FR2639651A1 - Procede de caracterisation d'un echantillon analytique d'adn genomique par extension de sequences de nucleotides, et kits de diagnostic pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN génomique par référence à au moins un locus génétique informatif. Ce procédé consiste à amplifier la séquence minisatellite au niveau d'au moins un locus génétique informatif par l'utilisation d'amorces et par extension de ces amorces. Application : kits de diagnostic destinés à la mise en oeuvre du procédé précité à des fins de caractérisation génétique, d'analyses de détermination de paternité et de maternité et d'analyses de médecine légale.

Description

L'invention concerne de manière générale un procédé de caractérisation

d'un échantillon d'ADN génomique

et des séquences de nucléotides utilisées dans ce procédé.

La présente invention concerne en particulier l'utilisation de séquences de nucléotides comprenant des oligonucléotides hybridables à des régions adjacentes a des loci génétiques informatifs. Le procédé de la présente invention peut être utilisé, par exemple, dans des contestations de paternité, en médecine légale ou dans la prévention, le diagnostic et

le traitement de troubles ou de prédispositions génétiques.

Le procédé est particulièrement utile lorsqu'une quantité limitée à une seule molécule d'un locus informatif est

présente dans l'échantillon d'ADN génomique.

Des procédés de caractérisation génétique sont connus dans la pratique. Le brevet du Royaume-Uni N 2 166 445 (Lister Institute) décrit différentes séquences d'ADN qui peuvent être utilisées comme sondes pour une hybridation simultanée à un certain nombre de sites polymorphes à l'intérieur de génomes d'animaux, par

exemple de l'homme, et de végétaux, permettant la produc-

tion d'une "empreinte digitale d'ADN" constituée de bandes

d'ADN marquées ayant des poids moléculaires différents.

L'empreinte digitale d'ADN, dans sa totalité, est carac-

téristique de l'individu concerné et l'origine des

différentes bandes peut être suivie à travers les ascen-

dants de l'individu et peut, dans certains cas, être considérée comme étant associée à certains troubles génétiques. La demande de brevet européen publiée sous le N 238 329 décrit différentes séquences d'ADN qui peuvent

être utilisées comme sondes pour une hybridation indi-

viduelle à des sites polymorphes distincts à l'intérieur du génome d'un animal, par exemple de l'homme. Des procédés de caractérisation génétique utilisant une ou plusieurs de ces

sondes sont décrits.

Les régions minisatellites répétitives en tandem dans l'ADN des vertébrés présentent fréquemment de hauts degrés de variabilité allélique en ce qui concerne le nombre des motifs répétés [1-4]. Des sondes d'hybridation capables de détecter des minisatellites multiples et de produire des empreintes digitales d'ADN spécifiques d'un

individu ont été élaborées [5-7], ainsi que des mini-

satellites humains clones qui donnent des sondes spécifi-

ques de loci pour des loci hypervariables distincts [5, 8-

10]. Ces marqueurs génétiques hautement informatifs ont trouvé une large application dans de nombreux domaines de la génétique, comprenant l'analyse des liens [9, 11-13], la détermination de la parenté, par exemple dans les contestations de paternité et d'immigration [6, 10, 14, 15], le contrôle des transplants de moelle osseuse, et pour l'identification des individus en médecine légale [10, 18, 19]. Cependant, les applications au typage d'échantillons de médecine légale, tels que des échantillons de sang et de sperme ou des racines de cheveux, sont limitées par la sensibilité des sondes d'hybridation, nécessitant au moins ng d'ADN humain relativement non dégradé pour un typage avec des sondes minisatellites spécifiques de loci [10] et 0,01 g d'ADN pour une analyse avec des sondes d'empreinte

digitale d'ADN multilocus [6].

Lorsqu'une quantité suffisante d'ADN est

disponible dans l'échantillon analytique, les descriptions

ci-dessus offrent des procédes de caractérisation génétique intéressants et fiables. Cependant, l'efficacité des techniques précitees est réduite lorsque la quantité d'ADN génomique dans l'échantillon analytique est limitée, par exemple dans des applications de médecine légale dans lesquelles seuls de petits nombres de copies de la molécule

d'ADN à analyser sont souvent disponibles.

En conséquence, il est souhaitable de proposer un autre procédé de caractérisation génétique qui soit particulièrement approprié pour de petits échantillons

d'ADN génomique.

K. Kleppe et collaborateurs, dans J. Mol.Biol.

(1971), 56, 341-361, décrivent un procédé d'amplification d'une séquence d'ADN désirée. Le procédé fait intervenir la dénaturation d'un duplex d'ADN pour former des brins simples. L'étape de dénaturation est mise en oeuvre en présence d'un excès suffisamment important de deux amorces d'acide nucléique qui s'hybrident & des régions adjacentes à la séquence d'ADN désirée. Par refroidissement, deux structures sont obtenues, chacune contenant la totalité de la longueur du brin servant de modèle, complexée de manière appropriée avec l'amorce. De l'ADN-polymérase et une quantité suffisante de chaque nucléoside-triphosphate requis sont ajoutées, ce qui permet d'obtenir deux molécules du duplex initial. Le cycle ci-dessus de dénaturation, d'addition d'amorce et d'extension est répété jusqu'à obtention du nombre approprié de copies de la séquence d'ADN désirée. Il est indiqué qu'il peut être nécessaire d'effectuer un ajustement de la concentration de l'amorce. Le procédé précité est désigné actuellement sous le nom de réaction en chaîne avec une polymérase (RCP), de la manière revendiquée dans les brevets des Etats- Unis d'Amérique N 4 683 195 et N" 4 683 202, réaction dans laquelle l'amplification d'une séquence d'acide nucléique donnée sur un modèle est effectuée par extension d'une amorce d'acide nucléique en présence de

polymérase Taq ou bien du fragment de Klenow de l'ADN-

polymérase I de E.coli. Le procédé d'amplification est généralement répété pendant un nombre de cycles allant jusqu'à environ 50. Les exemples proposés concernent

seulement des séquences d'ADN courtes, comprenant générale-

ment quelques centaines de paires de bases.

L'amplification enzymatique d'ADN par la réaction en chaîne avec une polymérase (RCP, [20]) permet l'analyse de ces faibles quantités d'ADN humain. La spécificité remarquable de la polymérase Taq thermostable a fortement simplifié la RCP [21] et a permis l'extension du typage de certaines catégories de polymorphisme d'ADN humain à des racines de cheveux isolees [22] et même a des cellules somatiques isolées et au sperme [23]. A ce jour, dans la plupart des travaux, la RCP a été utilisée pour amplifier de courtes régions d'ADN humain, habituellement

longues de quelques centaines de paires de bases [21-23].

Des polymorphismes par substitution de bases peuvent être détectés par hybridation de produits de RCP avec des oligonucléotides spécifiques d'alleles [22, 23], par analyse de la séquence d'ADN des produits de RCP [24] ou bien, si la substitution de bases affecte un site de restriction, par clivage des produits de RCP avec une endonucléase de restriction [25]. Des polymorphismes par délétion/insertion peuvent être également analysés par détermination des dimensions des produits de RCP par électrophorèse sur gel [22]. La plupart de ces systèmes de marquage sont cependant dimorphes et leur utilité, par

exemple en médecine légale, est limitée par leur variabi-

lité relativement faible dans les populations humaines.

De la manière expliquée ci-dessus, la RCP a été

restreinte à l'amplification de séquences d'ADN relative-

ment courtes et il existe des doutes sérieux quant à la possibilité d'utiliser avec succès la RCP en rapport avec des séquences d'ADN longues, notamment si une reproduction fidèle de ces séquences est nécessaire. Effectivement, il a été indiqué qu'une valeur de 2kb représente la limite absolue de la RCP [21]. Cependant, d'autres difficultés surgissent lorsque l'ADN de l'échantillon contient des séquences répétitives, par exemple des séquences répétées en tandem d'une séquence centrale ou séquence consensus particulière telle que celles trouvées au niveau de loci

hypervariables hautement informatifs.

Ainsi, il peut être envisagé qu'une hybridation s'effectue entre des produits d'amplification, ayant ainsi pour résultat la formation d'un réseau et la terminaison prématurée de la réaction RCP au niveau d'un site de réunification. Ces produits de RCP incomplets pourraient alors jouer le rôle, par une réunification hors registre au brin minisatellite complémentaire, de substrat pour l'extension dans le cycle suivant d'amplification. Il en

résulterait la formation de produits multiples d'ampli-

fication erronés. L'application de la RCP à l'amplification

de minisatellites, en particulier d'alleles de mini-

satellites longs contenant de nombreux motifs répétés, est ainsi susceptible de provoquer la perte de la fidélité de

séquence et de donner un nombre de produits d'ampli-

fication tellement grand que les résultats d'un tel procédé ne seront pas significatifs et ne représenteront pas non plus de manière précise les alleles de minisatellites dans

l'ADN génomique de départ.

Bien que E. Boerwinkle et L. Chan (1988) dans un résumé présenté au 39th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics à la NouvelleOrléans (Octobre 1988) [résumé (0548) 12.5] se réfèrent à l'utilisation de la RCP sur des loci hypervariables répétés en tandem, les dimensions de la région désignée comme cible qu'ils utilisaient étaient relativement faibles, correspondant toujours à une longueur inférieure à un kilobase. En outre, ils ne décrivent pas la manière de mettre en application la technique de RCP pour parvenir à une reproduction fidèle de séquences et à l'obtention d'un résultat significatif et précis. S. Odelberg et collaborateurs, dans une publication présentée à l'American Academy of Forensic Science (Février

1988) ont, d'autre part, décrit leur application infruc-

tueuse de la RCP à des minisatellites plus volumineux et leurs découvertes confirment les difficultés prévues, décrites précédemment, puisqu'ils ont été incapables d'utiliser la RCP pour obtenir un résultat significatif ou utile quelconque eu égard à la multiplicité des produits d'amplification détectés. La présente invention est basée sur la découverte qu'une quantité limitée à une seule molécule d'un locus génétique informatif dans un échantillon d'ADN génomique peut être soumise & une amplification fidèle a de

nombreuses reprises pour donner des produits d'amplifica-

tion qui sont utiles à des fins de caractérisation génétique, en effectuant l'amplification à l'intérieur d'un cadre défini, de sorte qu'une quantité suffisante du produit d'extension désiré soit produite pour être détectable, mais que le rendement en produit d'extension soit inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre des brins complémentaires répétés en tandem

servant de modèles.

Conformément à une caractéristique de la

présente invention, il est proposé un procéde de carac-

térisation d'un échantillon analytique d'ADN génomique par référence a un ou plusieurs témoins, procédé qui consiste à amplifier la séquence minisatellite au niveau d'au moins un locus informatif dans l'échantillon analytique par (i) hybridation de l'échantillon analytique avec une amorce en rapport avec chaque locus informatif à amplifier, l'amorce étant hybridable a un brin simple de l'échantillon analytique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite du locus informatif à amplifier dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétise un produit d'extension de l'amorce qui soit

complémentaire de, et recouvre, ladite séquence mini-

satellite du brin de l'échantillon analytique; (ii) séparation du produit d'extension ainsi formé du modèle sur lequel il a été synthétisé pour donner des molécules monocaténaires; (iii) lorsque cela est requis, hybridation de l'amorce de l'étape (i) avec des molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii) dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétisé un produit d'extension d'amorce a partir du modèle d'au moins l'une des molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii); et (iv) détection des produits d'amplification et comparaison de ces produits à un ou plusieurs témoins; le procédé étant mis en oeuvre de sorte qu'il soit obtenu une quantité du produit d'extension désiré suffisante pour être détectable, mais telle que le rendement en produit d'extension soit inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre des

brins complémentaires du minisatellite servant de modèle.

On notera que le cycle d'hybridation d'amorce à au moins l'une des molécules monocatenaires obtenues par séparation du produit d'extension formé à partir du modèle sur lequel il a été synthétise et, en outre, synthèse du produit d'extension, puisse être répété un nombre de fois aussi faible ou aussi grand que cela est requis, d'une part, pour obtenir une quantité de produit d'extension suffisante pour être détectable et, d'autre part, pour parvenir à un rendement en produit d'extension inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre des brins minisatellites complémentaires servant de modèles. Lorsque le procédé de la présente invention est mis en oeuvre en utilisant une amorce en rapport avec chaque locus informatif, il peut être avantageux de soumettre l'échantillon analytique d'ADN génomique à une restriction avant amplification. A cet égard, lorsqu'une seule amorce est utilisée en rapport avec un locus informatif, des produits d'extension de longueurs variables sont susceptibles d'être formés. Par exemple, une série de produits ayant la même extrémité 5', mais des extrémités 3' différentes, peut être formée. Un profil plus net du produit peut être obtenu si l'échantillon analytique d'ADN génomique est soumis a une restriction avant amplification. Lorsqu'une restriction est effectuée, n'importe quelle

endonucléase de restriction appropriée peut être utilisée.

Puisque les séquences entourant le locus informatif concerné sont connues et la séquence de reconnaissance d'enzymes de restriction connus est également connue, l'homme de l'art ne rencontrera aucune difficulté à choisir à cette fin un enzyme de restriction approprié. Lorsqu'une seule amorce est utilisée en rapport avec chaque locus informatif, une amplification arithmétique est obtenue mais, lorsque deux de ces amorces sont utilisées, une amplification exponentielle peut être obtenue. Ainsi, le procédé de la présente invention est de préférence mis en oeuvre en utilisant deux amorces en rapport avec chaque

locus informatif à amplifier.

Ainsi, conformément à une autre caractéristique de la présente invention, il est proposé un procédé de caractérisation d'un échantillon analytique d'ADN génomique par référence à un ou plusieurs témoins, procédé qui consiste à amplifier la séquence minisatellite au niveau

d'au moins un locus informatif dans l'échantillon analyti-

que par (i) hybridation de l'échantillon analytique avec deux amorces en rapport avec chaque locus informatif à amplifier, chaque amorce étant hybridable à des brins simples de l'échantillon analytique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite du locus informatif à amplifier dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétise un produit d'extension de chaque amorce qui soit complémentaire de, et recouvre, ladite séquence minisatellite de chaque brin de l'échantillon analytique, le produit d'extension synthétisé à partir de chaque amorce, lorsqu'il est séparé de son complément, pouvant ainsi servir de modèle pour la synthèse du produit d'extension de l'autre amorce; (ii) séparation du produit d'extension ainsi formé du modèle sur lequel il a été synthétisé pour donner des molécules monocaténaires; (iii) lorsque cela est requis, hybridation des amorces de l'étape (i) avec les molécules monocaténaires obtenues à l'étape (ii) dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétisé un produit d'extension d'amorce à partir du modèle de chacune des molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii); et (iv) détection des produits d'amplification et comparaison de ces produits à un ou plusieurs témoins; le procéde étant mis en oeuvre de sorte qu'il soit obtenu une quantité du produit d'extension désiré suffisante pour être détectable, mais telle que le rendement en produit d'extension soit inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre des

brins complémentaires du minisatellite servant de modèle.

De la manière précitee, on notera que le cycle

d'hybridation d'amorce à chacune des molécules mono-

caténaires obtenues par séparation du produit d'extension formé du modèle sur lequel il a été synthétisé et, en outre, synthèse du produit d'extension, peut être répété un nombre de fois aussi faible ou aussi grand que cela est nécessaire, d'une part pour obtenir une quantité de produit d'extension suffisante pour être détectable et, d'autre part, pour obtenir un rendement en produit d'extension inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre des brins complémentaires du

minisatellite servant de modèle.

Un locus informatif comprend des régions d'ADN génomique par référence auxquelles des individus peuvent être différenciés. Des loci hypervariables, dont il peut exister plus de 1000 dans le génome humain, peuvent être

utiles comme loci informatifs. Le pouvoir de différencia-

tion d'un locus génétique informatif est souvent désigné sous le nom de variation ou polymorphisme allélique. En général, plus le degré de variation ou polymorphisme allélique est grand entre des individus, plus le pouvoir de différenciation du locus en question est grand. A titre de

règle directrice convenable, les loci génétiques infor-

matifs comprennent ceux dans lesquels au moins 3 alleles différents peuvent être différenciés dans n'importe quel échantillon de 100 individus non apparentés choisis au

hasard. On notera que le terme "individu" a été utilisé ci-

dessus pour désigner non seulement des êtres humains, mais également d'autres animaux ainsi que des plantes et des lignées cellulaires dérivées de ces êtres humains, de ces animaux et de ces plantes. Cependant, dans chaque cas, l'échantillon d'individus non apparentés choisis au hasard

est toujours pris dans la même espèce.

En ce qui concerne les applications de la présente invention à l'homme, l'expression "locus génétique informatif", telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, peut être définie en variante comme désignant un locus au niveau duquel au moins 3 allèles différents peuvent être différenciés dans l'ADN extrait de n'importe laquelle de 20 lignées cellulaires choisies parmi les suivantes, lignées cellulaires qui ont été déposées dans l'American Type Culture Collection (ATCC): Lignée cellulaire N de dépôt ATTC Hela CCL2

RPMI 2650 CCL 30

Detroit 532 CCL 54 Detroit 525 CCL 65 Detroit 529 CCL 66 Detroit 510 CCL 72 Lignee cellulaire N de dépôt ATTC

WI-38 CCL 75

Citrullinemia CCL 76

EB-3 CCL 85

RAJI CCL 83

JIYOYE (P-2003) CCL 87

WI-26 CCL 95

Detroit 551 CCL 110

RPMI 6666 CCL 113

RPMI 7666 CCL 114

CCRF-CEM CCL 119

CCRF-SB CCL 120

HT-1080 CCL 121

HG 261 CCL 122

CHP3 (M.W.) CCL 132

LL47 (MaDo) CCL 135

HEL 299 CCL 137

LL24 CCL 151

HFLI CCL 153

WI-1003 CCL 154

MRC-5 CCL 171

IMR-90 CCL 186

LS 174T CCL 188

LL 86(LeSa) CCL 190 LL 97A (AIMy) CCL 191 HLF-a CCL 199 CCD-13Lu CCL 200 CCD-8Lu CCL 201 CCD-llLu CCL 202 CCD-14Br CCL 203 CCD-16Lu CCL 204 CCD18Lu CCL 205 CCD-19Lu CCL 210 Hs888Lu CCL 21

MRC-9 CCL 212

Lignée cellulaire N de dépôt ATTC Daudi CCL 213 CCD-25Lu CCL 215

SW403 CCL 230

NAMALWA CRL 1432

Toutes les lignees cellulaires précitées sont disponibles sans restriction auprès de 1'ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 208852-1776, USA, et sont énumérées dans le ATTC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas. Toutes les lignees cellulaires précitees ont

été déposées dans 1'ATTC avant 1985.

Des loci informatifs convenables pour l'utili-

sation dans la présente invention comprennent des loci auxquels peuvent s'hybrider des séquences de nucléotides et des sondes décrits dans la demande de brevet européen N 238 329, ainsi que les loci informatifs dont les séquences d'accompagnement sont décrites dans cette demande. D'autres loci informatifs comprennent des régions d'ADN génomique identifiées par les sondes minisatellites décrites par S. J. Gendler et collaborateurs dans PNAS, 84, (1987), pages 6060-6064. Un locus particulièrement informatif est le locus alpha-globine HVR 5' décrit dans

le American Journal of Human Genetics, 1988, 43, pages 249-

256.

Des loci informatifs convenables pour l'utili-

sation dans la présente invention comprennent ceux atteignant 15 kilobases. Des loci informatifs plus appropriés comprennent ceux qui donnent des allèles courts, la limite supérieure étant par exemple inférieure à 10 kilobases, en particulier inférieure à 8, de préférence inférieure à 6 kilobases. De manière convenable, les alleles possèdent une longueur d'au moins 1, en particulier d'au moins 1,5, notamment d'au moins 2 kilobases. Ainsi, des intervalles convenables vont de 1, 1,5, 2, 2,5 ou 3 à 6, 7, 8, 9 ou 10 kilobases. Eu égard aux performances du procédé de la présente invention en partant d'une seule molécule d'ADN d'un échantillon, il est préféré que la longueur des allèles n'excède pas 6 kilobases. Les loci informatifs préférés sont également ceux dont les allèles présentent une longueur dans un intervalle restreint. Il a été observé que ces références ne sont pas toujours compatibles avec l'obtention de loci hautement informatifs puisque ces loci sont habituellement associés a de grands nombres de motifs répétés minisatellites et a des allèles longs. Cependant, l'homme de l'art n'aura aucune difficulté

à choisir à cette fin des loci convenables.

