JP2007532100A - microRNAおよび低分子干渉RNAの定量化のための新規方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非常に多様な核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列の定量化に関し、より詳細には、標的ヌクレオチド配列、特にRNA標的配列(関心が持たれているmicroRNAおよびsiRNA標的配列など)を検出および定量化するのに有用な、また、核酸サンプル間の差(例えば、癌患者のサンプルと、健康な患者からのサンプルなど)を検出するのに有用な、オリゴヌクレオチドプローブの設計および使用を用いる方法に関する。
国際的な配列データベースの拡大しつつある目録や、これに付随する、生物−細菌、古細菌、および真核生物−の3つすべてのドメインに相当する、ほぼ200のゲノムの配列決定によって、生物体を、遺伝子、転写産物、およびタンパク質の包括的な分子カタログに解体するプロセスが第一に推進されてきた。単一の種内の遺伝的変異の重要性は明らかになり、いくつかの重要なゲノムの遺伝的設計図の完成が終わり、2001年には、ヒトゲノム配列の有効な草案の公開に達している(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3)。一方、いくつかのタイプの非−タンパク質−コードRNA(低分子核小体RNA、siRNA、microRNA、およびアンチセンスRNAなど)の最近の同定に加えて、ヒトおよびマウスゲノムに由来する転写の詳細で大規模な、数が増加しつつある分子分析によって、より高等の真核生物のトランスクリプトームが、元々予想されていたよりも、かなり複雑であることが示唆されている(非特許文献4;非特許文献5)。
1.miRNAは、約21〜25ntの一本鎖RNAである。
2.これらは、酵素ダイサー(Dicer)によって、より長い内因性二本鎖ヘアピン前駆体から切断される。
3.miRNAは、二本鎖ヘアピンの形の前駆体RNAを潜在的にコードすることができるゲノム領域に正確にマッチする。
4.miRNAおよびその予測される前駆体二次構造は、系統的に保存される。
miRNAのゲノム位置の分析によって、これらが、ヒトの発生および疾患において重要な役割を果たすことが示唆されている。miRNAまたはそのプロセッシング機構が関係する可能性があるいくつかのヒト疾患は、既に特定されている。それらのうちの1つは、脊髄性筋萎縮症(SMA)、すなわち、タンパク質レベルの低下または運動ニューロン(SMN)遺伝子の生存の機能喪失突然変異によって引き起こされる小児科の神経変性疾患である(非特許文献15)。SMN複合体の一部である2つのタンパク質(Gemin3およびGemin4)も、miRNPの成分であるものの、miRNA生合成または機能が、SMAにおいて異常調節されるかどうか、また、これが、病因に対してどのような影響を有するかは、まだ分かっていない。mi/siRNAに関連がある別の神経性疾患は、脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の欠乏または突然変異によって引き起こされる脆弱X精神遅滞(FXMR)であり(非特許文献16)、miRNAが、他の神経性疾患においても役割を果たす可能性があるさらなる手掛かりが存在する。さらに別の興味深い発見は、miR−224遺伝子座が、2つの異なる神経性疾患:早発性パーキンソン症候群およびX連鎖性精神遅滞の、ごく小さい候補領域内にあるということである:(非特許文献17)。癌とmiRNAとの関連も、最近記載されている。慢性リンパ性白血病(CLL)における最も頻度が高い単一の遺伝子異常は、染色体13q14に集中する(50%のケース)欠損である。最近の研究によって、2つの異なるmiRNA(miR15およびmiR16)遺伝子がクラスター化され、LEU2のイントロン内(B細胞慢性リンパ性白血病(B−CLL)腫瘍抑制座位の欠損される(deleted)最小領域内にある)に位置することが決定され、どちらの遺伝子も、大部分のCLL症例では、欠損または下方制御されている(非特許文献18)。miRNAとヒト疾患との関係は、miRNAおよびそれらが制御する遺伝子ネットワークについての知識に並行して強固になっていくだけであると予測されている。さらに、RNA仲介型の遺伝子発現の調節を理解することにより、おそらく臨床医学に革命をもたらすことになるであろう新規の治療的手法の進展につながる(非特許文献16)。
21〜25ntのサイズ範囲の低分子RNAに払われる最近の注目のいくつかは、二本鎖RNAが、相同である任意のRNAの分解をもたらす、RNA干渉(RNAi)という現象に起因する(非特許文献19)。RNAiは、おそらくウイルス攻撃および可動性の遺伝因子に対する予防のために進化してきたであろう複雑かつ古くからの細胞機構に依存する。RNAi機構における重要なステップは、短鎖干渉RNA(siRNA)(それぞれ約22nt長である二本鎖RNA)の産生である。siRNAは、相同の標的RNAの分解および同じ標的RNAに対するより多くのsiRNAの産生をもたらす(非特許文献20)。RNAiのmRNA分解経路についての現在の見解は、逆平行のダイサー二量体が、長い二本鎖dsRNAを切断し、ATP依存性の方式でsiRNAを形成するということである。その後、siRNAは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、siRNAのATP依存性の巻き戻しによって、RISCが活性化される(非特許文献21;非特許文献22)。活性なRISC複合体は、このようにして、特異的な標的mRNAを分解するように導かれる。
miRNAが、遺伝子調節の新しく発見された隠された層に相当する可能性があるという現在の見解により、世界中の研究者の間で、miRNA、その標的、および作用の機構の発見に高い関心が持たれるようになった。しかし、これらの低分子RNAの検出および分析は、平凡なものではない。したがって、現在までの700を超えるmiRNAの発見には、その特別な特徴を利用することが必要とされてきた。最初に、研究グループは、単離および検出のための第一の基準として、miRNAの小さなサイズを使用した。その結果、第一に、cDNAライブラリ構築手順におけるサイズ選択によって、低分子のRNAが、通常除外されるので、標準のcDNAライブラリは、miRNAを欠くこととなった。ハエ胚、虫、またはHeLa細胞由来の全RNAは、サイズ分別されており、その結果、25ヌクレオチド以下の分子のみが捕捉されることとなった(非特許文献23)。その後、合成のオリゴマーが、T4 RNAリガーゼを使用して、RNAプールに直接的に連結されている。次いで、これらの配列は、逆転写され、PCRによって増幅され、クローン化され、配列決定された(非特許文献23)。その後、ゲノムデータベースは、この配列について照会され、これらの生物からのmiRNAの起源が確認され、このmiRNA遺伝子が、ゲノム内の他の遺伝子との関係において物理的に位置づけされている。大多数のクローン化された配列は、イントロン領域内、あるいは、遺伝子と遺伝子の間、時としてクラスター内に位置され、これは、タンデムに配置されたmiRNAが、協調調節を可能にするための単一の転写産物からプロセッシングされることを示唆している。さらに、ゲノム配列は、miRNA前駆体の折り返し構造を示している(非特許文献23)。
RNAエディティングは、他の力学的に規定された方法(選択的スプライシングまたはポリアデニル化など)を除いて、RNA分子の一次配列中の任意の特異的な変化を示すために使用される。エディティングに起因するRNA変化は、その変化が塩基レベルで起こるかヌクレオチドレベルで起こるかどうかに応じて、2つの広いカテゴリに分かれる(非特許文献32)。RNAエディティングは、非常に広範囲にわたり、哺乳類、ウイルス、有袋類、植物、ハエ、カエル、虫、イカ、真菌、粘菌、渦鞭毛藻類、キネトプラスト目原虫、および他の単細胞の真核生物で起こる。RNAエディティングが、すべての後生動物を含めた多くの他の種において、ほぼ確実に起こるので、知られているエディティング酵素の相同体の分布に基づくと、現行リストは、おそらく氷山の一角を示すに過ぎない。RNAエディティングは、発生的または組織特異的方式で調節される可能性があるので、これは、おそらく、ヒト疾患の病因論においてかなりの役割を果たすであろう(非特許文献32)。
転写アウトプットの詳細な構造の検出は、細胞または組織の分子的特徴付けのための重要なゴールである。ある組織内に存在するスプライスバリアントを検出および定量化できなければ、転写産物含有量またはタンパク質含有量を、正確に示すことはできない。分子医学的な研究では、多くの癌が、スプライスバリアントのレベルを変化させることを示すので、これらの転写産物を検出および定量化する精密な方法が必要とされる。異常なスプライス形を産生する突然変異はまた、脊椎・筋ジストロフィーおよび嚢胞性線維症などの重い疾患の主因である可能性がある。
RNA仲介型の遺伝子調節は、高等真核生物において広範囲にわたっており、RNA干渉、共抑制、導入遺伝子サイレンシング、インプリンティング、メチル化、ならびに、ひょっとすると斑入り位置効果(position−effect variegation)、およびトランスベクションのような複雑な遺伝事象はすべて、RNAシグナリングに基づくあるいは関係する交差(intersecting)経路を含む(非特許文献34)。最近の研究では、アンチセンス転写が、マウスおよびヒトゲノムにおいて非常に一般的な事象であることが示唆されている(非特許文献35;非特許文献36)。したがって、真核生物の細胞(例えばヒト細胞)における遺伝子発現のアンチセンス調節は、一般的な調節機構であると考えられる。これを考慮して、本発明は、非コードアンチセンスRNAの定量化のための方法、ならびにセンス−アンチセンス転写単位間のオーバーラップ領域の非常に精密なマッピングのための方法を提供する。
ランダー(Lander)、リントン(Linton)、ビレン(Birren)ら、2001年、「Nature」409:860〜921 ベンター(Venter)、アダムズ(Adams)、マイヤーズ(Myers)ら、2001年、「Science」291:1304〜1351 サチダナンダム(Sachidanandam)、ワイスマン(Weissman)、シュミット(Schmidt)ら、2001年、「Nature」409:928〜933 ウォン(Wong)ら、2001年、「Genome Research」11:1975〜1977 カンパ(Kampa)ら、2004年、「Genome Research」14:331〜342 クー(Ke)ら、2003年、「Curr.Opin.Chem.Biol.」7:516〜523 リー(Lee)ら、1993年、「Cell」75:843〜854 ラインハルト(Reinhart)ら、2000年、「Nature」403:901〜906 アンブロース(Ambros)ら、2003年、「RNA」9:277〜279 ラインハルト(Reinhart)ら、2002年、「Genes Dev.」16:1616〜1626 ラゴス−キンタナ(Lagos−Quintana)ら、2001年、「Science」294:853〜858 グリショク(Grishok)ら、2001年、「Cell」106:23〜24 リー(Lee)およびアンブロース(Ambros)、2001年、「Science」294:858〜862 ハットヴァンガー(Hutvanger)およびザモール(Zamore)、2002年、「Science」297:2056〜2060 パウシュキン(Paushkin)ら、2002年、「Curr.Opin.Cell Biol.」14:305〜312 ネルソン(Nelson)ら、2003年、「TIBS」28:534〜540 ドスティエ(Dostie)ら、2003年、「RNA」9:180〜186 カリン(Calin)ら、2002年、「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.」99:15524〜15529 ファイア(Fire)ら、1998年、「Nature」391:806〜811 リパルディ(Lipardi)ら、2001年、「Cell」107:297〜307 チャン(Zhang)ら、2002年、「EMBO J.」21:5875〜5885 ニッカネン(Nykaenen)ら、2001年、「Cell」107:309〜321 モス(Moss)、2002年、「Curr.Biology」12:R138〜R140 リー(Lee)およびアンブロース(Ambros)、2001年、「Science」294:862〜864 ゾン(Zeng)およびカレン(Cullen)、2003年、「RNA」9:112〜123 クリチェフスキー(Krichevsky)ら、2003年、「RNA」9:1274〜1281 グラッド(Grad)ら、2003年、「Mol.Cell」11:1253〜1263 シュミッテゲン(Schmittgen)ら、2004年、「Nucleic Acids Res.」32:e43 マイケル(Michael)ら、2003年「Mol.Cancer Res.」1:882〜891 ファレス(Juarez)ら、2004年、「Nature」428:84〜88 キドナー(Kidner)およびマルティエンセン(Martienssen)、2004年、「Nature」428:81〜84 ゴット(Gott)、2003年、「C.R.Biologies」326 901〜908 クロフト(Croft)ら、「Nature Genetics」、2000年 マティック(Mattick)、2001年、「EMBO reports 2」、11:986〜991 オカザキ(Okazaki)ら、2002年、「Nature」420:563〜573 イェリン(Yelin)ら、2003年、「Nature Biotechnol」
ゲノム機能を確立し、高等真核生物の複雑なトランスクリプトームに隠された情報の層を理解するという課題は、複雑な核酸サンプルにおけるRNA分子の検出、分析、および定量化のための新規の改良された技術を必要とする。したがって、均質なアッセイシステムにおいて特異的かつ感受性が高いオリゴヌクレオチド検出プローブに基づく方法を使用して、成熟したmicroRNA、siRNA、RNAエディティングされた転写産物、ならびに真核生物のトランスクリプトームにおける高度に相同のスプライスバリアントの発現を検出および定量化できることは、非常に望ましいであろう。
以降の発明の詳細な説明の目的で、特定の用語について、以下の定義が提供され、これらは、本発明の開示において使用される。
本発明は、オリゴヌクレオチドが、複数のヌクレオシド類似体を含有することを特徴とする、microRNAまたは低分子干渉RNAの単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。
a)標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させること、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、捕捉プローブにおけるアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
c)固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化し、そのあとに固体支持体から標的配列を解放すること、
d)逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なDNA鎖を合成すること、
e)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブとを使用する第2鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
f)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化すること。
a)標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させること、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、捕捉プローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
c)固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化すること、
d)逆転写酵素と、プライマーとしての捕捉プローブとを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なDNA鎖を合成すること、
e)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブとを使用する第2鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
f)DNAポリメラーゼおよび一対のプライマーを使用して、標的配列を鋳型にするPCR増幅を続けること、
e)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化すること。
1)2つのタギングプローブ、すなわちRTタギングプローブおよび第2鎖タギングプローブは、それぞれが、標的リボ核酸配列(例えば成熟したmiRNA)の6〜12ntに相当するヌクレオチド認識配列、ならびに、標的配列と、あるいは互いに、いかなる相補性も持たないアンカー配列からなるように設計および合成される。RTタギングプローブ、またはRTプローブと第2鎖プローブの両方の認識配列は、高親和性のヌクレオチド類似体(例えばLNA)によって改変される。RTタギングプローブ内の認識配列は、標的リボ核酸配列内の配列と、例えば、成熟したmicroRNAまたはsiRNAの3’末端と、あるいは、標的リボ核酸配列における、RNAエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型または点突然変異の3’に位置する配列と相補的である。RTタギングプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、複雑な核酸サンプル中の標的RNA配列とハイブリダイズし、逆転写酵素を使用する、標的RNA配列と相補的なアンカー付けされたプライマー伸長産物を産生するための、逆転写反応におけるアンカー付けされたプライマーとして使用される。
a)標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的である請求項1から3に記載のオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
c)逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なDNA鎖を合成すること、
d)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブを使用する第2鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
e)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化すること。
多くの非コードRNA分子(microRNA分子など)は、非常に短く、両方の逆転写酵素、PCRによる増幅、および、PCRによる増幅と検出のため所望により標識された検出プローブのためのプライマーの配置を収容しない。これを収容するための1つの解決法は、本発明によれば、好ましくは、成熟特異的なアッセイの設計を可能にする方法によって、microRNAにさらなる配列を追加することである。
a)前記の短い長さのRNAを含むサンプルから、1)前記の短い長さのRNAの配列からなる一本鎖標的配列、その相当するDNA配列、または前記の短い長さのRNAの配列と相補的なヌクレオチド配列、および2)5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、
b)逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、cDNAの鎖を得ること、および
c) 鋳型として前記cDNAおよび所望により鋳型ポリヌクレオチドを含む定量リアルタイムPCR(qPCR)を実施すること
を含む方法に関する。
