实施方式，本领域技术人员将理解关于可由计算部件600执行的这些实施方式的功能的附加变化和细节。就此而言，本领域技术人员在研究后也将理解在不背离本公开内容的精神的情况下，可以相对于本文描述的其他实施方式(例如，方法)来实现本文描述的各种实施方式(例如，系统)的特征和方面。
如本文所使用的，术语部件可描述可根据本申请的一个或多个实施方式执行的给定功能单元。如本文所使用的，部件是指模块，和/或可以利用任何形式的硬件、软件或其组合来实施。例如，可以实施一个或多个处理器、控制器、ASIC、PLA、PAL、CPLD、FPGA、逻辑部件、软件例程或其他机构来组成部件。在实施方式中，本文描述的各种部件可以被实施为分离的部件，或者所描述的功能和特征可以在一个或多个部件之间部分或全部共享。换句话说，本领域普通技术人员在阅读本说明书后将明白，本文描述的各种特征和功能可以在任何给定的应用中实施，并且可以以各种组合在一个或多个单独或共享的部件中实现和排列。尽管可以将各种特征或功能元素作为单独的部件分开描述或要求保护，但是本领域普通技术人员在研究本公开内容后将理解这些特征和功能可以在一个或多个通用软件和硬件元素之间共享，并且此类描述不应要求或暗示使用单独的硬件或软件部件来实现此类特性或功能。
在该应用的部件全部或部分使用软件实现的情况下，在一个实施方式中，这些软件元素可以实施为与能够执行关于其描述的功能的计算或处理部件一起操作。图6中显示了一个这样的示例计算部件。根据该示例计算部件600描述了各种实施方式。在阅读了该描述之后，相关领域的技术人员将清楚如何使用其他计算部件或架构来实现该应用。
现在参考图6，计算部件600可以表示例如在自调整显示器、台式机、膝上型计算机、笔记本和平板计算机内发现的计算或处理能力；手持计算装置(平板电脑、PDA、智能手机、手机、掌上电脑等)；工作站或其他带显示器的装置；服务器；或对于给定的应用程序或环境来说可能是期望的或合适的任何其他类型的专用或通用计算装置。计算部件600还可以表示嵌入在给定装置中或以其他方式可用于给定装置的计算能力。例如，计算部件可能存在于其他电子装置中，诸如例如导航系统、便携式计算装置和可能包括某种形式的处理能力的其他电子装置。
计算部件600可以包括例如一个或多个处理器、控制器、控制部件或其他处理装置，比如处理器604。处理器604可以使用通用或专用处理引擎，诸如例如微处理器、控制器或其他控制逻辑来实施。尽管可以使用任何通信介质来促进与计算部件600的其他部件的交互或进行外部通信，但是在图解的实例中处理器604连接到总线602。
计算部件600还可以包括一个或多个存储器部件，在此简称为主存储器608。例如，优选地，随机存取存储器(RAM)或可用于存储信息和指令以由处理器604执行的其他静态或动态存储器。主存储器608还可以用于在执行由处理器604执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。计算部件600同样可以包括只读存储器(“ROM”)或耦合到总线602的其他静态存储装置，用于存储用于处理器604的静态信息和指令。
计算部件600还可以包括一种或多种各种形式的信息存储机构610，其可以包括例如介质驱动器612和存储单元接口620。介质驱动器612可以包括驱动器或其他机构以支持固定或可移动存储介质614。例如，硬盘驱动器、固态驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、压缩盘(CD)或数字视频光盘(DVD)驱动器(R或RW)，或者可能提供其他可移动或固定介质驱动器。因此，存储介质614可以包括例如硬盘、闪存驱动器、集成电路组件、USB、磁带、盒式磁带、光盘、CD或DVD、或其他固定或可移动介质，其被读取、写入到介质驱动器612或由介质驱动器612访问。如这些实例所示，存储介质614可以包括其中存储有计算机软件或数据的计算机可用存储介质。
在替代实例中，信息存储机构610可以包括其他类似的工具，用于允许将计算机程序或其他指令或数据加载到计算部件600中。这样的工具可以包括例如固定或可移动存储单元622和接口620。这样的存储单元622和接口620的实例可以包括程序卡盒和卡盒接口、可移动存储器(例如，闪存或其他可移动存储器部件)和存储器插槽、PCMCIA插槽和卡，以及其他固定或可移动存储单元622和允许软件和数据从存储单元622传输到计算部件600的接口620。
计算部件600还可以包括通信接口624。通信接口624可用于允许软件和数据在计算部件600和外部装置之间传输。通信接口624的实例可以包括调制解调器或软调制解调器、网络接口(例如以太网、网络接口卡、WiMedia、IEEE 802.XX或其他接口)、通信端口(诸如例如USB端口、IR端口、RS232端口
Figure BDA0003516399940000251
接口或其他端口)或其他通信接口。经由通信接口624传输的软件和数据通常可以承载在信号上，这些信号可以是电子、电磁(包括光学)或能够由给定通信接口624交换的其他信号。这些信号可以经由通道628提供至通信接口624。该通道628可以携带信号并且可以使用有线或无线通信介质来实现。通道的一些实例可以包括电话线、蜂窝链路、RF链路、光链路、网络接口、局域网或广域网以及其他有线或无线通信通道。
在本文档中，术语“计算机程序介质”和“计算机可用介质”通常用于指代暂时性或非暂时性介质，诸如例如存储器608、存储单元620、介质614和通道628。这些和其他各种形式的计算机程序介质或计算机可用介质可能涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理装置以供执行。体现在介质上的这种指令通常被称为“计算机程序代码”或“计算机程序产品”(可以以计算机程序或其他分组的形式分组)。当被执行时，这样的指令可以使计算部件1000能够执行如本文所讨论的本申请的特征或功能。
试剂盒
本公开还提供用于多重分析的试剂盒。试剂盒可用于例如分析核酸大小分布(例如胎儿分数)、确定样品的甲基化状态和/或确定样品的SNP数量。在一些实施方式中，试剂盒可以包括扩增试剂，包括例如寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、dNTP、核酸酶(例如聚合酶)和盐(例如Ca2+、Mg2+等)。在一些情况下，试剂可用于定量聚合酶链式反应(qPCR)，由此可以生成多个信号。在一些情况下，试剂可用于数字聚合酶链式反应(dPCR)，由此可以生成多个信号。试剂盒可以包括一个或多个寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以被冻干。不同的寡核苷酸探针可以以不同的浓度存在于试剂盒中。寡核苷酸探针可以包括荧光团和/或一种或多种猝灭剂。
