KR20020034161A - 불충분한 핵산 서열의 증폭방법 및 그 방법의 수행장치 - Google Patents

불충분한 핵산 서열의 증폭방법 및 그 방법의 수행장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플에서 핵산 서열을, 특히 상기 샘플에서 초기에 불충분하게 나타나는 핵산서열을 효과적으로 증폭하기 위한 핵산 프라이머들과 그들을 함유하는 키트들 및 방법에 관한 것이다.

Description

불충분한 핵산 서열의 증폭방법 및 그 방법의 수행장치{A METHOD FOR AMPLIFYING LOW ABUNDANCE NUCLEIC ACID SEQUENCES AND MEANS FOR PERFORMING SAID METHOD}
게놈 및 발현서열태그(EST) 서열화 프로젝트로부터 얻은 DNA 서열 정보는 유전자 산물 개개 및 집단의 제어와 행동모드를 더욱 이해하기 위한 근거를 제공할 것으로 예상된다.
이와 관련하여, 언제, 어디서 및 어느 정도로 유전자가 발현되는가를 분석하고 비교하는 것은 새롭게 확인된 유전자들의 기능적 특성화에 필수적이다.
면역계와 신경계등과 같은 여러 조직세포계들은 매우 이질적인 세포집단들로 구성되어 있다. 단서 인자는 그들의 생리현상, 및 세포 다양성의 배경에서 유전자 용도를 시험할 수 있는 능력을 발현하는 특정 유전자 산물의 역할을 이해하는 것에 있다.
과거에는 노던 블로팅과 뉴클레아제 보호검정과 같은 처리량이 낮고 고된 방법이 유전자 발현 연구에 사용되어졌다.
좀더 최근에는, 다수의 유전자의 발현을 동시에 분석하는 여러가지 방법들이 개발되고 있다.
그러나, 이들 기술 모두는 비교적 다량의 RNA를 필요로 하며, 일반적으로 소집단의 세포 또는 세포 개개로부터 유도된 시편들을 분석하기에 감도가 부족하다.
이것은 많은 세포 타입의 경우, 특정 세포물질을 RNA 실험법에 충분하게 얻는 것이 매우 어렵다는 사실에 강화된다. 결과적으로 여러 조사분야가 출발물질 부족으로 인하여 좌절되었다.
그러므로 그 장소에서의 잡종형성은 원상태의 조직중 유전자의 세포 발현 패턴의 상세한 정보를 제공한다. 그러나, 이 기술은 수행하기 힘들고 전체-대 또는 조직박편에서 수행될 때, 단일 표본에서 매우 소수의 전사물 이상의 분석을 허용하지 않는다.
폴리머라제 사슬반응(PCR)이, 세포질 샘플에서 특히 양호한 감도를 제공하지만 특정 유전자족과 밀접하게 관련된 소수의 유전자들로 분석이 제한되는 한배(nested)-프라이머법으로 유전자 발현을 성공적으로 조사하기 위해 사용되어지고 있다.
몇몇 기술은, mRNA의 T7 RNA 폴리머라제 증폭 및 제1 가닥 cDNA의 선(prior) 동형폴리머성 테일링 후의 PCR과 같이, 단일 세포에서 비관련 유전자 발현의 검출을 허용한다. 그러나, 이들 방법 어느 것도 소수의 유전자 이상의 분석을 허용한다는 것을 증명하지 못하며 널리 사용되지도 않는다.
전자는 기술적으로 어려우며, 후자는 긴 전사에 대해 편견을 가질 수 있으며 종종 증폭된 산물의 순차 클로닝을 요구한다.
선택적으로, 3' 말단 증폭 PCR을 사용한 단일 세포중의 발현 단면화 방법이 Dixon 등에 의해 개발되어졌다(1998, Nucleic acids research, vol.26(n 19):4426-4431). 이 방법은 세포에 존재하는 mRNA가 제 1 힐-화된 프라이머를 사용하여 역전사되고, 그것에 의해 일차가닥 cDNA의 개체군을 제공하는 제 1 단계와 부분 3' 말단 이차 cDNA 가닥 개체군이 제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 사용하여 합성되는 이차 단계로 이루어진다.
이 증폭기술을 사용하여, 본 발명자들은 단일 세포의 세포질에 함유되어 있는 mRNA에서 뉴로키닌 타입 1 수용체와 같은 콜린 내부 뉴런의 불량하게 발현된 전사 존재를 성공적으로 검출하였다.
그러나, 이 기술의 결점 중 하나는 단일세포로부터 불충분 유전자 40 개 이상의 검출을 허용하지 않는다는 것이다. 이 기술은 유전자 특이 PCR 반응에 고분자량 cDNA를 다량 발생시킨다. 이것은 PCR 분석의 감도를 감소시킬 뿐만 아니라 증폭 산물의 대부분이 유전자 서열에 대해 분석되지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명은 샘플에서 핵산 서열을, 특히 상기 샘플에서 초기에 불충분하게 나타나는 핵산서열을 효과적으로 증폭하기 위한 핵산 프라이머들과 그들을 함유하는 키트들 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 방법의 구현예 I를 이용하여 전체 RNA 100 pg으로부터 유도된 cRNA를 증폭한 후 유전자 특이서열을 검출한 것이다.
도 2는 본 발명의 방법의 두번째 (I) 및 세번째 3(II) 구현예를 이용하여 전체 RNA로부터 유도된 cRNA를 증폭한 후 유전자 특이 서열을 검출한 것이다.
도 3은 본 발명의 방법의 첫번째 및 구현예 II를 이용하여 소량의 cRNA를 증폭한 후 산물 프라이밍/산물 수복을 설명한 다이아그램이다.
도 4a와 b는 본 발명의 방법의 세번째 구현예를 사용하여 총 RNA 1000 pg으로부터 유도한 cRNA의 고엄격(high stringency) 증폭 후 유전자 특이 서열을 검출한 것이다.
도 5는 본 발명의 방법의 세번째 구현예를 사용하여 간 전체의 RNA로부터 유도된 증폭 cDNA로부터의 인비트로 전사 후 유전자 특이 서열을 검출한 것이다.
도 6은 T7 폴리머라제(상보적 RNA, 좌) 또는 T3 폴리머라제(센스 RNA, 우)의 존재하에 본 발명의 세번째 구현예에 따라 얻은 증폭 산물을 배양한 후 생산된 RNA의 크기에 따른 분포이다.
도 7A는 튜블린, RL3, 시납토타그민1 및 A2A 수용체에 특이한 프라이머를 갖는 유전자 특이 증폭 후 (세번째 구현예의 단계 (d)에 따라)얻은 증폭 산물을 시각화한 것이다.
도 7B는 T3 RNA 폴리머라제를 사용하여 인비트로에서 대응하는 센스 RNA로 전사되고, 그 다음 유전자 특히 PCR 전에 역전사된 본 발명의 세번째 구현예에 따라 얻어진 증폭 산물을 시각화한 것이다.
본 명세서를 통해 다음의 용어들은 다음과 같이 정의된다:
소량의 RNA는 최대 1000 세포, 바람직하기는 1 ~ 100개의 세포에 존재하는 mRNA의 양을 말하며, 일반적으로 주어진 세포에서 어느 주어진 mRNA의 1 ~ 100의 복사이다.
샘플에 존재하는 mRNA 종들에 해당하는 핵산 서열의 수의 증가는 다음 방법중 적어도 하나를 허용하기에 충분한 복사의 수를 얻기 위해 핵산 서열의 증가를 나타내기 위한 것이다:
(ⅰ) 특정 올리고핵산 탐침을 이용한 관심있는 서열 검출;
(ⅱ) 특정 올리고핵산 프라이머를 이용한 관심있는 서열 증폭;
(ⅲ) 복제 및/또는 발현 벡터에서 얻어진 DNA 분자들의 클로닝; 또는
(ⅳ) 임의로 비표지 또는 표지 기질을 사용한 추가의 역전사의 잡종형성 후 유전자 특이 PCR 분석을 위한 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
샘플은 분석할 mRNA를 함유하는 선정된 재료를 의미한다. 예를 들면 1 ~ 100 세포에서 얻은 세포추출물.
고분자량 DNA는 천연 mRNA에서 관찰되는 예상 분자량 범위 이외의 어느 핵산종을 의미한다. 바람직하기는 5kb 이상의 크기를 갖는 어느 핵산서열이다.
본 발명자들은 관심있는 하나 또는 몇몇 mRNA의 검출 및 클로닝을 허용하는, 샘플에 존재하는 mRNA 종, 특히 분석될 샘플에 카피수(copy number)가 적은 초기 존재하는 mRNA를 검출하고 증폭하는 민감한 방법을 개발하였다.
예를 들면, 본 발명의 새로운 방법을 콜린성 뉴론에서 얻은 mRNA 샘플에 적용하였을 때, 본 발명자들은 종래의 방법에서 가능한 것보다 50 배 낮은 수준에서 불충분 A1 수용체 mRNA의 발현을 검출하는데 성공하였다. 그 밖에, 본 발명의 방법을 총 RNA 2.5 ng(약 250 세포에 함유된 것과 동량)에 적용하였을 때, 특정 유전자 서열을 최종산물의 백만분의 일을 사용하여 검출할 수 있었다.
또한, 본 발명은 분석될 샘플에서 초기에 소수로 존재하는 mRNA 종에 대응하는 핵산 서열의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
그 밖에, 이 기술은 예를 들면, 단일 세포에서 유전자의 발현을 분석하는 것을 포함하는, 극히 적은 샘플에서 유전자 발현을 분석하기 위해 분석 또는 유전자 칩이 사용되어지는 고처리 분석 시스템을 허용한다.
또한, 본 발명은 이들 방법을 수행하는데 필요한 여러가지 기술적 방법들, 및 특히, 본 발명의 방법을 수행하는데 요구되는 올리고핵산 프라이머에 관한 것이다.
추가로, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 수행하기 위해 특별히 고안된 키트, 특히 상기의 올리고핵산 프라이머를 함유하는 키트로 이루어진다.
샘플에 존재하는 소량의 RNA를 증폭하는 세 가지 다른 방법을 발견하였고, 이들 방법을 이하에 각각 상세히 기술하였다. 그러므로, 증폭방법은 몇몇 예에서 관심있는 샘플에 존재하는 모든 mRNA를 증폭하는 것을 허용한다. 또한, 소량의 mRNA를 증폭하는데 요구되는 약제들과 올리고핵산염 프라이머들을 상세히 기술하였다.
구현예 I
증폭법의 구현예 I은 고분자량 DNA 분자들을 샘플에 존재하는 초기 mRNA 종의 역전사를 통해 얻은 cRNA 종을 증폭하여 생성하는 것을 이용한다. 본 발명자들은 이들 고분자량 DNA 분자들 또는 가교 산물들이, 어닐링 단계에서 부분적으로 이중화된 DNA 분자의 형성 결과임을 발견하였다. 이들 부분적으로 이중화된 DNA분자들은 사용된 비엄격 잡종형성 조건하에서 서로와 잡종형성되므로, 증폭 혼합물에 함유된 두개의 구조적으로 관련된 또는 비관련된 증폭 cDNA 분자 사이에 가교가 형성된, 부분적으로 상보적인 서열을 함유한다. 반복적인 증폭 순환은 큰 핵산분자를 생성한다. 더우기, 구현예 I은 관심있는 증폭종을 분석하기 위해 상기 방법으로 생산된 고분자량 DNA를 사용한다.
구현예 I은 특히 이들 고분자량 DNA 분자의 생산의 증가에 따라, 분석되어질 샘플에 소량으로 존재하는 mRNA의 증폭을 허용하는 방법을 제공하는데 상기의 발견을 이용한다.
더욱 정확하게는, 샘플 중 소량으로 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법으로서,
(a) 제 1 힐-화된(heeled) 프라이머 개체군을 사용한 상기 mRNA를 역전사시켜 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
(b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 사용한 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 일차 및 이차 cDNA 가닥을
(ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐(heel) 서열의 적어도 일부를 포함하는 제 1 프라이머; 및
(ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머를 사용하여, 내열성 DNA 폴리머라제의 도움으로 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계로 이루어지되,
d') 고분자량 DNA 분자의 비율이 증가하는 단계;
e') 고분자량 DNA 분자에 존재하는 특이 핵산 서열을 사용 또는 분석하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법이 기재되어 있다.
프라이머
"힐-화된" 프라이머라는 용어는 본 분야에서, 잡종형성영역과 비-잡종형성영역으로 이루어진 프라이머라고 쉽게 이해될 것이며, 여기서 비-잡종형성영역을 프라이머의 "힐"이라고 나타낸다.
제 1 힐-화된 프라이머는 실질적으로 개개의 프라이머 종들의 집단이다. 제 1 힐-화된 프라이머 개체군은 각각 5' 말단에서부터 3' 말단으로 다음으로 이루어진 핵산 서열의 개체군으로 이루어진다.
(ⅰ)샘플에 초기 존재하는 mRNA 분자들과 잡종형성하지 않는 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
(ⅱ) 15 ~ 25 길이의 올리고 dT 서열;
(ⅲ) 반드시 티미딘이 아닌(A, C 또는 G) 뉴클레오티드; 및
(ⅳ) 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열.
단계 (ⅲ) 및 (ⅳ)에 기재된 성분들은 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자와 잡종형성될 수 있으며, 여기서 실제적으로 가능한 모든 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견된다.
제 1 힐-화된 프라이머의 특정 구현예에서, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열은 다음의 가변 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다:
5'-(A 또는 G 또는 C)-N1-3-, 여기서 N은 A, T, C 또는 G에서 선택된 뉴클레오티드.
바람직하기는 유리한 선택에서, 제 1 힐-화된 프라이머는 또한 예를 들면 T7, T3 또는 SP6 프로모터와 같은, 올리고 dT 서열과 힐 사이에 위치하는 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함한다.
제 2 힐-화된 프라이머는 또한 개개의 프라이머 종들의 개체군이다. 일차 가닥 cDNA 개체군이 알맞는 잡종형성 조건하에서 접촉할 때, 각각의 cDNA 종들은 적어도 하나의 제 2 힐-화된 프라이머와 잡종형성될 것이며, (제 2 힐-화된 프라이머드 중 뉴클레오티드 서열의 선택 때문에 부분적으로), 그 다음 이차 cDNA 가닥 합성이 잡종형성된 이차 프라이머로부터 5' 에서 3' 방향으로 진행된다.
제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 뉴클레오티드 염기들이 최대 5개까지 다른(잡종형성영역의 차이) 프라이머들로 이루어질 수 있으며, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 바람직하기는 범위 1000 ~ 100,000개의 프라이머, 더욱 바람직하기는 1024 ~ 65536 개의 프라이머로 구성된다. 이것을 얻기 위해, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 프라이머들은 각각 3' ~ 힐까지 4 ~ 7 뉴클레오티드 범위의 뉴클레오티드의 일차 가변서열 및 그와 함께 3'에서 접촉하는 적어도 5 뉴클레오티드의 이차 가변서열로 이루어진다.
알 수 있는 바와 같이, 5개의 랜덤 뉴클레오티드가 있는 경우 45(즉 1024)개의 펜타머 서열이 가능한다.
상기 프라이머의 이차 가변서열은 전사 cDNA 종으로 잡종형성되기 위해 전체적으로 제 2 힐-화된 프라이머의 가능성을 촉진하기 위해 알려진 서열의 서열분석에 의해 선택될 수 있다. 서열분석은 DNA 또는 RNA 서열의 데이타베이스를 통해 수행될 수 있다. 특히, 바람직하기는 관심있는 유기체의 알려진 서열을 참조로 한다. 바람직하게, 뉴클레오티드의 이차 가변서열은 2 ~ 10 개 범위의 뉴클레오티드로 이루어진다. 특히 바람직한 구현예에서, 뉴클레오티드의 이차 가변서열은 이 프라이머의 일차 가변서열 중의 뉴클레오티드의 수와 같은 수의 뉴클레오티드로 이루어진다.
제 2 힐-화된 프라이머들의 이차 가변 뉴클레오티드 서열은 이들 프라이머들의 개체군을 통해 조사될 수 있고 프라이머들을 안정화시키고 표적 일차가닥 cDNA로의 잡종형성 최적화가 확실하도록 선택될 것이다.
바람직한 구현예에서, 이차 프라이머 개체군으로부터 제 2 힐-화된 프라이머들은 바람직하게 일차가닥 cDNA종의 매 1 kb 마다 평균 한번씩 잡종형성된다.
이차 프라이머중 특히 바람직한 뉴클레오티드의 이차 가변서열은 다음과 같다:
5'-CGAGA-3', 5'-CGACA-3', 5'-CGTAC-3' 및 5'-ATGCG-3'
제 1 및 제 2 힐-화된 프라이머의 비잡종형성 영역은 바람직하기는 mRNA 또는 일차가닥 cDNA와 잡종형성되는 능력이 부족하도록 선택된다. 이차 프라이머의 잡종형성 또는 가변서열 영역과 같이, 힐 영역은 알려진 뉴클레오티드 서열을 분석함에 의해 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, 힐 영역은 바람직하게 샘플 중 mRNA 종이 없는 서열로 이루어진다. 그러나, 힐 영역은 단순히 샘플을 취한 유기체의 게놈이 없는 서열로 이루어질 수 있다. 힐 영역은 바람직하게 15 ~ 22개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 18 ~ 20 뉴클레오티드로 이루어질 것이다.
바람직하게, 힐 서열은 약 50%의 GC 성분을 갖는 핵산서열 중에서, 또는 예를 들면 힐 서열의 약 43 ~ 55%로 선택된다.
특히 바람직한 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 힐 서열은 다음의 SEQ.ID No. 1의 핵산이다:
5'-CTGCATCTATCTAATGCTCC-3'
방법
역전사 방법에 사용된 특정 온도, 효소 및 시약들(제 1 힐-화된 프라이머와 다른)은 본 분야에 이미 알려져 있다.
바람직하게, 단계 (a)는 역전사효소 존재하에 37 ℃에서 수행된다.
개개의 제 2 힐-화된 프라이머 개체군 종들이 주어진 길이의 핵산에 따라 잡종형성되는 빈도는, 적용되는 적당한 잡종형성조건에 의해 조절된다. 바람직하기는, 잡종형성조건은 표적 cDNA에 일차 가변서열이 효과적으로 잡종형성 되도록 엄격히 제한된다. 제 2 힐-화된 프라이머에서 엄격성 및 접촉하는 랜덤 염기들의 수는, 주어진 길이의 핵산물질에 따라 제 2 힐-화된 프라이머의 원하는 잡종형성빈도를 얻기 위한 반복적인 시도 및 에러에 따라 변할 것이다.
더욱 바람직하기는, 제 2 힐-화된 프라이머와 단계 (a)에서 얻어진 일차 cDNA 가닥사이의 잡종형성 조건은 덜 엄격하다.
단계 (b)에서, 이차 cDNA 가닥의 합성은 적당한 연장 완충용액의 존재하에 DNA 폴리머라제, 바람직하기는 Taq 폴리머라제의 존재하에 수행된다.
바람직하게, 완충용액에 첨가되는 제 2 힐-화된 프라이머의 양은 연장반응 완충용액 중 0.01 ~ 10 ng 사이이다.
특히, 어닐링 완충용액은 마그네슘을, 일반적으로 최대 6 mM, 바람직하기는 1.5 ~ 6 mM, 가장 바람직하기는 약 4.5 mM의 농도로 포함할 것이다.
연장 완충용액 중의 마그네슘의 농도가 4.5 mM로 조절된 경우, 제 2 힐-화된 프라이머와 일차 cDNA 가닥간의 어닐링 온도는 약 50 ℃이며, 적당한 DNA 폴리머라제의 존재하에서의 연장온도는 약 72 ℃이다.
단계 (b)의 마지막에 생성된 cDNA 분자들은 불충분 mRNA 종이 더욱 풍부한 mRNA 종과 같이 효과적인 동일 수준으로 역전사됨에 따라, 샘플에서 mRNA 분자들의 스펙트럼을 나타낸다.
단계 (c):
단계 (c)의 증폭반응은 각각 상기 정의된 제 1 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부로 이루어진 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머들로 수행된다.
단계 (c)의 일차 프라이머는 바람직하게 제 1 힐-화된 프라이머의 힐이다.단계 (c)의 이차 프라이머는 바람직하게 제 2 힐-화된 프라이머의 힐이다.
단계 (c)의 이차 프라이머는 제 2 힐-화된 프라이머와 동일하며, 유리하게는 구현예 I의 수행에 필요한 시약의 수를 감소시킬 수 있다.
그 밖의 선택은 유일한 프라이머로서 제 2 힐-화된 프라이머를 사용하는 것이다.
단계 (c)의 증폭반응은 덜 엄격한 잡종형성조건을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 증폭반응은 일반적으로 최대 5 mM, 바람직하기는 4 mM ~ 5 mM 및 가장 바람직하기는 약 4.5 mM 농도의 마그네슘의 존재하에 수행된다. 후자의 마그네슘 농도에서 각 증폭 순환은 92 ℃에서의 변성단계, 60 ℃에서의 어닐링 단계 및 72 ℃에서의 연장단계로 이루어진다.