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、5’または3’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である−特に、両方のプライマーが隣接する配列に関連する場合に、ステップaおよびbにおいて、(短い長さのRNAまたはそこから得られる配列に)配列特異的な、5’および/または3’配列の付加の存在、および/またはステップbが、短い長さのRNAに対して特異的な手法を利用することから利益を得る実施形態、
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する5’または3’ヌクレオチド配列の部分によって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の近接する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である−短い長さのRNA(またはそこから得られる配列)の部分の特異的な認識に起因する、比較的高い程度の特異性が、ステップcにおいて存在し、5’または3’ヌクレオチド配列が、配列特異的な手法に基づいて付加されることが好都合である可能性がある、および/またはステップbが、短い長さのRNAに対して特異的な手法を利用する実施形態、および
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、1つは、一本鎖標的配列内の第1のヌクレオチド配列に相当し、もう1つは、一本鎖標的配列内の第2のヌクレオチド配列と相補的である−短い長さのRNA(またはそこから得られる配列)の特異的な認識に起因する、高い程度の特異性が、ステップcにおいて存在する実施形態。
トランスフェラーゼ:EC 2.7.7.19(ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)、EC 2.7.7.52(RNAウリジリルトランスフェラーゼ)、およびEC 2.7.7.31(DNAヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ)。
リガーゼ:EC 6.5.1.1(DNAリガーゼ(ATP))、EC 6.5.1.2(DNAリガーゼ(NAD+))、およびEC 6.5.1.3(RNAリガーゼ(ATP))。
− オリゴヌクレオチド捕捉プローブ(その5’末端は、短い長さのRNAの3’末端と相補的である)に、短い長さのRNAの3’末端をアニーリングするステップと、
− 鋳型ポリヌクレオチドを構成する、伸長された短い長さのRNA分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのRNAを伸長するステップ。一般的に、ヌクレオチド重合は、鋳型ポリヌクレオチドを構成するRNA−DNAハイブリッドを得るために、DNA重合を含む。
− オリゴヌクレオチド捕捉プローブ(その3’末端は、短い長さのRNAの5’と相補的であり、その5’末端は、5’隣接ヌクレオチド配列を含む)に、短い長さのRNAの5’末端をアニーリングするステップと、
− 鋳型ポリヌクレオチドを構成する、伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのRNAを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップ。この場合、鋳型ポリヌクレオチドは、本来の短い長さのRNAをいずれも含まない。
−本明細書で記述する方法において使用される、最小数の逆転写プライマー、および/またはヌクレオチド重合プライマー、および/またはqPCRのためのプライマー、および/またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および/またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および/またはオリゴヌクレオチドプローブ、ここで、逆転写プライマー、ヌクレオチド重合プライマー、qPCRのためのプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプローブは、上で述べた特徴を共にもつ、ならびに
−逆転写プライマー、および/またはヌクレオチド重合プライマー、および/またはqPCRのためのプライマー、および/またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および/またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および/またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する、成熟した短い長さのRNAの定量測定のための指示書。キットの提供に関するすべての開示を、このキットに必要な変更を加えて準用する。
miR特異的アッセイ
・Biotinyleret LNA捕捉プローブ
・miR特異的なリバースプライマー
・miR特異的なフォワードおよびリバースプライマー
・miR特異的な二重標識されたプローブ
・RNA対照のオリゴヌクレオチド
・DNA対照のオリゴヌクレオチド
基準U6 snoRNAアッセイ
・基準U6 snoRNA RTプライマー/ランダムヘキサマープライマー
・基準U6 snoRNAプライマーおよび二重標識されたプローブ
一旦、適切な標的配列が、選択されると、LNA置換タギングプローブおよび検出プローブは、当分野で記載される通りに市販品として入手できる方法および装置を使用して、好ましくは化学的に合成される(「Tetrahedron」54:3607〜30、1998年)。例えば、短いLNAプローブを産生するために、固相ホスホラミダイト法を使用することができる(カラザーズ(Caruthers)ら、「Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.」47:411〜418、1982年、アダムズ(Adams)ら、「J.Am.Chem. Soc.」105:661(1983年)。
本発明はまた、捕捉プローブを組み入れるためのヌクレオチドの配列を設計するための、方法、システム、および計算機可読の媒体に記憶されるコンピュータプログラム(「コンピュータプログラム製品」)を提供する。
a)捕捉プローブを組み入れるためのヌクレオチドの1つまたは複数の配列の初期推定。
b)条件および目的の達成に基づく、初期推定の反復的な改良。
c)目下の方法に使用される計算時間も含めて、条件および目的が十分に達成された場合のアルゴリズムの停止。
A)初期推定は、プライマー発見ソフトウェア(primer3)を用いることによって見つけられる適切なリバースプライマーのリストにマッチするように、miRNA配列に基づく。ランダムな配列は、捕捉プローブの非初期状態の部分(non initialized parts)をふさぐように産生される。このランダムな産生は、意図されるTm値の近くのTmをもつ配列を確かめるためのジ−ヌクレオチドTm表を用いることによって導かれる。
B)反復的な改良は、目的および条件、およびジ−ヌクレオチドTm表のものに基づくスコア機能によって導かれる。最適以下の繰り返しを回避するために、ランダムな変更が行われる
C)目的、条件、および計算時間に基づくスコア機能が満たされる場合に、アルゴリズムを停止する。
1.miRNAに対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションのための融解温度条件
捕捉プローブとmiRNAによって形成される二本鎖の融解温度は、DNAポリメラーゼ伸張反応に適切であるように設定される。この二本鎖内のオリゴヌクレオチド長さは、上で述べたDNAポリメラーゼ伸張反応のためのTm条件を満たすべきである。miRNAは、捕捉プローブの3’末端にハイブリダイズした。
2.捕捉プローブとDNAポリメラーゼで伸長されたmiRNAによって形成される二本鎖のための融解温度条件
捕捉プローブとDNAポリメラーゼで伸長されたmiRNA標的によって形成される二本鎖のTmは、RNA−DNA標的を破壊せずにヘテロ二本鎖を変性できるような温度を超えないようにされる。
3.捕捉プローブと逆転写(RT)プライマーの関係
RTプライマーは、捕捉プローブの5’末端と同一の配列であり、DNAポリメラーゼで伸長されたmiRNAの3’末端とハイブリダイズする。RTプライマーとDNAポリメラーゼで伸長されたmiRNAによって形成されるこの二本鎖のTmは、逆転写酵素を使用する第1の鎖合成に適していなければならない。
4.成熟したmiRNAと前駆体miRNAとの区別
前駆体miRNAの3’末端は、捕捉反応のための所与のハイブリダイゼーション条件下で、捕捉プローブに対する有意な量のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないようにされる。同様に、前駆体miRNA配列内の成熟したmiRNA配列モチーフの後の前述のモノマーは、非miRNA関連の捕捉プローブ配列とハイブリダイズしないようにされる。
本発明はまた、二重標識されたプローブに組み入れるためのヌクレオチド配列を設計するための、方法、システム、および計算機可読の媒体に記憶されるコンピュータプログラム(「コンピュータプログラム製品」)を提供する。二重標識されたプローブは、特定のmiRNAまたは最大限の特異性をもつ特定のファミリーのmiRNAの検出のために使用される。
a)低い自己アニーリングおよび低い自己ハイブリダイゼーションの必要性。
b)PCR反応で機能するのに適したTmを有することによって、標的にアニーリングしなければならない。
c)PCR反応におけるプライマーにアニーリングしてはならない。
A)miRNAまたはmiRNAのファミリーに対する最大限の特異性をもつプローブの設計。二重標識されたプローブマッチと呼ばれる、条件を満たす好ましいプローブは、他のmiRNAに結合する二重標識されたプローブの能力によって調査される。二重標識されたプローブマッチは、その後、スコア機能に従って特異性スコアを割り当てられる。配列マッチ、配列の長さ、および配列におけるLNA改変されたヌクレオチドの使用によって、二重標識されたプローブマッチが決定される。
B)二重の標識プローブマッチは、それがどの位十分に上の条件を満たすかによって記録される。二重標識されたプローブは、そのスコア機能に従って、それがどの位十分に上の条件を満たすかによって記録される。特異性スコアおよびこの条件から得られるスコアは、二重標識されたプローブの最高のヌクレオチド配列を決定するために、その後使用される。
材料および方法
1.microRNA検出および定量化のためのオリゴヌクレオチドタギングプローブおよび検出プローブの設計および合成。
RNAオリゴヌクレオチド(EQ15885およびEQ15886)は、DNAテクノロジー社(DNA Technology)(Aarhus、デンマーク)で購入し、逆相クロマトグラフィー(RP−HPLC)によって精製した。このRNAオリゴヌクレオチドを、ピロ炭酸ジエチル−(DEPC)処理したH2Oに溶解し、濃度を、NanoDrop ND1000(ナノドロップテクノロジー(NanoDrop technologies)、米国)で決定した。別途、オリゴヌクレオチドを合成した、あるいは、標準のDNAオリゴヌクレオチドを、DNAテクノロジー(DNA technology)で購入した。
連結反応は、120nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885)、120nMの各microRNA タギングプローブ(リン酸化されたEQ15848(上記参照)およびEQ15849)、10mM トリス−HCl pH 7.0(アンビオン(Ambion)、米国)、10mM MgCl2(PEバイオシステムズ(PE Biosystems)、米国)、0.05×T4 DNAリガーゼバッファー[2.5mM トリス−HCl、0.5mM MgCl2、0.5mM DTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、pH 7.5 25℃;(NEB(米国))]からなる20μL内で実施された。反応物を、37℃で15分間、予備保温し、800U T4 DNAリガーゼを加え、37℃でさらに2時間保温した。最後に、この反応物を、65℃で20分、熱不活性化させた。miR−15a DNA (EQ15852)、標的としてのmiR−16 RNA(EQ15886)、またはmiR−15a RNA標的の代わりに鋳型無しを使用して、この連結反応を繰り返した。標的:microRNAタギングプローブの1:1のモル比だけでなく、比5:1におよび1:5も、別の連結反応で使用した。
3.1.SYBRグリーン検出を使用するmicroRNAリアルタイムPCRアッセイ
この反応は、(50μL)1×SYBR(登録商標)Green PCR Master Mix(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、200nM M13フォワードプライマー(EQ7396)、200nM M13リバースプライマー(EQ7655)、および2.5μL連結反応物(上記)を含んでいた。サイクリング(Cycling)手順:ABI Prism(登録商標)7000 Sequence Detection System内での、95℃10分、(95℃15秒、45℃1分、60℃1分)を50サイクル、60℃から95℃までの20分間の最終解離。
反応物(50μL)は、1×QuantiTect プローブ PCRマスターミックス(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、200nM hsa miR−15a M13フォワードプライマー(EQ15887)、200 nM hsa miR−15a M13リバースプライマー(EQ15888)、100nM LNA配列特異的プローブ(EQ15866またはEQ15867)、2.5μL連結反応物(上記)であった。サイクリング手順:ABI Prism(登録商標)7000 Sequence Detection System内での、95℃15分、(95℃20秒、60℃1分)を50サイクル。
ヒトmiR−15a microRNA標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイ。
配列特異的なLNA改変microRNAタギングプローブを、アニーリングおよび連結した。連結された鋳型を、負の対照として鋳型を抜いて、miR−15a microRNAについて、リアルタイムPCR、アンカーPCRプライマー、およびLNA改変された二重標識された検出プローブを使用してその後検出した。反応物の特異性を、リガーゼを含まない反応物を使用して試験した。miR−15a microRNA鋳型を使用する、連結されたmicroRNAプローブに対する、PCRサイクルに相当するサイクル閾値(Ct)(そこでは、ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加を、最初に検出することができる)が、35.0(図2A)であったのに対し、負の対照実験(それぞれ、鋳型抜きおよびリガーゼ抜き)に対するCt値は、検出可能ではなかった。基準化されたレポーターシグナル(Rn)が、PCR反応物に対して測定され、これは、受動的な基準染料の蛍光シグナルによって割られるレポーター色素の蛍光シグナルに相当する。PCRの間、Rnは、反応が、安定期に接近するまで、アンプリコンコピー数が増加するにつれて増加する。ベースライン補正されたRn(ΔRn)は、PCRの最初の数サイクルにおいて確立された、Rnマイナスベースラインシグナルに相当する。終点分析では(図2B)、リアルタイムPCRサンプル(4μL)を、1:10000Gelstarで染色した2 %アガロースゲル上に適用し、1×TBEバッファー(90mM トリス−ホウ酸、2mM EDTA、pH 8.3)内で8V/cmで2時間電気泳動させた。レーン1は、リアルタイムPCRにおける鋳型としての、連結されたmiR15a タギングプローブを示す。負の対照は、レーン2:鋳型抜き、およびレーン3:リガーゼを含まないであった。
ヒトmiR−15a microRNA標的配列および相当するDNA 3’でブロックされた標的に対するリアルタイム定量PCRアッセイ。
RNA鋳型を、3’末端でのリン酸を用いて化学的にブロックされたDNA鋳型によって置き換えた。連結反応においてリガーゼを加えることなく、ブロックされたDNA鋳型は、LNA配列特異的リアルタイムPCRアッセイにおいて検出される可能性はなかった。RNA鋳型およびDNA鋳型に対するCt値は、それぞれ35.0および33.3であった(図3)。
ヒトmiR−15aおよびヒトmiR−16 microRNA標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイの特異性。
発明の方法の配列特異的なmicroRNA標的配列認識を、miR−15a microRNA標的を用い、miR−15a標的配列と72 %の配列同一性を有するヒトmiR−16標的と比較して評価した。リアルタイムPCR反応における、鋳型抜きの対照も、鋳型無しの対照(NTC)も、いかなるシグナルも示さなかった。LNA改変miR15a標的のアニーリングのためのハイブリダイゼーション条件を使用すると、miR−15a標的に対する上で述べた通りの配列特異的タギングプローブが、36.2のCt値をもたらしたのに対し、miR−16と非常に相同な同じタギングプローブの使用は、13倍の差に相当する、39.9のCt値をもたらした(図4)。
2種類のLNA改変二重標識された検出プローブを使用する、ヒトmiR−15a microRNA標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイ
2種類のLNA改変リアルタイムPCR検出プローブを、Quick T4 DNA連結キットによって連結される同じLNA改変タギングプローブを使用するヒトmiR15a microRNA標的配列のために設計した。リアルタイムPCRアッセイにおけるLNA改変検出プローブEQ15866およびEQ15867の使用は、それぞれ、38.2および32.2のCt値をもたらした(図5)。両方のリガーゼ抜きの対照から検出されるシグナルは無かった(EQ15866 中空きの四角形; EQ15867 中空きの三角形)。
標的とmiR−15aタギングプローブとの間の異なるモル比を使用する、ヒトmiR−15a標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイ
標的とタギングプローブと間のモル比が1:1にであったものが、最も高い終点蛍光シグナルをもたらした(図6)(ΔRn値)のに対し、1:5のモル比は、最も低い終点シグナル(ΔRn値)をもたらした。モル過剰のmiR−15aタギングプローブ(1:5モル比)も、特異的な終点シグナル(図6)をもたらしたのに対し、PCR反応における鋳型無し対照(NTC)は、いかなる有意な蛍光シグナルも示さなかった。
miR−15aタギングプローブおよび最良の形態のLNA改変検出プローブを使用する、Torulla酵母RNAの複合(complex)バックグラウンドにスパイクされるヒトmiR−15a標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイ
miR−15a microRNAを、2.4μMおよび1μM濃度の10μgのTorulla酵母RNAにスパイクし、等モルの濃度のmiR−15aタギングプローブとそれぞれアニーリングさせ、それに続いて、連結し、定量リアルタイムPCRによってmiR−15a検出した。最も高い蛍光シグナルが、miR−15a標的配列対照(複合酵母全RNAバックグラウンドを含まない)から観察されたのに対して、蛍光シグナルは、酵母全RNAサンプルから検出されなかった(図7)。鋳型抜きの対照を用いて実証される通り、リアルタイムPCRアッセイのコンタミネーションは観察されなかった。
SYBR検出を使用する、ヒトmiR−15a microRNA標的配列に対するリアルタイム定量PCRアッセイ。
配列特異的なLNA改変microRNAタギングプローブを、アニーリングおよび連結させた。連結された鋳型が、リアルタイムPCR、アンカーPCRプライマー、およびSYBRグリーン検出を使用して容易に検出された(図8)のに対して、鋳型抜きまたはリガーゼ抜きの対照からは、シグナルが検出されなかった。
1−(3−(2シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)プロ−ピルアミノ)−4−(3−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)プロピルアミノ)−アントラキノン(3)クエンチャー「Q1」の調製