在实施方式中，试剂盒可以包括一对或多对如本文描述的寡核苷酸引物。成对的寡核苷酸引物可以包括正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。一对寡核苷酸引物可以配置为扩增对应于特定靶标的核酸序列。不同的寡核苷酸引物对可以配置为扩增核酸序列。配置为扩增核酸分子的寡核苷酸引物可用于执行所公开的方法。在一些情况下，试剂盒中的所有寡核苷酸引物都是冻干的。
在实施方式中，试剂盒可以包括一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶(DNase)。DNAse可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶可以是核糖核酸聚合酶(RNase)。RNase可以是RNase III。RNase III可以是切酶。核酸酶可以是核酸内切酶。核酸内切酶可以是核酸内切酶I。核酸内切酶I可以是T7核酸内切酶I。试剂盒可以包括在本文描述的方法中使用任何前述的说明书。
术语“约”在提及诸如数量、持续时间等的可测量值时，意在涵盖指定值±20％或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。此外，“约”可以表示加或减小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于本领域技术人员已知或可知的情况。约还包括确切的量。因此，“约200nM”意味着“约200nM”以及“200nM”。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是这些实施方式仅通过举例提供。本发明不旨在受说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文的实施方式的描述和图解并不意味着被解释为限制性的。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多改变、变化和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比率，这取决于各种条件和变量。应当理解，在实践本发明时可以采用对本文描述的本发明的实施方式的各种替代。因此预期本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等效物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
应当理解，本发明不限于这些实例的具体细节。虽然已经相当详细地显示和描述了本发明的优选实施方式，但是应当理解，可以在不背离本发明的精神或范围的情况下对结构进行许多改变。因此，不希望本发明限于所提供的实例中显示和描述的确切结构。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”也旨在包括复数形式。此外，如果在说明书和/或权利要求书中使用了术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”、“比如(such as)”或其变型，这样的术语不是限制性的并且旨在以某种方式包括在内。
在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开包括此列范围内所有可能的子范围的公开，以及落入这样的范围内的特定数值，无论是特定数值或特定子范围是否被明确规定。
实施例
给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，并不意味着以任何方式限制本发明。应当理解，本发明不限于这些实施例的具体细节。虽然已经相当详细地显示和描述了本发明的优选实施方式，但是应当理解，可以在不背离本发明的精神或范围的情况下对结构进行许多改变。因此，不希望将本发明限于所提供的实施例中显示和描述的确切结构。
实施例1A：使用片段大小分布的差异定量
可以使用所有在不同荧光通道中的这些探针，或在相同通道中但在不同强度振幅下使用这些探针来构建测定。例如，表1描述了可由重叠的正向/反向区域和探针限定的化学品组成的三个扩增子，这样如果多于一个区域被扩增，所得检测探针强度将线性增加。例如，如果在分区中同时使用探针‘A’和‘B’，则最终强度的相对水平将为3。在此测定中，如果DNA片段仅与扩增子A重叠，则对于该分区，FAM荧光通道中的所得强度的相对水平为1，并且该片段的长度保证大于70个碱基对且小于450个碱基对，否则它将覆盖至少一个扩增子B或C。如果片段DNA的总强度为2或更高，这表明该片段的长度必须至少为260个碱基对。
表1
Figure BDA0003516399940000271
实施例1B：使用片段大小分布的差异定量–蒙特卡洛模拟(Monte CarloSimulation)
为了评估系统在分离不同长度的DNA片段的信号方面的性能，构建了蒙特卡洛模拟。DNA片段是通过假设一定数量的平均覆盖率(例如，3000x)，然后相对于表1的位置分配随机大小和位置来生成的。为了该模拟的目的，母体DNA被选择为平均600个碱基对长，标准偏差为100个碱基对，而胎儿DNA被选择为平均200个碱基对长，标准偏差为100个碱基对。对于每次模拟，选择‘胎儿分数’来确定每个大小组的分布(例如，10％的DNA被分配给胎儿大小分布)。然后将这些DNA片段随机分布在虚拟反应体积或分区(例如，20,000个分区)中，并根据存在的DNA为每个分区分配预期‘强度’的总和。例如，如果一个DNA片段仅覆盖扩增子A，则分区强度为1，但如果存在两个片段一起覆盖A和B，则总分区强度将为3。然后分区强度随机变化5％(正态分布)噪声以生成代表真实世界数据的人群(population)。
