JP2007532100A - ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡの定量化のための新規方法 - Google Patents

ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡの定量化のための新規方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現の検出、定量化、ならびにモニタリングのための、リボ核酸、プローブ、および方法に関する。本発明はさらに、他の非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現をモニタリングする、ならびに、ＲＮＡエディティング、単一の転写産物の対立遺伝子変異体、転写産物における特定のエキソンの突然変異、欠損、または重複（例えば、癌などのヒト疾患に関連する変化）を検出および定量化するための方法に関する。本発明はさらに、デオキシ核酸の発現の検出、定量化、ならびにモニタリングのための方法に関する。

Description

本発明は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現の検出、定量化、ならびにモニタリングのための核酸、プローブ、および方法に関する。本発明はさらに、他の非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現をモニタリングする、ならびに、ＲＮＡエディティング、単一の転写産物の対立遺伝子変異体、転写産物中の特定のエキソンの突然変異、欠損、または重複（例えば、癌などのヒト疾患に関連する変化）を検出および定量化するための方法に関する。本発明はさらに、標的ＤＮＡ配列の検出および定量化のための方法に関する。
発明の背景
本発明は、非常に多様な核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列の定量化に関し、より詳細には、標的ヌクレオチド配列、特にＲＮＡ標的配列（関心が持たれているｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ標的配列など）を検出および定量化するのに有用な、また、核酸サンプル間の差（例えば、癌患者のサンプルと、健康な患者からのサンプルなど）を検出するのに有用な、オリゴヌクレオチドプローブの設計および使用を用いる方法に関する。
ＭｉｃｒｏＲＮＡ
国際的な配列データベースの拡大しつつある目録や、これに付随する、生物−細菌、古細菌、および真核生物−の３つすべてのドメインに相当する、ほぼ２００のゲノムの配列決定によって、生物体を、遺伝子、転写産物、およびタンパク質の包括的な分子カタログに解体するプロセスが第一に推進されてきた。単一の種内の遺伝的変異の重要性は明らかになり、いくつかの重要なゲノムの遺伝的設計図の完成が終わり、２００１年には、ヒトゲノム配列の有効な草案の公開に達している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。一方、いくつかのタイプの非−タンパク質−コードＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡなど）の最近の同定に加えて、ヒトおよびマウスゲノムに由来する転写の詳細で大規模な、数が増加しつつある分子分析によって、より高等の真核生物のトランスクリプトームが、元々予想されていたよりも、かなり複雑であることが示唆されている（非特許文献４；非特許文献５）。
セントラルドグマ：「ＤＮＡはＲＮＡを作り、ＲＮＡはタンパク質を作る」の結果として、ＲＮＡは、遺伝情報をタンパク質に、ただ翻訳するだけの単純な分子と考えられていた。近年では、大部分のゲノムは転写されるが、高等真核生物では、ゲノムのうちのほぼ９７％は、タンパク質をコードせず、推定の非コードＲＮＡであると推定されている（非特許文献４）。非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、特に、非常に特異的な核酸認識を必要とする調節的役割のために十分に適合されていると考えられる。したがって、ＲＮＡに関する見解は、単なる情報分子から、細胞における多種多様な構造的、情報的、および触媒的分子へと迅速に変化しつつある。
近年では、多数の低分子非コードＲＮＡ遺伝子が同定され、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と名付けられた（総説については、非特許文献６）を参照のこと）。発見された最初のｍｉＲＮＡは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における、多様な発生的事象の通常の一時的制御にとって不可欠なヘテロクロニック切換遺伝子であるｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７であった（非特許文献７；非特許文献８）。ｍｉＲＮＡは、広範囲の種にわたって進化的に保存され、発現プロフィールにおいて多様性を示し、これは、それらが非常に様々な調節機能に従事し、細胞増殖および発生に対してかなりの効果を発揮することを示唆している（非特許文献６）。最近の研究によって、ｍｉＲＮＡが、多くの段階で遺伝子発現を調節できることが示され、これにより、新規の遺伝子調節機構が示され、また、ＲＮＡがタンパク質と類似の調節性役割を果たすことができるという考えの助けとなっている。ＲＮＡに基づくこの調節を理解することは、我々が、より高等真核生物におけるゲノムの複雑さを理解する、また、複雑な遺伝子調節性ネットワークを理解することを助けることとなる。
ｍｉＲＮＡは、より長い内因性ヘアピン型転写産物から加工される２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡである（非特許文献９）。サンガー研究所（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（英国）によって主催されるｍｉＲＮＡレジストリデータベースによれば、現在までに、ヒト、虫、ショウジョウバエ、および植物において、７１９を超えるｍｉｃｒｏＲＮＡが同定されており、また、推定上の遺伝子に相当する多くのｍｉＲＮＡも同定されている。ある種のｍｉＲＮＡは、ゲノム内で複数の座位を有し（非特許文献１０）、時として、いくつかのｍｉＲＮＡ遺伝子は、タンデムクラスターで配置される（非特許文献１１）。現在までに報告された多数のｍｉＲＮＡが、たった１度だけしか単離されていないという事実は、多くの新規のｍｉＲＮＡが将来発見されるであろうことを示唆する。ヒト染色体２１および２２の最近の徹底的な転写分析により、観察された転写の４９％が、知られているアノテーションと異なるということ、さらに、こうした新規の転写産物が、コードＲＮＡと非コードＲＮＡのどちらでもあることが発見された（非特許文献５）。現在までに同定されたｍｉＲＮＡは、おそらく氷山の一角であり、ｍｉＲＮＡの数は、非常に大きいことが判明する可能性がある。
現在までに特徴づけられたｍｉｃｒｏＲＮＡの特性を総合すると（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、以下のようにまとめることができる：
１．ｍｉＲＮＡは、約２１〜２５ｎｔの一本鎖ＲＮＡである。
２．これらは、酵素ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって、より長い内因性二本鎖ヘアピン前駆体から切断される。
３．ｍｉＲＮＡは、二本鎖ヘアピンの形の前駆体ＲＮＡを潜在的にコードすることができるゲノム領域に正確にマッチする。
４．ｍｉＲＮＡおよびその予測される前駆体二次構造は、系統的に保存される。
根拠のいくつかの系統は、酵素ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）およびアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）が、ｍｉＲＮＡ生合成、成熟、および機能に関係する重要なものであることを示唆している（非特許文献１２）。ｍｉＲＮＡ生合成に必要とされる遺伝子における突然変異は、遺伝発生的欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）をもたらし、これは、少なくとも部分的に、ｍｉＲＮＡを産生する役割に由来する。現在の見解は、ｍｉＲＮＡが、最初に３’末端に２または３ｎｔのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）をもち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと称される、二本鎖の形のヘアピン前駆体から、ダイサーによって切断されるということである。補助因子が、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＰを連結し、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをほどいて一本鎖ｍｉＲＮＡにし、その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＰは、ｍｉＲＮＰに変換される。ｍｉＲＮＰの一部が複合体を形成するのに対して、ｍｉＲＮＡは、調節性の標的を認識することができる。ｍｉＲＮＰとＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）との間には、サイズが類似であることや、ＲＮＡヘリカーゼとＰＰＤタンパク質の両方を含むことなどを含めて、いくつかの類似点が存在する。したがって、ｍｉＲＮＰとＲＩＳＣが、複数の機能をもつ同じＲＮＰであることが提案されてきた（非特許文献６）。様々な作用因子が、ｍｉＲＮＡを、様々な経路へと導く。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの構造は、３’末端に２または３ｎｔオーバーハングをもつ２２ｎｔ ＲＮＡ二本鎖が、タンパク質複合体の再構成のために有益であり、また、タンパク質成分への短いＲＮＡ二本鎖の高親和性結合に必要とされる可能性があるという見解と整合性があった（総説については、非特許文献６を参照のこと）。
ｍｉＲＮＡが、真核生物の遺伝子調節に重要な役割を果たすことを示唆する根拠は増加しつつある。発見された第１のｍｉＲＮＡ遺伝子、ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、他のヘテロクロニック遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における反復エレメントと不完全に塩基対をなし、アンチセンスＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって、直接的かつ負の方向に翻訳を調節する（非特許文献７；非特許文献８）。他のｍｉＲＮＡも、同様に、限定された相補的かつ抑制性の翻訳によって標的ｍＲＮＡと相互作用することが考えられる（非特許文献１１；非特許文献１３）。しかし、多くの研究が、ｍｉＲＮＡと、その標的ＲＮＡとの間に完全な相補性がある場合に、翻訳の阻害よりもむしろ、標的ＲＮＡの分解がもたらされる可能性があることを示しており（非特許文献１４）、これは、相補性の程度が、その機能を決定することを示唆している。近い相補性をもつ配列を同定することによって、いくつかの標的が、予測されており、これらのうちの大部分は、細胞増殖および発生に重要である潜在的な転写因子であると考えられている。発生の調節因子として作用する予測されたｍｉＲＮＡ標的の高い割合、および標的部位の保存は、ｍｉＲＮＡが、広範囲の生物の発生および挙動および細胞運命の決定に関与することを示唆している（総説については、非特許文献６を参照のこと）。
ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびヒト疾患
ｍｉＲＮＡのゲノム位置の分析によって、これらが、ヒトの発生および疾患において重要な役割を果たすことが示唆されている。ｍｉＲＮＡまたはそのプロセッシング機構が関係する可能性があるいくつかのヒト疾患は、既に特定されている。それらのうちの１つは、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、すなわち、タンパク質レベルの低下または運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子の生存の機能喪失突然変異によって引き起こされる小児科の神経変性疾患である（非特許文献１５）。ＳＭＮ複合体の一部である２つのタンパク質（Ｇｅｍｉｎ３およびＧｅｍｉｎ４）も、ｍｉＲＮＰの成分であるものの、ｍｉＲＮＡ生合成または機能が、ＳＭＡにおいて異常調節されるかどうか、また、これが、病因に対してどのような影響を有するかは、まだ分かっていない。ｍｉ／ｓｉＲＮＡに関連がある別の神経性疾患は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の欠乏または突然変異によって引き起こされる脆弱Ｘ精神遅滞（ＦＸＭＲ）であり（非特許文献１６）、ｍｉＲＮＡが、他の神経性疾患においても役割を果たす可能性があるさらなる手掛かりが存在する。さらに別の興味深い発見は、ｍｉＲ−２２４遺伝子座が、２つの異なる神経性疾患：早発性パーキンソン症候群およびＸ連鎖性精神遅滞の、ごく小さい候補領域内にあるということである：（非特許文献１７）。癌とｍｉＲＮＡとの関連も、最近記載されている。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）における最も頻度が高い単一の遺伝子異常は、染色体１３ｑ１４に集中する（５０％のケース）欠損である。最近の研究によって、２つの異なるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６）遺伝子がクラスター化され、ＬＥＵ２のイントロン内（Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）腫瘍抑制座位の欠損される（ｄｅｌｅｔｅｄ）最小領域内にある）に位置することが決定され、どちらの遺伝子も、大部分のＣＬＬ症例では、欠損または下方制御されている（非特許文献１８）。ｍｉＲＮＡとヒト疾患との関係は、ｍｉＲＮＡおよびそれらが制御する遺伝子ネットワークについての知識に並行して強固になっていくだけであると予測されている。さらに、ＲＮＡ仲介型の遺伝子発現の調節を理解することにより、おそらく臨床医学に革命をもたらすことになるであろう新規の治療的手法の進展につながる（非特許文献１６）。
低分子干渉ＲＮＡおよびＲＮＡｉ
２１〜２５ｎｔのサイズ範囲の低分子ＲＮＡに払われる最近の注目のいくつかは、二本鎖ＲＮＡが、相同である任意のＲＮＡの分解をもたらす、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という現象に起因する（非特許文献１９）。ＲＮＡｉは、おそらくウイルス攻撃および可動性の遺伝因子に対する予防のために進化してきたであろう複雑かつ古くからの細胞機構に依存する。ＲＮＡｉ機構における重要なステップは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（それぞれ約２２ｎｔ長である二本鎖ＲＮＡ）の産生である。ｓｉＲＮＡは、相同の標的ＲＮＡの分解および同じ標的ＲＮＡに対するより多くのｓｉＲＮＡの産生をもたらす（非特許文献２０）。ＲＮＡｉのｍＲＮＡ分解経路についての現在の見解は、逆平行のダイサー二量体が、長い二本鎖ｄｓＲＮＡを切断し、ＡＴＰ依存性の方式でｓｉＲＮＡを形成するということである。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ｓｉＲＮＡのＡＴＰ依存性の巻き戻しによって、ＲＩＳＣが活性化される（非特許文献２１；非特許文献２２）。活性なＲＩＳＣ複合体は、このようにして、特異的な標的ｍＲＮＡを分解するように導かれる。
ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出および分析
ｍｉＲＮＡが、遺伝子調節の新しく発見された隠された層に相当する可能性があるという現在の見解により、世界中の研究者の間で、ｍｉＲＮＡ、その標的、および作用の機構の発見に高い関心が持たれるようになった。しかし、これらの低分子ＲＮＡの検出および分析は、平凡なものではない。したがって、現在までの７００を超えるｍｉＲＮＡの発見には、その特別な特徴を利用することが必要とされてきた。最初に、研究グループは、単離および検出のための第一の基準として、ｍｉＲＮＡの小さなサイズを使用した。その結果、第一に、ｃＤＮＡライブラリ構築手順におけるサイズ選択によって、低分子のＲＮＡが、通常除外されるので、標準のｃＤＮＡライブラリは、ｍｉＲＮＡを欠くこととなった。ハエ胚、虫、またはＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡは、サイズ分別されており、その結果、２５ヌクレオチド以下の分子のみが捕捉されることとなった（非特許文献２３）。その後、合成のオリゴマーが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、ＲＮＡプールに直接的に連結されている。次いで、これらの配列は、逆転写され、ＰＣＲによって増幅され、クローン化され、配列決定された（非特許文献２３）。その後、ゲノムデータベースは、この配列について照会され、これらの生物からのｍｉＲＮＡの起源が確認され、このｍｉＲＮＡ遺伝子が、ゲノム内の他の遺伝子との関係において物理的に位置づけされている。大多数のクローン化された配列は、イントロン領域内、あるいは、遺伝子と遺伝子の間、時としてクラスター内に位置され、これは、タンデムに配置されたｍｉＲＮＡが、協調調節を可能にするための単一の転写産物からプロセッシングされることを示唆している。さらに、ゲノム配列は、ｍｉＲＮＡ前駆体の折り返し構造を示している（非特許文献２３）。
異なるｍｉＲＮＡのサイズ、ならびに時として低レベルの発現は、高感度かつ定量的な分析ツールの使用を必要とする。そのサイズが、２１〜２５ｎｔと小さいので、成熟したｍｉＲＮＡの発現をモニタリングするための定量的リアルタイムＰＣＲの使用は、除外される。したがって、大抵のｍｉＲＮＡ研究者は、成熟したｍｉＲＮＡとｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの両方の発現を試験するために、現在、ポリアクリルアミドゲルと組み合わせられたノーザンブロット解析を使用している（非特許文献８；非特許文献１１；非特許文献２４）。成熟したｍｉＲＮＡを検出するために、プライマー伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）も使用されている（非特許文献２５）。ｍｉＲＮＡ発現をモニタリングするためのツールとしてのすべてのゲルベースアッセイ（ノーザンブロッティング、プライマー伸張、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなど）の短所としては、低スループットおよび不十分な感受性が挙げられる。マイクロアレイは、優れたスループットを有するので、ＤＮＡマイクロアレイは、ｍｉＲＮＡを定量化するためのノーザンブロット解析に代わる優れたものであると考えられる。しかし、マイクロアレイの欠点は、効率的なハイブリダイゼーションおよびシグナル産生のための高濃度のインプット標的の必要性、稀な標的に対する不十分な感受性、ならびに、より感受性が高いアッセイ（リアルタイム定量ＰＣＲなど）を使用するポスト−アレイ・バリデーション（これは、実行可能でない）の必要性である。最近の報告では、標的として５から１０μｇ分量のインプット全ＲＮＡを用いて、ニューロン発達中のｍｉＲＮＡの発現をモニタリングするために、ｃＤＮＡマイクロアレイが使用されたが、成熟したｍｉＲＮＡは、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションの前に、マイクロ濃縮器（ｍｉｃｒｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を使用してｍｉＲＮＡ前駆体から分離される必要があった（非特許文献２６）。成熟したｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するために、ＰＣＲ手法も使用された（非特許文献２７）。この方法は、低分子ＲＮＡのゲル分離およびリンカー・オリゴヌクレオチドへの連結を含むので、ｍｉＲＮＡをクローン化するために有用であるが、通常のｍｉＲＮＡ発現プロファイリングのためには非常に非実用的である、非特許文献２８は、ｍｉＲＮＡ前駆体の発現を定量化するためにリアルタイムＰＣＲアッセイを使用する、ノーザンブロット解析に対する代替法を記載している。この方法の短所は、これによって、前駆体ｍｉＲＮＡの定量化（成熟したｍｉＲＮＡの発現レベルを必ずしも反映するというわけではない）が可能になるだけであることである。多数のｍｉＲＮＡの発現を十分に特徴づけるために、ｍｉＲＮＡ生合成の変化によって、前駆体ｍｉＲＮＡのレベルとは非常に異なるレベルのｍｉＲＮＡが産生される場面で、ヒト疾患において発現されるものなどの成熟したｍｉＲＮＡを定量化することが必要である。例えば、２６ｍｉＲＮＡの前駆体が、非癌性および癌性の結腸直腸組織において、患者から、等しく発現されたのに対して、成熟したヒトｍｉＲ１４３およびｍｉＲ１４５の発現は、非癌組織と比較して、癌組織で大いに減少し、これは、ヒト疾患における特異的なｍｉＲＮＡについてのプロセッシングの変化を示唆している（非特許文献２９）。一方では、シロイヌナズナにおけるｍｉＲ１６６およびｍｉＲ１６５を用いる、トウモロコシにおける最近の発見は、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、植物における葉の極性を定めるシグナルとして作用し、初期の葉のシグナルセンター（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒｅ）から出る可動性のシグナルを形成することもできることを示唆している（非特許文献３０；非特許文献３１）。
結論として、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して成熟したｍｉＲＮＡならびにｓｉＲＮＡを測定する際の最も大きな課題は、２１〜２５ｎｔというその小さなサイズである。本発明の記載されている方法は、小さなＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡならびにｓｉＲＮＡ）の検出および定量化における上述の実際的な問題に対処し、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ転写産物の正確かつ特異的な定量化のための、柔軟性のある、好都合な、安価なアッセイの開発を確実にすることを目指す。
ＲＮＡエディティングおよび選択的スプライシング
ＲＮＡエディティングは、他の力学的に規定された方法（選択的スプライシングまたはポリアデニル化など）を除いて、ＲＮＡ分子の一次配列中の任意の特異的な変化を示すために使用される。エディティングに起因するＲＮＡ変化は、その変化が塩基レベルで起こるかヌクレオチドレベルで起こるかどうかに応じて、２つの広いカテゴリに分かれる（非特許文献３２）。ＲＮＡエディティングは、非常に広範囲にわたり、哺乳類、ウイルス、有袋類、植物、ハエ、カエル、虫、イカ、真菌、粘菌、渦鞭毛藻類、キネトプラスト目原虫、および他の単細胞の真核生物で起こる。ＲＮＡエディティングが、すべての後生動物を含めた多くの他の種において、ほぼ確実に起こるので、知られているエディティング酵素の相同体の分布に基づくと、現行リストは、おそらく氷山の一角を示すに過ぎない。ＲＮＡエディティングは、発生的または組織特異的方式で調節される可能性があるので、これは、おそらく、ヒト疾患の病因論においてかなりの役割を果たすであろう（非特許文献３２）。
真核生物の遺伝子についての共通の特徴は、これらが、タンパク質をコードするエキソンおよびイントロンからなるということである。イントロンは、イントロンのそれぞれの端の配列が共にスプライシングされるようなＲＮＡスプライシングで、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子から切除されることによって特徴づけられる。ＲＮＡスプライシングは、機能性のｍＲＮＡを提供するだけではなく、さらなる多様性を生み出すことも担う。この現象は、選択的スプライシングと呼ばれ、これは、同じ遺伝子から異なるｍＲＮＡを産生するという結果になる。単一の遺伝子から生じるアイソフォームに相当するｍＲＮＡは、他のエキソンの使用、あるいは２つのエキソンを分断するイントロンの保持によって、異なる可能性がある。このプロセスによって、異なるタンパク質産物（関連する、あるいは大幅に異なる拮抗する細胞機能をもつ可能性がある）が、しばしばもたらされる。選択的スプライシングが非常に広範囲にわたることを示唆する根拠は増加している（非特許文献３３）。最近の研究では、ヒトゲノム中のおよそ３５，０００の遺伝子のうちの少なくとも８０％が、選択的スプライシングされることが示されている（非特許文献５）。明らかに、異なるタイプの改変を組み合わせ、その後、異なる遺伝子の転写産物の可能性のある異なる組み合わせを生み出すことにより、選択的スプライシングは、ＲＮＡエディティングと共に、タンパク質の多様性を生み出すための強力な機構である。
選択的スプライスバリアントおよびＲＮＡエディティングの分析は、言い換えると、機能性ゲノミクス、疾患診断法、および薬理ゲノミクスへの新規の手法となる。
ヒト疾患の原因因子としての、選択的スプライシングの誤制御
転写アウトプットの詳細な構造の検出は、細胞または組織の分子的特徴付けのための重要なゴールである。ある組織内に存在するスプライスバリアントを検出および定量化できなければ、転写産物含有量またはタンパク質含有量を、正確に示すことはできない。分子医学的な研究では、多くの癌が、スプライスバリアントのレベルを変化させることを示すので、これらの転写産物を検出および定量化する精密な方法が必要とされる。異常なスプライス形を産生する突然変異はまた、脊椎・筋ジストロフィーおよび嚢胞性線維症などの重い疾患の主因である可能性がある。
ヒト疾患の研究の多く、さらに言えば遺伝学の多くは、数モデルの生物の研究に基づいている。選択的スプライシングパターンの進化的な安定性、およびそのスプライシングに対する程度は、突然変異によって変化し、環境的および細胞的条件が、これらのモデルシステムの関連性に影響を与える。現在、選択的スプライシングパターンまたはＲＮＡエディティング変化の速度、およびこれらの速度に影響を与える因子は、ほとんど理解されていない。
以前、酵母におけるＲＮＡ転写産物それ自体のスプライシングを検出する、あるいはラット組織における推定上のエキソンスキップスプライシング事象を検出する目的で、他の分析法が実施されたが、これらの手法はどちらも、スプライスバリアント（すなわち細胞ライフサイクルおよび疾患の変化の理解に不可欠である可能性がある因子）の量を推定するのに十分な分解能を有さなかった。したがって、核酸増幅、ハイブリダイゼーションおよび定量化のために、改良された方法が必要である。本発明のこの方法は、ｍＲＮＡスプライスバリアントならびにＲＮＡエディティングされた（ｅｄｉｔｅｄ）転写産物を区別し、患者から得られるサンプルなどの核酸サンプル中のそれぞれのバリアントの量を定量化することを可能にする。
真核生物におけるアンチセンス転写
ＲＮＡ仲介型の遺伝子調節は、高等真核生物において広範囲にわたっており、ＲＮＡ干渉、共抑制、導入遺伝子サイレンシング、インプリンティング、メチル化、ならびに、ひょっとすると斑入り位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｅｆｆｅｃｔ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）、およびトランスベクションのような複雑な遺伝事象はすべて、ＲＮＡシグナリングに基づくあるいは関係する交差（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎｇ）経路を含む（非特許文献３４）。最近の研究では、アンチセンス転写が、マウスおよびヒトゲノムにおいて非常に一般的な事象であることが示唆されている（非特許文献３５；非特許文献３６）。したがって、真核生物の細胞（例えばヒト細胞）における遺伝子発現のアンチセンス調節は、一般的な調節機構であると考えられる。これを考慮して、本発明は、非コードアンチセンスＲＮＡの定量化のための方法、ならびにセンス−アンチセンス転写単位間のオーバーラップ領域の非常に精密なマッピングのための方法を提供する。
ランダー（Ｌａｎｄｅｒ）、リントン（Ｌｉｎｔｏｎ）、ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、２００１年、「Ｎａｔｕｒｅ」４０９：８６０〜９２１ ベンター（Ｖｅｎｔｅｒ）、アダムズ（Ａｄａｍｓ）、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、２００１年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９１：１３０４〜１３５１ サチダナンダム（Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ）、ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、２００１年、「Ｎａｔｕｒｅ」４０９：９２８〜９３３ ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、２００１年、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１１：１９７５〜１９７７ カンパ（Ｋａｍｐａ）ら、２００４年、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１４：３３１〜３４２ クー（Ｋｅ）ら、２００３年、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．」７：５１６〜５２３ リー（Ｌｅｅ）ら、１９９３年、「Ｃｅｌｌ」７５：８４３〜８５４ ラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ）ら、２０００年、「Ｎａｔｕｒｅ」４０３：９０１〜９０６ アンブロース（Ａｍｂｒｏｓ）ら、２００３年、「ＲＮＡ」９：２７７〜２７９ ラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ）ら、２００２年、「Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．」１６：１６１６〜１６２６ ラゴス−キンタナ（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ）ら、２００１年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９４：８５３〜８５８ グリショク（Ｇｒｉｓｈｏｋ）ら、２００１年、「Ｃｅｌｌ」１０６：２３〜２４ リー（Ｌｅｅ）およびアンブロース（Ａｍｂｒｏｓ）、２００１年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９４：８５８〜８６２ ハットヴァンガー（Ｈｕｔｖａｎｇｅｒ）およびザモール（Ｚａｍｏｒｅ）、２００２年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９７：２０５６〜２０６０ パウシュキン（Ｐａｕｓｈｋｉｎ）ら、２００２年、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」１４：３０５〜３１２ ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、２００３年、「ＴＩＢＳ」２８：５３４〜５４０ ドスティエ（Ｄｏｓｔｉｅ）ら、２００３年、「ＲＮＡ」９：１８０〜１８６ カリン（Ｃａｌｉｎ）ら、２００２年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」９９：１５５２４〜１５５２９ ファイア（Ｆｉｒｅ）ら、１９９８年、「Ｎａｔｕｒｅ」３９１：８０６〜８１１ リパルディ（Ｌｉｐａｒｄｉ）ら、２００１年、「Ｃｅｌｌ」１０７：２９７〜３０７ チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、２００２年、「ＥＭＢＯ Ｊ．」２１：５８７５〜５８８５ ニッカネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、２００１年、「Ｃｅｌｌ」１０７：３０９〜３２１ モス（Ｍｏｓｓ）、２００２年、「Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ」１２：Ｒ１３８〜Ｒ１４０ リー（Ｌｅｅ）およびアンブロース（Ａｍｂｒｏｓ）、２００１年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９４：８６２〜８６４ ゾン（Ｚｅｎｇ）およびカレン（Ｃｕｌｌｅｎ）、２００３年、「ＲＮＡ」９：１１２〜１２３ クリチェフスキー（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ）ら、２００３年、「ＲＮＡ」９：１２７４〜１２８１ グラッド（Ｇｒａｄ）ら、２００３年、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ」１１：１２５３〜１２６３ シュミッテゲン（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ）ら、２００４年、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」３２：ｅ４３ マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）ら、２００３年「Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」１：８８２〜８９１ ファレス（Ｊｕａｒｅｚ）ら、２００４年、「Ｎａｔｕｒｅ」４２８：８４〜８８ キドナー（Ｋｉｄｎｅｒ）およびマルティエンセン（Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ）、２００４年、「Ｎａｔｕｒｅ」４２８：８１〜８４ ゴット（Ｇｏｔｔ）、２００３年、「Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ」３２６ ９０１〜９０８ クロフト（Ｃｒｏｆｔ）ら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２０００年 マティック（Ｍａｔｔｉｃｋ）、２００１年、「ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ２」、１１：９８６〜９９１ オカザキ（Ｏｋａｚａｋｉ）ら、２００２年、「Ｎａｔｕｒｅ」４２０：５６３〜５７３ イェリン（Ｙｅｌｉｎ）ら、２００３年、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」
発明の概要
ゲノム機能を確立し、高等真核生物の複雑なトランスクリプトームに隠された情報の層を理解するという課題は、複雑な核酸サンプルにおけるＲＮＡ分子の検出、分析、および定量化のための新規の改良された技術を必要とする。したがって、均質なアッセイシステムにおいて特異的かつ感受性が高いオリゴヌクレオチド検出プローブに基づく方法を使用して、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、ならびに真核生物のトランスクリプトームにおける高度に相同のスプライスバリアントの発現を検出および定量化できることは、非常に望ましいであろう。
本発明は、短い核酸標的（例えば、ＲＮＡ標的配列）への十分な配列特異性および高い親和性をもつ新規のオリゴヌクレオチドタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）プローブおよび検出プローブの設計、合成、および組み合わせられた使用のための方法を提供することによって、ランダムなＲＮＡ標的分子を検出する可能性が低い上に、成熟前のＲＮＡ分子も検出する可能性が低いような、上に概説した均質なアッセイへの従来の手法が直面する目下の問題を解決する。こうしたタギングプローブは、リアルタイム定量ＰＣＲアッセイにおけるポリメラーゼ連鎖反応による核酸のその後の増幅のためのプライミング部位として不可欠である、タギングプローブにアンカーされた（ａｎｃｈｏｒｅｄ）配列を含有する。本発明の方法は、それぞれ、第１のタギングプローブが、標的配列内の第１の領域とハイブリダイズし、第２のタギングプローブが、同じ相補的な標的配列（例えば、第１の領域と隣接している短いＲＮＡ標的配列）内の第２の領域とハイブリダイズするような、相補的な標的配列（例えば短いＲＮＡ配列）を検出するために組み合わせて設計された２つのアンカー付けされた（ａｎｃｈｏｒｅｄ）タギングプローブを利用する。好ましい態様では、タギングプローブの１つは、単一のオリゴヌクレオチド配列を形成するためのリガーゼによって相補的な標的配列とハイブリダイズされる、２つの近接タギングオリゴヌクレオチドプローブの共有結合を可能にするように５’リン酸化されている。複雑な（ｃｏｍｐｌｅｘ）核酸サンプル中の標的ＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションにおけるバックグラウンドは、２つのプローブの共有結合的連結のために、両方のプローブの相補的な標的配列（例えば、短いＲＮＡ標的配列）へのハイブリダイゼーションが必要とされるような２つのタギングプローブを用いて排除される。この方法はさらに、短い標的配列（例えばｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）への感受性が高く特異的なハイブリダイゼーションのための、認識配列の、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）との置換を利用する。連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応の後、ＰＣＲプライマーのためのプライミング部位としてタギングプローブに付着されるアンカー（ａｎｃｈｏｒ）配列と、アンプリコンへの結合を可能にする、十分な二本鎖安定性をもつ短い検出プローブを使用する、標的配列（例えばリボ核酸を鋳型にする、共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチド分子）の定量リアルタイムＰＣＲが行われ、ここで、均質なアッセイに使用される様々な検出原理のうちのいずれかが使用される。好ましい態様では、リアルタイム定量ＰＣＲアッセイにおける短い検出プローブの使用を可能にするために、検出プローブは、二本鎖を安定化する、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）、好ましくはオキシＬＮＡで置換される。
別の手法では、核酸サンプル中の標的リボ核酸とハイブリダイズされるタギングプローブを共有結合的に連結することは、耐熱性のリガーゼを使用して実施され、これにより、標的配列タギング反応において実施されるべき高い温度で、変性、アニーリング、および連結の反復的なサイクルが可能になり、それによって、その後のリアルタイム定量ＰＣＲアッセイのための複数の共有結合的に連結された鋳型分子が産生される。好ましい態様では、アニーリング温度は、複雑な核酸サンプル中の高度に相同の標的リボ核酸の間の識別を可能にするように調節される。別の態様では、アニーリング温度は、高度に相同の標的配列の間の単一のミスマッチ識別を可能にするように調節される。
さらに別の手法では、第１のタギングプローブの認識配列は、標的リボ核酸配列中の配列、例えば成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端と、あるいは、標的リボ核酸配列におけるＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する３’に位置する配列と相補的である。前記の第１のタギングプローブ（ＲＴタギングプローブと呼ばれる）は、逆転写酵素を使用して、標的ＲＮＡ配列と相補的なプライマー伸長産物を産生するための、逆転写反応におけるアンカー付けされたプライマーとして使用される。第２のタギングプローブ（第２鎖タギングプローブと呼ばれる）は、その認識配列が、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列に、あるいは、リボ核酸標的配列におけるＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する５’に位置する配列と相補的であるように設計される。第２鎖タギングプローブは、プライマー伸長産物と相補的な第２鎖を産生するために、アンカー付けされたプライマーとして使用される。反応の特異性は、それぞれ、標的ＲＮＡおよび相補的なＤＮＡ配列の相補的な３’末端および５’末端領域とハイブリダイズする、２つのアンカー付けされたタギングプローブの連続的な使用に基づく。好ましい態様では、ＲＴタギングプローブの認識配列は、二本鎖を安定化する、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）、好ましくはオキシＬＮＡで改変され、高い厳密性のプライマーアニーリング条件の使用が可能になる。さらに別の好ましい態様では、どちらのタギングプローブの認識配列も、二本鎖を安定化する、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）、好ましくはオキシＬＮＡで改変され、それぞれ、逆転写と第２鎖合成反応において、高い厳密性のプライマーアニーリング条件の使用が可能になる。第２鎖反応の後、ＰＣＲプライマーのためのプライミング部位としてタギングプローブに付着されるアンカー配列と、アンプリコンへの結合を可能にする、十分な二本鎖安定性をもつ短い検出プローブを使用する、アンカー付けされた標的リボ核酸配列（例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ配列）に相当する得られた二本鎖標的配列の定量リアルタイムＰＣＲが行われ、ここでも均質なアッセイに使用される様々な検出原理のうちのいずれかが使用される。好ましい態様では、リアルタイム定量ＰＣＲアッセイにおける短い検出プローブの使用を可能にするために、検出プローブは、二本鎖を安定化する、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）、好ましくはオキシＬＮＡで置換される。さらに別の好ましい態様では、検出プローブは、ＬＮＡモノマーと組み合わせて、二本鎖を安定化するＬＮＡジアミノプリンまたはＬＮＡ ２−チオ−Ｔ高親和性類似体でさらに置換される。
本発明のこの方法は、何十万もの異なる核酸からなる複雑な混合物中の個々の小さいＲＮＡ分子の検出および定量化（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ標的特異的なタギングプローブセット、およびｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ検出プローブと組み合わせられた場合に、成熟したｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを検出することなど）のために非常に有用かつ適用可能である。タギングプローブセットならびに検出プローブ中の認識配列は、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）、好ましくはオキシＬＮＡの置換によって合成され、非常に感受性が高く特異的なハイブリダイゼーションおよび連結が、高い温度で起こることが可能になる。タギングプローブセットからのアンカープライマー部位を含む、高親和性のヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ、ＬＮＡジアミノプリンおよびＬＮＡ ２−チオ−チミジン、成熟したｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡに対応する短いアンプリコン）によって置換された、本発明の短い検出プローブの使用によって、標準のリアルタイム定量ＰＣＲアッセイにおいて、直接的にモニタリングすることができる。本発明の方法は、さらに、そのそれぞれのトランスクリプトームにおける何十万もの異なるリボ核酸からなる、ヒト、マウス、ラット、線虫、キイロショウジョウバエ、シロイヌナズナ、イネ、およびトウモロコシ・トランスクリプトームなどの複雑な核酸サンプル中の、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ以外の非コードＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ転写産物、ＲＮＡエディティングされた転写産物、または高度に相同の選択的スプライシング転写産物の検出および定量化において、非常に有用である。この方法はまた、例えば癌患者からの、複雑なヒト核酸サンプルにおける、ヒト疾患に関係または関連するｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、または他のｍＲＮＡスプライスバリアントの検出、試験、診断、または定量化に直接的に適用可能である。
定義
以降の発明の詳細な説明の目的で、特定の用語について、以下の定義が提供され、これらは、本発明の開示において使用される。
以下では、標的配列（例えば、短いＲＮＡ標的配列、オリゴヌクレオチド、プライマー）と相補的な認識配列を含む「ブロッカープローブ」は、プローブを指す。前記のブロッカープローブは、相補的な標的配列への配列同一分子のハイブリダイゼーションを防止するために使用される。一般に、ブロッカープローブは、１つ、２つまたはそれ以上のＬＮＡモノマーを含有し、ブロッカープローブの３’末端は、プライマー伸長産物へのブロッカープローブの組み込みを妨げるために改変される。この「ブロッキング」は、非相補的塩基を使用することによって、あるいは、最終のヌクレオチドの３’−水酸基にビオチンやリン酸基などの化学的部分を加えることによって達成することができる。
以下では、「ｄＮＴＰ」は、２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、および２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸の混合物を意味する。
「ＲＴ−プライマー」は、標的デオキシリボ核酸および／またはリボ核酸配列内の配列（例えば、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端）と、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ）部分と、あるいは標的リボ核酸配列内の、ＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する３’に位置する配列と相補的な認識配列と、その後の捕捉またはＰＣＲによる増幅にとって不可欠なアンカー配列とを含むプライマーを指す。前記のＲＴ−プライマーは、逆転写酵素を使用して、標的ＲＮＡ配列と相補的なプライマー伸長産物を産生するための逆転写反応においてアンカー付けされたプライマーとして使用される。
用語「捕捉プローブ」は、標的配列（例えば、短いＲＮＡ標的配列、およびその後の捕捉、逆転写反応、またはＰＣＲによる増幅にとって不可欠なアンカー配列）と相補的な認識配列を含むプローブを指す。アンカー配列は、その後の逆転写反応、リアルタイムＰＣＲにおける、ＲＴ−またはＰＣＲプライマーのためのプライミング部位として、あるいは捕捉アッセイのためのタグとして機能する。
本発明の状況では、用語「リンカー」は、上で規定されたタイプの２つ以上の異なるヌクレオチド部分を連結するために使用される、熱化学的かつ光化学的に非活性な距離を作る基を意味する。リンカーは、その疎水性、親水性、分子の自由度および長さを含めて、様々な特性に基づいて選択される（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）ら、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９９２年）、ｐ．１３７以降を参照のこと）。一般に、リンカーの長さは、約４００オングストロームまたはそれ未満であり、ある種の用途では、好ましくは１００オングストローム未満である。したがって、リンカーは、酸素原子、窒素原子、および／または硫黄原子などの、１つまたは複数のヘテロ原子で、任意に割り込まれるあるいは終結する炭素原子の鎖を含む。したがって、リンカーは、１つまたは複数のアミド、エステル、アミノ、エーテル、および／またはチオエーテル官能基、ならびに任意に芳香族またはモノ／ポリ不飽和炭化水素、ポリエチレングリコールなどのポリオキシエチレン、ポリ−（３−アラニン）などのオリゴ／ポリアミド、ポリグリシン、ポリリシン、および一般のペプチド、オリゴ糖、オリゴ／ポリリン酸塩を含むことができる。さらに、リンカーは、それらが組み合わせられた単位からなってもよい。リンカーの長さは、５または６員環に関して問題となる、基の「活性な／官能性」部分の、所望のあるいは必要な位置決めや、空間的方向を考慮して、変えることができる。特に興味深い実施形態では、リンカーは、化学的に切断可能な基を含む。こうした化学的に切断可能な基の例には、還元的な条件下で切断可能なジスルフィド基、ペプチダーゼによって切断可能なペプチド断片などが含まれる。