유리하게는, 단계 (c)의 증폭반응은 30 ~ 50 증폭순환, 및 더욱 바람직하기는 약 40 증폭순환으로 이루어진다. 그러나, 다른 순환횟수를 예상할 수 있다. 순환의 최적횟수에 요구되는 하나의 파라미터는 사용하는 폴리머라제에 의해 결정된다.
방법의 추가단계의 첫번째 열에서, cDNA는 cDNA의 적당한 농도가 샘플에 존재한다면 단계 (c) 직후, 또는 예를 들면 이하 상세히 논의되어질 단계 (d'), 단계 (d) 및 단계 (e)를 거친 추가의 증폭 후, 인비트로 전사될 것이다. 이와 관련하여, 단계 (a), (b) 및/또는 (c)에서 사용되는 프라이머 중 적어도 하나가 T7 RNA 폴리머라제 촉진제와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 갖는 것이 필수적이다. 생성된 RNA는 이후 예를 들면, 역전사중 표지화되고 DNA 배열로 잡종형성되는 추가 진행단계를 겪을 수 있다. 선택적으로, 표지된 기질이 존재 또는 존재하지 않을 때 생성된 cDNA를 유전자-특이 PCR 실험에 이용할 수 있다.
단계 (d')
단계 (d')의 바람직한 구현예에서, 단계 (d')는 아래의 단계 (d) 및 (e)의 결합이다.
단계 (d)
단계 (c)의 마지막에서 "가교 산물"을 포함하는 증폭된 DNA 분자들의 개체군을 함유하는 반응 혼합물을 희석하여 cDNA농도가 단계 (c)의 산물의 cDNA 농도보다 2 ~ 100 x 묽은 cDNA를 함유하는 희석된 cDNA를 얻었다. 바람직하게, 희석된 cDNA의 농도는 단계 (c)의 마지막에서 얻어지는 반응 혼합물중 발견되는 초기 cDNA 농도보다 약 2 ~ 100배, 가장 바람직하기는 약 40 ~ 80 배 묽다. 이 희석단계는 증폭 혼합물에 초기에 첨가된 프라이머들을 거의 완전히 제거하기 때문에 본 방법의 추가단계를 수행하는데 필수적이다. 검출되어질 초기 유전자 서열의 일부가 아닌, 프라이머들 대부분의 제거는, 추가 증폭 단계에서 도입되어질 임의 요소를 줄인다. 임의요소들은, 덜 엄격한 조건의 적용하에서 발생하는, 잘못된 잡종형성을 일으킨다.
단계 (e)
바람직하게 단계 (e)는 단계 (d)의 희석 cDNA 용액에 내열성 DNA 폴리머라제를 첨가하는 것 및 추가의 프라이머를 첨가함 없이 추가의 증폭반응 순환을 수행하는 것으로 이루어진다.
DNA를 희석한 다음, 단계 (e)의 증폭은 단계 (d)에서 얻은 희석 cDNA에 어느 프라이머도 첨가하지 않고 수행된다. 외인성 프라이머가 첨가되지 않으므로, 어닐링 단계에서 희석 cDNA 용액중 초기에 존재하는 기타 증폭 DNA분자들 간에 잡종형성이 일어나며, 이것은 그 후 생성된 이중 연장 DNA분자가 각 증폭 순환의 마지막에서 변성되기 전에 연장된다.
어느 특정 이론과 관련 없이, 단계 (e)의 "자동 프라이밍(self priming)" 증폭은 고분자량의 가교 DNA 분자들의 수를 증가시키며 따라서 샘플로부터 가교된 그러나 알맞게 증폭된 유전자 수를 증가시킨다.
바람직하게, 단계 (e)의 증폭반응은 20 ~ 40회의 증폭 순환, 더욱 바람직하기는 25 ~ 35회의 증폭순환 및 가장 바람직하기는 약 30회의 순환의 여러 증폭순환을 통해 수행된다. 그러나, 다른 순환횟수도 가능하다.
바람직하게, 단계 (e)의 증폭단계는 덜 엄격한 잡종형성조건 하에서, 단계 (c)의 증폭반응에 사용되는 잡종형성 조건보다 더 엄격한 조건에서 수행된다. 전형적으로 일반적으로 사용되는 마그네슘 농도는 최대 4.5 mM, 바람직하기는 1.5 ~ 4.5 mM 및 가장 바람직하기는 약 3.5 mM 사이이다. 이들 증폭 조건에서, 각 증폭 순환은 다음 단계들로 이루어진다:
(ⅰ)샘플을 85 ~ 95 ℃의 온도에서 배양하여 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
(ⅱ)단계 (ⅰ)에서 얻은 한가닥 DNA 분자를 55 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링 하는 단계;
(ⅲ)어닐링된 DNA 분자를 내열성 DNA를 사용하여 65 ~ 75 ℃의 온도에서 연장시키는 단계;
(ⅳ) 단계 (ⅰ)~(ⅲ)를 원하는 횟수만큼 반복순환하는 단계.
가장 바람직한 구현예에서, 단계 (e)의 증폭반응은 92 ℃의 증폭단계, 55 ~ 72 ℃사이, 예를 들면 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃ 또는 72 ℃에서의 증폭단계, 및 적당한 DNA 폴리머라제의 존재하의 72 ℃에서의 연장단계로 이루어진다.
단계 (e')
단계 (e')의 바람직한 구현예는 다음의 단계 f) 및 g)의 결합으로 이루어진다.
단계 (f)
증폭된 이형성 cDNA 분자개체군을 포함하는 증폭 혼합물은 추가로, 바람직하기는 적어도 4.5 kb길이를 갖는 고분자량 cDNA 종이 분리되는 단계(단계 f)를 겪는다.
단계 (g)
바람직한 구현예에서, 단계 (g)는 단계 (f)에서 분리된 고분자량 cDNA에 함유된 적어도 하나의 핵산서열 종의 존재를 확인하는 단계로 이루어진다.
단계 (f)에서 이미 분리된 고분자량 cDNA는 적어도 하나의 관심있는 핵산 서열의 존재를 검출하는데 쉽게 이용될 수 있다.
선택적으로, 증폭법은 단계 (f) 이후에 추가 증폭단계를 포함하며, 이것은 단계 (f)에서 분리된 고분자량 DNA 분자의 적어도 일부가 한쌍의 프라이머들을 이용한 추가의 증폭반응을 겪는 것으로 이루어지며, 여기서 일차 프라이머는 제 1힐-화된 서열의 일부를 포함하며, 이차 프라이머는 제2 힐 서열의 일부를 포함한다.
증폭법의 단계 (g)는 다음 방법 중 어느 하나를 포함한다:
(ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열 검출;
(ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열 증폭;
(ⅲ)복제 및/또는 발현벡터에서 얻은 DNA 분자들의 클로닝; 또는
(ⅳ)잡종형성 검정 또는 필요에 따라 비표지 또는 표지기질을 이용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
단계 (g)의 (ⅳ)에서, 생성된 cDNA는 인비트로 전사될 수 있다. 이와 관련하여, 프라이머 중 하나가 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 같이, RNA 폴리머라제 결합부위를 갖는 것이 필수적이다. 이후, 생성된 RNA는 예를 들면, 잡종형성 실험용 DNA 검정에 표지 및 결합되거나, 또는 표지 DNA를 생성하기 위해 필요에 따라 형광, 방사선 또는 기타방법으로 표지된 기질을 사용하여 역전사되어, 추가의 반응단계를 겪을 수 있다.
본 발명의 세 가지 구현예 중 어느 하나에서 사용된 어느 반응물의 표지화는, 비록 임의적이지만, 당업자들이 본 발명의 방법의 산물을 DNA 검정을 위해 직접 잡종형성할 수 있게 하므로 매우 유용하다.
상기 본 발명의 구현예 I에 따른 일련의 실험을 수행하는데, 본 발명자들은 "가교 서열"이 분석되어질 샘플에 존재하는 유전자에 대해 유용하고 이용할 수 있는 정보를 이미 가짐을 언급하지만, 더 나은 수득률로 개개의 유전자 서열을 얻기위해 가교 형성을 감소시키는 것이 유용하며 더 특이적으로 분석될 수 있음을 결론지었다. 그러므로 이하 기재되는 구현예 II 및 III의 단서 요소는 가능한 최대로 "가교 서열"의 형성을 막거나 또는 적어도 감소시키는 것이다. 그러므로, 구현예 II 및 III의 방법은, 상기 방법들이 "가교 서열"의 형성을 막거나 또는 감소시키며, 이후 분석될 샘플 중에 존재하는 핵산 서열의 역전사 및 증폭을 허용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
구현예 II
증폭방법의 구현예 II에서, 다수의 고분자량 DNA 분자의 생성은 절단부위, 특히 제한 엔도뉴클레아제 부위, 적어도 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열을 암호화하는 핵산 서열의 삼입에 의해 예방 또는 감소된다.
결과적으로, 본 발명의 또 다른 목적은 샘플에 소량으로 존재하는 mRNA 종에 해당하는 핵산 서열의 수를 증가시키는 방법으로 이루어지며, 여기서 상기 방법은 다음 단계로 이루어진다:
(a) 제 1 힐-화된 프라이머 종을 사용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계 ;
(b) 제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 사용하여 상기 일차가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계, 여기서 상기 제 1, 및/또는 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 각 프라이머들은 임의로 그의 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 드문 제한부위를 갖는다;
(c)단계 (b)에서 얻은 일차 및 이차 cDNA 가닥들을
(ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 제 1 프라이머; 및
(ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머를 사용하여 여러 증폭 순환을 통해 증폭하는 단계 ;
(d')어느 큰 DNA 분자를 절단하고 상기 제 1 또는 제 2 힐-화된 프라이머의 적어도 하나의 힐 부분을 억제함에 의해 이후의 단계에서 가교형성을 막는 단계;
(e')최초 mRNA로부터 5' 이상의 서열을 갖는 긴 두 가닥 산물의 양을 증가시키는 단계.
바람직하게, 단계 (a) 및 (b)의 일차 및 이차 cDNA 가닥의 합성은 구현예 I의 단계 (a) 및 (b)에 대해 정의된 것과 동일한 조건하에서 수행된다.
단계 (c)
전형적으로, 본 발명의 두번째 방법의 단계 (c)의 첫번째 증폭반응은 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 수행된다.
단계 (c)에서 사용되는 덜 엄격한 잡종형성 조건은, 일차 및 이차 cDNA 가닥 개체군을 함유하는 샘플에서 초기에 존재하는 어느 서열의 연장 기회를 증가시킨다.
바람직하게, 단계 (c)의 증폭 반응은 다음 단계로 이루어진다.
(ⅰ)85 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
(ⅱ)프라이머들을 45 ~ 65 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자로 어닐링하는 단계;
(ⅲ)어닐링한 DNA 분자를 65 ~ 75 ℃, 바람직하기는 70 ~ 75 ℃의 온도에서, 마그네슘 농도 4.5 mM 하에서 연장하는 단계;
(ⅳ)원하는 순환 횟수만큼 단계 (ⅰ) ~ (ⅲ)을 반복하는 단계.
가장 바람직한 구현예에서, 단계 (c)의 증폭반응은 92 ℃의 변성단계, 60 ℃의 어닐링 단계 및 72 ℃의 연장단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 일차 및 이차 cDNA 가닥의 증폭반응은 30 ~ 45 증폭순환, 더욱 바람직하기는 35 ~ 50 증폭 순환, 가장 바람직하기는 약 40 중폭순환으로 이루어진다. 그러나, 다른 순환 횟수도 가능하다. 최적의 순환횟수에 요구되는 하나의 파라미터는 사용한 폴리머라제에 의해 결정된다.
단계 (d')
바람직한 구현예에서, 단계 (d')는 단계 (c)에서 얻은 산물을 절단부위, 특히, 프라이머에 포함되어 있는 드문 제한부위를 특이적으로 인식하는, 적어도 하나의 제한효소와 함께 배양하는 것으로 이루어진다.
구현예 I에 나타난 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제와 같은 대응하는 절단제로 일차 증폭반응 단계 (c)의 마지막에 얻은 cDNA를 배양하여, 이 단계에서 생성된 고분자량 cDNA을 절단시킨다. 이것은 (구현예 I의) 이차 증폭반응 단계 (e)에서 생성될 수 있는 고분자량 cDNA의 수가 증가하는 것을 막는다. 또한, 상기 단계는 이후에 유전자 특이 PCR에서 사용되는 유전자 특이 프라이머와 경쟁할 수 있는 DNA 서열을 제거하는 역할을 한다. 더우기, 산물의 절단 및 제거는 증폭 DNA의 인비트로 RNA 전사 효율을 증가시킨다.
구현예 II의 특정 변형에 따르면, 단계 (c)에서 증폭된 DNA 분자는 단계 (d)에서 드문 절단부위, 특히 제 1 및 제 2 힐-화된 프라이머의 제한부위를 인식하는 두개의 제한효소와 함께 배양된다.
바람직한 변형에서, 적어도 제 2 힐-화된 프라이머의 힐의 3' 말단에 존재하는 드문 절단분위, 특히 드문 인식부위 서열은 Mlul 제한효소에 의해 인식되는 서열이다.
단계 (d)에서 제한절단은 샘부룩, 제이., 프리츠, 이.에프. 및 티. 매니아티스,(1989, Molecular cloning: A labaratory Manual. 2nd.; 콜드 스프링 하버 래버러토리, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)에 기재된 바와 같이 당업자들에게 알려진 종래의 제한 절단술로 수행된다.
단계 (e')
바람직한 구현예에서, 단계 (e')는 아래의 단계 (e)와 (f)의 결합이다.
단계 (e)
절단 단계 다음은 단계 (d)의 일차 증폭에 사용된 프라이머를 거의 완전히 제거하기 위해 2 ~ 100 배의 차수로 단계 (d)의 산물을 희석시키는 단계 (e)이다. 이것은 단계 (f)의 증폭반응 순환의 추가 세트에서 (도 3에 나타낸 바와 같이) 자동 프라이밍 현상을 돕는다.
도 3에 나타난 바와 같이, 프라이머 첨가 없이, 및 92 ℃에서 가닥 분리 후, 짧은 가닥(예를 들면, 가닥 B)은 긴 가닥(예를 들면, 가닥 A)에 상보적인 프라이머로서 작용할 것이며, 역전사 프라이머 부위에 두 가닥 유전자 특이 서열 5'의 양을증가시킨다. 이차가닥 프라이머 힐의 제거는 힐 프라이머 서열이 가닥 A의 유전자 서열과 상보적이지 않으므로 상기 공정을 용이하게 한다. 다이아그램 우측의 굵은 막대는 역전사 프라이머 힐을 나타내며, 좌측의 굵은 막대는 이차가닥 cDNA 프라이머 힐을 나타낸다.
더욱 바람직하게, 단계 (d)의 산물은 10 ~ 80 배로 희석되며 더욱 바람직하기는 약 40 배로 희석된다.
단계 (f):
바람직한 구현예에서, 단계 (f)는 내열성 DNA 폴리머라제를 단계 (e)의 희석된 샘플에 첨가하는 것 및 핵산 프라이머를 추가로 첨가하지 않고 추가 세트의 증폭 순환을 수행하는 것으로 이루어진다.
단계 (e)의 희석결과, 핵산 프라이머를 추가로 첨가하지 않고 추가 세트의 증폭 순환을 단계 (f)에서 유리하게 수행할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 단계 (f)의 각 증폭 단계는 다음의 단계들로 이루어진다.
(ⅰ)85 ~ 95 ℃의 온도에서 샘플을 배양함에 의해 한가닥 DNA를 얻는 단계;
(ⅱ)단계 (ⅰ)에서 얻은 한가닥 DNA 분자를 55 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링하는 단계;
(ⅲ)내열성 DNA 폴리머라제를 사용하여 65 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링된 DNA분자를 연장하는 단계;
(ⅳ)원하는 횟수만큼 단계(ⅰ) 에서 (ⅲ)를 반복하는 단계.
본 구현예의 바람직한 변형에서, 변성 단계는 92 ℃에서 수행되고, 어닐링 단계는 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃ 또는 72 ℃에서 수행되며 연장단계는 72 ℃에서 수행된다.
또 다른 바람직한 변형에서, 단계 (f)에서 행해지는 증폭단계는 10 ~ 40 순환, 더욱 바람직하기는 25 ~ 35 순환 및 가장 바람직하기는 약 30 순환으로 이루어진다. 최적 순환회수에 요구되는 하나의 파라미터는 사용된 폴리머라제에 의해 결정된다.
단계 (f)에서 행해지는 증폭순환 세트는 바람직하게 덜 엄격한 잡종형성조건, 약 3.5 mM 마그네슘의 존재하에서 수행된다.
구현예 II의 특정 변형에서, 본 방법은 추가 단계를 포함하는데, 여기서 단계 (f)에서 얻어진 50 염기쌍 미만의 길이의 DNA 분자는 반응 혼합물로부터 버려진다.
단계 (g):
추가로, 단계 (g)는 다음 방법중 하나 또는 몇몇으로 이루어진다.
(ⅰ)특이 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
(ⅱ)특이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
(ⅲ)복제 및/또는 발현 벡터에서 얻은 DNA 분자의 클로닝; 또는
(ⅳ)잡종형성 검정 또는 비표지 또는 표지 기질을 사용한 역전사 후, 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
샘플의 핵산서열을 역전사 또는 증폭하여 얻은 증폭 cDNA는, 샘플 중 cDNA가알맞는 농도로 존재한다면 단계 (d) 직후, 또는 단계 (e), (f), 및 (g)와 같은 추가의 증폭 후 인비트로 전사된다는 것을 주의해야 한다. 이와 관련하여, 적어도 하나의 프라이머는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 반드시 포함해야 한다. 생성된 RNA는 그 후, 예를 들면 표지화되고 DNA 배열에 잡종형성되거나, 또는 표지된 cDNA 가닥을 생성하기 위해, 필요에 따라 형광, 방사선 또는 다른 방법으로 표지된 기질을 사용하여 역전사되는 추가 단계를 겪는다. 생성된 표지 cDNA는 이후 DNA 배열에 잡종형성되거나 또는 유전자 특이 PCR 실험에 사용된다.
상기 방법에 사용된 어느 반응물의 표지화는, 비록 임의지만, 당업자들이 DNA 분석에서 본 발명의 방법의 산물을 직접 잡종형성할 수 있게 하므로 매우 유용하다는 것에 주목해야 한다.
프라이머
비록 절단부위의 존재가 구현예 II의 중요한 특성이지만, 이 절단부위는 제 1 힐-화된 프라이머, 제 2 힐-화된 프라미어, 양쪽 프라이머에 위치하거나 또는 단계 (c)에 사용되는 프라이머에 위치할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 그러나, 적어도 하나의 프라이머는 절단부위를 포함해야 한다.
A) 제 1 힐-화된 프라이머
본 발명의 구현예 II의 수행을 위해, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군은 5' 말단에서 3'말단으로, 다음으로 이루어진 핵산개체군으로 이루어진다.
(ⅰ)샘플에 존재하는 mRNA 분자 또는 단계 (a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA분자와 상보적이지 않으며, 힐 서열은 임의로 그의 3' 말단에 위치한 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
(ⅱ) 임의로 그러나 바람직하게 존재하는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열;
(ⅲ) 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열;
(ⅳ) 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열.
상기 서열은 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA와 잡종형성할 수 있고, 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 실제적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 발견된다.
전형적으로, 제 1 힐-화된 프라이머의 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열은 다음의 가변 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된다: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N1-3-3' , 여기서 N은 A,T,C, 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드.
따라서, 두번째 증폭방법의 특정 구현예에서, 제 1 힐-화된 프라이머는 또한 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함할 수 있다.
드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열은 보통 그의 힐 서열의 3' 말단 내에 또는 근접하여 위치한다. 본 발명과 관련하여, " 3' 말단에 근접하여"는 절단부위 특히 드문 제한부위가, 남아있는 서열과 생성된 서열들 간의 결과적인 비정상적 잡종형성을 막기 위해, 제한효소 절단 후 가능한 한 적은 염기들을 남기도록 위치하는 것을 의미한다.
바람직하게, 절단부위 특히 드문 제한부위는, 예를 들면 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael을 포함하는 소위 "드문 절단기" 군에서 선택된다.
바람직하게, 제 1 힐 힐el 프라이머의 절단부위 특히 드문 절단부위는 제 2 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 절단부위와 동일하다.
선택적으로, 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 절단부위는 제 2 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 절단부위와 다를 수 있다.