Des amorces capables d'hybridation à des

régions d'ADN d'un échantillon entourant des loci infor-

matifs sont nécessaires pour donner des points pour l'initiation de la synthèse de produits d'extension à travers des loci génétiques informatifs. Ces amorces sont généralement des oligonucléotides et sont de préférence des oligonucleotides monocaténaires pour une efficacité maximale d'amplification, mais peuvent être en variante des oligonucléotides bicaténaires. Si l'amorce est bicaténaire, elle est tout d'abord traitée pour séparer ses brins avant

d'être utilisée pour préparer des polynucléotides d'exten-

sion. Les amorces doivent être suffisamment longues pour amorcer la synthèse des polynucléotides d'extension. La longueur exacte de ces amorces dépend de plusieurs facteurs, comprenant la température et la nature de l'amorce. En général, une amorce comprend un nombre d'au moins sept nucléotides, tel qu'un nombre de 15 à nucleotides, par exemple de 20 à 25 nucléotides. On

notera qu'il n'est pas nécessaire que la séquence d'accom-

pagnement corresponde à la séquence exacte de la région d'accompagnement du locus informatif. Il est simplement nécessaire que les séquences respectives soient homologues

à un degré permettant une hybridation. Le produit d'exten-

sion ainsi obtenu doit également être capable de jouer le rôle de modèle pour une hybridation ultérieure avec une amorce. La longueur maximale de n'importe quelle amorce n'est pas considérée comme étant déterminante et est

seulement limitée par des considérations pratiques.

Habituellement, l'ADN de l'échantillon analytique est un ADN bicaténaire et il convient donc pour choisir des amorces qui s'hybrident à des brins différents de l'ADN de l'échantillon et à des positions relatives le long de la séquence de sorte qu'un produit d'extension synthétisé a partir d'une amorce puisse jouer le rôle de modèle pour l'extension de l'autre amorce en un acide

nucléique de longueur définie.

Les régions d'accompagnement de certaines des régions génétiques informatives identifiées par les sondes décrites dans le brevet du Royaume-Uni N 2 166 445 et la demande de brevet européen N 238 329 précités et les séquences de nucléotides hybridables à ces régions n'ont pas été décrites precédemment et, individuellement et en n'importe quelle association, représentent d'autres aspects de la présente invention. Les séquences sont indiquées aux pages précédant les exemples. Les régions génétiques informatives sont indiquées sur certaines séquences par le terme MINISATELLITE. De la manière expliquée ci-dessus, n'importe quelle séquence convenable peut être utilisée

comme amorce. Des exemples de certaines séquences con-

venables comme amorces ont été soulignés. A des fins de netteté et de brièveté, seul le motif répété externe de chaque côte de chaque rangée minisatellite en tandem est représenté sur certaines séquences (en capitales), séparé par une série de lettres x pour indiquer l'omission de la plupart des motifs répétés. Puisqu'il existe rarement la totalité du nombre de motifs répétés dans chaque série, les motifs répétés externes peuvent être hors registre les uns par rapport aux autres, mais conservent la relation

correcte avec l'ADN immédiatement adjacent.

Une région répétée en tandem antérieurement

insoupçonnée a été trouvée par séquençage de pMS31 (EP-

238329); cette série est séparée du minisatellite principal par 10 bases, et consiste en plus de 7 motifs répétés d'une séquence riche en G/C de 19 pb qui s'étend au site Sau3AI définissant l'extrémité du clone. Cette région, appelee 31B, est riche en G sur le brin opposé au brin riche en G du minisatellite principal. Une cartographie du génome montre que, si tant est qu'elle soit variable, la région 31B apporte une contribution minime a la variation

de longueur au niveau de ce locus (résultats non repré-

sentés). Deux loci ont été détectés par pMS228 (Armour et collaborateurs, 1989, NAR, 17, 13, 4925-4935) dans des conditions drastiques. Des analyses généalogiques ont

montré que ces loci étaient fortement liés. Une carto-

graphie de restriction de l'ADN cloné, confirmée ulté-

rieurement par une analyse de la séquence, a démontré la présence de deux régions répétitives en tandem distinctes, appelées 228A et 228B (figure 8) . Un resondage de i'ADN humain avec des sous-clones provenant de pMS228 a mis en évidence la détection par 228A du locus plus grand, à hybridation plus intense, et la détection par 228B des allèles plus petits, à hybridation plus faible. Ces minisatellites ont été localisés, en utilisant des hybrides de cellules somatiques et par hybridation in situ, à 17p13-pter. Les propriétés des loci détectés par pMS51 et pMS228, ainsi que par d'autres minisatellites, sont

résumées sur le tableau 2.

Les preuves anterieures de la disposition d'une paire de minisatellites dans pMS43, de la manière décrite dans la demande de brevet du RoyaumeUni de la Demanderesse NI 8813781.5, ont été confirmees par les résultats d'analyse de séquence et deux autres exemples (pMS31 et pMS228) de clones minisatellites contenant deux séries

répétées en tandem étroitement adjacentes ont été élucidés.

A l'opposé de pMS43, dans lequel le locus 43B "secondaire"

présente un faible hétérozygotisme (30 %), les deux mini- satellites dans pMS228 possèdent des hétérozygotismes supérieurs a 80 %.

Le minisatellite 228B (figure 8, tableau 2) associe un fort hétérozygotisme (85 %) a une plage restreinte de dimensions des allèles (0,6-5,5 kb); cette association en fait un locus très utile pour l'analyse de

minisatellites par la réaction en chaîne avec une polymé-

rase [23]. En général, la plupart des loci variables possedent une large plage de dimensions d'alleles, de sorte que de nombreux alleles excèdent les dimensions maximales actuellement amplifiables par ce procédé, donnant ainsi un profil incomplet. A l'opposé, au niveau du locus détecte par 228B, une étude de 48 sujets non apparentés a montré que 95 % des alleles possédaient des dimensions inférieures à 2 kb et que l'allele ayant la plus grande dimension (5,5 kb) entrait bien dans les limites de l'intervalle amplifiable (J. Armour et A. Jeffreys, non publié). Il a été montré par la Demanderesse que même l'allele le plus grand au niveau de ce locus peut être amplifié, ce qui offre la perspective d'un profil complet et cependant utilement informatif à partir de l'amplification au niveau

d'un seul locus.

Il a éte isolé un minisatellite clone nouveau, appelé MS29, qui détecte de manière remarquable deux loci variables dans l'ADN humain. Un locus, situé dans la région terminale du bras court du chromosome humain N 6, est également présent dans le grand apex. Le second locus du minisatellite est situé en position interstitielle sur le chromosome 16pll et est absent à la fois chez les primates autres que l'homme et chez certains humains. MS29 a été isolé d'une banque génomique L47 produite a partir d'ADN enrichi en séquences minisatellites, de la manière décrite

par ailleurs (Wong et collaborateurs, Ann. Hum. Genet.

(1987) 51, 260-288). MS29 comprend une séquence répétée de 39 pb. Cette séquence consiste en 13 motifs déviés répétés du trinucléotide YAG dans lequel Y représente l'une

quelconque des bases A, G, C et T. Les séquences d'accom-

pagnement de ce minisatellite peuvent être élucidées en utilisant des techniques de séquençage en elles-mêmes connues. En résumé, les séquences d'accompagnement nouvelles intéressantes sont celles de MS1, MS29, MS31A et MS31B, MS32, MS43A et MS43B, MS51, MS228A et MS228B. En outre, il est proposé également à présent une autre information de séquences d'accompagnement nouvelles pour la sonde minisatellite p g3 (Wong et collaborateurs, Nucleic Acids Research, 14, 11, (1986), 4605-4616), ainsi que pour les sondes 33,1, 33,4 et 33,6 (brevet du Royaume-Uni

N0 2 166 445/The Lister Institute of Preventive Medicine).

Un groupe particulier de séquences d'accom-

pagnement comprend celles des sondes minisatellites MSl, MS29, MS31A et MS31B, MS32, MS43A et MS43B, MS51, MS228A et

MS228B.

D'autres groupes particuliers de séquences d'accompagnement sont constitués par les séquences de

n'importe lesquelles des sondes minisatellites précitees.

De la manière précitée, les minisatellites MS29 et MS31B sont nouveaux et les séquences répétées et/ou séquences d'accompagnement de l'un ou l'autre de ces minisatellites représentent d'autres aspects particuliers

de la présente invention.

Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre en rapport avec n'importe quel locus informatif convenable. Ainsi, par exemple, des amorces peuvent être préparées pour une hybridation aux séquences d'accompagnement, par exemple, de la région hypervariable ' du gène de l'insuline humaine (Am.J.Hum Genet, 1986, 39, 291-229), du locus alphaglobine HVR 5' (Am.J.Hum. Genet, 1988, 43, 249-256), du locus alphaglobine HVR 3' (EMBO. J, 1986, 5, 1957-1963), de la région hypervariable au niveau du locus zêta-globine (PNAS, 1983, 80, 5022-5026), ou du locus Ha Ras (Nature, 1983, 302, 33-37). La présente Demande comprend également, & titre de reférence, un groupe

de sondes proposées par Ray White. Les séquences d'accom-

pagnement de ces sondes peuvent être élucidées en utilisant

des techniques connues.

Les polynucléotides d'accompagnement étendus préparés conformément au procédé de la présente invention

représentent un autre aspect de l'invention. Ces poly-

nucléotides peuvent être présents sous forme d'une seule copie ou de copies multiples. Lorsque des copies multiples sont présentes, il s'agit de copies fidèles et, de préférence, pratiquement dépourvues de réseau ou de réticulation entre des brins distincts. Le terme "fidèle" signifie que l'information de caractérisation génétique devant être obtenue a partir des dimensions et de la composition de la copie est pratiquement la même pour toutes les copies. De manière convenable, les amorces

étendues comprennent une séquence identique a, ou complé-

mentaire de, un locus génétique informatif de plus de un kilobase. D'autres valeurs convenables sont des valeurs de 1,5 et 2 kilobases. De manière convenable, le nombre de copies représente les produits d'au moins 3, 5, 7, 9, 13 ou cycles du procéde d'amplification de la présente invention. Conformément a encore un autre aspect de la présente invention, il est proposé un mélange contenant des copies fidèles multiples d'amorces étendues (répondant à la définition ci-dessus). De la manière précitée, le mélange est pratiquement dépourvu de réseau ou de réticulation

entre des brins distincts.

Les amorces destinées à être utilisées dans la présente invention peuvent être préparées par des procédés analogues à ceux connus dans la pratique. Par exemple, lorsqu'une séquence d'accompagnement donnée est connue, une amorce nucléotidique convenable peut être préparée par synthèse directe. Des techniques de clonage peuvent également être utilisées pour reproduire des fragments d'ADN contenant des séquences entourant des loci génétiques informatifs. En variante, des fragments d'ADN comprenant des loci génétiques informatifs peuvent être identifiés et, en utilisant un mode opératoire analogue a celui des procédés

mentionnés ci-dessus, une séquence de nucléotides hybri-

dable au locus génétique informatif peut être soumise à une extension. Puis le produit ainsi obtenu peut être modifié directement, par exemple par clivage, pour préparer une amorce convenable ou bien sa séquence peut être déterminée et des amorces convenables peuvent être ensuite préparées

par synthèse directe.

De la manière expliquée ci-dessus, 1'ADN de l'échantillon est généralement bicaténaire. En conséquence, il est souhaitable de séparer les brins de l'acide nucléique avant qu'il puisse jouer le rôle de modèle pour l'extension d'une amorce. La séparation des brins peut être effectuée par n'importe quel procédé convenable, comprenant des moyens physiques, chimiques ou enzymatiques. De manière convenable, une dénaturation par la chaleur est utilisée pour parvenir à une dénaturation allant jusqu'à environ 99 %. Les températures usuelles utilisées vont de 85 à

C pour des temps allant d'environ 1 à 10 minutes.

Une amorce est de préférence utilisée pour chaque brin particulier de l'ADN de l'échantillon. En ce qui concerne l'ADN bicaténaire, deux amorces sont donc normalement utilisées. En général, les amorces sont choisies pour permettre à l'extension de s'effectuer à travers le locus informatif dans le même sens le long des deux brins, c'est-a-dire dans le sens 5' à 3' ou vice versa. L'extension s'effectue de préférence dans le sens 5' à 3'. Les amorces sont convenablement hybridées à

l'échantillon d'ADN génomique dans des conditions connues.

En général, cela peut s'effectuer dans une solution aqueuse tamponnée, de préférence à un pH de 7 à 9. Un large excès d'amorce est de préférence présent dans le mélange réactionnel. On notera que, dans certaines applications de diagnostic, la quantité d'ADN de l'échantillon peut ne pas

être connue, mais un excès d'amorces est souhaitable.

L'amplification est convenablement effectuée par addition des désoxyribonucléoside-triphosphates dATP, dCTP, dGTP et dTTP au mélange de synthèse, en des quantités adéquates, et la solution résultante peut être, par exemple, chauffée ensuite à une température comprise par exemple dans l'intervalle de 90 à 100 C pendant un temps compris par exemple dans l'intervalle d'environ 1 à minutes. Apres cette période de chauffage, on peut laisser la solution refroidir à une température de 30 à 70C, qui est la température préférable pour l'hybridation de l'amorce. Lorsque la polymérase Taq est utilisée comme inducteur pour faciliter la réaction d'extension, il est préférable d'effectuer l'hybridation de l'amorce à une température de 50 à 70 C, par exemple de 50 à 65 C, telle

qu'une température de 60 C.

Il a été trouvé que l'hybridation de l'amorce est avantageusement effectuée dans un tampon de force

ionique réduite et à une température élevée de réunifica-

tion. Cela réduit la possibilité de mauvais amorçage. Les expressions "force ionique réduite" et "température élevée de réunification" doivent être considérées comme désignant des conditions aux valeurs extrêmes ou bien hors des intervalles qui seraient généralement considérés comme étant appropriés par tout biologiste moléculaire pour une réaction donnée d'amplification d'acide nucléique. A titre d'illustration, mais non a titre limitatif, un tampon convenable possede une force ionique suffisante pour permettre le maintien d'un pH stable de 7 à 9. Des températures convenables de réunification sont généralement comprises dans l'intervalle de 50 à 60'C. On notera que les conditions réactionnelles réelles dépendent de la ou des

amorces utilisées.

Il est possible ensuite d'ajouter au mélange de réunification un agent approprié pour l'induction ou la catalyse de la réaction d'extension, puis on peut laisser la réaction s'effectuer dans des conditions connues dans la pratique. L'inducteur est convenablement un enzyme. Des enzymes convenables comprennent le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase I de E. coli, l'ADN-polymérase de T4 et, en particulier, la polymérase Taq. D'autres ADN-polymérases disponibles, la transcriptase inverse et d'autres enzymes, comprenant des enzymes thermostables qui facilitent la

réaction d'extension, peuvent également être utilisés.

Le brin nouvellement synthétisé et son brin d'acide nucléique complémentaire forment une molécule bicaténaire qui est utilisée dans les étapes suivantes du procédé. Les étapes de séparation des brins et d'extension de la séquence peuvent ensuite être répétées d' la manière

requise en utilisant les modes opératoires r znnés ci-

dessus. Des conditions convenables pour ces es opéra-

toires sont indiquées dans les brevets des Etats-Unis

d'Amérique N 4 683 202 et N 4 683 195 incorporés ci-

dessus à titre de référence. De la manière expliquée dans

les brevets précités, les cycles de séparation et d'exten-

sion peuvent être mis en oeuvre par étape ou bien, avantageusement, plusieurs cycles sont mis en oeuvre, par exemple d'une manière semiautomatisée ou totalement automatisée. Dans la technique classique de RCP, on laisse généralement la réaction d'amplification s'effectuer pendant un nombre de cycles allant jusqu'a environ 50. A l'opposé, conformément au procédé de la présente invention, il est considéré que la limite supérieure pour l'amplifica- tion est égale à environ 25 cycles lorsque l'on part d'une seule copie d'ADN de l'échantillon. Lorsque des quantités de départ plus importantes d'échantillon d'ADN génomique

sont disponibles, un plus petit nombre de cycles d'amplifi-

cation est requis. Le cadre convenable de cycles d'amplifi-

cation dépend de la quantité d'ADN de l'échantillon et la nature de la séquence est illustrée à présent, mais en aucune manière à titre limitatif, par référence à l'analyse suivante: L'analyse suivante concerne des réactions d'amplification utilisant des volumes de 10 j1 et des temps d'extension de 15 minutes. En considérant un hétérozygote distinct pour des allèles A et B, lorsque A est plus long

que B, il peut être prévu que A présente donc une amplifi-

cation moins efficace que B. La limite inférieure du nombre de cycles C1 est imposée par la sensibilité des sondes, qui peuvent détecter environ 0, 1 pg de produit. Pour détecter l'allele A, un nombre de cycles suffisant est nécessaire pour obtenir comme produit plus de 0,1 pg d'allele A. De manière similaire, une quantité d'allele B supérieure à

0,1 pg doit être produite pour détecter les deux alleles.

La limite supérieure du nombre de cycles Cu est limitée par le rendement en les deux alleles A et B. C1 et Cu peuvent être estimés de la manière suivante: Soit M = masse initiale d'ADN génomique humain

(en picogrammes).

a = longueur de l'allele A (kb) b = longueur de l'allele B (kb) ga = gain d'allèle A par cycle de RCP gb = gain d'allèle B par cycle de RCP Puisque les dimensions du génome diploïde sont égales à 6x106 kb chez l'homme, la quantité initiale d'allèle A est égale à M. a pg 6 x 106 De manière similaire, la quantité initiale d'allèle B est égale à M. b pg 6 x 106 Le rendement en allèle A, après C cycles, est donné par: M. a gac pg 6 x 106 et il en est de même pour l'allele B. D'après la figure 3, le rapport entre le gain g par cycle et la longueur L de l'allèle sont donnés par l'équation gL = 2 - 0,093 L (L = 0-6 kb) La limite inférieure du nombre de cycles C1 est donc fixée par la valeur inférieure de C, soit M'a (2 0,093.L)c > 0;1 6 x 106 et M.b (2 - 0,093.L)C > G01 6 x 106 La limite supérieure Cu est également fixée par la valeur supérieure de C lorsque le rendement total des deux allèles est inférieur à 1000 pg, c'est-a-dire M__a (2 - 0,093.L)c + M.b (2 - 0,093.L)c <1000 6X106 6 x 106

C1 et Cu peuvent être déterminés par réitéra-

tion sur ordinateur. Quelques exemples classiques sont: M a b Ci C< pg kb kb

000 5 1 7 20

1 000 3 2 10 24

6 0X5 19 27

* 6 6 1 27+ 32+

+ signifie que le cadre devient très étroit et peut disparaître pour de très petites quantités d'ADN avec

des dimensions d'alleles largement différentes.

* N.B. Ce modèle ne tient pas compte du fait qu'une variation aléatoire notable existe en ce qui concerne le nombre de molécules-cibles dans des quantités d'ADN génomique humain inférieures à 100 pg (équivalentes à 17 cellules). L'analyse effectuée sur 6 pg d'ADN correspond à l'amplification d'une seule molécule-cible de chaque allele. Les homozygotes peuvent être aisément adaptés au modèle. Cu reste inchangé, tandis que C1 est défini par le nombre de cycles requis pour obtenir plus de 0,05 pg de chaque allele (c'est-a-dire une quantité totale supérieure

à 0,1 pg).