ロイコキニザリン(9.9g;0.04モル)を、3−アミノ−1−プロパノール(10ml)およびエタノール(200ml)と混合し、6時間加熱還流させる。この混合物を、室温に冷却し、大気条件下で終夜撹拌する。この混合物を、水(500ml)に注入し、沈殿物を濾過し、水(200ml)で洗浄して乾燥させる。この固体を、酢酸エチル(300ml)中で煮沸し、室温に冷却し、固体を濾過によって収集する。
収率:8.2g(56%)
1,4−ビス(3−ヒドロキシプロピルアミノ)−アントラキノン(7.08g;0.02モル)を、乾燥N,N−ジメチルホルムアミド(150ml)および乾燥ピリジン(50ml)の混合物に溶解する。ジメトキシトリチルクロライド(3.4g;0.01モル)を加え、混合物を2時間撹拌する。追加のジメトキシトリチルクロライド(3.4g;0.01モル)を加え、混合物を3時間撹拌する。混合物を、真空中で濃縮し、残渣を、ジクロロメタン(400mL)に再溶解し、水(2×200ml)で洗浄して、乾燥させる(Na2SO4)。この溶液を、シリカゲルパッド(φ10cm;h10cm)を介して濾過し、モノ−DMT−アントラキノン産物が捉えられなくなるまでジクロロメタンで溶出し、その後、溶媒を、ジクロロメタン中の2%メタノールに変更する。純粋な画分を合わせ、濃縮すると、青い泡が得られる。
収率:7.1g(54%)
1−(3−(4,4’−ジメトキシ−トリチルオキシ)プロピルアミノ)−4−(3−ヒドロキシプロピルアミノ)−アントラキノン(0.66g;1.0mmol)を、乾燥ジクロロメタン(100ml)に溶解し、3オングストローム分子ふるいを加えた。この混合物を、3時間撹拌し、その後、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(335mg;1.1mmol)および4,5−ジシアノイミダゾール(105mg;0.9mmol)を加える。この混合物を、5時間撹拌し、その後、飽和NaHCO3(50ml)を加え、10分間撹拌する。相を分離させ、有機相を、飽和NaHCO3(50mL)、塩水(50mL)で洗浄し、乾燥させる(Na2SO4)。濃縮後、ホスホラミダイトは、青い泡として得られ、さらに精製することなくオリゴヌクレオチド合成に使用される。
収率:705mg(82%)
1H−NMR(CDCl3):10.8(2H,2xt,J=5.3Hz,NH),8.32(2H,m,AqH),7.67(2H,m,AqH),7.5−7.1(9H,m,ArH+AqH),6.77(4H,m,ArH)3.9−3.75(4H,m),3.71(6H,s,OCH3),3.64−3.52(3.54(6H,m),3.26(2H,t,J=5.8Hz,CH2ODMT),2.63(2H,t,J=6.4Hz,CH2CN)2.05(4H,m,CCH2C),1.18(12H,dd,J=3.1Hz,CCH3)。
1−(3−(シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)プロピルアミノ)−5−(3−(4,4’−ジメトキシ−トリチルオキシ)プロピルアミノ)−アントラキノン(6)クエンチャー「Q2」の調製
1,5−ジクロロアントラキノン(2.8g;10mmol)を、DMSO(50ml)中の3−アミノ−1−プロパノール(10ml)と混合し、130℃まで4時間加熱する。この混合物を、約80°に冷却し、水(150mL)を加える。混合物がRTに到達したら、形成された沈殿物を、濾過によって単離し、水(2×50ml)で洗浄し、トルエン(200ml)中で煮沸し、溶解していない産物を、濾過によって単離し、乾燥させる。収率:3.2g(90%)。
1,5−ビス(3−ヒドロキシプロピルアミノ)−アントラキノン(1.4g;4mmol)を、ピリジン(50ml)と同時蒸発させ、その後、ピリジン(50ml)に再懸濁し、ジメトキシトリチルクロライド(1.4g;4.1mmol)を加え、終夜撹拌した。この混合物を、濃縮し、残渣をジクロロメタン(150ml)に再溶解し、飽和NaHCO3(2×50mL)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮する。シリカゲルカラム(メタノール/ジクロロメタン 2/98)上で精製する。適切な画分の濃縮後、モノDMT化合物は、赤い泡として得られる。収率:0.9g(34%)。1H−NMR(CDCl3):9.7(2H,2xt,NH),7.6−6.7(19H,m,ArH),3.86(2H,q,J=5.5Hz,CH2),3.74(6H,s,CH3),3.48(4H,m,NCH2),3.26(2H,t,J=5,9Hz),2.05(4H,m,CH2),1.45(1H,t,J=5Hz)。
1−(3−ヒドロキシプロピルアミノ)−5−(3−(4,4’−ジメトキシ−トリチルオキシ)プロピルアミノ)−アントラキノン(0.4g;0.61mmol)を、乾燥ジクロロメタン(50mL)に溶解し、3オングストローム分子ふるいを加える。この混合物を、3時間撹拌し、その後、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト(200mg;0.66mmol)および4,5−ジシアノイミダゾール(71mg;0.6mmol)を加える。この混合物を、2時間撹拌し、飽和NaHCO3(50mL)を加え、10分間撹拌する。相を分離させ、有機相を、飽和NaHCO3(50mL)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させる(Na2SO4)。濃縮後、ホスホラミダイトは、赤い泡として得られ、さらに精製することなくオリゴヌクレオチド合成に使用される。収率:490mg(93%)。31P−NMR(CDCl3):148.3。
1.トレハロースを使用するMicroRNAを鋳型にする連結反応
連結反応は、50nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I)、500nMの各々のmicroRNAタギングプローブ、10mMトリス−HCl pH 7.0(アンビオン(Ambion)、米国)、10mM MgCl2(アンビオン(Ambion)、米国)、0.05×T4 DNAリガーゼバッファー[2.5mM トリス−HCl、0.5mM MgCl2、0.5mM DTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、 pH 7.5 25℃;(NEB、米国)]、24g/100ml トレハロース(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)、米国)0.05μg/μL Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)からなる20μL内で実施された。この反応物を、42℃で15分間、予備保温し、800U T4 DNAリガーゼ(NEB、米国)を加え、サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)中で、42℃で1時間保温した。最後に、反応物を、95℃で20分間熱不活性化させた。連結反応は、miR−15a RNA標的以外の鋳型を含まずに繰り返された。
反応物(50μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2を含有; pH 8.7(20℃)](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA配列特異的miR−15a検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX Reference Dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μL連結反応物(上で述べた通り)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。サイクリング手順:Applied Biosystems(アプライドバイオシステム) 7500 リアルタイム PCR System内で、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を50サイクル。
aLNA(大文字)、DNA(小文字)、5−メチルC(mC);フルオレセイン(6−FITC(グレンリサーチ(Glenn Research)、Prod.Id.No.10−1964))、番号Q1(実施例8aに記載される通りに調製される)、z(5−ニトロインドール(グレンリサーチ(Glenn Research)、Prod.Id.No. 10−1044))、リン酸(P)、Xは、LNA−2,6−ジアミノプリンを表し、Zは、LNA−2−チオチミジンを表す。
miR−15aタギングプローブ対の3つの異なるセットと共にmicroRNAを鋳型にする連結を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対するリアルタイム定量PCR
配列特異的なLNA改変microRNAタギングプローブを、アニーリングおよび連結させた。ヒトmiR−15a microRNAタギングプローブの3つの異なる対を、選択し(表II)(Pair I. EQ16311/EQ16452、II. EQ16453/EQ16307、およびIII.EQ16447/EQ16307)、連結反応を、上で述べた通りに実施した。その後、連結された鋳型を、アンカーPCRプライマーと、miR−15a microRNAのためのLNA改変二重標識された検出プローブによって、上で述べた通りのリアルタイムPCRを使用して検出した。負の対照として鋳型を抜いた。連結反応の特異性を、T4 DNAリガーゼを加えない反応物を使用して試験した。miR−15a microRNA鋳型についての、PCRサイクルに相当するサイクル閾値(Ct)(そこでは、ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加を、最初に検出することができる)は、microRNAタギングプローブ対I、II、IIIについて、それぞれ17.2、30.5、および28.7であった(図13)。Ct値が、対IIおよびIIIを用いて実施された負の対照実験(それぞれ、鋳型抜き、リガーゼ抜き)について検出可能ではなかったのに対し、対Iを用いて実施される負の対照からのCt値は、それぞれ、サイクル数37および39の後に、検出可能であったが、これは、17.2という相当するCt値(図13)と比較すると、まだ許容されるものである。基準化されたレポーターシグナル(Rn)は、完全なPCRサイクリングプログラムを通して測定され、これは、受動的な基準染料の蛍光シグナルによって割られたレポーター色素の蛍光シグナルに相当する。PCRの間、Rnは、反応が、安定期に接近するまで、アンプリコンコピー数が増加するにつれて増加する。ベースライン補正されたRn(ΔRn)は、PCRの最初のk数サイクルにおいて確立された、Rnマイナスベースラインシグナルに相当する。
microRNAを鋳型にする連結およびLNA 2,6−ジアミノプリンで増強された検出プローブを使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対する、改良されたリアルタイム定量PCR
上で述べた通りのヒトmiR−15aを鋳型にする連結反応において、LNA改変配列特異的microRNAタギングプローブEQ16311/EQ16452(実施例9における対I)を使用して、リアルタイムPCR反応を繰り返した。連結された鋳型は、その後、アンカーPCRプライマーと、miR−15a microRNAのためのLNA改変二重標識された検出プローブ(EQ16580、EQ16581、EQ16582、またはEQ16583、表II)によって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量PCRを使用して検出された。連結反応の特異性は、T4 DNAリガーゼを加えない反応物を使用して試験された。Torulla酵母RNAの複合バックグラウンドにスパイクされたヒトmiR−15a microRNA鋳型を使用するCt値は、LNAで改変された二重標識された検出プローブEQ16580、EQ16581、EQ16582、およびEQ16583について、非常に類似(すなわち、それぞれ、30.4、30.0、29.9、および30.6)であった(図14、表II)。対照的に、Ct値は、負の対照実験(鋳型抜きおよびリガーゼ抜き、図14)については検出可能ではなかった。LNA Aヌクレオチドのうちの1つから2つを、LNA 2,6−ジアミノプリンモノマーで置換することによって、microRNAアッセイにおいて検出される、ベースライン補正された蛍光シグナル、ΔRnが、有意に増強されたのに対し、第3のLNA 2,6−ジアミノプリンモノマー(EQ 16583、表II)での置換は、蛍光シグナルをさらに増強はせず、二重の(double)LNA 2,6−ジアミノプリンで置換されたmiR−15a検出プローブ(EQ 16582、表II、図14)と類似の結果を示した。
鋳型としてmicroRNAを鋳型にする連結反応を使用するヒトmiR15a microRNAに対して作成される、リアルタイム定量PCRの標準曲線
LNA改変ヒトmiR−15a microRNA タギングプローブ対 EQ16311/EQ16452(実施例9における対I)を、上で述べた通りのmiR−15aを鋳型にする連結反応に使用した。ただし、ヒトmiR−15a鋳型濃度は、それぞれ、50、5、0.5、0.05、または0.005nMであった。連結された鋳型は、その後、アンカーPCRプライマーと、miR−15a microRNAのためのLNAで改変された二重標識された検出プローブ(EQ15866、表I)によって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量PCRを使用して検出された。連結反応の特異性は、リガーゼを含まない反応物を使用して試験された。miR−15a microRNA鋳型を使用するCt値は、miR−15a microRNAの、50、5、0.5、0.05、および0.005nMの濃度に対して、それぞれ、17.6、22.0、25.9、29.6、および35.6であったのに対し、Ct値は、負の対照実験(鋳型抜きおよびリガーゼ抜き)については検出可能ではなかった。Ct値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図15に図示するように、コピー数の対数に対してCt値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定された。タイトレーションカーブの傾きは−4.31、切片は30.9であった。
LNA改変タギングプローブおよびLNAで改変された二重標識された検出プローブを用いる、microRNAを鋳型にするRT−PCR反応を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対するリアルタイム定量PCR
1.LNA改変タギングプローブを用いるMicroRNA逆転写および第2鎖反応。
逆転写およびPCR(RT−PCR)反応は、2nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I))、600nMの各microRNA タギングプローブ、1×OneStep RT−PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2、DTT、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400μMの各dNTP(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、20uのSUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA、および2μLキアゲンOneStep RT−PCR Enzyme mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)からなる50μL内で実施された。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、開始温度に予備加熱した。温度プロフィールは、50℃を30分、95℃を15分、50℃を1分、、72℃を3分であり、最後に、4℃に冷却した。このRT−PCR反応を、負の対照として鋳型無しで繰り返した。
PCR反応(50μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7(20℃)を含有]、(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA配列特異的検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、鋳型(上記)としての5μLのRT−PCR反応物、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)内で実施された。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイム PCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内での、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を50サイクル。
LNA改変タギングプローブおよびLNA 2,6−ジアミノプリンで増強された検出プローブを用いるmicroRNAを鋳型にするRT−PCR反応を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対する改良されたリアルタイム定量PCR
1.LNA改変タギングプローブを用いるMicroRNA逆転写および第2鎖反応。
RT−PCR反応は、2nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I)、60nMの各microRNA タギングプローブ、1×OneStep RT−PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2、DTT、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400μMの各々のdNTP(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、10UのSUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA、および1μLキアゲンOneStep RT−PCR Enzyme mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)からなる25μL内で実施された。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、50℃30分、95℃15分、50℃1分、72℃3分であり、最後に、4℃に冷却した。このRT−PCR反応を、miR−15a RNA標的ではなく、負の対照として、鋳型を含まずに繰り返した。
この反応物(25μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μLのRT−PCR反応物(上記)、および1.25U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイム PCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内での、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を50サイクル。
鋳型としてmicroRNAを鋳型にするRT−PCR反応を使用する、ヒトmiR15a microRNAに対して作成されるリアルタイム定量PCR標準曲線