图7通过举例图解了模拟，具有强度水平为1、3和5的分区人群指示仅覆盖A (强度1)、A+B或A+C(强度3)或A+B+C(强度5)(例如，框701)的分区。将强度2下的所有分区分类为预期的‘短’片段导致两个人群的清晰分离，并具有一些重叠，如框702和图8中框801所显示的。此外，具有任何扩增的分区数量与2下强度分区数量的比率与胎儿分数(例如，框802)成线性比率，这表明使用这种技术可以直接测量分布大小并补充。
实施例1C：使用片段大小分布的差异定量–NIPT应用
表2通过举例图解了并入来自不同染色体的第二区域的测定。
表2
Figure BDA0003516399940000281
在该实施例中，对于不同的源染色体，使用具有不同强度水平的第二通道。在预期的NIPT应用中，胎儿片段(较短片段)部分可能具有非整倍性，比如21三体，这将导致贡献的胎儿分数样品中的21号染色体是18号染色体的1.5倍。具有10％胎儿分数的溶液的总比率仅为1.05:1Chr21:Chr18，因为预计母体DNA不会具有非整倍性。例如，图9中的框901图解了来自具有10％胎儿分数的样品的测定的两个通道的20,000个分区的示例分布图，并且显示了DNA的胎儿分数中的21三体。框902图解了总DNA含量的100次模拟中21号染色体与18号染色体的比率导致中值接近1.05，但是与1.0显著重叠，这将是正常样品的预期结果。这将表明测试在区分两种情况(正常和21三体)方面不准确。在箱线图的‘短’图中，只有‘短’片段之间的比率的中值为1.5，正如对具有21三体的样品所预期的那样，与基线的差异更大。本文公开的方法可用于多种应用，其中样品中存在的DNA片段大小对于测量或过滤掉很重要，包括NIPT示例，以及其他应用，包括但不限于肿瘤学标记测量或STR重复长度测量。
实施例2A：使用单核苷酸多态性的差异定量
在一个实例中，给定一组混合的DNA，其为10％胎儿分数，并且理想的SNP分布为5个仅胎儿的SNP，5个仅母体的SNP，5个二者的SNP，以及5个二者都不含的SNP，将测量：
5个SNP(仅胎儿)：～100个计数
5个SNP(仅母体)：～900个计数
5个SNP(胎儿+母体)：～1000个计数
5个SNP(二者均无)：0个计数
这里，然后可以通过使用仅在母体中或仅在胎儿基因组中出现的SNP以100/(100+900)个计数来计算的胎儿分数。
实施例2B：使用单核苷酸多态性的差异定量
在另一个实施例中，与仅母体SNP有关的计数的定量和与胎儿和母体二者来源中存在的SNP有关的计数的数量可能无法区分。因此，可以对计算进行调整，以在不知道的情况下正确估计胎儿分数，也不会将任何SNP分配为仅母体。例如，假设在具有20个不同SNP靶标的溶液中包含1000个基因组DNA计数。就该实施例而言，已知每个SNP代表大约50％的人群，并且此外，DNA由10％的胎儿分数组成，理想化的SNP分布为5个SNP(仅胎儿)；5个SNP(仅母体)；5个SNP(胎儿+母体)；和5个SNP(二者均无)。再次测量：
5个SNP(仅胎儿)：～100个计数
5个SNP(仅母体)：～900个计数
5个SNP(胎儿+母体)：～1000个计数
5个SNP(二者均无)：0个计数
这里，在与仅母体SNP相关的计数和与胎儿+母体来源中存在的SNP相关的计数可能无法区分的情况下，可能难以确定具有1000个计数的SNP群体与900个计数之间的差异。相反，假设5个SNP(仅胎儿)：～100个计数和10个SNP(‘仅母体’+‘胎儿+母体’)平均950个计数。在这种情况下，不需要计算、确定或甚至知道母体的贡献。此外，存在所有10个SNP都可能是仅母体的统计概率。然而，假设胎儿分数在SNP之间(基因组之间)分布相对均匀，则可以将胎儿分数计算为：100/(950+100/2)。这可能会增加测量中的噪音，因为在真实样品中，在上部桶中鉴定的10个SNP中，其中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个可能是母体只是出于偶然。
实施例2C：使用单核苷酸多态性的差分定量-蒙特卡洛模拟
为了评估预期的‘噪声’，可以采用蒙特卡洛模拟来对模拟中由于随机变量的干预而无法轻易预测的不同结果的概率进行建模。该模拟假设来自怀孕女性的血浆样品包括胎儿无细胞核酸和母体无细胞核酸。
这里，示例模拟是为dPCR设置的，并且包括：将包含至少一个核酸靶序列、至少一种扩增寡聚物、至少一种检测探针、dNTP、热稳定DNA聚合酶和其他PCR试剂的单个样品分配到大约20,000个大小均匀的分区中。因此，蒙特卡洛模拟假设样品将与至少第一对和至少第二对寡核苷酸引物(其中第一对寡核苷酸引物将被配置为扩增第一核酸(例如，胎儿核酸)，并且第二对寡核苷酸引物将被配置为扩增更长长度的核酸片段(例如母体核酸))混合，并且检测探针被配置为检测胎儿特异性SNP；和母体特异性SNP。然后将所得混合物进行dPCR。
对于该示例，假设1000个基因组输入拷贝具有2％至30％范围内的各种胎儿分数，进行蒙特卡洛模拟。然后将20个SNP随机分配为仅胎儿、仅母体、胎儿+母体或两者均无。
每个分区中的基因组计数(绝对定量)是使用泊松统计建模完成的。通常，在dPCR中，每个分区可以接收核酸靶序列的单个模板。然而，统计上，一些分区可能接收多于一份的核酸靶标模板，而其他分区可能不接收任何靶标模板。泊松建模计算给定反应接收0、1、2、3或更多个拷贝的概率(每个分区的平均拷贝数(λ)可由λ＝-ln(P(k＝0))来确定，其中k是正液滴的数量，n是液滴的总数，λ是每个液滴的平均拷贝数)。这种‘校正’使起始样品中的所有分子都能被计算在内，产生绝对定量。因此，泊松统计建模克服了对统计采样的依赖(dPCR的内在限制)。
这里，在每个水平上进行了1000次模拟，其变异性和统计数据显示在图10中(例如，框1001和1002)。在这里，0.3％的样品不具有仅来自胎儿的SNP将导致对该样品的‘未调用(no call)’。
在一些实施方式中，为了降低未调用的几率，可以采用‘简并编码’。简并编码允许在每个通道/强度下调用多个SNP。在这种方法中，可以在每个通道/强度组合中调用多个SNP。这将导致测定中没有特定的SNP可以作为测定的一部分进行计数或调用，但仍然可以确定总计数。
例如，2个SNP靶标(每个具有50％的等位基因分数)可用于在特定通道中扩增到特定水平。前述实施例中确定的潜在计数可能是：
5个SNP(仅胎儿)：～0、100或200个计数
5个SNP(仅母体)：～900、1000或1100个计数
5个SNP(胎儿+母体)：～1800、1900或2000个计数