Des réactions avec des volumes différents peuvent également être admises. C1 est défini par le nombre de cycles requis pour parvenir à une quantité supérieure à 0,1 pg de chaque allele dans la réaction totale. Cu est défini par le nombre de cycles requis pour parvenir à une quantité inférieure à 1000 pg de produit total pour 10 ul de mélange réactionnel. Pour une réaction RCP en grand volume, C1 est inchangé, mais Cu est légèrement supérieur à la valeur obtenue avec un mélange réactionnel de 10 pl. L'intervalle de cycles d'amplification qui donne une quantité appropriée de produit d'amplification pour la caractérisation (0,1 à 4000 pg de produit) est, par exemple, de 10-15 cycles pour 100 ng d'ADN génomique, 18 cycles pour 1 ng et 25 cycles pour l'amplification d'une seule cellule (6 pg). Il peut être nécessaire que le nombre de cycles de RCP soit accru pour détecter des allèles plus grands qui présentent une amplification de manière moins efficace. Suivant la longueur des allèles, 1000 à 106 pg de

produit fidèlement amplifiés peuvent être obtenus.

Un avantage particulier du procédé revendiqué est la possibilité d'identifier des différences pouvant

s'abaisser à un motif répété dans une région informative.

Le procéde de la présente invention est considéré également comme offrant une reproduction fidèle de grands loci génétiques informatifs, par exemple de loci allant jusqu'à

kb, tels que des loci atteignant environ 10 kb.

Il a été trouvé également que les problèmes liés à la formation d'un réseau de copies amplifiées d'ADN d'un échantillon ainsi que la formation de produits d'extension incomplets peut conduire à l'apparition de quantités notables d'ADN minisatellite monocatenaire de dimensions hétérogènes. Cet ADN monocaténaire peut donner des taux importants de produits non spécifiques dans la RCP. Ce problème peut être surmonté ou au moins réduit par

l'utilisation d'enzymes qui digèrent ou dégradent spécifi-

quement l'ADN monocaténaire et qui laissent l'ADN bi-

caténaire intact. L'enzyme préféré est la nucléase Sl. La digestion des produits finals de la RCP avec un tel enzyme a pour résultat un profil plus net des produits de RCP révélé à l'étape finale de détection. En conséquence, dans un aspect apprécié de la présente invention, le procédé de la présente invention comprend l'utilisation d'au moins un

enzyme qui digère ou dégrade spécifiquement l'ADN mono-

catenaire, tout en laissant l'ADN bicaténaire intact, ce qui réduit les problèmes posés par les produits non

spécifiques dans la RCP.

La détection des produits amplifiés peut être effectuée par n'importe quel moyen convenable. Les produits amplifiés peuvent être identifiés et caractérisés, par exemple, en utilisant l'électrophorèse sur gel, suivie, le

* cas échéant, par une hybridation avec des sondes hybri-

dables aux loci informatifs qui y sont présents, puis, par exemple, par une autoradiographie dans laquelle des sondes radiomarquees sont utilisées. Des modes opératoires convenables sont décrits dans la demande de brevet européen publiée sous le N 238 329. En variante, des procédés plus directs peuvent être utilisés. La séparation des produits d'amplification sur un gel peut être suivie par la visualisation directe de ces produits. Une coloration directe avec, par exemple, le bromure d'éthidium peut être effectué lorsqu'une quantité suffisante de produit est disponible. Les séquences de nucleotides d'accompagnement

peuvent, en variante, porter un constituant de visualisa-

tion ou de marquage et ce constituant de visualisation ou marqueur peut ensuite être détecté en utilisant n'importe quel procédé convenable. Ces constituants de visualisation

ou marqueurs peuvent comprendre des constituants radio-

actifs et non radio-actifs, mais ces derniers sont

préférés.

Le nombre de régions informatives qui peuvent être amplifiées simultanément n'est pas considéré comme

étant restreint autrement que par des limitations prati-

ques. Par exemple, il serait possible d'amplifier simul-

tanement jusqu'à vingt régions, convenablement dix régions et, en particulier, jusqu'à huit, sept, six, cinq ou quatre régions. Dans un aspect apprécié, six régions sont

amplifiées simultanément.

Les polynucléotides d'accompagnement de la présente invention peuvent être fournis convenablement dans un kit de diagnostic. En conséquence, un autre aspect de la présente invention concerne un kit comprenant deux polynucléotides complémentaires d'accompagnement capables d'hybridation à des régions d'ADN d'un échantillon adjacentes à un locus informatif, conjointement avec un échantillon-témoin d'ADN et des instructions pour leur utilisation. Des exemples de sondes convenables et appréciées comprennent les sondes mentionnées à différents

endroits dans la description. Le kit peut comprendre

également comme réactifs des nucléotides pour l'extension des polynucléotides d'accompagnement à travers le locus génétique informatif et/ou des promoteurs d'extension tels

qu'un enzyme.

Des exemples de séquences d'accompagnement de régions génétiques informatives, qui peuvent être utilisées dans le procédé de la présente invention, sont mentionnés dans les pages suivantes. Des détails d'un groupe de sondes à un seul locus qui sont capables d'hybridation à des régions génétiques informatives sont décrits également. Ce groupe de sondes a été décrit par Ray White à une réunion à

Quantico, Virginie, en Mai 1988. Des amorces polynucléoti-

diques capables d'hybridation à des régions adjacentes à ces régions génétiques informatives peuvent être préparées de la manière indiquée précédemment et utilisées dans le procédé de la présente invention. Des amorces peuvent être préparées en rapport avec n'importe laquelle de ces régions

ou ensembles de régions pour donner des produits d'exten-

sion de n'importe quel groupe désiré de régions informa-

tives. MS1.1lb: Sécuence d'accompDanement en 5'

s'étendant dans le minisatellite.

' GCCATTTCCATAAACACGTATCGAGTACCTAATACTACAAAGTACCATACCAGGTACTAC

I I I I. 1 I

3' CGGTAAAGGTATTTGTGCATAGCTCATGGATTATGATGTTTCATGGTATGGTCCATGATG

ATCCATTAAGAATGTTAATAATTAATCACGCTCATTTGCCATTGATTTTAAGTTTCCATT

TAGGTAATTCTTACAATTATTAATTAGTGCGAGTAAACGGTAACTAAAATTCAAAGGTAA

TTATTAGTGTCAGGTGGTTTTACCAATGGCCTCCCTTTCCTTCATGCTTACACTAAAAAA

AATAATCACAGTCCACCAAAATGGTTACCGGAG G GAAAGGAAGTACGAATGTG ATTTTTT

AGAACAACAGTAATGATTGTATGTCATGCTTTTCTGTGATGAGCCTTGATGTTTTTAACA

I II I I i

TCTTGTTGTCATTACTAACATACAGTACGAAAAGACACTACTCGGAACTACAAAAATTGT

GAATTTGATAGTTTGAGACATAAAAATTTTTGAAAAACCAACTCACGTTTCCAAACAAAA

CTTAAACTATCAAACTCTGTATTTTTAAAAACTTTTTGGTTGAGTGCAAAGGTTTGTTTT

GTGAAAAGGAGAGCTGGATTCCAGCCCCGCCACCCCAGCAAATTGAGAAATCACCCCTTG

CACTTTTCCTCTCGACCTAAGGTCGGGGCGGTGGGGTCGTTTAACTCTTTAGTGGGGAAC

CTGTGAGTCAGTGGGT 3'

I C- MINISATELLITE

GACACTCAGTCACCCA 5'

pMSl.lb: Sécquence d'accompagnement en 3', partant au niveau du site Eco Rv. à environ 50 pb de

l'extrémité du minisatellite.

EcoRV l

' TGGATATCTCATGCATGGGAGCCCAGATTGGGTGGTCCTGGCCCTCATGGGTTGCATATG

3' ACCTATAGAGTACGTACCCTCGGGTCTAACCCACCAGGACCGGGAGTACCCAACGTATAC

CTTCTTTGCTGCCTGTGCTGTAAGAACCATGCTAAGAACAGACCTGTGCCCCTGGGCTCT

I I I I I i

GAAGAAACTACGGACACGACATTCTTGGTACGATTCTTGTCTGGACACGGGGACCCGAGA

CAGCAGTGCATGTGCCAGGGAGCTGTGGGTGTGGAAGCAGCAGGAAAAACAGCTGTGCCA

Il I I I. . 1 'I

GTCGTCACGTACACGGTCCCTCGACACCCACACCTTCTGTCGTCCTTTTTGTCGACACGGT

GGTCGGGGAGGGGAAGGGACAGAGAACCAGGGGCAGGGAAAGAGTTCCAAGCTCCTTGGC

t I I I I

CCAGCCCCTCCCCTTCCCTGTCTCTTGGTCCCCGTCCCTTTCTCAAGGTTCGAGGAACCG

CACCGNACCATGTGCTCATGGCCTCCTCCCCGGCTGTCAGTTTCCCTATCTGTAAAATGA 3'

I I I I T I

GTGGCNTGGTACACGAGTACCGGAGGAGGGGCCGACAGTCAAAGGGATAGACATTTTACT 5'

pMS1 - Le bloc répété en tandem est condensé aux deux motifs répétés externes (en capitales) séparés par un certain nombre de

lettres X, un motif répété nouveau étant souligné.

I gatcctaaccctccaaccatgaagcccaaatctgaccccatgacccctgatttgtaaaccCccgcctggcc 73 tgtacaggtccagccccagctgctgtgccttccccggttcagttcctagtgaaggtgcgggagctgagca

atgaaggcactgttggggaaactgtagcagggaaggggcaggctctatggagggtccttgatacacaccgc.

217 acccccaagccttaagcagacatcaggaaaacccagtgaagggccgcaggagagatgtgtggacctgcacd-

289 tgcacctccgggctctgtccatgccccaccagctacgcacttgtaccagttggtgagcgtcatcatgacgt 361 cagtLagguccagcaccaggcagaagtggaagaagga9tagctgtaggtgacgccgtcctgCtcgttgtcaa 433 ggcccggccctcacaggctgccacctgctgctgctgctgctgtgttggcgtctagcataggtgggcactcct 505 ggtctgcatcaggctgttcacctgccggtggtctqaggagcgcagactgcaggggagggaggaaggtgggc 577 aatagatagctctggcgttggtcataacactggacacaaatggtcccagagcctcagaggccagcgacccg 649 ttactgggcctgggagttaacaaactgctttgcctctcaactctacccctacCcccactcccattttctgt 721 tqaccttqaqcaaaacacttaacCtctctgaqcctctgattccttqtctgtaaaataaqgqataatcgtac 793 tcctctagagggctgctggggggactagacggaataatgatgtaaggtctctagcatagtgCttggcacag 865 atataaattcaatcaacagtcactattgttaggattgttcctttgccatttccataaacacgtatCgagta 937 ctaatactacaaagtaccataccaggtactacatccattaagaatgttaataattaatcacgctcatttgc 1009 attgattttaagtttccatttatattagtgtcaggtggttttaccaatggcctccctttccttcatgcttac 1081 ctaaaaaaagaacaacagtaatgattgtatgtcatgcttttctgtgatgagccttgatgtttttaacagaa 1153 ttgatagtttgagacataaaaatttttgaaaaaccaactcacgtttccaaacaaaagtgaaaaggagagct 1225 gattccagccccgccaccccagcaaattgagaaatcaccccttgctgtgagtcagtgggtCCCTATCCAxx 1297 xxxxxxxxxxxxCTATCTACCaaataccatatggatatctcatgcatgggagcccagattgggtggtcctg 1369 ccctcatgggttgcatatgcttctttgctgcctgtgctgtaagaaccatgctaagaacagacctgtgcccc 1441 gggctctcagcagtgcatgtgccagggagctgtgggtgtggaagcagcaggaaaaacagctgtgccaggtc 1513 gggaggggaagggacagagaaccaggggcagggaaagagttccaagctCcttggccaccggcaccatgtgc 1585 catggcctcctccccggctgtcagtttccctatctgtaaaatgaaggtaatcaggccaggagtggtgcact 1657 ctgtaatccaaacactttggcaggctgaggtaggaggattgcttgggccaggagttcaaggccatcctggg 1729 aacatagtgtctctacaaaaaaaa 0% tn La séquence répétée minisatellite dans le clone MS29. La région dans la séquence consensus répétée de 39 pb similaire à l'extrémité 3' de la sequence centrale

minisatellite (GGAGGTGGGCAGGARG, Jeffreys et collabora-

teurs, 1985) est marquée avec des astérisques. Les déviations de la séquence consensus sont représentées pour deux blocs de 4 motifs répétés contigus (a-d, e-h) clonés de manière aléatoire à partir de MS29. La séquence répétée de 39 pb consiste en 13 motifs déviés répétés de

PyAG.

consensus TTGCAGTAGCTGTGGCAGGAGGAGTAGCAGCATCAGCAG = (YAG)13

--±)-- > ----+ --- >--

a -CG T b G c G G d G A e C G f --- G g --- GG C h C --- G pMS31: Séquence d'accompagnement en 5' s'étendant dans le minisatellite

' GATCCACTCGGAACCACCTGCAGTTAGGAGCAAGCCTAGAATGTTCTGGAAGGATTGAAG

I XI t I lI

3' CTAGGTGAGCCTTGGTGGACGTCAATCCTCGTTCGGATCTTACAAGACCTTCCTAACTTC

CCAGCCTTGTCTGAGGCCCTGGGAAAGTGGCCTGGACATGGGGATGTGGCTGGAGGACCC

I! i I l.

GGTCGGAACAGACTCCGGGACCCTTTCACCGGACCTGTACCCCTACACCGACCTCCTGGG

GAGGAAGATGCTGAAGTCCTGTGTGAGGCCCGGTCTGGGAGCCACGGCCCCTCCCCCACT

I,_,, t t

CTCCTTCTACGACTTCAGGACACACTCCGGGCCAGACCCTCGGTGCCGGGGAGGGGGTGA

CAGTCCGGCCTGCTGGGGTTTCCTGCCGGGCCTCCCTCAGAGCCCACGGCTCCCCAGGTG

I I II

GTCAGGCCGGACGACCCCAAAGGACGGCCCGGAGGGAGTCTCGGGTGCCGAGGGGTCCAC

GCTCTGGCCCGGGAGCCACAGGCACAACCTAGGCAGGGGAAGCCGCATGCACAATGTTGG

l

CGAGACCGGGCCCTCGGTGTCCGTGTTGGATCCGTCCCCTTCGGCGTACGTGTTACAACC

CTCTTCCCTTTGCACGCTGGACGGTGGCGTTTTGCCTTTCGCCTTGGGCTCAGGAGGGGC

I t! I. l

GAGAAGGGAAACGTGCGACCTGCCACCGCAAAACGGA&AGCGGAACCCGAGTCCTCCCCG

TGGGGGGTCAGGAGGGGCCATGAAGGGGACCTGGCCTTGG 3'

It i 1 1 MINISATELLITE

ACCCCCCAGTCCTCCCCGGTACTTCCCCTGGACCGGAACC 5'

pMS31 - Le motif répété en tandem 31B est représenté en capitales. 1 gatccactcggaaccacctgcagttaggagcaagcctagaatgttctggaaggattgaagccagccttgtc 73 gaqgccctgggaaagtggcctggacatggggatgtggctggaggaccCgaggaagatgCtgaagtcctgtg 145. gaggcccggtctgggagccacggcccctcccccactcagtccggcctgctggggtttcctgccgggcctcc 217 tcagagcccacggctccccaggtggctctggcccgggagccacaggcacaacctaggcaggggaagccgca 289 gcacaatgttggctcttccctttgCacgctggacggtggcgttttgcctttcgccttgggctcaggagggg 361 tgqggggtcaggaggggcca. tgaaggggacctggccttggCTGTCCACCTCCCACAGACAxxxxxxxxxxx 433 xxxTCTACCTCCCACAGACACTGCCggccggatggqgcGTGT'rGGGGACGGTGTGCCGGTGTGGGGACGGGGT

505 CAGGTGTGGGGACGGGGTGCAGGTGTGGGGACGGGGTGCAGGTGTGGGGACGGCGTGCAGGTGTGGGGACG

577 GGTGCAGGTGTGGGGACGGCGTGCTGTGGGGATC 610

do os ul 2b39651

SEQUENCE D'ACCOMPAGNEZENT EN 3'

DU LOCUS MS31

MINISATELLITE

MINISATELLITE 5' CCGGCCGG ATGGGCGTGT GGGGACGGTG TGCCGGTGTG GGGACGGGGT

3' GGCCGGCC TACCCGCACA CCCCTGCCAC ACGGCCACAC CCCTGCCCCA GCAGGTGTGG GGACGGGGTG CAGGTGTGGG GACGGGGTGC AGGTGTGGGG ACGGCGTGCA

CGTCCACACC CCTGCCCCAC GTCCACACCC CTGCCCCACG TCCACACCCC TGCCGCACGT

GGTGTGGGGA CGGGGTGCAG GTGTGGGAC GGCGTGCTGT GGGGATC 3'

CCACACCCCT GCCCCACGTC CACACCCCTG CCGCACGACA CCCCTAG 5'

Sequence d'accomnDacnement en 5' de DMS32.6 s'étendant dans le minisatellite

' GATCACCGGTGAATTCCACAGACACTTAAAAGCAAAAATAATAATTTGTTGAATACAGTG

3' CTAGTGGCCACTTAAGGTGTCTGTGAATTTTCGTTTTTATTATTAAACAACTTATGTCAC

AGTTCTAAATTTCTCTTCAAAGAATCAGTATGTCAGTATGTTCAGTTCTTTGTTCTCCAT

l I I I I I

TCAAGATTTAAAGAGAAGTTTCTTAGTCATACAGTCATAGGAGTCAAGAAAGCCGAGGTA

TTTAAAGTTGAACTTCCTCGTTCTCCTCAGCCCTAGTTTCACTAAACAACCTTTTCCAAC 3'

I I I ' I I I

AATTTCAACTTGAAGGAGCAAGAGGAGTCGGGATCAAAGTGATTTTGTTGGAAAAGGTTG 5'

MINISATELLITE

pMS32. 6: Sécuence d'accompagnement en 3' s'étendant à partir du minisatellite

' AACCACCCTTCCCAC

MINISATELLITE I I

3' TTGGTGGGAAGGGTG

CAAACTACTCACCCCGCCACTCTGGCTCATACCCCTGCTCTCTTTAAAGTAGCCAATCGG

I l I I X.

GTTTGATGAGTGGGGCGGTGAGACCGAGTATGGGGACGAGAGAAATTTCATCGGTTAGCC

AATTAGCTTAGACTGTGCAGTCCAACCCTAGCCGATACGGGAACGACGCATCAGTAGGGG

I I I II

TTAATCGAATCTGACACGTCAGGTTGGGATCGGCTATGCCCTTGCTGCGTAGTCATCCCC

CTACCTGTGTCAGGAATCAGAACCCCTTCCCCTCCCTTGTTCAGGTGTGCTCTGGCCATT

I I I I,

GATGGACACAGTCCTTAGTCTTGGGGAAGGGGAGGGAACAAGTCCACACGAGACCGGTAA

GCTCCATCTGCGAGTCGCACCCTTCTAGAGAAGTAAAATTGCCTTGCTGAGAAAATTAAA

I I I I I

CGAGGTAGACGCTCAGCGTGGGAAGATCTCTTCATTTTAACGGAACGACTCTTTTAATTT

CTTATGTTTGAGTGGTA'rTTCTTT.TGCAGCACCAAAAATTTATTTACAACAAATTCTACA 3'

GAATACACTCACCATAGAAACGTCGTGGTTTTTIATAAATGTTGTTTAAGATGT 5'I I I

GAATACAi4ACTCACCAT.A3AGAAAACGTCGTGGTTTTTAAATAAATGTTGTTTAAGATGT 5' Ln oa Do *0*

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* BEjeDD5gbeg..ee - Dbb D e D De e 101 D 111D:DV Di OOà V zLD IV 1D D Vx X X XX X X M X XXXXXVL9D3D DID913D Ll .si eeeD2D bebqbeDeleebllbllzeelUelvUeeeD6ePeel\DeDe6eDeDDlee6 66DDeDle6 L - ZCSWd SZIlqúS INI}I DD93VOfL! ODViDOO%

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VV9190VgW 00WO3DV3Z 9D3D3330V9 O3VDOM.úLO 3 OLVIOVO3DVD VNZOWVD

:DLDúLJD3 3; D93úDS0VOD DSOOD33DVLD OOVDDDWYOV VWYVDOIDS ZNOLDZ

VDVO9VO1YSYD DDDDL3DDDZ ISVDDV1DW DDDDOVDDVD -DDDODvDZO SSYSLSi r DILYL3; S aSYLDS Y3;SVSSILSS3SYSSS YDDVDSIO.LD DDVID9VLD À 3ú3úVLDZOLWDVOO1D VZOOVSVOZVV OOOúV.DOID gDDD9DVDL ODZDVDfLOV a I'-E ap;uamaueI dmo:1oDwp saouannpS tE

1[596ú9Z

Sécquences d'accompaqnement de 33.4

' ATCAAGGAGG CAGTGAGAGA TGAACTGGAA GTGACCAGGG GCTGCCAGCA AACCCCCTCC

3' TAGTTCCTCC GTCACTCTCT ACTTGACCTT CACTGGTCCC CGACGGTCGT TTGGGGGAGG

ACCGAGAAGA TGACTTTCAC CTACTATACA GCAGAAAACC AAAAGCCAAG ATAAAAATCG

TGGCTCTTCT ACTGAAAGTG GATGATATGT CGTCTTTTGG TTTTCGGTTC TATTTTTAGC

CTGGGGAGGG GCAGGGATGG GGGACCGGGC CAGACCCCAG CTGCTGAGCA CGCGCCACCT

GACCCCTCCC CGTCCCTACC CCCTGGCCCG GTCTGGGGTC GACGACTCGT GCGCGGTGGA

MINISATELLITE

CCTAAGCAGG TTCTGGTGGC CTCCTGGCTG GGTGTAGGCA GAGGCTGGCT CCCGGAGGCC

GGATTCGTCC AAGACCACCG GAGGACCGAC CCACATCCGT CTCCGACCGA GGGCCTCCGG

GCAGGGGGGC TCTGAGAAGG GGGCGGCCTG AGGGGGAGCC CAGGACAGCC CCTATGCTGC

CGTCCCCCCG AGACTCTTCC CCCGCCGGAC TCCCCCTCGG GTCCTGTCGG GGATACGACG

CCCCGTCCAG CCCGGCCCCT CAGGCTGTGT TTCCTGAGAC CTCGCTAGTC TAACCCAAAC

GGGGCAGGTC GGGCCGGGGA GTCCGACACA AAGGACTCTG GAGCGATCAG ATTGGGTTTG

CTCCCAGCTC TGTCATTCAA AGGGATGGAT TAGGTCCCCG TGGGTCCATT TCCCT 3'

GAGGGTCGAG ACAGTAAGTT TCCCTACCTA ATCCAGGGGC ACCCAGGTAA AGGGA 5'

Séquences d'accompaqnement de 33.6

' TGTGAGTAGA GGAGACCTCA CATTTGACCT TGGAAAGT

3' ACACTCATCT CCTCTGGAGT GTAAACTGGA ACCTTTCA

KINISATELLITE

GGTTG CTCCTCACTC TGTGGTCTTT GTCTGTCCAG ACCTTCCCIT

CCAAC GAGGAGTGAG ACACCAGAAA CAGACAGGTC TGGAAGGGAA

CTTGGATTGA GTAATGTCTC ACCTGCTTGC 3'

GAACCTAACT CATTACAGAG TGGACGAACG 5'

pMS43 - Les séquences Alu sont en caractères gras et les séquences courtes répétées en tandem sont soulignées. Les séries minisatellites sont représentées en abrégé par les deux motifs répé6tés externes (en capitales) s('paré.s par des lettres X, le séquençage en 3' de 43A se rétablissant au niveau d'un site Sma I à l'intérieur du dernier motif répété et,

ainsi, seules ces 6 bases sont mentionnées en capitales.

1 gatctatacatgtTTACACACATGCCACACACCCTTCCCAAGGCCGTCCCTATACCCAxxxxxxxxxxxxx

73 xCCCGGGggcc atc9gcgcatggcccactccc cgtcctc qagctctctc tgqqg-

cccacctcctctctt_ c tctctctctct 9tgccccacctggccgacctgaaggtcagg 217 catccac tc t.ttggggaaacgaagttgggttcgtagggcagactctggtgttgttggtccttccctccaga 219 catcagtcatcccct 2839 accacgtctcttcgtctggctcccaggagaccccagttctatttctatttctcccgcctctgtcatg ccct 361 aaactgcttctgcatagcccccactctgcctctcaggctttaaccccaactgtgagccccacctggctgtc 433 tgggccacLgaactccacgtgtccatcgtggctctccccaacatgccaccacgcaccqgctggcattctg 505 ccctldLgaagcctgcctLgcctLggygactgggaatcagccgctgtcccagcccaccccaatcacccatc 577 atcaccggccaatcacccgtcaatcaccqtctcttgccagctttgcatcctaaatat ttt tggaagagtc 6[ 'J crj LgtCc9cc:acdcccacaagaaa. gaaaqttcaccctactgggctcaacagtaaagatgttaatgaaggg 721 agcttagggatgtgtggttaggggcatagggacagacgggggcagtgcaacctcaggggcggcaacgtgca 793 tt ct cgacaccgqcaagtgaggcctcgqgcccactcggaccacggtgcagcttccaacaacctgtgt 865 ctccaC gg ccaaqacagcc caagaggga aggagctgg 937 gactggaaagcgtggcagcatcgagggcccggcacgTGGGCTAGA CGGGGGATGTGGTGAxxxxxx 1009 xxxxxxxxCGGGGGCCTGGTGATG GGGaca ggtgagtctcctgtccctcaccaggagaactgggttctggt 1081 cLcagcctgtctcccaccgtagagcaacctctgaccgccagacaggacaccaaggtgaaaactttcaagcc 1153 ccaggacgggagagaggtcagggggngaggtcggggnngaggtggcagggagggCagggaggtcagggagt 1225 gagtaaacgctggcgcggccacagctgtgccttgtcaggggatgaaggtgaaagacagaacccgcggtgac 1297 caggctcccctgccccgcggaggagtcaqc9catcagaaaggcccctatgtcagccaggcgtggtggttca 1369 acctggaatcccagcactgtgggaggcagaggcrggcagatc hi 0% VIl

SEQUENCES D'ACCOMPAGNEMENT DU LOCUS MS51

' GATCAGCGAA CTTCCTCTCG GCTCCCGATA TCCTCCTCGA TACGCACTCT GCCACAACGG

3' CTAGTCGCTT GAAGGAGAGC CGAGGGCTAT AGGAGGAGCT ATGCGTGAGA CGGTGTTGCC

GCAGGGTCCC TTTCAGCGTC TCATCCACAG TGAACGGGAG TTGAGGCTTT CTTAGCGGAG

CGTCCCAGGG AAAGTCGCAG AGTAGGTGTC ACTTGCCCTC AACTCCGAAA GAATCGCCTC

GGGCTGGAGG GAC

CCCGACCTCC CTG

MINISATELLITE

CCTC CCTGCGGTTT CCGGATGCTA CGGGGTGGAT CGGAGTGTGG

GGAG GGACGCCAAA GGCCTACGAT GCCCCACCTA GCCTCACACC

TGTTAAGCAC ATCTGGACAC GCTCTGTCCG AGACACATAG TCCCCAGGCG ACCTACAGCC

ACAATTCGTG TAGACCTGTG CGAGACAGGC TCTGTGTATC AGGGGTCCGC TGGATGTCGG

ACAGCCTGAC CTCCTGAAAA TTTCCCAGCT TCCCACAGTC CTCAATGTGG AAACCAGTGC

TGTCGGACTG GAGGACTTTT AAAGGGTCGA AGGGTGTCAG GAGTTACACC TTTGGTCACG

CCAAAGGCCA CCTGCCCACA CTGGCACCGA ATTC 3'

GGTTTCCGGT GGACGGGTGT GACCGTGGCT TAAG 5'

MS51 - Séquence a travers le site Hinf I adjacent

1 AGTGGATTTT CCCACTTCCC TCTGTTGTCT ATAATGAATG ACCACTACAT

51 TTTTAACCCC AAAAGCTTCT CATATGAAGA GGAGACTTCT TTCAGCAGCA

101 GGCAGGGCAC CTTCTCTGAA GCTCGCCAGC AAGCACCAAC CGACTCCCTG

151 GCCACGGCAG CTGACGCCCA GGCAGTGACC CCACACGGGA GGGCTCTCGA

201 AAAGRCTGGA GCTCCCATGA C

"...oe$66oo6eoea'b. e6oqoo'o6eOo-5-o'e6ooo606fioeoo6eD66b6eeeb'.' I'bl eo$6eeeoooDooD6o'ODe'ooooe6eeoDoD66oooe6eoo166o66eoooeoeDeo 69E1 oo6b66e6e6e6eollq l4ql4feDDo6ieooooeooeD666lee6oeee66ll6e6, 6Z L69E oeeoDDio66a6eo6DlDe6o6eooeoDi66eoeDaee6D6o66 o4Do6oDoooeDoooD)De6 u.I E ooDl oooDD6eoooo'oooo6eoo6o6e6ooo6oo>éoe6leoooo6oDooeoloeooDe ' BOr o6oeooeoooooeoo66ooo la6eoe6ee6ee66e6o1166eo66éDleoe6eoeoeooo6ee Lú LE6 6eoeo66elDole6e66a6e6ooooe66o66e6U oDoqeDoeeooo6eooo6666o6eooo666e 9 $66eoeoeoeooe6ooe6666oeoeDDooDoole$66leoooooDl66o$Geoell66eeDoD o 6 E6ú o6ieo66eooeooo6oie6oooo6el oolooDeoeoool 6eooo66e66z oooeool el o666ee666 IZ L 666o66666o6o6eo66ooGoo6666666666e666oDoéeeee66eoeoooo66e66o6oe 6b 6V9 eoo6ooeo6oo6eoooo6eoee666e66e6e6o6oeeD66e6o6eeoo6eeeo666eooe66 LS LLS le66oo66ooeo66eoo6o6olDDoeeoe666eoo6eoee6lDol6oDoeD6e66eo6666e66 50 SOS ooo6eoeo6066eooeooeo6o606666ooDlo666666el>o6666eoleoOOOVVOOOOO9VO9.9EE XXxXXXXXXXXxxxXODODOyDVODDgggDWD 66e6e6eD66e6?DD5666eDDD676DeDD6D6eD 9 19ú DSeDlllé6lDDleODll'6e6DD6De,666e6llDOeeeD6DDO66O66OD6e6eODDe SI ChI I 6e$6.eioD66e66oo66DDoe60o'66eo666eoo66DooeDDole6oe$oeo$o66ellle665o [L *6f66D6ee6"6OevD'OOO5'66e'Di6ee66ee6665e6eDDeezeeDeeDDeDDDDeDDD66e; x sa2z6l sep aud sgzedgs (suIldeDo seilql ua) sauzaixa svp.a9. spiom xnap sol ied 92gqe u3 saaquasgadai iuos saeTilazesTuTt saags sae squStInos quos uepuej ua sg4gdga sianoD s)Tqom sal ia seaS sazQIoZeleD ua sagnbîpu luos niv saDuanbgs saq gszZ iuvinoiua NGV,P ql Z ap auotD-snos un,p iueuaAoid aouanbqs - gzZskd Sécuences d'accompacnement de la région hypervariable en 5' du gène de l'insuline humaine

(AM. J. HUM. GENET., 1986, 39, 291-229)

' CTGGGGCTGC TGTCCTAAGG CAGGGTGGGA ACTAGGCAGC CAGCAGGGAG GGGACCCCTC

3' GACCCCGACG ACAGGATTCC GTCCCACCCT TGATCCGTCG GTCGTCCCTC CCCTGGGGAG

CCTCACTCCC ACTCTCCCAC CCCCACCACC TTGGCCCATC CATGGCGGCA TCTTGGGCCA

GGAGTGAGGG TGAGAGGGTG GGGGTGGTGG AACCGGGTAG GTACCGCCGT AGAACCCGGT

TCCGGGACTG GGG KINISATELLITE ACAG

AGGCCCTGAC CCC TGTC

CAGCGCAAAG AGCCCCGCCC TGCAGCCTCC AGCTCTCCTG GTCTAATGTG GAAAGTGGCC

GTCGCGTTTC TCGGGGCGGG ACGTCGGAGG TCGAGAGGAC CAGATTACAC CTTTCACCGG

CAGGTGAGGG CTTTGCTCTC CTGGAGACAT TTGCCCCCAG 3'

GTCCACTCCC GAAACGAGAG GACCTCTGTA AACGGGGGTC 5'

SEQUENCES D'ACCOMPAGNEMENT DU LOCUS

ALPHA-GLOBINE HVR 5'

(AM. J. HUM. GENET., 1988, 43, 249-256)

' TTAGATGCTC GCCG MINISATELLITE CTGTGCGGG AAGCCCGAAA TCCTTA 3'

3' AATCTACGAG CGGC GACACGCCC TTCGGGCTTT AGGAAT 5'

SEQUENCES D'ACCOMPAGNEMENT DU LOCUS

ALPHA-GLOBINE HVR 3'

(EMBO, 1986, 5, 1957-1863)

' AGTCCCACCT GCAGGAAAAG GTGCAGGTAA GG

3' TCAGGGTGGA CGTCCTTTTC CACGTCCATT CC

MINISATELLITE

AGGAACAGCA ACACGCAGGG AATATCGACA TGGGTGATGC

TCCTTGTCGT TGTGCGTCCC TTATAGCTGT ACCCACTACG

CTGCAAAGCA CAGCATCAAT CCCAAGTGAC TGA 3'

GACGTTTCGT GTCGTAGTTA GGGTTCACTG ACT 3'

Séquences d'accompaanement de la réqion hypervariable au niveau du locus de la zêta-globine

(PNAS, 1983, 890, 5022-5026)

' ACACCCATCA ATGGGAGCAC CAGGACAGACAT GGAGGCTAAT GTCATGTTGT AGACAGGAT

3' TGTGGGTAGT TACCCTCGTG GTCCTGTCTGTA CCTCCGATTA CAGTACAACA TCTGTCCTA

GGTGCTGAGC TGACCACACC CACATTATTA GAAAATAACA GCACAGGCTT GGGGTGGAGG

CCACGACTCG ACTGGTGTGG GTGTAATAAT CTTTTATTGT CGTGTCCGAA CCCCACCTCC

CGGGACACAA GACTAGCCAG AAGGAGAAAG AAAGGTGAAA AGCTGTTGGT GCAAGGAAGC

GCCCTGTGTT CTGATCGGTC TTCCTCTTTC TTTCCACTTT TCGACAACCA CGTTCCTTCG

TCTTGGTATT TTCAACGGCT MINISATELLITE AGC

AGAACCATAA AACTTGCCGA TCG

TACAGGGAGA AAAGACTTGG TGCTGTGGGC CTGCCTTGGG GCTGGTGGTA CAGCCCTTAT

ATGTCCCTCT TTTCTGAACC ACGACACCCG GACGGAACCC CGACCACCAT GTCGGGAATA

CTGCTGCCCT CAGGATCTCC CGGCCCCTCT CGTCCAGGCC CCTGCAACCC CATGCCCCAG

GACGACGGGA GTCCTAGAGG GCCGGGGAGA GCAGGTCCGG GGACGTTGGG GTACGGvGTC

CCTCTGAGGA CCAAAGGCGC CCCTGCTTGG GAAGAGGGGG CTCAGGGGAG TCGCCTGACC

GGAGACTCCT GGTTTCCGCG GGGACGAACC CTTCTCCCCC GAGTCCCCTC AGCGGACTGG

CGGTTCCAAG CCAGGCTGAT TTACCGTTGT TAACATCCTA GTGCACGCAT CCCTCTGCCT

GCCAAGGTTC GGTCCGACTA AATGGCAACA ATTGTAGGAT CACGTGCGTA GGGAGACGGA

CATGCACCCA ACTCCAAGGC CTGGTACAC 3'

GTACGTGGGT TGAGGTTCCG GACCATGTG 5'

SEQUENCES D'ACCOMPAGNEMENT DU LOCUS HA RAS

(NATURE, 302, 33-37)

' TGCTCCAAGG GGCTTGCCCT GCCTTGGGCC AAGTTCTAGG TCTGGCCACA GCCACAGACA

3' ACGAGGTTCC CCGAACGGGA CGGAACCCGG TTCAAGATCC AGACCGGTGT CGGTGTCTGT

GCTCAGTCCC CTGTGTGGTC ATCCTGGCTT CTGCTGGGGG CCCACAGCGC CCCTGGTGCC

CGAGTCAGGG GACACACCAG TAGGACCGAA GACGACCCCC GGGTGTCGCG GGGACCACGG

* CCTCCCCTCC CAGGGCCCGG GTTGAGGCTG GGCCAGGCCT CTGGGACGGG GACTTGTGCC

GGAGGGGAGG GTCCCGGGCC CAACTCCCAC CCGGTCCGGA GACCCTGCCC CTGAACACGG

CTGTCAGGGT TCCCTATCCC TGAGGTTGGG GGAGAGCTAG CAGGGCATGC CGCTGGCTCG

GACAGTCCCA AGGGATAGGG ACTCCAACCC CCTCTCGATC GTCCCGTACG GCGACCGACC

CCAGGGCTGC AGGGAC MINISATELLITE

GGTCCCGACG TCCCTG

GAGTGACCAG CTTCCCCATC GATAGACTTC CCGAGGCCAG GAGCCCTCTA GGGCTGCCGG

CTCACTGGTC GAAGGGGTAG CTATCTGAAG GGCTCCGGTC CTCGGGAGAT CCCGACGGCC

GTGCCACCCT GGCTCCTTCC ACACCGTGCT GGTCACTGCC TGCTGGGGGC GTCAGATGCA

CACGGTGGGA CCGAGGAAGG TGTGGCACGA CCAGTGACGG ACGACCCCCG CAGTCTACGT

GGTGACCCTG TGC 3'

CCACTGGGAC ACG 5'

Groupes de sondes à un seul locus proposées par Ray White

Propabi- Propabi-

lité de lité de concor- concor- Exclusion* Nombre Intervalle Intervalle de dance dance d'al- de dimen- fréquence des entre 2 entre 2 léles sions allèles individus parents I II r 1 D017530 1 YuZ22 I Zlta-globineI Hinfi l 14 0,5-1,3kb 1 0,0033-0,29 1 0,0377 1,33 1 70: 1 16,5705 1

I I I I I I I 1 HNAR

I 02544 I YfIH24 HBY-2 I Hlnfl I >30 1 1-Skb I 0,033-0,05 0,001 0,Z6 95S 15,10073 Ln I I I I I I M 1i I NAR I

1 0957 I pEFO126.3 1 HBY-4/5 I Hinf1 5 1-2kb 0,0349!,3 7:!S,06-

1 I I I 1 1 1 1 I I iiA! I 014513 1 MLJ14 Hyogloblne Hinfl >20 1 4-lSkb I 0,0046-0,096 0t0042 1 0,27 91 | 16,381 1

1 1 I I I I 1 1 1 NAR I

D 019520 JCZ3.1 Zeta Hinfi I >10 1 1,5-4kb 1 0,0554 0,35 1 65e 1 16,1229

I I I I I I I I I! I

1 016583 1 EKHA21 Aiu I I I 0,0302 0,2!74 1

I II I I I I' I I

I 01574 I CYNA13 A1u 1 0j0065 00,28 88% e I I pEFD64.1 I HBY4/5 I Hinfi l oo91 0,396 I 55 11 I I II I I I TOTAL 16xlO-15 1 lx10-4 1 1 Une probabilité quIun père putatif accusé à tort soit exclu parI la sn I I I i I I I I I I I Io * Une probabilité qu'un père putatif accusé à tort soit exclupar la sonde un Sondes supplémentaires à un seul locus clonées par Ray White Hé té rozygotisme I-I--- i f I ' i 1' - I I I It II I I I I NAR 1 01754 pCUM86 Myoglobine IlinflI >10 5-1,3kb 901 1 16.5223 1 II| tI I I I INAR I I 017526 1 EF052 t HBY-4 MspIX >8 5-10kb 83% I 16,786

I I I I I I I I NAR I

I 017528 I pYNH37.3 I HBV-2 I MspI I 5 2-4kb 78% 1 16,782 I

I I I [ I I I, INAR

075396 1 pJCZ67 I Zeta-globineI HspI I 4 1 3-6kb 80% 16,4191 1

I I I I I I I NAR I'

I D13552 I c4HZ47 I YNZ22 I Msp I >10 1 1,5-3,Okb 80% 1 16,3119 1 I} t 1 1 I 1 I NAR I I 014523 I cKYA33I I Msp1MI >10 2 2-4y5kb.1 83 1 16,3120 I __ _ j I * l _ _ Il _ _ _ l t I * Utilisation de HinfI non étudiée ro <' ta

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D'autres caracteristiques et avantages de la

présente invention ressortiront de la description détaillée

qui va suivre, faite en regard des dessins annexés suivants. Figure 1 Amorces et sondes d'hybridation utilisées dans l'amplification de minisatellites par RCP. Chaque locus minisatellite a été amplifié en utilisant des amorces A et B de 20 ou 24 motifs monomères situées dans des séquences particulières encadrant l'ADN, à respectivement a et b pb du minisatellite. Les produits de RCP ont été détectés par hybridation avec une sonde minisatellite interne isolée par clivage avec les endonucléases de restriction X et Y qui effectuent un clivage à des distances c et d pb du

minisatellite. Les détails concernant les six minisatel-

lites sont les suivants, R désignant la longueur du motif repété (pb): p g3, A - 5'-ACCACAGGCAGAGTAAGAGG-3', B - 5'-CCACCCTGCTTACAGCAATG-3' X - st I, Y - Ddel, a - 35, b - 58, c - 26, d - 45, R - 37; MS32,

A - 5'-TCACCGGTGAATTCCACAGACACT-3', B - 5'- AAGCTCTCCATTTCCAGTTTCTGG-3',

X - HUaI, Y - glI, a - 181, b - 324, c - 10, d - 37, R - 29: pMS51,

A - 5'-GATCAGCGAACTTCCTCTCGGCTC-3', B - 5'-TCCACATTGAGGACTGTGGGAAGC-3',

X - PdeI, Y - aâeII, a - 117, b - 131, c - 30, d - 0, R - 25 + 33: p33.1, A - 5'-CTTTCTCCACGGATGGGATGCCAC-3', B - 5'-GCCGTGTCACCCACAAGCTTCTGG-3', x - DdeI, Y - RsaI, a - 6, b - 27, c - 0, d - 15, R - 62; p33.4, A - 5'CCGGGCCAGACCCCAGCTGCTGAG-3' B - 5'-GCAGCATAGGGGCTGTCCTGGGCT-3', X - PdeI, Y - DdeI, a - 11, b - 96, c - 0, d - 2, R - 64: p33.6, A - 5'TGTGAGTAGAGGAGACCTCACATT-3', B - 5'-AGGTGAGACATTACTCAATCCAAG-3', X - StvI, Y - DrIII, a - 14,

b - 45, c - 10, d - 16, R - 37.

Figure 2 Amplification d'alleles de minisatellites MS32 par RCP. A: des portions aliquotes de 0,1 pg d'ADN provenant des individus 2306, 10208, 133101 et 133304 du CEPH, qui contiennent conjointement 8 allèles MS32 différents allant de 1,1 à 17,9 kb, ont été rassemblées et amplifiées pendant 10 a 20 cycles dans des mélanges réactionnels de 10 pi contenant 1 unité de polymérase Taq plus les amorces d'accompagnement A et B. Les produits du RCP ont été séparés par électrophorèse sur un gel à 1% d'agarose et ont été détectés par hybridation avec une sonde minisatellite, par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern. Les temps d'extension avec la polymérase Taq à 70 étaient de 6, 15 ou 30 minutes avec (+) ou sans (-) addition d'une quantité supplémentaire de polymérase (1 unité) au o10ème cycle. H: 2pg de chaque ADN du CEPH digérés avec AluI; les sites AluI entourant MS32 sont situés de sorte que chaque allèle AluI soit plus long

de 0,2 kb que son produit de RCP correspondant. L'auto-

radiographie a été effectuée pendant 5 heures (cycles 10, 14) ou 1 heure (17, 20) sans écran d'intensification. B:

effet d'une concentration croissante en polymérase Taq (a-

c, respectivement 0,5, 1, 2 unités) sur l'efficacité d'amplification d'allèles volumineux. Le temps d'extension

à 70' était égal à 15 minutes.

Fiqure 3 Efficacité d'amplification d'allèles minisatel-

lites MS32 en fonction de la longueur des allèles, avec des temps d'extension par RCP de 6 minutes (0) ou 15 minutes (0). Le gain en produit par cycle d'amplification a été déterminé par densitométrie laser par balayage des voies H, 6+ et 15+ de la figure 2, exposées à un film pour rayons X, pré-éclaire, sans écran d'intensification. Les estimations moyennes de gain par cycle déterminées jusqu'au 10eme cycle, du cycle 10 au cycle 14 et du cycle 14 au cycle 17, étaient en bon accord, indiquant que le rendement en produit de RCP augmente exponentiellement au moins jusqu'au cycle 17; la figure montre la valeur -moyenne des trois

estimations du gain pour chaque allèle.

Figure 4 Co-amplification de deux minisatellites & partir

de quantités d'ADN humain équivalant à une seule cellule.

A: des portions aliquotes de 60 ou 6pg d'ADN provenant du sang d'un individu hétérozygote pour les alleles a, b au niveau de 2MS32 et c, d au niveau de pMS51 ont été amplifiées pendant 25 cycles avec des temps d'extension de minutes en présence des amorces A et B pour les deux loci, puis une analyse des produits d'amplification par hybridation par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern a éte effectuée. Les faibles teneurs en allèle a ont pu être détectées dans trois des échantillons de 6pg par une exposition autoradiographique prolongée (flèches). B: analyse des produits erronés d'amplification de MS32. Deux portions aliquotes de 60 pg d'ADN ont été amplifiées pendant 30 cycles, puis ont été digérées avec la nuclease Sl (Sl), BqlI (B) ou HDaI (H). BqlI effectue un clivage dans l'ADN d'accompagnement, entre le minisatellite

MS32 et l'amorce B et élimine 311pb de l'ADN d'accompagne-

ment. HpaI effectue un clivage entre l'amorce A et le minisatellite, et élimine 195pb de l'ADN d'accompagnement

(voir la légende de la figure 1).

Figure 5 Co-amplification de six minisatellites humains différents par RCP. A: amplification de long (quatre premières voies) ou de lng d'ADN (deux dernières voies) à partir de l'individu 1, respectivement pendant 15 ou 18 cycles, en utilisant un cocktail d'amorces A et B pour les minisatellites p Àg3, MS32, pMS51, 33.1, 33.4 et 33.6. Les produits de RCP ont été détectés par hybridation, par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern,

avec un cocktail de la totalité des six sondes minisatel-

lites marquées au 32p. L'individu teste avait été préa-

lablement caractérisé séparément au niveau de la totalité des six loci, ce qui a permis l'attribution de la totalité

des fragments d'ADN d'hybridation, de la manière représen-

tée; cet individu est hétérozygote au niveau de la totalité des six loci. Ces empreintes digitales d'ADN proviennent de trois expériences séparées. Noter que 33.4 a présenté une incapacité d'amplification dans la dernière voie. B, l'empreinte digitale d'ADN de 8 individus non apparentés (2-9) après amplification d'échantillons de lng d'ADN pendant 18 cycles. C: empreintes digitales d'ADN d'une famille de 3 générations (1435 du CEPH), après amplification de 10 ng d'ADN pendant 15 cycles. Trois bandes, correspondant aux allèles de 33.4 et pMS51, ont présenté une incapacité d'amplification chez l'individu 12, de la manière indiquée par une seconde analyse de cette

famille (première voie, bandes marquées avec un astéris-

que). Dans toutes les expériences, les produits de RCP ont été digérés avec la nucléase Sl (voir matériels et méthodes) avant électrophorèse sur gel, pour réduire le marquage produisant un bruit de fond. Des témoins dépourvus d'ADN, dans toutes les expériences, étaient uniformément

vierges (non représenté).

Figure 6 Variabilité d'empreintes digitales d'ADN produites par coamplification de six minisatellites simultanément par RCP. Des échantillons de lng d'ADN provenant de 21 individus non apparentés ont été analysés de la manière décrite sur la figure 5. A: variation du nombre de fragments d'ADN séparables par individu. Nombre moyen de bandes séparées par les différences observées entre les empreintes digitales d'ADN de paires d'individus

non apparentés, sur la base de 29 comparaisons indépen-

dantes effectuées deux à deux. Le nombre de bandes discordantes est le nombre total de bandes non partagées par les deux individus comparés. Le nombre maximal théorique de discordances avec 6 loci est égal à 24 et la moyenne observée est égale à 10,8 2,8 (écart type). La distribution des discordances avoisine une distribution de

Poisson avec cette moyenne (points).

Figure 7 Amplification de minisatellites à partir de cellules humaines isolées. A: des échantillons contenant O, 1 ou 3 petits lymphocytes (provenant de l'individu analysé sur la figure 5A) ont été lysés avec la protéinase K plus du SDS ou bien par chauffage dans l'eau, puis ont été soumis à une co-amplification avec des amorces pour MS32, pMS51, 33.1, 33. 4 et 33.6 pendant 27 cycles. Les produits de RCP ont été hybridés successivement avec chacune des cinq sondes minisatellites, par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern. B: produits d'amplification de cellules buccales isolées, analysés après une lyse avec la protéinase K plus du SDS et par RCP, de la manière décrite ci- dessus. Des cellules provenant de deux individus, a et b, ont été testées; b est homozygote

au niveau de pMS51, 33.1 et 33.6. O, aucune cellule témoin.

Les produits erronés de RCP sont indiqués par des flèches.

Fiqure 8 Structure du clone de plasmide pMS228. Les

régions encadrées représentent des séries minisatellites.

Il existe deux régions minisatellites distinctes discer-

nables; 228A détecte les bandes plus fortement hybridantes et 228B les bandes plus faibles lors d'une hybridation

d'ADN humain dans des conditions drastiques.

Fiqure 9 Détection directe d'allèles minisatellites MS32 amplifiés par électrophorèse sur des gels d'agarose colorés au bromure d'éthidium, après 30 cycles de RCP sur 0,4 jg d'ADN génomique humain. M = ADN servant de marqueur (0,5 Mg d'ADN x Hind III + 0,2 pg 0x174 ADN x HaeIII). L'individu 1 est hétérozygote pour l'allele de 4,5kb détecté sur le gel

et un allèle plus grand (7 kb) qui présente une amplifica-

tion beaucoup moins efficace et ne peut donc être détecté.

L'individu 2 est hétérozygote pour les alleles de 3,7 et 4,6 kb, l'un et l'autre étant détectables. Les dimensions des allèles amplifiés correspondent aux dimensions prévues, déterminées par une analyseclassique, par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern, de l'ADN génomique provenant de ces individus. Noter la présence d'une série complexe supplémentaire de produits de RCP de bas poids moléculaires, correspondant à des allèles

minisatellites affaissés. 0 = aucun ADN témoin.

Figure 10 Carte de MVR de l'allèle MS32 plus petit dans l'individu 10202 CEPH. A: produits de digestion partielle par HinfI (F) et HaeIII (H) de l'allèle amplifié par RCP, après clivage avec EcoRI et marquage terminal au niveau du site EcoRI. B, le motif complémentaire à partir du même allèle soumis à un marquage terminal au niveau du site ClaI. C, carte des sites de clivage par HinFI et HaeIII dans l'allèle. Les emplacements des amorces A et B de RCP

sont représentés.

Ficure 11 Stratégie de cartographie de l'emplacement de

motifs variants répétés à l'intérieur d'un allele mini-

satellite MS32. A: emplacement des amorces de RCP en rapport avec les motifs répétés minisatellites (cadres ouverts) et entourant l'homologue LTR rétroviral (cadre fermé). Les sites de restriction pour HinfI (F), HaeIII (H) et Sau3A (S) sont également représentés. Les séquences des

amorces sont A, 5'-TCACCGGTGAATTCCACAGACACT-3'; B', 5'-

AAGCTCTCCATTT C CAGTTTCTGG-3 '; C,

' CTTCCTCGTTCTCCTGAGCCCTAG-3 '; D,

'CGACTCGGAGATGGAGCAATGGCC-3'. Les dérivés Cl et D1 avec une extension en 5' TCACCGGTGAATTC- contenant un site EcoRI clivé de manière efficace (souligné) ont été utilisés pour obtenir des produits de RCP avec un site EcoRI particulier

convenable pour un marquage terminal et une cartographie.

B: résultats de cartographie interne sur un allèle MS32 petit à partir de l'individu 10208 du CEPH. Cet allèle a été amplifié à partir d'ADN génomique en utilisant les amorces Cl plus D (à gauche) ou C plus D1 (à droite), a été soumis à un marquage terminal au niveau du site EcoRI et a été digéré partiellement avec HinfI (F) ou HaeIII (H), puis a été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose et à une autoradiographie. La distribution des motifs répétés minisatellites internes dans cet allèle clivé ou non clivé par HaeIII est représentée en A. Fiqure 12 Cartes de MVR d'alleles de MS32 prélevées dans différentes populations et alignés pour représenter les similarités de cartographie. Chaque allèle est codé suivant

chaque motif répété (a, A) ou non clivé (t, T) par HaeIII.

Un numéro de série (1 à 32) est attribué à chaque allele, dans l'ordre de la longueur des allèles en association avec l'origine de la population (A, Amish; E, English, F, Français; M, Mormon; V, Vénézuélien) et le nombre de motifs répétés. Des répétitions en tandem d'ordre élevé dans les cartes de MVR sont indiquées sous les allèles par ----.. Les régions des cartes de MVR communes à plus d'un allèle ont été identifiées par des comparaisons de matrices de points de toutes les associations d'alleles deux à deux. Des tirets (-) ont été introduits pour optimiser les alignements. Quatre haplotypes 5' communs (1, 2A, 2B, 3) ont été ainsi identifiés. L'haplotype 1 (partie supérieure) présente une extension pour 20-21 motifs répétés. L'haplotype 2A (partie supérieure) présente une longueur plus variable. L'haplotype 2B consiste en les 15

premiers motifs répétés de l'haplotype 2A (partie supé-

rieure), suivis par un nombre variable de motifs répétés supplémentaires (partie inférieure soulignee). L'haplotype 3 court et provisoirement identifié (partie supérieure) se révèle être préferentiellement associé à des alleles contenant principalement des motifs répétés de type A. Trois "autres" alleles restants ne présentent aucune similarité notable avec les alleles pouvant être classés dans les quatre groupes haplotypiques 5' principaux. Les concordances entre les allèles identiques (3, 4) et très semblables (24, 25, 26) sont indiquées par des lignes verticales. Figure 13 Amplification d'allèles MS32 mutants au niveau d'une seule molécule à partir d'ADN de sperme fractionné suivant dimensions. A, fidélité et efficacité d'une RCP sur une seule molécule. Des portions aliquotes de 30pg d'un élément de digestion par Sau3A plus MboI d'ADN de sperme provenant d'un individu hétérozygote pour les alleles 31 et 32 (figure 3) ont été amplifiées pendant 28 cycles en utilisant des amorces de RCP A plus B (figure IA). Les produits de RCP ont été soumis à une électrophorèse à travers un gel à 0,8% d'agarose et ont été hybridés par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern avec une sonde minisatellite MS32 marquée au 32p. 28 des 40 RCP effectuées en double ont donné des produits de RCP à partir des deux allèles. D'après la distribution de

Poisson, cela indique une moyenne de 1,8 cas d'amplifica-

tion réussi par allèle et par réaction, comparativement avec une introduction moyenne de 5 molécules de chaque allèle. Ainsi, 36% de molécules MS32 introduites donnent un signal de RCP. B, cas d'amplifications d'une seule molécule à partir d'ADN de sperme digéré avec Sau3A plus MboI et fractionné suivant dimension par élctrophorèse sur gel. Des portions aliquotes multiples d'ADN provenant des fractions Sl à S5 contenant chacune respectivement de l'ADN provenant de l'équivalent de 0,03, 0,15, 0,6, 1,2 et 1,0 gg d'ADN de sperme total ont été amplifiées pendant 25 cycles en utilisant les amorces A plus B de RCP. Les produits de RCP

ont été détectés par hybridation par fixation sur papier-

filtre suivant la méthode de Southern avec une sonde

minisatellite MS32. H: 30pg d'ADN de sperme non frac-

tionné. Les intervalles de dimensions de chaque fraction

sont représentés. C: minisatellites mutants dans (B) ré-

amplifiés en utilisant les amorces de RCP Cl plus D emboîtées (légende de la figure 11) pendant 25 à 28 cycles, puis une électrophorese sur gel d'agarose et une coloration

au bromure d'éthidium.

Exemple 1

MATERIELS ET METHODES

(a) Préparation d'ADN qgénomique. d'oliaonucléotides et de sondes d'hybridation Des échantillons d'ADN humain ont été fournis par le CEPH, Paris, ou bien ont été préparés à partir de sang veineux, de la manière décrite autre part [26]. Les oligonucleotides synthétisés sur un synthétiseur d'ADN ABI 380B, en utilisant des réactifs fournis par Cruachem, ont été purifiés par précipitation par l'éthanol et ont été dissous dans l'eau. L'élément d'insertion Sau3A de 5,6 kb provenant du clone de minisatellite humain MS32 [10] a été sous-cloné dans le site BamHI de pUC13 [27]. De manière similaire, les éléments d'insertion minisatellites provenant d'ADN recombinant M13 RF 33.1, 33.4 et 33.6 [5] ont été isolés respectivement sous forme d'un fragment BamHI-EcoRI de 1,9 kb, d'un fragment Sau3A-EcoRI de 2,7 kb

et d'un fragment BamHI-EcoRI de 0,7 kb, et ont été sous-

clonés dans pUC13 digérés avec BamHI plus EcoRI, pour produire la série de plasmides p33.1, p33.4 et p33.6. Des fragments d'ADN contenant des minisatellites appropriés ont été isolés des ADN de plasmides traités par restriction, par électrophorèse à travers un gel a 1% d'agarose à basse température de gélification (Sea Plaque); des plaques de gel contenant des fragments d'ADN ont été dissoutes dans de

l'eau a 65' à une concentration finale de 2 gg/ml d'ADN.

Des portions aliquotes de 10ng d'ADN ont été marquées avec

du 32p par formation aleatoire d'une amorce oligonucleoti-

dique [28].

(b) Réaction en chaîne avec une polymérase Des portions aliquotes d'ADN humain, diluées si necessaire avec du Tris-HCl 5 mM (pH7,5) en présence de 0,1 pm d'amorces oligonucléotidiques comme support, ont été amplifiées dans 10 41 de Tris-HCl 67mM (pH8,8), (NH4)2S04 16mM, MgC12 6,7mM, 2mercaptoéthanol 10mM, EDTA 6,7 gM, dATP 1,5mM, dCTP 1,5mM, dTTP 1,5mM, dGTP 1,5mM (Pharmacia), pg/ml de sérum-albumine bovine (dépourvue de DNase, Pharmacia) plus 1 pM de chaque amorce oligonucléotidique et 1,5 unité de polymérase Taq (Anglian Biolabs). Les mélanges réactionnels placés dans des tubes d'Eppendorf de 1,5 ml ont été recouverts de 40 p1 d'huile de paraffine et ont été soumis à un cycle de 1 minute à 95', 1 minute & 60' et 15 minutes à 70' sur un Intelligent Heating Block (Cambio, Cambridge). Les réactions finales d'amplification ont été généralement suivies par une étape finale de 1 minute à , pour réunifier tout ADN monocaténaire restant avec l'amorce, puis par une phase d'extension à 70' pendant 15 minutes. (c) Analyse des produits de RCP par fixation sur papier filtre suivant la méthode de Southern L'huile de paraffine a été éliminée des mélanges réactionnels de RCP par extraction avec de l'éther diéthylique. L'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de RCP, la fixation par la méthode de Southern sur papier-filtre Hybond N (Amersham) et l'hybridation avec des sondes minisatellites marquées au 32p ont été effectuees de la manière décrite précédemment [10], sauf que de i'ADN humain servant de compétiteur a été omis de toutes les hybridations. Les digestions par restriction et la digestion par la nucléase Sl des produits de RCP ont été effectuées en diluant 5 p1 du mélange réactionnel de RCP avec 25 p1 de tampon renfermant une endonucléase de restriction ou la nucléase S1 [29] et en effectuant une digestion pendant 30 minutes à 37 avec 3 unités d'en donucléase de restriction ou de nucléase Si (BRL) avant

électrophorèse sur gel.

(d) Séparation et analyse par RCP de cellules isolées Des lymphocytes ont été isolés en diluant du sang veineux avec un volume égal de lxSSC (solution saline

de citrate de sodium, 0,15M NaCl, 15mM de citrate triso-

dique, pH 7,0), en le plaçant en couche sur de l'Histopa-

que 1119 (Sigma) et en effectuant une centrifugation à 2000g pendant 10 minutes. Les cellules a l'interface ont éte diluées avec 3 volumes de lxSSC et ont été placées de nouveau en bandes sur de l'Histopaque. Les cellules ont été rassemblées en un culot par centrifugation à 2000g pendant minutes, ont été lavées à trois reprises avec lxSSC, avec centrifugation, et ont été remises en suspension dans

du lxSSC à 104 cellules/ml.

Des cellules buccales ont été isolées par dilution de 0,5ml de salive avec 5 ml de lxSSC et par centrifugation à 2000g pendant 10 minutes. Le culot de cellules a été rincé à trois reprises avec du lxSSC et a

été remis en suspension à 104 cellules/ml.

Des portions aliquotes d'approximativement 0,1 1l des suspensions cellulaires ont été placées à la pipette sur une lame porte-objets siliconée et ont été rapidement examinées à un grossissement de 100 sur un microscope inversé. Des gouttelettes contenant une seule cellule nucléée ont été immédiatement diluées avec 0,4 p1 de lxSSC et ont été transférees dans un tube d'Eppendorf en

utilisant une pipette à pointe jetable. La lame porte-

objets a été réexaminée pour contrôler l'enlèvement de la

cellule avec la gouttelette.

Les cellules ont été lysees avant RCP par chauffage ou bien par traitement avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) et avec la proteinase K [23]. Dans le premier cas, la gouttelette contenant la cellule a été diluée avec 4,5 M1 de Tris-HCl 5mM (pH7,5) contenant 0,l1M d'amorces oligonucléotidiques, a été recouverte d'huile de paraffine et a été chauffée a 95 pendant 3 minutes avant addition de 541 de 2x tampon de RCP concentré/amorces/Taq polymérase et amplification. Dans ce dernier cas, la gouttelette contenant la cellule a été mélangée à 0,541 de Tris-HCl 5mM (pH7,5), 0,l1M d'amorces plus 141 de Tris-HCl 5mM (pH7,5), mM de dithiothréithol, 3,4 pM SDS, 50 pg par ml de protéinase K [23], a été recouverte avec de l'huile de paraffine et digérée a 37' pendant 45 minutes. 3 M1 d'eau ont été ajoutés au produit de digestion et le mélange a éte

chauffé à 95 pendant 3 minutes pour inactiver la proté-

inase K avant addition de 5 41 de 2x mélange réactionnel de

RCP, de la manière précitée.

(a) Sélection de minisatellites humains pour l'amplification Par RCP

La stratégie pour l'amplification des mini-

satellites est représentée sur la figure 1. Des amorces oligonucléotidiques correspondant à l'ADN d'une séquence particulière entourant le minisatellite sont utilisées pour diriger l'amplification de la totalité du minisatellite par la polymérase Taq. Les allèles amplifiés sont détectés par hybridation par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern avec une sonde minisatellite située à l'intérieur des sites d'amorçage. Six minisatellites clonés ont eté choisis pour l'étude (Tableau 1). Deux d'entre eux, p àg3 et MS32 [8, 10] détectent des loci extrêmement variables avec des héterozygotismes de 97% et plus de 40 allèeles différant par le nombre de motifs répétés. Les quatre autres minisatellites, 33.1, 33.4 et 33.6 [53 et pMS51, isolés sous forme d'un fragment d'ADN Sau3A-EcoRI clonés à partir d'une empreinte digitale d'ADN [A. J. Jeffreys, résultats non publiés), détectent des loci beaucoup moins variables avec des hétérozygotismes de 66 à 77%; les allèles sont cependant beaucoup plus courts que ceux de p g3 et MS32 (Tableau 1) et devraient être plus susceptibles d'être amplifiés par RCP. Les séquences d'accompagnement de pg3, 33.1, 33.4 et 33.6 ont été décrites précédemment [5, 83: l'ADN d'accompagnement de

MS32 et pMS51 a été séquencé de la manière décrite ci-

dessus [8]. Toutes les séquences d'ADN d'accompagnement ont été sélectionnées par rapport a la base de données de séquences d'ADN EMBL pour identifier les motifs répétés tels que Alu, et des amorces oligonucléotidiques de RCP A et B (figure 1) ont été conçues pour éviter ces motifs. Les détails de toutes les amorces et sondes d'hybridation sont

mentionnés dans la légende la figure 1.

(b) Fidélité et efficacité de l'amplification par RCP d'alleles de minisatellites humains Pour déterminer l'aptitude de la polymérase Taq à amplifier en particulier des allèeles de minisatellites longs, un mélange de 0,1 pg d'ADN génomique provenant de chacun de 4 individus, donnant un total de 8 alleles MS32 différents ayant des longueurs allant de 1,1 à 17, 9 kb, a été amplifié pendant 10 à 20 cycles utilisant des amorces A et B d'accompagnement de XMS32, puis a été soumis à une hybridation avec une sonde minisatellite par fixation sur

papier-filtre suivant la méthode de Southern (figure 2A).

En utilisant des temps d'extension de 6 minutes pour la polymérase Taq, seuls les quatre allèles les plus courts (1,1 à 2,9 kb) ont été amplifiés de manière efficace. La prolongation du temps d'extension à 15 minutes, pour accroître la probabilité d'une progression totale de la polymérase Taq à travers le minisatellite, a provoqué un fort accroissement de rendement des deux plus grands alleles suivants (4,5, 6,6 kb), bien qu'aucune amélioration supplémentaire n'ait été observée avec des extensions de 30 minutes. Le rendement relatif des grands allèles aurait pu également être amélioré en augmentant la concentration de polymérase Taq (figure 2B), permettant la détection d'un allèle de 10,2 kb, bien que faiblement. L'addition d'une quantité supplémentaire de polymérase Taq au 13ème cycle a provoqué seulement une faible amélioration du rendement et il n'existe aucune preuve pour une chute importante

d'activité de la polymérase au cours de ces temps d'exten-

sion prolonges. D'autres expériences faisant varier la

température de recircularisation, la température d'exten-

sion et la concentration en tampon n'ont pu améliorer le rendement en allèles volumineux (résultats non représentés) et toutes les autres expériences ont utilisé des temps d'extension de 15 minutes et une forte concentration de polymérase Taq (1,5 unité pour 10 gl de mélange réactionnel

de RCP).

Pour des nombres inférieurs de cycles (10 cycles), les allèles amplifiés se révèlent être des copies totalement fidèles des allèles ?MS32 de départ, comme le montrent leurs mobilités électrophorétiques (figure 2A). A de plus grands nombres de cycles (14, 17 cycles), il existe une augmentation des marquages formant le bruit de fond; puisque la plus grande partie de ce marquage peut être supprimée par digestion avec la nucléase Sl (résultats non représentés), la plus grande partie de ce bruit de fond provient probablement des faibles teneurs en modèles monocaténaires provenant du cycle précédent qui n'ont pu être soumis à un amorçage, et de produits d'extension incomplets provenant des cycles précédents qui, par définition, ne peuvent présenter un amorçage. A de grands nombres de cycles (20), le motif d'hybridation dégénère en une traînée à dispersion hétérogène, de la manière prévue puisque le rendement en produits de RCP devient si élevé (supérieur à 400 ng/ml) qu'une réunification hors registre de l'ADN de minisatellite monocaténaire répété en tandem se produit au cours de la phase d'extension. Cela conduit à une terminaison prématurée de l'extension au niveau d'un site de réunification, à des "alleles" erronés provenant de

l'extension de modèles incomplets ayant subi une réunifica-

tion hors registre du brin complémentaire d'un mini-

satellite, et à la formation de réseaux multimoléculaires

de brins d'ADN minisatellites ayant subi une réunification.

Les rendements en chaque allèle)MS32 amplifié par RCP ont été quantifiés par densitométrie par balayage (figure 3). Les produits de RCP obtenus à partir de 0,1 g d'ADN génomique s'accumulent exponentiellement au moins

jusqu'au cycle n 17.

Le gain en produit par cycle diminue régulière-

ment avec la longueur des allèles, avec des gains in- férieurs pour des temps d'extension de 6 minutes, par rapport à des temps d'extension de 15 minutes. Les courbes de gain en fonction de la longueur des alleles présentent

une extrapolation en retour à un gain par cycle d'appro-

ximativement 2,0 pour des allèles très courts, indiquant que l'efficacité de dénaturation et d'amorçage à chaque cycle est proche de 100%. Les rendements finals en un allèle peuvent être calculés a partir de ces courbes; pour un allele A avec un gain gA par cycle présent initialement en un nombre de molécules égal à n, le rendement au bout de c cycles est approximativement égal a n.gAc molécules. Le déséquilibre molaire entre les allèles A et B de longueurs différentes, provenant d'une amplification plus efficace des alleles plus courts, est donne par (gA/gB) c. Par exemple, au bout de 10 cycles d'amplification avec des temps d'extension de 15 minutes, le rendement molaire d'un allele de 1 kb est 18 fois plus important que celui d'un allèle de 6 kb; au bout de 25 cycles, le déséquilibre est égal à 1300 fois. Ce déséquilibre est amélioré dans une certaine mesure par la détection plus efficace des alleles

plus longs par la sonde d'hybridation minisatellite.

Neanmoins, les allèles longs amplifies par RCP deviennent de plus en plus difficiles à détecter avec de faibles quantités d'ADN génomique humain de départ et de grand

nombre de cycles de RCP.

Les minisatellites pàg3, pMS51, 33.1, 33.4 et 33.6 ont été également testés en ce qui concerne leur

aptitude à être amplifiés par RCP (résultats non représen-

tés). Dans tous les cas, une amplification fidèle de tous les allèles testés a été observée, sauf en ce qui concerne les allèles les plus longs (> à 8kb) de p 1g3 qui, de la

manière escomptée, présentaient une incapacité d'amplifi-

cation. De même, les rendements en produits de RCP ont

* diminué avec l'accroissement de la longueur des allèles.

(c) Fidélité d'amplification de molécules minisatellites isolés Pour tester si une amplification fidèle de molécules isolées est possible, des portions aliquotes de et 6 pg d'ADN humain, correspondant à 10 et 1 cellules, ont été coamplifiées pendant 25 cycles en utilisant des amorces à la fois pour àMS32 et pMS51 (figure 4A). Les deux allèles de pMS51 (1,6 et 1,5 kb) ont présenté une amplification dans l'échantillon de 60pg, et des produits d'amplification de l'un ou des deux allèles ont été également observés dans les échantillons de 6pg, indiquant que des molécules-cibles isolées peuvent être amplifiées fidèlement. De manière similaire, les allèles de 2,8 et 5,9 kb de RMS32 ont pu être amplifiés avec succès à partir d'échantillons de 6pg d'ADN humain, malgré un très faible

rendement de l'allele le plus grand, de la manière prévue.

Une amplification réussie des allèles MS32 et pMS51 dans

des échantillons de 6pg s'est révélé se produire indépen-

damment, de la manière prévue, avec un taux moyen d'échec par allèle et par réaction de 63%. D'après la distribution

de Poisson, cela indique en moyenne 0,46 cas d'amplifica-

tion réussis pour des échantillons d'ADN de 6pg, compara-

tivement à un cas prévu puisque 6pg d'ADN humain contien-

nent en moyenne une molécule d'un allèle. Ainsi, des molécules minisatellites isolées servant de cibles peuvent,

avec une efficacité raisonnable, être amplifiées par RCP.

Aucun produit d'amplification erroné n'a été observé avec pMS51. A l'opposé, MS32 a donné fréquemment des produits inattendus à la fois dans les échantillons d'ADN de 60pg et 6pg (figures 4A,B). Une digestion par la nucléase S1 a éliminé une bande (figure 4B) apparaissant seulement occasionnellement, migrant conjointement avec le produit de RCP dénaturé et pouvant être éliminée en grande partie en soumettant ensuite les produits de RCP à une étape finale de reconstitution/extension (résultats non représentés, voir Matériel et Méthodes). Cette bande sensible à la

nucléase S1 correspond probablement à un modèle mono-

catenaire qui n'a pu être soumis à une extension d'amorce dans le cycle de RCP final. Les bandes erronées restantes détectées par)MS32 étaient résistantes à la nucléase S1 mais présentaient des dimensions réduites, avec le produit de RCP correct, par digestion avec des endonucléases de restriction qui clivent l'ADN entourant le minisatellite (figure 4B). Ces bandes erronées représentent probablement des produits anormaux de RCP avec de l'ADN d'accompagnement normal mais des nombres modifiés de motifs répétés minisatellites. Elles sont particulièrement fortes au bout de 30 cycles d'amplification, sont généralement présentes en de faibles quantités par rapport à l'allèle authentique et présentent une longueur variable d'une réaction à l'autre, par opposition à l'allele de départ. Elles ne sont pas le résultat d'une contamination des RCP avec de l'ADN

humain ou avec des produits des RCP précédentes puis-

qu'elles apparaissent seulement dans des réactions dans

lesquelles une amplification réussie d'un allèle authen-

tique s'est produite (figure A) et ont été observées en conséquence avec tous les ADN humains testés (résultats non représentés). Puisque presque tous les produits erronés

sont plus courts que l'allele authentique, il est vraisem-

blable qu'ils surgissent relativement précocement dans la RCP et s'accumulent préférentiellement en raison de leur

faible longueur et de leur plus forte efficacité d'amplifi-

cation concomitante. La manière dont surgissent ces allèles "mutants", ainsi que l'éventuelle possibilité de trouver des conditions de RCP qui suppriment leur apparition, ne sont pas encore nettement établies. Une fréquence similaire d'apparition "d'allèles" anormaux a été observée avec pg3, mais seulement beaucoup moins fréquemment avec les

quatre minisatellites testés.

Des mutations somatiques au niveau des loci minisatellites dans l'ADN génomique humain de départ pourraient également être une source de produits de RCP inattendue. Ces mutations existent, en particulier pour

AMS32, comme le montre l'apparition d'allèles mini-

satellites mutants dans des populations de cellules tumorales clonales [30]. Cependant, il est très peu probable que des mutants somatiques soient une source importante des bandes erronées représentées sur la figure 4, puisqu'il n'a été encore observé aucune réaction de RCP sur 6 pg d'ADN humain qui montre l'apparition d'un allèle

mutant en l'absence de l'allèle normal d'origine.

(d) Co-amplification de minisatellites multiples empreintes digitales d'ADN humain obtenues par RCP La figure 4 démontre que deux minisatellites peuvent être co-amplifiés avec succès dans la même réaction de RCP. D'autres analyses ont montré qu'au moins six minisatellites pouvaient être amplifiés conjointement sans aucune interférence apparente entre des loci. En outre, les

produits de RCP pouvaient également être soumis simul-

tanément à un typage par hybridation par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern avec un

cocktail constitué de la totalité des six sondes mini-

satellites. Des exemples de ces "empreintes digitales" d'ADN multilocus obtenues par RCP sont présentés sur la figure 5. Dans tous les cas, la réaction de RCP a été limitée à 15-18 cycles pour réduire au minimum l'apparition de produits erronés, comme le montre la figure 4. Des analyses répétées du même individu ont montré que le motif était reproductible, tous les fragments d'ADN d'hybridation représentant des produits minisatellites d'amplification authentiques. Les "empreintes digitales" d'ADN pouvaient

68 ?639651I

être aisément obtenues à partir de 1 ng d'ADN humain; de temps à autre, un ou deux loci n'ont pu être amplifiés (individus 1, 12, figure 5A, C); cette incapacité a touché habituellement 33.4, puis pMS51, et était moins susceptible d'affecter 33.1 (résultats non représentés). La probabilité d'un échec se révèle être corrélée à la teneur en GC des motifs minisatellites répétés (tableau 1) et suggère qu'une non-amplification résulte d'une incapacité de dénaturation à 95 des minisatellites riches en GC, probablement en raison de variations localisées de température dans le bloc chauffant ou d'une mauvaise conductibilité thermique entre

le bloc et le tube de réaction.

Ces empreintes digitales d'ADN PCR sont dérivées de six loci avec des taux de variabilité très différents (tableau 1). Pour déterminer la complexité globale et le taux de variabilité de ces motifs, des individus non apparentés ont été comparés (figure 5B). En moyenne, 8,9 bandes ont été séparées par individu (plages 6 à 11, figure 6). Le nombre maximal possible de bandes est

égal à 12 (figure 5A), ce qui correspond à un hétéro-

zygotisme au niveau de tous les loci sans aucune migration électrophorétique conjointe d'allèles provenant de différents loci et avec aucun allele trop volumineux pour être amplifié par RCP. Dans des comparaisons deux à deux

d'individus non apparentés, il existe en moyenne 10,8 ban-

des qui sont discordantes entre des paires d'individus

(intervalles 5-18). Puis que la distribution des discor-

dances se rapproche d'une distribution de Poisson, la probabilité que deux individus apparentés présentent des empreintes digitales d'ADN identique (aucune bande

discordante) peut alors être estimée à e- 10o'8 = 2 x 10-5.

En conséquence, ces motifs présentent un bon degré de spécificité individuelle, malgré le fait que quatre des six

loci utilisés présentent des taux de variabilité relative- ment faibles (Tableau 1). Les différences entre les empreintes digitales

d'ADN obtenues par RCP sont également aisément détectables entre des individus étroitement apparentés, comme par exemple dans la famille de troisième génération représentée sur la figure 5C dans laquelle une transmission fidèle des bandes d'un parent à des

descendants peut également être constatée.

(e) Typage de minisatellites dans des cellules humaines isolées Des cellules lysées peuvent être soumises directement à une RCP sans la nécessité de purifier l'ADN

[23], ce qui simplifie considérablement l'analyse d'échan-

tillons tels que du sang. Dans des expériences préliminai-

res, il s'est révélé possible d'effectuer le typage de minisatellites dans du sang en congelant et décongelant tout d'abord le sang pour lyser les érythrocytes, puis en effectuant une centrifugation pour recueillir les globules blancs et les noyaux et en effectuant un chauffage dans de l'eau pour lyser les cellules avant RCP. En utilisant ce

procédé, il a été possible d'effectuer un typage reproduc-

tible de 0,001 à 0,01 gl de sang, ce qui correspond à 3-30 cellules nucléées (résultats non représentés). Cette analyse a été étendue à des lymphocytes isolés (figure 7A)

à partir desquels cinq loci minisatellites ont été co-

amplifiés simultanément et soumis à un typage par hybrida-

tion séquentielle. Une amplification réussie et raison-

nablement fidèle a été observée à la fois à partir de cellules lysées avec la protéinase K et le SDS avant RCP,

et à partir de cellules lysees par chauffage dans l'eau.

Des cellules buccales nucléées isolées ont pu également être soumises à un typage après une lyse avec la proteinase K et le SDS (figure 7B), bien que ces cellules n'aient pu

subir une lyse dans l'eau (résultats non représentés).

Pour tester la possibilité d'identification de cellules isolées, 14 cellules buccales provenant de deux individus ont été soumises séparément à un typage dans une expérience en aveugle (figure 7B). Dans quatre cas, aucun produit d'amplification n'a été observé à partir de n'importe lequel des loci, ce qui suggère que la cellule n'avait pas été transférée au milieu réactionnel de RCP ou que la lyse ne s'était pas produite, ou bien que l'ADN nucleaire s'était dégradée avant RCP. Dans les dix cas restants, les alleles amplifiés ont pu être détectés à partir d'au moins deux des loci minisatellites et, dans certains cas, la totalité des cinq loci a présenté une amplification réussie à partir d'une seule cellule. En omettant les grands allèles de MS32, qui présentent une amplification médiocre et seraient difficiles à soumettre à un typage au niveau d'une seule cellule, il est estimé que, pour les réactions de RCP destinées à une seule cellule dans lesquelles au moins certains loci ont été amplifiés, approximativement 75% des allèles présents ont pu être détectés après RCP. Cette estimation concorde avec

l'efficacité d'amplification d'une seule molécule déter-

minee par analyse par RCP d'un échantillon de 6pg d'ADN humain (figure 4). De la manière escomptée d'après la figure 4, plusieurs cas de bandes erronées ont été observés à la fois dans des réactions de RCP sur des cellules buccales et des lymphocytes (figures 7A,B). Néanmoins, des allèles distinctifs provenant de chacun des deux individus testés ont pu être détectés dans les 10 cellules buccales ayant subi un typage avec succès, et l'origine de chaque cellule buccale a été prédite avec succès dans cet essai en aveugle. Finalement, il a été noté la présence de produits amplifiés de 33.6 dans certains des témoins dépourvus d'ADN sur les figures 7A,B et de 33.4 dans l'un des témoins constitués de cellules buccales. Dans la pratique, il a été trouvé que cette contamination, probablement avec des ADN recombinants ou les produits de réactions précédentes de RCP plutôt qu'avec des cellules humaines ou de l'ADN génomique, pouvait seulement être évitée en utilisant des solutions, de la verrerie, des pointes de pipettes jetables et des tubes d'Eppendorf qui n'ont pas été mis en contact auparavant avec le milieu du laboratoire. Il est intéressant de noter que le problème de contamination le plus important qui s'est présenté a eu lieu avec 33.6, l'une des sondes d'empreintes d'ADN multilocus [5.6] qui a été utilisée continuellement dans le

laboratoire de la Demanderesse ces quatre dernières années.

(f) Conclusions La polymérase Taq présente non seulement une fidélité remarquable dans l'amplification d'ADN non répété [21], mais est également capable d'amplifier fidèlement des minisatellites entiers et de préserver la spécificité allélique du nombre de motifs répétés. Cependant, à l'opposé des RCP classiques, une RCP sur un minisatellite doit habituellement être terminée avant que le rendement en produit devienne suffisamment élevé (>4 ng pour 10 pl de mélange réactionnel de RCP) pour que la réunification hors registre entre des brins complémentaires répétés en tandem, servant de modèles, se produise au cours de l'extension d'amorce, en particulier au cours des temps

d'extension assez longs requis pour obtenir une amplifica-

tion efficace d'allèles de minisatellites longs. De même, la RCP doit s'effectuer suffisamment rapidement pour donner une quantité de produit suffisante pour être détectable par hybridation. Les -sondes de minisatellites sont sensibles et peuvent aisément détecter O,lpg de produit de RCP minisatellite [10]. "L'intervalle" de cycles de RCP qui donnent une quantité appropriée de produit pour un typage (0,1 à 4000 pg de produit) est en conséquence très large et seule une estimation très approximative de la quantité d'ADN génomique humain initial est nécessaire pour prévoir le nombre de cycles de RCP requis pour un typage couronné de succès. A titre de guide, 10 à 15 cycles sont appropriés pour 10ong d'ADN génomique, 18 cycles pour lng et 25 cycles pour une RCP sur une seule cellule (6pg). Il peut être nécessaire que le nombre de cycles de RCP soit accru pour détecter des allèles plus volumineux qui présentent une amplification moins efficace. Puisque les amplifications de minisatellites

nécessitent souvent d'être restreintes à la phase exponen-

tielle d'accumulation des produits de RCP [21], le signal d'hybridation est alors approximativement proportionnel à la quantité d'ADN introduite, s'abaissant a 0,lng d'ADN génomique humain (résultats non représentés). Au-dessous de cette teneur, une variation aléatoire du nombre de molécules minisatellites servant de cibles peut altérer la

proportionnalité. En conséquence, une RCP sur un minisatel-

lite peut être utilisée quantitativement pour estimer de faibles concentrations d'ADN humain. De même, la quantité d'amorces et de polymérase Taq n'est pas limitante au cours de cette phase initiale de la RCP et, en principe, il devrait y avoir une interférence faible ou nulle entre des loci différents soumis à une amplification. Dans la pratique, au moins six minisatellites différents peuvent être co-amplifiés simultanément et il semble qu'il n'existe aucune raison théorique pour que ce nombre ne puisse être accru. La co-amplification de minisatellites, suivie par une hybridation simultanée ou séquentielle avec des sondes minisatellites, permet d'obtenir une quantité considérable d'informations concernant l'identité et les relations généalogiques d'individus, à partir de très petits échantillons d'ADN. Ces empreintes digitales d'ADN obtenues par RCP se révèlent être fiables jusqu'à une quantité s'abaissant à lng d'ADN humain. Il est possible également d'obtenir des informations à partir de quantités d'ADN bien inférieures et de cellules isolées, bien que la production de fragments d'ADN erronés a certains loci, au cours du nombre relativement grand de cycles de RCP requis pour le typage d'une seule cellule, puisse présenter des problèmes importants pour l'identification d'un individu au niveau d'une ou de quelques cellules. Heureusement, ces produits erronés de RCP se révèlent varier d'une réaction à

l'autre, et des RCP en double sur de très petits échantil-

lons d'ADN différencieraient donc des allèles amplifiés de

manière fidèle de produits erronés de RCP.

Les empreintes digitales d'ADN obtenues par RCP présentent déjà un bon degré de spécificité individuelle, avec une probabilité d'association erronée de deux individus approximativement égale à 2 x 10-5. A l'opposé, les empreintes digitales d'ADN classiques obtenues par hybridation par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern avec une sonde multilocus à centres multiples [6] ou avec cocktail de sondes minisatellites humaines spécifique d'un locus [6] présentent de beaucoup

plus hauts degrés de spécificité individuelle [respective-

ment inférieurs à 10-12 et 10-6). Cependant, la variabilité des empreintes digitales d'ADN obtenues par RCP pourrait être améliorée notablement. Tout d'abord, des alleles hautement informatifs, en particulier au niveau de p g3

et ?MS32, ne peuvent être détectés au-dessus d'approxima-

tivement 8 kb (lng d'ADN humain) ou d'approximativement 5 kb (cellule isolée). Ce problème pourrait être résolu en utilisant des minisatellites extrêmement variables avec un intervalle plus restreint de longueurs d'allèles. Ces loci

se révèlent être rares puisque de hauts degrés de variabi-

lité sont habituellement associés à de grands nombres de motifs minisatellites répétés et à des alleles longs [5, 8, ]. Cependant, certains loci pouvant être appropriés ont été isolés [9], J.A.L. Armour et A.J. Jeffreys, résultats non publiés). Deuxièmement, le nombre de minisatellites amplifiés simultanément pourrait être accru. Troisièmement, des loci qui sont particulièrement enclins à donner des produits erronés de RCP, tels que p>g3 et MS32, pourraient être identifiés et évités. Si ces objectifs peuvent être atteints, on ne voit alors aucune raison pour qu'une identification fiable au niveau d'une seule cellule ne soit possible, sous réserve qu'une contamination involontaire soit évitée et que la présence potentielle de mutations somatiques au niveau de loci hypervariables soit prise en

considération [30].

L'utilisation de sondes d'empreintes d'ADN multilocus, par exemple pour l'identification d'individus en médecine légale, dans les tests de contrôle de paternité et dans le contrôle de transplants de moelle osseuse, est limitée par la sensibilité de ces sondes, qui nécessitent au moins 0,1 à 1 ug d'ADN humain pour un typage [6]. De manière similaire, des sondes minisatellites spécifiques de locus peuvent seulement effectuer un typage jusqu'à une quantité d'ADN humain s'abaissant approximativement à 50ng [10]. La production d'empreintes digitales d'ADN par RCP améliore considérablement la sensibilité et peut être

utilisée pour le typage d'échantillons qui sont relative-

ment impossibles a traiter par une hybridation classique

par fixation sur papier-filtre suivant la méthode Southern.

Par exemple, les racines de cheveux humains contiennent

habituellement 10 à 50ng d'ADN [22] et, bien qu'approxima-

tivement 70% des racines puissent être soumises à un typage en utilisant des sondes minisatellites spécifiques de locus [Z. Wong, J.A.L. Armour et A.J. Jeffreys, résultats non publies), toutes les racines de cheveux testées jusqu'à présent peuvent être soumises à un typage par production d'une empreinte digitale d'ADN par RCP (résultats non représentés). De manière similaire, une quantité de 0,001 à 0,01 p1 de sang peut être soumise à un typage sans qu'il soit tout d'abord nécessaire de purifier l'ADN. De manière similaire, la salive contient habituellement 100 à 1000

cellules buccales nucléées par 1 et une analyse d'em-

preintes d'ADN obtenues par RCP d'échantillons de salive en un volume inférieur au microlitre est donc possible. La possibilité d'un typage de traces de cheveux, de sang, de sperme, de salive et d'urine dans des échantillons de médecine légale, y compris des échantillons partiellement dégradés, est évidente. La possibilité d'une contamination accidentelle des échantillons, par exemple avec des traces

de salive, est également évidente.

Les empreintes digitales d'ADN obtenues par RCP devraient finalement présenter une spécificité individuelle suffisante pour donner un test extrêmement polarisé pour établir une filiation dans des litiges de paternité. Non seulement la nécessité d'isoler l'ADN serait évitée, mais des échantillons plus petits de sang obtenus par piqûre d'un doigt plutôt que par ponction veineuse pourraient être utilisés. En variante, la détermination de la filiation pourrait être basée sur l'analyse de la salive. Cela éviterait le problème posé des individus qui s'opposent à donner des échantillons de sang en raison de convictions religieuses ou pour d'autres motifs et cela supprimerait le choc provoqué par le prélèvement de sang chez de jeunes enfants. ExemDle 2

NATERIELS ET METHODES

AmDlification d'allèles minisatellites par RCP Des amorces oligonucléotidiques ont été préparées de la manière décrite précédemment (Jeffreys et collaborateurs, Nucleic Acids Res. 16, 10953-10971). Des allèles minisatellites XMS32 ont été amplifiés en mélangeant 0,4 pg d'ADN génomique humain dans un volume inférieur à 4 g1 de H20 avec 50 p1 de Tris-HCl 45mM (pH

8,8), (NH4)2SO4 11mM, MgC12 4,5 mM, EDTA 4,5 iM, 2-mer-

captoéthanol 7 mM, dATP lmM, DCTP lmM, dGTP lmM, dTTP 1 mM (Pharmacia), 100 gg/ml de sérum-albumine bovine (dépourvue de DNase, Pharmacia), 1 MM d'amorce oligonucleotidique A et i MM d'amorce oligonucléotidique B. 7,5 unités de polymérase Taq (Cambio type III ou AmpliTaq Perkin Elmer) ont été ajoutées, le mélange réactionnel a été recouvert de 40.1 d'huile de paraffine et a été soumis à un cycle de 95 pendant 1,5 minute, 67' pendant 1,5 minute et 70 pendant 9,9 minutes, cycle qui a été répété 30 fois sur un

Dri-Block PHC-1 Techne Programmable, suivi par un traite-

ment final à 67 pendant 1,5 minute et 70 pendant 9,9 minutes. Des résultats équivalents ont été obtenus sur un DNA Thermal Cycler Perkin Elmer Cetus, le cycle étant mis en oeuvre à 95 pendant 1 minute, 67' pendant 1 minute et

pendant 10 minutes.

SéDaration des allèles amDlifiés Des mélanges réactionnels de RCP de 50 41 ont été mélangés à 5 p1 de mélange de charge (12,5% de Ficoll 400, 0, 2% de bleu de bromophénol, 0,2M de Tris-acetate (pH 8,3), 0,1M d'acétate de Na, lmM d'EDTA), ont été placés sur un gel à 1% d'agarose (Sigma Type I) et ont été soumis à une électrophorèse en présence de bromure d'éthidium. Les allèles amplifiés ont été visualisés en utilisant une bande UV de grande longueur d'onde (ou bien, si nécessaire, un transilluminateur UV de courte longueur d'onde) et les

plaques de gel contenant les alleles ont été excisées.

L'ADN a eté séparé par électrophorèse sur une membrane de dialyse, a éeté précipité par l'éthanol et dissous dans

1 de H20.

Amplification

La manière d'amplifier des alleles de mini-

satellites au moyen d'amorces oligonucleotidiques cor-

respondant à l'ADN entourant le minisatellite, pour diriger l'amplification de la totalité de la série répétée en tandem, a été décrite précédemment. Par une limitation du nombre de cycles de RCP et détection des alleles amplifiés par hybridation avec une sonde minisatellite par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern, il a été montré qu'une amplification fidèle était possible, mais

qu'à de grands nombres de cycles, les produits se transfor-

maient en une traînée à dispersion hétérogène de produits amplifiés en raison d'une réunification entre des fragments d'ADN minisatellites monocaténaires répétés en tandem. De même, la plupart des produits de RCP détectables à de grands nombres de cycles sur un gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium ne correspondaient pas aux produits de RCP du locus minisatellite mais provenaient d'un mauvais o10 amorçage au niveau d'autres sites génomiques (A.J. Jeffreys

et v.wilson, résultats non publiés).

Par diminution de la force ionique du tampon de RCP et élévation de la température de réunification de RCP pour réduire l'amorçage incorrect, ainsi qu'en changeant la source de polymérase Taq, il s'est révélé possible d'amplifier des minisatellites au point o des allèles authentiques amplifiés par RCP pouvaient être visualisés directement sur un gel coloré au bromure d'éthidium (figure 9). Une certaine traînée formant un bruit de fond qui se sépare en fragments d'ADN discrets de bas poids moléculaire se produit, en résultat du grand nombre de cycles de RCP requis pour parvenir à cette quantité de produit qui donne, par réunification, des produits minisatellites hétérodispersés. Néanmoins, des allèles authentiques sont nettement identifiables et correspondent par leurs dimensions aux alleles minisatellites détectés par une hybridation classique d'ADN génomique humain par fixation sur papier- filtre suivant la méthode de Southern. De la manière précitée (Jeffrey et collaborateurs, 1988), les rendements en allèles de minisatellites diminuent avec la longueur des allèles, et il ne s'est pas encore révélé possible d'amplifier des minisatellites ayant une longueur supérieure à 6 kb au point qu'ils puissent être identifiés sur un gel coloré au bromure d'éthidium. Pour des mélanges réactionnels de RCP de 50 j1 contenant 0,4 Gg d'ADN génomique humain, mélanges qui ont été traités pendant 30 cycles, une quantité de petits allèles (1 kb) allant jusqu'à 1 pg peut être produite; cette quantité s'abaisse à lng pour des allèles de 6 kb. Chez des hétérozygotes avec des dimensions d'allèles légèrement différentes, une

suramplification du plus petit allèle provoque habituelle-

ment une destruction du plus grand allele et sa disparition

de gels colorés au bromure d'éthidium.

Pour cartographier des motifs répétés et variants de minisatellites (RVM) dans des minisatellites, l'allèle amplifié est séparé par électrophorèse préparative sur gel, est clivé avec une endonucléase de restriction qui coupe à proximité de l'une ou l'autre extrémité de l'allèle

amplifié et est marqué à l'extrémité par marquage-comble-

ment au niveau de l'extrémité clivée. Une digestion partielle du fragment marqué à l'extrémité, avec des

enzymes de restriction appropriés, suivie par une électro-

phorèse sur gel d'agarose et d'une autoradiographie, donne une carte de l'emplacement des RVM internes. Le clivage terminal peut être effectué en utilisant un site de

restriction approprié se situant dans l'ADN d'accompagne-

ment à l'intérieur de la région amplifiée ou bien, en variante, une des amorces peut recouvrir un site de

restriction convenable. L'amorce 5' pour \MS32, 5'-

TCACCGGTGAATTCCACAGACACT-3', contient un site EcoRI 9-14nt à l'intérieur de l'amorce, correspondant à un site EcoRI dans l'ADN génomique. En l'absence d'un site approprié dans l'ADN entourant le minisatellite, comme cela est le cas avec la région 3' à MS32, un site terminal peut être produit en utilisant une amorce oligonucléotidique étendue

en 5'. Ainsi, la seconde amorce utilisée pour l'amplifica-

tion de)MS32 est modi fiée en 5'-

CTGATCATCGATCGACTCGCAGATGGAGCAATGGCC-3', les régions

soulignées correspondant à des séquences d'ADN génomi-

ques; l'extension en 5' contient un site pour ClaI (ATCGAT) qui ne présente pas de clivage à proximité de XMS32. La présence de l'extension 5' n'a aucun effet sur l'aptitude de cette amorce à amplifier ?MS32 (résultats non représentés). Les allèles amplifiés avec ces deux amorces peuvent être marqués à l'une ou l'autre extrémité

après clivage avec EcoRI ou ClaI, permettant à la car-

tographie de RVM d'être effectuée à partir de l'une ou

l'autre extrémité de la série répétée en tandem.

Cartoraphie de RVM à l'intérieur d'allèles MS32 amplifiés La sélection du groupe de familles d'origine Mormon, Française, Amish et Vénézuélienne du CEPH a révélé la présence d'allèles AluI de MS32 ayant une longueur comprise dans l'intervalle de 1,2kb à 20kb; puisque les allèles AluI sont plus longs de seulement 0,2kb que les produits de RCP correspondants avec les amorces précitees, des allèles AluI d'une longueur supérieure à 6,2 kb ne peuvent alors être aisément soumis à une cartographie

interne en raison de la faible efficacité d'amplification.

Les résultats de cartographie interne pour l'allèle le plus court dans le groupe du CEPH sont présentés sur la figure 10 pour l'allèle amplifié marqué avec EcoRI et ClaI. L'un et l'autre donnent une chaine HinfI continue et une chaine HaeIII discontinue, cette dernière étant complémentaire pour EcoRI et ClaI. Une carte complète de l'emplacement de tous les RVM clivables par HaeIII peut être déduite. L'analyse répétée de cet allèle amplifié dans des cas distincts a produit la même carte (résultats non représentés), mettant en évidence la

fidélité d'amplification et de cartographie.

Exemple 3

Cartocraphie d'un RVM constitué d'une seule molécule

Il a été montré que des molécules minisatel-

lites uniques peuvent être amplifiées avec une efficacité et une fidélité raisonnables, bien qu'avec l'apparition occasionnelle de produits erronés de RCP ayant une longueur

incorrecte (Jeffreys et collaborateurs, 1988). L'utilisa-

tion des conditions de RCP modifiées décrites dans la

présente invention a supprimé presque totalement l'appari-

tion de produits erronés de RCP, même à partir d'alleles longs (figure 12A). Pour déterminer la fidélité de cartographie d'un RVM constitué d'une seule molécule, 16 portions aliquotes de 6 pg d'ADN provenant de l'individu 10208 du CEPH, hétérozygote pour les allèles q et 4 (figure 12A) ont été amplifiées pendant 25 cycles avec des amorces

externes A et B (figure 11A) qui sont réservées exclusive-

ment à l'analyse d'une seule molécule pour réduire au minimum le risque de contamination par entraînement. Une hybridation par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern, avec une sonde minisatellite MS32, a révélé la présence d'alleles amplifiés correpondant par leurs longueurs à l'allele 1 dans 5 échantillons et l'allèle 4 dans 6 échantillons. Aucun autre produit amplifié n'a été détecté, et les témoins d'ADN étaient également négatifs (résultats non représentés). D'après les résultats, 42% de molécules minisatellites isolées ont engendré des produits de RCP, un rendement similaire à celui indiqué précédemment (Jeffreys et collaborateurs, 1988) et similaire au rendement d'amplification d'alleles plus grands (légende de la figure 12A). Les 11 allèles amplifiés à partir de molécules isolées ont été réamplifiés avec les amorces CI et D emboîtées pour réduire au minimum la contamination ultérieure des réactions de RCP avec une seule molécule pour éliminer les produits erronés provenant d'un mauvais amorçage avec les amorces A et/ou B autre part dans le génome, et ont été soumis à une cartographie

interne. Toutes les cartes obtenues étaient indifféren-

ciables des cartes des allèles 1 et 4 obtenues par amplification à partir d'ADN génomique en masse (résultats

non représentés).

Amplification de mutants par délétion nouveaux de MS32 à

partir d'ADN qénomicue humain sélectionné suivant dimen-

sions L'aptitude à amplifier fidèlement des molécules isolées de MS32 rend possibles l'amplification et la caractérisation de novo de mutations au niveau de ce locus présent dans l'ADN génomique humain en masse. Il a été choisi un individu qui était hétérozygote pour des alleles de longueurs similaires, mais de structures internes très différentes (allèles 31 et 32, figure 12). L'analyse par RCP effectuée sur 40 portions aliquotes en double de 30pg d'ADN de sperme provenant de cet individu a montré une amplification efficace de molécules minisatellites isolées sans aucune preuve de la présence d'allèles supplémentaires de longueur normale dans n'importe quelle réaction

(figure 13A).

L'ADN du sperme de cet individu a été digéré avec Sau3A plus l'isochizomère MboI, qui effectue un clivage en position distale aux amorces A et B (figure

11A), et a été fractionné suivant dimensions par électro-

phorèse sur gel d'agarose. Une série de fractions contenant des fragments d'ADN plus petits que les allèles 31 et 32 initiaux ont été recueillies et des portions aliquotes de chaque fraction ont été amplifiées avec les amorces A plus B. Une hybridation par fixation -sur papier-filtre suivant la méthode de Southern a révélé des cas d'amplification d'une seule molécule dans ces fractions, donnant des produits de RCP discrets dont les dimensions entraient dans l'intervalle de dimensions des fractions d'ADN testées (figure 13B, tableau 2). Une RCP-témoin à parallèles multiples, en l'absence d'ADN, ou en la présence de portions aliquotes de fractions de dimensions équivalentes à partir d'ADN de sperme servant de témoin, dépourvues d'éléments de digestion par Sau3A/MboI (voir les modes opératoires expérimentaux), était logiquement négative pour les produits de RCP de MS32. Les fractions S3 à S5 d'ADN de sperme ayant les plus petites dimensions étaient totalement dépourvues d'allèles-précurseurs amplifiables, indiquant qu'une quantité supérieure a 99,9999% de molécules d'allèles-précurseurs a été éliminée de ces fractions. Des traces de ces alleles étaient encore présentes dans les fractions Sl et S2, indiquant une purification incomplète malgré un fractionnement électrophorétique sur gel effectué à plusieurs reprises. La purification sur gel d'ADN ayant des dimensions proches de celles des alleles ancestraux a donné des fractions plus fortement contaminées dans lesquelles la détection de nouveaux alleles mutants a été entravée par les produits de RCP provenant des allèles

ancestraux (résultats non représentés).

Des mutants par délétion de minisatellites constitués d'une seule molécule ont été amplifiés de manière similaire à partir d'ADN fractionné suivant dimensions, préparé à partir de sang prelevé chez le même individu. De même, des cas d'amplification d'une seule molécule étaient aisément détectables dans l'ADN du sang mais non dans de l'ADN de sang servant de témoin, dépourvu d'éléments de digestion. Les détails du nombre et des dimensions des allèles de sperme et de sang des mutants nouveaux sont résumés sur le tableau 3. Un total de 64 mutants en ce qui concerne le sperme et de 42 mutants en ce

qui concerne le sang a été observe, des mutants apparais-

sant plus fréquemment dans les fractions ayant les plus

grandes dimensions.

L'aptitude à aligner tous les mutants concer-

nant le sperme et le sang avec l'un ou l'autre allèle ancestral offre une forte preuve que ces alleles courts représentent bona fide des molécules mutantes présentes dans l'ADN génomique, plutôt que des impuretés introduites au cours de l'isolement de l'ADN de sperme et de sang. En outre, la détection répétée d'alleles mutants en mosaïque identiques confirme la fidélité de la cartographie d'un RVM

constitué d'une seule molécule.

MODES OPERATOIRES EXPERIMENTAUX Préparation d'ADN Des ADN humains ont été fournis par le CEPH, Paris, et

ont été également préparés à partir de sang

veineux collecté chez 80 sujets britanniques non apparen-

tés, de la manière décrite par ailleurs (Jeffreys et Morton, 1987). L'ADN de sang pour l'analyse par RCP d'une seule molécule a été préparé à partir de 20 ml de sang collecté dans 20 ml de 1 x SSC (solution saline de citrate de sodium, NaCl 0,15M, citrate trisodique 15mM, pH 7,0). Le sang a été congelé et décongelé pour lyser les érythrocytes et les leucocytes ont été recueillis par centrifugation à 10 000g pendant 10 minutes. Le culot cellulaire a été rincé avec 1 x SSC, remis en suspension dans de l'acétate de Na 0,2M (pH 7,0) et a été lysé par addition de SDS à 1%. L'ADN a été recueilli, après extraction par le phénol, par précipitation à trois reprises par l'éthanol. Toutes les opérations ont été effectuées dans une hotte à flux laminaire en utilisant des pipettes, des ustensiles de laboratoire jetables en matière plastique et des réactifs qui n'avaient pas été antérieurement mis en contact avec le milieu du laboratoire, pour réduire au minimum le risque de contamination. L'ADN de sperme a été préparé de manière similaire à partir d'un seul éjaculat provenant d'un individu qui avait évité d'avoir un rapport sexuel avant de fournir l'échantillon (pour empêcher la contamination avec 1'ADN provenant de son partenaire). Le sperme a été dilué avec un volume égal de 1 x SSC et le sperme a été recueilli par centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes. Le culot cellulaire a été rincé à trois reprises avec 20 ml de 1 x SSC, tout en centrifugeant, puis a été lavé à six reprises avec 20 ml de 1 x SSC, 1% de SDS, pour lyser tous les leucocytes séminaux et les cellules épithéliales. Le culot de sperme résiduel a été mis à incuber dans i x SSC, 2-mercaptoéthanol 1H à température ambiante pendant 5 minutes, et le sperme réduit a été lysé par addition de SDS à 1%. L'ADN de sperme a été recueilli, après extraction par le phénol, en effectuant une précipitation par l'éthanol. Fractionnement suivant dimensions de 1'ADN humain gg d'ADN de sperme ont été digérés en totalité avec Sau3A plus MboI en présence de 4 mM de trichlorure de spermidine en utilisant les conditions recommandées par le fabricant. L'élément de digestion d'ADN, conjointement avec un ADN-témoin dépourvu d'élément de digestion, a été introduit dans un gel à 0,6%. d'agarose

horizontal long de 20 cm (Sigma type 1) dans du TNE (Tris-

acetate 20 mM, acetate de Na lOmM, EDTA 0,lmM, pH 8,3) de manière à remplir moins de la moitié de la fente de chargement avec l'échantillon. Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse à côté de marqueurs d'ADN Hind III à 20V pendant 18 heures. Les voies suivies par les marqueurs ont été prélevées et colorées au bromure d'éthidium. La région du gel contenant des fractions d'ADN humain ayant des dimensions comprises dans l'intervalle de 0,6 à 4,2kb a éte excisée avec la région correspondante de l'élément de digestion-témoin, et l'ADN a été recueilli par electro-élution sur une membrane de dialyse. L'ADN recueilli, plus l'extrait-témoin, a été refractionné de la manière précitée sur un gel frais. Puis l'ADN recueilli a été soumis à une électrophorèse à travers un troisième gel et une série de plaques de gel de 0,6 à 3,8 kb a été prélevée. La couche supérieure et la couche inférieure de 1 mm de gel ont été coupées dans chaque plaque pour réduire au minimum la contamination avec des fractions d'ADN migrant de manière aberrante le long de la surface du gel

et l'ADN a été recueilli par électro-élution et précipita-

tion par l'éthanol. L'ADN a été dissous dans du Tris-HCl 5mM (pH 7,5). Toutes les opérations ont été effectuées dans

une enceinte à flux laminaire et l'appareil d'électropho-

rèse a été décontaminé avant utilisation par immersion dans un agent de blanchiment domestique plus du HC1 1M sous une

hotte pendant 16 heures.

Amplification d'allèles MS32

Des allèles on été amplifiés par une modifica-

tion des procédés décrits précédemment (Jeffreys et collaborateurs, 1988). 0,4 pg d'ADN génomique humain a été amplifié dans 50 j1 de Tris-HCl 45mM (pH 8,8), (NH4)2S04 11 mM, MgCl2 4,5mM, 2-mercaptoéthanol 6,7mM, EDTA 4,5 pM, dATP lmM, dCTP lmM, dGTP lmM, dTTP lmM (Pharmacia), gg/ml de sérumalbumine bovine (dépourvue de Dnase, Pharmacia) plus 1 LM de chacun des oligonucléotides Cl plus

D, ou C plus D1, et 5 unités de polymérase Taq (Amersham).

Les réactions ont été soumises à un cycle de 1,3 minute à 96 , 1 minute à 67 et 4 minutes à 70 , le cycle étant répété à 25-30 reprises sur un DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus). Les produits de RCP ont été soumis à une électrophorèse à travers un gel de 0,8% d'agarose et les allèles amplifiés ont été visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Les allèles ont été recueillis par électro-élution et précipitation par éthanol et ont été dissous dans du Tris-HCl (pH 7,0). D'autres sources de polymérase Taq étaient également efficaces (AmpliTaq

(Perkin Elmer Cetus) et polymérase Taq Type III (Cambio).

Des échantillons d'ADN humains pour l'analyse d'une seule molécule ont été centrifugés pour éliminer

toute matière en particules, ont été dilués avec du Tris-

HCl 5mM (pH 7,0) plus 0,1.M d'amorces de RCP comme support, et ont été amplifiés dans des volumes réactionnels de RCP de 7 p1 en utilisant les amorces A plus B à 96' pendant 1,3 minute, 64' pendant 1 minute et 70 pendant quatre minutes, pendant 25 à 28 cycles. Les produits de RCP ont été détectés par hybridation, par fixation sur papier-filtre suivant la méthode de Southern, avec une sonde minisatellite MS32 marquée au 32p, de la manière

décrite précédemment (Jeffreys et collaborateurs, 1988).

Les produits de RCP ont été ré-amplifiés par ensemencement d'un mélange réactionnel de RCP de 30 g1 contenant 1 gM d'amorces emboitées C1 plus D, ou C plus Dl, avec 0,4 pl du mélange réactionnel initial par RCP et en les soumettant à un cycle comprenant les étapes de 96' pendant 1,3 minute, pendant 1 minute et 70* pendant 4 minutes, cycle répété à 25-30 reprises. Les allèles ré-amplifiés ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose de la manière décrite ci-dessus.

TABLEAU I Propriétés de minisatellites humains choisis pour l'amplification par RCP.

Intervalle des Clone Locus Localisation du Hétérozygotisme Nombre longueurs d'a]e- GC Ref chromosome d'allèles Jes (kb) p g3 D7522 7q36qter 97 >40 0,6-20 66 t8, 10, 32] MS32 D1S8 lq42-q43 97 >40 1,1-20 62 [10, 32] pMS51 DllS97 lq13 77 9 1,3-4,3 69 (33] p33.1 - - 66 10 111-2,5 56 [5] p.33.4 - 70 7 0,8-1,3 68 [5] p33.6 - - 67 8 0,5-1)0 70 [5] 1; Les longueurs des allèles comprennent le minisatellite et l'ADN d'accompagnement défini par les amorces

RCP (voir figure 1).

2; Teneur en GC des motifs répétés minisatellites. Le motif répété minisatellite pMS51 est '-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans lequel n est égal à 1 ou 2 suivant le motif répété. LY nn L>4 o Tableau 2 Propriétés de loci minisatellites détectés par des clones spécifiques de locus Pourcentage d'hé- Localisation pb ADN d'accompagnement Sonde Locus térozygotisme du chromosome 5' séquencé en 3' P g3 D7S22 97,4 7q36-qter 438 309 pMS1 D1S7 99,4 lp33-p35 1284 434 pMS31 D7S21 98,0 7p22-pter 399 12 pMS32 D1S8 97,5 lq42-q43 207 429 pMS43 D12Sll 95,9 (A) 12q24.3-qter 14 780

(B) (780) 373

pMS51 DllS97 77 lql3 113 194

pMS228 - 94 (A) 17p13-pter - -

(B) 400 1057

Note: dans pMS228, seul l'ADN voisin de 228B a été séquencé (voir figure 1). La cartographie de restric-

tion suggère que seulement environ 500pb au vosinage Jmwédiat 228A ont été ainsi omises.

u o L.. o o' NO - Ll-O - - O l 1 1-9'0 6Z-OZ IV-LI S 5 S S1' 9'1-1'1 ig Z9-8ú 6 -ú 6 I 0'IT ú'Z-9JI cg 98-19 98-65 úT si 51 ZL'0 I'ú-fú za ú11-16 011-98 L 8 I zitO0 8' ú-1' l u es - Lt-O - - 0 Itúl 1'T-9'0 çS i8c-çz LELI ú S S L< L'1-T'I t/S 09-8D Z9-LC ú Sl 6' Z tZ-L'I úS 9L-6S ú8-Z9 L LI LZ 1 l O'ú-t'i ZS 811-98 001-ú8 9 Zi LI 9T'0 5'ú-0' ú IS 1 uuadS sgAaasqo snlca slualgjjp sluaw spTqde/ao4/e: sIuenu 9 Lx sgsxKeue qy{ 'suoTs s89:19dga. -9a, -îp aiquioN suamuIg,,p aqmuoNap alqmo N sapIoEdeq -uamTp ap UOTap Dea sJTIom ap alquoN samoues ap alqoN allenaaluI ioqW snId VLneS DAe s,9I2TP 'suoTsuamTp JueATns squuoTiDela Sues @p N(IV,I ap la aueds ap NaV,I ap suep sgiDap ZúSR ap uoTlgTgp ied quinspH: ú neoIqe Leqende du tableau 3: l'ADN de sperme et l'ADN de sang provenant d'un individu hétérozygote pour les allèles de Sau3A de MS32 longs de 4,9 et 5,1 kb (allèles 31 et 32, figure 12) ont été digérés avec Sau3A plus MBoI et fractionnés suivant dimensions par électrophorèse sur gel d'agarose, de la manière décrite dans les procédés expérimentaux. Le rendement en ADN dans chaque fraction a été estimé en soumettant à une électrophorèse des portions aliquotes de chaque fraction contre une série de dilutions

d'ADN digéré non fractionné, puis en effectuant une den-

sitométrie par balayage de la région de poids moléculaire approprié sur des photographies d'un gel coloré au bromure d'éthidium. Des portions aliquotes multiples de chaque fraction ont été amplifiées en utilisant des amorces A et B de RCP et ont été testees pour déterminer la présence d'alleles mutants nouveaux, de la manière décrite sur la figure 13. Le nombre de génomes haploides analysés pour des mutants d'une classe de dimensions donnée a été obtenu à partir du rendement de chaque fraction, en considérant une quantité de 3pg d'ADN par génome haploïde et a été corrigé pour la proportion estimée (40%) de molécules MS32 isolées qui présente une amplification réussie. Le nombre observé de motifs répétés de chaque molécule mutante a été estimé à partir des dimensions du produit initial amplifié avec les amorces A plus B et a été confirmé par détermination directe du nombre de motifs répétés dans des mutants soumis

à une cartographie interne.

Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées

sans sortir de son cadre.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé de caractérisation d'un échantillon analytique d'ADN génomique par référence à un ou plusieurs témoins, caractérisé en ce qu'il consiste à amplifier la séquence minisatellite au niveau d'au moins un locus informatif dans l'échantillon analytique, par (i) hybridation de l'échantillon analytique avec une amorce en rapport avec chaque locus informatif à amplifier, l'amorce étant hybridable à un seul brin de l'échantillon analytique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite du locus informatif à amplifier dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétisé un produit d'extension de l'amorce qui soit

complémentaire de, et recouvre, ladite séquence minisatel-

lite du brin de l'échantillon analytique; (ii) séparation du produit d'extension ainsi formé du modèle sur lequel il a été synthétisé, pour donner des molécules monocaténaires; (iii) le cas échéant, hybridation de l'amorce de l'étape (i) avec les molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii) dans des conditions choisies de manière qu'un produit d'extension d'amorce soit synthétisé

à partir du modèle d'au moins l'une des molécules monocaté-

naires obtenues conformément à l'étape (ii), et (iv) détection des produits d'amplification et comparaison de ces produits à un ou plusieurs témoins; le procédé étant mis en oeuvre de sorte qu'il soit produit une quantité du produit d'extension désiré suffisante pour

être détectable, mais que le rendement en produit d'exten-

sion soit inadéquat pour permettre une hybridation hors

registre notable entre les brins minisatellites complémen-

taires servant de modèles.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon analytique d'ADN génomique est soumis à une restriction avant amplification, et une seule amorce est utilisée en rapport avec chaque

locus informatif a amplifier.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste (i) à hybrider l'échantillon analytique avec deux

amorces en rapport avec chaque locus informatif à ampli-

fier, chaque amorce étant hybridable à des brins simples de l'échantillon analytique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite du locus informatif à amplifier, dans des conditions choisies de manière qu'il soit synthétise un produit d'extension de chaque amorce qui soit

complémentaire de, et recouvre, ladite séquence minisatel-

lite de chaque brin de l'échantillon analytique, le produit d'extension synthétisé a partir d'une amorce, lorsqu'il est séparé de son complément, pouvant ainsi servir de modèle

pour la synthèse du produit d'extension de l'autre amorce.

(ii) à séparer le produit d'extension ainsi formé du module sur lequel il a été synthétisé pour donner des molécules monocaténaires; (iii) le cas échéant, à hybrider les amorces de l'étape (i) avec les molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii) dans des conditions choisies de manière qu'un produit d'extension d'amorce soit synthétisé à partir du modèle de chacune des molécules monocaténaires obtenues conformément à l'étape (ii); (iv) à détecter les produits d'amplification et à les comparer à un ou plusieurs témoins; le procédé étant mis en oeuvre de sorte qu'il soit obtenu une quantité du produit d'extension désiré suffisante pour être détectable, mais telle que le rendement en produit d'extension soit inadéquat pour permettre une hybridation hors registre notable entre les brins complémentaires du

minisatellite servant de modèle.

4. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications précédentes, caractérisé en ce que les

allèles d'un locus informatif dans l'échantillon analytique

ont des dimensions atteignant 15 kilobases.

5. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il

comprend l'utilisation d'au moins un enzyme qui digère ou dégrade spécifiquement l'ADN monocaténaire tout en laissant intact l'ADN bicaténaire, ce qui permet de réduire la

formation de produits d'amplification aspécifiques.

6. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ampli-

fication est effectuée dans un tampon de force ionique réduite et à une température de réunification élevée, ce

qui permet de réduire l'amorçage inadéquat.

7. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est

effectué simultanément l'amplification de plus d'un locus informatif.

8. Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il est hybridable à un brin simple d'un échantillon analytique d'ADN génomique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite d'un locus informatif de manière à permettre la formation d'un produit d'extension qui soit

complémentaire de, et recouvre, ladite séquence minisatel-

lite du brin de l'échantillon analytique, le locus

informatif étant choisi entre l'un quelconque des sui-

vants: MS1, MS29, MS31A et MS31B, MS32, MS43A et MS43B,

MS51, MS228 et MS228B.

9. Kit, caractérisé en ce qu'il comprend une amorce polynucléotidique pour l'amplification de la séquence minisatellite au niveau d'au moins un locus informatif dans un échantillon analytique d'ADN génomique, l'amorce étant hybridable à un brin simple de l'échantillon analytique au niveau d'une région qui entoure la séquence minisatellite du locus informatif à amplifier, dans les conditions choisies de manière que soit synthétisé un produit d'extension de l'amorce qui soit complémentaire de, et recouvre, ladite séquence minisatellite du brin de l'echantillon analytique, le kit comprenant en outre un

échantillon-témoin d'ADN et des instructions pour l'utili-

sation.

10. Kit suivant la revendication 13, carac-

terisé en ce qu'il comprend deux amorces polynucleotidiques complémentaires d'accompagnement, en rapport avec chaque

locus informatif.