B) 제 2 힐-화된 프라이머
제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 5' 말단에서 3' 말단으로 각각 다음으로 이루어진 핵산서열 개체군으로 이루어진다:
(ⅰ)샘플에 존재하는 mRNA 분자 또는 단계 a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA와 상보적이지 않고, 힐 서열은 임의로 그의 3' 말단에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 사용부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
(ⅱ)임의로 그러나 바람직하게 존재하는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열;
(ⅲ)4 ~ 7 뉴클레오티드의 가능한 모든 서열 결합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머개체군에서 발견되도록 선택된 4 ~ 7 뉴클레오티드 길이의 일차 가변서열; 및
(ⅳ)덜 엄격한 잡종형성조건하에서 상기 일차 가닥 cDNA 분자들의 매 1 kb 부분에 평균 한번씩 잡종형성 되도록 산출된 이차 가변 뉴클레오티드 서열.
바람직하게, 절단부위는 힐 서열 내에 위치한다. 더욱 바람직하게, 절단부위 특히 드문 제한부위는 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 힐 서열의 3' 말단에 위치하며, mRNA가 발현되는 게놈에서 절단부위 특히 드문 제한부위는 거의 발생하지 않는다.
더욱 바람직하게, 절단부위 특히 드문 제한부위는 cDNA 증폭이 추구되는 유기체의 게놈에서 20 kb에 한번씩 이하로 발견되는 절단부위 특히 제한부위 중에서 선택된다.
포유류에서, 및 더욱 특별히는 래트에서, 이와 같은 드문 절단부위 특히 드문 제한부위는 예를 들면, Not1, Bsshill, Narl, Nrul 및 Nael로 이루어진 절단부위 특히 드문 제한부위의 소위 "드문 절단기" 개체군으로부터 선택된다.
바람직하기는, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열은 SEQ ID NO. 2의 뉴클레오티드 서열 CTGCATCTATCTAGTACGCGT로 이루어진다.
제 2 힐-화된 서열의 바람직한 구현예에서, 상기 이차 가변서열은 5'-CGAGA-3', 5'-CGACA-3', 5'-CGTAC-3' 및 5'-ATGCG-3'으로 이루어진 서열개체군으로부터 선택되며, 상기 이차 가변서열 각각은 상기 제 2 힐-화된 프라이머개체군에서 발견된다.
키트
본 발명은 또한 샘플에 존재하는 mRNA 종의 증폭용 키트에 관한 것이며, 여기서 상기 키트는 다음으로 이루어진다.
(ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머 개체군; 및
(ⅱ)구현예 I 또는 II에서 정의한 바와 같이, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군.
본 발명은 또한 샘플에 존재하는 mRNA 종의 증폭용 키트에 관한 것이며, 여기서 상기 키트는 추가로 다음으로 이루어진다.
(ⅲ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열로 이루어진 일차 프라이머;
(ⅳ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열로 이루어진 이차 프라이머.
특정의 구현예에서, mRNA 증폭 키트는 추가로 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재할 수 있는 절단부위 특히 드문 절단부위 서열을 인식하는 하나 이상의 제한효소를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 mRNA 증폭키트는 추가로 제 1 힐-화된 프라이머에 존재할 수 있는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위 서열을 인식하는 제한효소를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 키트는 또한 적당한 RNA 폴리머라제를 포함할 수 있다.
구현예 III
본 발명의 구현예 III에 따르면 가교된 핵산의 생성을 막기 위해 더 엄격한 잡종형성 조건이 사용된다. 구현예 II에서, 가교는 그의 힐 서열에 드문 절단부위를 갖는 프라이머를 사용하여 절단된다. 이것은 절단제, 바람직하게 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 증폭순환의 첫번째 세트동안 형성된 긴 cDNA 분자의 절단을 허용한다.
구현예 III의 수행조건은 가교 형성이 더욱 감소되도록 선택되었다. 이와 같은 조건은 예를 들면, 반대로 잘못된 잡종형성을 감소시키는 완충 조건의 최적화및/또는 역시 잘못된 잡종형성을 감소시키고 잡종형성된 올리고뉴클레오티드 쌍 사이의 거리를 증가시키는, 고온 어닐링을 허용하는 프라이머의 GC 함량을 증가시킴으로써, 예를 들면 구현예 I 또는 II에 사용된 조건과 비교하여 잡종형성 엄격성이 증가되었다.
이와 같은 더 엄격한 잡종형성 조건들은 이하 기재된 구현예 III의 두가지 선택에 따라 만족될 것이다.
구현예 III의 방법은 소량의 샘플 중에 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법으로, 다음 단계로 이루어진다:
(a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 mRNA 종을 역전사하여 일차 가닥 cDNA종을 제공하는 단계;
(b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 이차cDNA 가닥을 합성하는 단계;
(c)단계 (b)에서 생성된 상기 이차 cDNA가닥을 많은 증폭순환을 통해 증폭하여 양쪽 말단에 힐을 포함하는 이차 cDNA 가닥을 생성하며, 분석할 샘플에 초기 존재하는 긴 mRNA 종에 해당하는 이차 cDNA 가닥의 수를 증가시키는 단계;
(d) 단계 (c)보다 더 엄격하고 고분자량 cDNA 분자의 합성을 감소시킬 수 있는 잡종형성조건하에서 단계(c)에서 얻은 DNA 분자를 증폭하는 단계;
(e)단계 (d)에서 얻은 DNA 분자의 개체군을 회수하는 단계.
방법
단계 (a)
바람직하게, 단계 (a)는 단계(c)의 증폭순환의 첫번째 세트에서 사용된 잡종형성조건의 엄격성을 증가시킴으로써 증폭 cDNA 분자내에 핵산 가교의 형성이 감소되도록 하기 위해, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군이 60 ~ 80 %, 가장 바람직하기는 약 75% 의 GC 함량을 반드시 갖는 힐 성분으로 이루어지는 것을 제외하고는 구현예 I과 II에서와 동일하다.
단계 (b)
단계 (b)의 이차 cDNA 가닥의 합성 또한, 본 발명의 구현예 및 II의 단계 (b)에서 사용된 잡종형성 조건보다 더 엄격한 잡종형성조건에서 수행된다.
단계 (b)는 바람직하게 높은 엄격 조건에서 수행된다. 높은 엄격 조건의 바람직한 예는 다음과 같다: 하기 조건에서 반응 당 바람직하게 0.02 ~ 200 ng의 농도의 제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 사용하여 이차 cDNA 가닥을 합성한다;
(ⅰ) 프라이머를 단계 (a)에서 얻은 cDNA에 첨가;
(ⅱ) 85 ~ 95℃의 온도에서 바람직하기는 2 ~ 5분 동안 한가닥 DNA 분자를 얻음;
(ⅲ) 내열성 DNA 폴리머라제 및 필요에 따라 내열성 교정효소를 단계 (ⅱ)에서 얻은 혼합물에 첨가;
(ⅳ) 필요에 따라 혼합물의 온도를 약 94 ℃에서 최대 5분 동안 유지함;
(ⅴ) 힐-화된 프라이머를 상기 한가닥 DNA로 40 ~ 72 ℃의 온도에서 어닐링;
(ⅵ) 어닐링된 DNA 분자를 60 ~ 75 ℃의 온도에서 연장.
높은 엄격성 잡종형성조건은 사용된 제 2 힐-화된 프라이머의 특이한 구조적특성에 따라 명백히 얻어진다.
바람직하게, 단계 (b)는 일반적으로 마그네슘 농도가 최대 5 mM, 바람직하기는 3 ~ 5mM, 가장 바람직하기는 3.5 mM 일 때 수행된다.
내열성 DNA 폴리머라제는 바람직하게 1 ㎕의 부피 중 DNA 폴리머라제 3 ~ 5 U, 바람직하기는 4.5 U의 양으로 단계(b)에서 첨가된다. 필요에 따라, 단계(b)는 내열성 DNA 폴리머라제와 교정효소 모두의 존재하에 수행된다.
상기 효소는 DNA 폴리머라제와 동시에, 바람직하기는 0.1 ~ 0.5 U, 더욱 바람직하기는 0.25 U의 양으로 첨가될 것이며 1 ㎕ 부피중 DNA 폴리머라제와 혼합된다.
단계(b)의 (ⅳ)에 관하여, 바람직하게 1 ~ 3 분, 더욱 바람직하게 2 분 동안 수행된다.
단계(b)의 (ⅴ)에 관하여, 50 ℃의 온도에서 일반적으로 최대 10분, 바람직하게 4 ~ 10분, 더욱 바람직하게 6 ~ 8 분 및 가장 바람직하게 7.5 분 동안 수행된다.
단계(b)의 (ⅵ)에 관하여, 72 ℃의 온도에서 1 ~ 5 분 동안, 바람직하게 2 ~ 4분 및 가장 바람직하게 2.5 분 동안 수행하는 것이 바람직하다.
단계 (b) 및 (c)에서 사용되는 다량의 제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 단계 (a)에서 이미 합성된 일차 cDNA 가닥에 함유된 모든 서열의 적어도 하나의 프라이머가 어닐링될 가능성을 증가시킨다.
단계 (c)
비록 본 발명자들은 어느 특정 이론에 연결시키기를 원하지 않으나, 5' 말단에 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열을 갖는 서열은, 단계 (c)의 증폭반응의 연속순환에 의해, 양쪽 말단에 힐을 갖는 이차 cDNA 가닥을 생성하기 위해 일차 가닥 cDNA로 어닐링 된다고 믿어진다. 단계 (c)의 반복 순환은 단계 (b)의 반응 혼합물에 존재하는 모든 일차 가닥을 검출하는 기회를 증가시킨다.
결론적으로, 샘플에 존재하는 유전자 서열의 5' 말단과 상보적인 서열이 생성된다.
단계 (c)의 첫번째 바람직한 구현예에서, 연속 순환중 변성은 수행되지 않는다. 이 상황은 프라이머들 또는 일차 가닥으로 잡종형성된 짧은 DNA 서열을 제거함 없이 폴리머라제가 여러 순환동안 작용하도록 허용함으로써 긴 서열의 연장 효율성을 증가시킨다. 더우기, 본 발명자들은 폴리머라제가, 일차 가닥에 이미 잡종형성된 더 긴 서열의 연장을 돕기 위해, 연장시 일차가닥에 잡종형성된 짧은 서열을 실질적으로 대치한다고 믿는다.
구현예 II의 단계 (c)에서, 변성은 알맞은 온도조건에서, 바람직하기는 80 ~ 85 ℃에서 수행된다. 이들 조건에서, 일반적으로 길이가 50 bp 이하 및 바람직하기는 적어도 제 2 힐 프라이머인, 잘못 짝지워진 작은 서열들은 그들의 일차가닥의 잡종형성부위로부터 제거되며, 따라서 이후 반응에서 추가 프라이밍에 이용할 수 있다. 이차가닥 cDNA의 증폭에서 수득률은 더욱 증가된다.
구현예 III의 단계 (c)에서, 변성은 통상의 온도 조건, 바람직하기는 85 ~ 95℃ 에서 수행된다.
이미 합성된 일차 및 이차 cDNA 가닥은 바람직하게 반응당 0.02 ~ 200 ng, 바람직하기는 0.02 ~ 100 ng, 더욱 바람직하기는 1 ~ 50 ng, 가장 바람직하기는 1 ~ 10 ng 범위의 농도에서 제 2 힐-화된 프라이머와 함께 증폭횟수에 따라 바람직하게 증폭된다.
단계 (c)에서 사용되는 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 바람직한 양은 단계 (a) 및 (b)에서 이미 합성된 일차 및 이차 cDNA 가닥에 함유된 모든 서열에 대해 적어도 하나의 프라이머의 어닐링 가능성을 증가시킨다.
바람직하게, 약 417의 프라이머의 개체군이 단계 (c)의 증폭반응시 사용된다. 이것은 각 유전자 서열이 적어도 하나의 프라이머로 어닐링되는 기회를 증가시킨다.
각 프라이머의 이용가능성은 단계 (c)의 증폭 반응에서 순환횟수의 곱으로 증가한다. 바람직하게, 단계 (c)는 마그네슘 농도가 4.5 mM이고 증폭 순환이 30 ~ 50, 더욱 바람직하기는 35 ~ 35 증폭 순환, 가장 바람직하기는 약 40 증폭순환으로 수행된다.
유리하게는, 단계 (c)의 증폭반응은 내열성 DNA 폴리머라제와 내열성 교정효소 모두의 존재하에 수행된다.
증폭 완충액 중의 내열 교정효소의 존재는 각 증폭반응 순환의 연장단계에서 합성되는 서열의 양을 상당히 증가시킨다.
가장 바람직하게, 단계 (c)는 힐-화된 프라이머가 DNA 폴리머라제와 필요에따라 교정효소의 존재하에 40 ~ 72 ℃에서 연장되는 단계를 포함한다.
필요에 따라, 어닐링 단계는 변성 단계 및 연장 단계 사이에, DNA 폴리머라제가 DNA를 합성하는 것을 거의 막는 온도인 40 ℃에서 수행될 수 있다.
바람직하게, 단계 (c)는 어닐링된 DNA가 65 ~ 75 ℃ 사이의 온도에서 내열성 DNA 폴리머라제의 존재하에 연장되는 연장 단계를 포함한다.
바람직한 변형에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터 생성된 이차 cDNA 가닥을, 바람직하기는 반응당 농도 0.02 ~ 200 ng의 상기 제 2 힐-화된 프라이머와 함께 여러 증폭순환을 통해 하기 조건에서 증폭하는 단계를 포함한다;
(ⅰ) 내열성 DNA 폴리머라제의 존재하에, 80 ~ 95 ℃의 온도에서 필요에 따라 한가닥 DNA 분자를 얻음;
(ⅱ)이차 가닥 프라이머를 일차가닥(한가닥) DNA 분자로 40 ~ 72 ℃, 바람직하게 40 ~ 60 ℃의 온도에서 어닐링;
(ⅲ)어닐링된 DNA 분자를 65 ~ 75℃ 범위의 온도에서 필요에 따라 내열성 DNA 폴리머라제 존재하에 연장;
(ⅳ)원하는 순환회수 만큼 단계 (ⅱ) ~ (ⅲ)( (ⅰ)은 선택)을 반복.
바람직하게, 단계 (c)(ⅱ) ~ (ⅲ)는 10 ~ 60회, 바람직하기는 20 ~ 50회 및 가장 바람직하기는 약 20 또는 약 40회 반복된다.
단계 (c)의 바람직한 변형에서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군이 단계 (b)에 첨가된다.
바람직하게, 단계 (c)는 마그네슘이 최대 5 mM 및 가장 바람직하기는 3.5mM로 존재할 때 수행된다.
가장 바람직한 변형에서, 단계 (c)는 내열성 DNA 폴리머라제와 교정효소 모두의 존재하에 수행된다.
유리하게는, 교정효소는 DNA 폴리머라제와 동시에 및 1 ㎕의 부피에서 0.1 ~ 0.5 U, 가장 바람직하기는 0.25 U의 양으로 첨가되며 DNA 폴리머라제와 혼합된다.
단계 (d)
구현예 III은 더욱 엄격한 잡종형성 조건하에서 단계 (d)에서 수행되는 증폭순환의 두번째 세트를 추가로 포함한다. 이것은 가교 형성이 최소화된 힐 서열을 갖는 모든 cDNA를 증폭시키는 역할을 하며, 매우 엄격한 조건이 사용되므로 높은 효율로, (상기 구현예 I 및 II와 비교했을 때) 샘플에 초기에 존재하는 서열의 수득률이 증가한다.
바람직하게, 단계 (d)의 각 증폭반응 순환은 다음 단계로 이루어진다:
(ⅰ) 85 ~ 95 ℃의 온도에서 샘플을 배양하여 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
(ⅱ) 65 ~ 75 ℃의 온도에서 내열성 DNA 폴리머라제를 사용하여 어닐링된 DNA 분자를 연장시키는 단계;
(ⅲ)원하는 회수의 반응 순환을 통해 단계 (ⅰ) ~ (ⅱ)를 반복하는 단계.
바람직하게, 단계 (d)의 증폭반응은 마그네슘이 2.5 mM의 농도로 존재할 때, 30 ~ 50 증폭순환, 더욱 바람직하기는 35 ~ 45 증폭순환 및 가장 바람직하기는 약 40 증폭순환으로 수행된다. 그러나, 폴리머라제의 선택에 따라 다른 마그네슘 농도를 사용할 수 있다.
변성온도는 바람직하게 95 ℃이며, 연장온도는 바람직하게 72 ℃이다.
가장 바람직하게, 어닐링 및 연장 단계는 프라이머들이 한가닥 cDNA 분자로 어닐링되는 것을 최대화하기에 충분한 시간동안 수행된다.
전형적으로, 이와 같은 어닐링 및 연장 단계는 2.5 ~ 3.5 분이며, 가장 바람직하기는 약 3분이다.
다른 바람직한 구현예에서, 단계 (d)는 다음과 같이 수행될 수 있다.
단계 (c)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥을, (1)특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보적 서열과 잡종형성 되기에 충분한 뉴클레오티드 길이의 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부로 이루어진 프라이머, (2)특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보적 서열과 잡종형성 되기에 충분한 뉴클레오티드 길이의 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부로 이루어진 프라이머, 및 (3) 프라이머(1)과 (2)의 혼합물로 이루어진 개체군으로부터 선택되며, 총 농도가 다음 조건하에서 반응당 0.02 ~ 500ng 사이인 프라이머들과 다수의 증폭순환을 통해 증폭시킨다:
(ⅰ) 프라이머들을 단계 c)에서 얻은 cDNA에 첨가;
(ⅱ) 80 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자를 얻음;
(ⅲ) 내열성 DNA 폴리머라제를 첨가;
(ⅳ) 바람직하게 5 초 ~ 15분 동안 80 ~ 95 ℃의 온도를 유지;
(ⅴ) 프라이머를 상기의 한가닥 DNA로 어닐링하고 및 어닐링된 DNA 분자를 65 ~ 75 ℃의 온도에서 연장;
(ⅵ) 단계(ⅳ) 및 (ⅴ)를 원하는 순환 회수만큼 반복.
단계 (d)와 관련하여, 바람직한 구현예에서, 단계 (d)(ⅳ)는 94 ℃에서 수행된다. 이들 조건에 따라, 반응 혼합물은 고온에서 활성이 아닌 내열성 DNA 폴리머라제 뿐만 아니라, 단계 (c)에서 얻은 한가닥 cDNA 산물, 증폭 프라이머를 반드시 함유한다.
바람직하게, 증폭법의 단계 (d)(ⅳ)의 첫번째 수행에서, 온도는 80 ~ 95 ℃의 범위, 가장 바람직하기는 94 ℃에서 최대 3분 동안, 가장 바람직하기는 2분 동안 유지된다. 단계 (d)(ⅳ)의 추가 수행에서, 온도는 80 ~ 95 ℃의 범위, 가장 바람직하기는 94 ℃이며, 최대 60초, 가장 바람직하기는 20초 유지된다.
단계 (d)(ⅴ)에서, 프라이머들은 내열성 DNA 폴리머라제가, 주형으로서 cDNA 분자를 사용하여 프라이머를 연장시킬 수 있는 온도에서 한가닥 DNA 분자들로 어닐링된다.
바람직하게, 단계 (d)(ⅴ)는 68 ~ 74 ℃, 가장 바람직하기는 72 ℃에서 수행된다.
바람직한 구현예에서, 단계 (d)(ⅴ)는 1 ~ 10 분 동안, 가장 바람직하기는 5분동안 수행된다.
바람직한 구현예에서, 단계 (d)(ⅴ)의 마지막 수행은 10 ~ 60분 동안, 바람직하기는 25 ~ 40분 동안, 가장 바람직하기는 35분 동안 수행된다.
단계 (d)(ⅵ)는 바람직하게 10 ~ 50회의 증폭순환으로 이루어진다.
바람직하게, 단계 (d)의 증폭반응은 내열성 DNA 폴리머라제 및 내열성 교정 효소 모두의 존재 하에 수행되며, 또한, 단계 (d)는 바람직하기는 농도 2 ~5 mM의마그네슘의 존재하에 수행된다.
구현예 III의 두번째 선택의 바람직한 표면에서, 단계 (d)에서 프라이머의 각각의 농도는 0.02 ~ 500 ng 범위이다.
상기와 같이 단계 (ⅰ) ~ (ⅳ)를 포함하는 단계 (d)는, 초기 샘플이 다량의 mRNA를 함유할 때, 예를 들면 약 100 세포(예를 들면 포유류 세포 100개)에서 추출한 후 발견될 수 있는 총 mRNA에 해당하는 양일 때 바람직하게 수행된다.
이 상황에서, 단계 (d)는 바람직하기는 마그네슘의 농도가 최대 3 mM, 바람직하기는 2mM로 존재할 때 수행된다.
초기 샘플이, 예를 들면 1 ~ 10 세포에서 추출 후 발견될 수 있는 mRNA의 양과 같은, 소량의 mRNA를 함유하는 경우, 단계 (d)는 바람직하게 두번째 선택의 단계 (d)에서 얻어진 산물을 증폭하는 추가의 단계를 포함할 것이다.