5个SNP(二者均无)：0个计数
这里，样品将包括其来自胎儿分数的计数的一部分的可能性为75％。将其复制到20个不同的测定中，40个SNP提供了更高的成功可能性，同时提高了‘未调用’率。
在一些实例中，在难以找到在整个人群中很好地代表的SNP靶标的情况下，可以使用采用SNP估计。在一些实施方式中，北欧人群中具有50％次要等位基因分数的SNP可以与来自非洲人群中具有50％次要等位基因分数的SNP组合以确保对所有潜在临床来源的合适覆盖。在这些表示中，可以计算跨SNP池的平均值并用于估计胎儿分数，并且不需要对所有SNP或不需要对单个SNP进行定量，甚至确定它们的存在或缺失。

Claims (29)

1.一种使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的核酸的方法，所述方法包括：
提供包括甲基化敏感限制酶的溶液；
提供生物样品，其中所述生物样品包括第一多个核酸和第二多个核酸，并且其中所述第一多个核酸和所述第二多个核酸中的每一个进一步包括一组甲基化的核酸和一组未甲基化的核酸；
通过将所述生物样品和所述溶液结合形成消化的生物样品，使得所述甲基化敏感限制酶切割所述一组未甲基化的核酸；
通过将所述消化的生物样品与下述物质结合形成反应混合物：
配置为扩增所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的一组扩增寡聚物；
配置为与所述第一多个核酸的区域退火的第一组检测探针；和
配置为与所述第二多个核酸的区域退火的第二组检测探针；
扩增所述反应混合物以产生来自所述第一组检测探针的第一信号和来自所述第二组检测探针的第二信号；
确定包括源自所述第一信号的第一值与源自所述第二信号的第二值的比率；和
鉴定所述生物样品中源自所述第一多个核酸的核酸的比例。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在扩增之前将所述反应混合物分配到反应体积中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号各自包括从包含来自所述第一多个核酸和所述第二多个核酸中的每一个的扩增子的扩增反应体积的总数产生的累积信号测量值。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号均在单个荧光通道中产生。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号在多于一个荧光通道中产生。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组扩增寡聚物包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括来自一种或多种生物体的基因组DNA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中第一组检测探针和第二组检测探针各自进一步包括可检测标记。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述可检测标记选自化学发光标记、荧光标记或其任意组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一组检测探针和所述第二组检测探针各自进一步包括猝灭剂。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述比率是在不定量所述第一多个核酸和第二多个核酸的情况下确定的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定所述生物样品中源自第一多个核酸的核酸的比例进一步包括确定所述生物样品中甲基化核酸的分数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中确定所述生物样品中甲基化核酸的分数包括将所述比率与参考值进行比较。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括来自怀孕女性的全血。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述全血包括母体核酸和胎儿核酸。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个核酸包括胎儿核酸序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多个核酸包括母体核酸序列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一组检测探针配置为检测与胎儿非整倍性相关的核酸区域。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述区域包括22号染色体、21号染色体、18号染色体、13号染色体、9号染色体、8号染色体、Y染色体或X染色体的区域。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲基化敏感限制酶包括HpaII、AatII、AccII、Aor13HI、Aor51HI、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HhaI、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI和SnaBI中的一种或多种。
22.一种使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
甲基化敏感限制酶；
配置为扩增第一多个核酸和第二多个核酸的一组扩增寡聚物；
配置为与所述第一多个核酸退火的第一组检测探针；和
配置为与所述第二多个核酸退火的第二组检测探针；
其中所述一组扩增寡聚物包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物；和