ヒトmiR−15a microRNAのためのLNA改変microRNAタギングプローブEQ16624/EQ16620(対VII)をアニーリングさせ、逆転写プライマー(RTタギングプローブ)および第2鎖タギングプローブとして伸長させた。RT−PCR反応を、上で述べた通りに実施した。ただし、ヒトmiR−15a microRNA鋳型濃度は、それぞれ、50、5、0.5、0.05、または0.005nMであった。miR−15a RT−PCR反応は、その後、アンカーPCRプライマーと、miR−15a microRNAのためのLNAで改変された二重標識された検出プローブ(EQ16582)を使用することによって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量PCRを使用して検出された。microRNA RT−PCR反応の特異性は、OneStep RT−PCREnzyme mixを含まない反応を使用して評価された。miR−15a microRNA鋳型を使用するCt値は、miR−15a microRNAの、50、5、0.5、0.05、および0.005nMの濃度に対して、それぞれ、22.2、26.5、30.6、33.6、および37.8であったのに対し、Ct値は、負の対照実験(鋳型抜きおよびOneStep RT−PCR Enzyme mix抜き)については検出可能ではなかった。Ct値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図18に図示するように、コピー数の対数に対してCt値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定される。タイトレーションカーブの傾きは−3.81、切片は34.0であった。
鋳型としてmicroRNAを鋳型にするRT−PCR反応物および高いアニーリング温度を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対するリアルタイム定量PCR
ヒトmiR−15a microRNAに対するLNA改変microRNAタギングプローブEQ16624/EQ16620(対VII)をアニーリングさせ、逆転写プライマー(RTタギングプローブ)および第2鎖タギングプローブとして伸長させた。アニーリング温度プロフィールは、逆転写プライマーと第2鎖タギングプローブ両方について、50℃から、55℃または60℃に変えた。RT−PCR反応は、上で述べた通りに実施した。miR−15a RTPCR反応を、その後、アンカーPCRプライマーと、負の対照として鋳型を抜く、miR−15a microRNAのためのLNAで改変された二重標識された検出プローブ(EQ16582)を使用することによって、上で述べた通りのリアルタイム定量PCRを使用して検出した。microRNA RT−PCR反応の特異性は、OneStep RT−PCR Enzyme mixを含まない反応を使用して評価された。miR−15a microRNA鋳型を使用するCt値は、50、55、および60℃のアニーリング温度に対して、それぞれ、28.6、29.3、および31.0であったのに対し(図19)、Ct値は、負の対照実験(鋳型抜きおよびOneStep RT−PCR Enzyme mix抜き)については検出可能ではなかった。
LNA改変タギングプローブおよびLNA 2,6−ジアミノプリン/LNA 2−チオチミジンで増強された検出プローブを用いるmicroRNAを鋳型にするRT−PCR反応を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対する改良されたリアルタイム定量PCR
1.LNA−改変タギングプローブを用いるMicroRNA逆転写および第2鎖反応。
RT−PCR反応は、2nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I)、60nMの各microRNA タギングプローブ、1×OneStep RT−PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2、DTT、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400μMの各々のdNTP(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、および2μLキアゲンOneStep RT−PCR Enzyme mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)からなる50μL内で実施された。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、50℃30分、95℃15分、50℃1分、72℃3分であり、最後に、4℃に冷却した。このRT−PCR反応を、miR−15a RNA標的ではなく、負の対照として、鋳型を含まずに繰り返した。
この反応物(25μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μLのRT−PCR反応物(上記)、および1.25U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイム PCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内で、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を50サイクル。
3’でブロックされたLNA改変タギングプローブおよびLNA改変検出プローブを用いるmicroRNAを鋳型にするRT−PCR反応を使用する、ヒトmiR−15a microRNAに対するリアルタイム定量PCR
1.ブロックされたLNA改変タギングプローブを用いるMicroRNA
1.鎖転写反応
逆転写(RT)反応は、25nM miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I)、50nM microRNAブロックタギングプローブ(EQ16695)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表1)、1×第1鎖バッファー(50mM トリス−HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH 8.3 20℃)(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、500μMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、10U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA、および1U Superscript III逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)からなる20μL内で実施された。mir−15a鋳型、microRNAブロックタギングプローブ、およびリバースプライマーは、混合物であり、70℃で10分加熱し、氷上で急冷した。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、55℃を60分、70℃を15分であり、最後に、4℃に冷却した。この第1鎖合成を、miR−15a RNA標的ではなく、負の対照として、鋳型またはSuperscript IIIを含まずに繰り返した。この第1の鎖合成をさらに、miR−15a RNA標的ではなく、標的としてmiR−16 RNA(EQ15886)を使用して繰り返した。
反応物(50μL)は、1×AmpliTaq Goldバッファー(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、1.5mM MgCl2、200nM 第2鎖LNAタギングプローブ(EQ16624、表II)、20μLのRT反応物(上記)、および1.25のU AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)であった。サイクリング手順:DYAD(商標)サーモサイクラー(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)内で、(95℃1分、55℃1分)を10サイクル。
この反応物(25μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、200nMの最終濃度までのhsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μLの第1および第2鎖反応物(上記)、および1.25U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイム PCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内で、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を45サイクル。
3’でブロックされたLNA改変タギングプローブおよびLNA改変検出プローブを用いるmiRNAを鋳型にするRT−PCRを使用する、成熟したヒトmiR−15a microRNAに対するリアルタイム定量PCR
1.RNA−プライムドDNA指向性のDNA合成が可能な酵素を使用する、ブロックされたLNA改変miRNAタギングプローブを用いるMicroRNAプライマー伸張
miRNAプライマー伸張反応は、20μL内で実施された。最初に、500nmol miR−15a RNA鋳型(EQ15885、表I)、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、および25nM microRNAブロックタギングプローブ(EQ16695、表II)を混合し、70℃で10分加熱し、氷上で急冷した。1×EcoPolバッファー(NEB、米国)、500μMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、10U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、5U Klenow Fragment(3’→5’エキソ−)酵素(NEB、米国)、および総体積20μLにするためのジエチルピロカルボネート処理H2Oを加えた。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、37℃に加熱し、以下のプロフィールを使用するサイクルにかけた;37℃を30分、75℃を20分、それに続いて4℃に冷却。
ステップ番号1からのプライマー伸張反応物を、以下を含有する50μL反応混合物に希釈した;60nM 第2鎖LNAタギングプローブ(EQ16624、表II)、200nM hsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表I)、400μMの各dNTP、1×Qiagen OneStep RT−PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、米国)、2μL Qiagen OneStep RT−PCR Enzyme mix(Omniscript(商標)逆転写酵素、SensiScript(商標)逆転写酵素、およびHotStarTaq(登録商標)DNAポリメラーゼを含有;dNTP、バッファー、および酵素は、キアゲン(Qiagen)、米国から購入)、およびジエチルピロカルボネート処理H2O(50μLの最終体積まで)。サーモサイクラーDYAD(商標)(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)を、50℃に加熱し、以下の温度プロフィールを使用するサイクルにかけた;50℃30分、95℃15分、および(95℃1分、55℃1分、72℃2分)を10サイクル、それに続いて4℃に冷却。
リアルタイムPCR反応混合物(25μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7(20℃)を含有](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、4mMの最終濃度までのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);200nM hsa−miR−15aフォワードプライマー2(EQ16444、表II)、300nMの最終濃度までのhsa−miR−15aリバースプライマー2(EQ16445、表II)、250nM LNA検出プローブ(EQ15866、表I)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μLの第1および第2鎖反応物(上記)、および1.25U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)を含有していた。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイムPCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内で、95℃10分、(95℃20秒、60℃1分)を40サイクル。
3’でブロックされたLNA改変されたタギングプローブを用いるmiRNAを鋳型にするRT−PCRを使用する、成熟したヒトmiR−15a microRNAについて作成されるリアルタイム定量PCR標準曲線。
上で述べた通り(実施例18)に3’でブロックされたLNA改変タギングプローブを用いる、miR−15aを鋳型にするRT−PCRに、LNA改変ヒトmiR−15a microRNA タギングプローブ対 EQ1695/EQ16624(実施例18における対IX)を使用した。ただし、ヒトmiR−15a鋳型鋳型濃度は、それぞれ、500、50、5、0.5、または0.05fmolであった。miRNA−15a鋳型は、その後、負の対照として鋳型を抜き、アンカーPCRプライマーと、miR−15a microRNAのためのLNAで改変された二重標識された検出プローブ(EQ15866、表I)によって、上で述べた通りのリアルタイム定量PCRを使用して検出した。Ct値は、500、50、5、0.5、および0.05fmolのmiR−15a microRNA鋳型それぞれに対して、それぞれ、18.4、21.1、24.7、28.5、および32.0であったのに対し、Ct値は、鋳型を含まない負の対照実験については36.8であった。Ct値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図24に図示するように、コピー数の対数に対してCt値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定された。タイトレーションカーブの傾きは−3.45、切片は27.4であった。
ヒトU6 snRNAに対するリアルタイムPCR。
1. U6 snRNA逆転写
逆転写(RT)反応は、1μg Quantitative PCR Human Reference Total RNA鋳型(ストラタジーン(Stratagene)、米国)、5μg pd(N)6ランダムヘキサマー(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences)、スウェーデン)、1×第1鎖バッファー(50mM トリス−HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH 8.3 20℃)(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1mMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、10UのSUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および200U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を含有する20μL内で実施された。Reference Total RNA鋳型およびランダムヘキサマーを、混合し、50℃で5分加熱し、氷上で急冷した。サーモサイクラーDYAD(商標)上の温度プロフィール(MJリサーチDNAエンジン(MJ Research DNA engine)、米国)は、37℃で30分、42℃で90分であり、その後、4℃で保持した。第1鎖合成体は、製品の指示書に従って、Microcon YM−30 Centrifugal Filter Unit(ミリポア(Millipore)、米国)上で精製した。遠心分離の後、回収されたサンプルを、元々のRT出発体積(全体で100μL)の5倍に希釈した。
この反応物(50μL)は、1×PCRバッファー[トリスHCl、KCl、(NH4)2SO4、pH 8.7 20℃](キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、最終濃度4mMまでのMgCl2、200nMの各dATP、dCTP、dGTP、および600nM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国);900nM U6 snRNAフォワードプライマー(EQ17160、表V)、900nM U6 snRNA RTプライマー(EQ17159、表V)、250nM LNA検出プローブ(EQ17167、表V)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1または5μLの第1の鎖合成(RT)反応物(上記)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。サイクリング手順:Applied Biosystems 7500 リアルタイム PCR System(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)内で、95℃10分、(95℃15秒、60℃1分)を40サイクル。
以下を使用するヒトmiR−15aのためのリアルタイムRT−PCR;3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのMicroRNA−プライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
1.3’でブロックされた、5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのmicroRNAプライムド伸張反応。
Hsa miR−15a RNA(1fmol;EQ15885、表I)を、総体積6μL中で、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)および100fmolのmiR−15a捕捉プローブ(EQ16879、表VI)と混合し、65℃で5分間加熱し、氷上で急冷し、1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)を加えた。保温は、37℃で30分間続けられた。
1体積の2×結合バッファー(200mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、800mM LiCl、40mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ(Roche)、ドイツ)に移した。37℃で3分間の保温によって、ビオチン−ストレプトアビジン結合を形成させた。室温の5体積の洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、20mM LiCl)中で3回洗浄することによって、結合していない材料を除去した。「直ちにRT反応を続行する」。
RT−プライマー(100fmol、EQ16994、表VI)および10nmoleの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンPCRチューブに加えた。このチューブを、70℃で5分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。5×第1の鎖バッファーa(50mM トリス−HCl pH 8.3 20℃、75mM KCl、3mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10×DTT(1×=10mM、インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および200U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え(8μLの体積中で)、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱して、反応を停止させた。
この反応物(50μL)は、1×PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、最終濃度4mMまでのMgCl2、0.2mMの各dATP、dCTP、dGTP、および0.6mM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、900nM miR−15aフォワードプライマー(EQ16990、表VI)、900nM miRリバースプライマー(EQ16989、表VI)、250nM miR−15a LNA検出プローブ(EQ16992、表VI)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった。37℃10分、95℃10分、45℃1分、60℃1分、それに続いて(95℃20秒、60℃1分)を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、ABI7500リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)で実行された。
以下を使用する、ヒトmiR−15aの希釈シリーズに対する、リアルタイムRT−PCR;3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上のMicroRNAプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中の逆転写酵素(RT)反応、およびLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
1.3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上のmicroRNAプライムド伸張反応
Hsa miR−15a RNA(100fmol、10fmol、1fmol、100amol、または10amol; EQ15885、表I)を、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)および100fmolのmiR−15a捕捉プローブ(EQ16879、表V))と総体積7μL内で混合し、65℃で5分間加熱し、氷上で冷却した。1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)を加えた。37℃で30分間保温を続けた。
1体積の2×結合バッファー(200mMトリスHCl pH 7.5 20℃、800mM LiCl、40mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ(Roche)、ドイツ)に移した。37℃での3分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の5体積の洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、20mM LiCl)中で、3回洗浄することによって除去した。
RT−プライマー(100fmol、EQ16994、表VI)および10nmolの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL内で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンPCRチューブに加えた。チューブは、70℃で5分間加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに移した。5×第1鎖バッファーa(50mM トリス−HCl pH 8.3)20℃、75mM KCl、3mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10x DTT(1×=10mM、インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および200U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え(体積8μL内で)、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。
この反応物(50μL)は、1×PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、最終濃度4mMまでのMgCl2、0.2mMの各dATP、dCTP、dGTP、および0.6mM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、900nM miR−15aフォワードプライマー(EQ16990、表VI)、900nM miRリバースプライマー(EQ16989、表VI)、250nM miR−15a LNA検出プローブ(EQ16992、表VI)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μLの第1鎖合成(RT)反応(上記)、0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。温度サイクリングプログラムは、37℃10分、95℃10分、45℃1分、60℃1分、それに続いて(95℃20秒、および60℃1分)を40サイクルであった。リアルタイムRT−PCR分析は、ABI 7500リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)で実行された。
3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA−改変捕捉プローブ上のMicroRNAプライムド伸張反応、ストレプトアビジンビーズ上の伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素(RT)反応、およびLNA改変検出プローブを使用するリアルタイムPCRを使用するヒトmiR−15aのためのリアルタイムRT−PCR
1.3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA−改変捕捉プローブ上でのmicroRNAプライムド伸張反応
Hsa miR−15a RNA(1fmol; EQ15885、表I)を、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)および100fmol miR−15a捕捉プローブ(EQ16879(表VI))と、総体積7μL中で混合し、65℃で5分間加熱し、氷上で冷却した。1μL 10× NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(それぞれ1mM;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)を加えた。37℃で30分間、保温を続けた。
10μg Dynabeads M−270ストレプトアビジン;(ダイナルバイオテック(Dynal Biotech)、ノルウェー)を含有する1体積(10μL)の2×結合バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、2M NaCl、1mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、回転させながら20℃で10分間保温し、ビオチン−ストレプトアビジン結合を形成させた。チューブを、磁性粒子濃縮器(magnetic particle concentrator)(Dynal MPC−9600;ダイナルバイオテック(magnetic particle concentrator)、ノルウェー)に入れた。上清を除去し、ビーズを100μL洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、20mM NaCl)で3回洗浄した。「直ちにRT反応を続行する」。
RT−プライマー(100fmol、EQ16994、表VI)および10nmolの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するチューブに加えた。このチューブを、70℃で5分加熱し、磁性粒子濃縮器に移し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。5×第1鎖バッファーa(50mM トリス−HCl pH 8.3 20℃、75mM KCl、3mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10×DTT(1×=10mM、インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および200U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え(体積8μL内で)、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。
この反応物(50μL)は、1×PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、最終濃度4mMまでのMgCl2、0.2mMの各dATP、dCTP、dGTP、および0.6mM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、900nM miR−15aフォワードプライマー(EQ16990、表VI)、900nM miRリバースプライマー(EQ16989、表VI)、250nM miR−15a LNA検出プローブ(EQ16992、表VI)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;37℃10分、95℃10分、45℃1分、60℃1分、それに続いて(95℃20秒、および60℃1分)を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、ABI 7500リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)で実行された。
5‘ビオチンを含有するLNA改変捕捉プローブによってプライムされる固体支持体上での逆転写を使用するヒトmiR−7aに対するリアルタイム定量PCR、それに続く、LNA改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
1.5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのmicroRNA−プライムド伸張反応
10μLの総体積内で、以下を混合した:Hsa miR−7a RNA(10fmol;EQ16898(表VII)、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)および100fmol miR−7a捕捉プローブ(EQ 17367、表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)。この混合物を、37℃で30分間保温した。
2.5μLの5×結合バッファー(500mMトリスHCl pH7.5 20℃、2M LiCl、100mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ(Roche)、ドイツ)に移した。37℃での3分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の100μLの洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH7.5 20℃、20mM LiCl)中で、5回洗浄することによって除去した。
20μLの以下のRT反応混合物を、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンでコートされたPCRチューブに加えた:1×第1鎖バッファー(50mM トリス−HCl pH8.3 20℃、75mM KCl、3mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1.25mMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、20U SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および200U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を、42℃で1時間保温した。
RT−混合物を除去し、1×Quantitect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen)、米国)、フォワードおよびリバースプライマー(EQ17372およびEQ17374、表VII)(各0.4μM)、1U ウラシル−DNA グリコシラーゼ(UNG、ロシュ(Roche)、ドイツ)を含有する20μLのPCRマスター混合物で置き換えた。Pre−PCRを、以下のPCR条件にかけた:95℃15分、30℃1分、40℃1分、60℃1分、および(94℃20分、および60℃1分) を10サイクル。この反応物を、リアルタイムPCRの実施まで4℃に維持した。その後、80μLのDEPC−H2Oを、リアルタイムPCRでの使用よりも前に、pre−PCR反応に加えた。
この50μLリアルタイムPCR混合物は、1×Quantitect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen))、フォワードおよびリバースプライマー(EQ17372およびEQ17374、表VII)(各0.4μM)、0.2μM miR−7a LNA検出プローブ(EQ17377、表VII)、1U UNG(ロシュ(Roche)、ドイツ)、および5μLの希釈された第1鎖合成(RT)−pre−PCR反応物(上記)を含有していた。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;95℃15分、94℃20秒および60℃1分を40サイクル。リアルタイムPCRは、オプティコン・リアルタイムPCR装置(Opticon リアルタイム PCR instrument)(MJリサーチ(MJ Research)、米国)で実施された。
リアルタイムPCRは、十分な量のシグナルを伴う、S字形増幅プロット(図26)、および18.5のCt値をもたらした。得られたCt値は、目下の実験で使用されるHsa−miR−7aの量に対して妥当であり、アッセイの完全な機能性を示唆している。
二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブの合成、脱保護および精製
表I、IIおよびV〜VIIの二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわちEQ15866、EQ15867、EQ16580−16583、EQ16679、EQ17167、EQ16879、EQ16992、EQ17367、およびEQ17377を、2−シアノエチルで保護された(protected)LNAおよびDNAホスホラミダイト(シンハ(Sinha)ら、「Tetrahedron Lett.24」:5843〜5846、1983年)を用いるホスホラミダイト手法(ビウケージ(Beaucage)およびカラザーズ(Caruthers)「Tetrahedron Lett.22」:1859〜1862、1981年)を使用して、自動DNA合成装置(Expedite 8909DNA合成装置、パーセプティブバイオシステムズ(PerSeptive Biosystems)、0.2μmolスケール)で調製した。
以下を使用するヒトhsa−Let−7aに対するリアルタイムRT−PCR;3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上のMicroRNAプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブ上の伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーQ2と共にLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR
1.3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのmicroRNA−プライムド伸張反応
Hsa Let−7a RNA(10fmol; EQ16898、表VII)を、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、100fmol cP5_hsa−let−7a捕捉プローブ(EQ17367、表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)と、総体積10μL中で混合した。37℃で30分間、保温を実施した。
体積2.5μLの5×結合バッファー(500mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、2M LiCl、100mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ((Roche))、ドイツ)の底部に移した。37℃での3分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の100μLの洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH7.5 20℃、20mM LiCl)中で、5回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
RT−プライマー(1μl 100fmol/μl、EQ17374、表VII)および2.5 dNTP(10mMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンPCRチューブに加えた。このチューブを、70℃で5分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。4μl 5×第1鎖バッファー(250mM トリス−HCl pH8.3 20℃、375mM KCl、15mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、2μl 10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μl 20U/μl SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および1μl 200U/μl Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。80μLのDEPC H2Oを加えることによって、総体積を、100μLに調節した。
この反応物(50μL)は、1×QuantiTect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400nM hsa−let−7a_qPcR−F−プライマー3(EQ17372、表VII)、400nM hsa−let−7a qPcR−R−プライマー2(EQ17375、表VII)、200nM hsa−let−7a_qPcR−プローブ2_Q2検出プローブ(EQ18089、表VII)、5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、および0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;37℃10分、95℃15分、30℃1分、40℃1分、60℃1分、それに続いて94℃20秒および60℃1分を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、オプティコン・リアルタイムPCR装置(Opticon リアルタイム PCR instrument)(MJリサーチ(MJ Research)、米国)で実施された。
実験は、3回繰り返して実施され、得られる平均Ct値は、19.0であり、CVは0.01であった。hsa Let−7a miRNAを加えない反応を3回繰り返しても、シグナルは生じず、Ct値は得られなかった。
前駆体pre−miRNA hsa Let−7aの調製
1.In vitro転写
a.T7プロモーター/リーダーオリゴ(EQ18219、表VIII参照)を、hsa−let−7a−1前駆体longmer DNAオリゴヌクレオチド(EQ18213、表VIII参照)と、各オリゴヌクレオチドの最終濃度20μMで混合した。
b.サンプルを、95℃で5分加熱し、この溶液を、ベンチ内で室温に冷却させた。
c.上の溶液の8μLを、通常の20μL MegaScript反応(アンビオン(Ambion)、米国)(ATP、GTP、CTP、UTP、反応バッファーおよび酵素ミックスを含有する)における鋳型として使用した。
d.この反応物を、37℃で終夜保温した。
e.1μL DNアーゼを加え、反応物を、37℃で15分保温した。
f.in vitro転写された前駆体pre−miRNAを、miRNAクリーンアップのための改変されたプロトコルを使用して、RNeasy MinElute Cleanupスピンカラムで精製した。
1.サンプルに350μlバッファーRLTを加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。
2.1体積の80%エタノール(350μl)を加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。遠心分離はしない。直ちにステップ3を続行する。
3.形成された可能性があるいかなる沈殿物も含むサンプルをピペットで、2mlのコレクションチューブに入れたRNeasy Miniスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、8000×gで15秒間遠心分離する。
4.RNeasy Miniスピンカラムを廃棄する。
5.ステップ3からのフロースルー(flow−through)(これはmiRNAを含有する)を、ピペットで2mlの反応チューブに移す。
6.1.4体積の100%エタノール(980μl)を加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。遠心分離はしない。直ちにステップ7を続行する。
7.サンプルの700μlを、ピペットで、2mlのコレクションチューブに入れたRNeasy MinEluteスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、8000×gで15秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄する。サンプル全体が、スピンカラムの中にピペットで移されるまで、ステップ7を繰り返す。毎回フロースルーを廃棄する。
8.500μl Buffer RPEを、ピペットでRNeasy MinEluteスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、8000×gで15秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄する。
9.500μlの80%エタノールを、ピペットでRNeasy MinEluteスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、8000×gで15秒間遠心分離する。フロースルーおよびコレクションチューブを廃棄する。
10.新しい2mlのコレクションチューブに、RNeasy MinEluteスピンカラムを入れる。蓋を開け、8000×gで1分間遠心分離する。
11.1.5mlのコレクションチューブに、RNeasy MinEluteスピンカラムを入れ、RNaseを含まない水14μlを、ピペットでスピンカラムメンブレンに乗せる。穏やかに蓋を閉じ、miRNAを抽出するために、8000×gで1分間遠心分離する。
miRNA溶出液の濃度を、OD260で測定し、それに続いて、DEPC H2Oで、10nM(1μLあたり10fmol)の最終濃度に希釈する。
以下を使用する、ヒトhsa−Let−7aの前駆体に対する成熟体の選択的検出のためのリアルタイムRT−PCR;3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上のMicroRNAプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーQ2と共にLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
1.3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのmicroRNA−プライムド伸張反応
miRNA hsa Let−7a(10fmol;EQ16898、表VII)および/または前駆体pre−miRNA hsa Let−7a(10fmol;実施例27に概説した通りに産生)を、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、100fmol cP5_hsa−let−7a捕捉プローブ(EQ17367、表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)と、総体積10μL中で混合した。37℃で30分間、保温を実施した。
体積2.5μLの5×結合バッファー(500mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、2 M LiCl、100 mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ(Roche)、ドイツ)の底部に移した。37℃での3分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の100μLの洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、20mM LiCl)中で、5回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
RT−プライマー(1μl 100fmol/μl、EQ17374、表VII)および2.5μl dNTP(10mMの各dNTP、アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンPCRチューブに加えた。このチューブを、70℃で5分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。4μl 5×第1鎖バッファー(250mM トリス−HCl pH 8.3 20℃、375mM KCl、15mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、2μl 10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μl 20U/μl SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および1μl 200U/μl Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。80μLのDEPC H2Oを加えることによって、総体積を、100μLに調節した。
この反応物(50μL)は、1×QuantiTect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400nM hsa−let−7a_qPcRF−プライマー3(EQ17372、表VII)、400nM hsa−let−7a qPcR−R−プライマー2(EQ17375、表VII)、200nM hsa−let−7a_qPcR−プローブ2_Q2検出プローブ(EQ18089、表VII)、5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、および0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;37℃10分、95℃15分、30℃1分、40℃1分、60℃1分、それに続いて94℃20秒および60℃1分を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、オプティコン・リアルタイムPCR装置(Opticon リアルタイム PCR instrument)(MJリサーチ(MJ Research)、米国)で実施された。
成熟したmiRNA hsa Let−7aおよび/またはpre−miRNA hsa Let−7aに対して上で概説したアッセイを実施することによって、以下のCt値が得られた(表IX)。
以下を使用する、密接に関連するmiRNA hsa−Let−7fおよびhsa−Let−7gに対するhsa−let−7aの選択的検出のためのリアルタイムRT−PCR;3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上のMicroRNAプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーQ2と共にLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
1.3’でブロックされ5’ビオチン標識されたLNA改変捕捉プローブ上でのmicroRNA−プライムド伸張反応
10fmol hsa Let−7a miRNA、hsa Let−7f miRNA、またはhsa Let−7gmiRNA(それぞれ、EQ16898、EQ16899、およびEQ16917−表VII)を、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、100fmol cP5_hsa−let−7a捕捉プローブ(EQ17367、表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)、1μL dNTPミックス(1mMの各dNTP;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、および5U Klenowエキソ−(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)と、総体積10μL中で混合した。37℃で30分間、保温を実施した。
体積2.5μLの5×結合バッファー(500mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、2 M LiCl、100 mM EDTA)を、Klenowエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたPCRチューブ(ロシュ((Roche))、ドイツ)の底部に移した。37℃での3分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の100μLの洗浄バッファー(10mM トリス−HCl pH 7.5 20℃、20mM LiCl)中で、5回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
RT−プライマー(1μl 100fmol/μl、EQ17374、表VII)および2.5μl dNTP(10mMの各dNTP、アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、総体積12μL中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラRNA−DNA鎖を含有するストレプトアビジンPCRチューブに加えた。このチューブを、70℃で5分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。4μl 5×第1鎖バッファー(250mM トリス−HCl pH 8.3 20℃、375mM KCl、15mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、2μl 10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μl 20U/μl SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および1μl 200U/μl Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を加え、42℃で1時間保温を続けた。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。80μLのDEPC H2Oを加えることによって、総体積を、100μLに調節した。
この反応物(50μL)は、1×QuantiTect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400nM hsa−let−7a_qPcRF−プライマー3(EQ17372、表VII)、400nM hsa−let−7a qPcR−R−プライマー2(EQ17375、表VII)、200nM hsa−let−7a_qPcR−プローブ2_Q2検出プローブ(EQ18089、表VII)、5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、および0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;37℃10分、95℃15分、30℃1分、40℃1分、60℃1分、それに続いて94℃20秒および60℃1分を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、オプティコン・リアルタイムPCR装置(Opticon リアルタイム PCR instrument)(MJリサーチ(MJ Research)、米国)で実施された。
鋳型としてhsa Let−7a miRNAを使用するhsa Let−7a miRNAアッセイでは、20.4のCt値が得られた。hsa Let−7f miRNAおよびhsa Let−7g miRNAが鋳型として使用されたこのアッセイでは、シグナルは生成されず、Ct値は得られなかった。同様に、miRNAが加えられなかったアッセイから、あるいは、RTが鋳型として加えられなかったqPCRからは、シグナルもCt値も得られなかった。これは、このアッセイが、近いmiRNA相同体hsa Let−7f miRNAおよびhsa Let−7gのmiRNAではなく、hsa−let−7a miRNAを弁別的に検出するものであることを示唆する(let−7a miRNAとhsa Let−7f miRNAとの間の違いは、GからAへの単一のヌクレオチドの変化のみである)。
調査されたmicroRNAを第1の鋳型として、人工のヘルパーオリゴヌクレオチドを第2の鋳型として使用する捕捉/RT−プローブの2つのステップの伸張を使用する、hsa−mir−143のリアルタイムRT−PCR定量化、それに続く、LNAで改変された二重標識された検出プローブを使用する、十分に伸長された捕捉/RT−プローブの増幅によるリアルタイムPCR定量化。
miRNAがステム−ループ分子のより下流の鎖上に位置する場合、ダイサー酵素によるプロセッシングは、成熟したmiRの固有の5’末端をもたらすのに対し、3’末端は、pre−miRおよび成熟したmiRについて同一である。
総体積25μLの反応混合物においては、以下が混合された:hsa−mir−143 microRNA(1fmol; EQ16900、表X)、1μg Torulla酵母RNA(アンビオン(Ambion)、米国)、hsa−Rim−143_CP5_NoBio(125fmol; EQ18080、表X)、hsa−Rim−143_AT_Bio(6.25pmol; EQ18079、表X)、dNTPミックス(各dNTPの最終濃度0.2mM;アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、1×Qiagen OneStep RT−PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、1×Qiagen OneStep RT−PCR Enzyme MixおよびDEPC処理水(アンビオン(Ambion)、米国)。
逆転写:60℃を30分
Taqの活性化:95℃を15分
捕捉プローブ伸張:(95℃20秒+60℃30秒)を10サイクル
冷却:4℃。
上のステップ1からの各々の反応混合物の20μLの一定分量を、1μL ImmunoPure(登録商標)Immobilized Streptavidin(ピアス(Pierce))と混合し、ボルテックス処理し、37℃で5分間保温し、スピンカラム(ハーバードアパレイタス)で回転させた。
総体積25μLの反応混合物においては、以下が混合された:hsa−Rim−143_プライマー2(最終濃度0.5μM、EQ17724、表X)、hsa−miR−143_Primer143_C2(最終濃度0.5μM、EQ17574、表X)、hsa−Rim−143_P4(最終濃度0.25μM、EQ18057、表X)、1×TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、上のステップ1またはステップ2からの希釈された反応混合物2.5μL、およびDEPC処理水。
Taqの活性化:95℃15分
PCR増幅:(95℃20秒+60℃30秒)を40サイクル
以下を使用する、密接に関連するhsa−Let−7gに対するhsa−let−7aの選択的検出のためのリアルタイムRT−PCR;成熟したmicroRNAへのRNAアダプターの連結、それに続く逆転写、およびクエンチャーQ2と共にLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
10fmolのhsa Let−7a miRNAまたはhsa Let−7g miRNA(それぞれEQ16898およびEQ16917−表VII)を、20fmol RNAアダプター(EQ18557−表XI)および40U T4 RNA リガーゼ(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)と、1×T4 RNA リガーゼ バッファー(50mM トリス−HCl pH7.8 25℃、10mM MgCl2、1mM ATP、および10mMジチオスレイトール)からなる総体積20μ中で混合した。37℃で15分保温することによって、連結を成し遂げた。65℃で15分加熱し、反応を停止させた。
逆転写反応は、2μM RT−プライマー(EQ17374、表VII)および500μMの各dNTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、1×第1鎖バッファー(50mM トリス−HCl pH 8.3 20℃ 75mM KCl、3mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、10mM DTT(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、60UのSUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、500U Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、および20μLの上記の連結混合物からなる50μL内で実施された。逆転写反応は、42℃で1時間実施した。70℃で15分加熱し、反応を停止させた。
この反応物(50μL)は、1×PCRバッファー(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、最終濃度4mMまでのMgCl2、0.2mMの各dATP、dCTP、dGTP、および0.6mM dUTP(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)、900nM hsa−let−7a_qPcR−F−プライマー3(EQ17372、表VII)、900nM hsa−let−7a qPcR−R−プライマー2(EQ17375、表VII)、250nM hsa−let−7a_qPcR−プローブ2_Q2検出プローブ(EQ18089、表VII)、0.1×ROX reference dye(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、2.5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、および2.5U HotStarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった;37℃10分、95℃10分、それに続いて95℃で20秒および60℃を1分を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、ABI 7500リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)で実行された。
鋳型としてhsa Let−7a miRNAを使用するhsa Let−7a miRNAアッセイでは、27.1のCt値が得られた(図35)。hsa Let−7g miRNAが鋳型として使用されたこのアッセイでは、シグナルは生成されず、Ct値は得られなかった。同様に、miRNAが加えられなかったアッセイから、あるいは、RTが鋳型として加えられなかったqPCRからは、シグナルもCt値も得られなかった。これは、このアッセイが、近いmiRNA相同体hsa Let−7gではなく、hsa−let−7a miRNAを弁別的に検出するものであることを示唆している。
以下を使用する、密接に関連するmiRNA hsa−Let−7gに対するhsa−let−7aの選択的検出のためのリアルタイムRT−PCR;「橋かけ」核酸配列(連結ヘルパーオリゴ(Ligation Helper Oligo))を使用する成熟したmicroRNAへのRNAオリゴの連結、それに続く逆転写、およびクエンチャーQ2と共にLNA−改変検出プローブを使用するリアルタイムPCR。
10fmolのhsa Let−7a miRNAまたはhsa Let−7gのmiRNA(それぞれEQ16898およびEQ16917−表VII)を、100fmolの連結オリゴおよび100fmolの連結−ヘルパー−オリゴ(それぞれEQ18557およびEQ18565−表XII)および400UのT4 DNAリガーゼ(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、米国)と、1×T4 DNA リガーゼ 反応 バッファー(50mM トリス−HCl pH 7.5 25℃、10mM MgCl2、1mM ATP、10mMジチオスレイトール、25μg/ml BSA)からなる総体積20μL内で混合する。室温で、30分間保温することによって、連結を実施する。65℃で10分間加熱し、反応を停止させる。
1μL RT−プライマー(100fmol/μL、EQ17374、表VII)および2μL dNTP(10mMの各dNTP−アプライドバイオシステム(Applied Biosystems)、米国)を、1μl 5×第1鎖バッファー(250mM トリス−HCl pH 8.3 20℃、375mM KCl、15mM MgCl2;インビトロジェン(Invitrogen)、米国)、1μl 20U/μl SUPERase−In(アンビオン(Ambion)、米国)、および1μl 200U/μl Superscript II逆転写酵素(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)と共に加える。42℃で1時間、逆転写反応を実施する。70℃で15分間加熱し、反応を停止させる。74μLのDEPC H2Oを加えることによって、総体積を100μLに調節する。
1×QuantiTect プローブ PCR Master Mix(キアゲン(Qiagen)、ドイツ)、400nM hsa−let−7a_qPcR−F−プライマー3(EQ17372、表VII)、400nM hsa−let−7a qPcR−R−プライマー2(EQ17375、表VII)、200nM hsa−let−7a_qPcR−プローブ2_Q2検出プローブ(EQ18089、表VII)、5μLの第1鎖合成(RT)反応物(上記)、および0.5U ウラシル DNA グリコシラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen)、米国)を含む、リアルタイムPCR反応(50μL)を準備する。以下の温度サイクリングプログラムを使用する:37℃10分、95℃15分、30℃1分、40℃1分、60℃1分、それに続いて94℃20秒および60℃1分を40サイクル。リアルタイムRT−PCR分析は、オプティコン・リアルタイムPCR装置(Opticon リアルタイム PCR instrument)(MJリサーチ(MJ Research)、米国)で実施された。
本発明は、また、以下の実施形態によって規定することができる。ただし、用語「アイテム」は、特定の数をもつ前述のアイテムを指す。
1.以下を含む、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量化する方法:
a)標的ヌクレオチド配列を、2つのオリゴヌクレオチドタギングプローブ(それぞれ、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなる)と接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的配列と相補的であり、第1のタギングプローブの認識配列が、標的配列の第1の領域とハイブリダイズし、第2のタギングプローブの第2の認識配列は、標的配列の第1の領域に隣接する標的配列の第2の領域とハイブリダイズする;
b)共有結合的にハイブリダイズしたタギングプローブの2つの隣接する認識配列を連結(ligation)によって繋げて、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列および2つのアンカーヌクレオチド配列を含む、近接するヌクレオチド配列を形成すること;および、
c)アンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムPCRによって、連結されたオリゴヌクレオチド分子を定量化すること。
2.タギングプローブおよび検出プローブにおける認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム1の方法。
3.高親和性のヌクレオチド類似体が、LNAである、アイテム1〜2の方法。
4.5’リン酸化されたタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、5’ヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド位置の、LNAで開始する第2、第3、または第4の各位置で、LNAで改変され、第2のタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、3’ヌクレオチド位置より前のヌクレオチド位置で終了する第2、第3、または第4の各位置で、LNAで改変される、アイテム1〜3の方法。
5.5’リン酸化されたタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、5’ヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド位置の、LNAで開始する第3の各位置で、LNAで改変され、第2のタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、3’ヌクレオチド位置より前のヌクレオチド位置で終了する第3の各位置で、LNAで改変されるアイテム4の方法。
6.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、DNA配列である、アイテム1〜5の方法。
7.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム1〜5の方法。
8.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、LNAで改変される、アイテム7の方法。
9.タギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、長さが約20ヌクレオチド未満、より好ましくは15ヌクレオチド未満、最も好ましくは10〜14ヌクレオチドであるアイテム1〜8の方法。
10.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、長さが約30ヌクレオチド未満、より好ましくは27ヌクレオチド未満、最も好ましくは15〜25ヌクレオチドであるアイテム1〜9の方法。
11.検出プローブ内の認識配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム1〜10の方法。
12.高親和性のヌクレオチド類似体がLNAである、アイテム11の方法。
13.検出プローブの長さが、約20ヌクレオチド未満、より好ましくは15ヌクレオチド未満、最も好ましくは8〜12ヌクレオチドである、アイテム12の方法。
14.検出プローブが、5’末端にDNAヌクレオチド、3’末端にリン酸基を含有するLNA配列を含む、アイテム13の方法。
15.検出プローブが、少なくとも1つの化学的な部分で置換される、アイテム14の方法。
16.検出プローブが、フルオロフォア−クエンチャー対を含有する、アイテム15の方法。
17.検出プローブが、5’ヌクレアーゼアッセイ原理によって、二重標識を使用して検出される、アイテム1〜16の方法。
18.検出プローブが分子ビーコン原理によって検出される、アイテム1〜16の方法。
19.タギングプローブが、T4 DNAリガーゼを使用して連結される、アイテム1〜18のうちのいずれか1つの方法。
20.タギングプローブが、耐熱性のDNAリガーゼを使用して連結される、アイテム1〜18のうちのいずれか1つの方法。
21.タギングプローブが、RNAリガーゼを使用して連結される、アイテム1〜18のうちのいずれか1つの方法。
22.タギングプローブが、耐熱性のRNAリガーゼを使用して連結される、アイテム1〜18のうちのいずれか1つの方法。
23.連結(ligation)反応が、変性と、タギングプローブのアニーリングおよび接合(joining)、複数の連結されたオリゴヌクレオチド分子の産生の間の繰り返されるサイクルである、アイテム20または22の方法。
24.タギングプローブのうちの1つが、リガンドで標識される、アイテム1〜23のうちのいずれか1つの方法。
25.連結された分子が、リガンド−捕捉分子相互作用を利用して精製される、アイテム24の方法。
26.リガンドが、ビオチンであり、リガンド−捕捉分子相互作用が、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンである、アイテム24〜25の方法。
27.標的ヌクレオチド配列が、RNA配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
28.標的ヌクレオチド配列が、microRNA配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
29.標的ヌクレオチド配列が、成熟したmicroRNA配列である、アイテム28の方法。
30.標的ヌクレオチド配列が、siRNAまたはRNAエディティングされた配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
31.標的ヌクレオチド配列が、選択的スプライスバリアント配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
32.標的ヌクレオチド配列が、非コード、あるいは、アンチセンスRNA配列または、単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するRNA配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
33.標的ヌクレオチド配列が、DNA配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
34.標的ヌクレオチド配列が、単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するDNA配列である、アイテム1〜26のうちのいずれか1つの方法。
35.標的ヌクレオチド配列が、ヒト配列である、アイテム1〜34の方法。
36.標的ヌクレオチド配列が、疾患に関与する、あるいは、疾患(例えば癌)の診断のために有用である、アイテム35の方法。
37.microRNAの検出または定量化のためのアイテム1〜36のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
38.植物または哺乳類のmicroRNAの検出および定量化のためのアイテム37のプローブのライブラリ。
39.ヒトまたは動物microRNAの検出および定量化のためのアイテム37のプローブのライブラリ。
40.アンチセンスRNA、非コードRNA、またはsiRNAの検出または定量化のためのアイテム1〜36のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
41.RNAエディティングされた転写産物の検出または定量化のためのアイテム1〜36のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
42.選択的スプライスバリアントの検出または定量化のためのアイテム1〜36のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
43.アイテム37〜42のうちのいずれか1つのキット。
44.以下を含む、核酸サンプル中の標的リボ核酸配列を定量化する方法:
a)標的リボ核酸配列を、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的リボ核酸配列内の配列と相補的である、
b)逆転写酵素およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドタギングプローブを使用する逆転写により、標的リボ核酸と相補的な鎖を合成すること、
c)DNAポリメラーゼおよびプライマーとしての第2のタギングプローブを使用する第2鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること(replacing)、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
d)オリゴヌクレオチドタギングプローブと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化すること。
45.タギングプローブおよび検出プローブ内の認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム44の方法。
46.第1のタギングプローブおよび検出プローブ内の標的リボ核酸内の配列と相補的な認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変され、第2のタギングプローブ中の認識配列は改変されない、アイテム44の方法。
47.タギングプローブに内の認識配列は改変されず、検出プローブが、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム44の方法。
48.高親和性のヌクレオチド類似体が、LNAであるアイテム44〜47の方法。
48.タギングプローブ内の認識配列が、認識配列の3’末端に少なくとも1つのDNAヌクレオチドをもつ第2、第3、または第4の各位置で、LNAで改変されるアイテム44〜48の方法。
49.タギングプローブ内の認識配列が、認識配列の3’末端に少なくとも1つのDNAヌクレオチドにより開始および終了する第3の各位置で、LNAで改変されるアイテム48の方法。
50.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、DNA配列である、アイテム44〜49の方法。
51.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム44〜50の方法。
52.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、LNAで改変される、アイテム51の方法。
53.タギングプローブ内の認識配列が、長さが約20ヌクレオチド未満、より好ましくは15ヌクレオチド未満、最も好ましくは6〜14ヌクレオチドであるアイテム44〜52の方法。
54.タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、長さが約30ヌクレオチド未満、より好ましくは27ヌクレオチド未満、最も好ましくは15〜25ヌクレオチドである、アイテム44〜53の方法。
55.検出プローブにおける認識配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム44〜54の方法。
56.高親和性のヌクレオチド類似体が、LNAである、アイテム55の方法。
57.LNAが、SBC核酸塩基、2’−O−メチル、2,6−ジアミノプリン、2−チオウラシル、2−チオチミジン、5−ニトロインドール、ユニバーサルまたは縮重塩基、インターカレーティング核酸または副溝バインダー(minor−groove−binder)で所望により改変されるアイテム56の方法。
58.認識配列中のLNAアデノシンモノマーの少なくとも1つが、LNA 2,6−ジアミノプリンで置換される、アイテム57の方法。
59.LNAモノマーの少なくとも1つが、LNA 2−チオチミジンで置換される、アイテム58の方法。
60.検出プローブの長さが、約20ヌクレオチド未満、より好ましくは15ヌクレオチド未満、最も好ましくは7〜12ヌクレオチドであるアイテム59の方法。
61.検出プローブが、5’末端にDNAヌクレオチド、3’末端にリン酸基を含有するLNA配列を含む、アイテム59の方法。
62.検出プローブが少なくとも1つの化学的な部分で置換される、アイテム61の方法。
63.検出プローブが、フルオロフォア−クエンチャー対を含有する、アイテム62の方法。
64.検出プローブが、5’ヌクレアーゼアッセイ原理によって、二重標識を使用して検出される、アイテム44〜63の方法。
65.検出プローブが分子ビーコン原理によって検出される、アイテム44〜63の方法。
66.標的リボ核酸と相補的な鎖が耐熱性の逆転写酵素を使用して合成される、アイテム44〜65のうちのいずれか1つの方法。
67.ヘテロ二本鎖内の標的リボ核酸配列を置換する第2鎖が、耐熱性のDNAポリメラーゼを使用して合成される、アイテム44〜66のうちのいずれか1つの方法。
68.第2鎖タギングプローブが、リガンドで標識される、アイテム44〜67のうちのいずれか1つの方法。
69.第2鎖分子が、リガンド−捕捉分子相互作用を利用して精製される、アイテム68の方法。
70.リガンドが、ビオチンであり、リガンド−捕捉分子相互作用が、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンである、アイテム68〜69の方法。
71.標的リボ核酸配列が、microRNA配列である、アイテム44〜70のうちのいずれか1つの方法。
72.標的リボ核酸配列が成熟したmicroRNA配列である、アイテム71の方法。
73.第1のタギングプローブの認識配列が、成熟したmicroRNAの3’末端と相補的であり、第2のタギングプローブの認識配列が、成熟したmicroRNAの5’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列の、3’末端と相補的である、アイテム72の方法。
74.標的リボ核酸配列が、siRNAまたはRNAエディティングされた配列である、アイテム44〜70のうちのいずれか1つの方法。
75.標的リボ核酸配列が、選択的スプライスバリアント配列である、アイテム44〜70のうちのいずれか1つの方法。
76.標的リボ核酸配列が、非コード、またはアンチセンスRNA配列、または単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するRNA配列である、アイテム44〜70のうちのいずれか1つの方法。
77.第1のタギングプローブの認識配列が、成熟したsiRNAの3’末端と、あるいは、RNAエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異の3’に位置する配列と相補的であり、第2のタギングプローブの認識配列が、siRNAの5’末端に相当する、あるいは、リボ核酸標的配列内のRNAエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異の5’に位置する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と相補的である、アイテム74〜76のうちのいずれか1つの方法。
78.標的リボ核酸配列がヒト配列である、アイテム44〜77の方法。
79.標的リボ核酸配列が、疾患に関与する、あるいは、疾患(例えば癌)の診断のために有用である、アイテム78の方法。
80.microRNAの検出または定量化のためのアイテム44〜79のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
81.植物または哺乳類のmicroRNAの検出および定量化のためのアイテム80のプローブのライブラリ。
82.ヒトまたは動物microRNAの検出および定量化のためのアイテム80のプローブのライブラリ。
83.アンチセンスRNA、非コードRNA、siRNA、RNAエディティングされた転写産物、または選択的スプライスバリアントの検出または定量化のための、アイテム44〜79のうちのいずれか1つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
84.アイテム80〜83のうちのいずれか1つのキット。
Claims (51)
- 複数のヌクレオシド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、microRNAまたは低分子干渉RNA(siRNA)などの非コードRNAを、単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉するための方法。
- 次のステップ:
a)オリゴヌクレオチド捕捉プローブと、非コードリボ核酸配列を接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列が、非コードRNAにおける配列と相補的である、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ中の残りのヌクレオチド配列(アンカーヌクレオチド配列)と相補的な鎖を合成するステップ、
c)形成された二本鎖を固体支持体上に固定させ、標的サンプルを富化し、それに続いて固体支持体から標的配列を解放させるステップ、
d)逆転写酵素と、プライマー結合部位としての捕捉プローブにおけるアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写によって、非コードリボ核酸に対して相補的なDNA鎖を合成するステップ、
e)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブとを使用する第2鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
f)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化するステップ、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 次のステップ:
a)標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成するステップ、
c)固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化するステップ、
d)逆転写酵素と、プライマーとしての捕捉プローブとを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なDNA鎖を合成するステップ、
e)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブとを使用する第2鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
f)DNAポリメラーゼと一対のプライマーとを使用して、標的配列を鋳型にするPCR増幅を実施するステップ、および、
e)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムPCRによって、このようにして得られた核酸を定量化するステップ、
を含む、請求項1に記載の方法。 - a)標的ヌクレオチド配列を、それぞれ、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなる2つのオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的配列と相補的であり、第1のタギングプローブの認識配列が、標的配列の第1の領域とハイブリダイズし、第2のタギングプローブの第2の認識配列は、標的配列の第1の領域に隣接する標的配列の第2の領域とハイブリダイズする、
b)ハイブリダイズしたタギングプローブの2つの隣接する認識配列を共有結合的に連結によって繋げ、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列および2つのアンカーヌクレオチド配列を含む、近接するヌクレオチド配列を形成すること、および、
c)アンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムPCRによって、連結されたオリゴヌクレオチド分子を定量化すること、
によって、核酸サンプル内の標的ヌクレオチド配列を定量化することを含む、請求項1に記載の方法。 - a)標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
b)DNAポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
c)逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なDNA鎖を合成すること、
d)DNAポリメラーゼと、プライマーとしての第2のタギングプローブとを使用する第2鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第2のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
e)オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムPCRによって、得られた核酸を定量化すること、
によって、核酸サンプル内の低分子非コードRNA配列を定量化することを含む、請求項1に記載の方法。 - ヌクレオシド類似体がLNAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- microRNAまたは低分子干渉RNA(siRNA)などの非コードRNAの単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのキットであって、反応体および1つまたは複数の改変されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
- 改変されたオリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオシド類似体を含有する、請求項7に記載のキット。
- ヌクレオシド類似体がLNAである、請求項8に記載のキット。
- 最高でも長さが100ヌクレオチドである、短い長さのRNAの定量測定のための方法であって、
a)前記の短い長さのRNAを含むサンプルから、1)前記の短い長さのRNAの配列、その相当するDNA配列、または前記の短い長さのRNAの配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖標的配列、および2)5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、
b)逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、cDNAの鎖を得ること、および
c)鋳型として前記cDNAと所望により鋳型ポリヌクレオチドを含む定量リアルタイムPCR(qPCR)を実施すること
を含む方法。 - ステップcにおいてqPCRのために使用されるプライマーが、
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、5’または3’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である、
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する5’または3’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の近接する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である、
−少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、ここで、1つは、一本鎖標的配列内の第1のヌクレオチド配列に相当し、もう1つは、一本鎖標的配列内の第2のヌクレオチド配列と相補的である、
から選択され、qPCRのために使用される前記プライマーが、それぞれ独立に、検出可能な標識を含みうる、請求項10に記載の方法。 - ステップ(b)における反応が、一本鎖標的配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、あるいは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する5’または3’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の近接する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、逆転写プライマーまたはDNA重合プライマーを利用する、請求項10または11に記載の方法。
- 前記逆転写プライマーまたはヌクレオチド重合プライマーが、少なくとも1つの短い長さのRNAに対して特異的である、請求項12に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、同一のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖標的配列と、5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列とが、共有結合的に結合される、請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖標的配列と、5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列とが、非共有結合的に結合される、請求項10〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、検出可能な標識を含む、請求項10〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、酵素反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、非酵素的な反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、サンプルRNAが得られる生物中に天然には存在しない、請求項10〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、非哺乳類のものである、請求項10〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列の、短い長さのRNAへの連結による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、あるいはステップ(a)が、5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列を、ターミナルトランスフェラーゼ反応において、好ましくはポリ−Aトランスフェラーゼ反応において、短い長さのRNAに連結することによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項10〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 連結が、オーバーハングライゲーションおよび平滑末端ライゲーションから選択され、好ましくはオーバーハングライゲーションである、請求項22に記載の方法。
- 小さいRNA分子のリガーゼ反応性の末端に直接隣接する5’または3’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端が、オーバーハングライゲーションを可能にするように配置されるように、5’または3’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であり、短い長さのRNA分子のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドの、短い長さのRNAへのアニーリングを含む、請求項23に記載の方法。
- サンプル中のすべてのRNAが、連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応にかけられる、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応が、標的配列の3’末端のみで実施される、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列の5’末端への連結が、連結反応の前に、標的配列の5’末端をリン酸化することによって実施される、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 連結の前に、5’隣接ヌクレオチド配列が、その5’末端でブロックされ、3’隣接ヌクレオチド配列が、その3’末端でブロックされる、請求項22〜27のいずれか一項の方法。
- 5’および/または3’隣接ヌクレオチド配列が、規定されたプロセッシング状態の、ステップ(a)における前記短い長さのRNAと優先的または独占的に結合される、請求項10〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAの規定されたプロセッシング状態が、成熟した状態である、請求項29に記載の方法。
- ステップ(b)が、cDNAを得るための鋳型ポリヌクレオチドの逆転写を含む、請求項22〜30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、隣接するヌクレオチド配列を付着するためのヌクレオチド重合のステップを含む、請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 重合が、鋳型に依存しないポリメラーゼおよび鋳型に依存するポリメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼによって達成される、請求項32に記載の方法。
- ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項33に記載の方法。
- 重合が、標的配列の3’末端へのポリ−A、ポリ−G、ポリ−T、またはポリ−Cテールの付加にある、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、以下のステップ
−その5’末端が短い長さのRNAの3’末端と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのRNAの3’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された短い長さのRNA分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのRNAを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。 - ヌクレオチド重合が、鋳型ポリヌクレオチドを構成するRNA−DNAハイブリッドを得るためにDNA重合を含む、請求項36に記載の方法。
- ステップ(b)が、(I)所望により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブにアニーリングしていない材料の除去の後、cDNAを得るために、RNA−DNAハイブリッド鎖を逆転写させることを含む、請求項36または37に記載の方法。
- 逆転写におけるプライマーが、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたは別の逆転写プライマーである、請求項38に記載の方法。
- ステップ(a)が、
−その3’末端が短い長さのRNAの5’と相補的でありその5’末端が5’隣接ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのRNAの5’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのRNAを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(b)が、短い長さのRNAが、伸長された捕捉プローブから除去され、捕捉プローブが、3’隣接ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに、その3’末端でアニーリング可能にされ、捕捉プローブが、cDNAを得るために、鋳型としてヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するDNA重合によって、5’→3’方向にさらに伸長されることを含む、請求項40に記載の方法。
- 捕捉オリゴヌクレオチドが、固体支持体上への固定化を可能にする部分を含有する、請求項36〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 非アニーリング材料の除去を可能にするために、捕捉プローブが、アニーリングの後に固定される、請求項42に記載の方法。
- ステップ(a)におけるサンプルが、短い長さのRNAについて富化される、請求項10〜43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、改変されたヌクレオチドを含む検出プローブの使用を含む、請求項10〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 改変されたヌクレオチドが、LNAヌクレオチドである、請求項45に記載の方法。
- 検出プローブが、短い長さのRNA内の配列に相当する、あるいはこの配列に相補的である、請求項45または46に記載の方法。
- 逆転写あるいはDNA重合に使用されるプライマーが、改変されたヌクレオチドを含む、請求項10〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 改変されたヌクレオチドが、LNAヌクレオチドである、請求項48に記載の方法。
- ステップ(c)におけるqPCRで使用される少なくとも1つのプライマーが、ステップ(b)の逆転写またはヌクレオチド重合で使用されるプライマーによって構成される、請求項10〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 最高でも100ヌクレオチドの長さである、短い長さのRNAの定量測定に有用なキットであって、
−請求項10から50のいずれか一項に記載の方法において使用される、最小数の逆転写プライマー、および/またはヌクレオチド重合プライマー、および/またはqPCRのためのプライマー、および/またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および/またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および/またはオリゴヌクレオチドプローブ、ここで、逆転写プライマー、ヌクレオチド重合プライマー、qPCRのためのプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプローブは、請求項11〜50のいずれか一項で定義した通りである、ならびに
−逆転写プライマー、および/またはヌクレオチド重合プライマー、および/またはqPCRのためのプライマー、および/またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および/またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および/またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する、短い長さのRNAの定量測定のための指示書
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