本発明の状況では、「固体支持体」は、様々なポリマー材料、例えばＣＰＧ（コントロールドポアグラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ））、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリエチレンから選択することができ、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、スティック、ビーズ、粒子、フィルターなどの様々な形をとることができる。オリゴヌクレオチドは通常、オリゴヌクレオチドの固定化において用いられる様々な化学的または光化学的方法によって、あるいは、例えば固定化されたストレプトアビジンへのビオチン化されたオリゴヌクレオチドの結合を介する非共有結合的な結合によって、その５’または３’末端を介して（あるいは５’または３’末端に付着されたリンカーの末端を介して）固体支持体に固定することができる。
「ループプライマー」は、標的デオキシリボ核酸配列内の配列と相補的な認識配列を含むプローブを指す。ただし、この認識配列は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と、あるいは、初期の（ｉｎｉｔｉａｌ）リボ核酸標的配列内のＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する５’に位置する配列と、その後の捕捉またはＰＣＲによる増幅にとって不可欠なアンカー配列と相補的である。前記のループプライマーは、プライマー伸長産物と相補的である第２の核酸鎖を産生するためのアンカー付けされたプライマーとして使用される。ループプライマーの別の態様は、アンカー配列が、選択されたアッセイ温度で、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端の相補的な配列によって仲介される、分子内ヘアピン構造を形成するものである。反応の特異性は、それぞれ、標的ＲＮＡおよび相補的なＤＮＡ配列の相補的な３’末端および５’末端領域とハイブリダイズする、オーバーラップしない認識配列をもつ２つのアンカー付けされたタギングプローブの、連続的な使用に基づく。
「ヘアピン構造」は、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端での相補的な配列のハイブリダイゼーションによって仲介される、選択されたアッセイ温度でのオリゴヌクレオチドの分子内構造を指す。
「Ｕ」は、規定された時間および温度を使用して所与の量の反応物を産物に転換するために必要とされる酵素の量として定義される酵素単位を指す。
本発明では、「リガンド」は、結合する何かを意味する。リガンドは、ビオチン、ならびに以下などの官能基を含む：芳香族基（ベンゼン、ピリジン、ナフタレン、アントラセン、およびフェナントレンなど）、複素環式芳香族基（チオフェン、フラン、テトラヒドロフラン、ピリジン、ジオキサン、およびピリミジンなど）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハライド、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハライド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、一級アルコール、二級アルコール、三級アルコール、フェノール、ハロゲン化アルキル、チオール、ジスルフィド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド；酸素原子、窒素原子、および／または硫黄原子などの、１つまたは複数のヘテロ原子で、任意に割り込まれるあるいは終結し、任意に芳香族またはモノ／ポリ不飽和炭化水素を含有するＣ１〜Ｃ２０アルキル基；ポリエチレングリコールなどのポリオキシエチレン、ポリ−β−アラニンなどのオリゴ／ポリアミド、ポリグリシン、ポリリシン、ペプチド、オリゴ／ポリサッカリド、オリゴ／ポリリン酸、毒素、抗生物質、細胞毒、およびステロイド、さらに、「親和性リガンド」、すなわち、特定のタンパク質、抗体、ポリ−およびオリゴ糖および他の生体分子上の部位に対して特異的親和性を有する官能基または生体分子。
単数形「ある」「一つの」および「その」は、その文脈が別途明らかに決定しない限り、複数の内容を含む。例えば、用語「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含めて、複数個の細胞を含む。用語「ある核酸分子（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、複数の核酸分子を含む。
「トランスクリプトーム」は、任意の種のゲノムの転写単位の完全な収集物を指す。タンパク質をコードするｍＲＮＡに加えて、これはまた、細胞での重要な構造的および調節的役割を含む、非コードＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡなど）も表す。
用語「アンプリコン」は、小さい、複製するＤＮＡ断片を指す。
「サンプル」は、これらに限定されないが、例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、髄液、尿、涙、血球、器官、腫瘍、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養成分のサンプル（これらに限定されないが、細胞培養培地における、細胞の成長に起因する調整された培地や、組換え型細胞、および細胞成分が含まれる）を含めて、生物または生物から単離される細胞または組織または体液のサンプルを指す。
「生物」は、これらに限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫、酵母、シロイヌナズナ、トウモロコシ、イネ、ゼブラフィッシュ、霊長類、家畜などを含めて、生命体を指す。
「タギングプローブ」は、標的配列、例えば短いＲＮＡ標的配列と相補的な認識配列、およびその後の捕捉またはＰＣＲによる増幅にとって不可欠なアンカー配列を含むプローブを指す。「２つのタギングプローブ」または「一対のタギングプローブ」は、それぞれが組み合わされて短い相補的な標的配列、例えば短いＲＮＡ配列を検出するように設計された、２つのアンカー付けされたタギングプローブを指す。ただし、第１のタギングプローブの認識配列は、標的配列内の第１の領域とハイブリダイズし、第２のタギングプローブの認識配列は、同じ相補的な標的配列（例えば、第１の領域と隣接する短いＲＮＡ標的配列）内の第２の領域とハイブリダイズする。本発明の方法では、タギングプローブの１つは、５’リン酸化されており、単一のオリゴヌクレオチド配列を形成するリガーゼによって相補的な標的配列とハイブリダイズされる、近接する２つのオーバーラップしないタギングオリゴヌクレオチドプローブの共有結合が可能になる。タギングプローブに付着されるアンカー配列は、本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーション条件下で、特定のトランスクリプトーム内の任意の標的核酸に、あるいは互いに交差ハイブリダイズしないように設計される。アンカー配列は、その後のリアルタイム定量ＰＣＲにおけるＰＣＲプライマーのためのプライミング部位として、あるいは捕捉アッセイのためのタグとして機能する。
「ＲＴタギングプローブ」は、標的リボ核酸配列における配列と、例えば、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端と、あるいは、標的リボ核酸配列におけるＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する３’に位置する配列と相補的な認識配列と、その後の捕捉またはＰＣＲによる増幅にとって不可欠なアンカー配列を含むプローブを指す。前記のＲＴタギングプローブは、逆転写酵素を使用する、標的ＲＮＡ配列と相補的なプライマー伸長産物を産生するための逆転写反応において、アンカー付けされたプライマーとして使用される。「第２鎖タギングプローブ」は、アンカー付けされたタギングプローブを指す。ただし、この認識配列は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と、あるいは、初期のリボ核酸標的配列内のＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する５’に位置する配列と相補的である。第２鎖タギングプローブは、第２の核酸鎖を産生するアンカー付けされたプライマーとして使用され、これは、プライマー伸長産物と相補的である。反応の特異性は、それぞれ、標的ＲＮＡおよび相補的なＤＮＡ配列の相補的な３’末端および５’末端領域とハイブリダイズする、オーバーラップしない認識配列をもつ２つのアンカー付けされたタギングプローブの、連続的な使用に基づく。
「２つのタギングプローブ」または「一対のタギングプローブ」は、それぞれが組み合わされて短い相補的な標的配列、例えば短いＲＮＡ配列を検出するように設計された、２つのアンカー付けされたタギングプローブを指す。ただし、第１のタギングプローブの認識配列は、標的配列内の第１の領域にハイブリダイズし、配列を認識する第２鎖のタギングプローブの認識配列は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と、あるいは、初期のリボ核酸標的配列内のＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する５’に位置する配列と相補的である。第２の鎖タギングプローブは、第２の核酸鎖を産生するためのアンカー付けされたプライマーとして使用され、これは、プライマー伸長産物と相補的である。
２つのタギングプローブの各々に付着されるアンカー配列は、本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーション条件下で、特定のトランスクリプトーム内の任意の標的核酸に、あるいは互いに交差ハイブリダイズしないように設計される。アンカー配列は、その後のリアルタイム定量ＰＣＲにおけるＰＣＲプライマーのためのプライミング部位として、あるいは捕捉アッセイのためのタグとして機能する。
用語「プライマー」は、２つ以上のプライマーを指し、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒されるような条件下に置かれた場合、相補的な鎖に沿った、合成の開始点として作用することができる、精製された制限消化産物などにおいて天然に生じる、または合成的に産生されるオリゴヌクレオチドを指すことができる。こうした条件としては、適切なバッファー（「バッファー」は、補助因子である置換基を含む、あるいは、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす）中の、かつ適切な温度の、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合誘発剤（例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在が挙げられる。プライマーは、適切なバッファー（「バッファー」は、補助因子である置換基を含む、あるいは、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす）中の、かつ適切な温度のポリメラーゼまたは逆転写酵素による増幅における最大効率のために、一本鎖であることが好ましい。プライマーは、増幅における最大効率のために、一本鎖であることが好ましい。
用語「検出プローブ」は、標的領域内の配列をもつプローブの相補性に起因して、増幅された標的核酸内の配列、例えば短いＲＮＡ標的配列と共に二本鎖構造を形成する、標識されたオリゴヌクレオチドを指す。検出プローブは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応を開始するために使用される配列に対して相補的な配列を含有しない。一般に、プローブの３’末端は、プライマー伸長産物へのプローブの組み込みを妨げるために「ブロック」されることとなる。「ブロック」は、非相補的塩基を用いて、あるいは、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルにビオチンまたはリン酸基などの化学的な部分を付加することによって達成することができ、これは、選択された部分に応じて標識として作用することによって、二重の目的を果たすことができる。
用語「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は、内因性遺伝子から得られる２１〜２５ｎｔの非コードＲＮＡを指す。これらは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるより長い（約７５ｎｔ）ヘアピン様前駆体から加工される。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと呼ばれる複合体に組み立てられ、アンチセンス相補性によってその標的を認識する。ｍｉｃｒｏＲＮＡが、１００％その標的にマッチする、すなわち、相補性が完全である場合、標的ｍＲＮＡは切断され、ｍｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのように作用する。マッチが不完全である、すなわち、相補性が部分的である場合、標的ｍＲＮＡの翻訳はブロックされる。
用語「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、線状二本鎖ＲＮＡのプロセッシングから得られる２１〜２５ｎｔのＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と称される複合体に組み立てられ、ヌクレオチド鎖切断のための相同のＲＮＡ配列を標的にする。合成のｓｉＲＮＡはまた、ＲＩＳＣを補充し、相同のＲＮＡ配列を切断することができる。
用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、標的ｍＲＮＡと相同の二本鎖ＲＮＡが、標的にされたｍＲＮＡを分解させる現象を指す。より広く言うと、相同のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解と定義される。
用語「認識配列」は、標的ヌクレオチド配列と認識配列との間の配列特異的ハイブリダイゼーションにとって不可欠な、標的ヌクレオチド配列内の領域と相補的であるヌクレオチド配列を指す。本発明のタギングプローブならびに検出プローブは、標的配列特異的認識配列を含有する。
用語「アンカー配列」は、一対のタギングプローブに近接して付着される２つのヌクレオチド配列を指し、このアンカー配列は、これらが、互いに、あるいは、標的ヌクレオチド配列または核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を含有する任意のヌクレオチド配列と、交差ハイブリダイズしないように設計される。
用語「標識」は、本明細書では、検出可能な（好ましくは定量化可能な）シグナルを提供するために使用することができる、かつ、核酸またはタンパク質に付着させることができる任意の原子または分子を指す。標識は、蛍光、放射能、比色、Ｘ線の回折または吸収、磁気、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供することができる。
標識は、それ自体で、あるいは、検出シリーズの一部として検出可能なレポーター基である。レポーター基の機能性部分の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基（ある種の波長の電磁放射（例えば光またはＸ線）を吸収し、その後、吸収されたエネルギーをより長い波長の放射線として再放射することが可能である基；実例は、ＤＡＮＳＹＬ（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４，４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３およびＣｙ５（バイオロジカルディテクションシステムズ社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のための商標）、エリトロシン、クマル酸、ウンベリフェロン、テキサス(Ｔｅｘａｓ）レッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒｏｘ、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、フルオレセイン、ユウロピウム、ルテニウム、サマリウム、および他の希土類元素である）、ラジオアイソトープ標識、化学ルミネセンス標識（化学反応中の光の放射を介して検出可能である標識）、スピン標識（電子スピン共鳴分光法を使用することにより検出可能な生体分子に結合する、フリーラジカル（例えば置換された有機窒素酸化物）または他の常磁性プローブ（例えばＣｕ２＋、Ｍｇ２＋））である。特に興味深い例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ユウロピウム、Ｃｙ５、Ｃｙ３などである。
「連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」または「共有結合」は、単一のヌクレオチド配列を形成するための、２つの隣接するヌクレオチド配列、例えば本発明のタギングオリゴヌクレオチドプローブ配列の共有結合を指す。この反応は、あるヌクレオチド配列の５’末端と、隣接するヌクレオチド配列の３’末端との間の（例えば、その相補的な、標的核酸配列とアニーリングされる本発明の２つの隣接するタギングプローブ間の）リン酸ジエステル結合を形成する酵素リガーゼによって触媒される。
「ＲＮＡを鋳型にするオリゴヌクレオチド連結」は、相補的なＲＮＡ標的配列とアニーリングして単一のヌクレオチド配列を形成する２つの隣接するオリゴヌクレオチドプローブ配列の共有結合を指す。この反応は、あるヌクレオチド配列の５’末端と、隣接するヌクレオチド配列の３’末端との間の、例えば、本発明の２つの隣接するタギングプローブ間のリン酸ジエステル結合を形成する酵素リガーゼによって触媒される。
用語「ＰＣＲ反応」、「ＰＣＲ増幅」、「ＰＣＲ」、「ｐｒｅ−ＰＣＲ」、および「リアルタイム定量ＰＣＲ」は、検出される標的核酸を増加させる核酸増幅システムの使用を意味するために互換的に使用される用語である。こうしたシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）システムが含まれる。最近記載されている、当分野の技術者に知られている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、キャンジーン（Ｃａｎｇｅｎｅ）、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、オンタリオ州）およびＱ Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅシステムである。前記増幅反応によって形成される産物は、リアルタイムで、あるいは、終点測定値として反応後のみにモニタリングしてもよいし、しなくてもよい。
本明細書では、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、検出されることとなるプライマー、プローブ、オリゴマーフラグメント、オリゴマーの対照、および標識されていないブロックオリゴマーを指し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）に、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース含有）に、また、プリンまたはピリミジン塩基、あるいは改変されたプリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチドに、属する。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」の間に、長さの意図される相違はなく、これらの用語は、同義的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡが含まれる。オリゴヌクレオチドは、所定の標的ヌクレオチド配列の領域に相当する、少なくともおよそ３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約８〜３０ヌクレオチドの配列からなる。「相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、所定の配列と同一であるあるいは相補的であることを意味する。オリゴヌクレオチドは、必ずしも任意の既存のまたは天然の配列から物理的に得られるというわけではなく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含めて、いずれの方法で産生されてもよい。
用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸」は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡのポリヌクレオチドであり、その起源または操作に基づいて、半合成または合成起源である：（１）それが天然に結合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と結合する；および／または（２）それが天然に連結される以外のポリヌクレオチドに連結される；ならびに（３）天然に見られない。あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して、ある方向でその隣の３’酸素に付着されるような方式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドが作製されるので、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸が、モノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されない場合、「５’末端」と、その３’酸素が、次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されない場合、「３’末端」と呼ばれる。本明細書では、たとえ、より大きなオリゴヌクレオチドの内部であったとしても、核酸配列は、５’および３’末端を有すると言うことができる。２つの異なるオーバーラップしないオリゴヌクレオチドが、同じ線状の相補的な核酸配列の異なる領域にアニーリングする場合、片方のオリゴヌクレオチドの３’末端は、もう片方の５’末端の方を指し；前者は、「上流の」オリゴヌクレオチド、後者は、「下流の」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
用語「ＳＢＣ核酸塩基」は、「選択的に結合する相補的な（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」核酸塩基、すなわち、その相補的な核酸塩基と安定な水素結合を作ることができるが、他のＳＢＣ核酸塩基とは安定な水素結合を作ることができない改変された核酸塩基を意味する。一例として、ＳＢＣ核酸塩基Ａ’は、その相補的な改変されていない核酸塩基、Ｔと、安定な水素結合対を作ることができる。同様に、ＳＢＣ核酸塩基Ｔ’は、その相補的な改変されていない核酸塩基Ａと、安定な水素結合対を作ることができる。しかし、ＳＢＣ核酸塩基Ａ’とＴ’は、塩基対Ａ’−ＴおよびＡ−Ｔ’と比較すると、不安定な水素結合対を形成する。同様に、（Ｃ’とＧ’は、塩基対Ｃ’−ＧおよびＣ−Ｇ’と比較すると不安定な水素結合された対を形成するものの）、ＣのＳＢＣ核酸塩基は、Ｃ’と呼ばれ、その相補的な改変されていない核酸塩基Ｇと、安定な水素結合対を作ることができ、また、ＧのＳＢＣ核酸塩基は、Ｇ’と呼ばれ、その相補的な改変されていない核酸塩基Ｃと、安定な水素結合対を作ることができる。２つまたはそれ以上の水素結合、例えばＡ’とＴ、ＡとＴ’、ＣとＧ’、およびＣ’とＧとの間の対が形成される場合、安定な水素結合対が得られる。１個の水素結合が形成される、あるいは水素結合が形成されない場合、例えばＡ’とＴ’、およびＣ’とＧ’と間の対が形成される場合、不安定な水素結合対が得られる。特に興味深いＳＢＣ核酸塩基は、２，６−ジアミノプリン（Ａ’、Ｄとも呼ばれる）と、２−チオ−ウラシル（Ｕ’、２ＳＵとも呼ばれる）（２−チオ−４−オキソ−ピリミジン）および２−チオ−チミン（Ｔ’、２ＳＴとも呼ばれる）（２−チオ−４−オキソ−５−メチル―ピリミジン）である。図４は、Ａ−２ＳＴおよびＤ−Ｔ対が、２つ以上の水素結合を有するが、Ｄ−２ＳＴ対は、単一の（不安定な）水素結合を形成することを示す。同様に、ＳＢＣ核酸塩基ピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン（Ｃ’、ＰｙｒｒｏｌｏＰｙｒとも呼ばれる）およびヒポキサンチン（Ｇ’、Ｉとも呼ばれる）（６−オキソ−プリン）が、図９に示される。ここでは、ＰｙｒｒｏｌｏＰｙｒ−ＧおよびＣ−Ｉ対が、２つの水素結合を有するのに対して、ＰｙｒｒｏｌｏＰｙｒ−Ｉ対は、単一の水素結合を形成する。
「ＳＢＣ ＬＮＡオリゴマー」は、核酸塩基が「ＳＢＣ核酸塩基」である少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含有する「ＬＮＡオリゴマー」を指す。「ＳＢＣ核酸塩基を含むＬＮＡモノマー」は、「ＳＢＣ ＬＮＡモノマー」を意味する。一般的に言って、ＳＢＣ ＬＮＡオリゴマーは、ＳＢＣ ＬＮＡモノマーの他に、他の改変されたあるいは天然に存在するヌクレオチドまたはヌクレオシドを含有するオリゴマーを含む。「ＳＢＣモノマー」は、ＳＢＣ核酸塩基を含む非ＬＮＡモノマーを意味する。「同じ配列の（ｉｓｏｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）オリゴヌクレオチド」は、相当する改変されたオリゴヌクレオチドと、ワトソン−クリックの意味で同じ配列をもつオリゴヌクレオチドを意味する（例えば、配列ａｇＴｔｃＡＴｇは、ａｇＴｓｃＤ２ＳＵｇと等しい）。ただし、ｓは、ＳＢＣ ＤＮＡモノマー２−チオ−ｔまたは２−チオ−ｕと等しく、Ｄは、ＳＢＣ ＬＮＡモノマーＬＮＡ−Ｄと等しく、２ＳＵは、ＳＢＣ ＬＮＡモノマーＬＮＡ２ＳＵと等しい。
核酸配列の相補体は、本明細書では、片方の配列の５’末端が、もう片方の３’末端と対にされるように核酸配列と整列配置される場合、「逆平行の関係」であるオリゴヌクレオチドを指す。本発明の核酸には、例えば、イノシンおよび７−デアザグアニンを含めて、天然の核酸中には一般に見つけられない塩基を含むことができる。相補性は、完全でない場合があり、安定な二本鎖は、ミスマッチの塩基対またはマッチしない塩基を含有することができる。核酸技術の当業者であれば、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドにおけるシトシンおよびグアニン塩基の濃度（％）、イオン強度、およびミスマッチの塩基対の発生率を含めて、いくつかの変数を考慮し、経験に基づいて二本鎖安定性を決定することができる。
融解温度または「Ｔｍ」は、核酸二本鎖の安定性の尺度となる。特定の条件下での特定の核酸二本鎖のＴｍは、二本鎖の半分が解離する温度である。
本明細書で定義する通り、「５’→３’ヌクレアーゼ活性」または「５’から３’ヌクレアーゼ活性」は、ある種のＤＮＡポリメラーゼと伝統的に関連する（すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩは、この活性を有するが、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントは有さない）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（それによって、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端から連続的に除去される）、あるいは、切断が、５’末端から２つ以上のヌクレオチドを生じる５’→３’エンドヌクレアーゼ活性、あるいはこれらの両方を含めて、鋳型特異的な核酸ポリメラーゼのその活性を指す。
「耐熱性の核酸ポリメラーゼ」は、例えば、大腸菌由来のポリメラーゼなどと比較した場合、比較的熱に対して安定であり、かつ、ヌクレオシドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、この酵素は、５’から３’ヌクレアーゼ活性を持つ場合、標的配列とアニーリングされるプライマーの３’末端で合成を開始することとなり、鋳型に沿って５’方向に進行することとなり、介在するアニーリングされたプローブを加水分解する、あるいは置き換え、合成が終結するまで、標識されたプローブフラグメントと標識されていないプローブフラグメントの両方、または完全なプローブを放出する。サーマスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）から単離される代表的な耐熱性の酵素は、米国特許第４，８８９，８１８号明細書に記載されており、従来のＰＣＲにおいてそれを使用するための方法は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８８年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９：４８７に記載されている。
「耐熱性の逆転写酵素」は、例えばトリ骨髄腫ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）逆転写酵素またはモロニーモンキー白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｏｎｋｅｙ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）逆転写酵素などと比較して、より熱安定性である逆転写酵素を指す。
用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびに、天然に存在しない核酸塩基、例えばキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、擬イソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−ヒドロキシ−５−４−メチル−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなど、およびベナー（Ｂｅｎｎｅｒ）ら、米国特許第５，４３２，２７２号明細書、およびスーザンＭ．フレイアー（Ｓｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ）およびカール−ハインツアルトマン（Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ）、１９９７年、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、第２５巻、４４２９〜４４４３ページに記載されている「天然に存在しない」核酸塩基などの、天然に存在しない核酸塩基をカバーする。したがって、用語「核酸塩基」には、知られているプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在する、および天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；Ｓ．Ｔ．クルック（Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ）およびＢ．ルブルー（Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、サングビ（Ｓａｎｇｈｖｉ）による第１５章；エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」３０：６１３〜７２２、１９９１年（特に６２２および６２３ページを参照のこと）、および「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」内、Ｊ．Ｉ．クロシュウィッツ（Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、８５８〜８５９ページ、１９９０年、クック（Ｃｏｏｋ）、「Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ ６」５８５〜６０７、１９９１年（これらをそれぞれ、その内容全体を本明細書に組み込むものとする）に開示されるものが含まれる。
用語「ヌクレオシド塩基」または「核酸塩基類似体」は、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として働くある種の「ユニバーサル塩基」を含めたヌクレオシド塩基のように働くことができる複素環化合物をさらに含むものとされる。３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールは、ユニバーサル塩基として特に挙げられる。他の好ましい化合物には、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体、ピレニル、ピレニルメチルグリセロール誘導体などが含まれる。他の好ましいユニバーサル塩基には、当技術分野で知られたユニバーサル塩基を含めたピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体が含まれる。
「ユニバーサル塩基」は、少なくとも１つ、好ましくはすべての天然の塩基（例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよび／またはチミン）と対になることが可能であり、本明細書に記述する通りの、１５、１２、１０、８、６、４または２℃以下のＴｍ差を有する、天然に存在する、または望ましくは天然に存在しない化合物または部分を指す。
「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」または「オリゴ」は、インターヌクレオシド連結を介して連結するモノマー（例えば複素環塩基のグリコシド）の連続する鎖を意味する。オリゴ中の２つの連続するモノマー間の連結は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される、１原子あたり２から４、望ましくは３つの基／原子からなる。ここで、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ１〜６−アルキルおよびフェニルから選択される。こうした連結の例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−Ｏ−、−ＯＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続するモノマーへの連結として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続するモノマーへの連結として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−ＳＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続するモノマーへの連結として使用される場合、Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−ＯＳ−（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−ＯＳ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＯＰ−（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−ＳＰ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ−（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ’’）２−Ｏ−；その中では特に、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−である。ここで、ＲＨは、選択された形の水素およびＣ１〜４−アルキルであり、Ｒ’’は、Ｃ１〜６−アルキルから選択され、フェニルが特に望ましい。さらなる実例は、メスマーカー（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ）ら、１９９５年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」５、３４３〜３５５、ならびに、スーザンＭ．フレイアー（Ｓｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ）およびカール−ハインツアルトマン（Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ）、１９９７年、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、第２５巻、４４２９〜４４４３ページに示されている。連結の左側が、３’−位置で置換基Ｐ＊として５員環に結合されるのに対して、右側は、先行するモノマーの５’位置に結合される。
「ＬＮＡ」または「ＬＮＡモノマー」（例えばＬＮＡヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオチド）またはＬＮＡオリゴマー（例えばオリゴヌクレオチドまたは核酸）は、少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含むヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を意味する。国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに開示される通りのＬＮＡモノマーは一般に、本発明のオリゴヌクレオチドに組み込むための、特に望ましい改変された核酸である。さらに、核酸は、当技術分野で知られた任意の改変のタイプによって、３’および／または５’末端で改変することができる。例えば、末端のうちのいずれかまたは両方を、保護基でキャップする、あるいは柔軟性のある連結基に付着させる、あるいは基体表面などへの付着を補助するための反応性の基に付着させることができる。望ましいＬＮＡモノマーおよびその合成方法はまた、米国特許第６，０４３，０６０号明細書、米国特許第６，２６８，４９０号明細書、国際公開第０１／０７４５５号パンフレット、国際公開第０１／００６４１号パンフレット、国際公開第９８／３９３５２号パンフレット、国際公開第００／５６７４６号パンフレット、国際公開第００／５６７４８号パンフレット、および国際公開第００／６６６０４号パンフレット、ならびに以下の刊行物に開示されている：モリタ（Ｍｏｒｉｔａ）ら、２００２年、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」１２（１）：７３〜７６；ハッカンソン（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ）ら、２００１年、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」１１（７）：９３５〜９３８；コシキン（Ｋｏｓｈｋｉｎ）ら、２００１年、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６６（２５）：８５０４〜８５１２；カヴァエルノ（Ｋｖａｅｒｎｏ）ら、２００１年、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６６（１６）：５４９８〜５５０３；ハッカンソン（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ）ら、２０００年、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６５（１７）：５１６１〜５１６６；カヴァエルノ（Ｋｖａｅｒｎｏ）ら、２０００年、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６５（１７）：５１６７〜５１７６；ファンドヘラー（Ｐｆｕｎｄｈｅｌｌｅｒ）ら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（９）：２０１７〜２０３０；およびクマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９９８年、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」８（１６）：２２１９〜２２２２。
好ましいＬＮＡモノマー（「オキシ−ＬＮＡ」とも呼ばれる）は、ＰＣＴ公開国際公開第０３／０２０７３９号パンフレットに開示される通りの二環式化合物を含むＬＮＡモノマーである。ただし、下の式（Ｉ）に示す通りのＲ４’とＲ２’の間の橋は、共に−ＣＨ２−Ｏ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を意味する。
「ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチド」または「ＬＮＡ置換オリゴヌクレオチド」は、以下に述べる、式（Ｉ）の少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドを意味する（改変の実例は、以下で述べる）：
Figure 2007532100
 ［式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｓ−、−（Ｎ（ＲＮ＊）−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｎ（ＲＮ＊）−、および−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）から選択される］。
Ｂは、上で示した通りの改変された塩基、例えば、任意に置換された炭素環式アリール（任意に置換されたピレンまたは任意に置換されたピレニルメチルグリセロールなど）、あるいは任意に置換されたヘテロ脂環式または任意に置換された複素環式芳香族化合物（任意に置換されたピリジルオキサゾール、任意に置換されたピロール、任意に置換されたジアゾール、または任意に置換されたトリアゾール部分など）；水素、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ１〜４−アルコキシ、任意に置換されたＣ１〜４−アルキル、任意に置換されたＣ１〜４−アシルオキシ、核酸塩基、ＤＮＡインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択される。
Ｐは、後続するモノマー、または５’末端基へのインターヌクレオシド連結、任意に置換基Ｒ５を含むこうしたインターヌクレオシド連結または５’末端基のためのラジカル位置を示す。置換基Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、およびＲ３＊のうちの１つは、先行するモノマー、または２’／３’末端基へのインターヌクレオシド連結を意味する基Ｐ＊である。Ｒ１＊、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６、Ｒ６＊、Ｒ７、Ｒ７＊、ＲＮの置換基、およびＰ＊を意味しないＲ２、Ｒ２＊、Ｒ３およびＲ３＊のうちの１つはそれぞれ、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）−Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｃ（Ｒａ）−Ｓ、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｒａ）−Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｑから選択される、１原子あたり約１〜８基／原子を含むビラジカルを意味する。ここで、Ｑは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂはそれぞれ、独立に、水素、任意に置換されたＣ１〜１２−アルキル、任意に置換されたＣ２〜１２−アルケニル、任意に置換されたＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロ−アリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノＣ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルフォノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択される。ここで、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは、共に任意に置換されたメチレン（＝ＣＨ２）を示すことができ、Ｒａ、Ｒｂから選択される２つの非ジェミナルまたはジェミナル置換基、ならびにＰ、Ｐ＊、またはビラジカル中に存在するが含まれない置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊、Ｒ７およびＲ７＊のうちのいずれかは、前に規定されたものと同じ種類のビラジカルから選択される関連するビラジカルを形成することができ；非ジェミナル置換基の対は、それによって、（ｉ）前記非ジェミナル置換基が結合する原子、および（ｉｉ）任意の介在原子との単環式または二環式実体を形成する。
Ｐ、Ｐ＊、またはビラジカル中に存在するが含まれない各々の置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊、Ｒ７およびＲ７＊は、独立に、水素、任意に置換されたＣ１〜１２−アルキル、任意に置換されたＣ２〜１２−アルケニル、任意に置換されたＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ−（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノＣ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルフォノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択される。ここで、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基は、共に、オキソ、チオキソ、イミノ、または任意に置換されたメチレンを示すことができる、あるいは、共に、１〜５個の炭素原子アルキレン鎖（これは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−（ＮＲＮ）−から選択される１つまたは複数のヘテロ原子／基によって任意に割り込まれるおよび／あるいは終結される）からなるスピロ・ビラジカルを形成することができ、ここで、ＲＮは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され、２つの隣接する（非ジェミナル）置換基は、二重結合をもたらすさらなる結合を示すことができ；ＲＮ＊は、ビラジカル中に存在するが含まれない場合、水素およびＣ１〜４−アルキル；およびそれらの塩基および酸付加塩から選択される。
例示的な５’、３’、および／または２’末端基には、−Ｈ、−ＯＨ、ハロ（例えば、クロロ、フルオロ、ヨードまたはブロモ）、任意に置換されたアリール、（例えば、フェニルまたはベンジル）、アルキル（例えば、メチルまたはエチル）、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アシル（例えば、アセチルまたはベンゾイル）、アロイル、アラルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオ、ヘテロアラルキルチオ、アミジノ、アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルケン、アルキン、保護基（例えば、シリル、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、またはトリチル（トリフェニルメチル））、リンカー（例えば、アミン、エチレングリコール、アントラキノンなどのキノンを含有するリンカー）、検出可能な標識（例えば、放射能標識または蛍光標識）、およびビオチンが含まれる。
核酸単位、核酸残基、ＬＮＡモノマー、または類似の用語に対する本明細書での言及は、個々のヌクレオシド単位とヌクレオチド単位、およびオリゴヌクレオチド内のヌクレオシド単位とヌクレオチド単位を含むものと理解されよう。
「改変された塩基」または他の類似の用語は、天然の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対になることができる、および／または天然に存在しない核酸塩基またはヌクレオシド塩基と対になることができる組成物（例えば、天然に存在しない核酸塩基またはヌクレオシド塩基）を指す。望ましくは、改変された塩基は、本明細書に記述する通りの、１５、１２、１０、８、６、４または２℃以下のＴｍ差を有する。例示的な改変された塩基は、欧州特許第１０７２６７９号明細書および国際公開第９７／１２８９６号パンフレットに述べられている。
用語「化学的な部分」は、分子の一部を指す。したがって、「化学的な部分によって改変される」は、通常でない化学構造の包含による標準の分子構造の改変を指す。前記構造の付着は、共有結合的であっても、非共有結合的であってもよい。
したがって、オリゴヌクレオチドプローブにおける用語「化学的な部分の包含」は、分子構造の付着を指す。こうした化学的な部分には、これらに限定されないが、非対称の（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）シアニン染料、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）、１−Ｏ−（１−ピレニルメチル）グリセロール、およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８からなる群から選択される、共有結合的および／または非共有結合的に結合された副溝バインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒｓ）（ＭＧＢ）および／またはインターカレーティング核酸（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＩＮＡ）が含まれる。他の化学的な部分には、改変された核酸塩基、ヌクレオシド塩基、またはＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドが含まれる。
用語「二重標識されたプローブ」は、２つの標識が付着されたオリゴヌクレオチドを指す。一態様では、片方の標識は、プローブ分子の５’末端に付着されるが、もう片方の標識は、分子の３’末端に付着される。本発明の特定の態様は、一端に付着される蛍光分子と、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）によってこのフルオロフォアを消光することが可能である、もう一端に付着される分子とを含有する。分子５’ヌクレアーゼアッセイプローブおよびある種の分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）は、二重標識されたプローブの例である。
「５’ヌクレアーゼアッセイプローブ」は、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって加水分解することができる二重標識されたプローブを指す。５’ヌクレアーゼアッセイプローブは、特定のＰＣＲアッセイで用いられる条件下では、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、必ずしも加水分解されるというわけではない。名前「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、観察される加水分解の程度に関係なく使用され、実験者の意向によるいかなる予想も示さない。用語「５’ヌクレアーゼアッセイプローブ」および「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、単に、プローブの加水分解を回避するための特定の注意を払わないアッセイを指すに過ぎない。「５’ヌクレアーゼアッセイプローブ」は、「ＴａｑＭａｎアッセイプローブ」と、また、「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、「ＴａｑＭａｎアッセイ」と、しばしば呼ばれる。これらの名前は、本出願において同義的に使用される。
「オリゴヌクレオチド類似体」は、特定の標的ヌクレオチド配列を認識することができる核酸結合分子を指す。特定のオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドの糖リン酸主鎖が、タンパク質様主鎖によって置き換えられたペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡでは、核酸塩基は、キメラの擬ペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）−核酸構造を生じる荷電してないポリアミド主鎖に付着され、これは、核酸の形と同形である。
「分子ビーコン」は、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によっておそらく影響を受けないであろう、単一または二重標識されたプローブを指す。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による標識または成分ヌクレオチドの分離を回避するために、プローブ、ポリメラーゼ、またはアッセイ条件に対する特別な改変が行われている。したがって、検出原理は、その標的配列への分子ビーコンの結合の際の、標識によって誘発されるシグナルの検出可能な差に依存する。本発明の一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、選択されるアッセイ温度で、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端で相補的な配列によって仲介される、分子内ヘアピン構造を形成する。オリゴヌクレオチドは、一端に付着された蛍光分子と、ヘアピン構造において互いに近付けられた場合にフルオロフォアを消光することが可能である、もう一端に付着された分子を有することができる。本発明の別の態様では、ヘアピン構造は、プローブ配列の末端の相補的な構造に基づいて形成されず、むしろ、結合時の検出されたシグナル変化は、形成された二本鎖構造との標識の一方または両方の間の相互作用に、あるいは、結合後の標識間の相互作用の低下に、あるいは、結合時のプローブの空間的配置の通常の変化に起因する可能性がある。分子ビーコンのある特定の態様は、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による加水分解を阻害するために、いくつかのＬＮＡ残基を含有する。
「高親和性のヌクレオチド類似体」は、少なくとも１つのこうした高親和性のヌクレオチド類似体で置換された場合、その相補的な認識配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの「結合親和性」を増大させる、天然に存在しないヌクレオチド類似体を指す。
本明細書では、同じ配列を含むが、安定化ヌクレオチドを含まないプローブと比較した場合に認識配列に対する「結合親和性」が増大したプローブは、プローブ認識セグメントの結合定数（Ｋａ）が、二本鎖分子の相補的な鎖の結合定数よりも高いプローブを指す。別の好ましい実施形態では、プローブ認識セグメントの結合定数は、二本鎖分子中の標的配列における認識配列の相補的な鎖の解離定数（Ｋｄ）よりも高い。
モノマーは、ワトソン−クリック塩基対合則（例えばＣとＧ、ＴとＡ、またはＵとＡ）に従って水素結合、または他の水素結合モチーフ（例えば、Ｔとジアミノプリン、Ｇと５−メチルＣ、Ａと２−チオチミジン、Ｃとイノシン、Ｇと擬イソシトシンなど）を形成することができる核酸塩基を含有する場合、「相補的である」と呼ばれる。
用語「後続するモノマー」は、５’末端方向において隣接するモノマーに関し、「先行するモノマー」は、３’末端方向において隣接するモノマーに関する。
用語「標的核酸」または「標的リボ核酸」は、単一の特定の配列のいかなる関連する核酸（例えば、患者、動物（ヒトまたはヒト以外の動物）、植物、細菌、真菌、古細菌、細胞、組織、生物などから得られる生物的核酸）も指す。例えば、標的リボ核酸または核酸が、細菌、古細菌、植物、ヒト以外の動物、細胞、真菌、またはヒト以外の生物から得られる場合、この方法は、標的核酸の検出に基づいて、所望により、細菌、古細菌、植物、ヒト以外の動物、細胞、真菌、またはヒト以外の生物を選択することをさらに含む。一実施形態では、標的核酸は、患者、例えばヒト患者から得られる。この実施形態では、本発明は、標的核酸の検出に基づいて、治療を選択すること、疾患を診断すること、または疾患に対する遺伝的素因を診断することを所望によりさらに含む。
「標的配列」は、いかなる標的核酸内の特定の核酸配列も指す。
用語「厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件」は、本明細書では、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度（Ｔｍ）より５℃下）から、Ｔｍより約２０℃から２５℃下までの範囲内で生じる「厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」である。当業者には公知であるように、ハイブリダイゼーションの厳密性は、同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変化させることができる。ハイブリダイゼーション技法は一般に、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ヘイムス．Ｂ．Ｄ．（Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．）およびヒギンズ，Ｓ．Ｊ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．）編、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８５年；ゴール（Ｇａｌｌ）およびパルデュー（Ｐａｒｄｕｅ）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ」６３：３７８〜３８３、１９６９年；およびジョン（Ｊｏｈｎ）ら、１９６９年、「Ｎａｔｕｒｅ」２２３：５８２〜５８７に述べられている。
本発明はまた、天然または合成の核酸の、単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのキットを提供する。ただしこのキットは、本明細書で定義する通りの反応体および１つまたは複数のＬＮＡ改変オリゴヌクレオチド（オリゴマー）を含む。ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドは、好ましくは前記反応体上に固定される。
本発明によるキットについて、反応体は、例えば、ホウケイ酸ガラス、ソーダ石灰ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリジノン、ポリメチルメタクリレート、およびポリ塩化ビニルから選択される固体支持体材料、好ましくはポリスチレンおよびポリカーボネートであることが好ましい。反応体は、標本管、バイアル、スライド、シート、フィルム、ビーズ、ペレット、ディスク、プレート、リング、ロッド、ネット、フィルター、トレイ、マイクロタイタープレート、スティック、またはマルチブレード（ｍｕｌｔｉ−ｂｌａｄｅｄ）スティックの形であり得る。
キットを使用するための最適な条件が書かれた説明書のシートが、一般的にキットに添付される。
発明の詳細な説明
本発明は、オリゴヌクレオチドが、複数のヌクレオシド類似体を含有することを特徴とする、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡの単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。
より詳細には、本発明は、高い感受性および優れた選択性を有する、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡの検出および定量化のための方法を提供する。本発明によれば、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡの定量化は、１００ｐＭから１０ｆＭまたはそれ以下（１０ａＭ）のＲＮＡ標的濃度に相当するサンプルにおいて、ＲＮＡ標的１０ｆｍｏｌから１０ａｍｏｌまたはそれ以下のレベル（１０ｚｍｏｌ）で検出可能である。
好ましい実施形態では、本発明は、図１および図９に示す通りの次のステップを含む。
１）２つのタギングプローブは、それぞれ、１０〜１２ｎｔの標的配列（例えば、成熟したｍｉＲＮＡ）と相補的な高親和性のヌクレオチド配列と、標的配列に対して、あるいは互いにいかなる相補性も含まないアンカーＤＮＡ配列からなるように設計および合成される。２つの認識エレメント含有タギングプローブは、溶液中の複雑な核酸サンプル中の標的配列と組み合わせると、厳密な条件下でハイブリダイズされ、それによって、２つのタギングプローブが、標的によって規定される位に近づけられ、ここで、片方のタギングプローブの５’末端は、もう片方のタギングプローブの３’末端と隣接する。
２）プローブの１つの５’末端がリン酸化されると、標的特異的なタギングプローブは、鋳型としてＤＮＡリガーゼおよび標的配列（例えばｍｉＲＮＡ）を使用して、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって連結される。連結反応は、熱安定なリガーゼを使用して、高い温度で実施することができしたがって、鋳型分子のコピー数を増大させるために、ＰＣＲによるその後の増幅のためのサイクルにかけることができる。
３）高い親和性のタギングプローブの、標的配列を鋳型にする連結の後、連結されたプローブ分子は、アンプリコンへの結合を可能にするための十分な二本鎖安定性をもつ短い検出プローブを使用する定量リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用され、均質なアッセイにおいて使用される様々な検出原理のいずれかを用いる。
さらなる本発明の好ましい実施形態では、検出および定量化は、図２７に示されるステップを含む。
ａ）標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させること、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、捕捉プローブにおけるアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
ｃ）固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化し、そのあとに固体支持体から標的配列を解放すること、
ｄ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成すること、
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
ｆ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、検出および定量化は、図２８に示されるステップを含む。
ａ）標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させること、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、捕捉プローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
ｃ）固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化すること、
ｄ）逆転写酵素と、プライマーとしての捕捉プローブとを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成すること、
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
ｆ）ＤＮＡポリメラーゼおよび一対のプライマーを使用して、標的配列を鋳型にするＰＣＲ増幅を続けること、
ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること。
固定化された捕捉プローブ法の１つの利点は、非タンパク質コードＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡなど）に対する全ＲＮＡサンプルの初期富化が必要でないことである。好ましくは、捕捉プローブを、溶液中の特異的な標的とハイブリダイズさせることとなる。第２に、捕捉プローブが固体支持体上に固定される場合、結合していない材料を除去することができ、それによって、特異的な標的の富化が成し遂げられる。
別のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、図１１に示す通りの次のステップを含む。
１）２つのタギングプローブ、すなわちＲＴタギングプローブおよび第２鎖タギングプローブは、それぞれが、標的リボ核酸配列（例えば成熟したｍｉＲＮＡ）の６〜１２ｎｔに相当するヌクレオチド認識配列、ならびに、標的配列と、あるいは互いに、いかなる相補性も持たないアンカー配列からなるように設計および合成される。ＲＴタギングプローブ、またはＲＴプローブと第２鎖プローブの両方の認識配列は、高親和性のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ）によって改変される。ＲＴタギングプローブ内の認識配列は、標的リボ核酸配列内の配列と、例えば、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端と、あるいは、標的リボ核酸配列における、ＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型または点突然変異の３’に位置する配列と相補的である。ＲＴタギングプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、複雑な核酸サンプル中の標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズし、逆転写酵素を使用する、標的ＲＮＡ配列と相補的なアンカー付けされたプライマー伸長産物を産生するための、逆転写反応におけるアンカー付けされたプライマーとして使用される。
２）第２鎖タギングプローブは、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と、あるいは、元のリボ核酸標的配列内のＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異に対する５’に位置する配列と相補的である認識配列を含む。第２鎖タギングプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＲＴ反応生成物とハイブリダイズし、その後、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば耐熱性のＤＮＡポリメラーゼによって、プライマー伸長産物と相補的である第２鎖を産生するためのアンカー付けされたプライマーとして使用される。反応の特異性は、それぞれ、標的ＲＮＡおよび相補的なＤＮＡ配列の相補的な３’末端および５’末端領域とハイブリダイズする、オーバーラップしない認識配列をもつアンカー付けされたＲＴおよび第２鎖タギングプローブの連続的な使用に基づく。タギングプローブに付着されるアンカー配列は、本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーション条件下で、特定のトランスクリプトーム内の任意の標的核酸に、あるいは互いに交差ハイブリダイズしないように設計される。アンカー配列は、その後のリアルタイム定量ＰＣＲにおけるＰＣＲプライマーのためのプライミング部位として、あるいは、捕捉アッセイのためのタグとして機能する。認識配列中に、本発明の新規の成分である高親和性のヌクレオチド類似体を使用することにより、逆転写反応ならびに第２鎖反応は、耐熱性の逆転写酵素および耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して、高い温度で実施することができ、それによって、ＰＣＲによるその後の増幅のための鋳型分子の産生における特異性が増大する。本発明の別の新規の成分は、例えばＬＮＡによって改変された前記の高親和性の認識配列を、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによってプライマーとして使用することができる、またさらに、こうした前記高親和性の認識配列を、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な鎖を合成するための鋳型として使用することができるという発見である。
３）標的ＲＮＡ配列特異的逆転写および第２鎖合成反応の後、二本鎖分子を、アンプリコンへの結合を可能にする、十分な二本鎖安定性をもつ短い検出プローブを使用する、定量リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用し、均質なアッセイに使用される様々な検出原理のうちのいずれかを使用する。
結合の検出は、標的に結合させた後の１つまたは複数の標識の特性における測定可能な変化（例えばステム構造の有無にかかわらない分子ビーコンタイプのアッセイ）による直接的な、あるいは、結合後のその後の反応、例えば５’ヌクレアーゼアッセイにおけるＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による切断による間接的なものである。検出プローブは、本発明のさらに別の新規の成分である。これは、その配列が、中心セグメントにおける標的配列に相当する短い増幅されたＤＮＡ分子の特異的な検出を可能にするように選択された、短いオリゴヌクレオチド部分、およびＰＣＲプライマーのためのアニーリング部位として使用されるアンカー付けされた配列を含む。
標的配列（例えば異なる成熟したｍｉＲＮＡ標的分子）を検出するために設計される新規の短い検出プローブは、非常に短い８〜１２−ｍｅｒのＬＮＡ−ＤＮＡキメラミックス−ｍｅｒプローブが、リアルタイムＰＣＲベースのアッセイと適合性があるという発見によって可能になる。本発明の一態様では、改変されたあるいは核酸塩基の類似体、ヌクレオシド塩基またはヌクレオチドは、ひょっとすると副溝バインダーおよび他の改変物（すべて、最も短い可能性のあるプローブ配列を使用して、標的分子とハイブリダイズして検出できるように、プローブおよび標的分子との間に形成される二本鎖を安定化することが意図されたもの）と共に、タギングプローブならびに検出プローブに組み込まれる。本発明の好ましい態様では、改変は、標準のリアルタイムＰＣＲアッセイ条件下で検出可能な形成された二本鎖の十分な安定性を維持しながら、検出プローブの長さを８または９または１０または１１または１２から１４ヌクレオチドに減少させるための、ＬＮＡ残基の組み込みである。本発明の別の好ましい態様では、連結反応のための一方または両方のタギングプローブ内の標的認識配列、または、ＲＴタギングプローブ内の認識配列、または、ＲＴタギングプローブとＲＴ−ＰＣＲ反応のための第２の鎖タギングプローブの両方における認識配列は、すべての第２、すべての第３、またはすべての第４ヌクレオチド位置で、ＬＮＡモノマーで置換され、両方のプローブの３’末端の少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチドが、それぞれ、ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドプローブの増大された二本鎖安定性によって、高い温度でも、その相補的な標的分子、特に標的ＲＮＡ分子への非常に特異的かつ感受性が高いハイブリダイゼーションができるようになる。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、検出および定量化は、図２２に示されるステップを含む。
ａ）標的リボ核酸配列を、認識ヌクレオチド配列が、標的配列内の配列と相補的である請求項１から３に記載のオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用し、タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
ｃ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用し、逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成すること、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブを使用する第２鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること。
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、図２９に示す通りのステップを含む。
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、図３０に示す通りのステップを含む。
さらなる実施形態は、成熟したｍｉＲＮＡ転写産物の長さを上回る鋳型へのＲＴ−プライマーの結合を防止するための「ブロッカープローブ」を含有するＬＮＡの使用を含む。ブロッカープローブは、成熟したｍｉＲＮＡ配列の３’領域と隣接する前駆体（ｐｒｉ／ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）ｍｉＲＮＡ配列内の非成熟ｍｉＲＮＡ領域に、相補的な配列を結合させるように設計される。ブロッカープローブは、さらに、成熟した配列と部分的にオーバーラップし、したがって、ＲＴ−プライマー（実施例１２〜１６に記載される通り、また、図１１、ステップ１に図示する通り）の前駆（ｐｒｉ／ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）配列への結合を防止し、ＲＴタギングプローブが、成熟したｍｉＲＮＡ配列のみにアニーリングすることが可能になるように設計される。反応ステップは、図３３、ステップＩおよび図２２．２〜２２．４に表される。
（Ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ配列（図２９）に類似の）成熟したｍｉＲＮＡ配列を用いる別の実施形態では、ある種の長さ（すなわち、未成熟（ｐｒｉ−ａｎｄ ｐｒｅ−ｍａｔｕｒｅ）ｍｉＲＮＡの長さなど）を超える鋳型への結合が妨げられるように設計されたＲＴ−プライマーを利用して検出される。ブロックは、例えば、大きな分子構造をＲＴ−プライマーに組み込むことによって、あるいは、プライマーに、成熟したｍｉＲＮＡの長さを上回る鋳型へのプライマーの結合を防止するように配置される二本鎖構造を導入するための短いＬＮＡ含有プローブ（ブロッカープローブ）をアニーリングすることによって達成される。ブロックプライマー設計では、成熟したｍｉＲＮＡ配列のみがアニーリングできるようになるのに対し、より長い鋳型はアニーリングしない。反応ステップは、図２９に示される。
別の実施形態では、前述の実施形態からのＲＴ−プライマーはまた、この反応におけるＰＣＲプライマーのうちの１つを含む。所望により、他のＰＣＲプライマーはまた、ある長さを上回る鋳型への結合が妨げられるように設計することができる。反応ステップは、図２９ｂに示される。
別の実施形態は、人工のオリゴヌクレオチド鋳型の反応物への添加を用いる。ｍｉＲＮＡが、（Ｈｓａ ｍｉＲ−１４３配列 図３０に類似の）前駆体分子の遠い３’末端から発現される場合、成熟した、また、前駆体のｍｉＲＮＡ鋳型は、ポリメラーゼ（例えばＫｌｅｎｏｗフラグメント）による伸張に適した３’末端を含有する。図３１に図示するように、ＲＴ−プライマーを用いることによって、これは、ＲＮＡ指向性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）によってその後伸長し、得られた鋳型は、成熟したまたは前駆体のｍｉＲＮＡ転写産物が、鋳型として働くかどうかによって、長さが異なることとなる。実施例１２〜１６で述べる、また、図１１のステップ２に示されるような第２鎖タギングプローブは、成熟したｍｉＲＮＡに由来するＲＴ転写産物の伸張のみが可能になるように、図３１に示される３’でブロックされた人工オリゴヌクレオチド鋳型によって交換されている。３’でブロックされた人工オリゴヌクレオチドは、その後、鋳型として使用され、ＰＣＲによるその後の増幅のためのプライマー部位を生じる。
ｍｉＲＮＡが、（Ｈｓａ ｍｉＲ−１４３配列 図３０に類似の）前駆体分子の遠い３’末端から発現される別の実施形態では、成熟したｍｉＲＮＡは、逆転写されたｍｉＲＮＡの３’末端（成熟したｍｉＲＮＡの本来の５’末端）とハイブリダイズするＰＣＲプライマーを利用して検出され、ある種の長さ（すなわち、逆転写された前駆体ｍｉＲＮＡの長さなど）を上回る鋳型への結合が妨げられるように設計される。このブロックは、例えば大きな分子構造を、このＰＣＲプライマー−例えばループプライマー−に組み込み、アンカー配列を保ち、選択されたアッセイ温度で、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端で相補的な配列によって仲介される、分子内ヘアピン構造を形成する、あるいは、成熟したｍｉＲＮＡの長さを上回る鋳型へのプライマーの結合を防止するために配置される短いＬＮＡ含有プローブ（ブロッカープローブ）を、プライマーにアニーリングさせて、二本鎖構造を導入することによって達成される。プライマーは、成熟した加工されたｍｉＲＮＡ配列のみがアニーリングでき、より長い鋳型は、アニーリングしないように、特異的に設計されている。反応ステップは、図３４に示される。
細胞では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子は、成熟したｍｉＲＮＡ（１７〜２５のヌクレオチド）の活性な形だけでなく、より長い（７０ヌクレオチド超の）前駆体分子として生じる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子の検出における１つの課題は、１７〜２５ｂｐ長の一本鎖ＲＮＡ分子である、成熟した形の分子のみを検出することである。
本発明の好ましい実施形態では、成熟したｍｉＲＮＡは、プライマーとして機能する、すなわち、ｍｉＲＮＡは、鋳型とハイブリダイズし、ＲＮＡ−プライムド（ｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡ指向性のＤＮＡ合成が可能な酵素で伸長される。第２に、検出は、この伸張の発生に依存し、さらに、伸張の発生は、プロセシングされた成熟したｍｉＲＮＡ分子のみの検出を確実にするために使用される鋳型へのアニーリング部位からの予測される距離で利用できる、ｍｉＲＮＡの３’末端の−ＯＨ末端を有することに依存する。検出反応においてプライマーとして標的（この場合はｍｉＲＮＡ）を使用する原理は、他の標的（ＤＮＡとＲＮＡの両方）を使用する、他の検出形式にも適用することができる。
本発明の一般的な態様
多くの非コードＲＮＡ分子（ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子など）は、非常に短く、両方の逆転写酵素、ＰＣＲによる増幅、および、ＰＣＲによる増幅と検出のため所望により標識された検出プローブのためのプライマーの配置を収容しない。これを収容するための１つの解決法は、本発明によれば、好ましくは、成熟特異的なアッセイの設計を可能にする方法によって、ｍｉｃｒｏＲＮＡにさらなる配列を追加することである。
記述する通り（実施例を参照のこと）、ｍｉｃｒｏＲＮＡに、（配列特異的なハイブリダイゼーションによって）ポリメラーゼ−反応のための鋳型を提供することによって、また、伸張を可能にするためにポリメラーゼ（例えばＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ）およびヌクレオチドを提供し、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡに、提供された鋳型と部分的に類似した配列を追加させることによって、こうした配列を付加することができる。こうした付加された配列は、単独で、あるいはｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列と組み合わせて、逆転写酵素のための、ＰＣＲ増幅のための、あるいは標識された検出プローブのためのプライマーを、部分的に収容することができる。
追加の配列を付加する別の手段は、連結反応という手段であり得る。こうした反応では、アダプター核酸配列を、ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子の３’末端、５’末端、あるいはその両方の末端に、連結反応によって付着させることができる。成熟した標的ＲＮＡ配列の末端部分に特異的なヌクレオチド配列と、前記アダプター分子の末端部分に特異的なヌクレオチド配列とを含む「橋かけ」核酸配列を提供し、成熟したＲＮＡ標的および前記アダプター分子が、配列特異的なハイブリダイゼーションの際に互いにごく近接する場所にあるようにすることによって、こうした連結反応を補助することができる。連結によって付加されるこうした配列は、単独で、あるいはｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列と組み合わせて、逆転写酵素のための、ＰＣＲ増幅のための、あるいは標識された検出プローブのためのプライマーを、部分的に収容することができる。
小さいＲＮＡ標的分子に追加の配列を追加するさらに別の手段は、鋳型に依存しないポリメラーゼ反応という手段であり得る。こうした一実施形態では、小さい標的ＲＮＡ分子のサンプルを、ポリメラーゼ反応にかけ、サンプル中に存在するすべてのｍｉｃｒｏＲＮＡにｐｏｌｙＡテールを提供する。これは、例えば、ｐｏｌｙＡポリメラーゼを用いて実施できる可能性がある。別のこうした実施形態では、小さい標的ＲＮＡ分子のサンプルは、サンプル中に存在するすべてのｍｉｃｒｏＲＮＡに、（それぞれ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰｓが加えられた場合）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴポリヌクレオチドテールを提供することができる、ターミナルトランスフェラーゼ酵素反応にかけられる。類似のヌクレオチドのヌクレオチドテールを伴って提供されるこうしたｍｉｃｒｏＲＮＡサンプルは、逆転写酵素反応において、相補的な類似のヌクレオチドを含むプライマーを使用してｃＤＮＡに転換することができる。したがって、類似のヌクレオチドのポリヌクレオチドテールが付加されたｍｉｃｒｏＲＮＡのｃＤＮＡサンプルが提供される。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列のオーバーラップ部分によって、ＲＴ−プライマーはまた、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡのグループまたはファミリーに対して特異的であることができる。こうしたｃＤＮＡサンプルは、その後、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ配列内に包含される、あるいは、鋳型に依存しないポリメラーゼ反応によって追加された配列と部分的にオーバーラップする、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に特異的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅反応のための鋳型として働くことができる。
こうした実施例は、図３７に示され、そこでは、全ＲＮＡサンプルまたは２００ヌクレオチド未満のサイズのＲＮＡのみを含有しているＲＮＡサンプル画分を、ｐｏｌｙＡポリメラーゼにかけ、すべてのｍｉｃｒｏＲＮＡ標的分子にｐｏｌｙＡヌクレオチドテールを付加する。その後、逆転写酵素反応において、ｐｏｌｙＴプライマーを、プライマーとして使用し、ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡに転換する。前記ＲＴ反応には、ＲＴ−プライマー配列を、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｍｉｃｒｏＲＮＡの基またはファミリーに特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ配列と部分的にオーバーラップさせることによって、配列特異性をさらに与えることができる。その後、前記ｃＤＮＡサンプルを、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的に対して特異的なＰＣＲプライマー、および所望により標識された検出プローブを使用するＰＣＲ増幅にかける。こうしたＰＣＲプライマーは、付加された配列と、ある程度全体的に、あるいは部分的にオーバーラップさせることができる。
したがって、本発明の広い態様は、最高でも１００ヌクレオチドの長さである短い長さのＲＮＡ（これは、本明細書で述べられる低分子ＲＮＡタイプのうちのいずれかであり得る）の定量的測定のための方法であって
ａ）前記の短い長さのＲＮＡを含むサンプルから、１）前記の短い長さのＲＮＡの配列からなる一本鎖標的配列、その相当するＤＮＡ配列、または前記の短い長さのＲＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列、および２）５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、
ｂ）逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの鎖を得ること、および
ｃ） 鋳型として前記ｃＤＮＡおよび所望により鋳型ポリヌクレオチドを含む定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施すること
を含む方法に関する。
本発明のこの態様は、本発明の根底にある概念を反映する、すなわち、ａからｃのすべてのステップによって、比較的高い程度の特異性が確実になり、各ステップにおける特異性が、この方法の通常の特異性に加わることによって、短い長さのＲＮＡの特異的な検出を達成することができる。１つの主要な特性は、ステップａにおける鋳型ポリヌクレオチドの提供である。ただし、前記鋳型は、その後のステップでプライマーのための「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」として働くことができる付加された配列を含み、したがって、必要なすべてのプライマーのための、また、使用される検出プローブのための空間が提供される。本明細書の説明から明らかとなるであろう通り、これらの「ハンドル」は、定量化することが望まれる短い長さのＲＮＡに対して特異的でも非特異的でもあり得る−特異的な配列の場合、これらは、反応中に付加され、短い長さのＲＮＡに、優先的または特異的に、配列を付加することとなるが、短い長さのＲＮＡを含む配列には付加されない。
本発明の状況では、用語「相当する」を使用する場合、基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、基準配列と同一である、あるいは、基準ヌクレオチド配列と相補的な配列とストリンジェントにハイブリダイズする配列を構成していることを意味する。一般的に、これは、ＤＮＡ配列に対して相補的な配列が、問題となるＲＮＡ配列に転写される可能性がある場合、ＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列に相当することができることを意味する。
この文脈における用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型ポリヌクレオチドの逆転写によって、あるいは、鋳型ヌクレオチドに基づくヌクレオチド重合（ＤＮＡ重合など）によって得られるＤＮＡ断片を意味する。
短い長さのＲＮＡは、前述の通り、最高でも１００ヌクレオチドであるが、かなり短いＲＮＡも、この方法によって測定することができる。最高でも９０、最高でも８０、最高でも７０、最高でも６０、最高でも５０、最高でも４０、最高でも３０、および最高でも２５ヌクレオチド残基の長さであるＲＮＡは、本発明の方法およびキットによって、好都合に測定することができるが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５ヌクレオチド残基を有するより短いＲＮＡでさえ測定することができる。好ましくは、短い長さのＲＮＡは、１６ヌクレオチド残基と２５ヌクレオチド残基との間の長さを有する。
ステップｃにおけるｑＰＣＲのために使用されるプライマーは、一実施形態では、以下から選択される：
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、５’または３’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である−特に、両方のプライマーが隣接する配列に関連する場合に、ステップａおよびｂにおいて、（短い長さのＲＮＡまたはそこから得られる配列に）配列特異的な、５’および／または３’配列の付加の存在、および／またはステップｂが、短い長さのＲＮＡに対して特異的な手法を利用することから利益を得る実施形態、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分によって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の近接する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である−短い長さのＲＮＡ（またはそこから得られる配列）の部分の特異的な認識に起因する、比較的高い程度の特異性が、ステップｃにおいて存在し、５’または３’ヌクレオチド配列が、配列特異的な手法に基づいて付加されることが好都合である可能性がある、および／またはステップｂが、短い長さのＲＮＡに対して特異的な手法を利用する実施形態、および
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、１つは、一本鎖標的配列内の第１のヌクレオチド配列に相当し、もう１つは、一本鎖標的配列内の第２のヌクレオチド配列と相補的である−短い長さのＲＮＡ（またはそこから得られる配列）の特異的な認識に起因する、高い程度の特異性が、ステップｃにおいて存在する実施形態。
ｑＰＣＲのために使用される前記プライマーは、それぞれ独立に、検出可能な標識を含みうる。
別の実施形態では、ステップ（ｂ）における反応は、一本鎖標的配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、あるいは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の近接する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である逆転写プライマーまたはＤＮＡ重合プライマーを利用する。逆転写プライマーまたはヌクレオチド重合プライマーが、少なくとも１つの短い長さのＲＮＡに対して特異的であることが好ましく、これは、多くの短い長さのＲＮＡが、高度な配列同一性を有するある種のファミリーに属するという事実を反映する。
付加された５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、ある実施形態では、同一のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである（配列を付加するためのターミナルトランスフェラーゼ酵素を利用することによって、あるいは、同一のヌクレオチド残基を加えるポリメラーゼを利用することによって達成することができる効果）。
いずれにせよ、一本鎖標的配列と５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、共有結合的に連結させることもできるし、非共有結合的に連結させることもできる−重要な問題は、鋳型配列を、ステップｂにおける逆転写またはヌクレオチド重合にかけることができるかどうかということである。
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、ある実施形態では、検出可能な標識を含み、それによって、その後の検出が容易になる。
多くの実施形態では、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、酵素的反応によって一本鎖標的配列に連結されるが、非酵素的な反応も想定される。
同一のヌクレオチドを加えるための有用な酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素命名法を使用して以下に提供される：
トランスフェラーゼ：ＥＣ ２．７．７．１９（ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）、ＥＣ ２．７．７．５２（ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼ）、およびＥＣ ２．７．７．３１（ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ）。
リガーゼ：ＥＣ ６．５．１．１（ＤＮＡリガーゼ（ＡＴＰ））、ＥＣ ６．５．１．２（ＤＮＡリガーゼ（ＮＡＤ＋））、およびＥＣ ６．５．１．３（ＲＮＡリガーゼ（ＡＴＰ））。
ある種の実施形態では、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、サンプルＲＮＡが得られる生物中に天然には生じない。これによって、サンプル中の関連性のない配列が検出されるリスクが低下すると考えられている。５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、非哺乳類のものであることが好ましい。
他の実施形態では、ステップ（ａ）は、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列の短い長さのＲＮＡへの連結による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、あるいは、ステップ（ａ）は、５’および／または３’隣接するヌクレオチド配列を、ターミナルトランスフェラーゼ反応で、好ましくはポリ−Ａトランスフェラーゼ反応で、短い長さＲＮＡに連結することによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む。連結は、配列特異的（例えばオーバーハングライゲーション）と平滑末端ライゲーションのどちらであってもよいが、オーバーハングライゲーションを利用することが好ましい。オーバーハングライゲーションの好ましい形態では、この方法は、小さいＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端に直接隣接する５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端を、オーバーハングライゲーションを可能にするように配置するために、５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端に部分的に相補的であり、かつ短い長さのＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端に部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドを、短い長さのＲＮＡにアニーリングすること含む。
連結またはターミナルトランスフェラーゼを使用することの１つの主要な利点は、サンプル中のすべてのＲＮＡが、その後のステップ（これは、その後、一方では、非常に特異的であるべきである）のために有用になる可能性があることである。これにより、例えば、ｂおよびｃにおける、より特異的なステップのために後で使用することができる、非特異的ｃＤＮＡライブラリの作成が可能になる。
一般的に、連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応は、標的配列の３’末端で実施されるだけであるが、連結反応の前に標的配列の５’末端をリン酸化することによって、標的配列の５’末端への連結も実施することができる。いずれにせよ、隣接するヌクレオチド配列の「自己連結」を回避するために、末端の片方をブロックすることが好ましい（リガーゼが、連結される分子内の３’−ヒドロキシルおよび５’−リン酸を必要とするので、これは、当業者にとっては、かなり簡単な作業である）。したがって、連結の前に、５’隣接ヌクレオチド配列は、その５’末端でブロックされ、３’隣接ヌクレオチド配列は、その３’末端でブロックされ、また、これらの２つのヌクレオチド配列は通常、別々のステップで加えられるので、それらが自己連結することは回避される。
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、規定されたプロセッシング状態の、ステップ（ａ）における前記の短い長さのＲＮＡと優先的または独占的に連結する。これは、隣接するヌクレオチド配列を付加するための手段が、短い長さのＲＮＡ内の遊離の３’または５’末端の存在にに依存する配列結合ステップ（それによって、識別が、例えば、同じ配列を含むが、関連する末端内ではない未成熟ＲＮＡにわたって導入される）を利用することを意味することになる。前記ＲＮＡの規定されたプロセッシング状態は、成熟した状態であることが好ましい。
多くの実施形態におけるステップ（ｂ）は、ｃＤＮＡを得るための、鋳型ポリヌクレオチドの逆転写を含む（例えば図２７を参照のこと）。しかし、上で述べたように、ステップｂはまた、ｃＤＮＡを得るために、ステップｂにおけるヌクレオチド重合を含むこともできる（例えば図３１の実施形態を参照のこと）。
連結またはターミナルトランスフェラーゼを利用する代わりに、ステップ（ａ）は、隣接するヌクレオチド配列を付着するために、ヌクレオチド重合のステップを含むことができる。この目的のために使用されるポリメラーゼは、鋳型に依存しないポリメラーゼであっても、鋳型に依存するポリメラーゼであってもよい。一般的に用いられるポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。
たとえ好ましい実施形態が、鋳型特異的である重合を利用しても、重合は、標的配列の３’末端へのポリ−Ａ、ポリ−Ｇ、ポリ−Ｔ、またはポリ−Ｃテールの付加にある可能性がある。
しかし、前述の通り、現在好ましい実施形態は、鋳型特異的な手法の使用を伴う。ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出の場合、本発明の一目的は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡと未成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡを区別することを可能にすることであり、この状況では、２つの異なる状態：すなわち、ｍｉｃｒｏＲＮＡがその成熟前の前駆体の３’末端に位置する状態、およびｍｉｃｒｏＲＮＡが成熟前の前駆体の５’末端に位置する状態に注目することが重要である。これらの前駆体の各々から成熟形態を識別するために、様々な手法が使用されている。
以下の実施形態は、この識別を達成するための様々な方法に対処するが、これらの実施形態は、いかなる短い長さのＲＮＡを定量化または検出する場合にも有用であるので、いかなる形であれｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化に限定されない。
一実施形態（図２７を参照）は、ステップ（ａ）が、以下のステップによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含むことを伴う：
− オリゴヌクレオチド捕捉プローブ（その５’末端は、短い長さのＲＮＡの３’末端と相補的である）に、短い長さのＲＮＡの３’末端をアニーリングするステップと、
− 鋳型ポリヌクレオチドを構成する、伸長された短い長さのＲＮＡ分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのＲＮＡを伸長するステップ。一般的に、ヌクレオチド重合は、鋳型ポリヌクレオチドを構成するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを得るために、ＤＮＡ重合を含む。
この実施形態では、ステップ（ｂ）は、所望により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブにアニーリングしていない材料の除去の後、ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を逆転写させることを含むことが好ましい（捕捉プローブが固定化を可能にするタグを含む場合に達成することができる）。逆転写では、使用されるプライマーは、オリゴヌクレオチド捕捉プローブそれ自体であってもよいし、あるいは、別の逆転写プライマーであってもよい（捕捉プローブが固定化されることができる場合には、しばしばこうである−その場合、二本鎖は変性され、鋳型は別の容器に移され、そこで新規のプライマーおよび他の試薬が加えられる）。
別の実施形態（図３１参照）は、ステップ（ａ）が、以下のステップによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含むことを伴う：
− オリゴヌクレオチド捕捉プローブ（その３’末端は、短い長さのＲＮＡの５’と相補的であり、その５’末端は、５’隣接ヌクレオチド配列を含む）に、短い長さのＲＮＡの５’末端をアニーリングするステップと、
− 鋳型ポリヌクレオチドを構成する、伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのＲＮＡを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップ。この場合、鋳型ポリヌクレオチドは、本来の短い長さのＲＮＡをいずれも含まない。
この実施形態は、ステップ（ｂ）が、短い長さのＲＮＡが、伸長された捕捉プローブから、（例えば温度を上昇させることによって）除去され、捕捉プローブが、３’隣接ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに、その３’末端でアニーリング可能にされ、捕捉プローブが、ｃＤＮＡを得るために、鋳型としてヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ重合によって、５’→３’方向にさらに伸長されることを含むことを伴う。したがって、この実施形態では、５’および３’隣接ヌクレオチド配列が付加される（両方とも、標的配列特異的な手法によって加えられる）。
上で述べた通り、捕捉オリゴヌクレオチドが、固体支持体上への固定化を可能にする部分を含有する場合、これらの実施形態は両方とも、利益を与えることができる。そのような場合、捕捉プローブは一般的に、非アニーリング材料除去が可能となるように、アニーリング後に固定化される。
本明細書で述べるすべての実施形態は、短い長さのＲＮＡについて、ステップ（ａ）においてサンプルを富化することによって最適化することができる−これは、当業者に知られている様々な分離方法によって行うことができる（サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動など）。これは、測定ステップにおいて、ｍＲＮＡおよび他の長いＲＮＡフラグメント中の配列から得られる偽陽性ヒットを得るリスクを低下させる。
本発明の原則に従って、ステップｃは、本明細書で述べられる検出方法のいずれも伴うことができる。しかし、ステップ（ｃ）は、改変されたヌクレオチド（ＬＮＡヌクレオチドなど）を含む検出プローブの使用を含むことが好ましい。これらの実施形態の大部分では、検出プローブは、短い長さのＲＮＡ内の配列に相当する、あるいはこの配列に相補的であるが、より前のステップａおよびｂが、十分に特異的である場合、これは、必要ではない。こうした例では、検出プローブは、ステップｂからの反応産物の他の部分に対して特異的である可能性がある。
また、逆転写において、あるいはＤＮＡ重合において、あるいは通常ステップａ〜ｃにおいて使用される様々なプライマー（および／または捕捉プローブおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチド）は、改変されたヌクレオチドを含むことができる。主な利点は、例えばＬＮＡが、ＤＮＡと高度なハイブリダイゼーションを示すので、プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドの全長を減少させることができ、したがって、配列特異的な結合は、より短いオリゴヌクレオチドを使用して得ることができることである。
ステップｃにおける検出で、プライマーとして、ステップｂで使用されたのと同じプライマー、すなわち、ステップ（ｂ）の逆転写またはヌクレオチド重合に使用されるプライマーによって構成されるプライマーを利用することも可能である。また、これらのステップにおける特異性の程度が全体として、短い長さのＲＮＡの「ノイズがない」検出を可能にするのに十分に高い場合、ステップｃにおける「再利用される」プライマーの使用は、この方法に有意に影響を及ぼさない。
本発明のこの通常の態様の説明によれば、本発明はまた、最高でも１００ヌクレオチドの長さである、成熟した短い長さのＲＮＡの定量測定に有用なキットに関する。前記キットは、以下を含む。
−本明細書で記述する方法において使用される、最小数の逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブ、ここで、逆転写プライマー、ヌクレオチド重合プライマー、ｑＰＣＲのためのプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプローブは、上で述べた特徴を共にもつ、ならびに
−逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する、成熟した短い長さのＲＮＡの定量測定のための指示書。キットの提供に関するすべての開示を、このキットに必要な変更を加えて準用する。
このキットは、本明細書に記述する通りの１つまたは複数の酵素および他の試薬をさらに含むことができる。
こうした「最小限のキット」の一例として、以下が、図２７に記述される方法を行使するために提供される（基準プライマーおよびプローブは、任意のものである）：
ｍｉＲ特異的アッセイ
・Ｂｉｏｔｉｎｙｌｅｒｅｔ ＬＮＡ捕捉プローブ
・ｍｉＲ特異的なリバースプライマー
・ｍｉＲ特異的なフォワードおよびリバースプライマー
・ｍｉＲ特異的な二重標識されたプローブ
・ＲＮＡ対照のオリゴヌクレオチド
・ＤＮＡ対照のオリゴヌクレオチド
基準Ｕ６ ｓｎｏＲＮＡアッセイ
・基準Ｕ６ ｓｎｏＲＮＡ ＲＴプライマー／ランダムヘキサマープライマー
・基準Ｕ６ ｓｎｏＲＮＡプライマーおよび二重標識されたプローブ
Figure 2007532100
本発明のさらなる態様
一旦、適切な標的配列が、選択されると、ＬＮＡ置換タギングプローブおよび検出プローブは、当分野で記載される通りに市販品として入手できる方法および装置を使用して、好ましくは化学的に合成される（「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」５４：３６０７〜３０、１９９８年）。例えば、短いＬＮＡプローブを産生するために、固相ホスホラミダイト法を使用することができる（カラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、「Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．」４７：４１１〜４１８、１９８２年、アダムズ（Ａｄａｍｓ）ら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．」１０５：６６１（１９８３年）。
ＬＮＡ−含有プローブは、一般的に、合成中に標識される。ホスホラミダイト合成手法の汎用性は、さらに、この標準の化学に利用できるすべての市販品として入手できるリンカー、フルオロフォア、および標識分子をもつＬＮＡの簡単な産生を容易にする。ＬＮＡは、また、酵素的反応によって、例えばキナーゼ処理（ｋｉｎａｓｉｎｇ）することによって標識することができる。
本発明による検出プローブは、単一の標識または複数の標識を含むことができる。一態様では、複数の標識は、標的配列に対する検出プローブのハイブリダイゼーションが生ずる場合に、シグナルを産生する、あるいはシグナルの変化を産生するために互いに相互作用する一対の標識を含む。
別の態様では、検出プローブは、ヌクレオチドからの蛍光発光の増加によって、ハイブリダイズした状態のプローブが、ハイブリダイズしていない状態のプローブと区別することができるように配置される、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む。一態様では、検出プローブは、認識エレメントに加えて、プローブが標的分子内の認識配列にハイブリダイズしない場合に、互いに特異的にハイブリダイズし、クエンチャー分子が前記レポーター分子の十分近くに持って来られて、レポーター分子の蛍光が消光されるような、第１および第２の相補的配列を含む。標的分子のハイブリダイゼーションにより、クエンチャーがレポーター分子から遠ざけられ、シグナルが生じ、これは、ハイブリダイゼーションの量に比例する。
別の態様では、核酸の鎖の重合は、５’ヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼを使用して検出することができる。フルオロフォアおよびクエンチャー分子は、プローブがその認識配列とハイブリダイズする場合、クエンチャーがフルオロフォア分子のシグナルを消去するように、十分に近接してプローブに組み込まれる。５’ヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼによるプローブの切断によって、クエンチャーとフルオロフォア分子が分離され、核酸配列としてのシグナルの増加量の存在がもたらされる。
標的核酸分子の適切なサンプルは、原形質体を含めた広範囲の真核生物および原核生物の細胞；または標的核酸を有する他の生体材料を含むことができる。したがって、この方法は、組織培養動物細胞、動物細胞（例えば、血液、血清、血漿、網状赤血球、リンパ球、尿、骨髄組織、脳脊髄液、あるいは血液またはリンパ液から調製される任意の産物）、あるいは任意のタイプの組織生検（例えば、例えば、溶解緩衝液中でホモジナイズされた、筋生検、肝生検、腎生検、膀胱生検、骨生検、軟骨生検、皮膚生検、膵生検、腸管の生検、胸腺生検、乳房生検、子宮生検、睾丸生検、目生検または脳生検）、史料組織の核酸、浸透圧衝撃に対する感受性が高い植物細胞または他の細胞、ならびに細菌、酵母、ウイルス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチア、真菌、および他の低分子微生物細胞などの細胞に適用可能である。
様々な増幅反応が、当業者によく知られており、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写、ローリングサークルＰＣＲ、ＯＬＡなどが含まれるが、これに限定されるものではない。複数のプライマーはまた、一連の特異的な標的分子を検出するための多重ＰＣＲで用いることができる。
好ましくは、本発明のタギングプローブならびに検出プローブは、標的配列のためのプローブの結合親和性を、改変されていない同じ配列のプローブと、ハイブリダイゼーションまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のための同じ条件下で比較した場合に少なくとも２倍増大させるために改変される。好ましい改変には、結合親和性を増大させるために、化学的な部分によって改変された、あるいは、類似体によって置き換えられた、核酸塩基、ヌクレオシド塩基、またはヌクレオチドの包含が含まれるが、これに限定されるものではない。好ましい改変には、二本鎖を安定化する薬剤（例えば、副溝バインダー（ＭＧＢ）またはインターカレーティング核酸（ＩＮＡ））の付着も含まれ得る。さらに、好ましい改変には、標的鎖上の対向する位置の核酸塩基に関係なく、二本鎖形成を安定化することができる、例えば、５−ニトロインドールなどの、非区別的な塩基の付加も含まれ得る。最後に、標的配列に特異的に配列を結合することができる糖−リン酸以外の主鎖からなるマルチプローブ（例えばＰＮＡなど）も、改変体と考えられる。上で述べた結合親和性を増大する様々な改変はすべて、以下では、「安定化改変」と呼ばれ、タギングプローブおよび検出プローブは、以下では、「改変されたオリゴヌクレオチド」とも呼ばれる。より好ましくは、改変されたオリゴヌクレオチドの結合親和性は、安定化改変されていない同じ配列のプローブの結合よりも少なくとも約３倍、４倍、５倍、または２０倍高い。
最も好ましくは、安定化改変は、１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチド類似体の包含である。本発明による６から３０ヌクレオチドのプローブは、１〜８の安定化ヌクレオチド（例えばＬＮＡヌクレオチド）を含むことができる。少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチドが含まれる場合、これらは、連続的であっても、１つまたは複数の非ＬＮＡヌクレオチドによって隔てられていてもよい。一態様では、ＬＮＡヌクレオチドは、アルファおよび／またはキシロＬＮＡヌクレオチドである。
本発明はまた、上で定義した通りの安定化改変を伴うタギングプローブおよび検出プローブを含むプローブライブラリを提供する。好ましくは、検出プローブは、長さが、約２０ヌクレオチド未満、より好ましくは、１５未満のヌクレオチド、最も好ましくは、約７または８または９または１０または１１ヌクレオチドである。また、好ましくは、タギングプローブは、長さが、約４０ヌクレオチド未満、より好ましくは、３５未満のヌクレオチド、最も好ましくは約２０または３０ヌクレオチドである。また、好ましくは、連結反応用のタギングプローブ、およびＲＴ−ＰＣＲ反応用のＲＴタギングプローブおよび第２鎖タギングプローブは、長さが約１５ヌクレオチド未満、より好ましくは、１４ヌクレオチド未満、最も好ましくは６と１３の間のヌクレオチドの、高親和性のタギング認識配列、さらに、長さが約３０ヌクレオチド未満、より好ましくは２５ヌクレオチド未満、最も好ましくは１５から２０ヌクレオチドの、ＰＣＲプライマーのためのプライマー部位としてのアンカー付けされた配列からなる。標識された検出プローブを含有するプローブライブラリは、認識エレメントに付着される検出エレメントのタイプに応じて、様々な用途で使用することができる。これらの用途には、５’ヌクレアーゼアッセイ（分子ビーコン用途）などの二重または単一標識されるアッセイ（チャギ（Ｔｙａｇｉ）およびクレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」１４：３０３〜３０８、１９９６年を参照のこと）、および他のＦＲＥＴベースのアッセイが含まれるが、これに限定されるものではない。
上で概説した通りの、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、選択的スプライスバリアント、およびアンチセンス非コードＲＮＡに対する既存の定量化アッセイに関する問題は、所与の生物からの所与の細胞のタイプにおける、発見および検出されるｍｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、ｓｉＲＮＡ、選択的スプライスバリアント、およびアンチセンス非コードＲＮＡのうちの大多数を認識または検出するために選択される、ＲＮＡタギングプローブと検出プローブのセット、または第２鎖タギングプローブと組み合わせられるＲＮＡ ＲＴタギングプローブと検出プローブのセットからなる本発明の方法のいずれかと組み合わせた、本発明のプローブを用いて対処される。一態様では、プローブライブラリは、哺乳類の成熟したｍｉＲＮＡ（マウス、ラット、ウサギ、サルまたはヒトｍｉＲＮＡなど）を標識および検出するプローブを含む。成熟したｍｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、ｓｉＲＮＡ、選択的スプライスバリアント、およびアンチセンス非コードＲＮＡのための、定量的リアルタイムおよび終点ＰＣＲアッセイのための費用効果が優れた有用な方法を提供することによって、本発明は、特に従来のｍｉＲＮＡアッセイおよびｓｉＲＮＡアッセイのための上で述べた限界を解決する。本発明による検出プローブの検出エレメントは、（例えば、プローブの各末端、または内部の位置に標識を含むことによって）単一標識されても二重標識されてもよい。したがって、本発明によるプローブは、５’ヌクレアーゼアッセイ、分子ビーコンアッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、および他の類似のアッセイで使用するために適合させることができる、一態様では、検出プローブは、シグナルを産生するための、あるいはシグナルを改変するための、互いに相互作用することができる２つの標識を含み、その結果、プローブが標的配列とハイブリダイズする場合に、シグナルまたはシグナルの変化を検出することができるようになる。この特定の態様は、２つの標識が、クエンチャーおよびレポーター分子を含む場合である。
別の態様では、プローブは、相補的な認識配列を含んでいる標的分子と特異的にハイブリダイズすることができる標的特異的な認識セグメントを含む。「ステム領域をもつ分子ビーコン」と呼ばれる本発明の特定の検出態様は、認識セグメントが、アニーリングしてヘアピンを形成することができる第１と第２の相補的なヘアピン形成配列と隣接する場合である。レポーター標識は、片方の相補的な配列の末端に付着され、消光部分は、もう片方の相補的な配列の末端に付着される。第１と第２の相補的配列がハイブリダイズする（すなわち、プローブ認識セグメントが、その標的にハイブリダイズしない）場合に形成されるステムによって、これらの２つの標識が互いに近くに保たれ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって消光されることとなる、レポーターによって産生されるシグナルが引き起こされる。プローブが標的配列にハイブリダイズする場合、２つの標識の近接度は低下し、近接度の変化は、標識の間の相互作用の変化を生じる。したがって、プローブのハイブリダイゼーションにより、レポーター分子によって産生されるシグナル（例えば蛍光）がもたらされ、これを、検出および／または定量化することができる。
さらに別の態様では、標的検出プローブは、短い標的認識配列の、反対側の末端にレポーターとクエンチャー分子を含み、その結果、これらの部分は、互いに十分に近接し、クエンチャーは、レポーター分子によって産生されるシグナルを実質的に低下させる。これは、プローブが、溶液内に遊離している場合と、プローブが標的核酸に結合される場合の両方に当てはまる。「５’ヌクレアーゼアッセイ」と呼ばれる本発明の特定の検出態様は、検出プローブが、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による切断に感受性である場合である。この反応は、レポーター分子からのクエンチャー分子の分離、および検出可能なシグナルの産生をもたらす可能性がある。したがって、こうしたプローブを、標的核酸のための増幅プロセスを検出および／または定量化するために、増幅に基づくアッセイで使用することができる。
本発明はまた、少なくとも１つの安定化核酸塩基を含むタギングプローブおよび検出プローブを設計するための、方法、システム、および計算機可読の媒体に記憶されるコンピュータプログラム（「コンピュータプログラム製品」）を提供する。この方法は、標的配列のデータベースに問い合わせを行うこと（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌのｍｉＲＮＡレジストリなど）、また、ｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、そのそれぞれの標的配列と結合するのに十分な結合安定性を有する、ｉｉ）それ自体で二本鎖構造を形成する限られた傾向を有する、また、ｉｉｉ）所与のデータベース中のすべての標的配列のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％と結合し、これを検出／定量化できるプローブを設計することを含む。
捕捉プローブ設計プログラム
本発明はまた、捕捉プローブを組み入れるためのヌクレオチドの配列を設計するための、方法、システム、および計算機可読の媒体に記憶されるコンピュータプログラム（「コンピュータプログラム製品」）を提供する。
この方法は、次のステップからなる：
ａ）捕捉プローブを組み入れるためのヌクレオチドの１つまたは複数の配列の初期推定。
ｂ）条件および目的の達成に基づく、初期推定の反復的な改良。
ｃ）目下の方法に使用される計算時間も含めて、条件および目的が十分に達成された場合のアルゴリズムの停止。
融解温度は、「Ｔｍ」と表される。
３つのステップの詳細な説明：
Ａ）初期推定は、プライマー発見ソフトウェア（ｐｒｉｍｅｒ３）を用いることによって見つけられる適切なリバースプライマーのリストにマッチするように、ｍｉＲＮＡ配列に基づく。ランダムな配列は、捕捉プローブの非初期状態の部分（ｎｏｎ ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅｄ ｐａｒｔｓ）をふさぐように産生される。このランダムな産生は、意図されるＴｍ値の近くのＴｍをもつ配列を確かめるためのジ−ヌクレオチドＴｍ表を用いることによって導かれる。
Ｂ）反復的な改良は、目的および条件、およびジ−ヌクレオチドＴｍ表のものに基づくスコア機能によって導かれる。最適以下の繰り返しを回避するために、ランダムな変更が行われる
Ｃ）目的、条件、および計算時間に基づくスコア機能が満たされる場合に、アルゴリズムを停止する。
プライマーおよびプローブ条件を得るための目的を、以下に列挙した：
１．ｍｉＲＮＡに対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションのための融解温度条件
捕捉プローブとｍｉＲＮＡによって形成される二本鎖の融解温度は、ＤＮＡポリメラーゼ伸張反応に適切であるように設定される。この二本鎖内のオリゴヌクレオチド長さは、上で述べたＤＮＡポリメラーゼ伸張反応のためのＴｍ条件を満たすべきである。ｍｉＲＮＡは、捕捉プローブの３’末端にハイブリダイズした。
２．捕捉プローブとＤＮＡポリメラーゼで伸長されたｍｉＲＮＡによって形成される二本鎖のための融解温度条件
捕捉プローブとＤＮＡポリメラーゼで伸長されたｍｉＲＮＡ標的によって形成される二本鎖のＴｍは、ＲＮＡ−ＤＮＡ標的を破壊せずにヘテロ二本鎖を変性できるような温度を超えないようにされる。
３．捕捉プローブと逆転写（ＲＴ）プライマーの関係
ＲＴプライマーは、捕捉プローブの５’末端と同一の配列であり、ＤＮＡポリメラーゼで伸長されたｍｉＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする。ＲＴプライマーとＤＮＡポリメラーゼで伸長されたｍｉＲＮＡによって形成されるこの二本鎖のＴｍは、逆転写酵素を使用する第１の鎖合成に適していなければならない。
４．成熟したｍｉＲＮＡと前駆体ｍｉＲＮＡとの区別
前駆体ｍｉＲＮＡの３’末端は、捕捉反応のための所与のハイブリダイゼーション条件下で、捕捉プローブに対する有意な量のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないようにされる。同様に、前駆体ｍｉＲＮＡ配列内の成熟したｍｉＲＮＡ配列モチーフの後の前述のモノマーは、非ｍｉＲＮＡ関連の捕捉プローブ配列とハイブリダイズしないようにされる。
設計されたあらゆるプローブおよびプライマーのための通常の条件は、低い自己アニーリングおよび低い自己ハイブリダイゼーションの必要性である。
二重の標識プローブ設計プログラム
本発明はまた、二重標識されたプローブに組み入れるためのヌクレオチド配列を設計するための、方法、システム、および計算機可読の媒体に記憶されるコンピュータプログラム（「コンピュータプログラム製品」）を提供する。二重標識されたプローブは、特定のｍｉＲＮＡまたは最大限の特異性をもつ特定のファミリーのｍｉＲＮＡの検出のために使用される。
二重標識されたプローブは、以下の条件を満たさなければならない：
ａ）低い自己アニーリングおよび低い自己ハイブリダイゼーションの必要性。
ｂ）ＰＣＲ反応で機能するのに適したＴｍを有することによって、標的にアニーリングしなければならない。
ｃ）ＰＣＲ反応におけるプライマーにアニーリングしてはならない。
この方法は、次のステップからなる：
Ａ）ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのファミリーに対する最大限の特異性をもつプローブの設計。二重標識されたプローブマッチと呼ばれる、条件を満たす好ましいプローブは、他のｍｉＲＮＡに結合する二重標識されたプローブの能力によって調査される。二重標識されたプローブマッチは、その後、スコア機能に従って特異性スコアを割り当てられる。配列マッチ、配列の長さ、および配列におけるＬＮＡ改変されたヌクレオチドの使用によって、二重標識されたプローブマッチが決定される。
Ｂ）二重の標識プローブマッチは、それがどの位十分に上の条件を満たすかによって記録される。二重標識されたプローブは、そのスコア機能に従って、それがどの位十分に上の条件を満たすかによって記録される。特異性スコアおよびこの条件から得られるスコアは、二重標識されたプローブの最高のヌクレオチド配列を決定するために、その後使用される。
クエンチャーは、好ましくは、ＥＰ出願番号２００４０７８１７０．０に開示される通り、ダーククエンチャーから選択され、特に、１，４−ビス−（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−アントラキノン、１−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−４−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン、１−（３−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−４−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（番号Ｑ１）、１，５−ビス−（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−アントラキノン、１−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン、１−（３−（シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（番号Ｑ２）、１，４−ビス−（４−（２−ヒドロキシエチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、１−（４−（２−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）エチル）フェニルアミノ）−４−（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、１−（４−（２−（２シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）エチル）フェニルアミノ）−４−（４−（２−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）エチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、および１，８−ビス−（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−アントラキノンから選択される、あるいは、６−メチル−キニザリン、１，４−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−６−メチル−アントラキノン、１−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−４−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−６（７）−メチル−アントラキノン、１−（３−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−４−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−６（７）−メチル−アントラキノン、１，４−ビス（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−６−メチル−アントラキノン、１，４−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−６−カルボキシ−アントラキノン、１，４−ビス（４−メチル−フェニルアミノ）−６−カルボキシ−アントラキノン、１，４−ビス（４−メチル−フェニルアミノ）−６−（Ｎ−（６，７―ジヒドロキシ−４−オキソ−ヘプタン−１−イル））カルボキサミド−アントラキノン、１，４−ビス（４−メチル−フェニルアミノ）−６−（Ｎ−（７−ジメトキシトリチルオキシ−６−ヒドロキシ−４−オキソ−ヘプタン−１−イル））カルボキサミド−アントラキノン、１，４−ビス（４−メチル−フェニルアミノ）−６−（Ｎ−（７−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）−６−ヒドロキシ−４−オキソ−ヘプタン−１−イル））カルボキサミド−アントラキノン、１，４−ビス（プロピルアミノ）−６−カルボキシ−アントラキノン、１，４−ビス（プロピルアミノ）−６−（Ｎ−（６，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−ヘプタン−１−イル））カルボキサミド−アントラキノン、１，４−ビス（プロピルアミノ）−６−（Ｎ−（７−ジメトキシトリチルオキシ−６−ヒドロキシ−４−オキソ−ヘプタン−１−イル））カルボキサミド−アントラキノン、１，５−ビス（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、１−（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−５−（４−（２−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）エチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、１−（４−（２−（シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）エチル）フェニルアミノ）−５−（４−（２−−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）エチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、１，８−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン、１−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−８−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン、１，８−ビス（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−アントラキノン、および１−（４−（２−ヒドロエチル）フェニルアミノ）−８−（４−（２−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）エチル）フェニルアミノ）−アントラキノンから選択される化合物である。
様々な固体支持体上へのオリゴヌクレオチドの共有結合のためのある好ましい方法は、国際公開第９６／３１５５７号パンフレットに、あるいは国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに記載される通りのオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に付着される、光化学的に活性なアントラキノンを使用する光化学的固定化である。
別の好ましい実施形態では、ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドの高い親和性および特異性は、天然または合成の核酸の、配列特異的な捕捉および精製において利用される。一態様では、天然のまたは合成の核酸を、固体表面上に固定化されたＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドと接触させる。この場合、ハイブリダイゼーションと捕捉が、同時に起こる。捕捉された核酸は、当分野でよく知られた様々な方法によって、例えば、検出する、特徴付ける、定量化する、あるいは、表面上で直接的に増幅させることもできるし、この核酸はこうした特徴付けまたは増幅を行う前に、固定化された、改変されたオリゴヌクレオチドおよび捕捉された核酸を、例えば熱などの脱ハイブリダイゼーション条件にかけることによって、あるいは低いイオン強度のバッファーを用いることによって、表面から解放することもできる。
別の態様では、ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドは、５’または３’のいずれかに共有結合的に付着したリガンドをもつ。この場合、ＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドは、溶液中の天然または合成の核酸と接触し、その後、形成されたハイブリッドは、リガンドと特異的に結合することができる分子をもつ固体支持体上で捕捉される。
ある好ましい態様では、標的配列データベースは、ヒト、マウス、ラット、キイロショウジョウバエ、線虫、シロイヌナズナ、トウモロコシ、フグ、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ウイルス、またはイネのｍｉＲＮＡに相当する核酸配列を含む。
別の態様では、この方法は、認識配列が少なくとも１つの安定化ヌクレオチド（例えばＬＮＡ分子）を含むという仮定に基づいて安定性を算出することをさらに含む。ある好ましい態様では、算出された安定性は、最適なプローブ認識配列の同定を開始するための、標的配列のデータベースに対する初期照会の前に、仮想の候補プローブのデータベースから、不適切な安定性をもつプローブを排除するために使用される。
別の態様では、この方法は、所与のプローブ配列の、それ自身と二本鎖構造を形成する能力を、その配列が少なくとも１つの安定化ヌクレオチド（例えばＬＮＡ分子）を含むという仮定に基づいて算出することをさらに含む。ある好ましい態様では、算出された傾向は、仮想の候補プローブのデータベースから、プローブ二本鎖を形成する可能性があるプローブ配列を排除するために使用される。
本発明の好ましい実施形態は、タギングプローブおよび標的検出プローブのライブラリを含む、標的ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、非コードアンチセンス転写産物、または選択的スプライスバリアントの検出または定量化のためのキットである。一態様では、キットは、その使用のためのプロトコルをコンピュータ内に含む。別の態様では、キットは、安価なＤＮＡプライマーを得るための指示に関する情報を含む。これらのキット内に含有されるプローブは、上述の特性のいずれかまたはすべてを有することができる。ある好ましい一態様では、複数のプローブが、少なくとも１つの安定化ヌクレオチド（例えばＬＮＡヌクレオチド）を含む。別の態様では、複数のプローブは、プローブの結合の安定性を増大するための、少なくとも１つの化学的な部分に結びつけられた、あるいは安定に結合されたヌクレオチドを含む。本発明によるキットは、使用者が、様々なｍｉＲＮＡ標的、ｓｉＲＮＡ標的、ＲＮＡエディティングされた転写産物、非コードアンチセンス転写産物、または選択的スプライスバリアントに対するアッセイを迅速かつ効率よく開発することを可能にする。
一般に、本発明は、二本鎖安定化特性を有する高親和性のオリゴヌクレオチドプローブの設計、ならびに様々な標的核酸検出、増幅、および定量化法のための非常に有用な方法（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現のモニタリング）を特徴とする。これらのオリゴヌクレオチドプローブのうちのいくつかは、特定の合成の核酸塩基をＬＮＡ主鎖と組み合わせることによってもたらされる、新規のヌクレオチドを含有するので、相補的な鎖に対する配列識別の低下や分子内二本鎖構造を形成する低下する能力の低下などの、特定の特性をもつ高親和性のオリゴヌクレオチドがもたらされる。本発明はまた、複雑な核酸サンプル中の核酸を検出および定量化するための、改良された方法を提供する。他の望ましい改変された塩基は、自己アニーリングする、あるいは１つまたは複数の改変された塩基を含有するオリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成する能力が低下されたものである。
本発明を、以下の実施例を参照してここからさらに示すこととする。この後に続くことは、例としてのものに過ぎず、本発明の範囲内にある限り、細かい改変を行うことができることを理解されたい。
以下の実施例ではプローブ参照番号は、以下の合成実施例において示されるＬＮＡ−オリゴヌクレオチド配列を意味する。
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対する感受性の評価およびリアルタイム定量ＰＣＲアッセイの特異性。
材料および方法
１．ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出および定量化のためのオリゴヌクレオチドタギングプローブおよび検出プローブの設計および合成。
ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＥＱ１５８８５およびＥＱ１５８８６）は、ＤＮＡテクノロジー社（ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）で購入し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。このＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ピロ炭酸ジエチル−（ＤＥＰＣ）処理したＨ２Ｏに溶解し、濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ１０００（ナノドロップテクノロジー（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）で決定した。別途、オリゴヌクレオチドを合成した、あるいは、標準のＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡテクノロジー（ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で購入した。
表Ｉ：ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブ、合成の転写鋳型および検出プローブの設計。
Figure 2007532100
 ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、ＲＮＡ（下線かつ小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）；フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１９６４）））、番号Ｑ１（実施例８ａに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレン研究所（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１０４４））、およびリン酸（Ｐ）。
３’末端認識配列をもつヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブを、１０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）米国）、４００ｐｍｏｌ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡプローブ１（ＥＱ１５８４８）、および１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（ＮＥＢ（米国））を使用する５０μＬ反応物中で、酵素的に５’リン酸化させた。この反応物を、３７℃で３０分保温し、７０℃で１０分、熱不活性化させた。キナーゼを、５０μＬの ＤＥＣＰ処理Ｈ２Ｏを加えることによって除去し、ＹＭ３０ Ｍｉｃｒｏｃｏｎスピンカラム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国）（３分、１４０００×ｇ）を介して、反応物を濾過した。リン酸化されたタギングプローブの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ１０００（ナノドロップテクノロジー（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）で決定した。
２．ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結反応
連結反応は、１２０ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５）、１２０ｎＭの各ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ（リン酸化されたＥＱ１５８４８（上記参照）およびＥＱ１５８４９）、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．０（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、０．０５×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー［２．５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５０μＭ ＡＴＰ、１．２５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ ７．５ ２５℃；（ＮＥＢ（米国））］からなる２０μＬ内で実施された。反応物を、３７℃で１５分間、予備保温し、８００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加え、３７℃でさらに２時間保温した。最後に、この反応物を、６５℃で２０分、熱不活性化させた。ｍｉＲ−１５ａ ＤＮＡ （ＥＱ１５８５２）、標的としてのｍｉＲ−１６ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８６）、またはｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的の代わりに鋳型無しを使用して、この連結反応を繰り返した。標的：ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブの１：１のモル比だけでなく、比５：１におよび１：５も、別の連結反応で使用した。
Ｑｕｉｃｋ連結キット（ＮＥＢ（米国））を使用して実施される連結反応を、供給元の指示書に従って実施した。手短に言えば、オリゴヌクレオチドは、上で述べたのと同じであった。２０μＬの反応混合物中で、オリゴヌクレオチドおよび１×ｑｕｉｃｋ連結バッファー（ＮＥＢ、米国）を、２５℃で１５分保温し、１μＬ のＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、米国）を加え、保温を、さらに３０分間延長した。酵素は、６５℃で２０分間熱不活性化させた。
３．リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ
３．１．ＳＹＢＲグリーン検出を使用するｍｉｃｒｏＲＮＡリアルタイムＰＣＲアッセイ
この反応は、（５０μＬ）１×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、２００ｎＭ Ｍ１３フォワードプライマー（ＥＱ７３９６）、２００ｎＭ Ｍ１３リバースプライマー（ＥＱ７６５５）、および２．５μＬ連結反応物（上記）を含んでいた。サイクリング（Ｃｙｃｌｉｎｇ）手順：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ内での、９５℃１０分、（９５℃１５秒、４５℃１分、６０℃１分）を５０サイクル、６０℃から９５℃までの２０分間の最終解離。
３．２．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイムＰＣＲアッセイ
反応物（５０μＬ）は、１×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ プローブ ＰＣＲマスターミックス（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、２００ｎＭ ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ Ｍ１３フォワードプライマー（ＥＱ１５８８７）、２００ ｎＭ ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ Ｍ１３リバースプライマー（ＥＱ１５８８８）、１００ｎＭ ＬＮＡ配列特異的プローブ（ＥＱ１５８６６またはＥＱ１５８６７）、２．５μＬ連結反応物（上記）であった。サイクリング手順：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ内での、９５℃１５分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を５０サイクル。
以下では、ｄＵＴＰは、２’−デオキシウリジン−三リン酸を意味する。
実施例１
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
配列特異的なＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブを、アニーリングおよび連結した。連結された鋳型を、負の対照として鋳型を抜いて、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡについて、リアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびＬＮＡ改変された二重標識された検出プローブを使用してその後検出した。反応物の特異性を、リガーゼを含まない反応物を使用して試験した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用する、連結されたｍｉｃｒｏＲＮＡプローブに対する、ＰＣＲサイクルに相当するサイクル閾値（Ｃｔ）（そこでは、ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加を、最初に検出することができる）が、３５．０（図２Ａ）であったのに対し、負の対照実験（それぞれ、鋳型抜きおよびリガーゼ抜き）に対するＣｔ値は、検出可能ではなかった。基準化されたレポーターシグナル（Ｒｎ）が、ＰＣＲ反応物に対して測定され、これは、受動的な基準染料の蛍光シグナルによって割られるレポーター色素の蛍光シグナルに相当する。ＰＣＲの間、Ｒｎは、反応が、安定期に接近するまで、アンプリコンコピー数が増加するにつれて増加する。ベースライン補正されたＲｎ（ΔＲｎ）は、ＰＣＲの最初の数サイクルにおいて確立された、Ｒｎマイナスベースラインシグナルに相当する。終点分析では（図２Ｂ）、リアルタイムＰＣＲサンプル（４μＬ）を、１：１００００Ｇｅｌｓｔａｒで染色した２ ％アガロースゲル上に適用し、１×ＴＢＥバッファー（９０ｍＭ トリス−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．３）内で８Ｖ／ｃｍで２時間電気泳動させた。レーン１は、リアルタイムＰＣＲにおける鋳型としての、連結されたｍｉＲ１５ａ タギングプローブを示す。負の対照は、レーン２：鋳型抜き、およびレーン３：リガーゼを含まないであった。
実施例２
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列および相当するＤＮＡ ３’でブロックされた標的に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
ＲＮＡ鋳型を、３’末端でのリン酸を用いて化学的にブロックされたＤＮＡ鋳型によって置き換えた。連結反応においてリガーゼを加えることなく、ブロックされたＤＮＡ鋳型は、ＬＮＡ配列特異的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて検出される可能性はなかった。ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型に対するＣｔ値は、それぞれ３５．０および３３．３であった（図３）。
実施例３
ヒトｍｉＲ−１５ａおよびヒトｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイの特異性。
発明の方法の配列特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列認識を、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的を用い、ｍｉＲ−１５ａ標的配列と７２ ％の配列同一性を有するヒトｍｉＲ−１６標的と比較して評価した。リアルタイムＰＣＲ反応における、鋳型抜きの対照も、鋳型無しの対照（ＮＴＣ）も、いかなるシグナルも示さなかった。ＬＮＡ改変ｍｉＲ１５ａ標的のアニーリングのためのハイブリダイゼーション条件を使用すると、ｍｉＲ−１５ａ標的に対する上で述べた通りの配列特異的タギングプローブが、３６．２のＣｔ値をもたらしたのに対し、ｍｉＲ−１６と非常に相同な同じタギングプローブの使用は、１３倍の差に相当する、３９．９のＣｔ値をもたらした（図４）。
実施例４
２種類のＬＮＡ改変二重標識された検出プローブを使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
２種類のＬＮＡ改変リアルタイムＰＣＲ検出プローブを、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡ連結キットによって連結される同じＬＮＡ改変タギングプローブを使用するヒトｍｉＲ１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列のために設計した。リアルタイムＰＣＲアッセイにおけるＬＮＡ改変検出プローブＥＱ１５８６６およびＥＱ１５８６７の使用は、それぞれ、３８．２および３２．２のＣｔ値をもたらした（図５）。両方のリガーゼ抜きの対照から検出されるシグナルは無かった（ＥＱ１５８６６ 中空きの四角形； ＥＱ１５８６７ 中空きの三角形）。
実施例５
標的とｍｉＲ−１５ａタギングプローブとの間の異なるモル比を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
標的とタギングプローブと間のモル比が１：１にであったものが、最も高い終点蛍光シグナルをもたらした（図６）（ΔＲｎ値）のに対し、１：５のモル比は、最も低い終点シグナル（ΔＲｎ値）をもたらした。モル過剰のｍｉＲ−１５ａタギングプローブ（１：５モル比）も、特異的な終点シグナル（図６）をもたらしたのに対し、ＰＣＲ反応における鋳型無し対照（ＮＴＣ）は、いかなる有意な蛍光シグナルも示さなかった。
実施例６
ｍｉＲ−１５ａタギングプローブおよび最良の形態のＬＮＡ改変検出プローブを使用する、Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡの複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）バックグラウンドにスパイクされるヒトｍｉＲ−１５ａ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを、２．４μＭおよび１μＭ濃度の１０μｇのＴｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡにスパイクし、等モルの濃度のｍｉＲ−１５ａタギングプローブとそれぞれアニーリングさせ、それに続いて、連結し、定量リアルタイムＰＣＲによってｍｉＲ−１５ａ検出した。最も高い蛍光シグナルが、ｍｉＲ−１５ａ標的配列対照（複合酵母全ＲＮＡバックグラウンドを含まない）から観察されたのに対して、蛍光シグナルは、酵母全ＲＮＡサンプルから検出されなかった（図７）。鋳型抜きの対照を用いて実証される通り、リアルタイムＰＣＲアッセイのコンタミネーションは観察されなかった。
実施例７
ＳＹＢＲ検出を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
配列特異的なＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブを、アニーリングおよび連結させた。連結された鋳型が、リアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびＳＹＢＲグリーン検出を使用して容易に検出された（図８）のに対して、鋳型抜きまたはリガーゼ抜きの対照からは、シグナルが検出されなかった。
実施例８ａ
１−（３−（２シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロ−ピルアミノ）−４−（３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（３）クエンチャー「Ｑ１」の調製
Figure 2007532100
 １，４−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（１）
ロイコキニザリン（９．９ｇ；０．０４モル）を、３−アミノ−１−プロパノール（１０ｍｌ）およびエタノール（２００ｍｌ）と混合し、６時間加熱還流させる。この混合物を、室温に冷却し、大気条件下で終夜撹拌する。この混合物を、水（５００ｍｌ）に注入し、沈殿物を濾過し、水（２００ｍｌ）で洗浄して乾燥させる。この固体を、酢酸エチル（３００ｍｌ）中で煮沸し、室温に冷却し、固体を濾過によって収集する。
収率：８．２ｇ（５６％）
１−（３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルアミノ）−４−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（２）
１，４−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（７．０８ｇ；０．０２モル）を、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）および乾燥ピリジン（５０ｍｌ）の混合物に溶解する。ジメトキシトリチルクロライド（３．４ｇ；０．０１モル）を加え、混合物を２時間撹拌する。追加のジメトキシトリチルクロライド（３．４ｇ；０．０１モル）を加え、混合物を３時間撹拌する。混合物を、真空中で濃縮し、残渣を、ジクロロメタン（４００ｍＬ）に再溶解し、水（２×２００ｍｌ）で洗浄して、乾燥させる（Ｎａ２ＳＯ４）。この溶液を、シリカゲルパッド（φ１０ｃｍ；ｈ１０ｃｍ）を介して濾過し、モノ−ＤＭＴ−アントラキノン産物が捉えられなくなるまでジクロロメタンで溶出し、その後、溶媒を、ジクロロメタン中の２％メタノールに変更する。純粋な画分を合わせ、濃縮すると、青い泡が得られる。
収率：７．１ｇ（５４％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１０．８（２Ｈ，２ｘｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，ＮＨ），８．３１（２Ｈ，ｍ，ＡｑＨ），７．６７（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．８ ａｎｄ ９．４，ＡｑＨ），７．４−７．１（９Ｈ，ｍ，ＡｒＨ＋ＡｑＨ），６．７６（４Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）３．８６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ２ＯＨ），３．７１（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．５４（４Ｈ，ｍ，ＮＣＨ２），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，ＣＨ２ＯＤＭＴ），２．０５（４Ｈ，ｍ，ＣＣＨ２Ｃ），１．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＯＨ）。
１−（３−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−４−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（３）
１−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−４−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（０．６６ｇ；１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、３オングストローム分子ふるいを加えた。この混合物を、３時間撹拌し、その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（３３５ｍｇ；１．１ｍｍｏｌ）および４，５−ジシアノイミダゾール（１０５ｍｇ；０．９ｍｍｏｌ）を加える。この混合物を、５時間撹拌し、その後、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍｌ）を加え、１０分間撹拌する。相を分離させ、有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させる（Ｎａ２ＳＯ４）。濃縮後、ホスホラミダイトは、青い泡として得られ、さらに精製することなくオリゴヌクレオチド合成に使用される。
収率：７０５ｍｇ（８２％）
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１５０．０
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１０．８（２Ｈ，２ｘｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，ＮＨ），８．３２（２Ｈ，ｍ，ＡｑＨ），７．６７（２Ｈ，ｍ，ＡｑＨ），７．５−７．１（９Ｈ，ｍ，ＡｒＨ＋ＡｑＨ），６．７７（４Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）３．９−３．７５（４Ｈ，ｍ），３．７１（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．６４−３．５２（３．５４（６Ｈ，ｍ），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，ＣＨ２ＯＤＭＴ），２．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＮ）２．０５（４Ｈ，ｍ，ＣＣＨ２Ｃ），１．１８（１２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，ＣＣＨ３）。
実施例８ｂ
１−（３−（シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（６）クエンチャー「Ｑ２」の調製
Figure 2007532100
１，５−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（４）
１，５−ジクロロアントラキノン（２．８ｇ；１０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（５０ｍｌ）中の３−アミノ−１−プロパノール（１０ｍｌ）と混合し、１３０℃まで４時間加熱する。この混合物を、約８０°に冷却し、水（１５０ｍＬ）を加える。混合物がＲＴに到達したら、形成された沈殿物を、濾過によって単離し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、トルエン（２００ｍｌ）中で煮沸し、溶解していない産物を、濾過によって単離し、乾燥させる。収率：３．２ｇ（９０％）。
１−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（５）
１，５−ビス（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−アントラキノン（１．４ｇ；４ｍｍｏｌ）を、ピリジン（５０ｍｌ）と同時蒸発させ、その後、ピリジン（５０ｍｌ）に再懸濁し、ジメトキシトリチルクロライド（１．４ｇ；４．１ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。この混合物を、濃縮し、残渣をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×５０ｍＬ）、塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮する。シリカゲルカラム（メタノール／ジクロロメタン ２／９８）上で精製する。適切な画分の濃縮後、モノＤＭＴ化合物は、赤い泡として得られる。収率：０．９ｇ（３４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：９．７（２Ｈ，２ｘｔ，ＮＨ），７．６−６．７（１９Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），３．８６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ２），３．７４（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．４８（４Ｈ，ｍ，ＮＣＨ２），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５，９Ｈｚ），２．０５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ）。
１−（３−（シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（６）
１−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−５−（３−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）プロピルアミノ）−アントラキノン（０．４ｇ；０．６１ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、３オングストローム分子ふるいを加える。この混合物を、３時間撹拌し、その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（２００ｍｇ；０．６６ｍｍｏｌ）および４，５−ジシアノイミダゾール（７１ｍｇ；０．６ｍｍｏｌ）を加える。この混合物を、２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を加え、１０分間撹拌する。相を分離させ、有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させる（Ｎａ２ＳＯ４）。濃縮後、ホスホラミダイトは、赤い泡として得られ、さらに精製することなくオリゴヌクレオチド合成に使用される。収率：４９０ｍｇ（９３％）。３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４８．３。
実施例９〜１１で使用される材料および方法。
１．トレハロースを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結反応
連結反応は、５０ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）、５００ｎＭの各々のｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．０（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、０．０５×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー［２．５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５０μＭ ＡＴＰ、１．２５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、 ｐＨ ７．５ ２５℃；（ＮＥＢ、米国）］、２４ｇ／１００ｍｌ トレハロース（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）０．０５μｇ／μＬ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）からなる２０μＬ内で実施された。この反応物を、４２℃で１５分間、予備保温し、８００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、米国）を加え、サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）中で、４２℃で１時間保温した。最後に、反応物を、９５℃で２０分間熱不活性化させた。連結反応は、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的以外の鋳型を含まずに繰り返された。
２．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイムＰＣＲアッセイ
反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有； ｐＨ ８．７（２０℃）］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ配列特異的ｍｉＲ−１５ａ検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬ連結反応物（上で述べた通り）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステム） ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ内で、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を５０サイクル。
表ＩＩ．実施例９〜１６において使用される様々なｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブ、検出プローブ、およびリアルタイムＰＣＲプライマーの設計。
Figure 2007532100
Figure 2007532100
ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）；フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１９６４））、番号Ｑ１（実施例８ａに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ． １０−１０４４））、リン酸（Ｐ）、Ｘは、ＬＮＡ−２，６−ジアミノプリンを表し、Ｚは、ＬＮＡ−２−チオチミジンを表す。
実施例９
ｍｉＲ−１５ａタギングプローブ対の３つの異なるセットと共にｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
配列特異的なＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブを、アニーリングおよび連結させた。ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブの３つの異なる対を、選択し（表ＩＩ）（Ｐａｉｒ Ｉ． ＥＱ１６３１１／ＥＱ１６４５２、ＩＩ． ＥＱ１６４５３／ＥＱ１６３０７、およびＩＩＩ．ＥＱ１６４４７／ＥＱ１６３０７）、連結反応を、上で述べた通りに実施した。その後、連結された鋳型を、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡ改変二重標識された検出プローブによって、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲを使用して検出した。負の対照として鋳型を抜いた。連結反応の特異性を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加えない反応物を使用して試験した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型についての、ＰＣＲサイクルに相当するサイクル閾値（Ｃｔ）（そこでは、ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加を、最初に検出することができる）は、ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブ対Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩについて、それぞれ１７．２、３０．５、および２８．７であった（図１３）。Ｃｔ値が、対ＩＩおよびＩＩＩを用いて実施された負の対照実験（それぞれ、鋳型抜き、リガーゼ抜き）について検出可能ではなかったのに対し、対Ｉを用いて実施される負の対照からのＣｔ値は、それぞれ、サイクル数３７および３９の後に、検出可能であったが、これは、１７．２という相当するＣｔ値（図１３）と比較すると、まだ許容されるものである。基準化されたレポーターシグナル（Ｒｎ）は、完全なＰＣＲサイクリングプログラムを通して測定され、これは、受動的な基準染料の蛍光シグナルによって割られたレポーター色素の蛍光シグナルに相当する。ＰＣＲの間、Ｒｎは、反応が、安定期に接近するまで、アンプリコンコピー数が増加するにつれて増加する。ベースライン補正されたＲｎ（ΔＲｎ）は、ＰＣＲの最初のｋ数サイクルにおいて確立された、Ｒｎマイナスベースラインシグナルに相当する。
実施例１０
ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結およびＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンで増強された検出プローブを使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する、改良されたリアルタイム定量ＰＣＲ
上で述べた通りのヒトｍｉＲ−１５ａを鋳型にする連結反応において、ＬＮＡ改変配列特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６３１１／ＥＱ１６４５２（実施例９における対Ｉ）を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を繰り返した。連結された鋳型は、その後、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡ改変二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８０、ＥＱ１６５８１、ＥＱ１６５８２、またはＥＱ１６５８３、表ＩＩ）によって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量ＰＣＲを使用して検出された。連結反応の特異性は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加えない反応物を使用して試験された。Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡの複合バックグラウンドにスパイクされたヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８０、ＥＱ１６５８１、ＥＱ１６５８２、およびＥＱ１６５８３について、非常に類似（すなわち、それぞれ、３０．４、３０．０、２９．９、および３０．６）であった（図１４、表ＩＩ）。対照的に、Ｃｔ値は、負の対照実験（鋳型抜きおよびリガーゼ抜き、図１４）については検出可能ではなかった。ＬＮＡ Ａヌクレオチドのうちの１つから２つを、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンモノマーで置換することによって、ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイにおいて検出される、ベースライン補正された蛍光シグナル、ΔＲｎが、有意に増強されたのに対し、第３のＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンモノマー（ＥＱ １６５８３、表ＩＩ）での置換は、蛍光シグナルをさらに増強はせず、二重の（ｄｏｕｂｌｅ）ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンで置換されたｍｉＲ−１５ａ検出プローブ（ＥＱ １６５８２、表ＩＩ、図１４）と類似の結果を示した。
実施例１１
鋳型としてｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結反応を使用するヒトｍｉＲ１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対して作成される、リアルタイム定量ＰＣＲの標準曲線
ＬＮＡ改変ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ対 ＥＱ１６３１１／ＥＱ１６４５２（実施例９における対Ｉ）を、上で述べた通りのｍｉＲ−１５ａを鋳型にする連結反応に使用した。ただし、ヒトｍｉＲ−１５ａ鋳型濃度は、それぞれ、５０、５、０．５、０．０５、または０．００５ｎＭであった。連結された鋳型は、その後、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）によって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量ＰＣＲを使用して検出された。連結反応の特異性は、リガーゼを含まない反応物を使用して試験された。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡの、５０、５、０．５、０．０５、および０．００５ｎＭの濃度に対して、それぞれ、１７．６、２２．０、２５．９、２９．６、および３５．６であったのに対し、Ｃｔ値は、負の対照実験（鋳型抜きおよびリガーゼ抜き）については検出可能ではなかった。Ｃｔ値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図１５に図示するように、コピー数の対数に対してＣｔ値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定された。タイトレーションカーブの傾きは−４．３１、切片は３０．９であった。
実施例１２
ＬＮＡ改変タギングプローブおよびＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを用いる、ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
１．ＬＮＡ改変タギングプローブを用いるＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写および第２鎖反応。
逆転写およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応は、２ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ））、６００ｎＭの各ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ、１×ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００μＭの各ｄＮＴＰ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、２０ｕのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、０．０５μｇ／μＬ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ、および２μＬキアゲンＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）からなる５０μＬ内で実施された。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、開始温度に予備加熱した。温度プロフィールは、５０℃を３０分、９５℃を１５分、５０℃を１分、、７２℃を３分であり、最後に、４℃に冷却した。このＲＴ−ＰＣＲ反応を、負の対照として鋳型無しで繰り返した。
２． ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
ＰＣＲ反応（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］、（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ配列特異的検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、鋳型（上記）としての５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応物、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）内で実施された。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内での、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を５０サイクル。
ヒトｍｉＲ−１５ａのためのＬＮＡ改変されたｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブを、アニーリングし、逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして伸長させた。３つの異なる対のｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブを選択した（表ＩＩ）：対ＩＶ．ＥＱ１６５９１／ＥＱ１６３１１、Ｖ． ＥＱ１６５９１／ＥＱ１６３１４、およびＶＩ． ＥＱ１６５８９／ＥＱ１６３１４。ｍｉＲ−１５ａ ＲＴ−ＰＣＲ反応を、上で述べた通りに実施した。鋳型は、その後、負の対照として鋳型抜きを用いる、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）を使用する、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲを使用して検出された。ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲアッセイの特異性を、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘを加えない反応を使用して評価した。ｍｉｃｒｏＲＮＡプローブのための、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用する、ＰＣＲサイクルに相当するＣｔ値（そこでは、ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加が、最初に検出することができる）が、対ＩＶ、Ｖ、およびＶＩについて、それぞれ、１９．２、２８．２、および２２．０であった（図１６）。対ＶおよびＶＩを用いて実施される負の対照実験（それぞれ、鋳型抜きおよびリガーゼ抜き）では、Ｃｔ値は検出可能ではなかったのに対し、対Ｖを用いる負の対照からの相当するＣｔ値は、それぞれ、鋳型無しおよびＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス無しについて、３９．０および３９．９であったが、これは、まだ許容される値である。Ｒｎシグナルは、完全なリアルタイムＰＣＲプログラムを通して測定され、これは、受動的な基準染料の蛍光シグナルによって割られるレポーター色素の蛍光シグナルに相当する。ＰＣＲの間、Ｒｎは、反応が、安定期に接近するまで、アンプリコンコピー数が増加するにつれて増加する。ΔＲｎは、ＰＣＲの最初の数サイクルにおいて確立された、Ｒｎマイナスベースラインシグナルに相当する。
実施例１３
ＬＮＡ改変タギングプローブおよびＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンで増強された検出プローブを用いるｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する改良されたリアルタイム定量ＰＣＲ
１．ＬＮＡ改変タギングプローブを用いるＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写および第２鎖反応。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）、６０ｎＭの各ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ、１×ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００μＭの各々のｄＮＴＰ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、１０ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、０．０５μｇ／μＬ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ、および１μＬキアゲンＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）からなる２５μＬ内で実施された。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、５０℃３０分、９５℃１５分、５０℃１分、７２℃３分であり、最後に、４℃に冷却した。このＲＴ−ＰＣＲ反応を、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的ではなく、負の対照として、鋳型を含まずに繰り返した。
２．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
この反応物（２５μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応物（上記）、および１．２５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内での、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を５０サイクル。
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６５９１／ＥＱ１６３１４（実施例１２における対Ｖ）を、アニーリングさせ、上で述べた通りに逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして伸長させた。ｍｉＲ−１５ ＲＴ−ＰＣＲ反応物を、その後、負の対照として鋳型を抜いて、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８０、ＥＱ１６５８１、およびＥＱ１６５８２、表ＩＩ）を使用して検出した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８０、ＥＱ１６５８１、およびＥＱ１６５８２に対して、それぞれ、３３．０、３３．２、および３３．７であった（図１７）のに対し、負の対照実験（鋳型抜きおよびＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ抜き）については、Ｃｔ値は、検出可能ではなかった。ＬＮＡ Ａヌクレオチドのうちの１〜２つを、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンモノマーで置換することによって、ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイにおいて検出される、ベースライン補正された蛍光シグナル、ΔＲｎが、有意に増強された（図１７）。
実施例１４
鋳型としてｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する、ヒトｍｉＲ１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対して作成されるリアルタイム定量ＰＣＲ標準曲線
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６２４／ＥＱ１６６２０（対ＶＩＩ）をアニーリングさせ、逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして伸長させた。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、上で述べた通りに実施した。ただし、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型濃度は、それぞれ、５０、５、０．５、０．０５、または０．００５ｎＭであった。ｍｉＲ−１５ａ ＲＴ−ＰＣＲ反応は、その後、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８２）を使用することによって、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイム定量ＰＣＲを使用して検出された。ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性は、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘを含まない反応を使用して評価された。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡの、５０、５、０．５、０．０５、および０．００５ｎＭの濃度に対して、それぞれ、２２．２、２６．５、３０．６、３３．６、および３７．８であったのに対し、Ｃｔ値は、負の対照実験（鋳型抜きおよびＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ抜き）については検出可能ではなかった。Ｃｔ値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図１８に図示するように、コピー数の対数に対してＣｔ値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定される。タイトレーションカーブの傾きは−３．８１、切片は３４．０であった。
実施例１５
鋳型としてｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応物および高いアニーリング温度を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６２４／ＥＱ１６６２０（対ＶＩＩ）をアニーリングさせ、逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして伸長させた。アニーリング温度プロフィールは、逆転写プライマーと第２鎖タギングプローブ両方について、５０℃から、５５℃または６０℃に変えた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、上で述べた通りに実施した。ｍｉＲ−１５ａ ＲＴＰＣＲ反応を、その後、アンカーＰＣＲプライマーと、負の対照として鋳型を抜く、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８２）を使用することによって、上で述べた通りのリアルタイム定量ＰＣＲを使用して検出した。ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性は、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘを含まない反応を使用して評価された。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、５０、５５、および６０℃のアニーリング温度に対して、それぞれ、２８．６、２９．３、および３１．０であったのに対し（図１９）、Ｃｔ値は、負の対照実験（鋳型抜きおよびＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ抜き）については検出可能ではなかった。
実施例１６
ＬＮＡ改変タギングプローブおよびＬＮＡ ２，６−ジアミノプリン／ＬＮＡ ２−チオチミジンで増強された検出プローブを用いるｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する改良されたリアルタイム定量ＰＣＲ
１．ＬＮＡ−改変タギングプローブを用いるＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写および第２鎖反応。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）、６０ｎＭの各ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ、１×ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００μＭの各々のｄＮＴＰ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、０．０５μｇ／μＬ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２μＬキアゲンＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）からなる５０μＬ内で実施された。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、５０℃３０分、９５℃１５分、５０℃１分、７２℃３分であり、最後に、４℃に冷却した。このＲＴ−ＰＣＲ反応を、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的ではなく、負の対照として、鋳型を含まずに繰り返した。
２．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
この反応物（２５μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬのＲＴ−ＰＣＲ反応物（上記）、および１．２５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内で、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を５０サイクル。
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６２３／ＥＱ１６６１８（対ＶＩＩＩ）を、アニーリングさせ、上で述べた通りに逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして伸長させた。ｍｉＲ１５ ＲＴ−ＰＣＲ反応は、その後、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびスクランブル対照ｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＥＱ１５８８６、表Ｉ）および負の対照として鋳型抜きを使用するｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６８５２およびＥＱ１６６７９、表ＩＩ）を使用して検出した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８２およびＥＱ１６６７９について、それぞれ２５．６および３０．１であった（図１９）。スクランブル化されたｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ対照ついてのＣｔ値は、３３．３であり、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８２およびＥＱ１６６７９については、それぞれ検出不可能であったのに対し、負の対照実験（鋳型抜きおよびＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅｍｉｘ抜き）についてのＣｔ値は、検出可能ではなかった。ＬＮＡ ＡおよびＬＮＡ Ｔヌクレオチドを、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンおよびＬＮＡ ２−チオチミジンモノマーで置換することによって、ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイにおいて検出される、完全にマッチする鋳型とスクランブル化されたｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型との間の区別が、有意に増強された（図２０）。
表ＩＩＩ．実施例１７で使用されるブロックされたｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブの設計
Figure 2007532100
 ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）；およびリン酸（Ｐ）。
実施例１７
３’でブロックされたＬＮＡ改変タギングプローブおよびＬＮＡ改変検出プローブを用いるｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
１．ブロックされたＬＮＡ改変タギングプローブを用いるＭｉｃｒｏＲＮＡ
１．鎖転写反応
逆転写（ＲＴ）反応は、２５ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）、５０ｎＭ ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ（ＥＱ１６６９５）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表１）、１×第１鎖バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ８．３ ２０℃）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５００μＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、０．０５μｇ／μＬ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ、および１Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）からなる２０μＬ内で実施された。ｍｉｒ−１５ａ鋳型、ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ、およびリバースプライマーは、混合物であり、７０℃で１０分加熱し、氷上で急冷した。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、反応開始温度に加熱した。温度プロフィールは、５５℃を６０分、７０℃を１５分であり、最後に、４℃に冷却した。この第１鎖合成を、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的ではなく、負の対照として、鋳型またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩを含まずに繰り返した。この第１の鎖合成をさらに、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的ではなく、標的としてｍｉＲ−１６ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８６）を使用して繰り返した。
２．ＬＮＡ改変タギングプローブを用いる、ＭｉｃｒｏＲＮＡ第２鎖タイムリリースＰＣＲ増幅。
反応物（５０μＬ）は、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄバッファー（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ 第２鎖ＬＮＡタギングプローブ（ＥＱ１６６２４、表ＩＩ）、２０μＬのＲＴ反応物（上記）、および１．２５のＵ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）であった。サイクリング手順：ＤＹＡＤ（商標）サーモサイクラー（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）内で、（９５℃１分、５５℃１分）を１０サイクル。
３．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するＭｉｃｒｏＲＮＡリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ。
この反応物（２５μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、２００ｎＭの最終濃度までのｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬの第１および第２鎖反応物（上記）、および１．２５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内で、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を４５サイクル。
ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６９５（ＲＴタギングプローブ）と、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマーを、アニーリングさせ、逆転写プライマーとして伸長させた。第１鎖反応に続いて、第２鎖タギングプローブを、上で述べた通りアニーリングし、伸長させた。ｍｉＲ−１５ ＲＴおよびＰＣＲ反応は、その後、負の対照として鋳型を抜いて、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８２、表ＩＩ）を使用して検出した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８２（図２１）について、３７．１であったのに対し、ｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型および負の対照実験（鋳型抜きおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ抜き）に対するＣｔ値は、検出可能ではなかった。
実施例１８
３’でブロックされたＬＮＡ改変タギングプローブおよびＬＮＡ改変検出プローブを用いるｍｉＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲを使用する、成熟したヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
１．ＲＮＡ−プライムドＤＮＡ指向性のＤＮＡ合成が可能な酵素を使用する、ブロックされたＬＮＡ改変ｍｉＲＮＡタギングプローブを用いるＭｉｃｒｏＲＮＡプライマー伸張
ｍｉＲＮＡプライマー伸張反応は、２０μＬ内で実施された。最初に、５００ｎｍｏｌ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ鋳型（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２５ｎＭ ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ（ＥＱ１６６９５、表ＩＩ）を混合し、７０℃で１０分加熱し、氷上で急冷した。１×ＥｃｏＰｏｌバッファー（ＮＥＢ、米国）、５００μＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’エキソ−）酵素（ＮＥＢ、米国）、および総体積２０μＬにするためのジエチルピロカルボネート処理Ｈ２Ｏを加えた。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、３７℃に加熱し、以下のプロフィールを使用するサイクルにかけた；３７℃を３０分、７５℃を２０分、それに続いて４℃に冷却。
２．ＬＮＡ改変タギングプローブと、ＤＮＡ−プライムドＲＮＡ／ＤＮＡ指向性のＤＮＡ合成が可能な酵素を使用する、ＲＴ−ＰＣＲによる成熟したｍｉＲＮＡの増幅
ステップ番号１からのプライマー伸張反応物を、以下を含有する５０μＬ反応混合物に希釈した；６０ｎＭ 第２鎖ＬＮＡタギングプローブ（ＥＱ１６６２４、表ＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表Ｉ）、４００μＭの各ｄＮＴＰ、１×Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、米国）、２μＬ Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素、ＳｅｎｓｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素、およびＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含有；ｄＮＴＰ、バッファー、および酵素は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、米国から購入）、およびジエチルピロカルボネート処理Ｈ２Ｏ（５０μＬの最終体積まで）。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）を、５０℃に加熱し、以下の温度プロフィールを使用するサイクルにかけた；５０℃３０分、９５℃１５分、および（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分）を１０サイクル、それに続いて４℃に冷却。
この反応をさらに、ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ標的ではなく、標的としてｍｉＲ−１６ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８６、表Ｉ）を使用して繰り返した。負の（対照として、ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ、第２鎖ＬＮＡタギングプローブ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’エキソ−）酵素、またはＱｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ酵素のいずれかを、それぞれの反応混合物において省略した。
３．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するｍｉＲＮＡリアルタイム定量ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ反応混合物（２５μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７（２０℃）を含有］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４ｍＭの最終濃度までのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；２００ｎＭ ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー２（ＥＱ１６４４４、表ＩＩ）、３００ｎＭの最終濃度までのｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２（ＥＱ１６４４５、表ＩＩ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬの第１および第２鎖反応物（上記）、および１．２５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）を含有していた。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内で、９５℃１０分、（９５℃２０秒、６０℃１分）を４０サイクル。
その３’末端でブロックされたヒトｍｉＲ−１５ａのためのＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６９５（第１鎖タギングプローブ）を使用して、成熟したｍｉＲ−１５ａを標識し、ＲＮＡ−プライムド ＤＮＡ指向性のＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマーとしてｍｉＲ−１５を使用することで伸長させた。逆転写反応を、ＲＴ−プライマーをアニーリングすることによって実施し、ＲＮＡ／ＤＮＡ指向性の ＤＮＡポリメラーゼ反応で伸長させた。最後に、第２鎖タギングプローブを、アニーリングさせ、ＤＮＡ指向性のＤＮＡポリメラーゼ反応で伸長させた。ｍｉＲ−１５ａプライマー伸張反応、逆転写、およびＰＣＲによって産生された、標識されたヒトｍｉＲＮＡ鋳型を、それぞれ、その後、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、および負の対照として鋳型を使用せずに、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８２、表ＩＩ）を使用して検出した。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１６５８２について、１４．９であった（図２３）のに対し、ｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型に対するＣｔ値は、２３．４であり、それに対し、負の対照実験に対するＣｔ値は、ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ無し、第２鎖ＬＮＡタギングプローブ無し、およびＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’エキソ−）無しの酵素反応に対して、それぞれ、３２．３、２７．７、および２９．９であった。検出可能なＣｔ値は、負の対照実験（ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２無し、またはＱｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ無し）については得られなかった。
実施例１９
３’でブロックされたＬＮＡ改変されたタギングプローブを用いるｍｉＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲを使用する、成熟したヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡについて作成されるリアルタイム定量ＰＣＲ標準曲線。
上で述べた通り（実施例１８）に３’でブロックされたＬＮＡ改変タギングプローブを用いる、ｍｉＲ−１５ａを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲに、ＬＮＡ改変ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブ対 ＥＱ１６９５／ＥＱ１６６２４（実施例１８における対ＩＸ）を使用した。ただし、ヒトｍｉＲ−１５ａ鋳型鋳型濃度は、それぞれ、５００、５０、５、０．５、または０．０５ｆｍｏｌであった。ｍｉＲＮＡ−１５ａ鋳型は、その後、負の対照として鋳型を抜き、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１５８６６、表Ｉ）によって、上で述べた通りのリアルタイム定量ＰＣＲを使用して検出した。Ｃｔ値は、５００、５０、５、０．５、および０．０５ｆｍｏｌのｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型それぞれに対して、それぞれ、１８．４、２１．１、２４．７、２８．５、および３２．０であったのに対し、Ｃｔ値は、鋳型を含まない負の対照実験については３６．８であった。Ｃｔ値は、初期の鋳型コピー数の対数に反比例する。したがって、標準曲線は、図２４に図示するように、コピー数の対数に対してＣｔ値をプロットすることによって作成される。線形回帰分析によって、傾きと切片が決定された。タイトレーションカーブの傾きは−３．４５、切片は２７．４であった。
表ＩＶ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ３’でブロックされたタギングプローブの設計。
Figure 2007532100
Figure 2007532100
 ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）、およびリン酸（Ｐ）。
表Ｖ。実施例２０で使用されるＵ６ ｓｎＲＮＡ検出プローブおよびリアルタイムＰＣＲプライマーの設計。
Figure 2007532100
 ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）；フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））（Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ． １０−１９６４））、番号Ｑ１（実施例８ａに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１０４４））、リン酸（Ｐ）。
実施例２０
ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ。
１． Ｕ６ ｓｎＲＮＡ逆転写
逆転写（ＲＴ）反応は、１μｇ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ鋳型（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）、５μｇ ｐｄ（Ｎ）６ランダムヘキサマー（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、スウェーデン）、１×第１鎖バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ８．３ ２０℃）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１０ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を含有する２０μＬ内で実施された。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ鋳型およびランダムヘキサマーを、混合し、５０℃で５分加熱し、氷上で急冷した。サーモサイクラーＤＹＡＤ（商標）上の温度プロフィール（ＭＪリサーチＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ）、米国）は、３７℃で３０分、４２℃で９０分であり、その後、４℃で保持した。第１鎖合成体は、製品の指示書に従って、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国）上で精製した。遠心分離の後、回収されたサンプルを、元々のＲＴ出発体積（全体で１００μＬ）の５倍に希釈した。
２．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用する、Ｕ６ ｓｎＲＮＡリアルタイムＰＣＲアッセイ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー［トリスＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ８．７ ２０℃］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、最終濃度４ｍＭまでのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００ｎＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；９００ｎＭ Ｕ６ ｓｎＲＮＡフォワードプライマー（ＥＱ１７１６０、表Ｖ）、９００ｎＭ Ｕ６ ｓｎＲＮＡ ＲＴプライマー（ＥＱ１７１５９、表Ｖ）、２５０ｎＭ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１７１６７、表Ｖ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１または５μＬの第１の鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。サイクリング手順：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）内で、９５℃１０分、（９５℃１５秒、６０℃１分）を４０サイクル。
Ｕ６ ｓｎＲＮＡ（受託番号 Ｘ５９３６２、ＧｅｎＢａｎｋ）ＲＴ反応物は、その後、負の対照として鋳型を抜き、上で述べた通りのリアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲプライマー、およびヒトＵ６ ｓｎＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用して検出された。１または５μＬ Ｕ６ ｓｎＲＮＡ ｃＤＮＡ鋳型を使用するＣｔ値は、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１７１６７、表Ｖ）に対して、それぞれ、２８．０および２５．６であった（図２５）のに対し、Ｃｔ値は、負の対照実験（鋳型無し）については得られなかった。
実施例２１
以下を使用するヒトｍｉＲ−１５ａのためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのＭｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
１．３’でブロックされた、５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応。
Ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（１ｆｍｏｌ；ＥＱ１５８８５、表Ｉ）を、総体積６μＬ中で、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）および１００ｆｍｏｌのｍｉＲ−１５ａ捕捉プローブ（ＥＱ１６８７９、表ＶＩ）と混合し、６５℃で５分間加熱し、氷上で急冷し、１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）を加えた。保温は、３７℃で３０分間続けられた。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
１体積の２×結合バッファー（２００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、８００ｍＭ ＬｉＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）に移した。３７℃で３分間の保温によって、ビオチン−ストレプトアビジン結合を形成させた。室温の５体積の洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で３回洗浄することによって、結合していない材料を除去した。「直ちにＲＴ反応を続行する」。
３．溶液中でのＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１００ｆｍｏｌ、ＥＱ１６９９４、表ＶＩ）および１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンＰＣＲチューブに加えた。このチューブを、７０℃で５分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。５×第１の鎖バッファーａ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０×ＤＴＴ（１×＝１０ｍＭ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え（８μＬの体積中で）、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱して、反応を停止させた。
４．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、最終濃度４ｍＭまでのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および０．６ｍＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、９００ｎＭ ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー（ＥＱ１６９９０、表ＶＩ）、９００ｎＭ ｍｉＲリバースプライマー（ＥＱ１６９８９、表ＶＩ）、２５０ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１６９９２、表ＶＩ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった。３７℃１０分、９５℃１０分、４５℃１分、６０℃１分、それに続いて（９５℃２０秒、６０℃１分）を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）で実行された。
記述した反応に対する結果は、Ｃｔ値３３．１であった。Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡを含まない反応は、３３．３のＣｔを示したのに対し、ステップ１においてＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎを含まない反応は、３２．１のＣｔを示した。ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）を含まない、あるいはｍｉＲ−１５ａ捕捉プローブ（ＥＱ１６８７９、表ＶＩ）を含まない、あるいは、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−を含まない負の対照実験はすべて、Ｃｔ値を与えなかった。また、鋳型無し対照（ＮＴＣ）ｑＰＣＲも、Ｃｔ値を与えなかった。アガロースゲル上のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応のサンプルを流すことによる終点分析により、結果、すなわち、Ｃｔ値が無いことは、ゲル上のＰＣＲアンプリコンの欠如に相当することが確認された。
表ＶＩ：実施例２１〜２３に使用されるオリゴヌクレオチド
Figure 2007532100
 ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ． １０−１９６４））、ビオチン（Ｂｉｏ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）））、２部分のヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ２（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）））、番号Ｑ１（実施例８ａに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ１０−１０４４））、リン酸（Ｐ）。
実施例２２
以下を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａの希釈シリーズに対する、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上のＭｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中の逆転写酵素（ＲＴ）反応、およびＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
１．３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上のｍｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応
Ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、または１０ａｍｏｌ； ＥＱ１５８８５、表Ｉ）を、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）および１００ｆｍｏｌのｍｉＲ−１５ａ捕捉プローブ（ＥＱ１６８７９、表Ｖ））と総体積７μＬ内で混合し、６５℃で５分間加熱し、氷上で冷却した。１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）を加えた。３７℃で３０分間保温を続けた。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
１体積の２×結合バッファー（２００ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、８００ｍＭ ＬｉＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）に移した。３７℃での３分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の５体積の洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で、３回洗浄することによって除去した。
３．溶液中のＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１００ｆｍｏｌ、ＥＱ１６９９４、表ＶＩ）および１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ内で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンＰＣＲチューブに加えた。チューブは、７０℃で５分間加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに移した。５×第１鎖バッファーａ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３）２０℃、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０ｘ ＤＴＴ（１×＝１０ｍＭ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え（体積８μＬ内で）、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。
４．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、最終濃度４ｍＭまでのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および０．６ｍＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、９００ｎＭ ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー（ＥＱ１６９９０、表ＶＩ）、９００ｎＭ ｍｉＲリバースプライマー（ＥＱ１６９８９、表ＶＩ）、２５０ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１６９９２、表ＶＩ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応（上記）、０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。温度サイクリングプログラムは、３７℃１０分、９５℃１０分、４５℃１分、６０℃１分、それに続いて（９５℃２０秒、および６０℃１分）を４０サイクルであった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）で実行された。
記述した反応に対する結果は、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｍｏｌおよび１０ａｍｏｌのｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）インプットに対して、それぞれ２４．０、２７．６、３１．１、３４．８、および３７．０のＣｔ値であった。ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）を含まない負の対照実験は、Ｃｔ値を与えなかった。また、鋳型無しの対照（ＮＴＣ）ｑＰＣＲも、Ｃｔ値を与えなかった。１０ａｍｏｌ ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（ＥＱ１５８８５、表Ｉ）のインプットは、５０μＬ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ混合物における１０ｆＭ以下の濃度に相当していた。アガロースゲル上のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応のサンプルを流すことによる終点分析により、結果、すなわち、Ｃｔ値が無いことは、ゲル上のＰＣＲアンプリコンの欠如に相当することが確認された。
実施例２３
３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ−改変捕捉プローブ上のＭｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応、ストレプトアビジンビーズ上の伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素（ＲＴ）反応、およびＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲを使用するヒトｍｉＲ−１５ａのためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
１．３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ−改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応
Ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ ＲＮＡ（１ｆｍｏｌ； ＥＱ１５８８５、表Ｉ）を、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）および１００ｆｍｏｌ ｍｉＲ−１５ａ捕捉プローブ（ＥＱ１６８７９（表ＶＩ））と、総体積７μＬ中で混合し、６５℃で５分間加熱し、氷上で冷却した。１μＬ １０× ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（それぞれ１ｍＭ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）を加えた。３７℃で３０分間、保温を続けた。
２．ストレプトアビジンビーズへの固定化
１０μｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ストレプトアビジン；（ダイナルバイオテック（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ノルウェー）を含有する１体積（１０μＬ）の２×結合バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、回転させながら２０℃で１０分間保温し、ビオチン−ストレプトアビジン結合を形成させた。チューブを、磁性粒子濃縮器（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−９６００；ダイナルバイオテック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）、ノルウェー）に入れた。上清を除去し、ビーズを１００μＬ洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。「直ちにＲＴ反応を続行する」。
３．溶液中でのＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１００ｆｍｏｌ、ＥＱ１６９９４、表ＶＩ）および１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するチューブに加えた。このチューブを、７０℃で５分加熱し、磁性粒子濃縮器に移し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。５×第１鎖バッファーａ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０×ＤＴＴ（１×＝１０ｍＭ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え（体積８μＬ内で）、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。
４．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、最終濃度４ｍＭまでのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および０．６ｍＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、９００ｎＭ ｍｉＲ−１５ａフォワードプライマー（ＥＱ１６９９０、表ＶＩ）、９００ｎＭ ｍｉＲリバースプライマー（ＥＱ１６９８９、表ＶＩ）、２５０ｎＭ ｍｉＲ−１５ａ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１６９９２、表ＶＩ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；３７℃１０分、９５℃１０分、４５℃１分、６０℃１分、それに続いて（９５℃２０秒、および６０℃１分）を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）で実行された。
記述した反応に対する結果は、２８．０のＣｔ値であった。鋳型無し対照（ＮＴＣ）のｑＰＣＲは、Ｃｔ値を与えなかった。
実施例２４
５‘ビオチンを含有するＬＮＡ改変捕捉プローブによってプライムされる固体支持体上での逆転写を使用するヒトｍｉＲ−７ａに対するリアルタイム定量ＰＣＲ、それに続く、ＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
１．５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応
１０μＬの総体積内で、以下を混合した：Ｈｓａ ｍｉＲ−７ａ ＲＮＡ（１０ｆｍｏｌ；ＥＱ１６８９８（表ＶＩＩ）、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）および１００ｆｍｏｌ ｍｉＲ−７ａ捕捉プローブ（ＥＱ １７３６７、表ＶＩＩ）、１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）。この混合物を、３７℃で３０分間保温した。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
２．５μＬの５×結合バッファー（５００ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５ ２０℃、２Ｍ ＬｉＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、上清を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）に移した。３７℃での３分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の１００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で、５回洗浄することによって除去した。
３．ＲＴ反応
２０μＬの以下のＲＴ反応混合物を、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブに加えた：１×第１鎖バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３ ２０℃、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、２０Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を、４２℃で１時間保温した。
４．ｐｒｅ−ＰＣＲ
ＲＴ−混合物を除去し、１×Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、米国）、フォワードおよびリバースプライマー（ＥＱ１７３７２およびＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）（各０．４μＭ）、１Ｕ ウラシル−ＤＮＡ グリコシラーゼ（ＵＮＧ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）を含有する２０μＬのＰＣＲマスター混合物で置き換えた。Ｐｒｅ−ＰＣＲを、以下のＰＣＲ条件にかけた：９５℃１５分、３０℃１分、４０℃１分、６０℃１分、および（９４℃２０分、および６０℃１分） を１０サイクル。この反応物を、リアルタイムＰＣＲの実施まで４℃に維持した。その後、８０μＬのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを、リアルタイムＰＣＲでの使用よりも前に、ｐｒｅ−ＰＣＲ反応に加えた。
５．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この５０μＬリアルタイムＰＣＲ混合物は、１×Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、フォワードおよびリバースプライマー（ＥＱ１７３７２およびＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）（各０．４μＭ）、０．２μＭ ｍｉＲ−７ａ ＬＮＡ検出プローブ（ＥＱ１７３７７、表ＶＩＩ）、１Ｕ ＵＮＧ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）、および５μＬの希釈された第１鎖合成（ＲＴ）−ｐｒｅ−ＰＣＲ反応物（上記）を含有していた。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；９５℃１５分、９４℃２０秒および６０℃１分を４０サイクル。リアルタイムＰＣＲは、オプティコン・リアルタイムＰＣＲ装置（Ｏｐｔｉｃｏｎ リアルタイム ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）で実施された。
結果
リアルタイムＰＣＲは、十分な量のシグナルを伴う、Ｓ字形増幅プロット（図２６）、および１８．５のＣｔ値をもたらした。得られたＣｔ値は、目下の実験で使用されるＨｓａ−ｍｉＲ−７ａの量に対して妥当であり、アッセイの完全な機能性を示唆している。
表ＶＩＩ：実施例２４で使用されるオリゴヌクレオチド
Figure 2007532100
ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、ＲＮＡ（下線かつ小文字）、５−メチルＣ（ｍＣ）；フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１９６４）））、ビオチン（Ｂｉｏ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）））、番号Ｑ１（実施例８ａに記載される通りに調製される）、番号Ｑ２（実施例８ｂに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１０４４））、リン酸（Ｐ）。
実施例２５
二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブの合成、脱保護および精製
表Ｉ、ＩＩおよびＶ〜ＶＩＩの二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわちＥＱ１５８６６、ＥＱ１５８６７、ＥＱ１６５８０−１６５８３、ＥＱ１６６７９、ＥＱ１７１６７、ＥＱ１６８７９、ＥＱ１６９９２、ＥＱ１７３６７、およびＥＱ１７３７７を、２−シアノエチルで保護された（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ＬＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイト（シンハ（Ｓｉｎｈａ）ら、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４」：５８４３〜５８４６、１９８３年）を用いるホスホラミダイト手法（ビウケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２」：１８５９〜１８６２、１９８１年）を使用して、自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ＤＮＡ合成装置、パーセプティブバイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２μｍｏｌスケール）で調製した。
合成サイクルは、ＤＮＡホスホラミダイトの場合に対してＬＮＡホスホラミダイトのために改変された（２５０秒の結合時間）。１Ｈ−テトラゾールまたは４，５−ジシアノイミダゾール（プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）が、結合ステップにおける活性化因子として使用された。
オリゴヌクレオチドを、３２％アンモニア水を使用して脱保護し（室温で１時間、その後、６０℃で２時間）、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ−ＳｐｅｃｔｒａＣｈｒｏｍシリーズ；Ｘｔｅｒｒａ（商標）ＲＰ１８カラム、１０μｍ ７．８×１５０ｍｍ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））。バッファー：Ａ：０．０５Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７．４ Ｂ．５０％ アセトニトリル水溶液。溶出液：０〜２５分：１０〜８０％ Ｂ； ２５〜３０分：８０％ Ｂ））によって精製した。組成物およびオリゴヌクレオチドの純度を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（パーセプティブバイオシステム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−Ｐｒｏ）分析によって確認した。
実施例２６
以下を使用するヒトｈｓａ−Ｌｅｔ−７ａに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上のＭｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブ上の伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
１．３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応
Ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡ（１０ｆｍｏｌ； ＥＱ１６８９８、表ＶＩＩ）を、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、１００ｆｍｏｌ ｃＰ５＿ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ捕捉プローブ（ＥＱ１７３６７、表ＶＩＩ）、１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）と、総体積１０μＬ中で混合した。３７℃で３０分間、保温を実施した。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
体積２．５μＬの５×結合バッファー（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２Ｍ ＬｉＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（（Ｒｏｃｈｅ））、ドイツ）の底部に移した。３７℃での３分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の１００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で、５回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
３．溶液中でのＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１μｌ １００ｆｍｏｌ／μｌ、ＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）および２．５ ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンＰＣＲチューブに加えた。このチューブを、７０℃で５分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。４μｌ ５×第１鎖バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３ ２０℃、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μｌ ２０Ｕ／μｌ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および１μｌ ２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。８０μＬのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを加えることによって、総体積を、１００μＬに調節した。
４．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−Ｆ−プライマー３（ＥＱ１７３７２、表ＶＩＩ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｑＰｃＲ−Ｒ−プライマー２（ＥＱ１７３７５、表ＶＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−プローブ２＿Ｑ２検出プローブ（ＥＱ１８０８９、表ＶＩＩ）、５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、および０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；３７℃１０分、９５℃１５分、３０℃１分、４０℃１分、６０℃１分、それに続いて９４℃２０秒および６０℃１分を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、オプティコン・リアルタイムＰＣＲ装置（Ｏｐｔｉｃｏｎ リアルタイム ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）で実施された。
５．結果。
実験は、３回繰り返して実施され、得られる平均Ｃｔ値は、１９．０であり、ＣＶは０．０１であった。ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを加えない反応を３回繰り返しても、シグナルは生じず、Ｃｔ値は得られなかった。
実施例２７
前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａの調製
１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ａ．Ｔ７プロモーター／リーダーオリゴ（ＥＱ１８２１９、表ＶＩＩＩ参照）を、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−１前駆体ｌｏｎｇｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＥＱ１８２１３、表ＶＩＩＩ参照）と、各オリゴヌクレオチドの最終濃度２０μＭで混合した。
ｂ．サンプルを、９５℃で５分加熱し、この溶液を、ベンチ内で室温に冷却させた。
ｃ．上の溶液の８μＬを、通常の２０μＬ ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ反応（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、反応バッファーおよび酵素ミックスを含有する）における鋳型として使用した。
ｄ．この反応物を、３７℃で終夜保温した。
ｅ．１μＬ ＤＮアーゼを加え、反応物を、３７℃で１５分保温した。
ｆ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＮＡクリーンアップのための改変されたプロトコルを使用して、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐスピンカラムで精製した。
表ＶＩＩＩ：実施例２７で使用されるオリゴヌクレオチド
Figure 2007532100
２：前駆体ｍｉＲＮＡクリーンアップのための改変されたプロトコル
１．サンプルに３５０μｌバッファーＲＬＴを加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。
２．１体積の８０％エタノール（３５０μｌ）を加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。遠心分離はしない。直ちにステップ３を続行する。
３．形成された可能性があるいかなる沈殿物も含むサンプルをピペットで、２ｍｌのコレクションチューブに入れたＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。
４．ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを廃棄する。
５．ステップ３からのフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）（これはｍｉＲＮＡを含有する）を、ピペットで２ｍｌの反応チューブに移す。
６．１．４体積の１００％エタノール（９８０μｌ）を加え、ボルテックス処理することによって、完全に混合する。遠心分離はしない。直ちにステップ７を続行する。
７．サンプルの７００μｌを、ピペットで、２ｍｌのコレクションチューブに入れたＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄する。サンプル全体が、スピンカラムの中にピペットで移されるまで、ステップ７を繰り返す。毎回フロースルーを廃棄する。
８．５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを、ピペットでＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄する。
９．５００μｌの８０％エタノールを、ピペットでＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移す。穏やかに蓋を閉じ、８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。フロースルーおよびコレクションチューブを廃棄する。
１０．新しい２ｍｌのコレクションチューブに、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを入れる。蓋を開け、８０００×ｇで１分間遠心分離する。
１１．１．５ｍｌのコレクションチューブに、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを入れ、ＲＮａｓｅを含まない水１４μｌを、ピペットでスピンカラムメンブレンに乗せる。穏やかに蓋を閉じ、ｍｉＲＮＡを抽出するために、８０００×ｇで１分間遠心分離する。
ｍｉＲＮＡ溶出液の濃度を、ＯＤ２６０で測定し、それに続いて、ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏで、１０ｎＭ（１μＬあたり１０ｆｍｏｌ）の最終濃度に希釈する。
実施例２８
以下を使用する、ヒトｈｓａ−Ｌｅｔ−７ａの前駆体に対する成熟体の選択的検出のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上のＭｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
１．３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応
ｍｉＲＮＡ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ（１０ｆｍｏｌ；ＥＱ１６８９８、表ＶＩＩ）および／または前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ（１０ｆｍｏｌ；実施例２７に概説した通りに産生）を、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、１００ｆｍｏｌ ｃＰ５＿ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ捕捉プローブ（ＥＱ１７３６７、表ＶＩＩ）、１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）と、総体積１０μＬ中で混合した。３７℃で３０分間、保温を実施した。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
体積２．５μＬの５×結合バッファー（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２ Ｍ ＬｉＣｌ、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）の底部に移した。３７℃での３分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の１００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で、５回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
３．溶液中でのＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１μｌ １００ｆｍｏｌ／μｌ、ＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）および２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンＰＣＲチューブに加えた。このチューブを、７０℃で５分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。４μｌ ５×第１鎖バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μｌ ２０Ｕ／μｌ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および１μｌ ２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。８０μＬのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを加えることによって、総体積を、１００μＬに調節した。
４．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲＦ−プライマー３（ＥＱ１７３７２、表ＶＩＩ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｑＰｃＲ−Ｒ−プライマー２（ＥＱ１７３７５、表ＶＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−プローブ２＿Ｑ２検出プローブ（ＥＱ１８０８９、表ＶＩＩ）、５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、および０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；３７℃１０分、９５℃１５分、３０℃１分、４０℃１分、６０℃１分、それに続いて９４℃２０秒および６０℃１分を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、オプティコン・リアルタイムＰＣＲ装置（Ｏｐｔｉｃｏｎ リアルタイム ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）で実施された。
５．結果。
成熟したｍｉＲＮＡ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａおよび／またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａに対して上で概説したアッセイを実施することによって、以下のＣｔ値が得られた（表ＩＸ）。
表ＩＸ
Figure 2007532100
成熟したｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡと前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡとの間には、Ｃｔ値の１１．８の差（ΔＣｔ）があった。１１．８のΔＣｔは、成熟したｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡについてのアッセイの前駆体よりも１０００〜１０，０００倍高い感受性に相当し、これは、２つのｍｉＲＮＡ種を区別するためのこのアッセイの能力を実証する。したがって、成熟したｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ単独、または等モルの濃度で存在する成熟したｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ＋前駆体のｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡをアッセイした場合には、非常に類似のＣｔ値が得られる。アッセイがｍｉＲＮＡを加えずに実施された場合、シグナルもＣｔ値も得られない。ＲＴ反応物が加えられなかった場合、あるいは、鋳型が、前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏの転写のために使用されるオリゴ−鋳型からなるものであった場合、ｑＰＣＲでは、シグナルは、ほとんどまたは全く得られなかった（結果は示さない）。同様に、ｑＰＣＲに加えられる鋳型が、上で概説した通りに実施されるが、鋳型として前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを使用する、すなわち、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応ステップを省略するＲＴからなる場合、シグナルは、ほとんどまたは全く得られなかった（結果は示さない）。
実施例２９
以下を使用する、密接に関連するｍｉＲＮＡ ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｇに対するｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの選択的検出のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上のＭｉｃｒｏＲＮＡプライムド伸張反応、ストレプトアビジンチューブにおける伸張産物の固定化、溶液中での逆転写酵素反応、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
１．３’でブロックされ５’ビオチン標識されたＬＮＡ改変捕捉プローブ上でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−プライムド伸張反応
１０ｆｍｏｌ ｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ、ｈｓａ Ｌｅｔ−７ｆ ｍｉＲＮＡ、またはｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇｍｉＲＮＡ（それぞれ、ＥＱ１６８９８、ＥＱ１６８９９、およびＥＱ１６９１７−表ＶＩＩ）を、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、１００ｆｍｏｌ ｃＰ５＿ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ捕捉プローブ（ＥＱ１７３６７、表ＶＩＩ）、１μＬ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）、１μＬ ｄＮＴＰミックス（１ｍＭの各ｄＮＴＰ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、および５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）と、総体積１０μＬ中で混合した。３７℃で３０分間、保温を実施した。
２．ストレプトアビジンチューブにおける固定化
体積２．５μＬの５×結合バッファー（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２ Ｍ ＬｉＣｌ、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ）を、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−反応物に加え、この混合物を、ストレプトアビジンでコートされたＰＣＲチューブ（ロシュ（（Ｒｏｃｈｅ））、ドイツ）の底部に移した。３７℃での３分間の保温により、ビオチン−ストレプトアビジン結合が形成された。結合されなかった材料を、室温の１００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２０℃、２０ｍＭ ＬｉＣｌ）中で、５回洗浄することによって除去した。洗浄されたチューブを、直ちに逆転写反応にかけた。
３．溶液中でのＲＴ反応
ＲＴ−プライマー（１μｌ １００ｆｍｏｌ／μｌ、ＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）および２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、総体積１２μＬ中で混合し、固定化された捕捉プローブおよびキメラＲＮＡ−ＤＮＡ鎖を含有するストレプトアビジンＰＣＲチューブに加えた。このチューブを、７０℃で５分加熱し、上清を、氷上の新しいチューブに取り出した。４μｌ ５×第１鎖バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μｌ ２０Ｕ／μｌ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および１μｌ ２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を加え、４２℃で１時間保温を続けた。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。８０μＬのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを加えることによって、総体積を、１００μＬに調節した。
４．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲＦ−プライマー３（ＥＱ１７３７２、表ＶＩＩ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｑＰｃＲ−Ｒ−プライマー２（ＥＱ１７３７５、表ＶＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−プローブ２＿Ｑ２検出プローブ（ＥＱ１８０８９、表ＶＩＩ）、５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、および０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；３７℃１０分、９５℃１５分、３０℃１分、４０℃１分、６０℃１分、それに続いて９４℃２０秒および６０℃１分を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、オプティコン・リアルタイムＰＣＲ装置（Ｏｐｔｉｃｏｎ リアルタイム ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）で実施された。
５． 結果。
鋳型としてｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを使用するｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡアッセイでは、２０．４のＣｔ値が得られた。ｈｓａ Ｌｅｔ−７ｆ ｍｉＲＮＡおよびｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇ ｍｉＲＮＡが鋳型として使用されたこのアッセイでは、シグナルは生成されず、Ｃｔ値は得られなかった。同様に、ｍｉＲＮＡが加えられなかったアッセイから、あるいは、ＲＴが鋳型として加えられなかったｑＰＣＲからは、シグナルもＣｔ値も得られなかった。これは、このアッセイが、近いｍｉＲＮＡ相同体ｈｓａ Ｌｅｔ−７ｆ ｍｉＲＮＡおよびｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇのｍｉＲＮＡではなく、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを弁別的に検出するものであることを示唆する（ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡとｈｓａ Ｌｅｔ−７ｆ ｍｉＲＮＡとの間の違いは、ＧからＡへの単一のヌクレオチドの変化のみである）。
実施例３０
調査されたｍｉｃｒｏＲＮＡを第１の鋳型として、人工のヘルパーオリゴヌクレオチドを第２の鋳型として使用する捕捉／ＲＴ−プローブの２つのステップの伸張を使用する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４３のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量化、それに続く、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用する、十分に伸長された捕捉／ＲＴ−プローブの増幅によるリアルタイムＰＣＲ定量化。
ｍｉＲＮＡがステム−ループ分子のより下流の鎖上に位置する場合、ダイサー酵素によるプロセッシングは、成熟したｍｉＲの固有の５’末端をもたらすのに対し、３’末端は、ｐｒｅ−ｍｉＲおよび成熟したｍｉＲについて同一である。
この実施例は、図３１におけるアッセイ設計に従う。
２つの捕捉／ＲＴ−プローブ伸張反応は、「Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ／ＰＣＲミックス」を使用する、同じ反応混合物において起こる。したがって、この反応混合物は、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ、捕捉／ＲＴ−プローブ、逆転写酵素、３’リン酸化された５’ビオチン化された人工のヘルパー鋳型、およびＴａｑポリメラーゼを含有する。
２−ステップ捕捉／ＲＴ−プローブ伸張の後、この反応混合物の一定分量を、リアルタイムＰＣＲ定量化反応におけるインプットとして、その後使用する。
１．２−ステップ捕捉／ＲＴ−プローブ伸張反応混合物。
総体積２５μＬの反応混合物においては、以下が混合された：ｈｓａ−ｍｉｒ−１４３ ｍｉｃｒｏＲＮＡ（１ｆｍｏｌ； ＥＱ１６９００、表Ｘ）、１μｇ Ｔｏｒｕｌｌａ酵母ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、ｈｓａ−Ｒｉｍ−１４３＿ＣＰ５＿ＮｏＢｉｏ（１２５ｆｍｏｌ； ＥＱ１８０８０、表Ｘ）、ｈｓａ−Ｒｉｍ−１４３＿ＡＴ＿Ｂｉｏ（６．２５ｐｍｏｌ； ＥＱ１８０７９、表Ｘ）、ｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰの最終濃度０．２ｍＭ；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１×Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、１×Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ＭｉｘおよびＤＥＰＣ処理水（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−１４３、表Ｘ）が省略される「ｍｉＲ無し」対照を実施した。
この反応混合物を、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｄｙａｄサーモサイクラー（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）を使用する、以下の温度サイクリングプログラムにかけた：
逆転写：６０℃を３０分
Ｔａｑの活性化：９５℃を１５分
捕捉プローブ伸張：（９５℃２０秒＋６０℃３０秒）を１０サイクル
冷却：４℃。
反応混合物は、さらなる処理の直前に、７５μＬ ＤＥＰＣ処理水（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）で希釈した。
２．ストレプトアビジンとの結合による、反応混合物からの人工のヘルパーオリゴヌクレオチドの除去
上のステップ１からの各々の反応混合物の２０μＬの一定分量を、１μＬ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））と混合し、ボルテックス処理し、３７℃で５分間保温し、スピンカラム（ハーバードアパレイタス）で回転させた。
３．ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ定量化
総体積２５μＬの反応混合物においては、以下が混合された：ｈｓａ−Ｒｉｍ−１４３＿プライマー２（最終濃度０．５μＭ、ＥＱ１７７２４、表Ｘ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３＿Ｐｒｉｍｅｒ１４３＿Ｃ２（最終濃度０．５μＭ、ＥＱ１７５７４、表Ｘ）、ｈｓａ−Ｒｉｍ−１４３＿Ｐ４（最終濃度０．２５μＭ、ＥＱ１８０５７、表Ｘ）、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、上のステップ１またはステップ２からの希釈された反応混合物２．５μＬ、およびＤＥＰＣ処理水。
反応混合物を、ＡＢＩ ７５００ リアルタイム ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を使用する以下の温度サイクリングプログラムにかけた：
Ｔａｑの活性化：９５℃１５分
ＰＣＲ増幅：（９５℃２０秒＋６０℃３０秒）を４０サイクル
上で述べた反応の結果は、ステップ２で精製されないｍｉｃｒｏＲＮＡ含有サンプルについて、３７のＣｔ値、ステップ２で精製される相当するサンプルについて、３６のＣｔ値であった。２つの相当する「ｍｉＲ無し」対照はどちらも、４０サイクル以内ではいずれのＣｔ値も与えなかった。図３２を参照のこと。
表Ｘ：実施例Ｒｉｍで使用されるオリゴヌクレオチド
Figure 2007532100
ａＬＮＡ（大文字）、ＤＮＡ（小文字）、フルオレセイン（６−ＦＩＴＣ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１９６４）））、ビオチン（Ｂｉｏ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）））、２部分のヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ２（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）））、番号Ｑ２（実施例８ｂに記載される通りに調製される）、ｚ（５−ニトロインドール（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐｒｏｄ．Ｉｄ．Ｎｏ．１０−１０４４））、リン酸（Ｐ）。
実施例３１
以下を使用する、密接に関連するｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｇに対するｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの選択的検出のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡへのＲＮＡアダプターの連結、それに続く逆転写、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
この実施例で用いられる方法は、概して図３６に示される。
１．成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡへのＲＮＡアダプターの連結。
１０ｆｍｏｌのｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡまたはｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇ ｍｉＲＮＡ（それぞれＥＱ１６８９８およびＥＱ１６９１７−表ＶＩＩ）を、２０ｆｍｏｌ ＲＮＡアダプター（ＥＱ１８５５７−表ＸＩ）および４０Ｕ Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）と、１×Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８ ２５℃、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、および１０ｍＭジチオスレイトール）からなる総体積２０μ中で混合した。３７℃で１５分保温することによって、連結を成し遂げた。６５℃で１５分加熱し、反応を停止させた。
２．ＲＴ反応
逆転写反応は、２μＭ ＲＴ−プライマー（ＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）および５００μＭの各ｄＮＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、１×第１鎖バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃ ７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１０ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、６０ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、５００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、および２０μＬの上記の連結混合物からなる５０μＬ内で実施された。逆転写反応は、４２℃で１時間実施した。７０℃で１５分加熱し、反応を停止させた。
４．ＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
この反応物（５０μＬ）は、１×ＰＣＲバッファー（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、最終濃度４ｍＭまでのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および０．６ｍＭ ｄＵＴＰ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）、９００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−Ｆ−プライマー３（ＥＱ１７３７２、表ＶＩＩ）、９００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｑＰｃＲ−Ｒ−プライマー２（ＥＱ１７３７５、表ＶＩＩ）、２５０ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−プローブ２＿Ｑ２検出プローブ（ＥＱ１８０８９、表ＶＩＩ）、０．１×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、２．５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、および２．５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）であった。温度サイクリングプログラムは、以下の通りであった；３７℃１０分、９５℃１０分、それに続いて９５℃で２０秒および６０℃を１分を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）で実行された。
５．結果。
鋳型としてｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを使用するｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡアッセイでは、２７．１のＣｔ値が得られた（図３５）。ｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇ ｍｉＲＮＡが鋳型として使用されたこのアッセイでは、シグナルは生成されず、Ｃｔ値は得られなかった。同様に、ｍｉＲＮＡが加えられなかったアッセイから、あるいは、ＲＴが鋳型として加えられなかったｑＰＣＲからは、シグナルもＣｔ値も得られなかった。これは、このアッセイが、近いｍｉＲＮＡ相同体ｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇではなく、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを弁別的に検出するものであることを示唆している。
表ＸＩ：連結に使用されるオリゴヌクレオチド。
Figure 2007532100
ＲＮＡ（下線かつ小文字）およびリン酸（Ｐ）。
実施例３２
以下を使用する、密接に関連するｍｉＲＮＡ ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｇに対するｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの選択的検出のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ；「橋かけ」核酸配列（連結ヘルパーオリゴ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｅｌｐｅｒ Ｏｌｉｇｏ））を使用する成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡへのＲＮＡオリゴの連結、それに続く逆転写、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ−改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ。
以下は、連結−ヘルパー−オリゴ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｈｅｌｐｅｒ−Ｏｌｉｇｏ）が、連結を援助する方法の例である。その後の逆転写およびｑＰＣＲは、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａを検出するために実施することができる。
１．成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡへのＲＮＡ 連結オリゴの連結。
１０ｆｍｏｌのｈｓａ Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡまたはｈｓａ Ｌｅｔ−７ｇのｍｉＲＮＡ（それぞれＥＱ１６８９８およびＥＱ１６９１７−表ＶＩＩ）を、１００ｆｍｏｌの連結オリゴおよび１００ｆｍｏｌの連結−ヘルパー−オリゴ（それぞれＥＱ１８５５７およびＥＱ１８５６５−表ＸＩＩ）および４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）と、１×Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ 反応 バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ ２５℃、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭジチオスレイトール、２５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）からなる総体積２０μＬ内で混合する。室温で、３０分間保温することによって、連結を実施する。６５℃で１０分間加熱し、反応を停止させる。
２．ＲＴ反応
１μＬ ＲＴ−プライマー（１００ｆｍｏｌ／μＬ、ＥＱ１７３７４、表ＶＩＩ）および２μＬ ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ−アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を、１μｌ ５×第１鎖バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ ２０℃、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）、１μｌ ２０Ｕ／μｌ ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）、および１μｌ ２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）と共に加える。４２℃で１時間、逆転写反応を実施する。７０℃で１５分間加熱し、反応を停止させる。７４μＬのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを加えることによって、総体積を１００μＬに調節する。
３．ＬＮＡ改変検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲ
１×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ プローブ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−Ｆ−プライマー３（ＥＱ１７３７２、表ＶＩＩ）、４００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ ｑＰｃＲ−Ｒ−プライマー２（ＥＱ１７３７５、表ＶＩＩ）、２００ｎＭ ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ＿ｑＰｃＲ−プローブ２＿Ｑ２検出プローブ（ＥＱ１８０８９、表ＶＩＩ）、５μＬの第１鎖合成（ＲＴ）反応物（上記）、および０．５Ｕ ウラシル ＤＮＡ グリコシラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を含む、リアルタイムＰＣＲ反応（５０μＬ）を準備する。以下の温度サイクリングプログラムを使用する：３７℃１０分、９５℃１５分、３０℃１分、４０℃１分、６０℃１分、それに続いて９４℃２０秒および６０℃１分を４０サイクル。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、オプティコン・リアルタイムＰＣＲ装置（Ｏｐｔｉｃｏｎ リアルタイム ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国）で実施された。
表ＸＩＩ：連結に使用されるオリゴヌクレオチド。
Figure 2007532100
実施形態
本発明は、また、以下の実施形態によって規定することができる。ただし、用語「アイテム」は、特定の数をもつ前述のアイテムを指す。
１．以下を含む、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量化する方法：
ａ）標的ヌクレオチド配列を、２つのオリゴヌクレオチドタギングプローブ（それぞれ、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなる）と接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的配列と相補的であり、第１のタギングプローブの認識配列が、標的配列の第１の領域とハイブリダイズし、第２のタギングプローブの第２の認識配列は、標的配列の第１の領域に隣接する標的配列の第２の領域とハイブリダイズする；
ｂ）共有結合的にハイブリダイズしたタギングプローブの２つの隣接する認識配列を連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって繋げて、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列および２つのアンカーヌクレオチド配列を含む、近接するヌクレオチド配列を形成すること；および、
ｃ）アンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって、連結されたオリゴヌクレオチド分子を定量化すること。
２．タギングプローブおよび検出プローブにおける認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム１の方法。
３．高親和性のヌクレオチド類似体が、ＬＮＡである、アイテム１〜２の方法。
４．５’リン酸化されたタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、５’ヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド位置の、ＬＮＡで開始する第２、第３、または第４の各位置で、ＬＮＡで改変され、第２のタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、３’ヌクレオチド位置より前のヌクレオチド位置で終了する第２、第３、または第４の各位置で、ＬＮＡで改変される、アイテム１〜３の方法。
５．５’リン酸化されたタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、５’ヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド位置の、ＬＮＡで開始する第３の各位置で、ＬＮＡで改変され、第２のタギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、３’ヌクレオチド位置より前のヌクレオチド位置で終了する第３の各位置で、ＬＮＡで改変されるアイテム４の方法。
６．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列である、アイテム１〜５の方法。
７．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム１〜５の方法。
８．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、ＬＮＡで改変される、アイテム７の方法。
９．タギングプローブ内の認識ヌクレオチド配列が、長さが約２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１５ヌクレオチド未満、最も好ましくは１０〜１４ヌクレオチドであるアイテム１〜８の方法。
１０．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、長さが約３０ヌクレオチド未満、より好ましくは２７ヌクレオチド未満、最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチドであるアイテム１〜９の方法。
１１．検出プローブ内の認識配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム１〜１０の方法。
１２．高親和性のヌクレオチド類似体がＬＮＡである、アイテム１１の方法。
１３．検出プローブの長さが、約２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１５ヌクレオチド未満、最も好ましくは８〜１２ヌクレオチドである、アイテム１２の方法。
１４．検出プローブが、５’末端にＤＮＡヌクレオチド、３’末端にリン酸基を含有するＬＮＡ配列を含む、アイテム１３の方法。
１５．検出プローブが、少なくとも１つの化学的な部分で置換される、アイテム１４の方法。
１６．検出プローブが、フルオロフォア−クエンチャー対を含有する、アイテム１５の方法。
１７．検出プローブが、５’ヌクレアーゼアッセイ原理によって、二重標識を使用して検出される、アイテム１〜１６の方法。
１８．検出プローブが分子ビーコン原理によって検出される、アイテム１〜１６の方法。
１９．タギングプローブが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結される、アイテム１〜１８のうちのいずれか１つの方法。
２０．タギングプローブが、耐熱性のＤＮＡリガーゼを使用して連結される、アイテム１〜１８のうちのいずれか１つの方法。
２１．タギングプローブが、ＲＮＡリガーゼを使用して連結される、アイテム１〜１８のうちのいずれか１つの方法。
２２．タギングプローブが、耐熱性のＲＮＡリガーゼを使用して連結される、アイテム１〜１８のうちのいずれか１つの方法。
２３．連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応が、変性と、タギングプローブのアニーリングおよび接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、複数の連結されたオリゴヌクレオチド分子の産生の間の繰り返されるサイクルである、アイテム２０または２２の方法。
２４．タギングプローブのうちの１つが、リガンドで標識される、アイテム１〜２３のうちのいずれか１つの方法。
２５．連結された分子が、リガンド−捕捉分子相互作用を利用して精製される、アイテム２４の方法。
２６．リガンドが、ビオチンであり、リガンド−捕捉分子相互作用が、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンである、アイテム２４〜２５の方法。
２７．標的ヌクレオチド配列が、ＲＮＡ配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
２８．標的ヌクレオチド配列が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
２９．標的ヌクレオチド配列が、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ配列である、アイテム２８の方法。
３０．標的ヌクレオチド配列が、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡエディティングされた配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
３１．標的ヌクレオチド配列が、選択的スプライスバリアント配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
３２．標的ヌクレオチド配列が、非コード、あるいは、アンチセンスＲＮＡ配列または、単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するＲＮＡ配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
３３．標的ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
３４．標的ヌクレオチド配列が、単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するＤＮＡ配列である、アイテム１〜２６のうちのいずれか１つの方法。
３５．標的ヌクレオチド配列が、ヒト配列である、アイテム１〜３４の方法。
３６．標的ヌクレオチド配列が、疾患に関与する、あるいは、疾患（例えば癌）の診断のために有用である、アイテム３５の方法。
３７．ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出または定量化のためのアイテム１〜３６のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
３８．植物または哺乳類のｍｉｃｒｏＲＮＡの検出および定量化のためのアイテム３７のプローブのライブラリ。
３９．ヒトまたは動物ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出および定量化のためのアイテム３７のプローブのライブラリ。
４０．アンチセンスＲＮＡ、非コードＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの検出または定量化のためのアイテム１〜３６のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
４１．ＲＮＡエディティングされた転写産物の検出または定量化のためのアイテム１〜３６のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
４２．選択的スプライスバリアントの検出または定量化のためのアイテム１〜３６のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
４３．アイテム３７〜４２のうちのいずれか１つのキット。
４４．以下を含む、核酸サンプル中の標的リボ核酸配列を定量化する方法：
ａ）標的リボ核酸配列を、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的リボ核酸配列内の配列と相補的である、
ｂ）逆転写酵素およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドタギングプローブを使用する逆転写により、標的リボ核酸と相補的な鎖を合成すること、
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーとしての第２のタギングプローブを使用する第２鎖の合成により、ヘテロ二本鎖内のリボ核酸配列を置き換えること（ｒｅｐｌａｃｉｎｇ）、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列内の配列と相補的である、
ｄ）オリゴヌクレオチドタギングプローブと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブに付着させたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること。
４５．タギングプローブおよび検出プローブ内の認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム４４の方法。
４６．第１のタギングプローブおよび検出プローブ内の標的リボ核酸内の配列と相補的な認識ヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変され、第２のタギングプローブ中の認識配列は改変されない、アイテム４４の方法。
４７．タギングプローブに内の認識配列は改変されず、検出プローブが、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム４４の方法。
４８．高親和性のヌクレオチド類似体が、ＬＮＡであるアイテム４４〜４７の方法。
４８．タギングプローブ内の認識配列が、認識配列の３’末端に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチドをもつ第２、第３、または第４の各位置で、ＬＮＡで改変されるアイテム４４〜４８の方法。
４９．タギングプローブ内の認識配列が、認識配列の３’末端に少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチドにより開始および終了する第３の各位置で、ＬＮＡで改変されるアイテム４８の方法。
５０．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列である、アイテム４４〜４９の方法。
５１．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム４４〜５０の方法。
５２．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、ＬＮＡで改変される、アイテム５１の方法。
５３．タギングプローブ内の認識配列が、長さが約２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１５ヌクレオチド未満、最も好ましくは６〜１４ヌクレオチドであるアイテム４４〜５２の方法。
５４．タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列が、長さが約３０ヌクレオチド未満、より好ましくは２７ヌクレオチド未満、最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチドである、アイテム４４〜５３の方法。
５５．検出プローブにおける認識配列が、高親和性のヌクレオチド類似体で改変される、アイテム４４〜５４の方法。
５６．高親和性のヌクレオチド類似体が、ＬＮＡである、アイテム５５の方法。
５７．ＬＮＡが、ＳＢＣ核酸塩基、２’−Ｏ−メチル、２，６−ジアミノプリン、２−チオウラシル、２−チオチミジン、５−ニトロインドール、ユニバーサルまたは縮重塩基、インターカレーティング核酸または副溝バインダー（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒ）で所望により改変されるアイテム５６の方法。
５８．認識配列中のＬＮＡアデノシンモノマーの少なくとも１つが、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンで置換される、アイテム５７の方法。
５９．ＬＮＡモノマーの少なくとも１つが、ＬＮＡ ２−チオチミジンで置換される、アイテム５８の方法。
６０．検出プローブの長さが、約２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１５ヌクレオチド未満、最も好ましくは７〜１２ヌクレオチドであるアイテム５９の方法。
６１．検出プローブが、５’末端にＤＮＡヌクレオチド、３’末端にリン酸基を含有するＬＮＡ配列を含む、アイテム５９の方法。
６２．検出プローブが少なくとも１つの化学的な部分で置換される、アイテム６１の方法。
６３．検出プローブが、フルオロフォア−クエンチャー対を含有する、アイテム６２の方法。
６４．検出プローブが、５’ヌクレアーゼアッセイ原理によって、二重標識を使用して検出される、アイテム４４〜６３の方法。
６５．検出プローブが分子ビーコン原理によって検出される、アイテム４４〜６３の方法。
６６．標的リボ核酸と相補的な鎖が耐熱性の逆転写酵素を使用して合成される、アイテム４４〜６５のうちのいずれか１つの方法。
６７．ヘテロ二本鎖内の標的リボ核酸配列を置換する第２鎖が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して合成される、アイテム４４〜６６のうちのいずれか１つの方法。
６８．第２鎖タギングプローブが、リガンドで標識される、アイテム４４〜６７のうちのいずれか１つの方法。
６９．第２鎖分子が、リガンド−捕捉分子相互作用を利用して精製される、アイテム６８の方法。
７０．リガンドが、ビオチンであり、リガンド−捕捉分子相互作用が、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンである、アイテム６８〜６９の方法。
７１．標的リボ核酸配列が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列である、アイテム４４〜７０のうちのいずれか１つの方法。
７２．標的リボ核酸配列が成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ配列である、アイテム７１の方法。
７３．第１のタギングプローブの認識配列が、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡの３’末端と相補的であり、第２のタギングプローブの認識配列が、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡの５’末端に相当する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列の、３’末端と相補的である、アイテム７２の方法。
７４．標的リボ核酸配列が、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡエディティングされた配列である、アイテム４４〜７０のうちのいずれか１つの方法。
７５．標的リボ核酸配列が、選択的スプライスバリアント配列である、アイテム４４〜７０のうちのいずれか１つの方法。
７６．標的リボ核酸配列が、非コード、またはアンチセンスＲＮＡ配列、または単一ヌクレオチド多型または点突然変異を含有するＲＮＡ配列である、アイテム４４〜７０のうちのいずれか１つの方法。
７７．第１のタギングプローブの認識配列が、成熟したｓｉＲＮＡの３’末端と、あるいは、ＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異の３’に位置する配列と相補的であり、第２のタギングプローブの認識配列が、ｓｉＲＮＡの５’末端に相当する、あるいは、リボ核酸標的配列内のＲＮＡエディティングされたヌクレオチド、スプライスジャンクション、単一ヌクレオチド多型、または点突然変異の５’に位置する逆転写酵素で伸長されたヌクレオチド配列と相補的である、アイテム７４〜７６のうちのいずれか１つの方法。
７８．標的リボ核酸配列がヒト配列である、アイテム４４〜７７の方法。
７９．標的リボ核酸配列が、疾患に関与する、あるいは、疾患（例えば癌）の診断のために有用である、アイテム７８の方法。
８０．ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出または定量化のためのアイテム４４〜７９のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
８１．植物または哺乳類のｍｉｃｒｏＲＮＡの検出および定量化のためのアイテム８０のプローブのライブラリ。
８２．ヒトまたは動物ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出および定量化のためのアイテム８０のプローブのライブラリ。
８３．アンチセンスＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡエディティングされた転写産物、または選択的スプライスバリアントの検出または定量化のための、アイテム４４〜７９のうちのいずれか１つのタギングプローブおよび検出プローブのライブラリ。
８４．アイテム８０〜８３のうちのいずれか１つのキット。
図１は、配列特異的なリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の１つの方法の模式的な表示である。 図１は、配列特異的なリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の１つの方法の模式的な表示である。 図２Ａは、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列のためのリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。配列特異的ＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブは、アニーリングされ、連結され、その後、連結されたタギングプローブは、負の対照（×印）として負の鋳型を使用する、リアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ（中塗りの四角形）に対するＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用して検出された。この反応の特異性は、リガーゼ（中空きの四角形）を含まない反応を使用して試験された。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ鋳型を使用する、連結されたｍｉｃｒｏＲＮＡプローブに対するサイクル閾値（Ｃｔ）が、３５．０であったのに対し、負の対照実験（鋳型抜きおよびリガーゼ抜き）については、Ｃｔ値は検出可能ではなかった。ΔＲｎは、ベースライン補正された規準化されたレポーターシグナル（Ｒｎ）であり、ＰＣＲの最初の数サイクルにおいて確立される、Ｒｎマイナスベースラインシグナルに相当する。 図２Ｂは、Ｇｅｌｓｔａｒ（１：１００００希釈、ケンブレックスバイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、米国）で染色される２％アガロースゲル電気泳動上のリアルタイムＰＣＲ反応の終点分析を示す。連結されたｍｉＲ−１５ａタギングプローブ鋳型は、レーン１ではＰＣＲフラグメントを示す（約６５ｂｐ）。負の対照実験（鋳型抜き（レーン２）およびリガーゼ抜き（レーン３））は、連結されたｍｉｒ−１５ａタギングプローブ鋳型よりも分子量が小さい、より短いフラグメントを示した。リアルタイムＰＣＲ反応における鋳型無しの対照（ＮＴＣ）は、アガロースゲル電気泳動上いかなるフラグメントも含まなかった（図示せず）。 図３は、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列および相当するＤＮＡ３’ブロック標的のためのリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。ＲＮＡ鋳型（中塗りの四角形）は、３’末端でリン酸を用いて化学的にブロックされるＤＮＡ鋳型（中塗りの三角形）によって置き換えられた。リガーゼを含まない、ブロックされたＤＮＡ鋳型（中空きの三角形）は、ＬＮＡ配列特異的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて検出することができなかった。ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型に対するＣｔ値は、それぞれ、３５．０および３３．３であった。 図４は、ヒトｍｉＲ−１５ａおよびヒトｍｉＲ−１６ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。本発明の方法の配列特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列認識を、ｍｉＲ１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的（中塗りの四角形）を用いて、ｍｉＲ−１５ａ標的配列と７２ ％の配列同一性を有するｍｉＲ−１６標的（中空きの丸）と比較して評価した。鋳型抜きの対照（×印）もリアルタイムＰＣＲ反応（黒い垂直線）におけるＮＴＣも、いかなるシグナルも与えることが示されなかった。ｍｉＲ−１５ａ標的に対するＬＮＡ−改変ｍｉＲ−１５ａ標的配列特異的タギングプローブのアニーリングのためのハイブリダイゼーション条件が、３６．２のＣｔ値をもたらしたのに対し、非常に相同のｍｉＲ−１６に対する同じタギングプローブの使用は、３９．９のＣｔ値（１３倍の判別可能な差に相当する）をもたらした。 図５は、２つの異なるＬＮＡ改変された二重標識された検出プローブを使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列のためのリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。２つの異なるＬＮＡ−改変リアルタイムＰＣＲ検出プローブは、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡ連結キットによって連結された同じＬＮＡ改変タギングプローブを使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列のために設計された。リアルタイムＰＣＲアッセイにおけるＬＮＡ改変検出プローブＥＱ１５８６６（中塗りの四角形）およびＥＱ１５８６７（中塗りの三角形）の使用は、それぞれ、３８．２および３２．２のＣｔ値をもたらした。リガーゼ抜きの対照からのシグナルは両方とも、検出されなかった（ＥＱ１５８６６ 中空きの四角形；ＥＱ１５８６７ 中空きの三角形）。 図６は、標的とｍｉＲ−１５ａ タギングプローブとの間の異なるモル比を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ標的配列のためのリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。標的とタギングプローブとの間のモル比が１：１であるもの（中塗りの四角形）が、最も高い終点蛍光シグナル（ΔＲｎ値）をもたらしたのに対し、１：５のモル比のもの（中空きの菱形）は、最も低い終点シグナル（ΔＲｎ値）をもたらした。モル過剰のｍｉＲ−１５ａタギングプローブ（１：５モル比（中塗りの菱形））も、特異的な終点シグナルをもたらしたのに対し、ＰＣＲ反応におけるＮＴＣからは、蛍光シグナルは検出されなかった。 図７は、ｍｉＲ−１５ａ タギングプローブおよび最良の形態のＬＮＡ改変検出プローブを使用する、Ｔｏｒｕｌｌａ酵母全ＲＮＡの複合バックグラウンドにスパイクされたヒトｍｉＲ−１５ａ標的配列のためのリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを、２．４μＭ（中空きの四角形）および１μＭ（中空きの丸）の濃度で１０μｇの酵母全ＲＮＡにスパイクし、それぞれ、等モルの濃度でｍｉＲ−１５ａタギングプローブとアニーリングさせ、それに続いて、連結および定量リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−１５ａ検出を行った。最も高い蛍光シグナルが、ｍｉＲ−１５ａ標的配列対照（複合酵母全ＲＮＡバックグラウンド（中塗りの四角形）を含まない）から観察されたのに対し、蛍光シグナルは、酵母全ＲＮＡサンプル（垂直線）からは検出されなかった。ＮＴＣ（×印）で実証される通り、リアルタイムＰＣＲアッセイのコンタミネーションは観察されなかった。 図８は、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。配列特異的ＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブは、アニーリングされ、連結され、その後、連結された鋳型は、負の対照（×印）として鋳型を抜く、リアルタイムＰＣＲ、アンカーＰＣＲプライマー、およびＳＹＢＲグリーン検出を使用して（中塗りの四角形）検出された。この反応の特異性は、リガーゼを含まない反応を使用して試験された（中空きの菱形）。 図９は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図９は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図１０は、ＤＮＡ、ＬＮＡ、およびＲＮＡヌクレオシドの構造を示す。 図１１は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図１１は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図１１は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図１２は、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンおよびＬＮＡ ２−チオチミジンヌクレオシドの構造を示す。 図１３は、３つの異なる対のｍｉＲ−１５ａ タギングプローブとのｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結を使用する、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。（Ｉ； ＥＱ１６３１１／ＥＱ１６４５２、ＩＩ； ＥＱ１６４５３／ＥＱ１６３０７、およびＩＩＩ； ＥＱ１６４４７／ＥＱ１６３０７））。対Ｉ：ｍｉＲ−１５ａ鋳型（中塗りの四角形）、鋳型無し（中空きの四角形）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ無し（開いた菱形）、対ＩＩ：ｍｉＲ−１５ａ鋳型（中塗りの三角形）、鋳型無し（開いた三角形）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ無し（点線）、対ＩＩＩ：ｍｉＲ−１５ａ鋳型（中塗りの丸）、鋳型無し（開いた丸）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ無し（黒線）。 図１４は、ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にする連結およびＬＮＡ ２，６−ジアミノプリン−増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ） ｍｉＲ−１５ａ検出プローブによる、ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する改良された検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。検出プローブ ＥＱ１６５８０ 中塗りの四角形、ＥＱ１６５８１ 中塗りの三角形、ＥＱ１６５８２ 中塗りの丸、およびＥＱ１６５８３ ×印、ならびに相当する鋳型無しの対照；ＥＱ１６５８０ 中空きの四角形、ＥＱ１６５８１ 中空きの三角形、ＥＱ１６５８２ 中空きの丸、およびＥＱ１６５８３ 黒線。 図１５は、ヒトｍｉＲ−１５ａリアルタイム定量ＰＣＲアッセイのための標準曲線である。ＬＮＡ改変ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブＥＱ１６３１１／ＥＱ１６４５２（対Ｉ）を、ｍｉＲ−１５ａを鋳型にする連結反応に使用した。ただし、ヒトｍｉＲ−１５ａ鋳型の濃度は、それぞれ、５０、５、０．５、０．０５、または０．００５ｎＭであった。その後、負の対照として鋳型を抜く、アンカーＰＣＲプライマー、およびｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１５８６６によるリアルタイムＰＣＲを使用して、連結された鋳型を検出した。鋳型コピー数の対数に対してサイクル閾値をプロットすることは、標準の曲線を生成するために使用された。 図１６は、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応、および、異なるＬＮＡで改変されたアンカー付けされたタギングプローブ、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用する、ヒトｍｉｒ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する検出を実証するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。３つの異なる対のｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ タギングプローブ：対ＩＶ：ＥＱ１６５９１／ＥＱ１６３１１、ｍｉＲ−１５鋳型（中塗りの四角形）、鋳型無し（黒い標識）；対Ｖ：ＥＱ１６５９１／ＥＱ１６３１４ ｍｉＲ−１５鋳型（中塗りの菱形）、鋳型無し（開いた三角形）；および対ＶＩ：ＥＱ１６５８９／ＥＱ１６３１４ ｍｉＲ−１５鋳型（中塗りの丸）鋳型無し（黒線）が、選択された。中空きの丸は、ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス無しの対照を表す。 図１７は、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリン−増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ） ｍｉＲ−１５ａ検出プローブを使用する、ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応によるヒトｍｉＲ−１５ａの向上された検出を実証するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。異なる二重標識された検出プローブは、以下の通りに示される：ＥＱ１６５８０（中塗りの三角形）、ＥＱ１６５８１（中塗りの四角形）、ＥＱ１６５８２（中塗りの四角形）検出プローブ、および鋳型無しの負の対照（実線）。 図１８は、ヒトｍｉＲ−１５ａリアルタイム定量ＰＣＲアッセイに対する標準曲線である。ヒトｍｉＲ−１５ａのためのＬＮＡ改変ｍｉｃｒｏＲＮＡタギングプローブＥＱ１６６２４／ＥＱ１６６２０（対ＶＩＩ）を、逆転写プライマー（ＲＴタギングプローブ）および第２鎖タギングプローブとして使用した。ｍｉＲ−１５ａ鋳型濃度を、それぞれ、５０、５、０．５、０．０５、または０．００５ｎＭに変えて、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。その後、ｍｉＲ−１５ａを、アンカーＰＣＲプライマーと、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡのためのＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブ（ＥＱ１６５８２）を使用するリアルタイムＰＣＲを使用して検出した。鋳型コピー数の対数に対してサイクル閾値をプロットすることは、標準の曲線を生成するために使用された。 図１９は、様々なアニーリング温度、６０℃（中塗りの三角形）、５５℃（中塗りの四角形）、および５０℃（中塗りの菱形）を使用する、ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応によるヒトｍｉＲ−１５ａの検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス無しの対照、および鋳型無しの負の対照については、シグナルは検出されなかった。 図２０は、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応、および、異なるＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用する、ヒトｍｉｒ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。異なる二重標識された検出プローブは、以下の通りに示され：ｍｉＲ−１５ａを鋳型にするリアルタイムＰＣＲおよび検出プローブＥＱ１６５８２（中塗りの三角形）、スクランブル化されたｍｉＲ−１６を鋳型にするリアルタイムＰＣＲおよび検出プローブＥＱ１６５８２（開いた三角形）、ｍｉＲ−１５ａを鋳型にするリアルタイムＰＣＲおよび検出プローブＥＱ１６６７９（中塗りの丸）、スクランブル化されたｍｉＲ−１６を鋳型にするリアルタイムＰＣＲおよび検出プローブＥＱ１６６７９（開いた丸）、シグナルは、ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス無しの対照および鋳型無しの負の対照については検出されなかった。 図２１は、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴおよびＰＣＲ反応、ＬＮＡで改変されたアンカー付けされたタギングプローブ、およびＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブを使用する、ヒトｍｉｒ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。サンプルは、以下の通りに示される：ｍｉＲ−１５ａを鋳型にするリアルタイムＰＣＲ（中塗りの三角形）、スクランブル化されたｍｉＲ−１６を鋳型にするリアルタイムＰＣＲ（中塗りの四角形）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ無しの負の対照（中空きの四角形）、および鋳型無しの負の対照（中空きの三角形）。 図２２は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２２は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２２は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２２は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２３は、ＬＮＡ ２，６−ジアミノプリンで増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ｍｉＲ−１５ａ検出プローブを使用する、ｍｉｃｒｏＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応によるヒトｍｉＲ−１５ａの向上された検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。このグラフは、ｍｉＲ−１５ａ標的配列と７２％の配列同一性を有するｍｉＲ−１６標的（中塗りの三角形）と比較した、ｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的（開いた丸）を表す。負の対照が、ｍｉｃｒｏＲＮＡブロックタギングプローブ無し（開いた三角形）、第２鎖ＬＮＡタギングプローブ無し（中塗りの四角形）、およびＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’エキソ−）酵素無し（中空きの四角形）であったのに対し、Ｃｔ値は、リアルタイムＰＣＲ反応における、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａリバースプライマー２無しの対照（線）またはＱｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ無しの対照（線）については、検出可能ではなかった。 図２４は、ヒトｍｉＲ−１５ａリアルタイム定量ＰＣＲアッセイに対する増幅プロットおよび標準曲線（小さいグラフ）である。ＬＮＡ改変ヒトｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ タギングプローブＥＱ１６９５およびＥＱ１６６２４（対ＩＸ）を、捕捉として３’でブロックされたＬＮＡ−改変 タギングプローブを用いるｍｉＲ−１５ａを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。ただし、成熟したヒトｍｉＲ−１５ａ鋳型は、個々の反応において、それぞれ５００、５０、５、０．５、または０．０５ｆｍｏｌであった。鋳型は、その後、アンカーＰＣＲプライマーと、負の対照として鋳型を抜くｍｉＲ−１５ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する、ＬＮＡで改変された二重標識された検出プローブＥＱ１５８６６によるリアルタイムＰＣＲを使用して検出された。鋳型コピー数の対数に対してサイクル閾値をプロットすることは、標準の曲線を生成するために使用された。 図２５は、ＬＮＡ検出プローブ、１μＬ ｃＤＮＡ鋳型（中塗りの四角形）、５μＬ ｃＤＮＡ鋳型（中空きの四角形）、および鋳型無しの負の対照（開いた三角形）を使用する、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲ反応の検出を実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。 図２６は、ｈｓａ ｍｉＲ−７ａを鋳型にするＲＴ−ＰＣＲの検出が、十分な量のシグナルおよび１８．５のＣｔ値と共にＳ字形増幅プロット線を生じることを実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。 図２７は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２７は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２８は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２８は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図２９は、Ｈｓａ ｍｉＲ−１５ａ前駆体配列の一部、成熟したＨｓａ ｍｉＲ−１５ａ配列、および配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。 図３０は、Ｈｓａ ｍｉＲ−１４３前駆体配列の一部、成熟したＨｓａ ｍｉＲ−１４３配列、および配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。 図３１は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示である。 図３２は、ヒトｍｉＲ １４３ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に対するリアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。このアッセイは、図３１における概略図に従って、実施例３０に記載される通りに実施された。中空きの四角形は、実施例３０のステップ２で精製を行う反応に相当し、閉じられた四角形は、実施例３０のステップ２で精製を行わない反応に相当する。ベースラインから上昇しない曲線は、「ｍｉＲ無し」の対照に相当する。 図３３は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。 図３４は、Ｈｓａ ｍｉＲ−１４３前駆体配列の一部、成熟したＨｓａ ｍｉＲ−１４３配列、および配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。 図３５は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡへのＲＮＡアダプターの連結、それに続く逆転写、およびクエンチャーＱ２と共にＬＮＡ改変された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲを実証する、リアルタイム定量ＰＣＲ増幅プロットを示す。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ 中空きの四角形、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ 中塗りの四角形、ｍｉＲＮＡ無し 中空きの三角形、およびＰＣＲ鋳型無しの対照 中塗りの三角形。 図３６は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。 図３７は、配列特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉｃｒｏＲＮＡの定量化のための本発明の一方法の模式的な表示を示す。

Claims (51)

  1. 複数のヌクレオシド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの非コードＲＮＡを、単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉するための方法。
  2. 次のステップ：
    ａ）オリゴヌクレオチド捕捉プローブと、非コードリボ核酸配列を接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列が、非コードＲＮＡにおける配列と相補的である、
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ中の残りのヌクレオチド配列（アンカーヌクレオチド配列）と相補的な鎖を合成するステップ、
    ｃ）形成された二本鎖を固体支持体上に固定させ、標的サンプルを富化し、それに続いて固体支持体から標的配列を解放させるステップ、
    ｄ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としての捕捉プローブにおけるアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写によって、非コードリボ核酸に対して相補的なＤＮＡ鎖を合成するステップ、
    ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
    ｆ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化するステップ、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 次のステップ：
    ａ）標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成するステップ、
    ｃ）固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化するステップ、
    ｄ）逆転写酵素と、プライマーとしての捕捉プローブとを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成するステップ、
    ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
    ｆ）ＤＮＡポリメラーゼと一対のプライマーとを使用して、標的配列を鋳型にするＰＣＲ増幅を実施するステップ、および、
    ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、このようにして得られた核酸を定量化するステップ、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  4. ａ）標的ヌクレオチド配列を、それぞれ、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなる２つのオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的配列と相補的であり、第１のタギングプローブの認識配列が、標的配列の第１の領域とハイブリダイズし、第２のタギングプローブの第２の認識配列は、標的配列の第１の領域に隣接する標的配列の第２の領域とハイブリダイズする、
    ｂ）ハイブリダイズしたタギングプローブの２つの隣接する認識配列を共有結合的に連結によって繋げ、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列および２つのアンカーヌクレオチド配列を含む、近接するヌクレオチド配列を形成すること、および、
    ｃ）アンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって、連結されたオリゴヌクレオチド分子を定量化すること、
    によって、核酸サンプル内の標的ヌクレオチド配列を定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. ａ）標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
    ｃ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成すること、
    ｄ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
    ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること、
    によって、核酸サンプル内の低分子非コードＲＮＡ配列を定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ヌクレオシド類似体がＬＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの非コードＲＮＡの単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのキットであって、反応体および１つまたは複数の改変されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
  8. 改変されたオリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオシド類似体を含有する、請求項７に記載のキット。
  9. ヌクレオシド類似体がＬＮＡである、請求項８に記載のキット。
  10. 最高でも長さが１００ヌクレオチドである、短い長さのＲＮＡの定量測定のための方法であって、
    ａ）前記の短い長さのＲＮＡを含むサンプルから、１）前記の短い長さのＲＮＡの配列、その相当するＤＮＡ配列、または前記の短い長さのＲＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖標的配列、および２）５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、
    ｂ）逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの鎖を得ること、および
    ｃ）鋳型として前記ｃＤＮＡと所望により鋳型ポリヌクレオチドを含む定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施すること
    を含む方法。
  11. ステップｃにおいてｑＰＣＲのために使用されるプライマーが、
    −少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、５’または３’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である、
    −少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の近接する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である、
    −少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、１つは、一本鎖標的配列内の第１のヌクレオチド配列に相当し、もう１つは、一本鎖標的配列内の第２のヌクレオチド配列と相補的である、
    から選択され、ｑＰＣＲのために使用される前記プライマーが、それぞれ独立に、検出可能な標識を含みうる、請求項１０に記載の方法。
  12. ステップ（ｂ）における反応が、一本鎖標的配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、あるいは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の近接する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、逆転写プライマーまたはＤＮＡ重合プライマーを利用する、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記逆転写プライマーまたはヌクレオチド重合プライマーが、少なくとも１つの短い長さのＲＮＡに対して特異的である、請求項１２に記載の方法。
  14. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、同一のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、共有結合的に結合される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、非共有結合的に結合される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、検出可能な標識を含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、酵素反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非酵素的な反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、サンプルＲＮＡが得られる生物中に天然には存在しない、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非哺乳類のものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列の、短い長さのＲＮＡへの連結による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、あるいはステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列を、ターミナルトランスフェラーゼ反応において、好ましくはポリ−Ａトランスフェラーゼ反応において、短い長さのＲＮＡに連結することによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 連結が、オーバーハングライゲーションおよび平滑末端ライゲーションから選択され、好ましくはオーバーハングライゲーションである、請求項２２に記載の方法。
  24. 小さいＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端に直接隣接する５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端が、オーバーハングライゲーションを可能にするように配置されるように、５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であり、短い長さのＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドの、短い長さのＲＮＡへのアニーリングを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. サンプル中のすべてのＲＮＡが、連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応にかけられる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応が、標的配列の３’末端のみで実施される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 標的配列の５’末端への連結が、連結反応の前に、標的配列の５’末端をリン酸化することによって実施される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 連結の前に、５’隣接ヌクレオチド配列が、その５’末端でブロックされ、３’隣接ヌクレオチド配列が、その３’末端でブロックされる、請求項２２〜２７のいずれか一項の方法。
  29. ５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、規定されたプロセッシング状態の、ステップ（ａ）における前記短い長さのＲＮＡと優先的または独占的に結合される、請求項１０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ＲＮＡの規定されたプロセッシング状態が、成熟した状態である、請求項２９に記載の方法。
  31. ステップ（ｂ）が、ｃＤＮＡを得るための鋳型ポリヌクレオチドの逆転写を含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ステップ（ａ）が、隣接するヌクレオチド配列を付着するためのヌクレオチド重合のステップを含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  33. 重合が、鋳型に依存しないポリメラーゼおよび鋳型に依存するポリメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼによって達成される、請求項３２に記載の方法。
  34. ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項３３に記載の方法。
  35. 重合が、標的配列の３’末端へのポリ−Ａ、ポリ−Ｇ、ポリ−Ｔ、またはポリ−Ｃテールの付加にある、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. ステップ（ａ）が、以下のステップ
    −その５’末端が短い長さのＲＮＡの３’末端と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの３’末端をアニーリングするステップと、
    −鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された短い長さのＲＮＡ分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのＲＮＡを伸長するステップと、
    による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ヌクレオチド重合が、鋳型ポリヌクレオチドを構成するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを得るためにＤＮＡ重合を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. ステップ（ｂ）が、（Ｉ）所望により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブにアニーリングしていない材料の除去の後、ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を逆転写させることを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 逆転写におけるプライマーが、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたは別の逆転写プライマーである、請求項３８に記載の方法。
  40. ステップ（ａ）が、
    −その３’末端が短い長さのＲＮＡの５’と相補的でありその５’末端が５’隣接ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの５’末端をアニーリングするステップと、
    −鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのＲＮＡを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップと、
    による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップ（ｂ）が、短い長さのＲＮＡが、伸長された捕捉プローブから除去され、捕捉プローブが、３’隣接ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに、その３’末端でアニーリング可能にされ、捕捉プローブが、ｃＤＮＡを得るために、鋳型としてヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ重合によって、５’→３’方向にさらに伸長されることを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 捕捉オリゴヌクレオチドが、固体支持体上への固定化を可能にする部分を含有する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 非アニーリング材料の除去を可能にするために、捕捉プローブが、アニーリングの後に固定される、請求項４２に記載の方法。
  44. ステップ（ａ）におけるサンプルが、短い長さのＲＮＡについて富化される、請求項１０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ステップ（ｃ）が、改変されたヌクレオチドを含む検出プローブの使用を含む、請求項１０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項４５に記載の方法。
  47. 検出プローブが、短い長さのＲＮＡ内の配列に相当する、あるいはこの配列に相補的である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 逆転写あるいはＤＮＡ重合に使用されるプライマーが、改変されたヌクレオチドを含む、請求項１０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項４８に記載の方法。
  50. ステップ（ｃ）におけるｑＰＣＲで使用される少なくとも１つのプライマーが、ステップ（ｂ）の逆転写またはヌクレオチド重合で使用されるプライマーによって構成される、請求項１０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 最高でも１００ヌクレオチドの長さである、短い長さのＲＮＡの定量測定に有用なキットであって、
    −請求項１０から５０のいずれか一項に記載の方法において使用される、最小数の逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブ、ここで、逆転写プライマー、ヌクレオチド重合プライマー、ｑＰＣＲのためのプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプローブは、請求項１１〜５０のいずれか一項で定義した通りである、ならびに
    −逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する、短い長さのＲＮＡの定量測定のための指示書
    を含むキット。
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