其中所述第一组检测探针和所述第二组检测探针各自含有可检测标记。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述可检测标记选自化学发光标记、荧光标记或其任意组合。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述第一组检测探针和所述第二组检测探针各自进一步包括猝灭剂。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，进一步包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸中的一种或多种。
26.一种使用差异甲基化基因座差异定量生物样品中的胎儿分数的试剂盒，所述试剂盒包括：
甲基化敏感限制酶；
配置为扩增多个胎儿核酸和多个母体核酸的一组扩增寡聚物；
配置为与所述多个胎儿核酸退火的第一组检测探针；
配置为与所述多个母体核酸退火的第二组检测探针；
其中所述一组扩增寡聚物包括正向扩增寡聚物和反向扩增寡聚物；和
其中所述第一组检测探针和所述第二组检测探针各自包括可检测标记。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述可检测标记选自化学发光标记、荧光标记或其任意组合。
28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述第一组检测探针和所述第二组检测探针各自进一步包括猝灭剂。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，进一步包括缓冲液、试剂、热稳定聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸中的一种或多种。
CN202080059783.4A 2019-06-24 2020-06-24 差异定量核酸的方法 Pending CN114929893A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962865832P 2019-06-24 2019-06-24
US62/865,832 2019-06-24
US201962888964P 2019-08-19 2019-08-19
US201962888966P 2019-08-19 2019-08-19
US62/888,964 2019-08-19
US62/888,966 2019-08-19
PCT/US2020/039457 WO2020264051A1 (en) 2019-06-24 2020-06-24 Methods for differentially quantifying nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114929893A true CN114929893A (zh) 2022-08-19

Family

ID=74037887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080059783.4A Pending CN114929893A (zh) 2019-06-24 2020-06-24 差异定量核酸的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200399677A1 (zh)
EP (1) EP3987056A4 (zh)
CN (1) CN114929893A (zh)
WO (1) WO2020264051A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023183596A2 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and system for sizing a population of nucleic acid fragments using a digital assay

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211522A1 (en) * 2002-01-18 2003-11-13 Landes Gregory M. Methods for fetal DNA detection and allele quantitation
US20110039724A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 The Chinese University Of Hong Kong Method for detecting chromosomal aneuploidy
US20120252015A1 (en) * 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
WO2016138105A2 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Zymo Research Corporation Assays to determine dna methylation and dna methylation markers of cancer
EP3140421A1 (en) * 2014-05-09 2017-03-15 Lifecodexx AG Detection of dna that originates from a specific cell-type and related methods

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8440404B2 (en) * 2004-03-08 2013-05-14 Rubicon Genomics Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation
US20090176655A1 (en) * 2007-11-16 2009-07-09 Oncomethylome Sciences Sa Methylation detection
EP3103871B1 (en) * 2008-09-16 2020-07-29 Sequenom, Inc. Processes for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for fetal nucleic acid quantification