이 상황에서, 단계 (d)는 단계 (d)(ⅳ)에서 얻은 DNA 분자를, (1)특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보적 서열과 잡종형성 되기에 충분한 뉴클레오티드 길이의 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부로 이루어진 프라이머, (2)특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보적 서열과 잡종형성 되기에 충분한 뉴클레오티드 길이의 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부로 이루어진 프라이머, 및 (3) 프라이머(1)과 (2)의 혼합물로 이루어진 개체군으로부터 선택되며, 총 농도가 다음 조건하에서 반응당 0.02 ~ 200 ng 사이인 프라이머들과, 다수의 증폭순환을 통해 증폭하는 단계를 추가로 포함한다:
(ⅶ) 80 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자를 얻음;
(ⅷ) 내열성 DNA를 단계 (ⅶ)에서 얻은 한가닥 DNA에 첨가;
(ⅸ) 65 ~ 75 ℃의 온도에서 한가닥 DNA의 어닐링 및 연장;
(ⅹ) 단계 (ⅶ) ~ (ⅸ)를 원하는 순환횟수로 수행함.
단계 (d)에서 사용되는 마그네슘의 농도와 관련하여, (a) 단계 (d)(ⅰ) ~ (ⅵ)에서는 2.5 mM의 마그네슘이 바람직하며, (b) 단계 (d)(ⅶ) ~ (ⅹ)에서는 2mM의 마그네슘이 바람직하다.
증폭반응 단계 (d)(ⅰ) ~ (ⅵ)에 관하여, 프라이머 각각의 농도는 0.02 ~ 90 ng, 바람직하기는 10 ~ 50 ng, 가장 바람직하기는 약 30 ng이며, 그 후 단계 (d)(ⅶ) ~ (ⅹ)는 프라이머 각각의 농도가 50 ~ 300 ng, 바람직하기는 65 ~ 200 ng 및 가장 바람직하기는 약 100ng 으로 수행된다.
그러므로, 초기 샘플이 소량의 mRNA를 함유할 때, 단계(d)(ⅰ) ~ (ⅹ)는 바람직하게 총량이 0.02 ~ 500 ng, 바람직하기는 60 ~ 300 ng 및 가장 바람직하기는 약 130 ng 인 프라이머를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기의 구현예 III의 두번째 선택의 단계(d)(ⅹ)는 20 ~ 60 증폭순환, 바람직하기는 30 ~ 50 증폭순환 및 가장 바람직하기는 약 40 증폭순환으로 이루어진다.
상기 설명과 같이, 단계(d)가 단계 (ⅰ) ~ (ⅹ)의 실시에 의해 수행될 때, 단계 (ⅰ)~ (ⅵ)의 증폭반응의 첫번째 세트는 단계(d)가 오직 단계(ⅰ) ~ (ⅵ)로 실시될 때 보다 소량의 프라이머로 수행된다. 상기의 특정 상황에서 단계 (ⅰ)에서 첨가된 소량의 프라이머들은 증폭반응의 첫번째 세트에서 잘못 잡종형성되는 정도를 감소시킬 것이다. 그러므로, 단계 (d)(ⅵ)에서 얻은 산물들은 전적으로 샘플중 초기에 함유된 mRNA 종을 나타낸다. 구현예의 상기 변형에 따르면, 증폭반응의 두번째 세트, 즉 단계 (d)(ⅶ) ~ (ⅹ)는 단계 (d)(ⅰ) ~ (ⅵ)에서 초기 증폭된 재료의 양을 증가시킬 것이다.
상기 방법에 따르면, 증폭반응 단계 (d) (ⅷ)~(ⅹ)는 바람직하기는 내열성 DNA 폴리머라제 및 내열성 교정효소 모두의 존재하에 수행된다.
바람직하게, 증폭단계 (d)(ⅷ) ~ (ⅹ)는 마그네슘의 농도가 최대 4 mM, 바람직하기는 1.6 ~ 2.5mM, 가장 바람직하기는 2.0 mM 일때 수행된다.
바람직한 구현예에서, 단계(d)(ⅶ) ~ (ⅹ)에서 사용되는 프라이머의 농도는 10 ~ 500 ng, 가장 바람직하기는 30 ~ 300 ng의 범위이다.
단계 (e)
(상기의) 단계 (e)에 관하여, 본 방법은 단계 (e)에서 얻은 길이가 50 bp 미만인 DNA 분자를 반응 혼합물로부터 버리는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
단계 (e')
본 발명의 유리한 선택적 변화에 있어서, 단계 (d)이후 다음 단계들이 따른다:
(ⅰ) 단계 (e)에서 얻은 DNA 분자를 제 1 및/또는 제 2 힐-화된 프라이머의 힐-화된 서열에 함유된 제한부위를 특별히 인식하는 적어도 하나의 제한효소와 배양하는 단계; 및/또는
(ⅱ) 단계(ⅰ)의 산물의 농도보다 약 2 ~ 100 배 묽은 농도의 cDNA를 함유하도록, 묽은 cDNA를 얻기 위해 단계 (ⅰ)의 산물을 희석하고, 및
희석한 샘플에 내열성 DNA 폴리머라제를 첨가하고 어느 핵산 프라이머의 첨가 없이 증폭반응 순환의 추가 세트를 수행하는 단계; 및/또는
(ⅲ) 단계 (ⅰ) 및/또는 (ⅱ)에서 얻은 DNA 분자개체군에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계.
상기 변형에서, 특히 단계 (ⅰ)이 수행되는 변형에서, 프라이머들은 바람직하게 각각 적어도 하나의 드문 제한부위를 포함한다.
이들 변형은 또한 반응 혼합물에서 길이가 50 bp 미만인 단계 (ⅰ)에서 얻은 DNA 분자를 버리는 추가 단계를 포함한다.
바람직하게, 단계 (ⅱ)에서 수행되는 증폭반응 순환의 회수는 20 ~ 40, 더욱 바람직하기는 25 ~ 40 및 가장 바람직하기는 30 ~ 40이다.
단계 (ⅲ)는 다음 방법 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
(ⅰ) 특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
(ⅱ) 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭; 및
(ⅲ) 얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에 클로닝.
본 바람직한 변형의 단계 (ⅰ) ~ (ⅲ)를 수행하기 위한 조건들은 구현예 I 및 II의 단계 (d)~ (g)를 수행하기 위해 기재한 것들과 동일하다.
단계 (f)
본 구현예의 하나의 특정 변형은 다음의 추가단계로 이루어진다:
(f) 단계 (e) 또는 (e')에서 얻어진 DNA 분자개체군에 함유된 적어도 하나의핵산 서열의 존재를 확인하는 단계.
단계 (f)는 다음 방법들 중 어느 하나로 이루어진다.
(ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
(ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
(ⅲ)얻어진 DNA 분자들을 복제 및/또는 발현벡터에 클로닝;
(ⅳ)잡종형성 검정을 위한, 또는 표지 또는 비표지 기질을 사용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
생성된 cDNA가, 적당한 농도의 cDNA가 샘플에 존재하는 경우에는 단계 (c) 직 후에, 또는 단계 (d) 또는 상기의 임의 단계 (e')를 통한 추가의 증폭 후에, 인비트로 전사될 수 있음을 주의해야 한다. 본 명세서에서, 프라이머중 하나는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함하는 것이 필수적이다. 생성된 RNA는 표지 cDNA 가닥을 생성하기 위해, DNA 분석체로 표지 또는 잡종형성되거나 또는, 임의로 형광, 방사선 또는 기타 표지 기질을 사용하여, 역전사되는 추가단계를 겪을 수 있다. 그 후, 산물은 DNA 분석 또는 유전자-특이 PCR 실험에 사용되기 위해 잡종형성될 수 있다. 비표지인 경우, 산물은 미량배열 염기에 첨부될 수 있고 표지 올리고뉴클레오티드에 잡종형성될 수 있다.
본 발명의 구현예에서 사용된 어느 반응물의 표지화는, 당업자들이 비록 임의적이지만, 본 발명의 방법의 산물을 DNA 분석을 위해 직접 결합 또는 잡종형성할 수 있게 하는데 매우 유용하다.
선택적으로, 단계 (e) 또는 (e') 후, RNA 전사는 이후의 RNA 폴리머라제 반응이 일어나도록 '깨끗해진' 환경을 제공하기 위해, 힐 프라이머를 포함하는 저분자량 DNA를 우선 임의로 제거함에 의해 실시될 수 있다.
이 "세정"으로 당업자들은 완충용액을 이후의 RNA 폴리머라제 반응에 더 적합한 완충액으로 바꿀 수 있다.
생성된 cDNA는 인비트로 전사될 수 있다는 것을 주의해야 한다. 프라이머에 RNA 폴리머라제 프로모터가 함유되면, 센스 유전자 특이 올리고뉴클레오티드를 갖는 유전자 칩(Gene Chips) 또는 배열에 잡종형성되거나, 또는 이후의 역전사와 생성 cDNA가 안티센스 유전자 특이 올리고뉴클레오티드에 잡종형성되는데 알맞는 상보적 RNA의 합성을 허용한다. 반대로, 제 2 힐-화된 프라이머에 RNA 폴리머라제 프로모터가 함유되면, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 갖는 배열에 잡종형성되거나, 또는 이후의 역전사 및 생성 cDNA가 센스 유전자 특이 올리고뉴클레오티드를 갖는 유전자 칩 또는 배열에 잡종형성되기에 알맞는 센스 RNA의 합성을 허용한다.
이와 관련하여, 프라이머들 중 하나가 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함하는 것이 필수적이다. 이후, 생성된 RNA는 표지된 cDNA 가닥을 생성하기 위해, 예를 들면 배열에서 DNA로 표지화 또는 잡종형성되거나 또는, 필요에 따라 형광, 방사선 또는 표지 기질을 사용하여 역전사됨에 의해 추가의 진행단계를 겪을 수 있다. 이후 산물은 DNA 배열로 잡종형성되거나, 또는 다른 핵산과의 순차 잡종형성을 위해 담체(예를 들면, 유리, 나일론, 실리콘 등)에 첨부되거나, 또는 유전자-특이 PCR 실험에 사용될 수 있다.
프라이머
본 구현예에 사용된 프라이머들(제 1 및 제 2 힐-화된 프라이머들, 단계 (c)에 사용된 프라이머들)의 특정 구조적 특징에는 구현예 I 및 II의 프라이머들과 비교하여 GC 함량의 증가가 포함된다.
그러므로, 본 구현예에 사용되는 프라이머들은 60 ~ 80 %, 가장 바람직하기는 약 75%의 GC 함량을 갖는 힐 서열로 이루어진다. GC 함량의 증가는 단계 (c)의 증폭순환의 첫번째 세트에 사용된 잡종형성 조건의 엄격성의 증가를 허용하므로, 증폭된 cDNA 분자 내부의 핵산가교의 생성을 막고 따라서 구현예 I 및 II의 단계 (c)에서 관찰되는 고분자량 cDNA의 합성을 막는다.
바람직한 구현예에서, 상기 프라이머들은 그들의 힐 서열에 또는 그들의 힐 서열의 3' 말단에 적어도 하나의 절단부위를 포함한다.
본 발명의 구현예 III의 다른 면에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군은 5' 말단에서 3'말단으로, 다음으로 이루어지는 핵산개체군으로 구성된다:
(ⅰ) 일차 가닥 cDNA 또는 샘플에 초기 존재하는 mRNA와 상보적이지 않은 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
(ⅱ) 선택적으로 그러나 바람직하게 존재하는 RNA 폴리머라제 프로모터 부위;
(ⅲ) 15 ~ 35 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열; 및
(ⅳ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA로 잡종형성될 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열, 여기서 실질적으로 모든 가능한 가변 서열의 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견된다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열은 다음의 가변 뉴클레오티드 서열중에서 선택된다: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C, 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.
바람직하게, 제 1 힐-화된 프라이머는 힐 서열내의 어느 위치에 및 바람직하기는 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치할 수 있는 드문 제한 부위의 서열을 포함한다.
바람직하게, 올리고 dT 서열은 20 ~ 35의 길이, 더욱 바람직하기는 25 ~ 35의 길이, 가장 바람직하기는 약 30 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
바람직한 변형에서, 제 1 힐-화된 프라이머의 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열은 다음의 가변 뉴클레오티드 서열들 중에서 선택된다: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N1-3-3', 여기서 N은 A, T, C, 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.
상기와 같이, 제 1 힐 프라이머의 힐 서열의 GC 함량은 50 ~ 80 %, 더욱 바람직하기는 60 ~ 80 %이며, 가장 바람직하기는 약 75 %이다. 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열에서 GC 함량이 높으면, 본 발명의 세번째 cDNA 증폭의 단계 (d)에서 명백히 사용되는 중간정도의 엄격성 잡종형성 조건하에서도, 상기 프라이머가 대응하는 상보성 서열로 양호하게 어닐링된다.
구현예 III의 다른 면에서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군은, 5' 말단에서 3' 말단으로, 각각 다음으로 이루어진 핵산서열의 개체군으로 이루어진다:
(ⅰ)샘플에 존재하는 mRNA 분자 또는 단계 (a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA분자와 상보적이지 않은, 25 ~ 75 뉴클레오티드 길이의 힐 서열; 및
(ⅱ)15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 실질적으로 모든 가능한 서열결합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 일차 가변서열.
바람직하게, 상기 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열은 드문 제한부위를 포함하며, 이것은 힐 서열의 어느 위치에도 존재할 수 있으나, 바람직하기는 상기 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에 존재한다.
특정 구현예에서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 길이는 25 ~ 35 뉴클레오티드이다.
또 다른 특정 변형에서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 길이는 45 ~ 75 뉴클레오티드이며 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함한다.
추가의 특정 변형에서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 길이는 45 ~ 75 뉴클레오티드이며 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함한다.
제 2 힐-화된 프라이머의 일차 가변영역은 바람직하게 길이가 15 ~ 20 뉴클레오티드이며 가장 바람직하기는 약 17 뉴클레오티드이다. 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 일차 가변서열은 상기 구현예 I 및 II를 수행하기 위해 사용되는 제 2 힐-화된 프라이머의 일차 가변서열보다 길며, 그러므로 단계 (c) 및 (d)의 일차 및 이차 증폭순환의 어닐링 및 연장순환동안 그에 대응하는 상보성 DNA 서열에 대해 모든 개체군의 제 2 힐-화된 프라이머를 안정화시키기에 알맞다.
제 2 힐-화된 프라이머 개체군에 속하는 프라이머를 안정화하기 위해, 특히 힐 서열의 길이가 길어지므로, 더 긴 일차 가변 서열이 요구되며, 이것은 바람직하게 길이가 25 ~ 30 뉴클레오티드이며 가장 바람직하기는 길이가 약 27 뉴클레오티드이다.
제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 첫번째 바람직한 구현예에서, 각각의 핵산서열은 또한 바람직하기는 구현예 I의 기준에 따라 선택된 이차 가변 핵산서열로 이루어진다. 바람직하게, 제 2 힐-화된 서열의 두번째 가변서열은 5'-CGAGA-3', 5'-CGACA-3', 5'-CGTAC-3' 및 5'-ATGCG-3'로 이루어진 개체군으로부터 선택되며, 상기의 두번째 가변서열 각각은 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군 중에서 발견된다.
바람직한 변형에서, 힐 서열은 28 뉴클레오티드 길이이다.
구현예 III을 실시하기 위한 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 바람직한 변형에 있어서, 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 25 ~ 30 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하기는 약 28 뉴클레오티드 길이의 힐 서열로 이루어지며 GC 함량은 50 ~ 70 %, 더욱 바람직하기는 60 ~ 70 %이며, 가장 바람직하기는 약 68 %이다.
구현예 III의 두번째 선택의 한 특정 변형에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머와 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열들은 동일하다.
선택적으로, 제 1 힐-화된 프라이머 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열은 적어도 연속 15 뉴클레오티드, 바람직하기는 적어도 연속 20 ~ 25 뉴크레오티드를 공유한다.
이 특정 구현예에 따라, 본 방법의 단계 (c)의 마지막에 얻은 혼합물에 존재하는 cDNA 가닥은 그들의 5' 말단에, 그들의 3' 말단에 포함된 서열과 상보적인, 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 갖는다. 이와 관련하여, 단계 (c)동안 재생된 짧은 핵산길이의 이차 cDNA 가닥은 높은 자동-어닐링 경향을 가지므로 단계 (d)의 증폭반응의 세트(들)에 더 이상 이용될 수 없다. 따라서 본 발명의 단계 (d)의 실시중 증폭되는 일차 및 이차 cDNA 가닥은 주로 큰 cDNA 분자이며, 샘플에 초기 존재하는 총 길이 mRNA 종과 동일 또는 상보적 서열로 이루어진 cDNA 분자를 포함한다.
제 1 및 제 2 힐-화된 프라이머들의 힐 서열은, 바람직하게 제한부위로부터 하류방향으로 위치하는 RNA 폴리머라제 결합부위 뿐만 아니라, RNA 바람직하게 그들 각각의 힐 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치하는 드문 제한부위의 서열을 포함한다.
첫 번째 변형에서, 제 1 힐-화된 프라이머의 제한부위 서열은 제 2 힐-화된 프라이머의 힐에 존재하는 제한부위 서열과 동일하다.
두 번째 변형에서, 제 1 힐-화된 프라이머의 제한부위 서열은 제 2 힐-화된 프라이머의 힐에 존재하는 제한부위 서열과 상이하다.
유리하게는, 제 1 힐-화된 프라이머 또는 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 포함되는 제한부위 서열은, 예를 들면 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael로 이루어진 소위 "드문 절단기들"의 군으로부터 선택된다.
키트
본 발명은 추가로 샘플에 존재하는 mRNA를 증폭하기 위한 키드에 관한 것이며, 상기 키트는 특히 상기 세 번째 cDNA 증폭법의 수행을 위해 고안된 것이다.
그러므로, 본 발명의 다른 목적은 샘플에 존재하는 mRNA의 증폭용 키트로 이루어지며, 여기서 상기 키트는 다음으로 이루어진다.
(ⅰ) 제 1 힐-화된 프라이머 개체군; 및
(ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머 개체군, 여기서 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머 개체군은 상기 정의와 같다.
상기 증폭용 키트는 추가로 다음을 포함할 수 있다.
(ⅲ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부로 구성되는 일차 프라이머; 및
(ⅳ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부로 구성되는 이차 프라이머.
상기 키트의 특정 구현예에서, 제 1 힐-화된 프라이머와 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열은 동일하거나 또는 선택적으로 적어도 15, 바람직하기는 적어도 20, 가장 바람직하기는 적어도 25 개의 연속 뉴클레오티드의 공통 서열을 공유한다.
특정 구현예에서, 상기 증폭 키트는 추가로 제 2 힐-화된 프라이머의 힐-화된 서열에 존재하는 드문 제한부위서열을 인식하는 제한효소를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 증폭 키트는 추가로 제 1 힐-화된 프라이머의 힐-화된 서열에 존재하는 드문 제한부위서열을 인식하는 제한효소를 포함한다.
또 다른 구현예에서는, 키트는 추가로 적당한 RNA 폴리머라제를 포함한다.
본 발명의 세 개의 mRNA 증폭법은 많은 샘플을 쉽고 높은 감도로 증폭하는 것을 가능하게 한다.
단일 세포정도의 소량으로부터 취한 샘플에서, 풍부한 및 불충분한, 어닐링된 서열의 많은 유전자들의 발현을 분석할 수 있는 능력은 잠재적으로 고처리량 스크리닝 시스템에서 사용할 수 있게 한다.
세포질의 성분 전체 또는 신경세포의 세포질 일부와 같은 세포질의 일부 및 또한 원하는 조직에서 추출한 mRNA와 같은, 다양한 종류의 mRNA를 함유하는 샘플을 본 발명의 cDNA 증폭법을 수행하기 위한 출발물질로서 사용할 수 있다.
상기의 세 가지 cDNA 증폭법 중 어느 하나의 마지막에 얻은 cDNA는 다음과 같은 여러 목적을 위해 사용될 수 있다:
(a) 소량의 조직으로부터 cDNA 라이브러리의 클로닝 및 생산;
(b) 작은 조직 샘플중의 유전자 발현의 서열분석;
(c) 두개의 다른 샘플로부터 증폭 산물의 추출 및 Diatchenko et al.(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.93: 6025-6030)에 의해 기재된 바와 같이 그들 사이에 상이하게 발현된 유전자들의 분석, 및 오직 하나 또는 여러 조직에 발현된 서열의 클로닝 및 서열화;
(d) Duggan, D.J.et al.,(1999, Nature Genetics, vol.21:S10-S14)에 의해 기재된 바와 같은, 잡종형성 검정에 사용하기 위한 표지 전구체를 사용한 mRNA 전사;
(e) 잡종형성 검정에 사용하기 위한 표지 전구체 존재하의 RNA 전사 및 역전사;
(f) 잡종형성 검정에 사용하기 위한, 증폭시 본발명의 cDNA 증폭법중 어느 것으로부터 얻은 cDNA의 표지화;
(g) 인간, 동물 및 식물의 작은 조직에 있는 이상 유전자의 발현 진단;
(h) 인비보 및 인비트로 유전자 발현에 대한 약물 및 기타 약제들(예를 들면, 감염제, 카르시노겐)의 영향 분석.
마지막 경우, 작은 조직 샘플 또는 배양된 세포들이 사용될 것이다. 앞의 경우에는 오직 매우 작은 샘플들 만이 필요하므로, 아무런 결점없이 살아있는 유기체로터 작은 조직 샘플들을 취할 수 있다.
(i) 상기 cDNA 증폭법 중 어느 것을 사용한 단일 세포중 유전자 발현의 분석;
(j) 적당한 발현 시스템에서, 결과 라이브러리 제작 또는 발현을 위한, 단일 세포들 및 작은 샘플들로부터 전장 RNA 샘플의 증폭.
본 발명의 바람직한 구현예들은 이하 제시된 실시예에서 설명될 것이나, 이것으로 제한되지는 않는다.
실시예 I. 구현예 I를 사용한 래트 뇌 mRNA 증폭
래트의 뇌 전체에서 분리된 mRNA를 역전사시켰다. 총 RNA 100 pg로부터 얻은 cDNA(5 ~ 10개의 세포에 있는 RNA 함량과 동가)를 구현예 I에 따라 증폭시켰다. 역전사만 한 후, 총 RNA 10 pg이상에서 유도된 cDNA를 각 분석에 사용했을 때, 도 1A에 나타난 바와 같이, 유전자 특이 PCR 분석은 양성이었다. 첫 번째 증폭단계(c) 후, 대부분의 유전자들은 도 1b 나타난 바와 같이, 낮은 수준으로 검출가능한 몇몇 유전자 서열을 가지며, 각 유전자 특이분석에서 증폭 산물 2.5%(즉, 초기 RNA 2.5 pg에서 유도된 물질을 함유하는 각 샘플)을 사용하여 검출되었다. 단계 (f)후, 감도의 추가 증가가, 도 1c와 같이, 증폭 산물을 0.1 % 보다 적게 사용한 양성으로 분석된 모든 유전자(즉, 초기 총 mRNA 샘플 0.1 pg에서 유도된 증폭 cDNA에서 관찰되었다. 그러므로, 이 방법을 사용하여, 각각 유전자 특이 PCR 반응에서 최종산물 0.1%를 사용하여 최대 1000 유전자의 발현을 분석할 수 있었다.
역전사
제조지침에 따른 Promega로부터 총 mRNA 분리 시스템을 사용하여 래트의 뇌 전체로부터 총 mRNA를 제조하였다. 열전사 역전사효소 또는 제조지침(GIBCO-BRL, Paiseley, 스코틀랜드)에 따른 MMLV 역전사효소를 사용하여 역전사를 실시하였다. 사용한 역전사 프라이머는 포유류 데이터 자료에 존재하지 않는 특이 5' 힐 서열을 갖는 고정된(anchored) 올리고-dT 프라이머로 구성되어 있다. 몇몇 경우에, RNA 폴리머라제(T7) 프로모터 부위는 힐 서열의 3' 말단에 결합되어 있다. 사용된 프라이머는 SEQ ID NO. 3에 나타내었다.
SEQ. ID No. 3: CTCTCAAGGATCTTACCGCTTTTTTTTTTTTTTTTT (A,G,C)(A,G,C,T)
이차가닥 cDNA 합성은 총 RNA 100 pg으로부터 유도된 cDNA와, 다음의 (5'-3')로 이루어진 혼합된 프라이머 개체군 25 pg을 배양함에 의해 개시되었다: 포유류 데이터 자료에 없는 5' 힐 서열(CTGCATCTATCTAATGCTCC), 5 랜덤 뉴클레오티드의연장(NNNNN, 여기서 N은 A, C, G, 또는 T를 나타냄) 및 SEQ ID NO. 4, 5, 6, 및 7에 나타낸 바와 같은, CGAGA, CGACA, CGTAC 및 ATGCG로부터 선택된 가변 펜타머릭 서열.
이들 프라이머들은 일차가닥 cDNA에 있는 다중부위에 결합되며 이와 같은 프라이밍 부위로부터 이차가닥 합성을 프라임한다. 어닐링(50 ℃에서 7.5 분) 후, 67 mM Tris HCl(pH 8.3), 4.5 mM MgCl2, 6 mM 베타메르캅토에탄올, 0.16% 혈청알부민 및 0.5 mM dNTPs로 이루어진 PCR-1 완충액 중의 ampliTaq DNA 폴리머라제(0.35 유니트, Applied Biosystems, Warrington, 영국)를 사용하여 72 ℃에서 8분동안 수행하였다.
이후, 역전사 프라이머 힐과 이차가닥 프라이머 힐 각각 1 ng을 PCR-1 완충액 5 ㎕에 첨가하고 반응을 92 ℃에서 0.5분 동안, 60 ℃에서 1.5분 및 72 ℃에서 1분을 10회 순환시키고 이후 10분 연장시켰다. 추가로 각각 힐 프라이머 10 ng을 PCR-1 완충액 20 ㎕에 첨가하고 추가로(상기와 같이) 40회 순환시켰다. 이 후, 최종 산물을 물 100 ㎕로 희석시키고 샘플(2.5 또는 5 ㎕)을 이후의 유전자 특이 PCR 분석에 사용하거나 또는 프라이머의 첨가함 없이 추가로 40회 순환(92 ℃에서 0.5 분, 60 ℃에서 1.5 분 및 72 ℃에서 1분 후, 최종 10분 연장)시켰다. 이것은 3.5 mM MgCl2, 45 mM Tris HCl, pH 8.8 및, 12.5 % 슈크로스, 0.1 mM 크레졸레드, 12 mM 베타-메르캅토에탄올, 0.5 mM dNTPS(Pharmacia)를 함유하는 PCR-2 완충액에서, 0.6 U AmpliTaq DNA 폴리머라제(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 수행하였다.이 산물을 2% 아가로스 겔(E-겔, 인비트로겐)에서 전기영동시키고 제조지침에 따라 Qiagen 겔 추출키트를 사용하여 겔로부터 고분자 산물을 분리하였다.
유전자 특이 PCR을 100 ng/반응으로 유전자 특이 프라이머를 갖는 PCR-2 완충액에서 증폭된 cDNA 샘플(2.5 ~ 10 ㎕)에 대해 수행하였다.
초기 2 분 변성단계 후, 각 PCR 순환은 0.5 분 변성(92℃), 1.5 분 어닐링 (55 ℃) 및 1 분 연장(72 ℃) 및 72 ℃에서 10 분 최종연장으로 이루어진다. 그 후, PCR 산물을 2.5 % 아가로스겔 중에서 전기영동시켜 분리하고 에티디윰브로마이드를 사용하여 착색시키고 이미지를 기록하였다.
사용된 유전자-특이 프라이머는 다음과 같다: α 튜블린(수탁번호 V01226, SEQ ID NO. 8 및 9), β-액틴( 수탁번호 V01217, SEQ ID NO. 10 및 11), 시클로필린(수탁번호 M25637, SEQ ID NO. 12 및 13), 아데노신 A1 수용체(수탁번호, Y12519, SEQ ID NO. 14 및 15), 아데노신 A2A 수용체(수탁번호 L08102, SEQ ID NO. 16 및 17), 아데노신 A2B 수용체(수탁번호 M91466, SEQ ID NO. 18 및 19), 아데노신 A3 수용체(수탁번호, M94152, SEQ ID NO. 20 및 21), NK1 수용체(수탁번호, J05097, SEQ ID NO. 22 및 23), NK2 수용체(수탁번호, M31838, SEQ ID NO. 24 및 25), trkA 수용체(수탁번호, M85214, SEQ ID NO. 26 및 27), trkB 수용체(수탁번호, M55291, SEQ ID NO. 28 및 29), 프로엔케팔린,(수탁번호, S49491, SEQ ID NO. 30 및 31), 시납토타그민 1(수탁번호, X52772, SEQ ID NO. 32 및 33), 시납토타그민 5(수탁번호, X 84884, SEQ ID NO. 34 및 35), 포유동물 디제너린(GAD67, 수탁번호, x57573, SEQ ID NO. 38 및 39), 크롤린 아세틸트란스퍼라제(GenBank/EMBL 데이터 자료에 없음, Brice et al., (1989) J.Neursoci. Res., 23, 266-273, SEQ ID NO. 40 및 41).
어느 특정이론과 관련없이, 본 발명자들은 단계 (e) 이후의 감도 증가는 유전자 특이 PCR 증폭에서 경쟁하는 단계 (c)에서 형성된 산물이 제거되었기 때문이라고 생각한다. 상기 산물들은 증폭 cDNA를 프라이밍할 수 있는 반복 프라이머 분자들을 함유하므로 유전자 특이 반응의 효율을 감소시킨다. 이들 산물들은 단계 (e)중 고분자량 산물로 결합된 증폭 유전자 서열이 유지되는 동안, 단계 (f)중 제거된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 총 RNA 100 pg로부터 유도된 cDNA의 증폭은 증폭안된 cDNA보다 낮은 수준에서 PCR에 의한 특이 유전자 서열을 검출할 수 있게 한다. (A)비증폭 cDNA의 희석물; (B)증폭 cDNA의 희석물(단계 c); (C)증폭 cDNA의 희석물(단계 e). (A)의 비율은, 각 유전자 특이 분석에 사용된 cDNA가 합성된 총 RNA의 양을 나타낸다. (B) 및 (C)에서, 비율은 유전자 특이 분석 샘플이 증폭된 총 RNA의 양을 나타낸다(즉, 0.1 pg은 총 RNA 100 pg에서 유도된 cDNA의 증폭 후 얻은 최종 산물의 1000분의 1을 나타낸다). 유전자 서열은, (본 발명의 구현예 I의 단계 (a) ~ (c)에 기재한 바와 같이), 초기 RNA를 1 pg 정도 소량 함유하는 증폭 산물을 사용했을 때, 증폭 후 검출되었다. 단계 (e)후, 추가의 감도 증가는 0.05 pg 만큼 낮은 단계에서의 검출로 나타났다.
실시예 II: 구현예 II 및 III를 사용한 래트 뇌 mRNA 증폭 후 특정 서열 검출에 대한 제한소화 효과
I. 래트 뇌 전체에서 분리한 mRNA를 역전사시키고 총 mRNA 25 g으로부터 유도된 cDNA(2 ~ 5 세포의 mRNA 함량과 동가)를 (A)와 함께 또는 (B)없이 단계 (d), 도2의 단계 (e)에서 (g)에 기재된 바와 같이 Mlu1으로 절단한 후, 실시예 1에 따라 증폭시켰다. 각 유전자 특이 분석은 총 RNA 0.6 pg으로부터 유도된 증폭 산물을 함유하였다. 절단(A)후 검출되는 아데노신 A1 및 A3 리셉터가, 절단(B) 후 검출되지 않음을 주목해야 한다.
II. 래트 뇌 전체에서 분리한 mRNA를 역전사시키고, (2 ~ 5개의 세포의 mRNA 함량과 동가인) 총 mRNA 25 pg 으로부터 유도된 cDNA를, (A)와 또는 단계 (g), 그 다음 도 2의 단계 (h) ~ (j)의 기재와 같이 Mlu1로 절단되는 (B) 없이 실시예 III에 따라 증폭되었다. 각 유전자 특이 검정은 총 RNA 0.6 pg로부터 유도된 증폭 산물을 함유하였다. 매질(GAD67(글루타매이트 디카르복실라제; ChAT, 콜린 아세틸트란스퍼라제)과 매우 풍부한(시납토타그민 1) mRNA의 검출 뿐만 아니라 불충분한 mRNAs(포유류의 디제너린 (MDEG), A2B 수용체)의 검출 빈도의 증가를 주목해야 한다.
(래트 뇌의 총 RNA 25 pg로부터 유도된) cDNA를 제조하고, 이차 가닥 프라이머의 힐이, 3' 말단에 Mlul 절단부위 특히 드문 제한부위를 함유하는 SEQ ID NO. 2인 것을 제외하고, 실시예 1의 기재와 같이 이차 가닥 합성을 수행하였다. 실시예 1(I) 또는 실시예 3(II)의 기재와 같이, 단계 (3)의 증폭 후, 희석 산물 10 ㎕를 제조사 지침(Promega)에 따라 6.0 mM Mg2 +중의 Mlul 2 유니트와 함께 37 ℃에서 60분 동안, 총 20 ㎕중에서 배양하였다.
Mg2 +를 킬레이트화하기 위해 EDTA를 첨가하고 65 ℃에서 5분동안 효소를 불활성화하기 위해 배양한 후, 분획량 10 ㎕을 AmpliTaq 0.625 유니트( 및 pfu 0.05 유니트) DNA 폴리머라제를 함유하는 PCR-2 완충액 중에서 92 ℃에서 0.5 분, 60 ℃에서 1.5분 및 72 ℃에서 1분동안 40 순환시키고, 이후 프라이머 (I) 및 (II)의 첨가 없이 최종 10분 연장시켜 재증폭하고, 분확량 10 ㎕를 92 Å에서 1.0 분, 95 Å에서 0.33분, 72 Å에서 3분 추가로 40 순환시키고 최종 15분 연장시켰다. 산물을 최종 부피가 50 또는 100 ㎕되도록 희석시키고, 샘플을 실시예 1의 기재와 같이 유전자 특이 PCR 분석하였다.
본 발명의 구현예 II에서, 일차 가닥 프라이머의 힐 서열의 제거는 실시예 I에 기재된 경쟁 산물의 절단에 의한 유전자 특이 PCR의 감도 증가를 위해 고안되었고(그러므로 이들은 이후의 PCR 반응에서 더 이상 경쟁하지 않는다), 역전사 프라이머 부위로부터 상부위치의 유전자 서열의 검출을 촉진한다. 증가된 감도는 프라이머 서열의 제거에 의한 것이며, 표시된 유전자 서열 검출의 감도 증가로 나타난다. 이것은(본 출원인들은 어느 이론과 결합하기를 원하지 않으며), 단계 (c)중 생성된 유전자 서열의 짧은 증폭 산물은 92 ℃에서 가닥 분리 후, 어닐링 된 후 더 긴 상보적인 산물로 연장된다고 믿어진다. 이차 가닥 프라이머 힐의 제거, 및 교정 DNA 폴리머라제 pfu에 의한 증폭은 상기 공정을 도울 수 있다. 이 방법으로, 역전사 프라이머 부위의 상부방향 서열을 함유하는 증폭 재료의 양이 증가될 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, (B) 없이 및 드문 절단 제한부위 효소 Mlu1으로 절단하는(A)와의, 단계 (f) 후의 유전자 특이 PCR은, 절단으로 아데노신 A1 및 A3 수용체와 같은 불충분한 유전자 서열의 검출이 증가된다는 것을 나타낸다.
실시예 III. 구현예 Ⅲ을 이용한 래트 뇌 mRNA의 증폭
증폭법의 감도와 특이성을 증가시키기 위해, 래트 유전성 DNA의 100 배 과량으로 존재하는 람다 박테리오파아지 DNA의 단일 복사들을 증폭시킬 수 있는 높은 엄격성에서 이용하기 위해 2개의 힐 프라이머를 고안하였다, 즉, 이들은 상보적 서열에 매우 민감하며 단일 복사들을 증폭시킬 수 있다(데이타는 나타내지 않음). 본 발명의 방법의 구현예 III의 이들 프라이머를 사용하여, 초기 RNA 0.01 pg의 소량으로부터 유도된 증폭 산물은 유전자 특이 PCR 분석에서 양성이었다. RNA의 양은 단일 세포에 함유된 양의 약 0.1%를 나타낸다.
역전사:
총 mRNA를 제조사의 지침에 따라 Promega의 총 RNA 분리시스템을 사용하여 래트 뇌 전체에서 제조하였다. 역시 제조사(GIBCO-BRL, Paisley, 스코틀랜드) 지침에 따라, MMLV 역전사제를 사용하여 역전사를 수행하였다. 사용된 역전사 프라이머들은 포유동물 데이터베이스에 없는 특이 5' 힐 서열을 갖는, 고정된 올리고-dT 프라이머로 이루어진다. 사용된 프라이머 SEQ ID NO. 42를 다음에 나타내었다;
ACTGCCAGACCGCGCGCCTGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A,C,G)(A,C,G,T)
두 번째 가닥 합성은 (5'에서 3')로 이루어진 두번째 가닥 프라이머 20 ng을 갖는 총 RNA 1000 pg에서 유도된 cDNA를 배양함으로써 개시되었다: 포유류 데이타베이스에 없는 힐 서열(TGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGC) Mlu1 부위(ACGCGT), 17 랜덤 뉴클레오티드(NNNNNNNNNNNNNNNNN) 및 서열 확인번호 43에 나타낸, 세 개의 임의의 염기들(G,T) (A,G,T) (A,C,G).
4.5 mM Mg2 +, AmpliTaq DNA 폴리머라제 1 유니트 및 pfu DNA 폴리머라제(Straragene) 0.05 유니트를 함유하는 PCR-1 완충액의 최종 부피가 20 ㎕이 되도록, 이들 프라이머들을 첨가하고 어닐링하고 다음 조건하에서 40 회 이상 연장시켰다: 92 ℃에서 0.5분 , 40 ℃에서 0.5분(임의) 및 72 ℃에서 5분, 그 후 최종 30분 연장. 이들 프라이머들의 경쟁적 어닐링은 초기 cDNA에 존재하는 모든 유전자 서열이 이중가닥 산물로 복사되는 가능성을 증가시키는 역할을 한다.
그 후 역전사 및 두 번째 가닥 힐 프라이머 300 ng을 Taqstart 항체(ClonTech)의 존재하에 추가의 AmpliTaq DNA 폴리머라제 1.25 유니트 및 Mg2 +1.5 mM, Tris HCl(pH 8.3) 67 mM 및 dNTPs 0.17 mM을 함유하는 완충액 35 ㎕중의 pfu DNA 폴리머라제 0.25 유니트와 함께 첨가하였다. 몇몇 경우에, 증폭 산물은 이후 실시예 2의 기재와 같이 Mlu1으로 제한소화되었고, (이차 가닥 프라이머를 포함하는) 저분자량 산물은 Nanosep 10K 칼럼(이들 Nanosep 칼럼의 필터를 통해 지나는 길이 100 bp보다 짧은 이중가닥 DNA)을 통해 제거되었고 더 큰 산물은 유전자 특이 PCR을 겪거나, 또는 추가로 92 ℃에서 1.0 분, 95 ℃에서 0.33분, 72 ℃에서 3분 40회 순환 후, 최종 15분 연장된다. 두 번째 가닥 힐 서열의 제거는 유전자 특이PCR 내의 어느 경쟁 산물과 프라이머들의 영향을 감소시키고 구현예 2의 기재와 같이 산물의 프라이밍/수복을 허용하도록 고안되었다.
상기 공정의 성과는, 총 RNA 0.01 pg 정도의 소량에서 유도된 증폭 cDNA의 희석물에서 (실시예 1에 기재된 바와 같이) 유전자 특이 PCR에 의해 유전자를 검출할 수 있는 능력으로, 약 100,000 유전자 특이 PCR 검정이 총 RNA 1 ng(즉, 약 100 세포의 함량)에서 유도된 cDNA의 증폭 후에 성공적으로 실시될 수 있음을 나타낸다. 그밖에, 산물 프라이밍/산물 수복이 유전자 서열 2.4 kb 5'의 역전사 프라이밍 부위로 검출에 의해 발생됨을 나타낸다(도 4).
도 4에 나타낸 바와 같이, 구현예 3의 기재와 같이 총 RNA 1000 pg으로부터 유도된 고엄격성 증폭 cDNA는 유전자 서열의 강화된 검출을 허용한다.
(I) 비율은 각 유전자 특이 검정에 사용된 cDNA가 합성되는 총 RNA의 양(A), 또는 유전자 특이 검정 샘플이 증폭된 RNA의 양(B)을 나타낸다.
특이 서열이 초기 RNA 0.01 pg정도의 소량으로부터 유도된 산물이 유전자 특이 PCR에 사용되었을 때 검출되었다.
(II) 유전자 특이 검정 당 총 RNA 2.5 pg에서 증폭된 cDNA를 사용한 유전자 특이 PCR. 증폭방법 3의 단계 (g)에서 (i)의 삽입은 또한 폴리A 스플라이스 부위(A)의 상부방향 2350 bp에 위치한 NK2 수용체 유전자 서열을 검출한다. 상기 서열은 단계 (g)가 삭제되면 검출되지 않는다(B).
(III) 증폭법 3에 의해 뇌 전체 RNA 총 1 ng에서 유도된 cDNA의 증폭은 산물 0.006%(총 RNA 0.06 pg에서 증폭된 cDNA와 동가)에서 유전자 특이서열의 검출을 허용한다.
그 밖에, 도 2의 (II)에서 나타낸 바와 같이, 실시예 3의 단계 (g) ~ (i)를 포함하여, (A)는 단계 (g)가 생략된 증폭과 비교했을 때, 아데노신 A2B 수용체와 포유류 디제너린 MDEG를 암호화하는 불충분한 메시지의 검출을 증가시킨다.
실시예 IV 구현예 I과 III에 따라 증폭된 cDNA의 RNA 인비트로 전사
역전사 프라이머 힐에 T7 프로모터를 결합시켜, 잡종형성법에 의한 순차분석을 위해, 예를 들면 올리고 분석을 위해 RNA를 생성하였다. 두 개의 일치하는 전사를 작동하여 증폭된 cDNA로부터의 RNA의 수득률을 평가하였다. 하나는 RNA 합성을 위해, 다른 하나는 기질로서 35S-UTP를 함유하는 것이며, RNA에 방사능을 혼입하여 RNA 합성의 인덱스로 사용할 수 있게 하였다. 증폭과정 1의 단계 c)에 의해 총 RNA 500 pg으로부터 유도된 래트 간 cDNA를 증폭시킨 후, 인 비트로 전사는 12.5 ㎍의 RNA가 생성되었다. 구현예 III의 단계 (c)를 사용하여, (총 RNA 500 pg으로부터 유도된) 간 cDNA의 RNA의 수득률은 34 ㎍이었다(5번 실험의 평균). 유사하게, 2500 pg에서 유도된 cDNA로부터의 수득률은 90 ㎍(5번 실험의 평균)이었다. 인비트로 전사 전에 구현예 3의 단계 (g)를 포함하는 것은 RNA의 수득률을 1.7배 증가시켰다(2번 실험의 평균).
구현예 3(단계 (c)까지)에 따라 증폭된 cDNA로부터 전사된 RNA의 서열 함량을 조사하기위해 RNA를 이차가닥 힐ded 프라이머의 힐을 사용하여 역전사시켰다. 도 5는 전사된 RNA에서 유도된 cDNA가 이렇게 생성된 RNA의 0.0001%를 나타내는 분획량에서 검출되는 액틴 튜블린과 시클로필린 서열을 갖는 과잉 유전자 서열을 함유한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 최대 1,000,000 유전자의 발현은 총 RNA 2500 pg, 즉 약 250 세포로부터 유도된 RNA에서 유도된 증폭된 샘플에서 평가될 것임을 나타낸다.
간 RNA의 역전사를 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 실시예 1과 3의 기재와 같이 수행하였다. 사용된 프라이머는 SEQ ID NO. 44였다:
CTCTCAAGGATCTTACCGCTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
(A,G,C)(A,G,C,T) 및 SEQ ID NO. 45
GACTGCCAGACCGCGCGCCTGACGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
(A,C,G)(A,C,G,T)
이 후의 이차가닥 합성 및 증폭을 관련 실시예의 기재와 같이 실시하였다. 각 구현예의 단계 (c) 후, 프라이머 및 기타 저분자량 산물을 제거하기 위해 증폭된 cDNA를 Qiaquick PCR 정화키트(Qiagen)를 제조사 지침에 따라 사용하여 분리하고, 분확량 5 ㎕를 제조사의 지침에 따라 T7 메가스크립 키트(Ambion)를 사용하여 인비트로 RNA 전사하였다. cDNA를 제거하기 위한 DNase 처리 후(DNase 1, 30분, 37 ℃), Rneasy 키트(Quagen)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분획량 중 하나를 RNA의 수득률을 정하기 위해 35S-UTP의 존재하에 전사시켰다. 이 후, 제조사 지침에 따라 MMLV 역전사를 이용하여 역전사하기 전, RNA를 에탄올 침전시켰다(에탄올 75%, 아세트산나트륨 5%, -20 ℃, 30분). 사용된 역전사 프라이머들은 SEQ ID NO. 1과 44인, 이차 가닥 프라이머의 힐 서열의 일부 또는 전체였다.
기질로서 상기 cDNA를 이용한 이후의 유전자 특이 PCR은, 산물의 0.0001% 정도의 소량이 유전자 특이 PCR에 사용될 수 있고 유전자 서열이 검출됨을 나타낸다. 나타낸 자료는 인비트로 RNA 전사된 구현예 III이 cDNA와 올리고뉴클레오티드 분석에 양호한 품질의 충분한 RNA를 생성함을 나타낸다. 이것은 약 250 세포를 함유하는 조직의 무수한 유전자의 발현을 단일세포 정도의 소량 세포로부터 추가로 향상된 분석이 가능하게 한다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 증폭된 cDNA로부터의 RNA의 인비트로 전사는 다량의 진실의 유전자 서열을 함유한다. 간 전체 RNA의 125, 500 및 2500 pg로부터 유도된 cDNA를 증폭법 3의 단계 (e)까지를 이용하여 증폭하고 RNA 전사하였다. 제한효소로의 절단(단계 g)은 생략되어 생성된 RNA가 이차가닥 프라이머의 힐 서열을 함유하도록 하였다. 이후 상기 힐 프라이머를 RNA의 프라임 역전사에 사용하였고, 생성된 cDNA를 3 유전자 서열의 존재에 관하여 분석하였다. 3개의 유전자 서열 모두가 산물을 106 배 희석한 후에도 검출되었다.
실시예 V. 구현예III을 이용한 전체 RNA 1ng(약 100 세포와 동가)에서 유도된 래트 척수 cDNA의 증폭
실시예 IV에서, 안티센스 RNA는 구현예 3에 의해 증폭된 cDNA로부터 인비트로 전사될 수 있고, 상기 RNA는 센스 탐침을 갖는 유전자 칩에 적용되거나 또는 역전사되어 안티센스 탐침을 갖는 미량배열에 적용될 수 있음을 나타내었다. 그러나, 많은 미량배열은 센스 탐침을 가지며(즉, 이들은 안티센스 DNA를 인식한다), 그러나 표지 RNA 샘플의 잡종형성에는 적당하지 않다. 구현예 3의 유용성을 최대로 하기 위해, 센스 RNA를 또한 인비트로 증폭된 cDNA로부터 전사하고, 역전사하고 유전자 서열 성분을 유전자 특이 PCR로 평가하였다.
역전사
역전사(RT)를 1x 일차가닥 완충액, 200 유니트 MMLV 역전사효소(BRL), 및 0.5 ng 일차가닥 프라이머를 함유하는 10 ㎕에서 37 ℃에서 60분 동안 수행하였다. 일차 가닥 프라이머(서열 확인번호 46), ACTGCCAGACCGCGCGCCTGAACGCGTAATACGACTCA CTATAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A, C, G) (A, C, G, T)는 그의 3' 말단에 Mlul 부위를 갖고, Mg2 +2mM의 존재하에 72 ℃에서 그의 보체와 잡종형성할 수 있는 포유류 데이터 베이스에 존재하지 않는 26 염기 서열, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열, 및 mRNA의 폴리A 서열의 5'말단에 잡종형성되는 올리고Ts의 고정된 스트레치를 함유한다.
이차 가닥 합성
Mg2 +의 최종농도가 3.5 mM인 완충액 4 ㎖ 중에 (모든 일차가닥 서열에 대한 어닐링 기회를 증가시키기 위해) 과량의 이차가닥 프라이머 (1ng)를 첨가하여 이차가닥 합성을 수행하였다.
80 ℃로 가열한 후, Taq(Appliied Biosystems, Warrington, 영국) 5 유니트를 교정효소 pfu 0.25 유니트와 첨가하였다. Taq를 고온에서 첨가하는 것("고온 출발")은 혼합물에서 효소가 잘못 잡종형성된 서열을 복사하는 것을 막는데, 이와 같은 잘못된 잡종형성은 반응을 시작할 때 만나게 되는 저온에서 발생하는 경향이 있다.
프라이머 어닐링은 50 ℃에서 일어나며(7.5분, 순환당 10초씩 감소) 72 ℃에서 2.5분 동안 연장된다. 50 ~72 ℃의 온도에서 40번 순환된다.
이론과 연결되는 것을 바라는 것은 아니나, 본 발명자들은 이런 상황에서, 각각의 일차가닥 DNA는 이차가닥 프라이머에 의해 여러 위치에서 어닐링될 것으로 믿는다. 각 순환은 프라이머의 추가 어닐링을 허용한다. 그러나, 정상 PCR과 달리, 이차가닥은 각 순환에서 용융에 의해 일차가닥으로부터 분리되지 않으며, 그 결과 각 프라이머는 (힐중 하나를 갖는) 일차가닥의 5'말단으로 연장될 수 있는 동일한 기회를 가지며 따라서 이후의 PCR 효율이 증가한다. 일차가닥의 3' 말단에서 프라이머의 연장은 각 이차가닥의 다수의 복사물을 생성하는 5' 말단 근처의 프라이머들을 대치할 것이다. 이차가닥 프라이머는 (5'에서 3'로) 다음을 함유한다: 2mM Mg2 +과 표준 PCR 완충액의 존재하에 72 ℃에서 그의 보체와 잡종형성 가능한 포유류 데이터 베이스에 없는 서열, Mlul 부위(ACGCG), T3 RNA 폴리머라제 프로모터 및 15개 염기의 랜덤서열, SEQ ID.NO 47:
AAAACTGCCAGACCGCGCGCCTGAACGCGTCGTATTAACCCTCACTAAAGGGN15
증폭반응
순차 PCR을 최종 Mg2 +농도 2.6 mM을 제공하기 위해, dNTPs 1.25 mM 및 프라이머(72 ℃에서 Mg2 +2 mM의 존재하에 그의 보체와 잡종형성 가능한 Mlul 부위를 갖는 포유류 데이터 베이스에 없는 서열) 33 ng을 함유하는 AmpliTaq 완충액(Applied Biosystems, Warrington, 영국)중 4 ㎕를 첨가하여 수행하였다.
본 실시예에서, 상기 프라이머는 일차 및 이차가닥 프라이머에 공통적이다. 80 ℃로 가열한 후, Taq(Applied Biosystems, Warrington, 영국) 5 유니트를 교정효소 pfu(Startgene) 0.25 유니트에 첨가하였다.
그 후, 반음물을 20 회 변성반응(94 ℃, 20초)시키고, 연장하며 어닐링하였다(72 ℃ 5분). 그 후, 0.2 mM dNTPs, 프라이머 100 ng를 함유하는 AmplTaq 완충액 19 ㎖를 첨가하고 최종 Mg2 +농도가 2.1 mM이 되도록 하였다. Taq(Applied Biosystems, Warrington, 영국) 5 유니트를 교정 효소 pfu(Startgene) 0.25 유니트와 함께 첨가하였다. 그 후 반응물을 상기와 같이 40 회 순환시키고, 72 ℃에서 30분동안 최종 연장시켰다.
증폭 후 저분자량 프라이머들과 산물들을 Qiaquick PCR 정화키트(Qiagen)를 통과시킴으로써 제거하였다. 이후 증폭된 cDNA를 Mlul로 절단하고 동일 키트를 사용하여 순차 유전자 특이 PCR 분석 또는 인비트로 전사에 앞서 재세정시켰다.
유전자 특이 PCR을 상기와 같이 실시하였다. RNA의 인비트로 전사를 앰비온(Ambion) 메가스크립트 키트를 사용하여 제조사 지침에 따라 수행하였다.
DNase 처리 후, 생성된 RNA중 몇몇을 유전자 특이 PCR을 위해 역전사하였다. 도 6은 T3 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터로부터 생성된 RNA을 크기에 따라 분포한 것을 나타낸다(즉 대부분 200 ~ 600 bp의 검출가능한 고분자량 물질). 전체 RNA 1 ng에서 유도된 cDNA의 증폭 후 얻은 산물의 10 %는 T7 폴리머라제 또는 T3 폴리머라제로 인비트로 전사되고 각 RNA의 30 %는 겔로 적용된다. 두 개의 RNA 폴리머라제로부터 평가된 수득률은 각각 0.5 및 1.5 ㎎이었다. 도 7A는 유전자 특이 PCR로 검출가능한 불충분(A2A 수용체) 및 충분한(예를 들면, 튜불린) 유전자 서열 모두를 함유하는 증폭 cDNA를 나타낸다. I: T3 프로모터가 부족한 이차가닥 프라이머에 의한 증폭, II: T3 프로모터를 갖는 이차가닥 프라이머에 의한 증폭. 샘플은 유전자 특이 PCR 전에 최대 1/3,000로 희석되었다. 도 7B는 (cDNA로의 역전사 후) T3 RNA 폴리머라제를 사용하여 생성된 인비트로 전사된 센스 RNA 역시 풍부 유전자 서열을 함유한다는 것을 나타낸다.
실시예 VI. 구현예 III을 이용한 선형 콜린성 뉴런 mRNA의 cDNA 증폭 후 미량배열을 이용한 단일세포 발현 분석
단일세포 유전자 발현을 조사하기 위해, mRNA를 실시예 V의 프라이머들과 조건들을 이용하여 구현예 III에 따라 증폭하였다. 폴리머라제를 이용하여 센스 RNA를 생성하였고, 이후 센스 DNA 형광 탐침을 갖는 글라스 미량배열에 적용하기 위해형광 표지된 dCTP(Cy3 또는 Cy5)를 이용하여 역전사시켰다.
단일 세포 mRNA의 수확
선형 콜린성 뉴런을 그들의 크기에 따라 확인하고, 선조체를 갖는 14 ~ 28일된 수컷 Sprague Dawley 래트의 관상조각 300 ㎕중의 전기생리적 특성들을 x64 침수된 대물 랜즈로 고정된 Zeiss Axioskop 현미경(Carl Zeiss Ltd., Welwyn Garden City, 영국)으로 관찰하였다. 슬라이스 내의 개개의 뉴런들의 해상을 위해 대조-강화 뉴비콘 카메라(Hamamatsu, Hamamatsu City, 일본)로 적외선 영역(>740 nm)의 빛을 사용하였다(Lee et al., 1998)
슬라이스를 담그는 생리적 식염수는 NaCl 125 ml, NaHCO325 ml, 글루코스 10 ml, KCl 2.5 ml, NaH2PO41.25 ml, CaCl2 2 ml, MgCl21 ml를 함유하며 95%/5% O2/CO2로 비등시켰다. 전극 완충액은 K 글루코네이트 120 ml, NaCl 10 ml, MgCl22 ml, EGTA 0.5 ml, HEPES 10 ml, Na2ATP 1 ~ 4 mM, Na2GTP 0.3 ml를 함유하며, pH를 KOH로 7.2로 조절하였다. 세포에서 RNA의 수확을 용이하게 하기 위해 0.5 ㎍/ml 글리코겐(Boehringer)과 RNase 억제제(Pharmacia, 0.1 유니트/㎕)를 포함시켰다. 상기 완충액은 또한 E. coli의 trp, thr 및 lys로부터 유도된 박테리아성 서열을 각각 10 fg 함유한다. 상기 mRNA는 3' 말단에 부착된 폴리A 서열을 가지므로 XTPEA로 증폭될 수 있다. 모든 용액은 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리수 중에서 제조하였다. 보로실리케이트 교정 전극을 3과 5 M‡사이의 저항에 넣기 전 굽는다(2시간, 250 ℃). 전기생리적 시그널을 Axopatch-1D 패치-클램프 증폭기(Axon Instruments, CA, 미국)를 사용하여 검출하였고 디지털 오디오 테잎에 기록하였다.
전세포배열을 생성한 후, 증폭기를 사용하여 직류저항을 부분적으로 보정하고, 과분극 전류 또는 전압을 주입시켜 세포 전도도를 연속적으로 모니터하였다.막 신호를 1 kHz에서 여과하여 pClamp 6.0 소프트웨어(Axon Instruments, CA, 미국)를 사용하여 Digidata 1200A/D/ 변환기를 통해 5 kHz에서 디지털화하였다.
뉴런 성분의 추출 및 증폭
(하나의 크기가 30 ㎛를 초과하는) 큰 세포의 세포질을 패치-클램프 기록전극으로 시각 조절 하에 체세포질의 약 40%를 모을 때까지 흡인하였다. 보통, 슬라이스로부터의 오염을 막기 위해, 전극을 회수하기 전에 전극 밀봉(0.5 G‡)이 형성될 때까지 핵을 전극 말단 위에 흡인시켰다. 세포에서 핵을 회수하는 것은 구조손상을 일으키므로, 세포를 실제적으로 면역화학적으로 시험하기 위해 외부-돌기 (outside-out) 패치를 사용하여 전극을 봉인하였다. 전극 성분은 미세튜브로 강화되고 역전사되고, 증폭되고, 저분자량 성분들이 제거되며 모든 산물은 실시예 V의 기재와 같이 인비트로 역전사되었다. Dnase 처리후, RNA를 미량배열에 적용하기 전에 Cy3 또는 Cy5 표지 dCTP를 이용하여 역전사시켰다.
미량배열 합성
맞춤 합성된 아민-변형 올리고뉴클레오티드 탐침을 탈염 칼럼에서 정화시켜아민 오염물을 제거하였다. 탐침을 인산염나트륨 150 mM, pH 8.5(SurModics Inc, 미국)을 함유하는, 1x Surmodics Printing 완충액 중에서 10 ~ 25 nmol/분의 최종농도로 제조하였다. 탐침용액을 3D-링크 활성 슬라이스(SurModics Inc, 미국)에서 인쇄하고 포화 NaCl 챔버에서 철야 저장하였다. 인쇄된 슬라이스를 실온에서 저장하였다. 미량배열은 패치 전극 완충액에 포함된 박테리아 서열을 인식할 수 있는 탐침을 함유한다. 이들은 성공적인 증폭이 발생했음을 보증하는 역할을 한다. 추가로 Dengue 바이러스 게놈의 3개의 탐침이 음성대조로서 포함된다. 배열은 141개의 다른 전사를 인식하는 총 510 올리고뉴클레오티드 탐침을 가지며, 각 전사는 3 개 또는 그 이상의 분리된 탐침에 의해 인식된다.
미량배열 잡종형성
슬라이스를 0.1 % SDS를 갖는 SurModics 블로킹용액(50 mM 에탄올아민, 0.1 M 트리스, pH 9)에 50 ℃에서 15분 동안 노출시켰다. 슬라이스를 물로 두 번 세척하고, 쉐이커에서 40분동안 50 ℃로 예열된 15 ml 4x SSC/0.1% SDS로 세척하였다. 슬라이스를 물로 세척하고, 3 분동안 800 rpm에서 원심분리하였다. 표지 cDNA(표적) 잡종형성 혼합물을 비등수조 중에서 2분간 가열하고, 냉각시키기 위해 잠시 회전시키고, 덮개 슬립 cm2당 표적 2.5 ℓ를 첨가하였다. 슬라이스를 습식 배양기에 철야 방치하였다. 슬라이스를 배양 챔버에서 제거하고 4X SSC로 30초, 2X SSC/0.1 % SDS 5분, 0.2 X SSC 1분 및 0.1 X SSC 1분 연속적으로 세척하였다. 슬라이스를 회전시켜 건조시키고 스캔하였다.
미량배열을 사용한 cDNA 증폭후 단일 세포의 유전자 발현 분석
구현예 III에 따른 cDNA 증폭을 이용하여, 저 및 고풍부 전사 모드를 검출할 목적으로, 4 선형 콜린성 뉴런 중의 다수의 유전자의 발현을 조사하였다. 단일 세포 수준의 어느 유전자 발현의 분석에서, 불충분 전사 및 세포 서브개체군에서 몇몇 mRNA의 비검출이라는 문제가 발생한다. 이 문제는 Suemeier et al(1996) J.Neurosci. 16, 6579-6591 및 Richardson et al.(2000) J. Neurochem 74, 839-846에서 논의되었다.
현재, 전사물이 검출되는 세포들의 수는 전사물의 풍부함과 관련된다고 받아들여진다. 즉, 개개의 세포에서 더 자주 전사물이 검출될수록 mRNA가 더 풍부하다. 그러므로, 외관상 동형의 세포 개체군의 연구에서, 몇몇 불충분 전사물는 오직 세포의 서브개체군에서 검출될 것이다. 예를 들면, 많은 GABAa 수용체 서브유니트 mRNA는 Yan 과 Surmeire(1997)에 의해 조사된 콜린성 뉴런의 100% 미만으로 검출되었고, 이것은 이들 전사물들이 모든 세포에서 불충분하게 발현되거나, 또는 세포의 특정 서브 개체군에서만 발현된다고 생각된다. 전자의 경우, 더 민감한 방법을 사용하면 주어진 전사물에 대해 양성으로 세포의 더 많은 부분이 드러날 것이며, 반면 후자의 경우는 주어진 전사물에서 세포의 %에 변화가 거의 없을 것이다.
표 1은 몇몇 검출된 유전자를 나타내며, 이들 세포중의 발현은 이미 특징지워졌고, 박테리아 양성대조는 검출되었으나 바이러스 음성대조는 아니다. 모든 하우스키핑(houskeeping) mRNA들은 모든 콜린성 뉴런에서 발현될 것으로 예상된다. 신경마커 다이노핀, 엔케팔린 및 PPTA는 선조체의 비콜린성 뉴론의 마커이며, 내피세포의 리포프로테인 리파아제이다.
또한, 표 1은 구현예 III의 사용이 전압민감 나트륨 채널 α6, trkC 및 NK3R mRNA가 검출되는 세포의 수를 증가시키고(이미 평가된 것과 비교하여), 이것은 상기 방법으로 단일 세포중의 불충분 전사를 검출할 수 있음을 나타낸다.
그 밖에, 이들 세포에서 발현될 것으로 예상되지 않은 다수의 mRNA가, 소마토스타틴(SST), mAChR3와 5, SUR 2 와 D3 및 D4 수용체를 포함하여 검출가능하며,이것은 다시 한번 본 방법의 높은 감도를 나타낸다.
대조적으로, 많은 GABA 수용체 서브유니트 mRNA는 오직 세포의 일부에서만 검출되었고 이것은, Yan과 Surmeier(1997)이 제안한 바와 같이, GABA 수용체 서브유니트의 다양한 보체들을 발현하는 이들 세포의 서브개체군이 존재한다는 것을 제안한다. 표 1의 다른 참조문헌은 다음과 같다: Yan & Surmeier (1996), Yan et al.,(1997) 및 Tallaksen-Greene et al(1998).
표 1.구현예 III을 이용하여 4개의 단일 콜린성 뉴런에서 검출되고 미량배열을 위해 잡종형성된 mRNA의 목록
예상되는(예를 들면, 하우스키핑 mRNA들은 모든 세포에서 발현될 것으로 예상) 또는 기타 방법으로 이미 나타난 세포들의 백분율을 두 번째 컬럼의 알맞는 참조와 함께 세 번째 칼럼에 나타내었다(% 양성 세포). 구현예 III 및 미량배열 후 해당 mRNA가 검출되는 콜린성 세포의 백분율은 칼럼 4에 나타내었다(구현예 III에 의한 양성조절).
하우스키핑 유전자 참고문헌 예상 %+ve 구현예 3에 의한 % +ve
리보소말GDPDHG6PDHNS에놀라제α튜블린중뉴로파일뉴로파일 68β액틴MAP2 예상예상예상예상예상예상예상예상예상 100100100100100100100100100 1007575100751001007575
신경세포 마커
다이노르핀엔케팔린SST파르발부민칼레티닌PPTAGAD67GAD65리포프로테인 리파아제 예상예상예상예상리차드슨 등(2000)예상예상 000모름모름028280 00505075075250
글루탄산염 수용체 서브 유니트1000
NR1NR2ANR2BNR2CNR2DGluR1GluR2GluR3GluR4mGluR1mGluR5 리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)탈라크센-그린 등(1998)탈라크센-그린 등(1998) 1005020080304030208965 1007550100100755050252550
GABA 수용체 서브유니트
GABAα1GABAα2GABAα3GABAα4GABAβ1GABAβ2GABAβ3GABAγ1GABAγ2GABAγ3 얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997) 존재존재739210039776210077 50251007550255007550
성장인자 수용체
trkAtrkBtrkC 리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000) 1007010 7510075
술포닐우레아 수용체
SUR1SUR2 리 등(1998)리 등(1998) 1000 75100
전압민감성 Ca 채널 서브유니트
α1Aα1Bα1Cα1Dα1E 얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997) 6090505050 752510010050
G 단백질 결합 수용체
mAChR1mAChR3mAChR4mAChR5아데노신A1R아데노신A2AR아데노신A2BR아데노신A3R도파민 D1R도파민 D2R도파민 D3R도파민 D4R도파민 D5RNK1RNK2RNK3R 얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)얀 & 서마이어(1997)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)얀 등(1997)얀 등(1997)얀 등(1997)얀 등(1997)얀 등(1997)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000) 3009006045306520100001008005 100251001001007550025755050501005075
전압민감 Na 채널 서부유니트
α1α2α3α4α5α6 리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000)리차드슨 등(2000) 45]5020모름모름5 0252510025100
박테리아 양성대조
lysthrtrp 예상예상예상 100100100 75100100
바이러스 음성대조
Dengue 예상 0 0

Claims (138)

  1. 샘플에 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서,
    (a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
    (c)단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을
    (ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 일차 프라이머; 및
    (ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머를 사용하여 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계로 이루어지되,
    (d)단계 (c)의 산물을 희석하여, 단계(c)의 산물의 cDNA 농도보다 2 ~ 100 배 희석된 농도의 cDNA를 함유하는 희석된 cDNA 용액을 얻는 단계;
    (e)내열성 DNA 폴리머라제를 단계 (d)의 희석된 cDNA 용액에 첨가하고, 추가로 핵산 프라이머들을 첨가함 없이, 추가 세트의 증폭반응 순환을 수행하는 단계 ;
    (f)단계 (e)에서 얻은 고분자량 cDNA 종, 바람직하기는 적어도 길이가 4.5 kb인 cDNA종을 분리하는 단계; 및
    (g)단계 (f)에서 분리한 고분자량 cDNA 종에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계로 이루어진 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (c)의 증폭반응이 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 수행되는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계(c)의 증폭반응이
    (ⅰ) 85 ~ 97 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
    (ⅱ) 한가닥 DNA 분자를, 마그네슘 농도가 1.5 ~ 6 mM일 때, 55 ~ 65 ℃의 온도에서 어닐링하는 단계;
    (ⅲ) 어닐링된 DNA 분자를, 마그네슘 농도가 4.5 mM일 때, 70 ~ 75 ℃의 온도에서 연장시키는 단계;
    (ⅳ)원하는 회수의 순환 동안 단계 (ⅰ)에서 단계 (ⅲ)을 반복하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계(c)에서 실시되는 상기 일차 및 이차 cDNA 가닥의 증폭이 30 ~ 50 증폭 순환으로 이루어지는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (e)의 각 증폭반응 순환이 다음 단계들로 이루어지는 방법.
    (ⅰ) 상기 샘플을 85 ~ 95 ℃의 온도에서 배양하여 한가닥 DNA 분자를 얻는단계;
    (ⅱ) 단계 (ⅰ)에서 얻은 한가닥 DNA 분자를 55 ~ 75 ℃에서 어닐링하는 단계;
    (ⅲ) 어닐링된 DNA 분자를 내열성 DNA 폴리머라제를 이용하여 65 ~75 ℃에서 연장하는 단계; 및
    (ⅳ) 원하는 회수의 순환동안 단계 (ⅰ)에서 (ⅲ)을 반복하는 단계.
  6. 제 1 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (e)에서 실시된 증폭반응 순환의 추가 세트가 10 ~ 40 순환으로 이루어지는 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 단계 (e)의 증폭반응이 마그네슘 농도가 1.5 ~ 4.5 mM일 때 수행되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (f) 다음에, 단계(f)에서 분리된 고분자량 DNA 분자의 적어도 일부가, 프라이머로서 제 1 힐 서열의 적어도 일부 및 제 2 힐 서열의 적어도 일부를 이용한 추가의 증폭반응을 겪는 것으로 이루어진 추가 증폭단계를 포함하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (g)가 다음 방법들 중 어느 하나를 포함하는 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
    (ⅲ) 얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에서 클로닝; 또는
    (ⅳ) 잡종형성 검정 또는 필요에 따라 비표지 또는 표지 기질을 이용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로, 각각
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA 또는 단계 (a)에서 얻어진 일차 가닥 cDNA 분자와 상보적이지 않은, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열;
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자와 잡종형성할 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열을 포함하는 핵산 서열의 개체군으로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 제 1 힐-화된 프라이머가 T7 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로, 각각
    (ⅰ) 샘플에 존재하는 mRNA 또는 단계 (a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA 분자와 상보적이지 않은, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 실제적으로 4 ~ 7 뉴클레오티드의 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 4 ~ 7 뉴클레오티드 길이의 제 1 가변서열;
    (ⅲ) 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 상기 일차 가닥 cDNA 분자의 매 1 kb마다 평균 한번씩 잡종형성 되도록 산출된 제 2 가변 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 서열의 개체군으로 구성되는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 힐 서열이 핵산 서열 5'-CTGCATCTATCTAATGCTCC-3'으로 이루어진 방법.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 제 2 힐-화된 프라이머가 T7 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함하는 방법.
  15. 샘플에 존재하는 mRNA에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서,
    (a)상기 mRNA 종을 제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b) 제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계, 여기서 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군의 각 프라이머들은 그의 힐 서열의 3' 말단에 또는 근처에 위치한, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 갖는다;
    (c)단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을
    (ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 일차 프라이머; 및
    (ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머를 사용하여 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계;
    (d)단계 (c)의 산물을 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 포함된 절단 부위 특히 드문 제한부위를 특별히 인식하는 적어도 하나의 제한 효소와 함께 배양하는 단계;
    (e)단계 (d)의 산물을 희석하여, 단계(c)의 산물의 cDNA 농도보다 2 ~ 100 배 희석된 농도의 cDNA를 함유하는 희석된 cDNA 용액을 얻는 단계;
    (f)내열성 DNA 폴리머라제를 단계 (e)의 희석된 cDNA 용액에 첨가하고, 추가로 핵산 프라이머들을 첨가함 없이, 추가 세트의 증폭반응 순환을 수행하는 단계 ;
    (g)단계 (f)에서 얻은 반응 혼합물에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계로 이루어진 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 단계(c)의 증폭반응이 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 수행되는 방법.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 단계 (c)의 각 증폭반응 순환이 다음 단계들로 이루어지는 방법.
    (ⅰ) 85 ~ 97 ℃의 온도에서 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
    (ⅱ) 한가닥 DNA 분자를 45 ~ 65 ℃에서 어닐링하는 단계;
    (ⅲ) 어닐링된 DNA 분자를 마그네슘이 농도 4.5 mM로 존재할 때 70 ~75 ℃에서 연장하는 단계; 및
    (ⅳ) 원하는 회수의 순환동안 단계 (ⅰ)에서 (ⅲ)을 반복하는 단계.
  18. 제 15항 내지 제 17항에 있어서, 단계 (c)에서 실시되는 상기 일차 및 이차 cDNA 가닥의 증폭이 30 ~ 50 증폭순환을 포함하는 방법.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로, 각각
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA 분자와 상보적이지 않은, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열;
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자로 잡종형성할 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열을 포함하는 핵산의 개체군으로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 2~4 뉴클레오티드의 가변서열이 다음의 가변서열중에서 선택되는 방법: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C, 또는 G 중에서 선택되는 뉴클레오티드.
  21. 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로, 각각
    (ⅰ) 샘플에 존재하는 mRNA 분자 또는 단계 (a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA 분자와 상보적이지 않으며, 힐 서열은 임의로 그의 3' 말단에 위치한 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 실제적으로 4 ~ 7 뉴클레오티드의 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 4 ~ 7 뉴클레오티드 길이의 제 1 가변서열;
    (ⅲ) 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 상기 일차 가닥 cDNA 분자의 매 1 kb마다 평균 한번씩 잡종형성 되도록 산출된 제 2 가변 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 서열의 개체군으로 이루어진 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 힐 서열이 핵산서열 5'-CTGCATCTATCTAGTACGCGT-3'으로 이루어진 방법.
  23. 제21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 제 2 가변서열이, 5'-CGAGA-3', 5'-CGACA-3', 5'-CGTAC-3' 및 5'-ATGCG-3'으로 이루어진 서열의 군으로부터 선택되며, 상기 제 2 가변서열은 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 방법.
  24. 제 15항 내지 제 23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머가 그의 힐 서열의 3' 말단에 위치한 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 제한부위가 상기 제 2 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 절단부위와 동일한 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 제한부위가 상기 제 2 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 제한부위와 상이한 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 단계 (d)에서 단계 (c)에서 증폭된 DNA 분자가 각각 일차및 제 2 힐-화된 프라이머의 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 인식하는 두 개의 제한효소로 배양되는 방법.
  28. 제15항 내지 제 27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (f)의 각 증폭반응 순환이 다음의 단계로 이루어지는 방법.
    (ⅰ) 85 ~ 95 ℃의 온도에서 샘플을 배양하여 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
    (ⅱ) 단계 (ⅰ)에서 얻어진 한가닥 DNA 분자를 55 ~ 75 ℃에서 어닐링하는 단계;
    (ⅲ) 어닐링된 DNA 분자를 65 ~75 ℃의 온도에서 내열성 DNA 폴리머라제를 사용하여 연장하는 단계; 및
    (ⅳ) 원하는 회수의 순환동안 단계 (ⅰ)에서 (ⅲ)을 반복하는 단계.
  29. 제 15항 내지 제 28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (f)에서 실시되는 증폭 반응 순환의 추가 세트가 20 ~ 40 순환으로 이루어지는 방법.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 단계 (f)의 증폭반응이 농도 3.5 mM의 마그네슘 존재하에 수행되는 방법.
  31. 제 15항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (f)에서 얻어진, 50 미만의 염기쌍의 길이를 갖는 DNNA 분자를 반응 혼합물로부터 분리되는 추가 단계를 포함하는 방법.
  32. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (g)가 다음 방법들 중 어느 하나로 이루어진 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
    (ⅲ) 얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에서 클로닝; 또는
    (ⅳ) 잡종형성 검정 또는, 필요에 따라 비표지 또는 표지 프라이머 또는 기질을 이용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
  33. (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA와 상보적이지 않은 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열;
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자로 잡종형성될 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열을 포함하는 핵산의 개체군으로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  34. 제 33항에 있어서, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열이 다음의 가변 뉴클레오티드 서열중에서 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C, 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 힐 서열이 그의 3' 말단에 위치한 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  36. 제 35항에 있어서, 절단부위 특히 드문 제한부위가 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael로 이루어진 효소의 드문 절단기 군으로부터 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  37. (ⅰ) 샘플에 존재하는 mRNA와 또는 단계 (a)에서 합성된 일차 가닥 cDNA 분자와 상보적이지 않고, 힐 서열은 그의 3' 말단에 또는 근처에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 4 ~ 7 뉴클레오티드의 실질적으로 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택된 4 ~ 7 뉴클레오티드 길이의 제 1 가변 서열; 및
    (ⅲ) 제 2 가변 뉴클레오티드 서열로 이루어진 힐-화된 프라이머 개체군.
  38. 제 37항에 있어서, 절단부위 특히 드문 제한부위가 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael로부터 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  39. 제 37항 또는 제 38항에 있어서, 힐 서열이 핵산서열 5'-CTGCATCTATCTAGTACGCGT-3'으로 이루어지는 힐-화된 프라이머 개체군.
  40. 제 37항 내지 제 39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가로 RNA 폴리머라제 프로모터 부위를 포함하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  41. (ⅰ)제 33항 내지 제 36항 중 어느 하나의 항에 따른 제 1 힐-화된 프라이머 개체군; 및
    (ⅱ)제 37항 내지 제 40항 중 어느 하나의 항에 따른 제 2 힐-화된 프라이머 개체군으로 이루어지는, 샘플에 존재하는 mRNA 종의 증폭용 키트.
  42. 제 41항에 있어서, 추가로
    (ⅲ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열로 이루어진 제 1 프라이머;
    (ⅳ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열로 이루어진 제 2 프라이머를 포함하는 키트.
  43. 제41항 또는 제 42항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위 서열을 인식하는 하나 또는 여러개의 제한 효소를 추가로 포함하는 키트.
  44. 제 41항 내지 제 43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가로 RNA 폴리머라제를 포함하는 키트.
  45. 샘플에 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서,
    (a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
    (c)단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을 다음 조건하에서 반응 당 0.02 ~ 200 ng 농도의 상기 제 2 힐-화된 프라이머를 사용하여 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계:
    (ⅰ) 78 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 DNA를 얻음
    (ⅱ) 필요에 따라, 40 ~ 72 ℃의 온도에서 상기 한가닥 DNA를 어닐링;
    (ⅲ) 내열성 DNA 폴리머라제의 존재하에 65 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링된 DNA를 연장;
    (d) 단계 (c)에서 얻은 DNA를 다음과 함께 추가의 여러 증폭 순환을 통해 증폭하는 단계
    (ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열을 포함하는 일차 프라이머; 및
    (ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열을 포함하는 이차 프라이머,
    여기서 각 프라이머 각각의 농도는 반응 당 10 ~ 500 ng이며, 그것에 의해 증폭된 DNA 분자의 개체군이 얻어짐; 및
    (e) 단계 (d)에서 얻은 DNA 분자들의 개체군을 회수하는 단계로 이루어진 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 단계 (c)에서 실시된 상기 제 1 및 제 2 cDNA 가닥이 30 ~ 50 증폭 순환으로 이루어지는 방법.
  47. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 단계 c)의 증폭반응이 내열성 DNA 폴리머라제와 내열성 교정 효소 모두의 존재하에 수행되는 방법.
  48. 제 45항 내지 제 47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (c)의 증폭반응이 4.5 mM 농도의 마그네슘 존재하에 수행되는 방법.
  49. 제 45항 내지 제 48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (d)에서 실시되는 증폭반응 순환의 추가 세트가 30 ~ 50 순환으로 이루어지는 방법.
  50. 제 45항 내지 제 49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (d)의 각 증폭반응이 다음 단계들로 이루어지는 방법:
    (ⅰ) 78 ~ 95 ℃의 온도에서 샘플을 배양하여 한가닥 DNA 분자를 얻는 단계;
    (ⅱ) 65 ~ 75 ℃의 온도에서 내열성 폴리머라제를 이용하여 어닐링된 DNA 분자를 연장하는 단계;
    (ⅳ)증폭 순환의 원하는 회수만큼 단계 (ⅰ)에서 단계(ⅲ)를 반복하는 단계.
  51. 제 45항 내지 제 50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (d)의 증폭반응이 2.5 mM 농도의 마그네슘 존재하에 수행되는 방법.
  52. 제 45항 내지 제 51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법이 다음으 추가 단계로 이루어진 방법:
    (f) 단계 (e)에서 얻어진 DNA 분자의 개체군에 함유된, 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계.
  53. 제 52항에 이어서, 상기 방법이, 50개 미만의 염기쌍의 길이를 갖는 단계 (f)에서 얻은 DNA 분자를 반응 혼합물로부터 버리는 추가 단계를 포함하는 방법.
  54. 제 52항 또는 제 53항에 있어서, 단계 (f)가 다음 방법들 중 어느 하나로 이루어지는 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
    (ⅲ) 얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에서 클로닝; 또는
    (ⅳ) 잡종형성 검정 또는, 필요에 따라 비표지 또는 표지 프라이머 또는 기질을 이용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
  55. 제 45항 내지 제 54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 일차 프라이머 개체군이 5' 말단에서 3' 말단으로,
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA와 상보성이 아닌 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 35 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열; 및
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자로 잡종형성될 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열로 이루어진 핵산의 개체군으로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열이 다음의 가변서열 중에서 선택되는 것인 방법: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드.
  57. 제 45항 내지 제 56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머가 그의 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 방법.
  58. 제 45항 내지 제 57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로,
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA 또는 단계 (a)에서 합성된 제 1 가닥 cDNA 분자와 상보성이 아닌 25 ~ 30 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드의 실질적으로 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 제 1 가변서열; 및
    (ⅲ) 제 2 가변 뉴클레오티드 서열로 이루어진핵산 서열의 개체군으로 이루어지는 방법.
  59. 제 45항 내지 제 58항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 그의 3' 말단에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열로 이루어진 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 제 2 힐-화된 프라이머가 상기 절단부위 특히 드문 제한부위로부터 아래로 위치하는 RNA 폴리머라제 결합부위로 이루어진 방법.
  61. 제 45항 내지 제 60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열들이 그들 각각의 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열로 이루어지는 방법.
  62. 제 58항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 제한부위 서열이 제 2 힐-화된 프라이머의 힐에 존재하는 절단부위 특히 드문 제한부위 서열과 동일한 방법.
  63. 제 61항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머의 절단부위 특히 드문 제한부위가 제 2 힐-화된 프라이머의 힐에 존재하는 절단부위 특히 드문 제한부위와 상이한 방법.
  64. 제 60 항 내지 제 63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (e) 다음에,
    (g) 단계 (e)에서 얻은 DNA 분자를, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 포함된 절단 부위 특히 드문 제한부위를 특별히 인식하는 적어도 하나의 제한 효소와 함께 배양하는 단계;
    (h) 단계 (d)의 산물을 희석하여, 단계(d)의 산물의 cDNA 농도보다 2 ~ 100배 희석된 농도의 cDNA를 함유하는 희석된 cDNA 용액을 얻는 단계;
    (i) 내열성 DNA 폴리머라제를 단계 (h)의 희석된 cDNA 용액에 첨가하고, 추가로 핵산 프라이머들을 첨가함 없이, 추가 세트의 증폭반응 순환을 수행하는 단계 ;
    (j) 단계 (g), (h) 및 (i)에서 얻은 DNA 분자의 개체군중에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계가 추가로 포함되는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머들의 힐이 각각 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 포함할 때, 상기 방법이, 단계 (g)에서 DNA 분자가 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 각각 인식하는 제한 효소와 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 64항 또는 65항에 있어서, 상기 방법이, 염기쌍 50개 미만의 길이를 갖는 단계 (g)에서 얻어진 DNA 분자를 반응 혼합물로부터 분리하는 추가단계를 포함하는 것인 방법.
  67. 제 64항 내지 제 66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (i)에서 수행되는 증폭반응 순환의 회수가 20 ~ 40인 방법.
  68. 제 61항 내지 제 64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 j)가 다음 방법중 어느 하나로 이루어지는 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭; 및
    (ⅲ) 얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에서 클로닝.
  69. 샘플에 존재하는 mRNA 종에 해당하는 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서,
    (a) 제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 종을 제공하는 단계;
    (b) 제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 사용하여 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 생성된 상기 이차 cDNA 가닥을 제 2 힐-화된 프라이머를 사용하여 여러 증폭순환을 통해 증폭시키는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 일차 및 이차 가닥을, (1) 그 일부가 특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보성 서열과 잡종형성하기에 충분한 길이의 뉴클레오티드인, 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부, (2)그 일부가 특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보성 서열과 잡종형성하기에 충분한 길이의 뉴클레오티드인, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부, 및 (3)프라이머 (1)과 (2)의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머를 이용하여 증폭시키되, 여기서 프라이머들의 총 농도는 다음 조건하에서 반응당 0.02 ~ 500 ng 범위인 단계:
    (ⅰ) 프라이머들을 단계 (c)에서 얻어진 cDNA 산물에 첨가;
    (ⅱ) 80 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 cDMA 분자를 얻음;
    (ⅲ) 내열성 DNA 폴리머라제 첨가;
    (ⅳ) 온도를 80 ~ 95℃에서 5초 ~ 1분동안 유지함;
    (ⅴ) 상기 한가닥 DNA를 어닐링하고 65 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링된 DNA 분자를 연장;
    (ⅵ)원하는 순환 횟수로 단계 (ⅳ)와 (ⅴ)를 반복.
    (e)단계 (d) 얻어진 DNA 분자의 개체군을 회수.
  70. 제 69항에 있어서, 단계 (d)가, 단계 (d)(ⅵ)에서 얻은 DNA 분자를 여러 증폭 순환을 통해, (a) 그 일부가 특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보성 서열과 잡종형성하기에 충분한 길이의 뉴클레오티드인, 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부, (b)그 일부가 특정의 잡종형성 조건하에서 그의 상보성 서열과 잡종형성하기에 충분한 길이의 뉴클레오티드인, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 일부, 및 (c)프라이머 (a)와 (b)의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머를 이용하여 증폭시키되, 여기서 프라이머들의 총 농도는 다음 조건하에서 반응당 0.02 ~ 200 ng 범위인 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (ⅶ) 80 ~ 95 ℃의 온도에서 한가닥 cDMA 분자를 얻음;
    (ⅷ) 단계 (ⅶ)에서 얻어진 한가닥 DNA 분자에 내열성 DNA 폴리머라제를 첨가;
    (ⅸ) 상기 한가닥 DNA를 65 ~ 75 ℃의 온도에서 어닐링하고 연장;
    (ⅹ) 원하는 순환 횟수로 단계 (ⅶ)와 (ⅸ)를 반복.
  71. 제 69항에 있어서, 단계 (c) (ⅵ)가 10 ~ 50 증폭순환으로 이루어지는 방법.
  72. 제 69항에 있어서, 단계 (c)의 증폭반응이 내열성 DNA 폴리머라제와 내열성 교정효소 모두의 존재하에 수행되는 방법.
  73. 제 69항에 있어서, 증폭단계 (b)와 (c)가 농도 2 ~ 5 mM인 마그네슘의 존재하에 수행되는 방법.
  74. 제 88항에 있어서, 증폭단계 (d)가 농도 2 ~ 3 mM인 마그네슘의 존재하에 수행되는 방법.
  75. 제 69항에 있어서, 단계 (b)와 (c)에서 프라이머들의 각각의 농도가 0.02 ~ 500 ng의 범위인 방법.
  76. 제 69항에 있어서, 프라이머들 각각의 농도가 0.02 ~ 90 ng의 범위인 방법.
  77. 제 69항에 있어서, 단계 (d)에서 프라이머들 각각의 농도가 100 ~ 500 ng 범위인 방법.
  78. 제 70항에 있어서, 단계 (d)(x)가 20 ~ 60 증폭 순환으로 이루어지는 방법.
  79. 제 70항에 있어서, 단계 (d)(ⅷ)에서 (ⅹ)의 증폭반응이 내열성 DNA 폴리머라제와 내열성 교정 효소 모두의 존재하에 수행되는 방법.
  80. 제 70항에 있어서, 단계 (d)(ⅷ)에서 (ⅹ)의 증폭반응이 마그네슘이 1.5 ~ 4 mM의 농도로 존재할 때 수행되는 방법.
  81. 제 80항에 있어서, 단계 (d)(ⅷ)에서(ⅹ)의 증폭반응이 마그네슘이 1.6 ~ 2.5 mM의 농도로 존재할 때 수행되는 방법.
  82. 제 80항에 있어서, 단계 (d)(ⅷ)~(ⅹ)의 증폭반응이 마그네슘이 2.0 mM의 농도로 존재할 때 수행되는 방법.
  83. 제 70항에 있어서, 단계 (d)(ⅶ)~ (ⅹ)에서 각각의 프라이머들의 농도가 10 ~ 500 ng의 범위인 방법.
  84. 제 83항에 있어서, 단계 (d)(ⅶ)~(ⅹ)에서 각각의 프라이머들의 농도가 30~ 300 ng의 범위인 방법.
  85. 제 69항에 있어서, 이차 cDNA 가닥의 합성단계(b)가 마그네슘이 3 ~ 5 mM의 농도로 존재할 때 수행되는 방법.
  86. 제 85항에 있어서, 마그네슘 농도가 4.5 mM인 방법.
  87. 제 69항 또는 제 70항에 있어서, 이차 cDNA의 합성단계(b)가 다음의 단계들로 이루어진 방법:
    (ⅰ)단계 (a)에서 얻어진 cDNA에 프라이머들을 첨가하는 단계;
    (ⅱ)한가닥 DNA 분자들을 80 ~ 95 ℃의 온도에서 얻는 단계;
    (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 얻은 혼합물에 DNA 폴리머라제와 교정 효소를 첨가하는 단계;
    (ⅳ)혼합물의 온도를 약 94℃에서 30초 ~ 5분동안 유지시키는 단계;
    (ⅴ)상기 한가닥 DNA를 40 ~ 72 ℃에서 어닐링하는 단계;
    (ⅵ)어닐링된 DNA 분자를 60 ~ 75 ℃에서 연장시키는 단계.
  88. 제 69항 또는 제 70항에 있어서, 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계(c)가 다음 단계들로 이루어지는 방법.
    (ⅰ)임의로 한가닥 DNA 분자를 80 ~ 95 ℃에서 내열성 DNA 폴리머라제의 존재하에 얻는 단계;
    (ⅱ)단계 (ⅰ)에서 얻은 한가닥 DNA 분자를 제 2 힐-화된 프라이머 개체군과 함께 40 ~ 60 ℃에서 어닐링하는 단계;
    (ⅲ)어닐링된 DNA 분자를 65 ~ 75 ℃에서 연장시키는 단계;
    (ⅳ)원하는 순환횟수만큼 단계 (ⅱ)~ (ⅲ)을 반복하는 단계.
  89. 제 88항에 있어서, 단계 (ⅳ)에서, 단계(ⅱ)~(ⅲ)가 10 ~ 60회 반복되는 방법
  90. 제 69항 또는 제 70항에 있어서, 상기 방법이 다음의 추가단계를 포함하는 방법:
    (f)단계 (e)에서 얻은 DNA 분자의 개체군에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계.
  91. 제 90항에 있어서, 상기 방법이, 50개 미만의 염기쌍 길이를 갖는 단계 (e)에서 얻어진 DNA 분자가 반응혼합물에서 버려지는 추가 단계를 포함하는 방법.
  92. 제 69항 또는 제 70항에 있어서, 단계 (f)가 다음 방법 중 어느 하나로 이루어지는 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
    (ⅲ)얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현벡터에서 클로닝;
    (ⅳ)잡종형성 검정 또는 필요에 따라 비표지 또는 표지 프라이머 또는 기질을 이용한 추가의 역전사 후의 유전자 특이 PCR 또는 잡종형성을 위한, 인비트로 RNA 전사.
  93. 제 69항 내지 제 92항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로,
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA 분자와 상보성이 아닌 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 35 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열; 및
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자로 잡종형성 가능한 2 ~ 4 뉴클레로티드 길이의 가변서열로 이루어진 핵산의 개체군으로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐de 프라이머 개체군에서 발견되는 것인 방법.
  94. 제 93항에 있어서, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열이 다음의 가변 뉴클레오티드 서열 중에서 선택되는 방법: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C, 또는 G 중에서 선택되는 뉴클레오티드.
  95. 제 69항 내지 94항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머가 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 방법.
  96. 제 95항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 5' 말단에 위치하는 방법.
  97. 제 95항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 상기 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 방법.
  98. 제 69항 내지 제 97항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머 개체군이, 5' 말단에서 3' 말단으로,
    (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA 또는 단계 (a)에서 합성된 제 1 가닥 cDNA 분자와 상보성이 아닌 25 ~ 75 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드의 실질적으로 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 제 1 가변서열로 이루어진 핵산 서열의 개체군으로 이루어지는 방법.
  99. 제 98항에 있어서, 상기 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 방법.
  100. 제 99항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 힐 서열의 5' 말단에 위치하는 방법.
  101. 제 100항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 방법.
  102. 제 99항에 있어서, 제 2 힐 프라이머의 힐 서열이 25 ~ 35 뉴클레오티드 길이인 방법.
  103. 제 98항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 45 ~ 75 뉴클레오티드 길이이며 RNA 폴리머라제 결합부위를 갖는 방법.
  104. 제 99항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 45 ~ 75 뉴클레오티드 길이이며 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 RNA 폴리머라제 결합부위를 krw는 방법.
  105. 제 99항 내지 제 104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (e) 다음에,
    (g) 단계 (e)에서 얻은 DNA 분자를, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 포함된 절단 부위 특히 드문 제한부위를 특별히 인식하는 적어도 하나의 제한 효소와함께 배양하는 단계;
    (h) 단계 (d)와 (g)의 마지막에 얻은 산물을 희석하여, 단계(d) 또는 (g)의 산물의 cDNA 농도보다 2 ~ 100 배 희석된 농도의 cDNA를 함유하는 희석된 cDNA 용액을 얻는 단계;
    (i) 내열성 DNA 폴리머라제를 단계 (h)의 희석된 샘플에 첨가하고, 추가로 핵산 프라이머들을 첨가함 없이, 추가 세트의 증폭반응 순환을 수행하는 단계 ;
    (j) 단계 (g), (h) 및 (i)에서 얻은 DNA 분자의 개체군중에 함유된 적어도 하나의 핵산 서열의 존재를 확인하는 단계가 추가로 포함되는 방법.
  106. 제 105항에 있어서, 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐들이 각각 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 포함할 때, 상기 방법이 단계 (g)에서, 상기 DNA 분자가 일차 및 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 각각 인식하는 제한효소와 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제 105항 또는 제 106항에 있어서, 상기 방법이 50 개 미만의 염기쌍 길이를 갖는 단계 (e)와(g)에서 얻은 DNA 분자가 반응 혼합물로부터 버려지는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  108. 제 105항 내지 제 108항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (i)에서 수행되는 증폭반응 순환 횟수가 20 ~ 40인 방법.
  109. 제 105항 내지 제 108항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (j)가 다음 방법 중 어느 하나로 이루어지는 방법:
    (ⅰ)특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 관심있는 서열의 검출;
    (ⅱ)특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 관심있는 서열의 증폭;
    (ⅲ)얻어진 DNA 분자를 복제 및/또는 발현 벡터에서 클로닝.
  110. 제 69항 내지 제 109항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머와 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 동일한 방법.
  111. (ⅰ) 샘플에 초기에 존재하는 mRNA와 상보성이 아닌 15 ~ 22 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 35 뉴클레오티드 길이의 올리고 dT 서열; 및
    (ⅲ) 그의 폴리-A 테일의 5' 말단에서 mRNA 분자로 잡종형성될 수 있는 2 ~ 4 뉴클레오티드 길이의 가변서열로 이루어지되,
    실질적으로 모든 가능한 가변서열 조합이 상기 제 1 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  112. 제 111항에 있어서, 2 ~ 4 뉴클레오티드의 가변서열이 다음의 가변 디뉴클레오티드 서열중에서 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군: 5'-(A 또는 G 또는 C)-N-1-3, 여기서 N은 A, T, C, 또는 G로부터 선택되는 뉴클레오티드.
  113. 제 111항 또는 제 112항에 있어서, 힐 서열이 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 포함하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  114. 제 113항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 힐 서열의 3'말단에 위치하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  115. 제 113항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위가 힐 서열의 5'말단에 위치하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  116. 제 113항에 있어서, 절단부위 특히 드문 제한부위가 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael로 이루어진 효소의 드문 절단기 군으로부터 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  117. 제 111항 내지 제 116항 중 어느 하나의 항에 있어서, 힐 서열이 50 ~ 80 %의 GC 함량을 갖는 힐-화된 프라이머 개체군.
  118. (ⅰ) 샘플에 존재하는 mRNA 또는 일차 가닥 cDNA 분자와 상보성이 아닌 25 ~ 75 뉴클레오티드 길이의 힐 서열;
    (ⅱ) 15 ~ 25 뉴클레오티드의 실질적으로 모든 가능한 서열 조합이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되도록 선택되는 15 ~ 25 뉴클레오티드 길이의 일차 가변서열로 이루어진 힐-화된 프라이머 개체군.
  119. 제 118항에 있어서, 각 프라이머가
    (ⅲ) 덜 엄격한 잡종형성 조건하에서 상기 일차 가닥 cDNA 분자의 모든 1 kb 부분에 평균적으로 한번씩 잡종형성 되도록 산출되는 이차 가변 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  120. (ⅰ) 제 119항에 있어서, 상기 이차 가변서열이 5'CGAGA-3', 5'-CGACA-3', 5'-CGTAC-3' 및 5'-ATGCG-3'으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 이차 가변서열 각각이 상기 제 2 힐-화된 프라이머 개체군에서 발견되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  121. 제 118항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열을 함유하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  122. 제 120항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열이 힐 서열의3' 말단에 위치하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  123. 제 121항에 있어서, 드문 절단부위 특히 드문 제한부위의 서열이 힐 서열의 5' 말단에 위치하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  124. 제 121항에 있어서, 절단부위 특히 드문 제한부위가 Not1, Bsshll, Narl, Mlul, Nrul 및 Nael로부터 선택되는 힐-화된 프라이머 개체군.
  125. 제 111항 내지 제 124항 중 어느 하나의 항에 있어서, 힐 서열이 50 ~ 70 %의 GC 성분을 갖는 힐-화된 프라이머 개체군.
  126. 제 115항에 있어서, 힐 서열이 25 ~ 35 뉴클레오티드 길이 범위인 힐-화된 프라이머 개체군.
  127. 제 115항에 있어서, 힐 서열이 45 ~ 75 뉴클레오티드 길이 범위이며 RNA 폴리머라제 결합부위를 포함하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  128. 제 127항에 있어서, RNA 폴리머라제 결합부위가 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 힐-화된 프라이머 개체군.
  129. 샘플에 존재하는 mRNA 종을 증폭하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트가 다음으로 이루어지는 것인 키트:
    (ⅰ)제 11항 내지 제 126항 중 어느 하나의 항에 따른 제 1 힐-화된 프라이머;
    (ⅱ)제 117항 내지 제 127항 중 어느 하나의 항에 따른 제 2 힐-화된 프라이머 개체군.
  130. 제 126항에 있어서, 상기 키트가 추가로 다음을 포함하는 키트:
    (ⅲ)(a)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열 및 (b)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 15 연속 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 프라이머;
    (ⅳ)(a)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열 및 (b)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 15 연속 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 2 프라이머.
  131. 제 129항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머와 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열이 동일한 키트.
  132. 제 130항에 있어서, 일차 및 이차 프라이머의 서열이 동일한 키트.
  133. 제 129항 내지 제 132항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위 서열를 인식하는 제한효소를 추가로 포함하는 키트.
  134. 제 129항 내지 제 133항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열에 존재하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위 서열을 인식하는 제한효소를 추가로 포함하는 키트.
  135. 제 129항 내지 134항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 폴리머라제르 추가로 포함하는 키트.
  136. 샘플에 소량으로 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서,
    (a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
    (c)단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을
    (ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 일차 프라이머; 및
    (ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머와 함께 내열성 DNA 폴리머라제의 도움으로 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계로 이루어지되, 상기 방법이
    (d')고분자량 DNA 분자의 비율을 증가시키는 단계;
    (e')고분자량 DNA 분자에 존재하는 특정 핵산 서열을 이용 또는 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 샘플에 소량으로 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법에 있어서, 상기 방법이
    (a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계, 여기서 상기 일차 및/또는 제 2 힐-화된 개체군의 프라이머 각각이 임의로 그의 힐 서열의 3' 말단에 위치하는 드문 절단부위 특히 드문 제한부위를 함유하며;
    (c)단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을
    (ⅰ)제 1 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 일차 프라이머; 및
    (ⅱ)제 2 힐-화된 프라이머의 힐 서열의 적어도 일부를 포함하는 이차 프라이머를 사용하여 여러 증폭순환을 통해 증폭하는 단계;
    (d')어느 큰 DNA 분자를 절단하고 적어도 하나의 상기 일차 또는 제 2 힐-화된 프라이머의 힐 부분을 억제하여 이후 단계에서 가교 형성을 막는 단계;
    (e')최초 DNA의 5' 이상의 서열을 갖는 긴 이중가닥 산물의 양을 증가시키는 단계로 이루어지는 방법.
  138. (a)제 1 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 mRNA를 역전사하여 일차 가닥 cDNA 서열을 제공하는 단계;
    (b)제 2 힐-화된 프라이머 개체군을 이용하여 상기 일차 가닥 cDNA 서열로부터 이차 cDNA 가닥을 합성하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 생성된 일차 및 이차 cDNA 가닥들을 원하는 회수만큼의 증폭순환을 통해 증폭하여 양쪽 말단에 힐을 갖는 이차 cDNA 가닥을 형성하고 및 분석되어질, 샘플에 초기에 존재하는 긴 mRNA 종들에 해당하는 이차 cDNA 가닥들의 수를 증가시키는 단계;
    (d)단계 (c)에서 생성된 DNA 분자들을 단계(c)의 조건보다 더 엄격하며 고분자 cDNA의 합성을 감소시킬 수 있는 잡종형성 조건하에 증폭시키는 단계; 및
    (e)단계 (d)에서 얻어진 DNA 분자들의 개체군을 회수하는 단계로 이루어진 샘플에 소량으로 존재하는 mRNA 종에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 수를 증가시키는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100590621B1 (ko) * 2004-09-21 2006-06-19 (주)지노믹트리 하이힐 프라이머를 이용한 ｒｎａ의 선형 증폭방법
CN107075732A (zh) * 2014-11-25 2017-08-18 深圳华大基因研究院 游离dna测序文库的构建方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1275738A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Method for random cDNA synthesis and amplification
US7414111B2 (en) 2001-09-19 2008-08-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
AU2002341752B2 (en) * 2001-09-19 2008-04-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
GB0216026D0 (en) * 2002-07-10 2002-08-21 Cambridge Biotechnology Ltd Nucleic acid amplification method
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
ES2380923T3 (es) * 2004-04-07 2012-05-21 Exiqon A/S Procedimientos de cuantificación de microARN y ARN interferentes pequeños
US8192937B2 (en) 2004-04-07 2012-06-05 Exiqon A/S Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs
JP4777631B2 (ja) * 2004-09-27 2011-09-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸増幅分析法および装置
US8278429B2 (en) * 2007-04-05 2012-10-02 Genera Biosystems Limited Oligonucleotide amplification primers for targeting oncogenic HPV
CN102685048B (zh) * 2012-05-28 2014-10-29 上海师范大学 一种突发信号盲均衡算法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7653691A (en) * 1990-04-05 1991-10-30 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Modified rna template-specific polymerase chain reaction
GB9618050D0 (en) * 1996-08-29 1996-10-09 Cancer Res Campaign Tech Global amplification of nucleic acids
GB9817055D0 (en) * 1998-08-05 1998-09-30 Medical Res Council Reverse transcription and amplification processes and primers therefore

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100590621B1 (ko) * 2004-09-21 2006-06-19 (주)지노믹트리 하이힐 프라이머를 이용한 ｒｎａ의 선형 증폭방법
CN107075732A (zh) * 2014-11-25 2017-08-18 深圳华大基因研究院 游离dna测序文库的构建方法
CN107075732B (zh) * 2014-11-25 2020-08-04 深圳华大智造科技有限公司 游离dna测序文库的构建方法

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