GB201212047D0 (en) * 2012-07-05 2012-08-22 Fermentas Uab Restriction endonucleases and their use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211522A1 (en) * 2002-01-18 2003-11-13 Landes Gregory M. Methods for fetal DNA detection and allele quantitation
US20110039724A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 The Chinese University Of Hong Kong Method for detecting chromosomal aneuploidy
US20120252015A1 (en) * 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
EP3140421A1 (en) * 2014-05-09 2017-03-15 Lifecodexx AG Detection of dna that originates from a specific cell-type and related methods
WO2016138105A2 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Zymo Research Corporation Assays to determine dna methylation and dna methylation markers of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020264051A1 (en) 2020-12-30
EP3987056A1 (en) 2022-04-27
EP3987056A4 (en) 2023-07-26
US20200399677A1 (en) 2020-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10774380B2 (en) Methods for multiplex PCR amplification of target loci in a nucleic acid sample
US9938570B2 (en) Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
EP3117011B1 (en) Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2569453B1 (en) Nucleic acid isolation methods
CA2834218C (en) Quantification of a minority nucleic acid species using inhibitory oligonucleotides
AU2018214075A1 (en) Systems and methods for prenatal genetic analysis
AU2015296602A1 (en) Detection of target nucleic acids using hybridization
GB2524948A (en) Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
Handley et al. Noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection using plasma cell-free nucleic acid
CN109923215B (zh) 序列变体的检测
US20200399677A1 (en) Methods for differentially quantifying nucleic acids
AU2006226873B2 (en) Nucleic acid detection
US20200407794A1 (en) Molecular targets for fetal nucleic acid analysis
US20210340611A1 (en) Digital polymerase chain reaction method for detecting nucleic acids in samples
CN112969707A (zh) 用于单核苷酸多态性的多重检测的具有多个结合基序的通用尾引物
CN112424377A (zh) 用于多重分析的方法和系统
Deharvengt et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory
Batra et al. Single nucleotide polymorphisms (SNPs)
Deharvengt et al. Nucleic acid analysis in the clinical laboratory
Al-Turkmani et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory
WO2024015999A1 (en) Methods, systems and compositions for detection of multiple analytes
WO2023014898A1 (en) Methods, systems and compositions for detection of multiple analytes
Lefferts et al. Essential Concepts and Techniques in Molecular Biology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination